DE69022542T2 - Chelatierungsmittel zur bindung von metallionen zu proteinen. - Google Patents

Chelatierungsmittel zur bindung von metallionen zu proteinen.

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Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf neue Chelatbildner zum Binden von Metallionen an Proteine wie beispielsweise Albumin, Transferrin, Antikörper und so weiter.
  • Das Binden van Metallionen an Proteine führt zu verschiedenen nützlichen Produkten. Diese umfassen fluoreszierende, radioaktive und paramagnetische Metallionen, die an Proteine gebunden sind, welche als Proben in vivo in biologischen Systemen und in vitro in analytischen Systemen wie beispielsweise Radioimmunversuchen verwendet werden können. Zum Beispiel liefert das Binden von Radionukliden an monoklonale Antikörper, die mit Tumoren assoziierte Antigene erkennen, Radioimmunkonjugate, die für die Krebsdiagnose und Krebstherapie nützlich sind. Die monoklonalen Antikörper werden als Beförderer gewünschter Substanzen zu spezifischen Stellen in vivo verwendet. Es ist berichtet worden, dass zahlreiche Chelatbildner wie beispielsweise Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Makrozykliker stabile Komplexe bilden, wenn sie an Protein gebunden werden. Insbesondere offenbart M.W. Brechbiel et al. (Anorg. Chem. 25 (16), 2772-81, 1986) 1-(p-Isothiocyanatbenzyl)- Derivate von DTPA und EDTA sowie ebenfalls eine mit einem Protein verbundene Diethylentriamintetraessigsäure (DTTA). Die kinetische Instabilität des Radioimmunkonjugats oder des Chelats unter physiologischen Bedingungen bewirkt, dass diese Komplexe zerfallen. Trotz mehrerer Versuche, die Bindungsart, die Chelatstruktur und so weiter zu verändern, resultiert eine Verabreichung solcher Radioimmunkonjugate in vivo in einer Ansammlung von Radioaktivität in Nichtziel-Geweben, insbesondere in der Leber. Es besteht somit ein offensichtlicher Bedarf an neuen Chelatbildnern, um Radiometalle an Antikörper zu binden, die Kornplexe bilden, welche nicht zerfallen, wenn sie einem Patienten verabreicht werden.
  • Ziel dieser Erfindung ist, einen neuen Satz Chelatbildner zu liefern, um Metallionen an Proteine zu binden und dabei eine wässerige Lösung zu liefern, die Antikörperchelatkonjugate enthalten, die in vivo stabil sind.
  • Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist, einen Satz Chelatbildner zu liefern, um eine Vielfalt von Metallionen zu binden, umfassend In, Y, Gd, Tb, Cu, Co, Sm, Rh, Ru, Re, Tc, Fe, Pb, Ba, Aktinoide, Lanthanoide und Uebergangsmetallionen.
  • Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht darin, neue Chelationsstrukturen zu synthetisieren, die zum Binden von Metallionen an Proteine nützlich sind, umfassend monoklonale Antikörper.
  • Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist, versatile Chelatbildner zu erhalten, die sich nicht nur zum Binden an Proteine mit geringem Molekulargewicht eignen wie beispielsweise Albumin und IgG, sondern auch an Proteine mit grossem Molekulargewicht wie beispielsweise IgM (9x10&sup5;), Lipoproteine (2x10&sup6;) und 50 weiter gebunden werden können.
  • Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist, ein verbessertes Verfahren zum Herstellen von Antikörpern zu erhalten, die mit Metallchelaten konjugiert sind.
  • Ein zusätzliches Ziel dieser Erfindung ist, Chelationsstrukturen zu erhalten, die eine hohe Metallionenkonzentration pro Antikörpermolekülliefern, ohne die biologische Aktivität des konjugierten Proteins in wesentlichem Ausmass zu zerstören.
  • Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist, mit Fluoreszenz markierte Proteine zu erhalten, indem fluoreszierende/lumineszierende Metallionen an Proteinchelatkonjugate gebunden werden.
  • Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist, metallionenbindende Reagenzien zu erhalten, die an chromatographische Säulenmaterialien gebunden werden können wie beispielsweise Polymere und Gele, die Chelataffinitätssäulen bilden.
  • Diese und weitere Ziele werden durch eine oder mehrere Ausführungen der vorliegenden Erfindung erreicht.
  • Die bifunktionellen Chelatbildner der Erfindung sind in Figur 1 dargestellt. In Figur 1 ist "a" LiLo1 und "b" ist LiLo2.
  • Figur 2 illustriert synthetische Verfahren zum Erhalten des metallbindenden Chelatbildners.
  • Figur 3 vergleicht die Stabilitäten von mit Indium-11 markiertem HSA-LiLo1 und HSA-DTPA in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS), (0,05M, pH 7,2) bei 37ºC.
  • Figur 4 vergleicht die biologische Aktivität (Immunreaktivität) eines Proteinchelatkonjugats (LiLo1, das an IgM-isotypische menschliche monoklonale Antikörper 16-88 konjugiert ist) mit derjenigen von nichtkonjugiertem Protein (16-88).
  • Figur 5 illustriert die Reinigung von (16.88)LiLo¹¹¹In durch Gelfilterungschromatographie.
  • Eine Ausführung dieser Erfindung richtet sich auf eine gepufferte Lösung, die ein Antikörper- oder Proteinchelatkonjugat enthält, in dem alle Metallionen über den Chelator an Protein gebunden sind.
  • Das Binden von Radiometallen an Antikörper erfordert zuerst das Binden von Liganden an Antikörper. Liganden, die auch Chelatoren oder Chelatbildner genannt werden, sind Verbindungen, die Radiometalle durch Bildung von koordinativen Bindungen wirkungsvoll binden können. Ligande wie beispielsweise Polyamincarboxylsäuren, Makrocykliker, Kronenether, Kryptande und Cyklame können verwendet werden, um Radiometalle zu binden. Die Wahl des Liganden hängt von der Wahl der Radionuklide und den Eigenschaften des konjugierten Proteins ab. Für die Radioimmunabbildung und - therapie umfassen die Radionuklide, die von Interesse sind, ¹¹¹In, &sup9;&sup0;y, ²&sup0;³Pb, ¹&sup5;&sup5;Sm, ¹&sup0;¹Rh, &sup9;&sup7;Ru, &sup6;&sup7;Cu, ²&sup0;¹Tl, &sup9;&sup9;mTc, &sup5;&sup5;Co, ¹&sup8;&sup6;Re ¹&sup8;&sup8;Re ²¹²Bi ²¹³Bi.
  • Re, Re, Bi und Bi. Für paramagnetische Metallionen können Gd und andere ähnliche Metallionen verwendet werden. Für auf Fluoreszenz und Lumineszenz basierende Untersuchungen können Metallionen wie beispielsweise Tb, Eu, Ru und Rh verwendet werden.
  • Liganden, die sich sowohl zum Binden an Proteine sowie auch an Metallionen eignen, werden oft bifunktionelle Chelatbildner genannt. Zusätzlich zu ihrer metallbindenden Komponente besitzen diese Verbindungen auch reaktive Funktionsgruppen, die zum Binden an Proteine nützlich sind. Die reaktiven Funktionsgruppen sind auf diesem Fachgebiet bereits bekannt. Beispiele dieser Gruppen sind Isothiocyanat-, Bromacetamid-, Diaz-, N-Hydroxysuccinimid-Ester und -Anhydride. Diese Gruppen können in Chelatbildner eigebaut werden. Die Metallionen können einen Teil eines Linkermoleküls sein, das mehrere Kohlenstoffatome [(CH&sub2;)n] und mehrere andere Gruppen enthält. Einige Faktoren, die bei der Herstellung eines Immunkonjugats in Betracht gezogenen werden müssen, sind: (1) sie müssen stabil sein, (2) die Metallionen schnell binden und (3) die biologische Aktivität des Proteins aufrechterhalten. Die in dieser Erfindung beschriebenen Chelationsstrukturen erfüllen diese Bedingungen.
  • Zusätzlich zu den Chelatbildnern umfasst diese Erfindung die Synthese einer Familie von bifunktionellen Chelatbildnern, angefangen bei (p)-Nitrobenzylbromid und Diethylmalonat. Aus den kondensierten Produkten können verschiedene Amine wie beispielsweise (p)NO&sub2;-PH-CH&sub2;-CH(CH&sub2;NH&sub2;)&sub2;, (p)NO&sub2;-Ph-CH(CH&sub2;.CH&sub2;.NH&sub2;)&sub2; und
  • mit (p)NO&sub2;-Ph-CH&sub2; bei C-3 hergestellt werden. Sie sind die Schlüsselzwischenglieder, aus denen die metallbindenden Chelatbildner a und b in Figur 1 synthetisiert werden können. Diese Reagenzien besitzen ebenfalls eine reaktive Funktionsgruppe wie beispielsweise -NCS, -NH-CO-CH&sub2;Br oder -N&sub2;Br, die verwendet werden können, um sie an Proteine zu binden.
  • Herkömmliche Chelatbildner führen zu verschiedenen unterschiedlichen Produkten, wenn sie mit Proteinen (zum Beispiel Aggregate) gekoppelt werden. Oft kann die Verwendung von Linkern wie beispielsweise Dianhydride der Grund dafür sein. Durch die Verwendung von Linkern wie beispielsweise Isothiocyanat oder -N-CO- CH&sub2;Br können diese Komplikationen verhindert werden
  • Zum Herstellen der Chelate dieser Erfindung wurden alle Reaktionen in nichtwässrigen Lösungsmitteln wie beispielsweise Methanolmethylenchlorid und THF durchgeführt, und die Reinigung erfolgte durch Silicagelchromatographie. Es gibt zahlreiche bedeutende Aspekte für dieses Vorgehen. Durch die Verwendung der gleichen Reaktionssequenz erhielten wir chelatenthaltende Carboxylgruppen und/oder Phenoxylgruppen, makrozyklische Chelatbildner, Reagenzien, die zahlreiche metallbindende Gruppen enthalten und Reagenzien, die eine strukturmässig feste Komponente enthalten. Diese Reagenzien bieten eine grosse Vielfalt an Metallchelaten mit einzigartigen und nützlichen Eigenschaften. Weiter kann die definierte Reaktionssequenz verwendet werden, um verschiedene andere bifunktionelle Reagenzien sowie polymerische Sternberst-Liganden zu erhalten.
  • Durch die Verwendung der oben erwähnten Reaktionssequenz kann man eine Reihe von Reagenzien erhalten, die zum Binden verschiedener Metallionentypen an Proteine verwendet werden können wie beispielsweise LiLo für ¹¹¹In/&sup9;&sup0;y.
  • Diese Reagenzien können mit sanften und einfachen Mitteln an Proteine gekoppelt werden. Ein Verfahren umfasst das Inkubieren des Proteins und des Chelatbildners in einem geeigneten Puffer bei pH 6-9 für 1-3 Stunden bei 37ºC, sowie das Reinigen der durch Gelfilterungschromatographie gebildeten Proteinchelatkonjugate. Wir koppelten diese Reagenzien an menschliches Serumalbumin und das daraus resultierende chelatkonjugierte Albumin bindet Metalle wie beispielsweise &sup5;&sup7;Co mit sehr hohem Wirkungsgrad (> 95%). Die Proteine können monoklonale oder polyklonale Antikörper sein oder andere Proteine wie beispielsweise Transferrin, Albumin und deren Derivate. Man kann die Linker verändern, um eine maximale Immunreaktivität zu erhalten. Die Metallionen können Uebergangsmetallionen, paramagnetische, radioaktive und fluoreszierende/lumineszierende Metallionen, Lanthanide, Actinide und andere sein. Diese umfassen ohne sich auf sie zu beschränken Gd, Tb, Eu, Ru, Rh, Pd, Pb, Sm, Tb, Ga, In, Tl, Fe, Co, Ni, Re, Y, Tc, Cr, Os, Tr, Sb und Cu. Das Verfahren zum Binden der Metallionen umfasst das Inkubieren des Immunkonjugats mit einer Metallsalzlösung bei pH 5-9, bei Temperaturen von 20- 37ºC während eines Zeitraums von 0,5-6 Stunden, oder bei 4ºC während 24 Stunden, gefolgt von der Gelfilterungschromatographie.
  • Wenn das miteinbezogene Metallion nicht radioaktiv ist, kann das Metallchelatkonjugat zuerst hergestellt und gereinigt und danach an das Protein gebunden werden, um das Metallchelatproteinkonjugat zu bilden. Aufgrund der Anwesenheit von Polyamincarboxylaten im Fall von LiLo kann man leicht eine hohe Metallionenkonzentration erhalten. Bei der Radioimmuntherapie und der magnetischen Resonanzabbildung ist dies von grösster Wichtigkeit, da die Antikörperaufnahme durch Tumore in Patienten oftmals < 0,005% I.D/g ist.
  • Alle Reagenzien a und b in Figur 1 sind Polyamincarboxylate, die Radiometalle und andere Metallionen binden, und die an Proteine wie beispielsweise monoklonale Antikörper gebunden werden können. Die Wahl des Reagenzes ist abhängig von:
  • a. der Anwendung (oder vom Endgebrauch)
  • b. der Natur des Metallions
  • c. dem Protein (biologische Eigenschaften).
  • Als zum Beispiel LiLo1 an HSA gebunden und mit Indium-111 markiert wurde, und der Zerfallsgrad des Radioimmunkonjugats bei 37ºC durch eine DTPA-Verfolgungstechnik bestimmt wurde, fand man heraus, dass HSA-LiLo-¹¹¹In in einem Ausmass von < 1%/Tag ¹¹¹In verliert. Unter ähnlichen experimentellen Bedingungen verliert HSA-DTPA-¹¹¹In ¹¹¹In in einem Ausmass von 10% pro Tag. Diese Resultate zeigen, dass LiLo ein besserer Chelator für Indium sein kann als DTPA.
  • Die Anwesenheit von ungebundenen Metallionen im gereinigten Konjugat kann, falls vorhanden, bestimmt werden, indem Standardanalysetechniken wie beispielsweise Dünnschichtchromatographie (aufsteigend), NMR, IR oder Sicht- oder Fluoreszenzspektroskopie verwendet wird.
    • Beispiel I
  • Konjugation und Stabilitätsstudien:
  • Für Stabilitätsstudien wurde zuerst ein HSA-LiLo-Konjugat vorbereitet, indem HSA (30 mg/ml, 0,05M PBS-Lösung, pH7,2) während 2 Stunden mit LiLo (Molarverhältnis HSA:LiLo = 1:10) bei 37ºC reagierte. Ungebundenes Chelat wurde durch Gelfilterungschromatographie (G-50 Sephadex, Pharmacia) entfernt. Das Konjugat (HSA- LiLo) wurde gesammelt und die Proteinkonzentration durch Absorbtion bei 280 nm bestimmt. Die Herstellung von HSA-DTPA umfasste das Hinzufügen von DTPA-Dianhydrid zum HSA in einem PBS-Puffer (0,05m, pH7,2) und das Inkubieren während 15 Minuten bei Raumtemperatur. Ungebundenes Chelat wurde durch Gelfilterungschromatographie entfernt.
  • Das Konjugat wurde in einem Puffer (0,05M Citrat/0,5M Acetat, pH 5,5) mit In-111 markiert. DTPA wurde hinzugefügt, um jegliches ungebundene Indium-111 zu binden, und das markierte Konjugat wurde durch G-50- oder G-25-Gelfilterungschromatographie gereinigt. Die Reinheit des Immunkonjugats wurde durch ITLC in einem PBS-Puffer bestimmt, wobei Gelman-ITLC-SG-Chromatographiepapier verwendet wurde.
  • Stabilitätsstudien wurden in 0,05M PBS-Puffer mit pH 7,2 bei 37ºC durchgeführt. In periodischen Intervallen wurde ein Aliquot der Lösung entfernt und mit überschüssiger DTPA-Lösung behandelt, um jegliches dissoziierte ¹¹¹In zu chelieren. Eine Dünnschichtchromatographieanalyse wurde durchgeführt, indem ein ITLC-SG-Streifen (Gelman Sciences) in einem PBS-Puffer (0,05M, pH 7,2) verwendet wurde, der ITLC-Streifen wurde in zwei Teile geschnitten und die Indium-(111)-Aktivität wurde unter Verwendung eines Gammazählers bestimmt.
  • 100 x Radioaktivität am Bodenstreifen / Radioaktivität an den (Boden- + Decken-)Streifen
  • ist gleich dem an Protein gebundenen ¹¹¹In-Prozentsatz. Resultate, die mit ¹¹¹In-HSA-LiLo und ¹¹¹In-HSA-DTPA erhalten wurden, sind in Figur 3 dargestellt.
  • Der Chelator LiLo wurde ebenfalls an einen menschlichen monoklonalen Antikörper 16.88 konjugiert. Menschlicher monoklonaler Antikörper 16.88 ist ein IgM-Isotyp, der von einer spontan transformierten menschlichen Lymphoblastoidzellinie produziert wird, die von den peripheren Blutlymphozyten von Dickdarmkrebspatienten gewonnen werden, die das Epstein-Barr-Kernantigen exprimieren. Es wurde berichtet, dass das Binden von Radiometallen an IgM-Monoklone schwierig ist, verglichen mit IgG oder anderen Proteinen. Herkömmliche Chelatbildner wie beispielsweise DTPA- Anhydride führen zu einer Anhäufung der Antikörper; zusätzlich ist die Rückgewinnung des radiomarkierten MOAB gering. Eine derartig geringe Rückgewinnung wurde im Fall von radiomarkiertem 16.88-LiLo nicht festgestellt.
  • Der neue Chelatbildner LiLo wurde an 16.88 konjugiert. Durch einen kompetitiven Bindeversuch wurde die Immunaktivität dieser Konjugate im Vergleich mit unkonjugiertem 16.88 bestimmt. Bei diesem Versuch wurde Antigen auf eine Miktrotiterplatte aufgetragen und mit 16.88 behandelt, das mit Radioiod markiert war. Dies liess man dann mit unkonjugiertem 16.88 oder 16.88-LiLo vervollständigen. Die durch diesen Versuch erhaltenen Resultate zeigen, dass 16.88-LiLo genau so immunreaktiv war wie unkonjugiertes 16.88. Mit 16.88 erhaltene Resultate sind in Figur 4 dargestellt.
  • Die Anzahl Chelate pro MoAB wurde durch bekannte Verfahren des Standes der Technik bestimmt. Im allgemeinen umfasst dieses Verfahren das Beifügen von bekannten Mengen INCl&sub3;, das ¹¹¹InCl&sub3; enthält, zum Immunkonjugat, und Inkubieren des Gemischs in 0,05M Citrat/0,5M Acetatpuffer, pH 5,5, während 30 Minuten bei Raumtemperatur (23-27ºC). Danach wurde überschüssige DTPA-Lösung zugegeben, um das ungebundene Indium zu gelieren. Nach 5 Minuten wurde ein Aliquot der Mischung auf TLC (Dünnschichtchromatographie) getupft. Die Chromatographie wurde durchgeführt, indem 10%iges Ammoniumacetat (wässriges) und Methanol (Volumenverhältnis 1:1) als Eluierungsgemisch verwendet wurde. Mit ¹¹¹In markiertes Protein bleibt am ursprünglichen Ort, während sich In-DTPA bewegt (Rf=0,75). Durch Schneiden und Zählen der verschiedenen TLC-Teile könnte man die Anzahl Chelate pro Protein bestimmen, da die im Reaktionsgemisch miteinbezogenen Protein- und Indiumkonzentrationen bekannt sind. Normalerweise betrug dieses Verhältnis 1-5.
  • Die Immunreaktivität dieser Konjugate wurde ebenfalls durch einen direkten Zellbindungsversuch bestimmt, wie er von Lindmo, T. et al. J. Immunol.Meth, 72(1), 77-79(1984) vorgeschlagen wurde. Bei diesem Versuch wurden 16.88-Chelatkonjugate mit ¹¹¹In markiert und durch Gelfilterungschromatographie geklärt. Figur 5 beschreibt die Reinigung von (16.88)LiLo¹¹¹In durch Gelfilterungs-(Sephadex, G-25)-Chromatographie. Die erste Spitze (Fraktionen #3-#6, 0,9ml/Fraktion) enthält die Radioimmunkonjugate. Ein PBS-Puffer (0,05M, pH 72) wurde als Eluierungsmittel verwendet. Die markierten Konjugate wurde entweder mit WiDr- Zellinien oder den Antigenen inkubiert, und es wurde der Prozentsatz der an die Zellen oder Antigene gebundene Aktivität bestimmt. Die Immunreaktivität von 16.88-LiLo-¹¹¹In war > 95%.
  • Diese Resultate bestätigen, dass der Chelator LiLo verwendet werden kann, um ¹¹¹In ohne bedeutenden Immunaktivitätsverlust an menschliche monoklonale Antikörper zu binden.
  • Wie im Kall von HSA-Chelatorkonjugaten beobachtet war 16.88- LiLo-¹¹¹In in einer PBS-Pufferlösung (< 1% pro Tag) unter physiologischen Bedingungen stabil. Für ¹¹¹In und &sup9;&sup0;Y, das Eigenschaften aufweist, die denjenigen von Indium ähnlich sind, ist 16.88-LiLo ein gutes Konjugat für in vivo-Anwendungen.
    • Beispiel II
  • Die Synthese von LiLo ist in Figur 2 beschrieben. P-Nitrobenzylbromid wurde mit Diethylmalonat kondensiert, um p-Nitrobenzyldiethylmalonat zu erhalten. p-Nitrobenzyldiethylmalonat wurde direkt zu einem Diamin reduziert und mit DTPA kondensiert, um LiLo1 zu erhalten. Diese Kondensation wurde auf drei verschiedene Wege durchgeführt.
  • 1. Kondensation zwischen dem Diamin und dem DTPA-Nethylester.
  • 2. Koppelung zwischen dem Diamin und dem zyklischen DTPA-Anhydrid.
  • 3. Eine Reaktion zwischen dem Diamin und der DTPA-Säure durch das gemischte Anhydridverfahren.
  • In unseren Experimenten mit den Wegen 2 und 3 wurde das erhaltene Produkt in einen Methylester umgewandelt, mit Silicagelchromatographie gereinigt und in LiLo1 umgewandelt. Reduktion von Dinitril (III) zu einem Diamin, gefolgt von Carboxylmethylierung, Reduktion mit Wasserstoff in Anwesenheit von Palladium auf Aktivkohle und Behandlung mit CSCl&sub2; und Trifluoressigsäure ergaben LiLo2.
  • Einzelheiten der Synthese sind weiter unten angegeben:
  • A. 2(4-Nitrobenzyl)diethylmalonat(I):
  • 6,9g (0,3m) Natriummetal wurde einer gerührten Lösung von 300ml absolutem Ethanol unter einer Stickstoffatmosphäre stufenweise beigegeben. Nachdem sich alles Metall aufgelöst hatte wurden der Lösung 96g (0,6m) Diethylmalonat langsam tropfenweise zugegeben. Danach wurden 65g (0,3m) 4-Nitrobenzylbromid in Portionen über eine Stunde hinzugefügt. Die Lösung wurde während 24 Stunden unter Rückfluss erhitzt, und ausgefällte Beiprodukte wurden abfiltriert. Die Lösung wurde verdampft und das kristallisierte Produkt wurde filtriert und mit Ethanol gewaschen. Ertrag 34,9g(40%), m.pt.60ºC. Ir 1736cm&supmin;¹m, 1524cm&supmin;¹, 1346cm&supmin;¹, 1151cm&supmin;¹, 852cm&supmin;¹, KBr-Pellet. NMR, CDCl3, 8,14d, 2H; 7,37d, 2H; 4.15, q, 4H; 3,64,t 1H; 3,30, d.2H; 1.22,t,6H.
  • B. 2-(4-Nitrobenzyl)-1,3-propandiol (II):
  • 11,3g (0,038m) (I) wurde in 20ml wasserfreiem THF aufgelöst und in eine gerührte Lösung von 190ml 1M BH&sub3;-THF-Lösung eingespritzt unter einer Stickstoffatmosphäre bei 4ºC. Die Lösung wurde während 18 Stunden unter Rückfluss langsam erhitzt. Die Lösung wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt und Methanol wurde in kleinen Portionen zugefügt, um den überschüssigen BH&sub3;-Komplex zu quenchen. Die Lösung wurde dann unter Rotation verdampft. Eine weitere Reinigung wurde dann mit Silicagelchromatographie durchgeführt. Der Ertrag war 6,3g (78%), mpt. 85ºC. IR(KBr-Pellet) 3260 cm&supmin;¹, 1539 cm&supmin;¹, 1351 cm&supmin;¹, 1030 cm&supmin;¹. NMR 3,73ppm, d, 4H; 2,78ppm, d, 2H; 2, 35ppm, s, 2H; 2,03ppm, s, 1H.
  • C. 3-(4-Nitrobenzyl)1,5-pentandinitril(III):
  • 6,9g (0,036m)p-Toluolsulfonylchlorid (Tosyl) wurde in 10ml trockenem Pyridin aufgelöst und auf 4ºC abgekühlt. 2,5g (0,012m) II wurden in 5ml trockenem Pyridin verdünnt und langsam der gerührten Tosyllösung unter Kühlung beigemengt. Die Lösung wurde während 15 Minunten bei 4ºC gerührt, dann auf Raumtemperatur erwärmt und während 3 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde gequenched, indem die Lösung unter Rühren langsam in 100ml 30%iges HCL bei 4ºC gegossen wurde. Das Produkt wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert, verdampft und in Ethanol kristallisiert, um das Tosylderivat herzustellen. mpt 85-89C. IR(KBr-Pellet) 1524 cm&supmin;¹, 1352 cm&supmin;¹, 1194 cm&supmin;¹, 1176 cm&supmin;¹.
  • 3,1g KCN wurde in einer gerührten Lösung von 30 ml absolutem Ehtanol bei 4ºC suspendiert. Das obige Tosylderivat wurde in einer 1:1-Mischung von CH&sub2;CL&sub2;:EtOH aufgelöst und der KCN-Mischung zugefügt. Die Lösung wurde dann während 24 Stunden unter Rückfluss langsam erhitzt. Die Lösung wurde dann unter Rotation verdampft, mit CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert, filtriert und verdampft. Das Oel liess man dann durch eine Silicagelsäule fliessen, um als ein oranges Öl (III) isoliert zu werden. 1,9g Ertrag 70%, IR (NaCl- Platte) 2248 cm&supmin;¹, NMR 2,96ppm,s,2H; 2,5ppm,s,4H; 2, 13ppm,m, 1H.
    • Beispiel III Synthese von LiLo1:
  • A. 3-(4-Nitrobenzyl)diamidmalonat(VII):
  • 4,3g (I) wurden in 150 ml Methanol aufgelöst, auf 4ºC abgekühlt und es wurde Ammoniak bis zum Sättigungspunkt durch die Lösung gegeben. Die Lösung wurde verschlossen und während 48 Stunden bei 4ºC gehalten. Das ausgefällte Produkt wurde filtriert und mit Methanol gespült. IR (KBr-Pellet) 3441 cm&supmin;¹, 3392 cm&supmin;¹, 1678 cm&supmin;¹, 1657 cm&supmin;¹.
  • B. 2-(4-Nitrobenzyl)1,3-diaminpropan (VIII):
  • Dihydrochloridsalz
  • 2,0g (VII) wurden in THF (Tetrahydrofuran) (20ml) suspendiert und einer gerührten 60ml 1m BH3.THF-Lösung bei 4ºC zugegeben. Die Reaktion wurde während 15 Stunden unter Rückfluss langsam erhitzt. Die Lösung wurde mit Methanol gequenched, und es wurde ohne äussere Kühlung HCl hindurchgegeben, bis sich das Produkt als gelbes Oel abtrennte. Die Festkörper wurden abfiltriert und mit Methanol gespült. Ertrag 2,17g (91%), IR (KBr-Pellet) 2934 cm&supmin;¹, 1600 cm&supmin;¹, 1514 cm&supmin;¹, 1353 cm&supmin;¹.
  • C. Nitro-"LiLo"-Methylester (IX):
  • 300mg (VIII) und 3,3g DTPA-Pentamethylester wurden in 10ml trockenem Methanol aufgelöst und während 7 Tagen unter Rückfluss erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde verdampft und mittels Silicagelsäulenchromatographie gereinigt. Das Resultat war Fluorescamin-negativ. Ertrag 17,5%. IR (KBr-Pellet) 1741 cm&supmin;¹, 1654 cm&supmin;¹, 1348 cm&supmin;¹, 1204 cm&supmin;¹.
  • D. ICN-LiLo-Methylester(X):
  • 15mg (IX) wurden in 5ml Methanol aufgelöst und auf 4ºC abgekühlt. Eine katalytische Menge von 10% Palladiumkohle wurde unter Rühren zugefügt. H&sub2;-Gas wurde dann bei 4ºC durch das gerührte Reaktionsgemisch gegeben. Nach 10 Minuten wurde die Lösung auf 25ºC erwärmt und die Wasserstoffzugabe wurde für weitere 12 Stunden aufrechterhalten. Die Lösung wurde dann filtriert, um den Katalysator zu entfernen. Das Produkt wurde durch einen Fluorescamin-Versuch getestet und erwies sich für primäres Amin als positiv.
  • Die obige Lösung wurde bei 25ºC gerührt unter langsamer Zugabe von 0,1 ml Thiophosgen (5 Stunden). Die Lösung wurde dann zu einem orangen klebenden Film verdampft. Das IR (KBr-Pellet) zeigte NCS-Spitzen bei 2106&supmin;¹. Die Methylester wurden hydrolysiert und bis zur Trockenheit verdampft.
  • Synthese von LiLo1:
  • LiLo-Methylester (IX) wurde ebenfalls durch ein gemischtes Anhydridverfahren erhalten.
  • 1,0g (0,0025M) DTPA wurden in 30ml CH&sub2;Cl&sub2; suspendiert mit 2ml Triethylamin unter N2-ATM. Die Lösung wurde während 24 Stunden bei 25ºC gerührt, dann in einem Eis/Salz-Bad auf ungefähr 10ºC abgekühlt. 250ml (0,0025M) Ethylchlorformiat wurden dann der Lösung tropfenweise zugegeben. Die Lösung wurde während 25 Minuten gerührt, 367mg VIII (0,00125M) wurden dann mit 0,5ml Triethylamin in 5ml CH&sub2;Cl&sub2; aufgelöst und auf -5ºC abgekühlt. Dies wurde unter starkem Rühren der gemischten Anhydridlösung tropfenweise beigegeben. Die Lösung wurde während 2 Stunden unter 0ºC gehalten, dann wurde sie langsam auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht weitergerührt. Die Lösung wurde dann verdampft und der Rest in trockenem CH&sub3;OH (50ml) aufgelöst, 4ml Thionylchlorid wurden unter N&sub2;-ATM tropfenweise zugegeben. Die Lösung wurde dann während 5 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Die flüchtigen Stoffe wurden verdampft und der Rest liess man durch eine Silicasäule (CH&sub2;Cl&sub2; mit einem CH&sub3;OH-Gradient) fliessen. IR (KBr- Pellet) 1742 cm&supmin;¹, 1664 cm&supmin;¹, 1520 cm&supmin;¹, 1347 cm&supmin;¹, 1207 cm&supmin;¹.
    • Beispiel IV
  • LiLo1 wurde ebenfalls durch ein alternatives Verfahren hergestellt, wobei DTPA-Dianhydrid verwendet wurde. 20ml (VIII) wurden in 10ml Wasser aufgelöst. 105mg DTPA-Dianhydrid wurden Zugefügt und die Lösung bis zum Auflösen geschüttelt. Dies wurde während 5 Tagen bei 4ºC aufrechterhalten und dann sofort reduziert. Eine katalytische Menge von 10% Pd/C wurde zugegeben und Wasserstoff während 6 Stunden bei Raumtemperatur durch die Lösung gesprudelt, dann über Nacht unter einer Wasserstoffatmosphäre gerührt. Die Lösung wurde filtriert, unter Verwendung von Thiophosgen in Isothiocyanat umgewandelt und das überschüssige Thiophosgen mit Ether extrahiert. Das IR-Spektrum zeigte eine Spitze bei 2126 cm&supmin;¹, was für Isothiocyanat charakteristisch ist.

Claims (6)

1. Bifunktioneller Chelatbildner mit der Struktur
worin n 1 oder 2 ist.
2. Komplex, umfassend ein Radionuklid, das an den Chelatbildner von Anspruch 1 gebunden ist.
3. Komplex, umfassend ein Metall, das an den Chelatbildner von Anspruch 1 gebunden ist.
4. Komplex, umfassend ein Polypeptid, das an den Chelatbildner von Anspruch 1 gebunden ist.
5. Komplex nach Anspruch 4, worin das Polypeptid ein Antikörper ist.
6. Komplex nach Anspruch 4, umfassend ein Radionuklid, das an den Chelatbildner gebunden ist.
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