FI104409B - Kelaatinmuodostajia ja niitä sisältäviä, diagnostiikassa käytettäviä komplekseja - Google Patents

Kelaatinmuodostajia ja niitä sisältäviä, diagnostiikassa käytettäviä komplekseja Download PDF

Info

Publication number
FI104409B
FI104409B FI910329A FI910329A FI104409B FI 104409 B FI104409 B FI 104409B FI 910329 A FI910329 A FI 910329A FI 910329 A FI910329 A FI 910329A FI 104409 B FI104409 B FI 104409B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
solution
metal ions
lilo
protein
metal
Prior art date
Application number
FI910329A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI910329A0 (fi
Inventor
Ramaswamy Subramanian
James L Colony
Original Assignee
Akzo Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Akzo Nv filed Critical Akzo Nv
Publication of FI910329A0 publication Critical patent/FI910329A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI104409B publication Critical patent/FI104409B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B59/00—Introduction of isotopes of elements into organic compounds ; Labelled organic compounds per se
    • C07B59/008—Peptides; Proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/76—Metal complexes of amino carboxylic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/595—Polyamides, e.g. nylon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6883—Polymer-drug antibody conjugates, e.g. mitomycin-dextran-Ab; DNA-polylysine-antibody complex or conjugate used for therapy
    • A61K47/6885—Polymer-drug antibody conjugates, e.g. mitomycin-dextran-Ab; DNA-polylysine-antibody complex or conjugate used for therapy the conjugate or the polymer being a starburst, a dendrimer, a cascade
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6887—Antibody-chelate conjugates using chelates for therapeutic purposes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/081—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins the protein being an albumin, e.g. human serum albumin [HSA], bovine serum albumin [BSA], ovalbumin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/088—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins conjugates with carriers being peptides, polyamino acids or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1093—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B59/00—Introduction of isotopes of elements into organic compounds ; Labelled organic compounds per se
    • C07B59/001—Acyclic or carbocyclic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B59/00—Introduction of isotopes of elements into organic compounds ; Labelled organic compounds per se
    • C07B59/002—Heterocyclic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/34—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups
    • C07C233/42—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C233/43—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by a carbon atom of a six-membered aromatic ring having the carbon atom of the carboxamide group bound to a hydrogen atom or to a carbon atom of a saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C245/00—Compounds containing chains of at least two nitrogen atoms with at least one nitrogen-to-nitrogen multiple bond
    • C07C245/20—Diazonium compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D211/00—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings
    • C07D211/04—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D211/06—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D211/36—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D211/56—Nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F13/00—Compounds containing elements of Groups 7 or 17 of the Periodic Table
    • C07F13/005—Compounds without a metal-carbon linkage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
    • C07F5/003—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table without C-Metal linkages
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/534—Production of labelled immunochemicals with radioactive label
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2123/00—Preparations for testing in vivo

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)

Description

104409
Kelaatinxnuodostajia ja niitä sisältäviä, diagnostiikassa käytettäviä komplekseja Tämä keksintö koskee uusia kelaatinmuodostajia, 5 jotka soveltuvat metalli-ionien liittämiseen proteiineihin, kuten esimerkiksi albumiiniin, transferriiniin, vasta-aineisiin yms. Tämä keksintö koskee edelleen komplekse- .
ja, joita käytetään diagnostisissa menetelmissä ja jotka perustuvat uusiin kelaatin muodostajiin.
10 Keksinnön tausta
Metalli-ionien liittäminen proteiineihin johtaa moniin käyttökelpoisiin tuotteisiin. Niihin kuuluvat pro- 1
teiinit, joihin on liitetty fluoresoivia, radioaktiivisia tai paramagneettisia metalli-ioneja ja joita voidaan käyt- I
15 tää koettimina in vivo biologisissa systeemeissä ja in L
vitro analyysisysteemeissä, kuten esimerkiksi radioimmuno- “
logisissa määrityksissä. Esimerkiksi radionuklidien liit- L
täminen monoklonaalisiin vasta-aineisiin, jotka tunnista- _ vat kasvaimiin liittyviä antigeenejä, antaa tulokseksi 20 radioimmuunikonjugaatteja, joita voidaan käyttää syövän _ diagnosoinnissa. Monoklonaalisia vasta-aineita käytetään kuljettamaan haluttuja aineita spesifisiin kohtiin in vi- 1 vo. Useiden kelaatinmuodostajien, kuten esimerkiksi die- ^ tyleenitriamiinipentaetikkahapon (DTPA), etyleenidiamiini- ir
: ' 25 tetraetikkahapon (EDTA) ja makrosyklisten yhdisteiden, on T
raportoitu muodostavan stabiileja komplekseja proteiiniin Z
liitettäessä. Radioimmuunikonjugaatin tai kelaatin kineet- z tinen epästabiilisuus fysiologisissa olosuhteissa johtaa _ kuitenkin näiden kompleksien hajoamiseen. Huolimatta mo- ^ 30 nista yrityksistä muuntaa sitoutumistapaa, kelaatin raken- = „ ’· netta jne., sellaisten radioimmuunikonjugaattien antami- Γ • . =· sesta ifl vivo on seurauksena radioaktiivisuuden kasaantu- f- minen muihin kuin kohdekudoksiin, erityisesti maksaan. Sen z vuoksi on olemassa aivan ilmeinen sellaisten uusien kelaa- z 35 tinmuodostajien tarve, jotka soveltuvat radioaktiivisten • » 104409 2 metallien liittämiseen vasta-aineisiin sellaisten kompleksien muodostamiseksi, jotka eivät hajoa potilaalle annettaessa.
Yhteenveto keksinnöstä 5 Tämän keksinnön päämääränä on tarjota käytettäväksi uusi ryhmä kelaatinmuodostajia, jotka soveltuvat metalli-ionien liittämiseen proteiineihin, ja saada siten aikaan vasta-aine-kelaattikonjugaattia sisältävä vesiliuos, joka on stabiili in vivo.
10 Lisäksi tämän keksinnön päämääränä on tarjota käy tettäväksi ryhmä kelaatinmuodostajia monien erilaisten ; metalli-ionien sitomiseksi mukaan luettuina In, Y, Gd, Tb, = Cu, Co, Sm, Rh, Ru, Re, Te, Fe, Pb, Ba, aktinidit, lanta- nidit sekä siirtymämetalli-ionit.
15 Lisäksi tämän keksinnön päämäränä on valmistaa uu- 1 siä kelaatiorakenteita, joita voidaan käyttää metalli-io- - nien liittämiseen proteiineihin, monoklonaaliset vasta-ai- J neet mukaan luettuina.
ί
Yhtenä tämän keksinnön päämääränä on saada aikaan « 20 monipuolisia kelaatinmuodostajia, jotka soveltuvat paitsi - moolimassaltaan pienten proteiinien, kuten esimerkiksi alii bumimin ja IgG:n, myös moolimassaltaan suurten proteiini-^ en, kuten esimerkiksi IgM-.n (9 x 105) , lipoproteiinien (2 x ^ 106) jne., sitomiseen.
: 25 Yhtenä tämän keksinnön päämääränä on vielä saada aikaan parempi menetelmä metallikelaatti-vasta-ainekonju-gaattien valmistamiseksi.
; Lisäksi tämän keksinnön päämääränä on saada aikaan - kelaatiorakenteita, jotka tarjoavat suuren metalli-ionipi-* j 30 toisuuden vasta-ainemolekyyliä kohden tuhoamatta konjugoi- ; dun proteiinin biologista aktiivisuutta merkittävässä mää- L rin.
Eräänä tämän keksinnön päämääränä on vielä saada aikaan fluoresoivalla aineella leimattuja proteiineja 1 35 liittämällä proteiini-kelaattikonjugaatteihin fluoresoi- s via/luminesoivia metalli-ioneja.
104409 3
Lisäksi tämän keksinnön päämääränä on saada aikaan metalli-ioneja sitovia reagensseja, joita voidaan liittää kromatografisissa pylväissä käytettäviin aineisiin, kuten esimerkiksi polymeereihin ja geeleihin, jolloin muodostuu 5 kelaattiaffiniteettikolonneja.
Nämä ja muut tavoitteet saavutetaan yhdellä tai useammalla tämän keksinnön mukaisella suoritusmuodolla.
Lyhyt selostus piirroksista
Keksinnön mukaiset bifunktionaaliset kelaatinmuo-10 dostajat on esitetty kuviossa 1. Kuviossa 1 "a" on LiLol ja "b" on LiLo2.
Kuvio 2 valaisee synteesimenetelmiä metalleja sitovan kelaatinmuodostan LiLo aikaansaamiseksi.
Kuviossa 3 on verrattu indium-111:llä leimatun HSA-15 LiLol:n ja HSA-DTPA:n stabiilisuutta fosfaattipuskuroidus- sa fysiologisessa suolaliuoksessa (PBS; 0,05 M, pH 7,2) 37 °C:ssa.
Kuviossa 4 on verrattu proteiini-kelaattikonjugaa-tin (IgM-isotyyppiä olevan ihmisen monoklonaalisen vasta-20 aineen 16-88, johon on konjugoitu LiLol) biologista aktiivisuutta konjugoimattoman proteiinin (16-88) biologiseen ~ aktiivisuuteen.
Kuvio 5 valaisee (16-88)LiLomIn:n puhdistusta gee-lisuodatuskromatografiän avulla.
; ' 25 Edullisten suoritusmuotojen kuvaus
Keksintö koskee kalaatinmuodostajaa, jolla on kaava : /—COO OOC—s.
/ N v N\ / \— coo OOC_/ \ l OOC—\ ) 30 30 / N—coo \
I y COO OOC—v J
' .· \ n/ \ N/ n— CONH HNOC—/ (CH2>n <^2>n 104409 4 jossa n on 1 tai 2.
Keksintö koskee myös diagnostisessa menetelmässä käytettävää kompleksia, joka sisältää edellä kuvattuun kelaatinmuodostajaan sitoutunutta radionuklidia.
5 Keksintö koskee edelleen diagnostisessa menetelmäs sä käytettävää kompleksia, joka sisältää edellä kuvattuun kelaatinmuodostajaan sitoutunutta metallia. Keksintö koskee lisäksi diagnostisessa menetelmässä käytettävää kompleksia, joka sisältää edellä kuvattuun kalaatinmuodosta-I 10 jaan sitoutunutta polypeptidiä.
Yksi tämän keksinnön mukainen suoritusmuoto koskee puskuroitua liuosta, joka sisältää vasta-aine- tai prote-Ξ iini-kelaattikonjugaattia, jossa kaikki metalli-ionit ovat sitoutuneet proteiiniin kelaatinmuodostajan välityksellä. 15 Radioaktiivisten metallien liittäminen vasta-ainei siin edellyttää ensin ligandien liittämistä vasta-aineisiin. Ligandit, joita nimitetään myös kelaatinmuodostajik-si, ovat sellaisia yhdisteitä, jotka sitovat radioaktiivi-, siä metalleja tehokkaasti muodostamalla koordinaatiosidok- 20 siä. Radioaktiivisten metallien sitomiseen käytetään sei-
A
laisia ligandeja kuin polyaminokarboksyylihapot, makrosyk-liset yhdisteet, kruunueetterit, kryptandit ja syklamii-ä nit. Ligandin valinta riippuu kulloinkin sidottavan radio- nuklidin valinnasta ja konjugoitavan proteiinin ominai- · 25 suuksista. Radioimmunologista kuvausta ajatellen kiinnos- * tavia radionuklideja ovat 311In, 90Y, 203Pb, 155Sm, 101Rh, 97Ru, 1 67Cu, 201T1, 99mTc, 55Co, iasRe, 18BRe, 212Bi ja 213Bi. Mitä para- I magneettisiin metalli-ioneihin tulee, voidaan käyttää Gd:a ja muita samankaltaisia metalli-ioneja. Mitä fluoresens-30 siin tai luminesenssiin perustuviin tutkimuksiin tulee, * » ; voidaan käyttää sellaisia metalli-ioneja kuin Tb, Eu, Ru * j a Rh.
Ligandeja, jotka soveltuvat liitettäviksi sekä pro-teiineihin että metalli-ioneihin, kutsutaan usein bi-] 35 funktionaalisiksi kelaatinmuodostajiksi. Sen lisäksi, että a ϊΐ i 104409 5 nämä yhdisteet sisältävät metalliin sitoutuvan osan, niissä on myös proteiineihin liittämiseen soveltuvia reaktiivisia funktionaalisia ryhmiä. Reaktiiviset funktionaaliset ryhmät ovat alalla jo tunnettuja. Esimerkkejä näistä ryh-5 mistä ovat isotiosyanaatti-, bromiasetamidi- ja diatsoryh-mät, N-sukkiini-imidiesterit ja anhydridit. Kelaatinmuo-dostajiin voidaan sisällyttää näitä ryhmiä. Metalli-ionit voivat olla osana jotakin kytkijämolekyyliä, joka sisältää useita hiiliatomeja [(CH2)n] sekä useita muita ryhmiä.
10 Eräitä seikkoja, jotka on otettava huomioon immuunikonju- gaattia muodostettaessa, ovat seuraavat: (1) niiden täytyy olla stabiileja, (2) sitoa helposti metalli-ioneja ja (3) säilyttää proteiinin biologinen aktiivisuus. Tässä keksinnössä kuvattavat kelaatiorakenteet täyttävät nämä olosuh- 15 devaatimukset.
Kelaatinmuodostajien lisäksi kuvataan erään bifunk- 7 tionaalisten kelaatinmuodostajien ryhmän valmistus käyttäen lähtöaineina p-nitrobentsyylibromidia ja dietyylima- 7 lonaattia. Kondensaatiotuotteista voidaan valmistaa monia 20 amiineja, kuten esimerkiksi p-N02-Ph-CH2-CH (CH2-NH2) 2, p-N02-
Ph-CH (CH2-CH2-NH2) 2 ja u jossa p-N02-Ph-CH2 sijaitsee asemassa C-3. Ne ovat avain-30 asemassa olevia välituotteita, joista kuviossa 1 esitetyt ~ metalleja sitovat kelaatinmuodostajat voidaan valmistaa. : Nämä reagenssit sisältävät myös sellaisen reaktiivisen ' funktionaalisen ryhmän, kuten esimerkiksi ryhmän -NCS, -NH-CO-CH2Br tai -N2Br, jota voidaan käyttää niiden liittä- =.
35 miseen proteiineihin.
1 104409 6
Tavanomaiset kelaatinmuodostajat johtavat useisiin eri tuotteisiin (esim. aggregaatteihin), kun ne liitetään yhteen proteiinien kanssa. Usein syynä tähän saattaa olla · kytkijöiden, kuten esimerkiksi dianhydridien, käyttö. Nämä 5 ongelmat vältetään käyttämällä sellaisia kytkijöitä kuin isotiosyanaatti ja -NH-CO-CH2Br.
Kaikki reaktiot tämän keksinnön mukaisten kelaat-tien valmistamiseksi toteutettiin vettä sisältämättömissä i liuottimissa, kuten esimerkiksi metanolissa, metyleeniklo-10 ridissa tai THF:ssa, ja puhdistus tapahtui silikageelikro-matografian avulla. Tähän menettelytapaan liittyy useita ; merkittäviä näkökohtia. Olemme saaneet samaa reaktiosarjaa käyttäen aikaan kelaatteja, jotka sisältävät karboksyyli-ryhmiä ja/tai fenoksyyliryhmiä, makrosyklisiä kelaatinmuo-15 dostajia, reagensseja, jotka sisältävät useita metallin s sitovia ryhmiä, sekä reagensseja, jotka sisältävät konfor- maatiollisesti jäykän osan. Nämä reagenssit tarjoavat laajan valikoiman metallikelaatteja, joilla on ainutlaatuisia j ja hyödyllisiä ominaisuuksia. Lisäksi esitettyä reaktio- n 20 sarjaa voidaan käyttää useiden muiden bifunktionaalisten ' reagenssien samoin kuin polymeeristen starburstligandien j aikaansaantiin.
Edellä mainittua reaktiosarjaa käyttäen voidaan saada aikaan joukko reagensseja, jotka soveltuvat eri • 25 tyyppisten metalli-ionien liittämiseen proteiineihin, esi merkiksi LiLo 111In:n/90Y:n liittämiseen.
Reagenssit voidaan liittää yhteen proteiinien kans- sa hellävaraisin ja yksikertaisin keinoin. Yksi menetelmä sisältää proteiinin ja kelaatinmuodostajien inkuboinnin : 30 sopivassa puskurissa pH:ssa 6 - 9 ja 37 °C:n lämpötilassa ' 1-3 tuntia ja muodostuvan proteiini-kelaattikonjugaatin ; * puhdistuksen geelisuodatuskromatografiän avulla. Me lii timme reagensseja ihmiseen seerumialbumiiniin, ja tulokseksi saaatava kelaattiin konjugoitu albumiini sitoo me-35 talleja, kuten esimerkiksi 57Co:a, erittäin tehokkaasti 104409 7 (tehokkuus >95 %). Proteiinit voivat olla monoklonaalisia tai polyklonaalisia vasta-aineita tai muita proteiineja, joista esimerkkejä ovat transferriini, albumiini ja niiden johdannaiset. Suurimman mahdollisen immuunireaktiivisuuden 5 saavuttamiseksi kytkijöitä voidaan muuntaa. Metalli-ionit voivat olla siirtymämetalli-ioneja, paramagneettisia, radioaktiivisia tai fluoresoivia/luminesoivia metalli-ione- ! ja, lantanideja, aktinideja tai muita. Niihin kuuluvat Gd,
Tb, Eu, Ru, Rh, Pd, Pb, Sm, Ga, In, Tl, Fe, Co, Ni, Re, Y, 10 Te, Cr, Os, Ir, Sb ja Cu, mutta ne eivät rajoitu tässä mainittuihin. Menetelmä metalli-ionien liittämiseksi käsittää immuunikonjugaatin inkuboinnin metallisuolaliuoksen kanssa pH-.ssa 5 - 9 ja 20 - 37 °C:n lämpötilassa 0,5-6 tuntia tai 4 °C:n lämpötilassa 24 tuntia sekä sitä seuraa- r 15 van geelisuodatuskromatografiapuhdistuksen. -
Mikäli liitettävä metalli-ioni ei ole radioaktiivinen, voidaan ensin valmistaa metallikelaattikonjugaatti ja ”
puhdistaa se, ja se voidaan sitten liittää proteiiniin me- Z
tallikelaatti-proteiinikonjugaatin aikaansaamiseksi. Poly-20 aminokarboksylaattiryhmien läsnäolon vuoksi voidaan LiLo:n
ja muiden korkeampien analogien tapauksessa saavuttaa helposti suuri metalli-ionipitoisuus. Tämä on ensiarvoisen I
tärkeätä radioimmmunologisessa diagnostiikassa ja magneet- Z
tiseen resonanssiin perustuvassa kuvauksessa, koska kas- ‘ ' 25 vaimen vastaanottama vasta-ainemäärä on potilailla usein alle 0,005 % ID:stä/g.
Kuviossa 1 esitetyt reagenssit a ja b ovat poly-karboksylaatteja, jotka sitovat radioaktiivisia ja muita metalli-ioneja ja jotka voidaan liittää proteiineihin, ku-30 ten esimerkiksi monoklonaalisiin vasta-aineisiin. Reagens-sin valinta riippuu a. sovelluksesta (eli lopullisesta käytöstä) b. metalli - ionin luonteesta c. proteiinista (biologisista ominaisuuksista). - * 104409 8
Esimerkiksi, kun LiLol liitettiin HSA:han ja leimattiin indium-111:llä ja määritettiin radioimmuunikonjugaatin hajoamisen nopeus 37 °C:ssa DTPA-jäijitystekniikalla, havaittiin HSA-LiL01-111In: stä häviävän luIn:tä alle 1 %/vuo-5 rokausi. Samanlaisissa koeolosuhteissa HSA-DTPA-niIn menettää 11TIn:tä nopeudella 10 %/vuorokausi. Nämä tulokset osoittavat, että LiLo saattaa olla indiumin tapauksessa parempi kelaatinmuodostaja kuin DTPA.
Mahdollisten sitoutumattomien metalli-ionien läsnä-10 olo puhdistetussa konjugaatissa voidaan määrittää tavano- « maisilla analysointitekniikoilla, kuten esimerkiksi ohut- kerroskromatografiän (nousevan) tai NMR-, IR-, näkyvän tai z fluoresenssispektroskopian avulla.
Esimerkki I
= 15 Konjugoitumis- ja stabiilisuustutkimukset:
Stabiilisuustutkimuksia varten valmistettiin ensin HSA-LiLo-konjugaatti antamalla HSA:n (30 mg/ml, 0,05 M ! PBS-liuos, pH 7,2) reagoida LiLo:n kanssa (HSA:n ja LiLo:n moolisuhde 1:10) 37 °C:ssa 2 tuntia. Sitoutumaton kelaatti 20 poistettiin geelisuodatuskromatografiän avulla (G-50 = Sephadex, Pharmacia). Konjugaatti (HSA-LiLo) kerättiin talteen ja proteiinipitoisuus määritettiin aallonpituudella 280 nm tapahtuvan absorption perusteella. HSA-DTPA:n Ϊ valmistus käsitti DTPA-dianhydridin lisäyksen PBS-pusku-^ ' 25 rissa (0,05 M, pH 7,2) olevaan HSA:han ja niiden inkuboin- ] nin huoneen lämpötilassa 15 minuutin ajan. Sitoutumaton i kelaatti poistettiin edellä kuvatun geelisuodatuskromato- J grafian avulla.
Konjugaatti leimattiin In-lll:llä puskurissa 30 (0,05 M sitraatti - 0,5 M asetaatti, pH 5,5), mahdollisen sitoutumattoman indium-111:n sitomiseksi lisättiin " " DTPA:ta, ja leimattu konjugaatti puhdistettiin G-50- tai G-25 -geelisuodatuskromatografiän avulla. Immuunikonjugaa-1 tin puhtaus määritettiin ITLC:n avulla PBS-puskurissa !; 35 Gelman ITLC-SG -kromatografiapaperia käyttäen.
a ä 9 104409 9
Stabiilisuustutkimukset tehtiin PBS-puskurissa (0,05 M, pH 7,2) 37 °C:ssa. Määrätyin aikavälein pieni osa liuoksesta poistettiin ja käsiteltiin ylimäärällä DTPA-liuosta kaiken dissosioituneen 111In:n kelatoimiseksi.
5 Tehtiin ohutkerroskromatografia-analyysi PBS-puskurissa (0,05 M, pH2 7,2) ITLC-SG-liuskaa (Gelman Sciences) käyttäen, ITLC-liuska leikattiin kahtia, ja määritettiin in- : ! dium-lll-aktiivisuus gammalaskuria käyttäen. Proteiiniin sitoutuneen i;L1In:n prosenttiosuus on 10 _100 x alaliuskan radioaktiivisuus_ ala- ja yläliuskan radioaktiivisuuden summa i:ilIn-HSA-LiLo : 11a ja li:iIn-HSA-DTPA: 11a saadut tulok-15 set on esitetty kuviossa 3.
Kelaatinmuodostaja LiLo konjugoitiin myös ihmisen ; monoklonaaliseen vasta-aineeseen 16-88. Ihmisen mono- klonaalinen vasta-aine 16-88 on IgM-isotyyppi, jota tuot- l taa spontaanisti transformoitunut lymfoblastoidisolulinja, " 20 joka on saatu paksusuolensyöpäpotilaiden ääreisveren lym- ~ fosyyteistä ja joka tuottaa Epstein-Barr-tuma-antigeenia. !
Radioaktiivisten metallien liittämisen monoklonaalisiin IgM-vasta-aineisiin on mainittu olevan vaikeata IgG-vasta- Γ aineisiin tai muihin proteiineihin liittämiseen verrattu-·, 25 na. Tavanomaiset kelaatinmuodostajat, kuten DTPA-anhydri- _ dit, johtavat vasta-aineen aggregoitumiseen; lisäksi ra- 1 dioaktiivisesti leimatun MoAbm talteensaanti jää heikoksi. Sellaista huonoa talteensaantia ei havaittu radioak-tiivisesti leimatun 16-88-LiLo:n tapauksessa.
30 Uusi kelaatinmuodostaja LiLo konjugoitiin mono- L
klonaaliseen vasta-aineeseen 16-88. Konjugaatin immunolo- = ginen aktiivisuus konjugoimattomaan vasta-aineeseen 16-88 Γ verrattuna määritettiin kompetitiivisen sitoutumisen tes-tauksella. Tässä testissä mikromaljalle levitettiin anti-35 geeniä, joka käsiteltiin radioaktiivisella jodilla leima- Γ7 • » 104409 10 tulla 16-88:11a. Tämän annettiin sitten kilpailla konju-goimattoman 16-88:n tai 16-88-LiLo:n kanssa. Tämän testin tulokset osoittavat, että 16-88-LiLo oli yhtä immuunireak-j tiivinen kuin konjugoimaton 16-88. 16-88:11a saadut tulok- 5 set on esitetty kuviossa 4.
Kelaattien lukumäärä MoAb:ta kohden määritettiin alalla tunnetuin menetelmin. Yleensä tässä menetelmässä immuunikonjugaattiin lisättiin jokin tunnettu määrä InCl3:a, joka sisälsi 111InCl3:a, ja seosta inkuboitiin 10 0,05 M sitraatti - 0,5 M asetaatti -puskurissa (pH 5,5) * huoneen lämpötilassa (23 - 27 °C) 30 minuuttia. Tämän jäl keen lisättiin ylimäärin DTPA-liuosta sitoutumattoman in-diumin kelatoimiseksi. 5 minuutin kuluttua osasta seosta muodostettiin täplä TLC-liuskalle (ohutkerroskromatogra-15 fialiuskalle). Kromatogrammi ajettiin käyttäen eluenttina 10-%:isen ammoniumasetaatin (vesiliuoksen) ja metanolin l seosta (tilavuussuhde 1:1). 111In:llä leimattu proteiini jää lähtöpisteeseen, kun taas In-DTPA liikkuu (Rf = 0,75).
Leikkaamalla TLC-liuskan eri osat irti ja suorittamalla . 20 niistä laskenta kyettiin määrittämään kelaattien lukumäärä proteiinia kohden, koska proteiinin ja indiumin alkuperäiset pitoisuudet reaktioseoksessa ovat tunnettuja. Tavalli-ij sesti tämän suhde oli 1-5.
Konjugaattien immuunireaktiivisuuskin määritettiin
M
2 5 T. Lindmon ai. , J. Immunol. Meth. 72 (1984), nro 1, 1 la - 79, esittämällä suoraan soluun sitoutumisen testauk- i sella. Tässä testissä 16-88-kelaattikonjugaatit leimattiin « : 111In:llä ja puhdistettiin geelisuodatuskromatografiän avul la. Kuvio 5 kuvaa 16-88-LiLo-inIn:n puhdistusta geelisuoda-30 tuskromatografiän avulla (Sephadex G-25). Ensimmäinen huippu (jakeet nro 3 - 6, 0,9 ml/jae) sisältää radioim- muunikonjugaatit. Eluenttina käytettiin PBS-puskuria (0,05 M, pH 7,2). Leimattuja konjugaatteja inkuboitiin joko WiDr-solulinjojen tai antigeenin kanssa, ja määritet-ϋ 35 tiin soluihin tai antigeeniin sitoutuneen aktiivisuuden n Ϊ ·’· ίβ 104409 11 prosentuaalinen osuus. 16-88-LiLo-111In:n immuunireaktiivi-suus oli yli 95 %.
Nämä tulokset vahvistavat sen, että kelaatinmuodos-tajaa LiLo voidaan käyttää 111In:n liittämiseen ihmisen mo-5 noklonaaliseen vasta-aineeseen 16-88 ilman immunologisen aktiivisuuden merkittävää menetystä.
Niin kuin HSA-kelaatinmuodostajakonjugaattien tapauksessa havaittiin, 16-88-LiLo-ulIn oli stabiili PBS-pus- ' kurissa (<1 %/vuorokausi) fysiologisissa olosuhteissa 10 Mitä tulee i:ilIn:een ja 90Y:een, joka on ominaisuuksiltaan indiumin kaltainen, 16-88-LiLo on hyvä konjugaatti iji vivo -sovelluksia ajatellen.
Esimerkki II
LiLo:n synteesi on esitetty kuviossa 2. p-nitro-15 bentsyylibromidi kondensoitiin dietyylimalonaatin kanssa, jolloin saatiin p-nitrobentsyylidietyylimalonaatti.
p-nitrobentsyylidietyylimalonaatti pelkistettiin suoraan diamiiniksi ja kondensoitiin DTPAzn kanssa, jolloin saatiin LiLol. Tämä kondensointi toteutettiin kolmel- ’ 20 la eri tavalla.
1. Kondensoimalla diamiini DTPA:n metyyliesterin 1 kanssa.
2. Kondensoimalla diamiini DTPA:n syklisen anhydri- ~ din kanssa.
*.25 3. Antamalla diamiinin reagoida DTPA-hapon kanssa ” seka-anhydridimenetelmällä. u
Kokeissamme, joissa noudatettiin teitä 2 ja 3, saatu tuote muunnettiin metyyliesteriksi, puhdistettiin sili- ϊ
kageelikromatografiän avulla ja muunnettiin LiLol:ksi. Di- I
30 nitriilin (III) pelkistys diamiiniksi sekä sitä seuranneet . t· karboksimetylointi, pelkistys vedyllä aktiivihiilikantoai- I
neella olevan palladiumin ollessa läsnä ja käsittely CSCl2:lla ja trifluorietikkahapolla tuottivat tulokseksi |
LiLo2:n.
« 104409 12
Yksityiskohtia synteesistä on esitetty alla: A. 2-(4-nitrobentsyyli)dietyylimalonaatti (I): 6.9 g (0,3 mol) natriummetallia lisättiin vähitellen 300 ml:aan absoluuttista etanolia, jota sekoitettiin 5 typpikaasukehän alla. Kaiken metallin liuettua liuokseen lisättiin hitaasti pisaroittain 96 g (0,6 mol) dietyylima-lonaattia. Tämän jälkeen lisättiin vähitellen 1 tunnin aikana 65 g (0,3 mol) 4-nitrobentsyylibromidia. Liuosta refluksoitiin 24 tuntia, ja saostunut sivutuote poistet-10 tiin suodattamalla. Liuos haihdutettiin, ja kiteytynyt ' tuote erotettiin suodattamalla ja pestiin etanolilla.
Saanto 34,9 g (40 %) , sp. 60 °C. IR-spektri (KBr-pellet- , ti) : 1736 cm'1, 1524 cm"1, 1346 cm'1, 1151 cm'1, 852 cm"1.
NMR-spektri (CDCl3) : 8,14 (d, 2 H), 7,37 (d) , 4,15 (9, ^ 15 4 H), 3,64 (t, 1 H), 3,30 (d, 2 H), 1,22 (t, 6 H).
B. 2-(4-nitrobentsyyli-1,3-propaanidioli (II): 11,3 g (0,038 mol) yhdistettä I liuotettiin 20 ml:aan vedetöntä THF:a ja ruiskutettiin 190 ml:aan 1 M BH3-THF-liuosta, jota sekoitettiin typpikaasukehän alla I 20 4 °C:ssa. Liuos kuumennettiin hitaasti kiehuvaksi ja sitä refluksoitiin 18 tuntia. Liuos jäähdytettiin sitten huoneen lämpötilaan ja lisättiin metanolia pienissä erissä ylimääräisen BH3-kompleksin tuhoamiseksi. Sen jälkeen liuos s haihdutettiin pyöröhaihduttimella. Jatkopuhdistus toteu- : · 25 tettiin silikageelikromatografiän avulla. Saanto oli 6,3 g l (78 %) , sp. 85 °C. IR-spektri (KBr-pelletti) : 3260 cm'1, \ 1539 cm'1, 1351 cm"1, 1030 cm"1. NMR-spektri: 3,73 ppm (d, 4 H), 2,78 ppm (d, 2 H), 2,35 ppm (s, 2 H), 2,03 ppm (s, 1 H) .
30 C. 3 -(4-nitrobentsyyli)-1,5-pentaanidinitriili (III): : « 6.9 g (0,036 mol) p-tolueenisulfonyylikloridia (to- - syylikloridia) liuotettiin 10 ml:aan kuivaa pyridiiniä ja
J jäähdytettiin 4 °C:seen. 2,5 g (0,012 mol) yhdistettä II
- 35 laimennettiin 5 ml :11a kuivaa pyridiiniä ja lisättiin hi- - taasti ja samalla jäähdyttäen tosyylikloridiliuokseen, « - · < m 13 104409 jota sekoitettiin. Liuosta sekoitettiin 4 °C:ssa 15 minuuttia, ja sen jälkeen sen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan ja sitä sekoitettiin 3 tuntia. Reaktio tukahdutettiin kaatamalla liuos hitaasti ja samalla sekoittaen 5 100 ml:aan 30-%:ista HCl:a, jonka lämpötila oli 4 °C. Tuo te uutettiin CH2Cl2:iin, liuotin haihdutettiin ja tuote kiteytettiin etanolista, jolloin saatiin tosyylijohdannainen, sp. 85 - 89 °C. IR-spektri (KBr-pelletti) : 1524 cm'1, 1352 cm'1, 1194 cm'1, 1176 cm'1.
10 3,1 g KCN:a suspendoitiin 30 ml:aan absoluuttista etanolia, jota sekoitettiin 4 °C:ssa. Edellä saatu tosyyli johdannainen liuotettiin CH2Cl2-EtOH-seokseen (1:1) ja lisättiin KCN-seokseen. Liuos kuumennettiin hitaasti kiehuvaksi ja sitä refluksoitiin 24 tuntia. Liuos haihdutet-15 tiin sitten pyöröhaiduttimellä, jäännös uutettiin CH2C12: iin, ja liuos suodatettiin ja haihdutettiin. Öljy laskettiin sitten silikageelipylvään läpi, jolloin saatiin eristetyksi oranssi öljy (III). Saanto 1,9 g (70 %) . IR-spektri (NaCl-levy) : 2248 cm'1. NMR-spektri: 2,96 ppm (s, 20 2 H), 2,5 ppm (s, 4 H), 2,13 ppm (m, 1 H).
Esimerkki III
Lilol:n synteesi A. 3-(4-nitrobentsyyli)diamidimalonaatti (VII): r 4,3 g yhdistettä I liuotettiin 150 ml:aan metanolia v 25 ja jäähdytettiin 4 °C:seen, ja liuoksen läpi puhallettiin ammoniakkia, kunnes se saavutti kyllästymispisteen. Liuosta pidettiin suljettuna 4 °C:ssa 48 tuntia. Saostunut tuote erotettiin suodattamalla ja huuhdottiin metanolilla.
IR-spektri (KBr-pelletti) : 3441 cm'1, 3392 cm'1, 1678 cm'1, 30 1657 cm'1.
B. 2-(4-nitrobentsyyli)-1,3-diaminopropaani (VIII), « dihydrokloridisuola: 2,0 g yhdistettä VII suspendoitiin 20 ml:aan THF:a (tetrahydrofuraania) ja lisättiin 60 ml:aan 1 M BH3-THF-35 liuosta, jonka lämpötila oli 4 °C. Reaktioseos kuumennet- • « 104409 14 tiin hitaasti kiehuvaksi ja sitä refluksoitiin 15 tuntia. Liuokseen lisättiin metanolia, ja sen läpi puhallettiin HCl:a. ilman ulkopuolista jäähdytystä, kunnes tuote erottui keltaisena öljynä. Kiinteä aine erotettiin suodattamalla 5 ja huuhdottiin metanolilla. Saanto 2,17 g (91 %) . IR- spektri (KBr-pelletti) : 2934 cm'1, 1600 cm'1, 1514 cm'1, 1353 cm'1.
C. Nitro-LiLo-metyyliesteri (IX): 300 mg yhdistettä VIII ja 3,3 g DTPA:n pentametyy- j 10 liesteriä liuotettiin 10 mlraan kuivaa metanolia, ja liu- i osta refluksoitiin 7 vuorokautta. Reaktioseos haihdutettiin ja puhdistettiin silikageelipylväskromatografiän avulla. Tuote oli fluoresamiininegatiivinen. Saanto 17,5 %. IR-spektri (KBr-pelletti): 1741 cm'1, 1654 cm'1, I 15 1348 cm'1, 1204 cm'1.
D. ICN-LiLo-metyyliesteri (X): 15 mg yhdistettä IX liuotettiin 5 ml:aan metanolia ^ ja jäähdytettiin 4 °C:seen. Lisättiin katalyyttinen määrä hiilikantoaineella olevaa palladiumia (10 %) samalla se-20 koittaen. Reaktioseoksen läpi, jota sekoitettiin 4 °C:ssa, i puhallettiin sitten H2-kaasua. 10 minuutin kuluttua liuos I lämmitettiin 25 °C:seen ja vedyn lisäystä jatkettiin vielä 12 tuntia. Sen jälkeen liuos suodatettiin katalysaattorin poistamiseksi. Tuote osoittautui fluoresamiinitestissä ~ * " 25 primaarisen amiinin suhteen positiiviseksi.
Edellä saatua liuosta sekoitettiin 25 °C:ssa, sa-1 maila kun lisättiin hitaasti 0,1 ml tiofosgeenia (5 h) .
j Sen jälkeen liuos haihdutettiin oranssiksi tahmeaksi kal- | voksi. IR-spektrissä (KBr-pelletti) esiintyi NCS-piikki 30 aaltoluvulla 2106 cm'1. Metyyliesterit hydrolysoitiin ja haihdutettiin kuiviin.
«
LiLol:n synteesi:
E
LiLo-metyyliesteri (IX) valmistettiin myös seka-! anhydridimenetelmällä.
; 35 1,0 g (0,0025 mol) DTPA:ta suspendoitiin 30 ml:aan 13 -I CH2Cl2: a, joka sisälsi 2 ml trietyyliamiinia ja joka oli N2- § ‘-a m 15 104409 kaasukehän alla. Liuosta sekoitettiin 25 °C:ssa 24 tuntia, jonka jälkeen se jäähdytettiin noin -10 °C:seen jää-suola-hauteessa. Liuokseen lisättiin pisaroittain 250 ml (0,0025 mol) etyyliklooriformiaattia. Liuosta sekoitettiin 5 25 minuuttia, 367 mg (0,00125 mol) yhdistettä VIII liuo tettiin 5 ml:aan CH2Cl2:a, joka sisälsi 0,5 ml trietyyli-amiinia, ja jäähdytettiin -5 °C:seen. Tämä liuos lisättiin pisaroittain ja voimakkaasti sekoittaen seka-anhydridi-liuokseen. Liuosta pidettiin 0 °C:n alapuolella 2 tuntia, 10 jonka jälkeen sen annettiin lämmetä hitaasti huoneen lämpötilaan ja sitä sekoitettiin yön yli. Sen jälkeen liuos haihdutettiin ja jäännös liuotettiin kuivaan 50 ml:aan CH3OH:a, ja liuokseen lisättiin pisaroittain N2-kaasukehän alla 4 ml tionyylikloridia. Liuosta refluksoitiin sitten 5 15 tuntia. Haihtuvat aineosat haihdutettiin pois ja jäännös laskettiin silikageelipylvään läpi (CH2C12 CH3OH-gradientin kera) . IR (KBr-pelletti) 1742 cm'1, 1664 cm'1, 1520 cm'1, 1347 cm'1, 1207 cm'1.
Esimerkki IV
20 LiLo valmistettiin myös vaihtoehtoisella menetelmällä DTPA-dianhydridiä käyttäen. 20 mg yhdistettä VIII = liuotettiin 10 ml:aan vettä. Lisättiin 105 mg DTPA-dian- _ hydridiä ja liuosta ravistettiin, kunnes se oli liuennut.
Liuosta pidettiin 4 °C:ssa 5 vuorokautta, ja välittömästi !_ '« ' 25 sen jälkeen suoritettiin pelkistys. Lisättiin katalyytti-
• I
nen määrä 10 % Pd/C-katalysaattoria, ja liuoksen läpi puhallettiin vetyä huoneen lämpötilassa 6 tunnin ajan, jonka jälkeen sitä sekoitettiin vetykaasukehän alla yön yli. ^
Liuos suodatettiin, tuote muunnettiin isotiosyanaatiksi 30 tiofosgeeniä käyttäen ja ylimääräinen tiofosgeeni uutet- : tiin eetterillä. IR-spektrissä esiintyi piikki aaltoluvul- - la 2126 cm'1, joka on karakteristinen isotiosyanaatille.
• «

Claims (6)

1. Kelaatinmuodostaja, jolla on kaava 5 y—coo ooc—^ / N \—coo ooc_/N\ l OOC^v / ;nv ^n( / N— coo \ [Μ/Λ-εο° OOC-V J
10. N' ' n/ n— CONH HNOC—/ (CH2')n (di2)n 15 'C^NCS 5 jossa n on 1 tai 2. . 2. Kompleksi käytettäväksi diagnostisessa menetel- 20 mässä, tunnettu siitä, että se sisältää patentti- _ vaatimuksen 1 mukaiseen kelaatinmuodostajaan sitoutunutta radionuklidia.
3. Kompleksi käytettäväksi diagnostisessa menetel mässä, tunnettu siitä, että se sisältää patentti- : '.25 vaatimuksen 1 mukaiseen kelaatinmuodostajaan sitoutunutta • > 1 metallia.
4. Kompleksi käytettäväksi diagnostisessa menetelmässä, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaiseen kelaatinmuodostajaan sitoutunutta 30 polypeptidiä.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen kompleksi, t u n- • « n e t t u siitä, että polypeptidi on vasta-aine.
6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen kompleksi, t u n-i n e t t u siitä, että se sisältää kelaatinmuodostajaan 35 sitoutunutta radionuklidia. · t Ϊ 104409
FI910329A 1989-05-26 1991-01-22 Kelaatinmuodostajia ja niitä sisältäviä, diagnostiikassa käytettäviä komplekseja FI104409B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35891789A 1989-05-26 1989-05-26
US35891789 1989-05-26
PCT/US1990/002910 WO1990014881A2 (en) 1989-05-26 1990-05-23 Chelating agents for attaching metal ions to proteins
US9002910 1990-05-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI910329A0 FI910329A0 (fi) 1991-01-22
FI104409B true FI104409B (fi) 2000-01-31

Family

ID=23411575

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI910329A FI104409B (fi) 1989-05-26 1991-01-22 Kelaatinmuodostajia ja niitä sisältäviä, diagnostiikassa käytettäviä komplekseja

Country Status (13)

Country Link
EP (2) EP0429644B1 (fi)
JP (1) JP2865112B2 (fi)
KR (2) KR100199892B1 (fi)
AT (1) ATE128035T1 (fi)
AU (1) AU638757B2 (fi)
CA (1) CA2033086A1 (fi)
DE (1) DE69022542T2 (fi)
DK (1) DK0429644T3 (fi)
ES (1) ES2080160T3 (fi)
FI (1) FI104409B (fi)
IE (1) IE68411B1 (fi)
WO (1) WO1990014881A2 (fi)
ZA (1) ZA904047B (fi)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5914095A (en) * 1989-04-07 1999-06-22 Salutar, Inc. Polychelants containg amide bonds
US5808003A (en) * 1989-05-26 1998-09-15 Perimmune Holdings, Inc. Polyaminocarboxylate chelators
US5292868A (en) * 1989-05-26 1994-03-08 Akzo N.V. Chelating agents for attaching metal ions to proteins
CA2180662A1 (en) * 1994-01-07 1995-07-13 Ramaswamy Subramanian New polyaminocarboxylate chelators
GB9407812D0 (en) * 1994-04-20 1994-06-15 Nycomed Salutar Inc Compounds
US5814521A (en) * 1995-10-06 1998-09-29 Bayer Corporation Metal ion determination by sandwich aggregation assay
US6207858B1 (en) * 1999-03-03 2001-03-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Regioselective synthesis of DTPA derivatives

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE8301395L (sv) * 1983-03-15 1984-09-16 Wallac Oy Kelatiserande foreningar med funktionella grupper vilka tillater kovalent koppling till bio-organiska molekyler
US4899755A (en) * 1985-05-08 1990-02-13 The General Hospital Corporation Hepatobiliary NMR contrast agents
ES2054678T5 (es) * 1986-08-18 1997-09-16 Dow Chemical Co Conjugados estrella.

Also Published As

Publication number Publication date
EP0429644A4 (en) 1991-11-21
JP2865112B2 (ja) 1999-03-08
EP0661267A1 (en) 1995-07-05
EP0429644B1 (en) 1995-09-20
KR100186799B1 (ko) 1999-05-15
ZA904047B (en) 1991-09-25
AU6427590A (en) 1991-01-07
JPH04500389A (ja) 1992-01-23
FI910329A0 (fi) 1991-01-22
ES2080160T3 (es) 1996-02-01
AU638757B2 (en) 1993-07-08
DK0429644T3 (da) 1996-01-22
IE68411B1 (en) 1996-06-12
DE69022542T2 (de) 1996-05-02
CA2033086A1 (en) 1990-11-27
ATE128035T1 (de) 1995-10-15
WO1990014881A3 (en) 1991-01-24
WO1990014881A2 (en) 1990-12-13
EP0429644A1 (en) 1991-06-05
KR100199892B1 (ko) 1999-06-15
KR920701127A (ko) 1992-08-11
DE69022542D1 (de) 1995-10-26
IE901867L (en) 1990-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5292868A (en) Chelating agents for attaching metal ions to proteins
US5808003A (en) Polyaminocarboxylate chelators
AU638127B2 (en) A bifunctional dtpa-type ligand
AU630362B2 (en) Macrocyclic chelates &amp; methods of use thereof
KR920003590B1 (ko) 금속 킬레이트-단백질 결합체를 형성하기 위한 다중치환된 골격을 갖는 킬레이트
US4479930A (en) Amines coupled wth dicyclic dianhydrides capable of being radiolabeled product
JP2831073B2 (ja) 大環状二官能キレート剤、その錯体及びそれらの抗体接合体
JPH0647557B2 (ja) 放射性標識抗体フラグメント
CA2001765C (en) Chelants possessing ortho ligating functionality and complexes thereof
FI104409B (fi) Kelaatinmuodostajia ja niitä sisältäviä, diagnostiikassa käytettäviä komplekseja
JPH05320147A (ja) ペンダント型二官能性大環状キレート配位子、その製造法および金属錯体
AU692224B2 (en) New polyaminocarboxylate chelators
KR0153501B1 (ko) 오르토 결합 작용기를 갖는 킬란트 및 그의 착물
AU614973B2 (en) Functionalized polyamine chelants and rhodium complexes thereof and process for their preparation
Cai Synthesis and characterization of site-specific porphyrin-antibody conjugates
NO179871B (no) Diagnostisk anvendelig makrocyklisk kompleksforbindelse
NO179585B (no) Fremgangsmåte ved fremstilling av antistoffkonjugater med makrocykliske bifunksjonelle chelaterte komplekser
IL113068A (en) Acid Ligand-Haftan Acids of 1,4,7,01-Tetraazacyclododecane - N, (N,) N-Tetratic (
NZ245370A (en) Chelants containing amino groups;complexes,conjugates and pharmaceutical formulations thereof
JPH0517456A (ja) 新規大環状キレート配位子およびその金属錯体