NO179585B

NO179585B - Fremgangsmåte ved fremstilling av antistoffkonjugater med makrocykliske bifunksjonelle chelaterte komplekser

Info

Publication number: NO179585B
Application number: NO954045A
Authority: NO
Inventors: Jaime Simon; Garry E Kiefer; Joseph R Garlich; Kenneth Mcmillan; Richard Keith Frank; Sharon Baughman; William A Fordyce; Jr William J Kruper; David Alan Wilson; William F Goeckeler; Roberta C Cheng
Original assignee: Dow Chemical Co
Priority date: 1988-06-24
Filing date: 1995-10-11
Publication date: 1996-07-29
Also published as: NO954045L; NO179585C; NO954045D0

Description

Funksjonaliserte chelateringsmidler, eller bifunksjonelle koordineringsmidler, er kjent for å være i stand til å bindes kovalent til et antistoff som har spesifisitet for cancer- eller tumorcelleepitoper eller -antigener. Radionuklidkomplekser av slike antistoff/chelateringskonjugater kan brukes ved diagnostiske og/eller terapeutiske anvendelser som et middel til å bringe radionuklidene til en cancer- eller tumorcelle. Se f.eks. Meares et al., Anal.Biochem. 142. 68-78, (1984); og Krejcarek et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 77, 581-585

(1977) .

Aminokarboksylsyrechelateringsmidler har vært kjent og studert i mange år. Typisk for aminokarboksylsyrene er nitriltrieddiksyre (NTA), etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), hydroksyetyletylendiamintrieddiksyre (HEDTA), dietylentriaminpentaeddiksyre (DTPA), trans-1,2-diaminocykloheksantetraeddiksyre (CDTA) og 1,4,7,10-tetraazacyklododekantetraeddiksyre (DOTA). Flere bifunksjonelle chelateringsmidler basert på amino-karboksylsyrer er blitt foreslått og fremstilt. F.eks. er det cykliske dianhydridet av DTPA [Hnatowich et al. Science 220, 613-615, (1983); U.S. patent 4,479,930] og blandede karboksy-karboksylsyreanhydrider av DTPA[Gansow, U.S. patenter 4,454,106 og 4,472,509; Krejcarek et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 77, 581-585, (1977)] blitt beskrevet. Når anhydridene kobles til proteiner, foregår koblingen via dannelse av en amidbinding, slik at det etterlates fire av de opprinnelig fem karboksymetylgruppene på dietylentriamin (DETA) ryggraden [Hnatowich et al. Int. J. Appl. Isot. 33, 327-332, (1982)]. Dessuten beskriver U.S. patentene 4,432,907 og 4,352,751 bifunksjonelle chelateringsmidler som anvendes til å binde metallioner til "organiske molekyler såsom organiske målmolekyler eller antistoffer." Som ovenfor oppnås koblingen via en amidgruppe ved anvendelse av diaminotetraeddiksyredianhydrider. Eksempler på anhydrider omfatter dianhydrider av EDTA, CDTA, propylendiamintetraeddiksyre og fenylen 1,2-diamintetraeddiksyre. Et nyere U.S. patent 4,647,447 beskriver flere komplekssalter som dannes av anionet i en kompleksdannende syre for anvendelse i forskjellige diagnostiske teknikker. Konjugering via en karboksylgruppe i den kompieksdannende syren er beskrevet, hvilket gir en forbindelse via en amidbinding.

I J. of Radioanalytical chemistry 57 (12), 553-564 (1980), beskriver Paik et al. anvendelse av p-nitrobenzylbromid i en omsetning med et "blokkert" dietylentriamin, dvs. bis-(2-ftalimidoetyl)amin etterfulgt av deblokkeringsprosedyrer og karboksymetylering ved bruk av kloreddiksyre, for å gi N'-p-nitrobenzyldietylentriamin N,N,N",N"-tetraeddiksyre. Siden tilknytningen er via et nitrogenatom, oppnås igjen et tetra-eddiksyrederivat. Konjugering av det bifunksjonelle chelateringsmidlet og chelatering med indium blir diskutert. Sub-stitusjon på nitrogenatomet beskrives også av Eckelman, et al.

i J. of Pharm. Sei. 64(4), 704-706 (1975) ved omsetning av aminer såsom "etylendiamin eller dietylentriamin med det passende alkylbromidet for karboksymetylering." Forbindelsene foreslås som potensielle radiofarmasøytiske avbildningsmidler.

En annen gruppe bifunksjonelle chelateringsmidler basert

på aminokarboksylsyrefunksjonalitet er også vel dokumentert i litteraturen. Således beskriver Sundberg, Meares, et al. i J.

of Med. Chem. 17(12), 1304 (1974) bifunksjonelle analoger av EDTA. Representative for disse forbindelsene er l-(p-aminofenyl)-etylendiamintetraeddiksyre og 1-(p-benzen-diazonium)-etylendiamintetraeddiksyre. Kobling til proteiner via para-substituenten og binding av radioaktie metallioner til chelateringsgruppen blir diskutert. Forbindelsene er også beskrevet i Biochemical and Biophysical Research Communications 75(1).

149 (1977), og i U.S. patentene 3,994,966 og 4,043,998. Det er viktig å merke seg at tilknytningen av den aromatiske gruppen til EDTA-strukturen er via et karbonatom i etylendiaminryggraden. Optisk aktive bifunksjonelle chelateringsmidler basert på EDTA, HEDTA og DTPA er beskrevet i U.S. patent 4,622,420. I disse forbindelsene er det en alkylengruppe som forbinder den aromatiske gruppen (som inneholder den nødvendige funksjonali-teten for tilknytning til proteinet) til karbonatomet i polyaminet som inneholder chelateringsfunksjonaliteten. Andre referanser til slike forbindelser omfatter Brechbiel et al., Inorg. Chem. 25, 2772-2781 (1986), U.S. patent 4,647,447 og International Patent Publication No. WO 86/06384.

Ganske nylig er beskrevet visse makrocykliske bifunksjonelle chelateringsmidler og anvendelse av deres kobberchelatkonjugater for diagnostiske eller terapeutiske anvendelser i U.S. patent 4,678,667 og av Moi et al., Inorg. Chem. 26, 3458-3463 (1987). Tilknytning av aminokarboksylsyrefunksjonaliteten til resten av det bifunksjonelle chelateringsmolekylet er via et ringkarbon i den cykliske polyaminryggraden. Et forbindelsesledd, tilknyttet i den ene enden til et ringkarbon i det cykliske polyaminet, er således også tilknyttet i sin andre ende til en funksjonell gruppe som er i stand til å reagere med proteinet.

En annen gruppe av bifunksjonelle chelateringsmidler som også er verdt å merke seg, består av forbindelser hvori chelateringsgruppen i molekylet, dvs. aminokarboksylsyren, er tilknyttet via et nitrogen til den funksjonelle gruppen i molekylet som inneholder den gruppen som er i stand til å omsette seg med proteinet. Som eksempel beskriver Mikola et al. i patentsøknaden (International Publication Number WO 84/03698, publisert 9/27/1984) et bifunksjonelt chelateringsmiddel fremstilt ved å omsette p-nitrobenzylbromid med EDTA etterfulgt av omsetning med bromeddiksyre for å fremstille aminokarboksylsyren. Nitrogruppen reduseres til den tilsvarende amingruppe og konverteres deretter til isotiocyanatgruppen ved omsetning med tiofosfgen. Disse forbindelsene er bifunksjonelle chelateringsmidler som er i stand til å chelatere lantanider som kan konjugeres til bioorganiske molekyler for anvendelse som diagnostiske midler. Siden tilknytningen av linkerdelen av molekylet er via ett av nitrogenatomene i aminokarboksylsyren, er én potensiell aminokarboksylgruppe tapt for chelatering. På denne måten fremstilles et EDTA-basert bifunksjonelt chelateringsmiddel som inneholder fire (ikke fem) syregrupper. I dette henseende ligner denne gruppen av bifunksjonelle chelateringsmidler dem hvor tilknytning til proteinet er via en amidgruppe med påfølgende tap av en karboksylchelaterende gruppe.

Nylig har Carney, Rogers og Johnson beskrevet (3rd. International Conference on Monoclonal Antibodies For Cancer; San Diego, California - 2/4-6/88) sammendrag med tittelen "Absence of Intrinsically Higher Tissue Uptake from Indium-111 Labeled Antibodies: Co-administration of Indium-111 and Iodine-125 Labeled B72.3 in a Nude Mouse Model" og "Influence of Chelator Dencity on the Biodistribution of Indium-111 Labeled B72.3 Immunoconjugates in Nude Mice". Biodistribusjonen av indium-111 kompleksert med et EDTA og DTPA bifunksjonelt chelateringsmiddel er beskrevet. Tilknytningen av den aromatiske ringen til EDTA/DTPA-gruppene er via en acetatmetylen. D.K. Johnson et al. [Florida Conf. on Chem. in Biotechnology, April 26-29 (1988) , Palm Coast, FL] har også i et møte nylig beskrevet bifunksjonelle derivater av EDTA og DTPA hvor en p-isotio-cyanatbenzylgruppe er knyttet til metylenkarbonet i én av karboksymetylgruppene. Tidligere har Hunt et al. i U.S. patentene 4,088,747 og 4,091,088 (1978) beskrevet etylendiamin-dieddiksyre (EDDA) baserte chelateringsmidler hvori tilknytning av en aromatisk ring til EDDA-gruppen er via alkylen- eller acetatmetylen. Forbindelsene hevdes å kunne anvendes som chelater for å studere hepatobiliær funksjon. Det foretrukne metallet er technetium-99m. Indium-111 og indium-113m hevdes også å kunne anvendes som radionuklider for avbildning.

Det ville derfor være fordelaktig å tilveiebringe et kompleks som ikke lett dissosierer, som raskt elimineres fra hele kroppen unntatt fra det ønskede vevet, og konjugerer med et antistoff for å frembringe de ønskede resultatene.

I de medfølgende tegningene kan figurene beskrives som følger: Figurene 1-7 og 15-21 viser biodistribusjonen av <153>Sm administrert som et konjugat inneholdende <153>Sm ifølge den foreliggende oppfinnelse. Antistoffet CC4g-IgG ble anvendt i konjugatet ifølge den foreliggende oppfinnelse. Biodistribusjonen ble bestemt i nakne mus med LS 174-T tumor. Figurene 8-14 og 22-28 viser biodistribusjonen av <153>Sm administrert som et konjugat inneholdende <153>Sm ifølge den foreliggende oppfinnelse. Konjugatet ifølge den foreliggende oppfinnelse brukte CC49-F(ab</>)2 som antistoffragment. Biodistribusjonen ble bestemt i nakne mus med LS 174-T-tumor. Figurene 29-34 viser biodistribusjonen av <177>Lu som et konjugat inneholdende <177>Lu(PA-DOTMA) eller 177Lu(PA-DOTA).

Konjugatet brukte CC49-IgG som antistoff. Biodistribusjonen ble bestemt i (balb/C) mus med LS 174-T tumor.

Overraskende er kompleksene og/eller konjugatene ifølge oppfinnelsen relativt stabile (dvs. at de ikke lett dissosierer) og noen viser hurtig clearance fra hele kroppen og noen ikke-målorganer, såsom lever, nyrer og ben.

Oppfinnelsen omfatter utforming og syntese av nye bifunksjonelle chelateringsmidler, som alle inneholder en chelate-ringsfunksjonalitet, og en kjemisk reaktiv gruppe for kovalent binding til biomolekyler. En del av oppfinnelsen utgjør også fremgangsmåter for fremstilling av forskjellige bifunksjonelle koordinator (BFC)-metallkomplekser og sammenbindingen av kompleksene med antistoff for å fremstille antistoffer merket med radionuklider (såsom samarium-153, lutetium-177 og yttrium-90) og/eller fragmenter som egner seg for diagnostiske og/eller terapeutiske anvendelser.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører nye bifunksjonelle chelateringsmidler som danner komplekser med metallioner, spesielt "radioaktive" metallioner som har kjemi av typen sjeldne jordarter. Foretrukne metallioner av typen sjeldne j ordarter omfatter La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y og Sc, spesielt foretrukket er Sm, Ho, Y og Lu. Foretrukne radioaktive meallioner av typen sjeldne jordarter omfatter 153Sm, 166Ho, 9<0>Y, 149Pm, <159>Gd, <140>La, 17<7>Lu, <175>Yb, <47>Sc og 14<2>Pr, spesielt foretrukket er 153Sm, <166>Ho, <90>Y og 17<7>Lu. Andre radioaktive metallioner som kan vræe av interesse er 47Sc, 99mTc, 1<86>Re, 188Re, <97>Ru, 105Rh, 109pd> 197^f 67CU> 19<8>AUf 199Au> 6<7>Ga, 68Ga§ lllIn> 113<m>In>

<115>mIn> 117<m>Sn og 21<2p>b/21<2>Bi> De således dannede kompleksene kan tilknyttes (bindes kovalent) til et antistoff eller fragment derav, og anvendes for terapeutiske og/eller diagnostiske formål. Kompleksene og/eller konjugatene kan formuleres for in vivo eller in vitro anvendelser. En foretrukket anvendelse av de formulerte konjugatene er behandling av cancer hos dyr, spesielt mennesker.

Anvendelser av kompleksene og/eller konjugatene ifølge denne oppfinnelsen som inneholder et ikke-radioaktivt metall for diagnose og/eller behandling av sykdomstilstander såsom cancer, er også mulig. Slike anvendelser er kjent for ikke-radioaktive metaller som anvender radiofrekvens for å indusere hypertermi (Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 61,158,931) og fluorescent-immunoguided therapy (FIGS) [K. Pettersson et al., Clinical Chemistry 29 (1), 60-64 (1983) og C. Meares et al., Acc. Chem. Res. 17, 202-209 (1984)].

Mer spesielt vedrører den foreliggende oppfinnelse en forbindelse med formelen:

hvori; hver Q uavhengig er hydrogen eller (CHR<5>')pC02R; Q<1> er hydrogen eller (CHR<5>')wC02R; hver R uavhengig er hydrogen, benzyl eller Ci-C4-alkyl; under den forutsetningen at i det minste to av summen av Q og Q<1> må være forskjellig fra hydrogen; hver R<5>' uavhengig er hydrogen, C1-C4~alkyl eller -(C1-C2-alkyl)fenyl; X og Y begge uavhengig er hydrogen eller kan tas sammen med en nærliggende X og Y for å danne en ytterligere karbon-karbon-binding; n er 0 eller l; m er et helt tall fra 0 til og med 10; p = 1 eller 2; r = 0 eller 1; w = 0 eller 1; under den forutsetningen at n er bare 1 når X og/eller Y danner en ytterligere karbon-karbon-binding, og summen av r og w er 0 eller 1; L er en linker/spacer-gruppe kovalent bundet til, og erstatter ett hydrogenatom på ett av de karbonatomene som den er bundet til, idet nevnte linker/spacer-gruppe er representert ved formelen

hvori:

s er et helt tall på 0 eller 1;

t er et helt tall på 0 til og med 20;

R<1> er en elektrofil eller nukleofil gruppe som tillater kovalent tilknytning til et antistoff eller fragment derav, eller en syntetisk linker som kan knyttes til et antistoff eller fragment derav, eller forløper for dette; og

Cyc representerer en cyklisk alifatisk gruppe, aromatisk gruppe, alifatisk heterocyklisk gruppe, eller aromatisk heterocyklisk gruppe, idet hver av nevnte grupper eventuelt er substituert med én eller flere grupper som ikke interfererer med binding til et antistoff eller antistoffragment;

under den forutsetning at når s, t, m, r og n er 0, da er R<1 >forskjellig fra karboksyl; eller

et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Foretrukne trekk av forbindelsene med formelen (I) er de hvor: R er hydrogen; R<5>' er H eller metyl; n er 0; m er er 0 til og med 5; r er 0; og L er en forbindelse med formelen:

hvori:

R<2> velges fra gruppen bestående av hydrogen, nitro, amino, isotiocyanat, semikarbazid, tiosemikarbazid, karboksyl, bromacetamido og maleimido;

R<3> velges fra gruppen bestående av C1-C4-alkoksy, -OCH2C02H, hydroksy og hydrogen;

R<4> velges fra gruppen bestående av hydrogen, nitro, amino, isotiocyanat, semikarbazid, tiosemikarbazid, karboksyl, bromacetamido og maleimid;

under den forutsetningen at R<2> og R<4> ikke begge kan være hydrogen, men én av R<2> og R<4> må være hydrogen; eller

et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Når det ønskes et konjugat ifølge den foreliggende oppfinnelse, må R<2> og R<4> begge være forskjellige fra nitro. Når R<2> eller R<4> er nitro, da er en forløper for linkergruppen (L) tilstede. Denne forløpergruppen kan være en hvilken som helst gruppe som dannes for R<2> eller R<4> for fremstilling av forbindelsene med formelen (I) og som ikke bindes til et antistoff eller antistoffragment.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også komplekser av metallioner av typen sjeldne jordarter, spesielt radioaktive nøytrale eller ladde komplekser av metallioner av typen sjeldne jordarter, og konjugater som dannes med de forannevnte kompleksene og antistoff- eller antistoffragmentene. I tillegg omfatter den foreliggende oppfinnelse også formuleringer som har konjugater ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer, spesielt formuleringer hvor den farmasøytisk akseptable bæreren er en væske. Oppfinnelsen omfatter også en fremgangsmåte for diagnose eller behandling av en sykdomstilstand, spesielt cancer, hos pattedyr som omfatter å administrere til pattedyret en effektiv mengde av formuleringen.

Som anvendt heri har de følgende viste uttrykkene disse betydningene: med hensyn til definisjonen av R<1>, R<2> eller R<4>, omfatter "elektrofile" grupper, men er ikke begrenset til, isotiocyanat, bromacetamid, maleimid, imidoester, tioftalimid, N-hydroksysuccinimylester, pyridyldisulfid og fenylazid; egnede "nukleofile" grupper omfatter, men er ikke begrenset til, karboksyl, amino, acylhydrazid, semikarbazid og tiosemikarbazid; "syntetiske linkere" omfatter hvilke som helst syntetisk organiske eller uorganiske linkere som er i stand til å bindes kovalent til et antistoff eller antistoffragment, foretrukne syntetiske linkere er bionedbrytbare syntetiske linkere som er stabile i pasientens serum, men som har et potensial for spalting i et clearingsorgan for radio-konjugatet, f.eks. bionedbrytbare peptider eller peptidholdige grupper. Av de elektrofile gruppene foretrekkes isotiocyanat, og av de nukleofile gruppene foretrekkes amino, semikarbazid og tiosemikarbazid. Det er ønskelig at karakteren av og/eller stillingen for R<1> er slik at den ikke i betydelig grad interfererer med chelateringsreaksj onen.

"X-C-Y"-uttrykket i formelen (I) representerer det alternative nærvær av en dobbelt- eller trippelbinding mellom nabokarbonatomer. De umettede bindingene kan være tilstede uavhengig i kjedelengden på 0 til og med 10 karbonatomer som definert ved "m"-uttrykket i formel (I).

Som anvendt heri skal uttrykket "pattedyr" bety dyr som mater ungene med melk utskilt av melkekjertler, fortrinnsvis varmblodige pattedyr, mer fortrinnsvis mennesker. "Antistoff11 refererer til et hvilket som helst polyklonalt, monoklonalt, chimerisk antistoff eller heteroantistoff, fortrinnsvis et monoklonalt antistoff; "antistofffragment" omfatter Fab-fragmenter og F(ab')2-fragmenter, og en hvilken som helst del av et antistoff som har spesifisitet mot en ønsket epitop eller epitoper. Når uttrykket "metallchelat/antistoffkonjugat" eller "konjugat" anvendes, skal "antistoff"-delen bety at den omfatter hele antistoffer og/eller antistoffragmenter, omfattende halvsyntetiske eller genetisk konstruerte varianter derav.

Som anvendt heri viser "kompleks" til en forbindelse

ifølge oppfinnelsen, f.eks. formel (I), kompleksert med et metallion av typen sjeldne jordarter, spesielt et radioaktivt metallion av typen sjeldne jordarter, hvori minst ett metallatom er chelatert eller kompleksbundet; "radioaktivt metallion-chelat/antistoffkonjugat" eller "radioaktivt metallionkonjugat" refererer til et radioaktivt metallionkonjugat som er kovalent knyttet til et antistoff eller antistoffragment; "radioaktiv" når det anvendes i forbindelse med ordet "metallion" refererer til én eller flere isotoper av elementer av typen sjeldne jordarter som sender ut partikler og/eller fotoner, såsom <153>Sm, 16<6>Ho, 90Y, 149^, 159Gd> 140La> 177Lu> 175Yb, 47Sc og 142pr;

uttrykkene "bifunksjonell koordinator", "bifunksjonelt chelater ingsmiddel" og "funksjonalisert chelateringsmiddel" anvendes om hverandre og viser til forbindelser som har en chelaterings-gruppe som er i stand til å chelatere et metallion og en linker/spacergruppe som er kovalent bundet til chelateringsgruppen som er i stand til å tjene som et middel til å binde seg kovalent til et antistoff eller antistoffragment.

Som anvendt heri betyr "farmasøytisk akseptabelt salt" et hvilket som helst salt av en forbindelse med formelen (I) som er tilstrekkelig ikke-toksisk til å kunne anvendes ved terapi eller diagnose av pattedyr. Saltene er således brukbare i samsvar med denne oppfinnelse. Representative for disse saltene, som dannes ved standard omsetninger, fra både organiske og uorganiske kilder, omfatter f.eks. svovelsyre, saltsyre, fosforsyre, eddiksyre, ravsyre, sitronsyre, melkesyre, malein-syre, fumarsyre, palmitinsyre, cholinsyre, palmoinsyre, mucinsyre, glutaminsyre, d-kamfersyre, glutarsyre, glykolsyre, ftalsyre, vinsyre, maursyre, laurinsyre, stearinsyre, salicyl-syre, metansulfonsyre, benzensulfonsyre, sorbinsyre, picrinsyre, benzosyre, kanelsyre og andre egnede syrer. Også innbefattet er salter som dannes ved standard omsetninger av både organiske og uorganiske kilder såsom ammonium-, alkalimetallioner, jordalkalimetallioner og andre lignende ioner. Spesielt foretrukket er saltene av forbindelsene med formel (I) hvor saltet er kalium, natrium, ammonium eller blandinger derav.

Den frie syren av forbindelsene med formelen (I) kan naturligvis anvendes, også den protonerte formen av forbindelsene, f.eks. når karboksylatet blir protonert og/eller nitrogenatomene dvs. når HCl-saltet blir dannet.

Foretrukne forbindelser med formelen (I) omfatter de forbindelsene hvor Q<1> er hydrogen og L er representert ved formelen A som vist ved følgende formel:

hvori:

hver Q uavhengig er hydrogen eller CHR<5>C02R;

hver R uavhengig er hydrogen, benzyl eller C^- C^-alkyl; under den forutsetning at minst to av Q må være forskjellig fra hydrogen;

m er et helt tall fra 0 til og med 5;

R<2> velges fra gruppen bestående av hydrogen, nitro, amino, isotiocyant, semikarbazid, tiosemikarbazid, karboksyl, bromacetamido og maleimid;

hver R<5> uavhengig er hydrogen eller Ci~C4-alkyl;

under den forutsetning at R<2> og R<4> ikke begge kan være hydrogen, men én av R<2> og R<4> må være hydrogen; eller

et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

I formelen (II) når R<3> og R<4> begge er hydrogen, er forbindelsene representert ved følgende formel:

hvori:

hver Q uavhengig er hydrogen eller CHR<5>C02R;

hver R uavhengig er hydrogen, benzyl eller C1-C4-alkyl; under den forutsetningen at minst to av Q må være forskjellig fra hydrogen;

m er et helt tall fra 0 til og med 5;

R<2> velges fra gruppen bestående av nitro, amino, isotiocyanat, semikarbazid, tiosemikarbazid, karboksyl, bromacetamido og maleimid;

hver R<5> uavhengig er hydrogen eller Ci~C4-alkyl; eller

et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

I formelen (II) når R<2> er hydrogen, representeres forbindelsene ved formelen:

hvori:

hver Q uavhengig er hydrogen eller CHR<5>C02R;

hver R uavhengig er hydrogen, benzyl eller C1-C4-alkyl; under den forutsetning at minst to av Q må være forskjellig fra hydrogen;

m er et helt tall fra 0 til og med 5;

R<3> velges fra gruppen bestående av C1-C4-alkoksy, - OCH2C02H og hydroksy;

R<4> velges fra gruppen bestående av nitro, amino, isotiocyanat, semikarbazid, tiosemikarbazid, karboksyl, bromacetamido og maleimid;

hver R<5> uavhengig er hydrogen eller Ci-C4-alkyl;

eller

et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Ytterligere foretrukne forbindelser med formel (I) omfatter de forbindelsene hvor minst én Q er hydrogen og representeres ved formelen:

hvori:

hver Q uavhengig er hydrogen eller CHR<5>C02R; Q<1> er hydrogen eller (CHR<5>)wC02<R; >hver R uavhengig er hydrogen, benzyl eller C1-C4-alkyl; under den forutsetningen at minst to av summen av Q og Q<1> må være forskjellig fra hydrogen og én av Q er hydrogen; m er et helt tall fra 0 til og med 5; w er 0 eller 1; R<2> velges fra gruppen bestående av hydrogen, nitro, amino, isotiocyanat, semikarbazid, tiosemikarbazid, karboksyl, maleimid og bromacetamido; R<3> velges fra gruppen bestående av C1-C4-alkoksy, -OCH2C02H, hydroksy og hydrogen;

R<4> velges fra gruppen bestående av hydrogen, nitro, amino, isotiocyanat, semikarbazid, tiosemikarbazid, karboksyl,

maleimid og bromacetamido;

hver R<5> uavhengig er hydrogen eller C1-C4-alkyl;

et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Andre foretrukne forbindelser med formelen (I) omfatter forbindelser hvor Q<1> er C02R (w=0) og representeres ved formelen:

hvori:

hver Q uavhengig er hydrogen eller CHR<5>C02R; hver R uavhengig er hydrogen, benzyl eller C^-C^alkyl; under den forutsetningen at minst én Q må være forskjellig fra hydrogen; m er et helt tall fra 0 til og med 5; R<2> velges fra gruppen bestående av hydrogen, nitro, amino, isotiocyanat, semikarbazid, tiosemikarbazid, karboksyl, maleimid og bromacetamido; R<3> velges fra gruppen bestående av C^-C^-alkoksy, -OCH2CO2H, hydroksy og hydrogen;

R<4> velges fra gruppen bestående av hydrogen, nitro, amino, isotiocyanat, semikarbazid, tiosemikarbazid, karboksyl, maleimid og bromacetamido;

hver R<5> uavhengig er hydrogen eller Ci-C4-alkyl;

et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Noen foretrukne forbindelser med formelen (VI) er de hvor R<3> og R<4> begge er hydrogen, forbindelsene er representert ved formelen:

hvori:

hver Q uavhengig er hydrogen eller CHR<5>C02R;

hver R uavhengig er hydrogen, benzyl eller C^- C^-alkyl; under den forutsetningen at minst én Q må være forskjellig fra hydrogen;

m er et helt tall fra 0 til og med 5;

hver R<5> uavhengig er hydrogen eller C1-C4-alkyl;

eller

et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Andre foretrukne forbindelser med formelen (VI) er de hvor R<2> er hydrogen og er representert ved formelen:

hvori:

hver Q uavhengig er hydrogen eller CHR5CC>2R; hver R uavhengig er hydrogen, benzyl eller C1-C4-alkyl; under den forutsetningen at minst én Q må være forskjellig fra hydrogen; m er et helt tall fra 0 til og med 5; R<3> velges fra gruppen bestående av C1-C4-alkoksy, -OCH2C02H og hydroksy;

R<4> velges fra gruppen bestående av nitro, amino, isotiocyanat, semikarbazid, tiosemikarbazid, karboksyl, maleimid og bromacetamido;

hver R<5> uavhengig er hydrogen eller C^-C^-alkyl;

eller

et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

De bifunksjonelle chelateringsmidlene som er beskrevet heri [representert ved hvilken som helst av formlene (I)-(VIII)] kan anvendes til å chelatere eller kompleksbinde metallioner av typen sjeldne jordarter, spesielt radioaktive metallioner av typen sjeldne jordarter, slik at det dannes metallionchelater (også referert til heri som "komplekser"). P.g.a. at funk-sjonaliseringsgruppen (representert ved "R<1>" i formelen (I)] er tilstede, kan kompleksene bindes til funksjonaliserte bærere, såsom funksjonaliserte polymere bærere eller, når et kompleks med formel (I) hvor L representerer formelen (A) og R<2> og R<4> må være forskjellige fra nitro, kan de fortrinnsvis bindes kovalent til proteiner eller mer spesielt til antistoffer eller antistoffragmenter. Kompleksene beskrevet heri (representert ved hvilken som helst av formlene I-VIII kompleksert med metallioner av typen sjeldne jordarter, spesielt radioaktive metallioner av typen sjeldne jordarter) kan således bindes kovalent til et antistoff eller antistoffragment, og refereres til heri som "konjugater".

Antistoffene eller antistoffragmentene som kan anvendes i konjugatene beskrevet heri, kan fremstilles ved teknikker som er velkjent i teknologien. Svært spesifikke monoklonale antistoffer kan fremstilles ved hybridiseringsteknikker som er velkjent i teknologien, se f.eks. Kohler og Milstein [Nature 256. 495-497 (1975); og Eur. J. Immunol. 6, 511-519 (1976)]. Slike antistoffer har vanligvis en høyst spesifikk reaktivitet. I de radioaktive metallionkonjugatene kan anvendes antistoffer rettet mot hvilket som helst ønsket antigen eller hapten. Fortrinnsvis er de antistoffene som anvendes i de radioaktive metallionkonjugatene, monoklonale antistoffer, eller fragmenter derav som har høy spesifisitet for én eller flere ønskede epitoper. Antistoffer som anvendes i den foreliggende oppfinnelse, kan rettes mot f.eks. tumorer, bakterier, sopp, virus, parasitter, mykoplasma, differensierings- og andre celle-membranantigener, patogene overflateantigener, toksiner, enzymer, allergener, medikamenter og hvilke som helst biologisk aktive molekyler. Noen eksempler på antistoffer eller anti-stof fragmenter er CC-ll, CC-46, CC-49, CC-49 F(ab')2, CC-83, CC-83 F(ab')2 og B72.3. [Se D. Colcher et al., Cancer Res. 48, 4597-4603 (15. august 1988) for CC-49, CC-83 og B72.3 antistoffer. Hybridomcellelinjen B72.3 er lagret i the American Type Culture Colleciton (ATCC) med adgangsnummeret HB 8108. De forskjellige CC-antistoffene er beskrevet i U.S. patentsøknad 7-073,685, innlevert 15. juli 1987, som er tilgjengelig gjennom NTIS. De andre murine monoklonale antistoffene binder seg til epitoper av TAG-72, et tumorassosiert antigen]. En mer fullstendig liste over antigener kan finnes i U.S. patent 4,193,983, som er inntatt heri ved referanse. De radioaktive metallionkonjugatene ifølge den foreliggende oppfinnelse blir spesielt foretrukket for diagnose og behandling av forskjellige typer cancer.

De foretrukne sjeldne jordarts- (lantanid eller pseudo-lantanid) kompleksene ifølge den foreliggende oppfinnelse, representeres ved formelen:

hvori: Ln er et sjeldent jordartmetall- (lantanid)ion, såsom Ce<3+>, Pr<3+>, Nd3+, Pm<3+>, Sm<3+>, Eu<3+>, Gd<3+>, Tb<3+>, Dy<3+>, Ho<3+>, Er3<+>, Tm<3+>, Yb<3+> og Lu<3+>, eller pseudo-lantanidmetallion, såsom

Sc<3+>, Y<3+> og La<3+>, spesielt foretrukne metallioner er Y<3+>,

Ho<3+>, Lu<3+> eller Sm<3+>; BFC representerer et bifunksjonelt chelateringsmiddel; og C representerer et farmasøytisk akseptabelt ion eller gruppe av ioner med tilstrekkelig ladning til å gjøre hele komplekset nøytralt. Dersom BFC inneholder fire eller flere negativt ladede grupper, da er C et kation eller en gruppe av kationer såsom H+, Li<+>, Na<+>, K<+>, Rb<+>, Cs<+>, Mg<2+>,

Ca2<+>, Sr<2+>, Ba<2+>, N<H>4<+>, N(CH3)4<+>» N(C2H5)4<+>, N(C3<H>7)4<+>, N(<C>4H9)4<+>, As(C6<H>5)4<+,> [(C6H5)3P=]2N<+> og andre protonerte aminer. Dersom BFC inneholder tre negativt ladede grupper, da er C ikke nødvendig. Dersom BFC inneholder to negativt ladede grupper, da er C et anion såsom F~, Cl", Br", I", C104~, BF4~, H2P04~, HC03~, HC02", CH3S03~, H3C-C6H4-S03~, PF6", CH3C02" og B(C6H5)4~.

Konjugatene ifølge denne oppfinnelsen, og i noen tilfeller kompleksene ifølge denne oppfinnelsen, kan anvendes som en formulering. Formuleringen omfatter en forbindelse med formelen (I) med antistoff- og/eller metallionet og en fysiologisk akseptabel bærer, et bindemiddel eller hjelpemiddel for denne. Formuleringen kan således bestå av en fysiologisk akseptabel bærer med et kompleks (metallion + ligand), konjugat (metallion + ligand + antistoff) eller (ligand + antistoff). Fremgangsmåtene for fremstilling av slike formuleringer er vel kjent. Formuleringen kan være i form av en oppslemming, injiserbar løsning eller andre egnede formuleringer. Fysiologisk akseptable oppslemmingsmedier, med eller uten hjelpemidler, kan anvendes.

Formuleringene ifølge den foreliggende oppfinnelse er i fast eller flytende form inneholdende det aktive radionuklidet kompleksert med liganden. Disse formuleringene kan være i kit-form slik at de to komponentene (dvs. ligand og metall,

kompleks og antistoff, eller ligand/antistoff og metall) blir blandet på et passende tidspunkt før anvendelsen. Enten blandet på forhånd eller som en kit, krever formuleringene vanligvis en farmasøytisk akseptabel bærer.

Injiserbare blandinger ifølge den foreliggende oppfinnelse kan være enten i form av en oppslemming eller løsning. Ved fremstilling av egnede formuleringer må man vanligvis ta hensyn til at vannløseligheten av saltet er større enn syreformen. I løsningsform blir komplekset (eller om ønsket de separate komponentene) løst i en fysiologisk akseptabel bærer. Slike bærere omfatter et egnet løsningsmiddel, konserveringsmidler såsom benzylalkohol, om nødvendig, og buffere. Anvendbare løsningsmidler omfatter f.eks. vann, vandige alkoholer, glykoler og fosfonat- eller karbonatestere. Slike vandige løsninger inneholder ikke mer enn 50% av det organiske løs-ningsmidlet etter volum.

Injiserbare suspensjoner er blandinger ifølge den foreliggende oppfinnelse som krever et flytende suspensjonsmedium, med eller uten hjelpemidler, som bærer. Suspensjonsmediet kan være f.eks. vandig polyvinylpyrrolidon, inerte oljer såsom vegetabilske oljer eller høyt raffinerte mineraloljer, eller vandig karboksymetylcellulose. Egnede fysiologisk akseptable hjelpemidler, dersom de er nødvendige for å holde komplekset i suspensjon, kan velges blant fortykningsmidler såsom karboksymetylcellulose, polyvinylpyrrolidon, gelatin og alginatene. Mange tensider kan også anvendes som suspensjonsmidler, f.eks. lecitin, alkylfenol, polyetylenoksydaddukter, naftalensul-fonater, alkylbenzensulfonater og polyoksyetylensorbitanesterne.

Mange stoffer som påvirker de hydrofile egenskapene, tettheten, og overflatespenningen for det flytende suspensjonsmediet, kan befordre fremstillingen av injiserbare suspensjoner i enkelte tilfeller. F.eks. er silikonantiskummidler, sorbitol og sukkerarter alle sammen brukbare suspensjonsmidler.

En "effektiv mengde" av formuleringen blir anvendt for terapi. Dosen vil variere avhengig av den sykdommen som behandles. Selv om in vitro diagnose kan gjennomføres med formuleringene ifølge denne oppfinnelse, blir også in vivo diagnose overveid ved bruk av formuleringer ifølge denne oppfinnelse. Konjugatene og formuleringene ifølge denne oppfinnelse kan også anvendes i radioimmunstyrt kirurgi (RIGS); andre metaller som kan anvendes for dette formålet, omfatter imidlertid også 99mTc, i:L1In, 113mIn, 67Ga og 68Ga.

Andre anvendelser av noen av chelateringsmidlene ifølge den foreliggende oppfinnelse, kan omfatte magnetisk resonansav-bildning, f.eks. bindingen til polymere bærere for spesielle formål av komplekser med formel I, spesielt komplekser med formelen VI, med Gd<+3>, f.eks. som diagnostiske midler, og fjerning av lantanidmetall eller pseudo-lantanidmetallion ved selektiv ekstraksjon.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer chelateringsmidler, komplekser og antistoffkonjugater hvorav noen er mer stabile, og/eller har forbedret biodistribusjon, og/eller har hurtighere clearance fra kroppen enn dem som er kjent i teknologien. Fremgangsmåtene for fremstilling av chelateringsmidlene, kompleksene og antistoffkonjugatene ifølge denne oppfinnelsen, tilveiebringes også.

En fornuftig og generell syntetisk tilnærming til et tolv-leddet makrocyklisk, bifunksjonelt chelateringsmiddel ifølge den foreliggende oppfinnelse som representert ved formelen (I) medfører monofunksjonalisering av en fri-basemakrosyklus (f.eks. 1,4,7,10-tetraazacyklododekan) ved bare ett av nitrogenatomene med en egnet elektrofil (f.eks. en hvilken som helst egnet substituert a-halogenkarboksylsyreester). Denne elektrofil må ha en egnet linkergruppe eller egnet beskyttet linkergruppe som ville tillate kovalent binding av den bifunksjonelle liganden til et protein, antistoff eller antistoffragment.

Det er anerkjent i teknologien at alkyleringsteknikker for fremstilling av mono-N-funksjonelle polyazamakrocykler kan resultere i blandinger av produkter som er vanskelig å separere [T. Kaden, Top.Curr.Chem. 121, 157-75 (1984)]. Dette problemet er blitt løst ved den beskrevne anvendelse av store overskudd av makrosyklus (5-10 ekvivalenter i forhold til elektrofilen) hvilket befordrer dannelse av monoalkyleringsadduktet [M. Studer og T.A. Kaden, Helv.Chim.Acta 69. 2081-86 (1986); E. Kimura et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1158-59 (1986)].

Andre veier til mono-N-funksjonelle polyazamakrocykler medfører vidtgående beskyttelses-, funksjonaliserings- og avbeskyttelsesskjema [P.S. Pallavicini et al., J. Amer. Chem. Soc. 109, 5139-44 (1987); M. F. Tweedle et al., Eur. Pub. Pat. Appln. No. 0232-751]. En fersk rapport over reduktiv aminering av substituerte fenylpyruvinsyrer og -aminer er utgitt av Abbott Labs. som et sammendrag fra et nylig avholdt møte (D. K. Johnson et al., Florida Conf. on Chem. in Biotechnology, 26.-29. april (1988) , Palm Coast, FL). En fremgangsmåte som fremstiller mono-N-alkylerte polyazamakrocykler ved anvendelse av en elektrofil med mellom om lag én og fem ekvivalenter av en egnet makrosyklus i et løsningsmiddel som ikke vil befordre protonoverføring, er beskrevet i U.S. søknad serie nr. 289,163, av W. J. Kruper, innlevert 22. desember 1988.

Generelle syntetiske veier til chelateringsmidlene ifølge den foreliggende oppfinnelse er beskrevet i synteseskjerna I-IV

i det følgende, og medfører omsetning av en egnet elektrofil og polyazamakrocykelen, ved forskjellig støkiometri, temperatur og konsentrasjon i et egnet organisk løsningsmiddel. Eksempler på egnede organiske løsningsmidler er et hvilket som helst

hydrokarbon som understøtter løseligheten, såsom acetonitril, isopropanol, metylenklorid, toluen, kloroform, n-butanol, karbontetraklorid, tetrahydrofran, 5% etanol i kloroform, mens de mest foretrukne er kloroform, metylenklorid, n-butanol, 1,4-dioksan og acetonitril. Støkiometriske mengder eller nesten støkiometriske mengder av makrosyklus og elektrofil kan anvendes, og gir det tilsvarende mono-N-alkyleringsproduktet i et enkelt trinn. Temperaturområdet for omsetningen er fra om lag 0°C til om lag tilbakeløp, fortrinnsvis fra 0°C til 25°C. Reaksjonstiden til fullstendig omsetning er om lag 1 til om lag 24 timer.

Generell tilgang til substituerte a-halogensyreestere er ønskelig for at synteseskjema II og IV totalt sett skal være brukbare. En egnet tilnærming medfører brominering eller klorering av det in situ fremstilte syrehalogenidet, f.eks. D.N. Harpp et al., J. Org. Chem. 40» 3420-27 (1975). Denne metoden tillater eksklusiv alfa-halogenering av alkansyrer som til og med inneholder reaktive benzylgrupper. En generell metode til substituerte syrehalogenider medfører omsetning av den organiske syren med tionylklorid eller sulfurylklorid, f.eks. E. Schwenk et al. J. Amer. Chem. Soc. 7_0, 3626-27

(1944). Begge metodene anvender den frie karboksylsyren som ofte er tilgjengelig fra kommersielle kilder.

Polyazamakrocykler såsom 1,4,7,10-tetraazacyklododekan kan fremstilles ved dokumenterte metoder såsom T. J. Atkins et al.., J. Amer. Chem. Soc. 96, 2268-70 (1974) og T.J. Richman et al., Org. Synthesis 58. 86-98 (1978).

Karboksymetylering av den mono-N-funksjonelle makrocykelen kan gjennomføres ved fremgangsmåten til Desreux ved bruk av bromeddiksyrederivater og en egnet base [J.F. Desreux, Inor. Chem. 19, 1319-24 (1980)].

Alle de utgangsmaterialene som er nødvendige for fremstilling av forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen er enten tilgjengelige fra kommersielle kilder eller kan lages utifrå beskrivelser i kjente litteraturreferanser.

I det følgende skjema (I) fremstmilles forbindelsene med formelen (I) hvor Q<1> er hydrogen. Selv om bare én forbindelse er indikert ved de viste betingelsene, kan det også fremstilles andre lignende grupper innenfor formel (I) hvor Q<1> er hydrogen, r = 0 eller 1, n = 0 eller 1 og m = 0 til og med 10 ved hjelp av denne fremgangsmåten.

I det følgende skjema II fremstilles forbindelsene med formelen (I) hvor Q<1> er hydrogen. Selv om bare én forbindelse er indikert ved de viste betingelsene, kan det også fremstilles andre lignende grupper innenfor formelen (I) hvor Q<1> er hydrogen, r = 0 eller 1, n = 0 eller 1 og m = 0 til og med 10 ved hjelp av denne fremgangsmåten.

I det følgende skjema III fremstilles forbindelsene med formelen (I) hvor Q<1> er C02R. Selv om bare én forbindelse er vist ved de angitte betingelsene, kan det også fremstilles andre lignende grupper innenfor formelen (I) hvor Q<1> er C02R. innbefattet m = 0 til og med 10, n = 0 eller 1 og r = 0 ved hjelp av denne fremgangsmåten. I det følgende skjema IV fremstilles forbindelsene med formelen (I) hvor Q<1> er (CHR<5>')wC02R. Selv om bare én forbindelse er vist ved de angitte betingelsene, kan det også fremstilles andre lignende grupper innenfor formelen (I) hvor Q<1> er (CHR<5>')wC02R, omfattende m = 0 til og med 10, n = 0 eller 1 og r = 0 ved denne fremgangsmåten.

I skjema IV kan det viste reagenset inneholdende A' være en hvilken som helst egnet utgående gruppe for en oc-syre, dvs. A' er fenyl eller CF3.

Anvendelse av et optisk aktivt alkyleringsmiddel har minimalisert diastereomerene og forenkler syntesen. Isolering av en enkelt diastereomer som kunne føre til et enkelt lanta-nidkompleks som var lett å rense, ville være ønskelig for radichelatering så vel som for antistoffkonjugering.

I det følgende skjema V fremstilles forbindelsene med formelen (I) hvor Q<1> er hydrogen eller (CHR<5>)wC02R og R<2> er hydrogen. Selv om bare to forbindelser er vist ved de angitte betingelsene, kan også andre lignende grupper innenfor formelen (I) hvor Q<1> er hydrogen eller (CHR<5>)wC02R, Q er hydrogen eller (CHR<5>)pC02R, r = 0 eller 1, n = 0 eller 1, w = 0 eller 1, m = 0 til og med 10, p = 1 eller 2, L representerer formelen A hvori R<3> er definert som tidligere, R<2> og R<4> velges fra gruppen bestående av hydrogen, amino, nitro, isotiocyanat, semikarbazid, tiosemikarbazid, maleimid, bromacetamido og karboksyl, fremstilles ved denne fremgangsmåten.

Den eleketrofile gruppen ("R<1>" i formelen) kan også fremstilles ved fremgangsmåter kjent i teknologien. Slike fremgangsmåter kan finnes i Acc. Chem. Res. 17, 202-209 (1984). En fremgangsmåte som kan fremstille forbindelser med formelen (I) hvor R<1> kunne være en isotiocyanatgruppe (tilstedeværende R<2> eller R<4> er isotiocyanto når L = formel A) medfører omsetning av aminochelatet (R<2> eller R<4> lik amino, tilstede når L = formel A) med tiofosgen, og er beskrevet i U.S. søknad serie nr. 289,172, av M.J. Fazio, et al., innlevert 23. desember 1988.

Radionuklider kan fremstilles på flere måter. I en kjernereaktor bombarderes et nuklid med nøytroner for å oppnå et radionuklid, f.eks.

En annen fremgangsmåte til å oppnå radionuklider er å bombardere nuklider med partikler i en lineær akselerator eller en cyklotron. Ytterligere en annen måte er å isolere radionuklidet fra en blanding av fisjonsprodukter. Fremgangsmåten til å oppnå nuklidene som anvendes i den foreliggende oppfinnelse, er ikke avgjørende for disse.

Konjugatene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved først å danne komplekset og deretter binde antistoffet eller antistoffragmentet. Fremgangsmåten medfører således å fremstille eller og oppnå liganden, danne komplekset med metallet og deretter tilsette antistoffet. Alternativt kan en fremgangsmåte for fremstilling av merkede antistoffkonjugater først innbefatte konjugering av BFC til antistoffet og dets påfølgende chelatering for å oppnå det radionuklid-BFC-merkede Ab. En hvilken som helst egnet fremgangsmåte som fører til dannelsen av konjugatene ifølge denne oppfinnelsen, er innenfor rammen av denne oppfinnelse.

I de følgende eksemplene ble det brukt følgende uttrykk og betingelser, dersom intet annet er oppgitt.

Massespektra ble oppnådd på enten et Finnigan TSQ massespektrometer (Q^-MS metoden) eller et VG ZAB-MS massespektrometer med høy oppløsning (hurtig atombombardement med xenon, ved bruk av 3:1 ditiotreitol:ditioerytritol).

^•H og <13>C NMR-spektra ble oppnådd ved bruk av et Varian VXR-300, Bruker APC 300, IBM/Bruker NR-80 eller et Jeol FX400 spektrometer. Alle spektra ble fremstilt ved 30°C dersom intet annet er bemerket. ^-H NMR ble utført ved hhv. 300 MHz, 80 MHz eller 400 MHz, på det utstyret som er oppført ovenfor; <13>C NMR ble utført ved hhv. 75 MHz, 20 MHz eller 100 MHz på det utstyret som er oppført ovenfor. Verdiene for NMR er å mot TMS (tetrametylsilan) eller når D20 var løsningsmidlet, mot DSS (2,2-dimetyl-2-silapentan-5-sulfonsyre, natriumsalt).

Infrarød spektra (IR) ble opptatt på et Nicolet 5Sx FT/IR instrument.

For kromatografifremgangsmåtene var de fleste løsnings-midlene Fisher materialer av HPLC-kvalitet. Ammoniumacetat ble kjøpt fra Aldrich. Vann ble renset ved bruk av et Barnstead NANOpure™ vannfiltreringssystem. Preparativ kromatografi av organiske forbindelser ble utført enten med vanlig tyngdekraft-kromatografi ved bruk av standard teknikker, eller med flash-kromatografi som beskrevet av C.W. Still et al., J. Org. Chem.

43., 2923-24 (1978). De følgende løsningsmiddelsystemene ble anvendt:

Rf-verdier er rapportert ved bruk av disse løsningsmiddel-systemene og kommersielt tilgjengelig, normalfase, silika TLC-lplater [GHLF 250 mikron, Analtech Inc. eller Merck Kieselgel 6OF254]. Preparativ kolonnekromatografi ble utført ved bruk av Merck kvalitet 60, 60 Å silikagel.

Alle prosentsatser er etter vekt dersom intet annet er bemerket.

Noen faste stoffer ble tørket ved bruk av en roterende fordamper (Buchi 461) og/eller en vakuumovn ved en temperatur på om lag 55-60°C i flere timer. Dessuten ble anvendt en Virtis modell 10-010 automatisk frysetørker eller Speed Vac™ konsentrator for løsningsmiddeltjerning.

Samarium-153 og lutetium-177 ble fremstilt av forsknings-reaktoren, University of Missouri, (Columbia, MO). Yttrium-90 ble kjøpt fra Oak Ridge National Laboratory.

1-(4-isotiocyanatbenzyl)dietylentriaminpentaeddiksyre (SCN-Bz-DTPA) ble fremstilt ved en modifikasjon av fremgangsmåten til M. W. Brechbiel, et al., Inorg. Chem. 25, 2772-2781

(1986), og renset for å gi en enkelt forbindelse ved anionbytter HPLC (Q-Sepharose™). Noen av de anvendte kjemikaliene ble levert fra de oppgitte kildene: N-2-hydroksyetylpiperazin-N'-2-etansulfonsyre (HEPES), fri syre og natriumsaltet ble kjøpt fra Behring Diagnostics (La Jolla, CA); natriumcitrat (garantert) var fra Fisher Scientific; tiofosgen var fra Aldrich Chemicals; ammoniumacetat, natriumacetat, etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og fosfatbufret saltløsning (PBS) var fra Sigma Diagnostics.

Anvendte HPLC-kolonner var: Håndpakket Q-Sepharose™

(Pharmacia) enten 1,5 cm x 25 cm eller 2,5 cm x 25 cm; Zorbax™ BIO Serier GF-250 (9,4 mm x 25 cm) fra Du Pont Instruments; Vydac™ (Varemerke til the Separations Group, Hesperia, CA) protein C-4 (4,6 mm x 25 cm) fra the Separation Group (Hesperia, CA) ; og Mono-Q™ og SP-Sephadex™ (Varemerke til Pharmacia Biotechnology Products) fra Pharmacia. Sep-Pak™ (varemerke til Waters Associates) C-18 patron ble kjøpt fra Waters Associates (Milford, MA), Sephadex ™ G-25 engangskolonner

(2,2 ml) fra Isolab Inc. (Akron, OH) , og Centricon™-30

(Varemerke til Amicon Division, W. R. Grace & Co., Danvers, MA)

mikrokonsentratorer fra Amicon.

Fem HPLC-systemer ble anvendt for analyse og prøvesepara-sjoner: System I bestod av LKB 2150 pumpe, og 2152 kontroller, en UV-detektor - LKB 2238 UV Cord, en Berthold LB 506 A HPLC radioaktivitetmonitor (fra den internasjonale Berhold-gruppen)

og en Gilson fraksjonskollektor 201-202 (Gilson International, Middleton, WI);

System II var utstyrt med en auto-prøvetager, WISP 710 B,

to pumper (modell 510) og en automatisk gradientkontroller (fra Waters Associates), en Perkin-Elmer LC-75 spektrofotometrisk detektor, en Beckman modell 170 radioisotop detektor, og en fraksjonssamler (Frac-100 fra Pharmacia);

System III bestod av to Waters M-6000A pumper med en Waters 660 løsningsmiddelprogrammerer, en Waters modell 481 variabel bølgelengdedetektor, og en Waters datamodul, også en ISCO-fraksjonssamler ble anvendt preparativt.

System IV var Dionex BioLC™ system utstyrt med en variabel bølgelengde UV-detektor; og

System V var en Waters modell 590 pumpe med en ISCO modell 2360 gradientprogrammerer og en Dionex variabel bølgelengde-detektor .

For sentrifugering og kosentrering ble anvendt en Sorvall RT 6000B (kjølesentrifuge fra Du Pont). En Speed Vac konsentrator (Savant Instruments Inc., Hicksville, N.Y.) ble brukt til fjerning av flyktige løsningsmidler. Radioaktivitetsmålinger ble gjort på en Capintec™ radioisotop kalibrator (varemerke for Capintec Inc.) CRC-12, eller ved væskescintillasjon på Beckman LS 9800 (Beckman Instruments, Inc, Irvine, CA), eller på en Canberra 35<+> multikanalanalysator innfaset med en 3 tommers (7,5 cm) talliumdrevet natriumjodid brønnkrystall.

I eksemplene vedrørende kompleksdannelse ble prosent kompleksbestemmelsen utført ved hjelp av følgende generelle utvekslingsmetode hvor det er angitt.

En 10 ml plastkolonne ble fylt med 1 til 2 ml SP-Sephadex™ C-25 harpiks som var svellet i vann. Overskudd av vann ble fjernet ved hjelp av trykk på toppen av kolonnen. Testløsningen

(15 ul) ble tilsatt til toppen av harpiksesn, deretter ble anvendt 2 ml av 4:1 (V:V) av isotonisk saltløsning: kons. NH4OH som elueringsmiddel. Elueringsmidlene ble oppsamlet i et tellerør. Ytterligere 2 ml elueringsmiddel ble brukt. Etter oppsamlingen av elueringsmiddel i et andre tellerør, ble det anvendt lufttrykk på toppen av harpiksen for å bringe den til tørrhet. Den tørkede harpiksen ble overført til et tredje tellerør. Aktiviteten i hvert av tellerørene ble målt med en Nal brønnteller koblet til en Canberra multikanalanalysator. Mengden av metallet som kompleks ble gitt som prosent av den totale aktiviteten som ble funnet i elueringsmidlet. Mengden av metall i den frie ukomplekserte tilstand ble gitt som prosentsatsen av alt det metallet som blir tilbake i harpiksen.

Fjerning av ukompleksert metall ved ionebytting

En 10 ml plastkolonne ble fylt med 0,5 ml SP-Sephadex™ C-25-harpiks svellet i vann. Overskuddsvann ble fjernet ved sentrifugering av kolonnen ved 3,000 rpm i 4 min.. Et volum på 200-500 pl av kompleksløsningen ble plassert på toppen av harpiksen, og røret sentrifugert igjen i 4 min. ved 3,000 rpm.. Det ukomplekserte metallet ble tilbake i kolonnen, og det komplekserte metallet ble eluert med løsningsmidlet.

Fremstilling av vttriumkompleks:

Komplekser ble laget ved fremstilling av en 3 x 10"<4>M yttriumløsning i vann (YC13.6H20, 303,26 g/mol; eller Y(0Ac)3, 12,1% H20). Radioaktiv Y<3+->løsning (Oakridge National Laboratories) ble tilsatt, for å gi det ønskede radioaktivitetsnivået. 10 pl ligandløsning (ved 0.03M) ble tilsatt til 990 pl av <y3+->løsningen, hvilket ga et 1:1 molforhold for ligand:metall. 10 ganger mengden av ligandløsning ble anvendt for et 10:1 ligand til metallforhold. pH ble justert til 7,4 ved bruk av mikro-litermengder av HC1 eller NaOH. Løsningen ble deretter testet for mengden av kompleksert yttrium ved bruk av kationbyttermetoden gitt ovenfor.

Fremstilling av samariumkompleks:

Samariumkomplekser ble laget som beskrevet ovenfor for yttriumkomplekser, unntatt at 3 x 10~<4>M samarium ble fremstilt ved oppløsning av Sm203 (348,7 g/mol) i 0,1M HC1. Radioaktiv Sm-153 ble laget som en om lag 3 x 10~<4>M løsning i 0,1M HC1 fra University of Missouri Research Reactor, Columbia, Missouri.

Følgende definisjoner gis for noen av uttrykkene som anvendes i denne teksten.

Ordliste:

Kons. betyr konsentrert;

~OAc betyr acetatgruppen, "0C0CH3;

TLC betyr tynnsjiktskromatografi;

DI H20 betyr avionisert NANOpure™ vann;

NANOpure™ vann er rent vann som fås fra et Barnstead NONOpure™ vannfiltreringssystem;

Omgivende temperatur betyr romtemperatur eller om lag 20 til om lag 25°C;

Over natten betyr fra om lag 9 til om lag 18 timer;

LC betyr væskekromatografi;

NBS betyr N-bromravsyreimid;

MES betyr 2-(N-morfolin)etansulfonsyre;

HPLC betyr høytrykks-væskekromatografi;

PBS betyr fosfatbufret saltløsning fra Sigma, inneholdende 120 mM NaCl, 2,7 mM KC1 og 10 mM fosfatbuffer, pH 7,4;

SP-Sephadex™ C-25 harpiks er en kationbytterharpiks som har sulfonsyrefunksjonalitet, og selges av Pharmacia, Inc.;

rpm = omdreininger pr. min.;

pD betyr pH hvor hydrogenet er deuterisert;

DOTA = 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,7,10-tetraeddiksyre;

HEPES = N-2-hydroksyetylpiperazin-N'-2-etansulfonsyre;

BFC = bifunksjonelt chelateringsmiddel;

Cyklen = 1,4,7,10-tetraa z acyklododekan;

PA-DOTA = a-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksyre;

PA-DOTMA = a-[2-(4-aminofenyl)etyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododekan-l-eddik-4,7,10-tris(metyleddik)syre;

BA-DOTA = a-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraeddiksyre;

OMe-BA-DOTA = a-(5-amino-2-metoksyfenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraeddiksyre;

EA-D03A = 1-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre;

DTPA = dietylentriaminpentaeddiksyre;

SCN-Bz-DTPA = 1-(4-isotiocyanatbenzyl)-dietylentriaminpentaeddiksyre ;

EDTA = etylendiamintetraeddiksyre;

chelateringsmiddel er likeverdig med ligand;

kompleks er likeverdig med chelat;

konjugat betyr et chelateringsmiddel eller kompleks som er kovalent bundet til et antistoff eller antistoffragment; og

antistoffer betyr CC-49, CC-83 og B72.3 og deres fragmenter såsom Fab og F(ab')2- Andre mulige antistoffer er gitt heri tidligere. Hybridomcellelinjen B72.3 oppbevares i the American Type Culture Collection, med adgangsnummeret ATCC HB 8108, og de andre navngitte murine monoklonale antistoffene binder seg til epitoper av TAG-72, et tumorassosiert antigen.

Oppfinnelsen vil nå bli ytterligere belyst ved betraktning av følgende eksempler, som utelukkende har til hensikt å være eksempler på anvendlese av oppfinnelsen.

Fremstilling av utqanqsmaterialer

Eksempel A

Fremstilling av d,l-2-brom-4-(4-nitrofenyl)-butansyre, metylester

Til en løsning av 5 ml karbontetraklorid og 15 ml (0,2 mol) av tionylklorid ble tilsatt 10,46 g (0,05 mol) av 4-(4-nitro-fenyl)butansyre under nitrogenatmosfære. Løsningen ble brakt til tilbakeløp i 1 time med begynnende frigjøreing av hydrogen-kloridgass og svoveldioksydgass. Til den varme løsningen ble tilsatt 11,0 g (0,06 mol) av N-bromravsyreimid i 25 ml karbontetraklorid, og tre dråper av 48 prosent vandig hydrogenbromidkatalysator. Frigjøring av bromgass ble bemerket. Den mørkerød løsningen ble brakt til tilbakeløp i 35 min.. Løsningen ble avkjølt og helt over i 100 ml metanol under omrøring. TLC-analyse (60:40 etylacetat:heksan v:v) indikerte et nytt produkt (Rf = 0,69, silikaplater). Overskudd av løsningsmiddel ble fjernet ved roterende fordampning, og den mørkerød oljen ble filtrert gjennom et flash silikagelsjikt (1 tomme x 5 tommer)

(2,5 cm x 12,5 cm) ved bruk av metylenklorid som elueringsmiddel. Fordampning av løsningsmidlet ga en klar olje, utbytte 15,43 g, som var en 85:15 blanding av tittelproduktet: metylesteren av det opprinnelige butansyrederivatet. Tittelproduktet ble karakterisert ved:

^■H NMR (CDC13)

8,16(d), 7,38(d), 4,20(dd), 3,79(s), 2,88(m), 2,38(m);

<13>C NMR (CDCI3, 75 MHZ)

169,6, 147,5, 129,3, 123,7, 53,0, 44,4, 35,5, 33,0.

Eksempel B

Fremstilling av a-[2-(4-nitrofenyl)etyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododekan-l-eddikskyre, 1-metylester.

Til en omrørt løsning av 1,72 g (10,0 mmol) av 1,4,7,10-tetraazacyklododekan i 17 ml pentenstabilisert kloroform ble tilsatt 2,07 g (5,82 mmol) av d,l-2-brom-4-(4-nitrofenyl)butan-syre, metylester (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel A) i løpet av fem minutter under nitrogenatmosfære med omrøring. Reaksjonsblåndingen ble omrørt i 48 timer ved om lag 25°C. TLC (ved bruk av løsningsmiddelsystem 2, på Analtech silikakgel-plater) indikerte dannelse av tittelproduktet (Rf = 0,73). Den gule kloroformløsningen ble påsatt på en 1 tomme x 15 tommer flash silikagelkolonne (foreluert med 5% metanolisk kloroform), eluert med 250 ml av 5% metanolisk kloroform, etterfulgt av eluering med løsningmsiddelsystem 2. Fraksjoner som inneholdt rent tittelprodukt ble slått sammen, og inndampet for å gi 2,15 g (5,46 mmol, 94%) av tittelproduktet som et lysegult glass. Utgnidning av en kloroformløsning av dette glasset i dietyleter resulterte i utfelling av et hvitt pulver (sp. = 156-159°C) av analytisk renhet og karakterisert ved:

<X>H NMR (CDCI3)

8,14(d), 7,39(d), 3,71(s), 3,39(dd), 2,5-3,0(m), 2,08(m), 2,01(m);

<13>C NMR (CDCI3, 75 MHZ)

172,7, 149,3, 146,4, 129,2, 123,6, 62,3, 51,2, 48,9, 47,2, 45,8, 45,4, 32,8, 30,9.

Eksempel C

Fremstilling av 2-brom-2(4-nitrofenyul)etansyre, metylester.

En blanding av p-nitrofenyleddiksyre (25,0 g, 0,14 mol) og tionylklorid (15,1 ml, 0,21 mol) i tørr benzen (100 ml) ble omrørt ved tilbakeløp under en N2 atmosfære i tre timer. Blandingen ble deretter inndampet til tørrhet in vacuo. Residuet ble oppløst i karbontetraklorid og omrørt ved tilbakeløp under nitrogenatmosfære. Brom (7,2 ml, 0,14 mol) ble tilsatt i små porsjoner i løpet av en periode på 3 døgn til tilbakeløps-blandingen. Reaksjonsblandingen fikk avkjøle seg, og syre-kloridet ble guenchet med metanol (50 ml, tilsatt langsomt).

Den resulterende bromester (27 g, 71%) ble gjenvunnet som en

gul olje ved destillasjon ved redusert trykk (kp. = 168°C ved 1,1 mm) gjennom en 6 tommers kolonne av glass-spiraler. Strukturen for tittelproduktet ble bekreftet ved:

<X>H NMR (CDC13)

8,25(d), 7,81(d), 5,51(s), 3,86(s).

Eksempel D

Fremstilling av a-(4-nitrofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l-eddiksyre, 1-metylester.

Til 529 mg (2,068 mmol) av 2-brom-2-(4-nitrofenyl)etansyre, metylester (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel C) i 20 ml acetonitril ble tilsatt på en gang en løsning av 354 mg

(2,068 mmol) av 1,4,7,10-tetraazacyklododekan i 20 ml acetonitril som inneholdt akkurat tilstrekkelig metanol til å gjennomføre fullstendig oppløsning. Den resulterende lyserød løsningen ble omrørt i 1,5 timer, deretter konsentrert in vacuo ved 35°C til

et lite volum. Dette rå monoestertetraamin ble renset ved silikagelkromatografi, eluert med 20% (vekt/volum) NH4OAC/CH3OH. Det rensede monoestertetraaminet isolert på denne måten som triacetatsaltet ble deretter omdannet til det frie amin. Deretter ble 270 mg i 3 ml vann behandlet ved 0°C med vandig K2C03 (10% vekt/vekt) til en pH på 11. Den basiske løsningen ble deretter ekstrahert med 10 ml kloroform, fem ganger, og kloroformsjiktene ble slått sammen, tørket over natriumsulfat og konsentrert for å gi 160 mg (42% utbytte) av det ønskede monoestertetraamin, karakterisert ved NMR og hurtig atombom-bardementmassespektrometri ([M+HJ<+>=366) og ved:

^-H NMR (CDCI3)

8,12(d), 7,44(d), 4,75(s), 3,76(s), 2,67-2 ,44 (m) ;

<13>C NMR (CDCI3)

171,5, 147,6, 144,0, 130,,0, 124,0, 67,0, 49,8, 47,9, 46,9, 46,0.

Eksempel E

Fremstilling av N-(2-metoksy-5-nitrobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan.

Til en omrørt kloroformløsning (20 ml) inneholdende 2,9 g av 1,4,7,10-tetraazacyklododekan (16,8 mmol) ble tilsatt en kloroformløsning (20 ml) inneholdende 2,1 g av 2-metoksy-5-nitrobenzylbromid (8,5 mmol) i en porsjon. Etter omrøring ved romtemperatur i 3 timer, ble reaksjonsblandingen filtrert, og filtratet konsentrert (in vacuo) for å gi et residuum som ble kromatografert (silika, løsningsmiddelsysstem 3). Det mono-alkylerte produktet ble isolert i 79% utbytte (sp. = 154-156°C), og karakterisert ved:

<13>C NMR (CDCI3)

162,47, 140,63, 127,92, 125,49, 124,53, 109,91, 55,88, 53,25, 50,90, 47,18, 45,45, 45,29.

Eksempel F

Fremstilling av N-(2-hydroksy-5-nitrobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan.

Til en 1,4-dioksanløsning (20 ml) av 1,4,7,10-tetraazacyklododekan (2,3 g, 14 mmol) ble tilsatt en dioksanløsning (15 ml) av 2-hydroksy-5-nitrobenzylbromid (1,2 g, 7 mmol) i én porsjon under konstant omrøring. Etter flere minutter ble tilsatt K2C03 (lg), og omrøringen fortsatt i 1 time ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble deretter filtrert, og filtratet konsentrert in vacuo for å gi et gult halvfast stoff som ble kormatografert (kolonne) på silikagel, eluert med løsningsmiddelsystem 5. Det ønskde mono-alkylerte produktet ble isolert fra den siste 1/3 av lysegult elueringsmiddel som også inneholdt ureagert amin. Etter konsentrering ble den gule oljen gnidd ut med CHC13 (100 ml) og filtrert, for å fjerne CHCl3-løselig amin-utgangsmateriale. Det endelige produktet ble deretter isolert i ren form som et gult fast stoff (1,2 g,

55%); (sp. = 142-145°C) og ytterligere karakterisert ved:

<13>C NMR (D20)

25,04, 25,28, 26,83, 31,80, 36,54, 101,88, 107,22, 110,92, 111,80, 115,26, 159,99.

Eksempel G

Fremstilling av l-[2-(4-nitrofenyl)etyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododekan .

Til en omrørt løsning av 3,50 g (20,3 mmol) av 1,4,7,10-tetraazacyklododekan i 50 ml pentenstabilisert kloroform ble tilsatt dråpevis i løpet av en 5 minutters periode under kraftig omrøring under en nitrogenatmosfære 4,00 g (17,4 mmol) av 1-(2-brometyl)-4-nitrobenzen.

Omrøringen ble fortsatt i om lag 18 timer ved romtemperatur (om lag 25°C) hvorpå krystaller av aminhydrobromid falt ut av løsningen. Hele reaksjonsblandingen ble påsatt på en flash silikagelkolonne (1 tomme x 18 tommer) som var blitt foreluert med 5% metanol i kloroform; 200 ml av denne løsningen ble påsatt som elueringsmiddel, etterfulgt av eluering med løs-ningsmiddelsystem 3. Fra det ønskede produktet ble adskilt 1,45 g (9,7 mmol) av p-nitrostyren (Rf = 0,98; løsningsmiddel-system 1). Det ønskede monofunksjonelle tittelproduktet ble isolert som en oransje-gul olje (2,17 g, 7,06 mmol, 40,6%) som størknet ved henstand (Rf = 0,73, løsningsmiddelsystem 1).

En prøve av tittelproduktet ble omkrystallisert fra CHCl3/cykloheksan og viste følgende karakteristikker: sp. = 146,5-148,5°C;

<1->H NMR (CDC13)

8,135(d, m), 7,395(d, m), 2,91(t), 2,77(t),

2,72(t), 2,50(t), 2,60(s);

13C NMR (CDCI3, 75 MHz)

148,5, 146,7, 129,6, 123,4, 55,5, 51,4, 46,9,

45,9, 45,1, 33,7.

Eksempel H

Fremstilling av 1-(4-nitrobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan.

I 50 ml kloroform ble tilsatt 3,5 g (20,3 mmol) av 1,4,7,10-tetraazacyklododekan og 1,7 g (7,87 mmol) p-nitrobenzylbromid, og blandingen omrørt under nitrogen i 24 timer ved 25°C. Kloroformvellingen av hydrobromidsaltet ble deretter påsatt på en 1 tomme x 17 tommer kolonne av flashsilikagel (løsningsmiddelsystem 3). Det ble oppnådd 2,13 g (6,93 mmol)

av tittelproduktet som et blekgult fast stoff av analytisk renhet i 88% utbytte (Rf = 0,58, løsningsmiddelsystem 3), sp. = 128-129°C, og ytterligere karakterisert ved:

<3->H NMR (CDCI3)

8,19 (d), 7,49 (d), 3,69 (s), 2,82 (t), 2,70 (t), 2,59 (m);

<13>C NMR (CDCI3, 75 MHZ)

147,2, 128,4, 123,8, 58,8, 51,7, 47,1, 46,3, 45,1.

(Intet eksempel I; for å unngå forveksling med senere biologi-eksempelnumre).

Eksempel J

Fremstilling av 1-(4-aminobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan.

I 10 ml metanol ble løst 690 mg (2,25 mmol) av l-(4-nitrobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel H). Til løsningen ble tilsatt 350 mg av 10% palladium på karbonkatalysator. Overskudd av hydrogen ble boblet gjennom løsningen ved 25°C. I løpet av 45 min. viste TLC at tittelproduktet var fremstilt (Rf = 0,33, løsnings-middelsystem 3). Kromatografisk rensing av det dannede tittelproduktet ble utført på 1 tomme x 16 tommer flash silikakolonne (løsningsmiddelsystem 3) og ga 480 mg (77%) av tittelproduktet som en lysegul, klar olje.

Det frie basetittelproduktet (103 mg, 0,37 mmol) ble omdannet til hydrokloridsaltet ved gjennombobling av vannfri hydrogenklorid gjennom etanolløsning av den frie basen. Det resulterende tetrahydrokloridsaltet av tittelproduktet, etter vasking med kald etanol og tørking in vacuo, ble oppnådd i et utbytte på 147 mg (0,347 mmol), sp. = 255-260°C (dec), og ble ytterligere karakterisert ved: <1->H (D20, pD = 1,9)

7,56 (d), 7,47 (d), 3,95 (s), 3,28 (t),3,23 (t), 3,09 (t), 2,96 (t);

13C NMR (D20, pD = 1,9, 75 MHz)

138,3, 134,2, 132,2, 126,0, 58,5, 50,3, 46,7, 44,6, 44,3.

Eksempel K

Fremstilling av 2-metoksy-5-nitrobenzylnitril.

Til en løsning av natriumcyanid (6 g, 121,9 mmol) i vann

(5,3 ml) ved 70°C ble tilsatt i små porsjoner under omrøring en varm løsning av 2-metoksy-5-nitrobenzylbromid (25 g, 101,6 mmol) i etanol (15 ml). Reaksjonsblandingen ble deretter underkastet tilbakeløp i 1,5 timer, avkjølt og filtrert. Filterkaken ble vasket med acetonitril og filtratet ble inndampet in vacuo for

å gi 2-metoksy-5-nitrobenzylnitril (19,5 g, 100%) som et brunfarget fast stoff. Produktet ble karakterisert ved:

<13>C NMR (CDCI3)

161,4, 141,0, 125,7, 124,6, 119,8, 116,5, 110,2, 56,3, 18,8.

Eksempel L

Fremstilling av 2-metoksy-5-nitrofenyleddiksyre.

En velling av 2-metoksy-5-nitrobenzylnitril (19,5 g)

(fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel K) i kons. HCl (20 ml) ble underkastet tilbakeløp i 3 timer. Etter avkjøling ble det rå produktet gjenvunnet ved filtrering, og vasket med vann. Det faste stoffet ble tatt opp i varm vandig natriumhydroksyd og filtrert varmt. Den oransje løsningen ble avkjølt, og surgjort med HCl. Bunnfallet ble filtrert, vasket med vann, og tørket for å gi 2-metoksy-5-nitrofenyleddiksyre som et hvitt fast stoff (15 g, 70%). Produktet ble karakterisert ved:

<13>C NMR (CDCI3-CD3OD)

172,8, 162,5, 140,7, 126,2, 124,7, 124,1, 109,7, 55,8, 35,0.

Eksempel M

Fremstilling av a-brom-(2-metoksy-5-nitrofenyl)eddiksyre, metylester.

Til en velling av 2-metoksy-5-nitrofenyleddiksyre (2,266 g, 10,74 mmol) (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel L) i tørr benzen (50 ml) ble tilsatt tionylklorid (4,0 ml, 54,8 mmol).

Et tørkerør og kondensator ble plassert på flasken, og blandingen ble underkastet tilbakeløp i 2 timer. Den resulterende gule løsningen ble konsentrert in vacuo til et lite volum, og tatt opp i tørr karbontetraklorid. Brom (0,6 ml, 11,6 mmol) ble tilsatt, og løsningen ble underkastet tilbakeløp i to døgn under utelukkelse av atmosfærisk fuktighet. Reaksjonsblandingen ble konsentrert til et lite volum, og metanol (50 ml) ble tilsatt. Etter fordampning av overskudd av metanol in vacuo, ble den resulterende oljen renset kromatografisk (silikagel, metylenklorid-heksan 4:1). Tittelproduktet (2,399 g, 74%) ble oppnådd som en gul olje. Produktet ble karakterisert ved:

<1->H NMR (CDCI3)

8,45(dd), 8,15(dd), 6,95(d), 5,75(s), 3,99(s), 3,78(s).

Eksempel N

Fremstilling av a-(2-metoksy-5-nitrofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan, 1-eddiksyre, metylester.

En løsning av a-brom(2-metoksy-5-nitrofenyl)-eddiksyre (2,399 g, 7,89 mmol) (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel M) i kloroform (10 ml) ble tilsatt til en omrørt løsning av 1,4,7,10-tetraazacyklododekan (2,72 g, 15,79 mmol) i kloroform (50 ml). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer.

Den tåkete blandingen ble deretter kosentrert til et lite volum in vacuo ved romtemperatur. Det rå produktet ble renset ved kromatografi (silikagel, løsningsmiddelsystem 3). Tittelforbindelsen ble gjenvunnet som et gult fast stoff (2,60 g,

83%) og karakterisert ved:

<13>C NMR (CDCI3)

170,7, 161,6, 139,9, 125,0, 124,5, 124,2, 110,2, 59,5, 55,5, 50,5, 48,0, 47,3, 45,6, 44,3, 43,5.

Eksempel O

Fremstilling av d,l-2-brom-4-(4-nitrofenyl)-butansyreiso-propylester.

4-(4-nitrofenyl)butansyre (21,0 g, 0,10 mol) ble tilsatt til en løsning av karbontetraklorid (10 ml) og tionylklorid (30 ml, 0,4 mol) under nitrogenatmosfære ved bruk av fremgangsmåten til Harpp et al., J. Org. Chem 40, 3420-27 (1975). Løsningen ble brakt til tilbakeløp i 1 time med begynnende rask frigjøring av hydrogenklorid og svoveldioksyd. På dette tidspunktet ble tilsatt N-bromravsyreimid (22,0 g, 0,12 mol) som en løsning i karbontetraklorid (50 ml) og 8 dråper av 48% vandig hydrogenbromidkatalysator ble tilsatt til den varme løsningen, hvorpå frigjøring av brom ble bemerket. Den mørke rød løsningen ble underkastet tilbakeløp i ytterligere 35 min.. Løsningen ble avkjølt og helt over i isopropanol (400 ml) under omrøring. TLC-analyse (metylenklorid, silikagelplater)

åpenbarte et nytt produkt (Rf=0,73). Overskudd av løsningsmiddel ble fjernet, og den mørke rød oljen ble filtrert gjennom et flash silikagelsjikt (3 tommer x 6 tommer) ved bruk av metylenklorid som elueringsmiddel. Løsningsmidlet ble fjernet in vacuo, og den lyse gule oljen ble påsatt på en flash-silikagelkolonne (3 tommer x 18 tommer) og eluert med metylenklorid for å gi 25,0 g (0,076 mol) av bromestertittelproduktet som en klar olje i 75% utbytte som et isopropanolsolvat som inneholdt mindre enn 5% ubromert ester og karakterisert ved:

^■H NMR (CDC13)

8,16(d, 2H), 7,38(d, 2H), 5,05(septet, 1H), 4,14(dd, 1H), 2,88(m, 4H), 2,39(m, 4H), l,29(d, 6H);

<13>C NMR (CDCI3)

168,7, 147,7, 129,3, 123,8, 69,9, 45,1, 35,6, 33,0, 21,5, 21,2.

Eksempel P

Fremstilling av a-[3-(4-nitrofenyl)propyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododekan-l-eddiksyre, 1-metylester.

Til en omrørt løsning av 3,137 g (18,2 mmol) av cyklen fri base i 30 ml pentenstabilisert kloroform ble tilsatt 4,81 g (14,6 mmol korrigert) av d,l-2-brom-4-(4-nitrofenyl)-butansyre-isopropylester (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 0) i løpet av en 5 minutters periode under nitrogenatmosfære med om-røring. Reaksjonsløsningen ble omrørt i 24 timer ved romtemperatur. TLC-analyse (løsningsmiddelsystem 2) åpenbarte omdanning til monoalkyleringstittelproduktet (Rf=0,78, påvisning med ninhydrin, jod og UV-aktivitet). Den gule kloroform-løsningen ble påsatt på en 1 tomme x 17 tommer flash silikagelkolonne som var blitt for-eluert med 5% metanolisk kloroform. Eluering med 300 ml av dette løsningsmiddelsystemet ble etterfulgt av eluering med løsningsmiddelsystem 2, og ga fraksjoner inneholdende rent tittelprodukt som ble slått sammen og inndampet, og ga 4,85 g (5,46 mmol) av fri base tittelproduktet som en lett olje i 79% utbytte, og ytterligere karakterisert ved:

<3->H NMR (CDCI3)

8,15(d, 2H) , 7,40(d, 2H) , 5,07(p, 1H) , 3,35(dd, 1H) , 2,65-3,0(m, 13H), 2,5-2,64(m, 4H), 2,14(m, 1H), 2,00(m, 1H),

1,28(dd, 6H);

<13>C NMR (CDC13)

171,6, 149,5, 146,5, 129,2, 123,6, 68,1, 62,7, 49,2, 47,5, 45,9, 45,7, 32,9, 31,0, 22,1, 22,0;

IR (CDCI3) cm"<1>

3231(N-H), 2978, 2933, 1721(esterkarbonyl), 1601, 1512, 1458, 1345, 1107;

Hurtig-atombombardement-massespektrum, m/e 422 [(M+H)]+, 408, 392.

Fremstilling av sluttprodukter - ligander

Eksempel 1

Fremstilling av a-(4-nitrofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraeddiksyre, monometyl, trietylester.

I 46 ml acetonitril som inneholdt 4,6 g (33,3 mmol) av friskt pulverisert vannfritt kaliumkarbonat ble løst 700 mg (1,91 mmol) av a-(4-nitrofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1-eddiksyre, 1-metylester (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel D). Til denne oppslemmingen ble tilsatt på en gang 1,022 g (6,12 mmol) etylbromacetat. Etter fire timer omrøring ved romtemperatur ble oppslemmingen vakuumfiltrert, filterkaken ble vasket med 15 ml acetonitril, to ganger, og filtratet inndampet in vacuo ved 38°C for å gi den rå tittelprodukttetra-esteren som et purpurrødt fast stoff. Tetraesteren ble deretter renset ved silikagelkromatografi ved eluering med 5% C2H5OH/CHCI3, deretter løsningsmiddelsystem 3, for å gi 620 mg (0,988 mmol, 52%) av det ønskede produktet. Dette produktet ble karakterisert ved hurtig-atombombardement-massespektrometri ([M+H]<+>=624) og ytterligere karkaterisert ved:

<3->H NMR (CDCI3)

8,24(d), 7,45(d), 4,94(s), 4,35-4,10(m), 3,79(s), 3,75-l,84(m), l,34-l,22(m);

<13>C NMR (CDCI3)

174,3, 173,8, 173,6, 171,5, 147,6, 138,9, 131,5, 123,4,

64.8, 61,5, 61,4, 60,2, 55,4, 55,0, 53,1, 52,9, 52,7, 52,4, 51.9, 51,7, 48,8, 48,3, 44,9, 19,1, 14,1.

Eksempel 2

Fremstilling av a-(4-nitrofenyl)-1,4,7,10- tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraeddiksyre.

I 30 ml av 6N HCl ble løst 300 mg (0,478 mmol) av a-(4-nitrofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,7,10-tetraeddi-syre, monometyl, trietylester (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 1) og blandingen ble oppvarmet med tilbakeløp over natten. Ved slutten av denne tilbakeløpsperioden ble løsningen konsentrert in vacuo ved 70°C for å gi et gult fast stoff.

Dette faste stoffet ble løst i 3 ml vann, filtrert, og filtratet inndampet for å gi 253 mg (0,378 mmol, 79%) av det rå produktet. Dette produktet ble renset ved preparativ TLC [silikagel, fremkalt i 20% NH4OAC/CH3OH (vekt/volum)] og karakterisert ved hurtig-atombombardement-massespektrometri ([M+H]<+>=526) og ytterligere karakterisert ved:

^■H NMR (D20)

8,21(d), 7,42(d), 4,83(s), 3,83-2,19(m), l,92(s);

<13>C NMR (D20)

175,0, 173,6, 171,8, 167,0, 166,3, 146,9, 138,3, 130,1, 123,0, 62,2, 54,0, 53,0, 52,2, 50,4, 97,3, 46,8, 44,8, 42,8, 20,0.

Eksempel 3

Fremstilling av a-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4 ,7,10-tetraeddiksyre; (BA-DOTA).

Metode A:

Katalytisk hydrogenering av nitrogruppen i tetrasyren (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 2) ble gjennomført ved bruk av Adams katalysator (Pt02) og hydrogen i alt vesentlig i kvantitativt utbytte for å gi tittelproduktet. Dette produktet ble karakterisert ved hurtig-atombombardement ([M+H]<+>=496) og anionbytter HPLC (på Q-Sepharose™) og ytterligere karakterisert ved:

<X>H NMR (D20)

8,12(d), 7,86(d), 5,66(s), 4,73-4,57(m) , 4,27-3,78(m), 3,39-2,91(m);•

<13>C NMR (D20)

176,54, 176,52, 176,46, 141,1, 128,9, 120,9, 112,5, 65,0, 55,9, 55,7, 53,6, 49,7, 49,5, 49,3, 45,7, 45,4, 44,9, 44,6, 41,4.

Metode B:

En annen metode til syntese av denne forbindelsen var å omdanne monoestertetraaminforbindelsen fra eksempel D til monosyretetraaminforbindelsen (6N HCl, tilbakeløp over natten), etterfulgt av vandig alkylering ved bruk av bromeddiksyre, deretter reduksjon av nitrogruppen til amingruppen (Pt02-katalysator) for å gi et produkt identisk med det som er beskrevet ovenfor.

Eksempel 4

Fremstilling av a-(4-nitrofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7-trieddiksyre.

I 60 ml av 6N HCl ble løst 2,0 g (5,48 mmol) av monoestertetraaminforbindelsen (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel D). Blandingen ble oppvarmet til 95°C over natten (om lag 10 timer) hvoretter den ble konsentrert in vacuo ved 75°C for å gi 2,53 g (5,11 mmol, 96%) av monosyretetraamintetrahydrokloridet som et gult fast stoff.

Monosyretetraamintetrahydrokloridet ovenfor (0,5 g,

1,0 mmol) ble løst i 15 ml vann og justert til pH 9 med NaOH.

En separat løsning av bromeddiksrye ble fremstilt (0,71 g,

5,13 mmol) og tilsatt til vannløsningen av monosyretetraaminet. pH i løsningen ble igjen justert til 9 og holdt ved denne pH i løpet av omsetningen ved små tilsetninger av 1,0N NaOH. Mens reaksjonen ble omrørt, ble alikvoter fjernet ved forskjellige tidspunkter, og fremdriften av alkyleringen ble kontrollert ved anionbytter HPLC. Når mengden av dialkyleringsprodukt (totalen av tre tilstedeværende acetatgrupper) hadde nådd et maksimum, ble hele reaksjonsblandingen frysetørket for å gi et mørkt fast stoff. Denne rå blandingen av alkylerte produkter ble deretter

renset ved silikagelkromatografi (eluering med løsningsmiddel-system 1), etterfulgt av preparativ anionbytterkromatografi (eluering med en gradient av 0-100% IM NH40Ac), deretter ved preparative TLC-plater (fremkalt i løsningsmiddelsystem 4) og til slutt ved silikagelkromatografi (eluering med løsnings-middelsystem 4). Denne utstrakte rensefremgangsmåten ga, som et gult fast stoff, 30 mg (0,06 mmol, 6,0%) av tittelproduktet. Dette produktet ble karakterisert ved hurtig-atombombardement-massespektrometri ([M+H]<+>=468), anionbytter HPLC og ytterligere karakterisert ved:

1-H NMR (D20)

8,12(bs), 7,35(bs), 4,76(s), 3,57-3,44(m), 2,97-1,83(m), l,80(s);

<13>C NMR (D20)

181,75, 180,68, 179,00, 175,37, 147,70, 141,22, 133,08, 123,53, 68,44, 59,72, 56,00, 52,80, 49,96, 49,29, 47,86, 45,36, 44,26, 42,78, 42,25, 23,72.

Eksempel 5

Fremstilling av o-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7-trieddiksyrepentahydroklorid og a-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,10-trieddiksyrepentahydro-klorid.

En rå blanding av alkylerte produkter ble fremstilt ved fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4. Denne rå blandingen ble kromatografert på en silikagelkolonne, eluert med 20% NH4OAC/CH3OH (vekt:volum). De tilhørende fraksjonene fra denne kolonnen ble slått sammen og inndampet til tørrhet. Det rå produktet med betydelige mengder av NH4OAC, ble løst i 80 ml NANOpure™ vann og frysetørket for å gi et lysebrunt fast

stoff. Dette faste stoffet ble løst i 20 ml NANOpure™ vann, rystet med Pt02-katalysator under H2-atmosfære inntil hydrogenopptaket stoppet. Katalysatoren ble fraskilt ved vakuum-filtrering, og filtratet frysetørket for å gi et gult fast stoff. Det faste stoffet ble løst i 3 ml av løsningsmiddelsystem 4 og kromatografert på silikagel ved bruk av løsningsmiddel-systemet 4. De sammenslåtte fraksjonene ble deretter avdrevet

in vacuo og frysetørket for å gi 779,6 mg av et lyseglut fast stoff. <13>c NMR og proton NMR antyder at dette produktet er en 50/50-blanding av de to mulige geometriske isomerene. Den isomere blandingen ble kontaktet med overskudd av HCl og frysetørket for å gi 548,4 mg (61% utbytte) av tittelproduktene. Sp.>270°C. Anionbytterkromatografi (HPLC-system III) viste én betydelig topp (>94% renhet); hurtig-atombombardement-massespektrum viste de geometriske isomerene [M+H]<+> = 438.

Eksempel 6

Fremstilling av a-[2-(4-nitrofenyl)etyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraeddiksyre, 1,4,7,10-tetrametylester.

Til en løsning av 1,43 g (3,63 mol) av a-[2-(4-nitro-fenyl) etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l-eddiksyre, 1-metylester (fremstilt ved fremgangsmåten fra eksempel B) i 40 ml argongjennomstrømmet acetonitril ble tilsatt 1,71 g (12,34 mmol) av vannfritt kaliumkarbonat under kraftig omrøring. Til reaksjonsblandingen ble tilsatt 1,78 g (11,61 mmol) metylbromacetat, og reaksjonsblandingen ble omrørt ved om lag 25°C i 48 timer. TLC-analyse viste dannelse av et nytt produkt (Rf = 0,62, løsningsmiddelsystem 2). Til denne vellingen ble tilsatt 6,0 g av flash-silikagel, og acetonitril ble fjernet på en roterende fordamper. Det resulterende materialet ble påsatt på en 1 tomme x 16 tommer tommer silikakolonne som var blitt foreluert med 5% metanolisk kloroform. Om lag 400 ml av den fremstilte løsningen ble anvendt til å eluere flere ikke-polare forurensninger og ureagert alkyleringsmiddel. Deretter ble løsningsmiddelsystem 2 påsatt, fraksjonene som inneholdt produktet (Rf = 0,62) ble oppsamlet, slått sammen og inndampet for å gi 2,1 g (3,44 mmol, 95%) av tittelproduktet som et lysegult glass. % NMR indikerte at dette produktet måtte være en 2:l-blanding av konformasjons- eller geometriske isomerer.

<X>H NMR (CDCL3, 50°C)

8,137(d), 8,128(d), 7,398(d), 7,385(d), 3,82(s), 3,76(s), 3 ,75(s) ,3 ,74(s) , 3,68(S), l,5-3,52(m);

<13>C NMR (CDC13, 50°C, 75 MHz)

175,8, 174,2, 174,1, 174,0, 149,0, 129,5, 129,3, 123,6, 60,1, 55,1, 52,8, 52,7, 52,6, 52,4, 52,2, 52,1, 52,0, 51,2, 51.1, 51,0, 49,1, 48,8, 47,5, 45,2, 34,2, 32,6.

Eksempel 7

Fremstilling av a-[2-(4-aminofenyl)etyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksyre, 1,4,7,10-tetrametylester.

I 25 ml metanol som inneholdt 400 mg av 10% palladium-på-karbon-katalysator under nitrogenatmosfære, ble løst 1,41 g (2,31 mol) av a-[2-(4-nitrofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraeddiksyre, 1,4,7,10-tetrametylester (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 6). Overskudd av hydrogen ble blåst gjennom løsningen ved én atmosfære i tre timer. TLC-indikerte dannelse av et sterkt ninhydrinpositivt materiale (Rf = 0,62, løsningsmiddelsystem 2). Den metanoliske katalysatorvellingen ble filtrert gjennom celitt, og fordampning av løsningsmidlet ga tittelproduktet, 1,21 g (2,08 mmol, 91%), som et hvitt fast glass (som en 2:1 blanding av konformasjons-isomerer). De mindre mengdene av konformasjons- eller geometrisk isomer ble adskilt fra hovedisomeren ved flash-kromatografi ved bruk av 10% metanolisk kloroform for å gi tittelproduktet som et nesten hvitt pulver (SP = 89-95°C) og karakterisert ved:

<1->H NMR (CDC13, 50°C)

6,94(d), 6,89(d), 6,69(d), 6,66(d), 3,91(s), 3,80(s), 3,78(s), 3,74(8), 3,73(s), 3,72(s), 3,71(s), 1,5-3,5(m);

<13>C NMR (CDC1<3>, 50°C, 75 MHz)

176,1, 174,0, 173,9, 172,2, 170,4, 169,6, 144,2, 144,1, 130,6, 130,5, 129,5, 129,1, 115,9, 115,8, 62,6, 58,7, 55,1, 54,3, 52,7, 52,5, 52,3, 52,2, 52,1, 52,0, 51,9, 51,8, 51,7, 50.2, 50,0, 47,3, 44,7, 32,8, 31,8, 30,0, 25,2;

Hurtig-atombombardement-massespektrum, m/e 602 [M+Na<+>], 618 [M+K<+>]<+>, [624 M+2Na<+->H<+>]<+>.

Eksempel 8

Fremstilling av a-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraeddiksyre; (PA-DOTA).

I 50 ml kons. saltsyre ble løst 1,5 g (2,59 mmol) av a-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,7,10-tetraeddiksyre, 1,4,7,10-tetrametylester (som den rå 2:1 blandingen fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 7). Reaksjonsblandingen ble underkastet tilbakeløp ved om lag 105°C i 6 timer. TLC (løsningsmiddelsystem 1) indikerte omdanning av esteren (Rf = 0,88) til tittelproduktet som saltsyresaltet (Rf = 0,43). Overskudd av løsningsmiddel ble fjernet på en roterende fordamper, og det resulterende hvite faste stoffet ble tørket. Tittelpoduktet som saltsyresaltet ble oppnådd i et utbytte på 1,6 g og karakterisert ved:

^■H NMR (D20, pD = 1,0, 90°C)

7,48(d), 7,42(d), 2,8-4,3(m), 2,23(m), 2,03(m);

13C NMR (D20, pD = 1,0, 90°C, 75 MHz)

176,4, 174,9, 171,6, 144,7, 132,9, 132,8, 130,4, 125,7, 61,7, 56,8, 56,0, 53,7, 53,1, 51,6, 47,9, 34,3, 37,6.

Hurtig-atombombardement-massespektrum m/e 524 [M+H]<+>, 546 [M+Na2+]<+>, 568 [M+2Na<+->H<+>]<+>.

Ved bruk av flash-kromatografi og løsningsmiddelsystem 1, ble fjernet eventuelle sporforurensninger av esteren fra tittelroduktet som saltsyresaltet. På en 1 tomme x 23 tommer flash-silkagelkolonne ble påsatt 1,10 g av tittelproduktet, som hydrokloridsaltet. Fraksjoner som inneholdt bare tittelproduktet, som det blandede kaliumammoniumsaltet, ble slått sammen for å gi 580 mg.

HPLC-analyse viste at materialet hadde mer enn 98% arealrenhet ved 230 og 254 nanomemter.

Hurtig-atombombardement-massespektrum, m/e 562 (M+K)<+>, 584 [M+K<+->Na<+->H<+>], 600 [M+2K<+->H<+>]<+>.

Eksempel 9

Isolering av cx-[2-(4-aminofenyl) etyl]-1,4 ,7 ,10-tetraazacyklododekan-l,4,10-trieddiksyre, blandet kaliumammoniumsalt.

En rå løsning inneholdende både tetra- og trisyrene(2,05 g)

(fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 8) ble løst i en minimumsmengde av løsningsmiddelsystem 1 og påsatt på en 12 tommmer x 3 tommer kolonne av flash-silikagel som var blitt foreluert med dette løsningsmidlet. Eluering av fraksjoner som inneholdt tittelproduktet (Rf = 0,63 i løsningsmiddelsystem 1) ble oppsamlet, og ga 200 mg av a-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,10-trieddiksyre, blandet kaliumammoniumsalt. ^-H og <13>C NMR-analyse antydet at denne trisyren var den symmetriske isomeren (1,4,10-trisyreposisjons-isomeren) :

<X>H NMR (D20, pD = 0,5 med DC1, T = 90°C)

7,52(d), 7,46(d), 3,60(m), 3,54(m), 3,19(m);

1<3>C NMR (D20, pD = 0,5, T = 90°C)

176,1, 170,2, 140,0, 132,7, 131,1, 126,1, 57,6, 57,2, 56,1, 54,9, 53,2, 51,5, 51,2, 31,2.

Hurtig-atombombardement-massespektrum, m/e 466[M+H<+>]<+>, 488[M+Na<+>]<+>, 504[M+K<+>]<+>, 526[M+K<+>+Na<+->H<+>]<+>, 542[M+2K-H)]<+>.

Eksempel 10

Fremstilling av a-(2-metoksy-5-nitrofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksyre, tetrametylester.

Metylbromacetat (565 pl, 5,97 mmol) ble tilsatt til en omrørt blanding av a-(2-metoksy-5-nitrofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan, 1-eddiksyre, metylester (580 mg, 1,47 mmol)

(fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel N) og pulverisert kaliumkarbonat (1,15 g, 8,32 mmol) i acetonitril (20 ml). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer. Blandingen ble deretter filtrert, og filtratet ble konsentrert til en olje in vacuo. Det rå produktet ble renset ved kromatografi (silikagel, 8% metanol i metylenklorid). Tittel-

produktet ble oppnådd som et gult fast stoff (469 mg, 52%), TLC Rf = 0,4 (silikagel, 10% CH3OH i CHC13), og ytterligere karakterisert ved:

<13>C NMR (CDC13)

173,2, 172,6, 161,2, 139,1, 125,1, 124,6, 120,5, 110,7, 57,0, 55,6, 53,5, 52,6, 51,3, 50,8, 46,8, 46,0, 44,0.

Eksempel 11

Fremstilling av a-(2-metoksy-5-nitrofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4 ,7 ,10-tetraeddiksyre.

En løsning av a-(2-metoksy-5-nitrofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksrye, tetrametylester (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 10) i konsentrert HCl (5 ml, J.T. Baker ULTREX) ble underkastet tilbakeløp under nitrogenatmosfære i 5 timer. Løsningen ble deretter konsentrert til tørrhet in vacuo for å etterlate et fast residuum. Dette ble renset ved kromatografi (silikagel, løsningsmiddelsystem 6) for å gi tittelproduktet som et nesten hvitt fast stoff (209 mg). Dette stoffet ble omdannet til tetrahydrokloridsaltet og ble karkaterisert ved:

<13>C NMR (D20-DC1, 80°C)

171,0, 166,9, 161,2, 139,0, 125,5, 119,3, 110,7, 56,8, 54,5, 52,7, 51,0, 49,2, 49,0, 46,3, 42,9.

Eksempel 12

Fremstilling av a-(2-metoksy-5-aminofenyl)1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksyre, tetraammoniumsalt.

Til en løsning av a-(2-metoksy-5-nitrofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4 ,7 , 10-tetraeddiksyre (157 mg) (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 11) i vann (20 ml) ble tilsatt platinaoksyd (20 mg). Denne blandingen ble hydrogenert (1 atmofære hydrogen) i 1 time ved romtemperatur. Etter filtrering ble stoffet ytterligere renset ved kromatografi (silikagel, løsningsmiddelsystem 5) for å gi tittelforbindelsen (141 mg) som et nesten hvitt fast stoff, og karakterisert ved:

<13>C NMR (D20-DC1)

175,5, 172,6, 172,3, 159,9, 128,8, 127,5, 124,6, 123,8, 115,5, 61,2, 58,1, 57,3, 55,7, 53,4, 51,6, 49,6, 47,4.

Eksempel 13

Fremstilling av 1-(4-aminobenzyl)-1,4,7, 10-tetraazacyklododekan-4,7,10-triedikksyre, 4,7,10-trimetylester.

Til 4 ml av argongjennomstrømmet acetonitril med omrøring ble tilsatt 100 mg (0,236 mmol) av 1-(4-aminobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan, tetrahydrokloridsaltet (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel J), 260 mg (1,88 mmol) kaliumkarbonat, og 108 mg (0,708 mmol) metylbromacetat. Blandingen ble omrørt i 48 timer ved 25°C. Den saltholdige løsningen ble påsatt på

en 1 cm x 4 cm flashsilikagelkolonne og ble eluert med acetonitril. Fraksjonene som inneholdt det ønskede produktet ble slått sammen, og løsningsmidlet fjernet ved rotasjonsfordampning for å gi 65 mg (0,132 mmol, 56%) av tittelproduktet som ble ytterligere krakterisert ved:

% NMR (CDC13)

7,29 (d), 6,75 (d), 4,62 (s), 4,20 (bred s), 3,70 (s),

3,69 (s), 3,64 (s), 3,62 (t), 3,27 (s), 3,06 (t), 2,82 (bred t), 2,79 (bred t);

<13>C NMR (CDCI3, 75 MHZ),

171,4, 171,0, 148,4, 132,8, 117,5, 115,0, 55,9, 55,3,

54,7, 53,1, 51,7, 51,4, 50,6, 50,5, 47,4.

Eksemel 14

Fremstilling av 1-(4-aminobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre, hydrokloridsalt.

I 2 ml av 6N saltsyre, 42 mg (0,085 mmol) av 1-(4-amino-benzyl) -1 ,4 ,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre, 4,7,10-trimetylester (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 13) ble oppvarmet til 80°C i 2 timer. TLC indikerte flere produkter (Rf = 0,60 for det ønskede tittelproduktet, løsningsmiddel-system 1). Fjerning av løsningsmiddel ga 41 mg av det rå tittelrpoduktet.

Eksempel 15

Fremstilling av 1-[2-(4-nitrofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre, 4,7,10-trimetylester.

Til en løsning av 2,24 g (6,97 mmol) av 1-[2-(4-nitro-fenyl) etyl] -1 ,4 ,7 ,10-tetraazacyklododekan (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel G) i 75 ml av argongjennomstrømmet acetonitril ble tilsatt under kraftig omrøring 3,17 g vannfritt kaliumkarbonat. Til denne reaksjonsblandingen ble tilsatt dråpevis i løpet av en 5 min. periode 3,20 g (20,9 mmol) metylbromacetat. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 17 timer under argonatmosfræe. TLC-analyse viste omdanning av utgangsmaterialet (Rf = 0,73, løsningsmiddelsystem 1) til et nytt produkt (Rf = 0,46, løsningsmiddelsystem 1). Til løsningen ble tilsatt 70 ml kloroform, og løsningen med det oppslemmede saltet ble påsatt på en 1 tomme x 7 tommer flash-silikakolonne. Produktet ble eluert ved bruk av 10% metanol i kloroform for å gi 2,95 g av tittelproduktet som en ravfarget olje som dannet et sprøtt glass ved vakuumtørking (78%). Tittelproduktet ble karakterisert ved:

<1->H NMR (CDC13)

8,17 (m,m) , 7,4-7,66 (m) , 2,38-3,95 (m) .

<13>C NMR (CDCI3, 75 MHz)

171,5, 171,2, 146,7, 144,5, 130,3, 123,9, 56,0, 55,2, 53,5, 53,4, 52,6, 51,9, 51,8, 50,6, 48,1, 29,5.

Eksempel 16

Fremstilling av 1-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksrye, 4,7,10-trimetylester.

I 50 ml metanol ble løst 2,8 g (5,18 mmol) av rå l-[2-(4-nitrofenyl)etyl]-1,4 ,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre, 4,7,10-trimetylester (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 15). Til den omrørte løsningen som ble gjennomblåst med nitrogen, ble tilsatt 10% palladium på karbonkatalysator (600 mg). Løsningen ble holdt under en atmosfære av nitrogen, og deretter ble hydrogen (1 atm. 20-25°C) blåst gjennom den omrørte løsningen i 2,5 timer. Løsningen ble deretter gjennomblåst i flere minutter med nitroen, og katalysatoren fjernet ved filtrering gjennom et tynt sjikt av celitt. TLC-analyse (10% metanol i kloroform) åpenbarte tittelproduktet (Rf =

0,14). Tittelproduktet ble eluert med kloroform fra silikagel for å gi 2,2 g (4,33 mmol, 83%) som et hvitt glass og karakterisert ved:

<1->H NMR (CDC13)

7,03 (d,m), 6,63 (d), 3,4-3,6 (m), 2,7-3,2 (m);

<13>C NMR (CDCI3, 75 MHz)

171,4, 171,2, 145,6, 129,7, 125,6, 115,5, 55,9, 54,4,

54.3, 53,0, 52,8, 51,8, 51,6, 50,3, 47,8, 28,6;

Hurtig-atombombardement-massespektrum, m/e 508 [M+H<+>]<+.>

Eksempel 17

Fremstilling av l-[2-(4-aminofenyl)etyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre, hydrokloridsalt; (EA-D03A).

I 30 ml kons. HCl ble løst 850 mg (1,69 mmol) av l-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre, 4,7,10-trimetylester (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 16). Løsningen ble omrørt ved 70-80°C i 2,5 timer, og løsningen fikk avkjøle seg under omrøring til 25°C, og omrøringen ble fortsatt i om lag 18 timer. Løsningsmidlet ble fjernet på en roterende inndamper ved redusert trykk (10 mm, 75°C).

Solvat og overskudd av hydrogenklorid ble fjernet fra den resulterende klare oljen ved vakuumtørking (10-<1> mm, 45°C). Tittelproduktet ble tilveiebrakt som et hvitt fast stoff, i et utbytte på 890 mg, (Rf = 0,46, løsningsmiddelsystem 2) og ytterligere karakterisert ved:

<X>H NMR (D20, pD = 1,9, T = 90°C)

7,50(d), 7,41(d), 4,26(s), 3,43-3,68(m), 3,0-3,3(m);

<13>C NMR (D20, pD = 1,9, T = 90°C)

176,7, 170,9, 139,8, 133,0, 131,2, 125,9, 57,5, 57,1,

55.4, 54,4, 52,7, 51,0, 50,6, 31,3;

Hurtig-atombombardement-massespektrum, m/e 466 (M+H<+>), 488 [M+Na<+>], 510 [M+2Na<+->H<+>]<+>.

HPLC-analyse viste mer enn 92% arealrenhet (254 nm) ved

bruk av en 10 cm Partisil-5-OD53 RAC II reversfasekolonne. Elueringsmidlet var 10% acetoniril i 0.05M pH = 7,0 kalium-fosfatløsning.

Eksempel 18

Fremstilling av l-[2-(4-isotiocyanatfenyl)etyl]-1,4,7 ,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre; (SCN-EA-D03A).

1-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksrye, hydrokloridsalt (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 17, 106 mg, 0,21 mmol) ble løst i 2 ml vann under nitrogenatmosfære med omrøring. Natriumbikarbonat (105,6 mg, 1,26 mmol) ble langsomt tilsatt for å forhindre skumdannelse ved karbondioksydutvikling (resulterende pH =

8,0). Tiofosgen (16,8 pl, 0,22 mmol) ble tilsatt, og etter én time med kraftig omrøring, indikerte TLC-analyse (20% vann i acetonitril) omdanning av utgangsmateriale (Rf = 0,12) til tittelproduktet (Rf = 0,26). Løsningsmidlet ble fjernet fra det rå produktet ved rotasjonsfordampning for å gi 130 mg av tittelproduktet som inneholdt natriumklorid. Infrarød analyse av dette stoffet (KBr-pellet) betraktet tilstedeværelse av isotiocyanatgruppen (SCN = 2150 cm-<1>).

Eksempel 19

Fremstilling av l-[2-(4-nitrofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre, trietylester.

Til 5 ml av en omrørt acetonitrilløsning som inneholdt

395 mg (1,12 mmol) av l-[2-(4-nitrofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel G) og 1,5 g (11 mmol) av K2C03 ble tilsatt 496 pl (4,5 mmol) etylbromacetat i én porsjon. Etter oppvarming ved 68°C under en ^-atmosfære i én time, ble den resulterende oppslemmingen filtrert. Filterkaken ble vasket med CH3CN (2 x 10 ml). Filtratet ble deretter konsentrert for å gi det rå produktet

som en viskøs olje, gnidd ut med 30 ml dietyleter, og konsentrert for å gi 650 mg (100% utbytte) av l-[2-(4-nitrofenyl)etyl]-

1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksrye, trietylester og karakterisert ved:

^-H NMR (CDCI3)

8,2(d), 7,6(d), 4,3(q), 2,6-3,8(m), 155(t);

Hurtig-atombombardement-massespektrum [M+H]<+> = 588.

Eksempel 20

Fremstilling av l-[2-(4-nitrofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre.

Til en oppslemming av 200 mg (0,35 mmol) av l-[2-(4-nitrofenyl)etyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre, trietylester (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 19)

i 15 ml vann ble tilsatt 59 pl NaOH (50% vekt/vekt, 3 ekv.). Blandingen ble omrørt ved 80°C i 6 timer. Den resulterende homogene oransje løsningen ble deretter avkjølt til romtemperatur og frysetørket for å gi et brunt fast stoff som ble renset ved HPLC (Q-Sepharose™, HPLC-system III) ved bruk av en lineær gradient av 0-10% vandig HOAc i løpet av 60 min. for å gi (50%) av det hydrolyserte produktet 1-[2-(4-nitrofenyl)etyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre, og karakterisert ved:

<1->H NMR (D20)

8,22(d), 7,55(d), 3,60-3,90(m), 3,10-3,40(m).

Eksempel 21

Fremstilling av 1-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre; (EA-D03A).

I en Parr-hydrogenator ble plassert 50 ml av en vandig løsning av 214 mg (0,43 mmol) av 1-[2-(4-nitrofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 20) og 40 mg av 10% Pd/C. Oppslemmingen ble rystet inntil hydrogenopptaket stoppet.

Etter filtrering ble den vandige løsningen frysetørket, og ga 197 mg (98%) som et lysebrunt fast stoff, l-[2-(4-aminofenyl)-etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre, og karakterisert ved:

<X>K NMR (D20)

7,35(d), 7,20(d), 3,10-3,70(m);

<13>C NMR (D20)

173,85, 172,50, 137,90, 131,90, 130,22, 121,55, 56,25, 55,14, 54,42, 50,12, 49,65, 49,31, 31,00.

Eksempel 22

Fremstilling av 1-(2-metoksy-5-nitrobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre, 4,7,10-trimetylester.

Til en omrørt acetonitrilløsning (20 ml) som inneholdt

1,0 g av 1-(2-metoksy-5-nitrobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan (3 mmol) (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel E) ble tilsatt 1,6 g metylbromacetat (11 mmol) i én porsjon.

Etter én time ble tilsatt kaliumkarbonat (0,3 g) og omrøringen fortsatt ved romtemperatur i 12 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter filtrert, og filtratet konsentrert in vacuo. Det resulterende residuet ble kolonnekromatografert (silika, CH3CN/CH3OH, 9:1, V:V) hvilket ga triesteren som et hvitt fast stoff i 68% utbytte etter konsentrering, og ble ytterligere karakterisert ved:

<X>H NMR (CDCI3)

8,19(d), 8,14(s), 7,18(d), 2,58-3,99(m);

<13>C NMR (CDCI3)

173,53, 172,83, 164,59, 142,28, 128,51, 127,69,

126,49, 112,30, 57,25, 56,90, 55,,03, 54,21, 53,06, 52,09, 52,00, 51,54, 50,68, 50,30, 49,85, 49,63, 49,31, 49,00,

48,68, 48,37, 48,05, 47,70, 47,39.

Eksempel 23

Fremstilling av 1-(2-metoksy-5-nitrobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre.

En 6M saltsyreløsning (3 ml) inneholdende 0,25 g av l-(2-metoksy-5-nitrobenzeyl)-1,4,7,l0-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre , 4,7,10-trimetylester (0,45 mmol) (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 22) ble omrørt og oppvarmet ved 100°C i 24 timer. Etter avkjøling til romtemperatur ble tilsatt 5 ml vann, og den vandige løsningen frysetørket for å gi et lysebrunt fast stoff. Etter kolonnekromatografi (silika, løsningsmiddel-system 5) ble trisyren isolert i 60% utbytte som et nesten hvitt fast stoff, SP = 228-230°C (dec), og ytterligere karakterisert ved:

% NMR (D20)

8,18(d), 8,09(s), 7,12(d), 3,87(s), 2,10-3,60(m);

<13>C NMR (D20)

180,45, 179,80, 163,66, 140,22, 128,60, 126,24,

122,6, 111,50, 59,91, 59,06, 56,44, 52,75, 50,92, 48,84

Eksempel 24

Fremstilling av 1-(2-metoksy-5-aminobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre.

Til en nitrogenspylt vandig (50 ml) løsning inneholdende 50 mg Pt02 ble tilsatt 50 mg av 1-(2-metoksy-5-nitrobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 23). Etter hydrogenering i en Parr-bombe i én time, ble løsningen filtrert og det vandige filtratet frysetørket for å gi anilinderivatet som et lysebrunt fast stoff (95% utbytte), SP>240°C dec, og ytterligere karakterisert ved:

^■H NMR (D20)

7,54(bs), 7,21(d), 7,09(d), 7,05(s), 6,88(s), 3,84(s), 3,78(S), 2,85-3,56m);

<13>C NMR (D20)

180,59, 179,77, 153,38, 124,16, 124,03, 122,82,

120,18, 113,68, 112,43, 59,06, 57,02, 55,96, 53,67, 50,52, 50,08, 49,70, 49,04, 48,32.

Eksempel 25

Fremstilling av 1-(2-hydroksy-5-nitrobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre.

Til en vandig løsning (1 ml) av 1-(2-hydroksy-5-nitrobenzyl-1,4,7,10-tetraazacyklododekan (200 mg, 0,62 mmol) (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel F) ble tilsatt bromeddiksyre

(309 mg, 2,2 mmol), og NaOH (3,5 ml, ~ IM) under omrøring ved romtemperatur. Fremdriften av omsetningen ble kontrollert ved LC (anionbytter, Q-Sepharose™) og pH holdt ved om lag 8 ved hjelp av tilsetning av NaOH etter behov. Etter 12 timer ble løsningen frysetørket, og det faste residuet kromatografert (kolonne) på silikagel ved eluering med løsningsmiddelsystem 5. Den gule hovedfraksjonen ble konsentrert, løst i H2O og fryse-tørket for å gi det ønskede produktet som et lysegult pulver (150 mg, 49%) ; SP = 230-235°C (dec), og ytterligere karakterisert:

<13>C NMR (D20)

166,41, 165,60, 160,00, 119,91, 116,02, 113,85,

111,71, 104,59, 45,20, 44,50, 43,96, 36,43.

Eksempel 26

Fremstilling av 1-(2-hydroksy-5-aminobezyl)-1,4,7,lo-tet raa zacy kl ododekan- 4 ,7,10-trieddiksyre.

Til en argongjennomspylt vandig løsning (25 ml) av N-(2-hydroksy-5-nitrobenzyl)-1,4,7,l0-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksrye (200 mg, 0,4 mmol) (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 25) ble tilsatt Pt02 (130 mg) etterfulgt av innføring av H2 (Parr-hydrogenator). Etter fullstendig forsvinning av den gule fargen, ble løsningen gjennomspylt med argon og filtrert. Den vandige løsningen ble deretter frysetørket for å gi produktet som et lysebrunt faststoff (146 mg, 78%).

Eksempel 27

Fremstilling av a-[2-(4-nitrofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l- (R,S)-eddik-4,7,10-tris-(R-metyleddik)syre, l-isopropyl-4,7,10-trimetylester; (PN-DOTMA trimetylisopropyl-ester).

Til en løsning av 1,00 g (2,37 mmol) av a-[3-(4-nitro-fenyl )propyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l-eddiksyre, 1-metylester (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel P) i 35 ml tørr acetonitril ble tilsatt 1,15 g (8,32 mmol) av vannfritt kaliumkarbonat med kraftig omrøring under nitrogen. Optisk aktiv a-benzensulfonat av melkesyremetylester (1,79 g, 7,36 mmol S:R=98,2) ble tilsatt, og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 60 timer. TLC-analyse indikerte dannelse av nye produkter (Rf=0,71, løsningsmiddelsystem 2 for tetraesterne ifølge tittelen og Rf=0,89 for triester). Den resulterende løsningen med oppslemmet karbonatsalter ble helt over i 40 ml kloroform, og de utfelte uorganiske saltene ble frafiltrert. Løsningsmiddel ble fjernet fra dette filtratet, og den rå oransje oljen ble kromatografert to ganger på en 1 tommer x 16 tommer flash-silikagelkolonne ved bruk av løsningsmiddelsystem 2 som elueringsmiddel for å gi produktet ifølge tittelen som en ikke-oppløst blanding av tetraesterdiastereomerer (1,00 g, 1,47 mmol, 62% utbytte) som var fri for underalkylerte produkter.

^■H NMR-analyse av dette stoffet viste at det inneholdt om lag 0,5 ekvivalenter ureagert benzensulfonatderivat. NMR-spektra av dette stoffet var ikke koaliserende ved 60°C i kloroform:

<3->H NMR (CDC13, 60°C)

7,9-8,l(m, 2H), 7,2-7,4(m, 2H), 5,06(m, 1H), 3,4-4,0(m, 9H), l,7-3,4(m, 20H), l,0-l,7(m, 15H);

IR (CDCI3) cm"<1>

2980, 2840, 1725, 1710 (esterkarbonyl), 1590, 1510, 1440, 1340;

Hurtig-atom-bombardement-massesektrum, m/e 702 [M+Na<+>]<+>, 687.

Eksempel 28

Fremstilling av a-[2-(4-aminofenyl)etyl]-l,4,7,10-[tetraazacyklododekan-l-(R,S)-eddik-4,7,10-tris-(R-metyleddik)syre, l-isopropyl-4,7,10.trimetylester; (PA-DOTMA trimetyliso-propylester).

a-[2-(4-nitrofenyl)etyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododekan-l-(R,S)-eddik-4,7,10-tris-(R-metyleddik)syre, 1-isopropyl-4,7,10-trimetylester (950 mg, 1,40 mmol) ukorrigert) (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 27), som inneholdt ureagert a-[3-(4-nitrofenyl)propyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l-eddiksyre, 1-metylester, ble løst i 10 ml 30% vandig metanol som inneholdt

1,00 g av 10% palladium på karbonkatalysator under nitrogenatmosfære. Overskudd av hydrogen ble blåst gjenom løsningen i 7 timer. På dette tidspunktet åpenbarte TLC-inspeksjon dannelse av et sterkt ninhydrin positivt stoff (Rf=0,62 løsnings-middelsystem 2, Rf=0,71 for utgangsmateriale). Den metanoliske katalysatorvellingen ble filtrert gjennom celitt, og fordampning av løsningsmiddel ga 800 mg av det rå tittelproduktet som en klar olje som inneholdt benzensulfonsyre (Rf = 0,09 løsnings-middelsystem 2) fra den ledsagende hydrogenolyse av benzensul-fonatesteren. Den rå oljen ble kromatografert på en 1 tomme x 8 tommer flash-silikagelkolonne med 10% metanol i kloroform som eluerte et lyst gult bånd i porevolumet. Løsningsmiddelsystem 2 ble deretter påsatt for å eluere tittelprodutket (480 mg) i 52% utbytte som en blanding av uoppløste diastereomerer og geometriske isomerer. Tre distinkte ab-kvartetter ble observert i den aromatiske regionen av ^-H NMR:

<X>H NMR (CDC13, 30°C)

6,63-8,0 (m (kvartetter), 4H), 5,07(m, 1H, isopropylmetin H), 3,53-3,9(m, 13 H med fire singletter ved 3,85, 3,73, 3,69

og 3,56), 3,46(m, 1H), 3,25(bredt, 3H), 2-3,l(m, 14H), 1,0-2,0(m, 15H;

<13>C NMR (CDCI3, 30°C)

177,3, 177, 176,4, 176,2, 175,9, 174,3, 172,9, 170,6, 145,3, 144,9, 130,8, 129,7, 129,3, 129,1, 128,8, 128,4, 127,5, 126,3, 115,2, 115,1, 114,9, 69,0, 68,4, 67,3, 61,6, 57,8, 57,4, 56.7, 56,5, 56,4, 52,9, 52,7, 52,1, 50,8, 50,7, 50,6, 47,3, 47,1, 47,0, 46,9, 46,5, 46,3, 46,1, 44,8, 44,5, 44,3, 34,1, 32,9, 32,5, 32,2, 31,8, 24,8, 22,2, 22,1, 22,0, 21,8, 21,6, 15.8, 14,9, 7,7, 7,5, 7,4, 7,1;

IR (CDC123) cm"<1>

2960, 2840, 1720, 1510, 1450, 1375;

Hurtig-atombombardement-massespektrum, m/e 672 [M+Na<+>]<+>, 686.

Eksempel 29

Fremstilling av a-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l- (R,S)-eddik-4,7,10-tris-(R-metyleddik)syre;

(PA-DOTMA).

Den diastereomere blandingen av a-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l-(R,S)-eddik-4,7,10-tris-(R-metyleddik)syre, l-isopropyl-4,7,10-trimetylester (400 mg,

0,59 mmol) (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 28) ble løst i 50 ml av 6N konsentrert saltsyre og underkastet tilbakeløp i 30 timer. TLC-analyse (løsningsmiddelsystem 1) indikerte omdanning av ester (Rf=0,98 løsningsmiddelsystem 1) til to nye flekker (Rf=0,6, høy diastereomer og Rf=0,54, lav diastereomer løsningsmiddelsystem 1, begge flekker UV, ninhydrin, og jod positive). Overskudd av løsningsmiddel ble fjernet på en roterende fordamper, og etter tørkingen ble oppnådd en blanding av rå diastereomerer av tittelproduktet (403 mg) som hydrokloridsaltet. Preparativ separasjon av de to diastereomerene av tittelproduktet ble gjennomført ved påsetting av 290 mg (0,51 mmol) av det rå saltet på en 1 x 13 cm silikaflashgel-kolonne som ble eluert med løsningsmiddelsystem 8. Den høye Rf-diastereomeren (119 mg, 0,21 mmol) ble oppnådd i renere form enn den lave Rf-diastereomeren (90 mg, 0,16 mmol) siden høy Rf-diastereomer eluerte fra kolonnen først:

^•H NMR for høy Rf-diastereomer:

<X>H NMR (D20, 90°C, pD=7,5)

7,12(d, 2H), 6,80(d, 2H), 3,66(m, 1H), 3,57(bredt, 3H), 2-3,4(m, 19H) , l,89(m, 1H) , l,37(m, 1H) , l,15(d, 3H) , l,10(d, 3H), l,06(d, 3H);

<13>C NMR (D20, 90°C, pD=7,5)

184,4, 184,2, 184,0, 183,3, 135,9, 132,6, 131,7, 119,1, 78,2, 69,0, 61,7, 61,5, 57,4, 54,1, 49,7, 49,6, 48,2, 47,7, 47,2, 34,8, 33,8, 9,6, 9,1, 9,0;

Hurtig-atombombardement-massespektrum, m/e 566 [M+H<+>]<+>,

588 [M+Na<+>]<+>, 604 [M+K<+>]<+>, 626 [M+K<+>+Na<+->H<+>]<+>, 642 [M+2K<+->H<+>]<+.>

Fremstilling av sluttprodukter - Komplekser

Metalligandkomplekser ble fremstilt ved forskjellige fremgangsmåter som vist nedenfor. Fremgangsmåtene omfattet blanding av metallet og liganden i vandig løsning, og justuering av pH til ønsket verdi. Komplekseringen ble utført i løsninger inneholdende salter og/eller buffere så vel som vann. Av og til fant man at oppvarmede løsninger ga høyere kompieksutbytter, enn når komplekseringen ble utført ved omgivende temperaturer. Også den opparbeidingen som ble anvendt ved syntesen av BFC, er blitt vist å påvirke komplekseringen.

Eksempel 3 0

Fremstilling av a-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksyre, ammoniumsalt, samarium(III)-kompleks; Sm(BA-DOTA).

En liten prøve, 53 mg (0,094 mmol) av oe-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,7,10-tetraeddiksyre (fremstilt ved fremgangmsåten i eksempel 3) ble løst i 100 pl vann og behandlet med 3 ml av 0.043M Sm(OAc)3-løsning (48,8 mg,

0,129 mmol) ved pH 6-7. Denne løsningen ble oppvarmet ved 100°C, og komplekseringsgraden ble bestemt ved anionbytter HPLC. Når komplekseringen var fullstendig ved anionbytterkromatografi, HPLC system III, ble løsnignen av komplekset avkjølt til romtemperatur (om lag 25°C) og frysetørket. Samariumkomplekset ble renset ved silikagelkromatografi (eluering med løsningsmiddelsystem 1). Denne fremgangmsåten ga tittelproduktet i 82% utbytte. Dette komplekset ble karakterisert ved TLC, hurtig-atombombardement-massespektrometri, aniobytter HPLC, og ytterligere karakterisert ved: 3-H (D20)

8,94, 7,81, 7,21, 6,97, 6,80, 5,63, 5,01, 4,58, 4,01,

3,56, 1,78, 1,53, 1,24, 1,10, 0,77, -2,80, -2,95, -3,21, -3,91;

<13>C NMR (D20)

190,3, 184,9, 181,4, 146,8, 134,3, 122,7, 116,4, 80,8, 72,6, 64,2, 57,2, 55,8, 54,7, 53,4, 51,5, 49,7, 45,5, 43,5, 23,6.

Hurtig-atombombardement-massespektrum, [M+H<+>]<+> = 645 (Sm isotop prove).

Eksempel 31

Fremstilling av a-(4-aminofenyl)-l,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4 ,7,10-tetraeddiksyre, samarium(III)-kompleks.

En løsning av 150 pl Sm-153 (3 10~<4>M, i 0,1N HCl) og

600 pl SmCl3 (3 x 10~<4>M) i 0,1N HCl ble fremstilt ved tilsetning av Sm-153-løsningen til SmCl3-løsningen. Deretter ble tilsatt 5,0 pl av 2,OM NaOAc etterfulgt av 45 pl av 50 mM ligand (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 3) i HEPES-buffer. Løsningens pH ble justert til 7 med 275 pl av 0,5M HEPES.

Denne løsningen ble delt i to fraksjoner på 500 pl hver, og én fraksjon ble oppvarmet i 1 time ved 100°C.

Løsningene ble ledet gjennom SP-Sephadex™-kationbytterharpiks. Prosenten av metall som kompleks ble bestemt ved bruk av fremgangsmåten beskrevet tidligere. Resultatene viste 99,6% av metallet som kompleks for den oppvarmede prøven, og 96,6%

for den ikke-oppvarmede prøven.

Stabilitet av chelater ved pH- profil.

Stabiliteten av metalligandkomplekser ble målt ved å underkaste dem forskjellige pH-verdier og analysere for kompleks i løsningen. Ved lav pH kan protonering av liganden forårsake frigjøring av metall. Ved høy pH, konkurrerer metallhydroksydene med chelatdannelsen. Når man derfor søker etter inerte chelater, vil et ønskelig inert chelat forbli som chelat når det utsettes for høye og lave pH-verdier.

Profiler av upåvirkeligheten ved forskjellige pH-verdier for noen av chelatene ifølge denne oppfinnelsen, ble fremstilt ved bruk av fremgangsmåtene beskrevet i de følgende eksemplene.

I noen tilfeller ble ikke-chelatert metall fjernet ved å lede løsningen gjennom en kationbytterhapriks. Fortynnede natriumhydroksyd- og saltsyreløsninger ble anvendt for å justere pH

for de komplekse løsningene fra om lag 1 til om lag 14.

Prosent metall som kompleks ble deretter bestemt ved fremgangsmåtene beskrevet tidligere.

På lignende måte ble fremstilt flere bifunksjonelle chelatkonjugater, og underkastet pH 2,8, 4,0 og 6,0. Mengden av konjugat som forble i løsning, ble bestemt ved HPLC ved bruk av en radiometrisk detektor. Resultatene er vist i eksempel XX

i biologiavdelingen.

Eksempel 32

pH-stabiliteten av a-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksyre, samarium(III)kompleks.

De oppvarmede og ikke-oppvarmede prøvene fra eksempel 30 ble alle delt i 2 x 250 pl alikvoter. En 250 pl alikvot ble justert med HCl for å gi de pH-verdiene som er vist i den følgende tabell. Den andre 250 pl alikvot ble justert med pl-mengder av NaOH til de ønskede pH-verdiene. Når den ønskde pH-verdien var nådd, ble en 25 pl alikvot fjernet, og prosenten av metall som kompleks bestemt som tidligere beskrevet. Resultatene er som følger:

Disse data viser stabiliteten for denne prøven enten den er oppvarmet eller ikke, og uten hensyn til den testede pH.

Eksempel 33

Fremstilling av a-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l, 4,7,10-tetraeddiksyre, yttrium(III)kompleks.

10 pl av en løsning inneholdende 1,4 mg/100 pl av oc-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,7,10-tetraeddiksyre (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 3) ble tilsatt til

100 pl av Y(0Ac)3 (0.003M) tilsatt Y-90. Til denne løsningen ble tilsatt 500 pl vann etterfulgt av 125 pl NaOAc (0,5M). Vann (265 pl) ble tilsatt til løsningen for å bringe det totale volumet til 1 ml. Denne løsningen ble delt i to alikvoter. Én alikvot ble oppvarmet til 100°C i 1 time. Både oppvarmede og ikke-oppvarmede prøver ble testet for å bestemme prosent metall som kompleks ved bruk av den kationbytterfremgangsmåten som er beskrevet tidligere. Resultatene viste 84% og 4% for metallet som et kompleks for hhv. den oppvarmede prøven og den ikke-oppvarmede prøven.

Eksempel 34

Fremstilling av a-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4 ,7 , 10-tetraeddiksyre , lutetium(III) kompleks.

En løsning av cx-4 (-aminofenyl) -1,4 ,7 ,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraeddiksyre (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 3) ble løst i destillert vann for å gi en konsentrasjon på 1,63 mg/ml.

En lutetiumkloridløsning ble fremstilt ved å løse lutetiumklorid i 0,1N HCl for å gi en konsentrasjon på 3,9 mg/ml (0,01M). Lutetium-177 (0,3 mmolar) ble anvendt som en tracer.

Et volum på 30 pl av 0,01M lutetiumløsning ble tilsatt til

2 pl Lu-177-løsning. Den passende mengde ligand fra ovenfor ble tilsatt, og HEPES-buffer (0,1M, pH = 7,6) ble tilsatt for å gi et totalt volum på 1,0 ml. De resulterende løsningene var 0,3 mmolar i ligand og lutetium. Løsningen ble deretter oppvarmet til 100°C i 1 time, og prosenten av Lu som kompleks bestemt til å være 86% ved kationbytterfremgangsmåten beskrevet tidligere.

Eksempel 35

Fremstilling av a-(4-isotiocyanatfenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4 ,7,10-tetraeddiksyre, samarium(III)kompleks.

En prove, 7 mg (10,8 pmol) av a-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4 ,7,10-tetraeddiksyre, samarium(III)-kompleks (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 30) ble lost i 400 pl vann. Overskudd av tiofosgen (50 pl) ble tilsatt, etterfulgt av 400 pl CHCI3, og den to-fase-omsetningen omrørt kraftig i 30 min.. Ved slutten av denne tiden ble vannsjiktet ekstrahert med 500 pl CHCI3 fire ganger, og vannsjiktet ble deretter lyofilisert for å gi det ønskede tittelproduktet i kvantitativt utbytte.

UV viste at denne forbindelsen hadde et bånd ved 272 og 282 nm. TLC, silikagel fremkalt ved 75:25 V:V CH3CN:H20, ga Rf = 0,38. Utgangsmaterialet hadde en Rf = 0,19. IR viste -SCN-strekk ved 2100 cm"<1>; hurtig-atombombardement-massespektrum [M+H<+>]<+> = 687.

Eksempel 36

Fremstilling av a-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4 ,7 , 10-tetraeddiksyre , ammoniumsalt, yttrium(III)-kompleks.

En prøve på 90 mg (160 mmol) av a-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksyre (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 3) ble løst i 1 ml vann. Til denne løsningen ble tilsatt 3 ml vann inneholdende 51 mg (192 mmol) av Y(0Ac)3. Reaksjonsblandingen, pH = 6 til 7, ble deretter oppvarmet ved 100°C i to timer. Den resulterende løsningen ble deretter ledet gjennom glassull og lyofilisert for å gi 126 mg gult fast stoff. Det faste stoffet ble kromatografert på silikagel (løsningsmiddelsystem 1) for å 71 mg (76%) av det ønskede kompieksproduktet. Analyse ved anionbytter viste den samme retensjonstiden som ble funnet for det analoge Sm-komplekset. Tittelproduktet ble karakterisert ved:

<13>C NMR (D20)

180,8, 180,5, 179,9, 146,1, 133,4, 122,0, 116,1, 74,9,

66,3, 56,3, 55,8, 55,4, 55,1, 54,8, 52,2, 46,0, 44,0, 23,6;

<1->H NMR (D20)

6,90(d), 6,70(d), 4,40(s), 3,45-3,06(m), 2,71-2,10(m) , 1,75(S) .

Hurtig-atombombardement-massespektrum, [M + H<+>]<+> = 582.

Eksempel 37

Fremstilling av a-(4-isotiocyanatfenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksyre, natriumsalt, yttrium(III)-kompleks.

En prøve av cx-(4-aminofenyl)-1,4 ,7 ,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraeddiksykre, yttriumkomplekset (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 36) (10 mg, 17 pmol) ble løst i 400 pl H20. Til denne løsningen ble tilsatt 64 pl tiofosgen (overskudd) og 400 pl CHC13, og den resulterende blandingen omrørt kraftig i 40 min.. I løpet av denne tiden ble det foretatt flere små tilsetninger av fast NaHC03 for å holde pH

på om lag 8. Ved slutten av omsetningen ble vannsjiktet fraskilt og ekstrahert med 1 ml CHC13, fire ganger, og lyofilisert. Tittelproduktet ble karakterisert vedTLC- og UV-spektroskopi.

Eksempel 38

Fremstilling av a-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksyre, yttrium(III)-kompleks, ammoniumsalt; NH4[Y(PA-DOTA)].

Liganden a-[2-(4-aminofenyl)etyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraeddiksyre (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 8) ble omdannet til det blandede protonerte ammonium-saltet ved kromatografi på en sterk kationbytterharpiks (SP-Sephadex™ C-25, Pharmacia). Kolonnen var i den protonerte formen og ble vasket med destillert vann. En konsentrert vandig løsning av liganden ble påsatt på kolonnen, etterfulgt av vasking av kolonnen med destillert vann. Liganden ble eluert fra kolonnen med 0,5M NH4OH. Elueringsmidlet ble redusert til tørrhet.

En løsning av Y(OAc)3.4H20 (0,0728 g, 0,215 mmol) i 5 ml destillert vann ble tilsatt til en varm løsning av den blandede protonerte ammoniumsaltliganden (0,120 g, 0,215 mmol) i 5 ml vann. Løsningen ble brakt til tilbakeløp, og pH justert til om lag 7,0 med 0,1M NH4OH. Etter 1 times tilbakeløp ble løsningen avkjølt og redusert til tørrhet. Overskudd NH4OAc ble fjernet ved oppvarming av det hvite faste stoffet i oljebad ved om lag 105°C under vakuum. Utbyttet av tittelproduktet (som inneholdt om lag én ekvivalent ammoniumacetat) var 0,142 g (94%) og ble karakterisert ved:

1<3>C NMR (D20, 88°C, 75 MHz)

23,8, 27,6, 35,4, 49,6, 55,0, 56,2, 56,9, 57,1, 65,7, 68,0, 121,7, 132,6, 138,8, 180,7, 181,4, 182,0, 183,1;

Hurtig-atombombardement-massespektrum, m/e 610 (positivt ion, [M"+2H<+>]<+>), 608 (negativt ion, M").

Eksempel 39

Fremstilling av a-[2-(4-aminofenyl)etyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksyre, samarium(III)-kompleks, ammoniumsalt; NH4[Sm(PA-DOTA)].

Når fremgangsmåten i eksempel 38 ble gjentatt, ved bruk av Sm(OAc)3.3H20 (0,082 g, 0,215 mmol) istedenfor Y(OAc)3.4H20,

ble tittelproduktet (som inneholdt om lag én ekvivalent ammoniumacetat) fremstilt i et utbytte på 0,155 g (94%) og ble karakterisert ved:

13C NMR (D20, 88°C, 75 MHz)

23,5, 27,2, 35,6, 50,5, 54,5, 56,0, 57,2, 57,9,

69,5, 71,5, 122,3, 133,0, 139,7, 181,2, 188,4, 189,3, 190,9;

Hurtig-atombombardement-massespektrum, m/e 673 (positivt ion, [M~+2H<+>]<+>, Sm isotop mønster), m/e 671 (negativt ion, M~, Sm isotop mønster).

Eksempel 40

Fremstilling av a-[2-(4-isotiocyanatofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraeddiksyre, samarium(III)-kompleks, ammoniumsalt; NH4[Sm(SCN-PA-DOTA)].

Løsninger av Sm(OAc)3.3H20 (27,9 mg, 381,56 g/mol,

73,1 pmol) i 10 ml destillert vann og 42 mg PA-DOTA, blandet kaliumammoniumsalt (632,97 g/mol, 66,4 jjmol) (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 8) i 10 ml destillert vann, ble blandet og oppvarmet på dampbad. Etter 30 min. var omsetningen til å danne [Sm(PA-DOTA)] fullstendig som bestemt ved HPLC ved bruk av fremgangsmåten beskrevet i eksempel 41. Løsningen ble omsatt med en løsning av 45,4 mg CSC12 (114,98 g/mol, 395 jjmol)

i 20 ml kloroform ved omrysting i en skilletrakt. Omsetningen var fullstendig etter om lag 1 min. som bestemt ved HPLC og ved fravær av en positiv test med ninhydrin (0,2 % i etanol) når den vandige løsningen ble spottet på en silikagel TLC-plate (utgangschelatet, [Sm(PA-DOTA)], testet positivt). Kloroformsjiktet ble fjernet, og det vandige sjiktet ble vasket med to 20 ml porsjoner kloroform. Det vandige sjiktet ble redusert til tørrhet ved tilsetning av 100 ml acetonitril og inndampet ved omgivende temperatur under en strøm av nitrogen for å gi 56 mg av tittelprodutket.

Hurtig-atombombardement-massespektrum, m/e 715 (positivt ion, [M~+2H<+>]<+>, Sm isotop mønster), m/e 713 (negativt ion, M", Sm isotop mønster).

Eksempel 41

HPLC-analyse av chelateringshastigheten for Y<3+> med PA-DOTA.

Hastigheten for PA-DOTA-chelateringen med Y<3+> ble studert som en funksjon av opparbeidingen anvendt ved syntesen av PA-DOTA. Graden av chelatering ble kontrollert ved HPLC ved bruk av en Alltech Econosphere™ C18 100 mm kolonne. Den anvendte gradienten var: A) 95:5 med pH 6,0, 0,05M NaOAc buffer:CH3CN,

B) 30:70 med pH 6,0, 0,05M NaOAc buffer:CH3CN, A til B på

15 min.. En løsning av PA-DOTA, hydrokloridsalt, (retensjonstid = 1,31 min.) og av PA-DOTA blandet kaliumammoniumsalt (retensjonstid = 4,55 min.)» begge fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 8, ble fremstilt som 1,6 mM, pH 6,0 0,5M NaOAc-buffer. Én ml (1,6 pmol) av hver av de to løsningene ble omsatt med 0,2 ml (8 jjmol) av Y (OAc) 3. 4H20-løsning (40 mM i pH 6,0 0,5M NaOAc buffer). Chelatdannelsen ble bestemt ved tilsynekomsten av en topp ved en retensjonstid = 3,96 min. (bekreftet ved sammenligning med en prøve fra eksempel 38). Resultatene av chelatdannelsen var som følger.

Åpenbart har fremgangsmåten ved rensingen av BFC en virkning på chelateringshastigheten.

Eksempel 42

Fremstilling av cx-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4 ,7 ,10-tetraazacyklododekan-l-(R, S) -eddik-4,7,10-tris-(metyleddik)syre, samarium(III)-kompleks, ammoniumsalt; NH4[Sm(PA-DOTMA)].

En løsning av Sm(OAc)3.3H20 (13,2 mg i 2 ml destillert vann) ble tilsatt til en løsning av a-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l-(R,S)-eddik-4,7,10-tris-(metyleddik)syre (30 mg i 2 ml destillert vann), (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 29, høy Rf-diastereomer). Løsningen med pH 6,5 ble oppvarmet på dampbad, og omsetningen ble kontrollert ved HPLC. Etter 30 min. oppvarming ble løsningen redusert til tørrhet på en rotasjonsfordamper og tørket i vakuumovn.

Hurtig-atombombardement-massespektrum, m/e 715 (postivit ion, [M+2H<+>]<+>, Sm isotopmønster), 737 (positivt ion, [M+H<+>+Na<+>]<+>, Sm isotopmønster) 713 (negativt ion, (M~), Sm isotopmønster).

I de følgende eksemplene ble de komplekse løsningene ledet gjennom en ionebytterkolonne for å fjerne eventuelt overskudd av fritt metall fra løsningen. Labile systemer ville gå tilbake til likevekt, og lignende mengder av det fri metallet ville være i løsning. Inerte systemer ville ikke gå tilbake til likevekt, og mengden av ikke-chelatert metall skulle avta.

Selv om således et kompleks kan dannes i lavt utbytte, kan en rensing ved å lede det gjennom en ionebytterharpiks resultere i et brukbart stabilt kompleks uten ukompleksert metall.

Eksempel 4 3

Fremstilling av a-(2-metoksy-5-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksyre, samarium(III)-kompleks.

En 3 x 10~<2>M løsning av a-(2-metoksy-5-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,7,10-tetraeddiksyre (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 12) ble fremstilt ved å løse 5,8 mg i 325 pl NANOpure™ vann. En 10 pl alikvot av denne løsningen ble tilsatt til 990 pl av 3 x 10"<4>M SmCl3 (i 0,1N HCl) tilsatt med Sm-153. pH ble deretter brakt til 7,0 med NaOH. Denne løsningen ble splittet i to fraksjoner på 500 pl hver, og én fraksjon ble oppvarmet i 1 time ved 100°C. Både oppvarmede og ikke-oppvarmede prøver ble testet for å bestemme prosenten av metall som kompleks ved kationbytterfremgangsmåten beskrevet tidligere. Løsningen ble deretter ledet gjennom SP-Sephadex™-harpiks. Komplekseringen ble igjen bestemt som i de rensede prøvene. Resultatene er vist i følgende tabell.

Eksempel 44

pH-stabilitet av a-(2-metoksy-5-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksyre, samarium(III)-kompleks.

De oppvarmede og ikke-oppvarmede rensede prøvene fra eksempel 43 ble alle splittet i 2 x 250 pl alikvoter. Én alikvot ble justert med HCl og den andre med NaOH for å gi de pH-verdiene som er vist i den følgende tabell. Etter at den ønskede pH var oppnådd, fikk prøven stå i 10 min., og mengden av metall som kompleks ble bestemt ved kationbyttermetoden beskrevet tidligerere. Resultatene er vist i den følgende tabell.

Eksempel 45

Fremstilling av a-(2-metoksy-5-nitrofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4 ,7,10-tetraeddiksyre, samarium(III)-kompleks.

En 3 x 10~<2>M løsning av a-(2-metoksy-5-nitrofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,7,10-tetraeddiksyre (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 11) ble fremstilt ved å løse 7,9 mg i 464 pl NANOpure™-vann. En 10 pl alikvot av denne løsningen ble tilsatt til 950 pl av 3 x 10*4M SmCl3 (i 0,1N ;HCl) tilsatt med Sm-153. pH ble deretter brakt til 7,0 med NaOH. Denne løsningen ble splittet i to fraksjoner på 500 pl hver, og én fraksjon ble oppvarmet i 1 time ved 100°C. Både oppvarmede og ikke-oppvarmede prøver ble testet for å bestemme prosenten av metall som kompleks ved bruk av kationbytterfremgangsmåten beskrevet tidligere. Løsningene ble ledet gjennom SP-Sephadex™-harpiks. Komplekseringen ble deretter bestemt på de rensede prøvene ved bruk av den generelle fremgangsmåten beskrevet heri tidligere. Resultatene er vist i følgende tabell: ;Eksempel 46 ;pH-stabilitet av a-(2-metoksy-5-nitrofenyl)-1,4,7,10-tetraa z acyklododekan-1,4,7,10-tetraeddiksyre, Sm(111)-komp1eks. ;Den oppvarmede og ikke-oppvarmede rensede prøven fra eksempel 45 ble begge delt i to alikvoter. Én alikvot ble justert med fortynnet HCl, og den andre med NaOH for å gi de pH-verdiene som er vist i den følgende tabell. Etter at de ønskede pH-verdiene var oppnådd, fikk prøven stå i 10 min., og mengden av metall som kompleks ble bestemt ved kationbytterfremgangsmåten beskrevet tidligere. Resultatene er vist i den følgende tabell: ;Eksempel 47 ;Fremstilling av a-(4-nitrofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7-trieddiksyre, samarium(III)-kompleks. ;En 0.0219M (100 pl, 2,195 mmol) løsning av a-(4-nitrofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,7-trieddiksyre (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 4) ble kontaktet med en 0,043M ;(25 pl, 1,075 mmol) løsning av Sm(OAc)3. Reaksjonsblandingen ble underkastet anionbytter HPLC (Q-Sepharose™-kolonne, 1 cm x 25 cm, strømningshastighet = 2 ml/min, eluert med 0-1M NH4OAc-gradient i løpet av 30 min.). Etter 1 time hadde komplekset (retensjonstid = 11,1 min.) dannet seg i 77% utbytte (arealprosent), og var fullstendig oppløst fra ligandtoppen (retensjonstid = 15,5 min.). Ytterligere sannsynlighet for at ;tittelkomplekset hadde dannet seg, ble oppnådd ved silikagel TLC (løsningsmiddelsystem 4) hvorved liganden hadde en Rf = ;0,59 og komplekset hadde en Rf = 0,00. ;Eksempel 48 ;Fremstilling av a-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4 , 7-trieddiksyre , samarium(III)-kompleks og cx-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,10-trieddiksyre, samarium(III)-kompleks. ;En løsning, 0.022M (100 pl, 2,2 pmol) av isomerene (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 5) ble kontakt med en 0.043M (6,4 pl, 0,275 pmol) løsning av Sm(0Ac)3. Reaksjonsblandingen ble underkastet anionbytter HPLC (Q-Sepharose™-kolonne, 1 cm x 25 cm, strømningshastighet = 2 ml/min., eluert med 0-0,25M NH4OAC-gradient i løpet av 30 min.). Etter 40 min. hadde komplekset (retensjonstid = 9,0 min.) dannet seg i 66% utbytte (arealprosent og var fullstendig oppløst fra ligandtoppen (retensjonstid = 18,5 min.). ;Eksempel 49 ;Fremstilling av a-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7-trieddiksyre, samarium-153 kompleks og cx-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,10-trieddiksyre, samarium-153-kompleks. ;En 3 x 10"<2>M løsning av a-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7-trieddiksyre pentahydroklorid og a-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,10-trieddiksyre-pentaklorid (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 5) ble fremstilt ved å løse 4,2 mg i 300 pl NANOpure™-vann. En 10 pl alikvot av denne løsningen ble tilsatt til 15 pl av 2 x 10~<2>M SmCl3 (i 0.1N HCl) tilsatt med Sm-153. Volumet ble brakt til ;1 ml ved tilsetning av vann. pH-et ble deretter brakt til 7,0 med NaOH. Denne løsningen ble splittet i to fraksjoner på ;500 pl hver, og én fraksjon ble oppvarmet i 1 time ved 100°C. ;Både oppvarmede og ikke-oppvarmede prøver ble testet for å bestemme prosenten av metall som kompleks ved kationbytterfremgangsmåten beskrevet tidligere. Resultatene viste 89% og 96% av metallet som kompleks for hhv. de oppvarmede og ikke oppvarmede provene. ;Eksempel 50 ;pH-stabiliteten for a-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l , 4 ,7-trieddiksyre, samarium (III) -kompleks , og cx— ;(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,10-trieddiksyre, samarium(III)-kompleks. ;Den oppvarmede prøven fra eksempel 49 og den ikke-oppvarmede prøven ble begge delt i 2 alikvoter. Én alikvot ble justert med HCl og den andre med NaOH for å gi de pH-verdiene som er vist i den følgende tabell. Når den ønskede pH var oppnådd, fikk prøvene stå i 10 min. og prosenten metall som kompleks ble bestemt ved kationbytterfremgangsmåten beskrevet tidligere. Resultatene er vist i følgende tabell: ;Eksempel 51 ;Fremstilling av cx-(4-nitrofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7-trieddiksyre, samarium(III)-kompleks. ;13 mikroliter av 2 x 10~<2>M løsning av cx-(4-nitrofenyl) - 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,7-trieddiksyre (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 4) 15 pl av Sm Cl3 (0,02M 0,1N HCl) ;og 2 pl av Sm-153, fikk volumet brakt opp til 1 ml med NANOpure™ vann. pH ble justert til 7,0 med NaOH. Denne løsningen ble splittet i to fraksjoner på 500 pl hver, og én fraksjon ble oppvarmet i 1 time ved 100°C. Både oppvarmede og ikke-oppvarmede prøver ble testet for å bestemme prosenten av metall som kompleks ved bruk av kationbytterfremgangsmåten beskrevet tidligere. Resultatene viste 74% og 42% av metallet som kompleks for hhv. de oppvarmede og ikke-oppvarmede prøvene. ;Eksempel 52 ;pH-stabiliteten av a-(4-nitrofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l , 4 ,7-trieddiksyre, samarium(III)-kompleks. ;Den oppvarmede prøven fra eksempel 51 ble delt i 2 alikvoter. Én alikvot ble justert med HCl og den andre med NaOH for å gi de pH-verdiene som er vist i følgende tabell. Etter at den ønskede pH var nådd, fikk prøven stå i 10 min. og mengden av metall som kompleks ble bestemt ved kationbyttermetoden beskrevet tidligere. Resultatene er vist i følgende tabell. ;Eksempel 53 ;Fremstilling av l-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan- 4 ,7,10-trieddiksyre, lutetium(III)-kompleks. ;En løsning av EA-D03A (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 17) ble laget ved å løse det faste stoffet i vann. Sluttkonsentrasjonen var 0.01M. ;En lutetiumkloridløsning ble fremstilt ved å løse lutetiumklorid i 0,1N HCl. Den resulterende konsentrasjonen var 3,9 mg/ml av lutetiumklorid (0.01M Lu). Lutetium-177 ble anvendt som tracer. ;Et volum på 30 pl av 0,01M Lu-løsning ble tilsatt til 2 pl av Lu-177-løsning. Et volum på 30 pl ligand ble tilsatt, og HEPES-buffer (0,1M, pH = 7,6) ble tilsatt for å gi et totalt ;volum på 1,0 ml. Den resulterende løsningen var 0,3 mM i ;ligand og lutetium. ;Mengden av Lu som kompleks ble bestemt til å være 98% ved kationbytterfremgangsmåten tidligere beskrevet. ;Eksempel 54 ;Fremstilling av l-[2-(4-aminofenyl)etyll]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre, yttrium(III)kompleks; ;[Y(EA-D03A)] ;Liganden, l-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksrye (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 17) ble omdannet til det blandede protonerte-ammoniumsaltet ved kromatografi på en sterk kationbytterharpiks (SP-Sephadex™ C-25, Pharmacia). Kolonnen var i den protonerte formen og ble vasket med destillert vann. En konsentrert vandig løsning av liganden ble påsatt på kolonnen, etterfulgt av vasking av kolonnen med destillert vann. Liganden ble eluert fra kolonnen med 0.5M NH4OH. Eluatet ble redusert til tørrhet på en roterende fordamper og tørket i en vakuumovn. ;En løsning av Y(OAc)3.4H20 (0,203 g, 338,101 g/mol, ;0,600 mmol) i 10 ml destillert vann ble tilsatt til en varm løsning av den blandede protonert-ammoniumsaltliganden (0,300 g, 499,615 g/mol, 0,600 mmol) i 10 ml destillert vann. Løsningen ble brakt til tilbakeløp og pH justert til om lag 7,0 med 0,1M NH40H. Etter 15 min. tilbakeløp ble løsningen avkjølt og redusert til tørrhet på en roterende fordamper. Overskudd av ammoniumacetat ble fjernet ved oppvarming av det hvite faste stoffet på oljebad ved om lag 105°C under vakuum. Tittelproduktet (som inneholdt om lag én ekvivalent ammoniumacetat) ble fremskaffet i et utbytte på 373 mg (99%) og ble karakterisert ved: ;<13>C NMR (88°C, D20, 75 MHz) ;24,4, 28,4, 51,2, 56,5, 57,2 (2C), 57,7, 67,2, 67,6, ;120,5, 132,3, 135,2, 182,1, 182,5, 183,0; ;Hurtig-atom-bombardement-massespektrum, m/e 552 (positivt ion, [M+H<+>]<+>), m/e 610 (negativt ion, [M+OAc"]"). ;Eksempel 55 ;Fremstilling av l-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre, samariumkompleks; [Sm(EA-D03A)]. ;Når fremgangsmåten i eksempel 54 ble gjentatt, ved bruk av Sm(OAc)3.3H20 (0,229 g, 381,531 g/mol, 0,600 mmol) istedenfor Y(OAc)3.4H20, ble tittelproduktet (som inneholdt om lag én ekvivalent ammoniumacetat) fremstilt i et utbytte på 408 mg (99%) og ble karakterisert ved: ;<13>C NMR (88°C, D20, 75 MHz) ;23,8, 17,9, 51,4, 57,5, 58,1 (3C), 68,7, 73,4, 120,3, 132,2, 134,7, 185,0, 186,8, 192,1; ;Hurtig-atom-bombardement-massespektrum, m/e 615 (positivt ion [M+H<+>]<+>, Sm isotopmønster), m/e 673 (negativt ion, [M+OAc~]", Sm isotopprøve). ;Eksempel 56 ;Fremstilling av l-[2-(4-nitrofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre, samarium(III)-kompleks. 10 mikroliter av 1,48 mg/100 pl (0.03M) løsning av l-[2-(4-nitrofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-tetraeddiksyre (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 20) ble tilsatt til 15 pl av SmCl3-løsning (0,02M i 0.1N HCl) og tilsatt Sm-153. Volumet ble brakt til 1 ml med NANOpure™ vann. Denne løsningen ble delt i to 500 pl fraksjoner, og én fraksjon ble oppvarmet i 1 time ved 100°C. Både oppvarmede og ikke-oppvarmede prøver ble testet for å bestemme prosenten av metall som kompleks ved bruk av kationbytterfremgangsmåten beskrevet heri tidligere. Resultatene viste 81% og 43% av metallet som kompleks for hhv. de oppvarmede og ikke-oppvarmede prøvene. ;Eksempel 57 ;pH-stabilitet av l-[2-(4-nitrofenyl)etyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre, samarium(III)kompleks. ;Den oppvarmede prøven i eksempel 56 ble delt i to alikvoter. Én alikvot ble justert med HCl og den andre med NaOH for å gi de pH-verdiene som er vist i følgende tabell. Etter at den ønskede pH var oppnådd, fikk prøven stå i 10 min. og mengden av metall som kompleks ble bestemt ved kationbytterfremgangsmåten beskrevet tidligere. Resultatene er vist i den følgende tabell. ;;Eksempel 58 ;Fremstilling av l-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre, samarium(III)kompleks. ;Tre pl av 4,65 mg/100 ml løsning av 1-[2-(4-aminofenyl)-etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 20) ble tilsatt til en løsning av 15 pl SmCl3 (0.02M i 0,1N HCl) tidligere tilsatt Sm-153. Volumet ble brakt til 1 ml med NANOpure™ vann. Løsningens pH ble justert til 7,3 med NaOH. Løsningen ble delt i to alikvoter, og én alikvot ble oppvarmet ved 100°C i 1 time. ;Både oppvarmede og ikke-oppvarmede prøver ble testet for å bestemme prosenten av metall som kompleks ved kationbytterfremgangsmåten beskrevet tidligere. Resultatene viste 96% og 93% av metallet som kompleks for hhv. de oppvarmede og ikke-oppvarmede prøvene. ;Eksempel 59 ;pH-stabilitet av 1-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksrye, samarium(III)kompleks. ;De oppvarmede og ikke-oppvarmede prøvene i eksempel 58 ble alle delt i to alikvoter. Én alikvot av hver prøve ble justert med HCl og den andre med NaOH for å gi de pH-verdiene som er vist i følgende tabell. Etter at den ønskede pH var oppnådd, fikk prøven stå i 10 min., og mengden av metall som kompleks ble bestemt med kationbytterfremgangsmåten beskrevet tidligere. Resultatene er vist i følgende tabell. ;Eksempel 60 ;Fremstilling av 1-(2-hydroksy-5-nitrobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre, samarium(III)kompleks. ;En 3 x 10~<2>M løsning av 1-(2-metoksy-5-nitrobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 25) ble fremstilt ved å løse 3,9 mg i 260 pl NANOpure™-vann. En 10 pl alikvot av denne løsningen ble tilsatt til 15 pl av 2 x 10~<2>M SmCl3 (i H20) tilsatt med 10 pl av Sm-153 i 0,1N HCl (3 x 10"<4>M). Volumet ble brakt til én milliliter ved tilsetning av 965 pl DI H20. ;pH ble deretter brakt til 7,0 med NaOH. Løsningen ble splittet i to fraksjoner på 500 pl hver, og én fraksjon ble oppvarmet i 1 time ved 100°C. Både oppvaremde og ikke-oppvarmede prøver ble testet for å bestemme prosenten av metall som kompleks ved den tidligere beskrevne kationbytterfremgangsmåten. Resultatene viste 71% og 74% av metallet som kompleks for hhv. de oppvarmede og ikke-oppvaremde prøvene. ;Eksempel 61 ;pH-stabilitet av 1-(2-hydroksy-5-nitrobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddksyre, samarium(III)kompleks. ;Den oppvarmede og ikke-oppvarmede prøven fra eksempel 60 ble hver splittet i to 250 pl alikvoter. Én alikvot ble justert med HCl og den andre med NaOH for å gi de pH-verdiene som er vist i den følgende tabell. Etter at den ønskede pH var oppnådd, fikk prøven stå i 10 min. og mengden av metall som kompleks ble bestemt ved kationbytterfremgangsmåten beskrevet tidligere. Resultatene er vist i følgende tabell. ;Eksempel 62 ;Fremstilling av 1-(2-hydroksy-5-aminobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre, samarium(III)kompleks. ;En 3 x 10~<2>M løsning av 1-(2-hydroksy-5-aminobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 26) ble fremstilt ved å løse 3,2 mg i 100 pl NANOpure™-vann. En 10 pl alikvot av denne løsningen (fortynnet til 20 pl) ble tilsatt til 15 pl av 2 x 10"<2>M SmCl3 (i H20) tilsatt med Sm-153. Volumet ble brakt til 1 ml ved tilsetning av 950 pl DI H20 og 20 pl 0,1N NaOH. Denne ;løsningen ble splittet i to fraksjoner på 500 pl hver, og én fraksjon ble oppvarmet i 1 time ved 100°C. Både oppvarmede og ;ikke-oppvaremde prøver, ble testet for å bestemme prosenten av metall som kompleks ved kationbytterfremgangsmåten beskrevet tidligere. Når mindre enn 95% av metallet var kompleksert, ble løsningen ledet gjennom SP-Sephadex™-harpiks. Prosenten av ;metall som kompleks ble atter bestemt. Resultatene er vist i følgende tabell. ;Eksempel 63 ;pH-stabilitet av 1-(2-hydroksy-5-aminobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre, samarium(III)kompleks. ;De oppvarmede og ikke-oppvarmede rensede kromatograferte prøvene fra eksempel 62 ble hver splittet i to 250 pl alikvoter. Én 250 pl alikvot ble justert med HCl og den andre med NaOH for å gi de pH verdiene som er vist i følgende tabell. Når den ønskede pH var oppnådd, fikk prøvene stå i 10 min., og prosenten metall som kompleks ble bestemt ved kationbyttermetoden beskrevet tidligere. Resultatene er som vist i følgende tabell: ;Anvendelsesmetoder- Bioloai ;Bifunksjonelle chelateringsmidler som innenfor det samme molekylet har en metallchelaterende gruppe såsom DTPA og en reaktiv linker (arylaminet) er kjent for å være i stand til å bindes kovalent til forskjellige målrettede biomolekyler som har spesifisitet for cancer- eller tumorcelleepitoper eller antigener. Radionuklidkomplekser av slike konjugater er nyttige ved diagnostiske og/eller terapeutiske anvendelser, som midler til å bringe radionuklidet til en cancer- eller tumor-celle. ;[Referanse, Meares et al., Anal Biochem._142, 68-78 (1984); se også diskusjon på sidene 215-216 i J. Protein Chem., 2(2) ;(1984) av Meares og Goodwin, ferskere referanser er Meares, U.S. patent 4,678,677, innvilget 7. juli 1987, Warshawsky et al. U.S. patent 4,652,519, innvilget 24. mars. 1987 og Brechbiel et al., Inorg. chem., 25, 2772-2781 (1986). Forståelig nok kan produktet ved anvendelse av radioaktive eller luminiscerende metaller, også anvendes for in vitro immunprøver. ;Bakgrunnsinformasi on ;Anvendbarheten av de merkede antistoffene avhenger av et antall faktorer, f.eks.: 1) antistoffets spesifisitet, 2) bestandigheten eller stabiliteten for komplekset under anvendel-sesbetingelsene (dvs. serumstabilitet), og 3) antistoffets integritet, dvs. at antistoffets spesifisitet og immunreaktivitet ikke blir påvirket av merkeprosessen. ;Kompleksets stabilitet eller bestandighet er av ytterste viktighet for effektiviteten av radionuklidantistoff-konjugatet som et diagnostisk og/eller terapeutisk middel. Kinetisk labilitet kan føre til ustabilitet, f.eks. i serum, og dissosiasjon av radionuklidet fra komplekset. Den reduserer således den diagnostiske og terapeutiske effektiviteten. Dessuten representerer den et større potensial for generell strålingsskade på normalt vev. [Cole, et al., J. Nucl. Med., 28, 83-90 (1987)]. ;Sammenbinding av radionuklid til antistoff ;Binding av radionuklid til antistoff kan utføres ved enten ;å binde BFC til antistoffet ved hjelp av fremgangsmåter som er vel kjent i teknologien, etterfulgt av chelatering av radionuklidet under betingelser som er forlikelige med antistoffet, eller alternativt, konjugering av antistoffet til fordannet (omgivende eller forhøyet temperatur) metall - BFC-kompleks. ;[Meares et al., Aec.Chem.Res. 17, 202-209 (1984)]. Det tilveiebringes eksempler. ;Eksempel ZA (Sammenlignende) ;Konjugering av l-(4-isotiocyanatbenzyl)-dietylentriaminpentaeddiksyre, samarium-153-kompleks med IgG og F(ab')2 i cc~ 49;[15<3>Sm(SCN-Bz-DTPA)]-IgG og [<153>Sm(SCN-Bz-DTPA)]-F(ab')2-fragment. ;1-(4-isotiocyanatbenzyl)dietylentriaminpentaeddiksyre, samarium-153 kompleks [<153>Sm(SCN-Bz-DTPA)] ble fremstilt ved å ;blande 150 pl 15<3>Sm i 0,1N HCl med 9 pl av 1-(4-isotiocyanat-benzyl)dietylentriaminpentaeddiksyre hvortil var tilsatt HEPES-buffer (0.5M, pH 8,9, om lag 30 pl) for å bringe pH til om lag 6. For å konjugere ble 22,5 x 10~<9> mol IgG eller F(ab')2 i CC-49 (om lag 1 x 10~<4>M konsentrasjon av protein i 50 mmol HEPES, pH 8,5) blandet med 153Sm-komplekset, og pH ble justert til 8,9 ved tilsetning av en natriumkarbonatløsning (1,0M, 12-15 pl). Konjugeringen ble utført ved romtemperatur (om lag 25°C) i om lag 3 timer. 15<3>Sm komplekset merket IgG eller F(ab')2 ble isolert og karakterisert på samme måten som beskrevet i eksempel XII. ;Eksperimentelt for biologi ;Eksemplene I & II og komparative eksempler A- D IN VIVO ;SCREENING AV BIFUNKSJONELLE CHELATER. ;Stabiliteten av visse sjeldne jordartschelater er blitt undersøkt ved in vivo testing hos dyr. F.eks. rapporterer Rosoff, et al. i the International Journal og Applied Radiation and Isotopes 14» 129-135 (1963) om fordeling av radioaktive sjeldne jordartschelater hos mus, i forhold til visse amino-karboksylsyrer. Det ble funnet at in vivo "er det konkurransen mellom chelateringsmidlet og kroppens bestanddeler (uorganiske og organiske) for de sjeldne jordartsionene som bestemmer deres avsetning og ekskresjon". De sterke jordartchelatene ifølge denne oppfinnelsen antas å dissosiere svært lite og bli utskilt, mens de svake chelatene og chelater med midlere styrke som er kjent i teknologien, dissosierer lettere, og blir således avsatt i organer såsom lever. Konsentrasjonen av radionuklid i leveren er imidlertid ikke alltid p.g.a. svak kompleksdannelse, men i noen tilfeller skyldes den affiniteten som metallchelatet har for leveren. Chelaterer i virkeligheten blitt fremstilt og anvendt for evaluering av leverfunksjon [Fritzberg, Alan R., Radiopharmaceuticals: Progress and Clinical Perspectives, Vol. 1, 1986; U.S. patenter 4,088,747 og 4,091,088]. ;Biodistribusjonen av yttrium- og samarium-chelatene av forbindelsen i eksempel 3, et eksempel på et sterkt chelat med sjeldne jordarter, ble bestemt, og prosent dose i leveren ble anvendt som en in vivo screening-fremgangsmåte for å vurdere chelatenes stabilitet kvalitativt. Chelater av NTA og EDTA er tatt med for sammenligning. Ogås samarium ble injisert som samariumklorid i uchelatert form som kontroll. ;Sprague-Dawley-rotter som veide fra 150 til 200 g ble innkjøpt fra Charles River Laboratories. Disse dyrene ble plassert i bur og fikk vann og for ad libitum. Dyrene ble akklimatisert i minst fem døgn før anvendelse. Før injisering av kompleks ble dyrene plassert under en varmelampe (15 til 30 min.) for å dilatere halevenen. Dyrene ble deretter plassert i tvangsbur, halen renset med alkohol, og dyret injisert (50 til 200 pl) via halevenen. Etter injiseringen ble dyret plassert i et annet bur i 2 timer, hvoretter dyret ble avlivet ved hals-hugging. Dyret ble deretter dissekert, delene skylt med avionisert vann, tørket og veid i et tarert telleglass. Minst tre standarder av samme materiale som injisert, ble preparert og telt med dyrevevene. Prosent dose er antallet tellinger i organet dividert ved antallet tellinger i standarden multiplisert med 100 (se følgende tabell). ;/ ;<*>Kompleksene ble fremstilt ved ligand/metallforhold på 1:1 for eksemplene I og II; i 5:1 for eksempel A; og ved om lag 3 00:1 for eksemplene B og C.

Eksemplene III oa E.

1:1-kompleksene av yttrium (tilsatt med en tracermengde av <90>Y) med liganden i eksempel 3, som er BA-DOTA, og EDTA (sammenlignende E) ble fremstilt ved fremgangsmåter beskrevet tidligere. Flere 100 pl alikvoter ble deretter overført til separate sentrifugerør. Overskudd av Y(III) ble tilsatt, slik at den totale volumforandringen minimaliseres og tiden bemerkes. 1/2 time etter metalltilsetningen ble kompleksprosenten bestemt ved kationbyttermetoden beskrevet tidligere, og denne ble

sammenlignet med den opprinnelige kompleksmengden. Prosent kompleks i forhold til tilsatt metall gir en indikasjon på ligand-metallkompleksets labilitet. Resultatene er gitt i

tabellen.

Eksempel IV

Fremstilling av 1-[2-4-isotiocyanatfenyl)etyl]-1,4 ,7 ,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksrye, samarium-153-kompleks; [<153>Sm(SCN-EA-D03A)]-kompleks.

Til 100 pl av <153>Sm i 0, IN HCl ble tilsatt 5 pl av SCN-EA-D03A (5mM i 50 mM HEPES, pH 8,2) (fremstilt i eksempel 18). Dette ble blandet i en vortex-blander, og HEPES-buffer (0,5M, pH 8,9) ble tilsatt gradvis (om lag 25 pl totalt) for å justere pH til om lag 7. Chelateringsgraden ble fulgt ved HPLC på GF-250-kolonne (HPLC system I). Utbytter omkring 50% ble oppnådd.

Eksempel V

Fremstilling av a-[2-(4-aminofenyl)etyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksyre, samarium-153-kompleks; [<153>Sm(PA-DOTA)]-kompleks.

Til 150 mikroliter (pl) av <153>Sm løsning i 0,1N HCl (om lag 4,6 mCi) ble tilsatt 1 pl natriumacetat (2,OM) og 9 pl av a-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,7,10-tetraeddiksyre blandet kaliumammoniumsalt (5 mmol i 50 mmol HEPES, pH 8,5, fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 9). Blandingen ble mekanisk rystet og titrert gradvis med HEPES-buffer (0,5M, pH 8,9; om lag 31 pl tilsatt) til pH 7. Denne ble deretter oppvarmet ved 98°C i sandbad i 1 time. Etter fullføring ble anvendt 5 pl av blandingen for analyse på en Mono-Q™-kolonne på HPLC-system II, eluert med et gradient løsningsmiddelsystem (0-15 min., fra 0 til 100% B; hvor A = vann, og B = 1,0M ammoniumacetat og 0,1 mmol EDTA). Utbytter på 85-95% basert på <153>Sm ble opnådd. ot-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,7,10-tetraeddiksyre, samarium-153-komplekset fremstilt således ble karakterisert ved sammenligning med den identiske ikke-radioaktive prøven, ved deres respektive kromatografiske oppførsel på Mono-Q™ og GF-250-kolonner. Ytterligere indisier på tilstedeværelsen av det radioaktive komplekset ble bestemt ved omdanning til isotiocyanatderivatet og dets påfølgende konjugering til antistoff. Komplekset er også blitt fremstilt uten oppvarming (ved omgivende temperatur) ved inkubering i 6 til 18 timer, hvilket resulterte i 70-80% utbytte.

Eksempel VI

Fremstilling av a-[2-(4-isotiocyanatfenyl)etyl]-l,4 ,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7 ,10-tetraeddiksyre, samarium-153-kompleks; [153Sm(SCN-PA-DOTA)]-kompleks.

Til reaksjonsblandingen oppnådd i eksempel V ble tilsatt

2 pl av HEPES-buffer (0,5M, pH 8,9), 2 pl tiofosgen og 0,2 ml kloroform. Blandingen ble mekanisk kraftig omrystet 2 til 3 ganger i et par sekunder hver time. Kloroformsjiktet ble kastet, og det vandige sjiktet som inneholdt hovedsakelig det ønskede produktet, ble tatt vare på og ytterligere renset. Utbyttet av cx-[2-(4-isotiocyanatfenyl) etyl]-1,4 ,7 ,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksyre, samarium-153-kompleks var 85-90%, basert på <153>Sm-aktivitetsmåling ved HPLC på GF-250-kolonne ved bruk av HPLC system I. For rensing ble det vandige sjiktet ledet gjennom en Sep-Pak™ C-18 patron, og eluert med 90% acetonitril i vann. De første 300 pl avløp ble kastet, og SCN-derivatet som kom ut i de neste 900 pl ble karakterisert ved HPLC på GF-250. Gjenvinningen av 153Sm-aktiviteten var bedre enn 90%. Det meste av løsningsmidlet ble deretter fordampet over en periode på 1,5 til 2 timer, og residuet ble brukt for konjugering til antistoff.

Eksempel VII

Fremstilling av a-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4 ,7,10-tetraeddiksyre, samarium 153-kompleks; [<153>Sm (BA-DOTA)]-kompleks.

Til 200 pl av <153>Sm løsning i 0.1N HCl ble tilsatt 1 pl natriumacetat (2,OM) og 12 pl av a-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4 ,7 , 10-tetraeddiksyre (5 mmol i 50 mmol HEPES, pH 8,5) (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 3). Blandingen ble mekanisk omrystet og titrert gradvis med en HEPES-buffer (0,5M, pH 8,9; om lag 38 pl tilsatt) til pH 7. Denne ble deretter oppvarmet ved 98°C i sandbad i 1 time. Etter fullføring ble anvendt 5 pl av blandingen for analyse på en Mono-Q™-kolonne (HPLC sytem II, eluert med et gradient løsningsmiddelsystem: 0-15 min., fra 0 til 100% B; hvor A = vann, og B = 1,0M ammoniumacetat og 0,1 mmol EDTA). Vanligvis ble oppnådd utbytter på 85-95% basert på 153Sm. Komplekset er også blitt fremstilt ved inkubering av blandingen ved romtemperatur i 12-18 timer, hvilket ga et utbytte av tittelproduktet på 80-90%. a-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksrye, samariuml53-komplekset fremstilt på denne måten, ble karakterisert ved sammenligning med en autentisk prøve ved deres kromatografiske oppførsel på MonoQ™-kolonnen, omdanning til isotiocyantderivatet og dets påfølgende konjugering til antistoff.

Eksempel VIII

Fremstilling av a-(4-isotiocyanatfenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4 ,7,10-tetraeddiksyre, samarium-153-kompleks; [<153>Sm(SCN-BA-DOTA)]-kompleks.

Til reaksjonsblandingen oppnådd i eksempel VII ble tilsatt 2 pl av HEPES-buffer (0,5M, pH 8,9), 2 pl tiofosgen og 0,2 ml kloroform. Den ble kraftig mekanisk rystet 2 eller 3 ganger i løpet av et par sekunder hver time. Kloroformsjiktet ble kastet, og det vandige sjiktet som inneholdt hovedsakelig det ønskede produktet, ble tatt var på og ytterligere renset. Utbyttet av a-(4-isotiocyanatfenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraeddiksyre, samarium-153-komplekset, som analysert ved HPLC på GF-250-kolonne basert på <153>Sm-aktiviteten ved anvendelse av HPLC-system I, var over 90%. For rensing ble det vandige sjktet ledet gjennom en Sep-Pak™ C-18-patron, og eluert med 90% acetonitril i vann. De første 0,3 ml av avløp ble kastet, og det ønskede produktet kom ut i de neste 1,2 ml, med 86-93% gjenvinning. Det meste av løsningsmidlet ble deretter fordampet over en periode på om lag 2 timer, og residuet ble anvendt for konjugering til antistoff.

Eksempel IX

Konjugering av l-[2-(4-isotiocyanatfenyl)etyl]-l,4,7,lo-tet raa zacyklododekan- 4 ,7,10-trieddiksyre, samarium-153-kompleks til antistoff; [153Sm(SCN-EA-D03A)]-IgG-konjugat.

Det anvendte antistoffet var CC-49, et murint monoklonalt IgG som binder seg til en epitop av TAG-72, et tumorassosiert antigen. For å konjugere ble 187 pl av antistoffløsningen (1,20 x 10"<4>M i 50 mM HEPES, pH 8,5) blandet med 4,5 x 10"<8> mol av 15<3>Sm(SCN-EA-D03A) fremstilt som beskrevet i eksempel IV, fulgt av tilsetning av en natriumkarbonatløsning (1,0M) for å heve pH til 8,9. Omsetningen fikk fortsette i 2 timer ved romtemperatur. Etter fullføring ble det <153>Sm merkede IgG isolert ved sentrifugegelfiltrering på Sephadex G-25 (2,2 ml) engangsko1onner, og ytterligere renset ved HPLC på GF-250 kolonne, eluert med citratbuffer (0.25M, pH 7,4). Fraksjonene som inneholdt det merkede IgG ble slått sammen, konsentrert og utvekslet (3x) til PBS ved anvendelse av Centricon™-konsentratorer. Den spesifikke aktiviteten for <153>Sm merket IgG fremstilt på denne måten, var om lag 0,16 pCi/pg protein. Integriteten av [<153>Sm(EA-D03A)]-IgG-preparatet ble verifiert ved HPLC (Sivakoff, S.I., BioChrom. 1(1), 42-48 (1986)] og standard biokjemiske fremgangsmåter, f.eks. natriumdodecyl-sulfat:polyakrylamidgelelektroforese og autoradiografi, og fastfaseradioimmunoassay (RIA). [Se David Colcher et al., Cancer Res. 43, 736-742 (1983)].

Eksempel X

Konjugering av l-[2-(4-isotiocyanatfenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre, samarium-153-kompleks med fragment F(ab')2 i CC-49; [<153>Sm(SCN-EA-D03A)]-fragment F(ab')2 i CC-49.

F(ab')2-fragmentet i CC-49, fremstilt ved enzymatisk spalting ifølge fremgangsmåten beskrevet av Lamoyi og Nisonoff [E. Lamoyi og A Nisonoff, J. Immunol. Methods, 56, 235-243

(1983)], (225 pl av 1 X 10"<4>M i 50 mM HEPES, pH 8,5) ble blandet med 2,9 x IO"<8> mol av <153>Sm(SCN-EA-D03A) fremstilt som beskrevet i eksempel IV. Natriumkarbonat (1,0M, om lag 5 pl) ble tilsatt for å bringe pH til 8,9, og omsetningen ble fortsatt i om lag 2,5 timer. Etter fullføring ble det 153Sm-merkede fragmentet isolert, og karakterisert som beskrevet i eksempel IX.

Eksempel XI CA og B)

In vivo lokalisering av [153Sm(EA-D03A)]-IgG og [15<3>Sm(EA-D03A)]-F(ab')2.

Nytten av den <153>Sm(EA-D03A) merkede IgG (fra eksempel IX) og F(ab')2 i CC-49 (fra eksempel X) ble demonstrert ved opptak av de merkede stoffene ved human tumor xenograft i atymiske mus. Atymiske (Nu/Nu, CD1 bakgrunn) hunnmus ble således inokulert subkutant (S.C.) (0,1 ml/kilde) med den humane kolonkarcinoncellelinjen, LS-174 T (om lag 1 x IO<6> celler/dyr). Om lag 2 uker etter inokuleringen ble hvert dyr injisert via halevenen med om lag 2 pCi (15-30 pg) av <153>Sm merket antistoff i PBS. Musene ble avlivet etter forskjellige tidsintervaller. Etter avblødning ble tumoren og utvalgt vev skåret ut og veid, og radioaktiviteten ble målt i en gamma-teller. Tellinger pr. min. (CPM) for <153>Sm i hvert vev ble bestemt og uttrykt som CPM pr. gram vev pr. injisert dose multiplisert med 100 (% injisert dose/gram). Resultatene er vist i figurene 1-14 og tabellene IA og Ib. 15<3>Sm(SCN-Bz-DTPA) merket IgG og F(ab')2 i CC-49 (fra eksempel ZA) ble innbefattet i studien for sammenligning. Resultatene er vist i tabell IC og ID).

Eksempel XII

Konjugering av a-[2-(4-isotiocyanatfenyl)etyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksyre, samarium-153-kompleks til antistoff; [<153>Sm(SCN-PA-DOTA)]-IgG-konjugat.

Det anvendte antistoff var CC-49, et murint monoklonalt IgG som binder seg til en epitop av TAG-72, et tumorassosisert antigen. For å konjugere ble 178 pl av antistoffløsningen (1,26 x 10~<4> M i 50 mmol HEPES, pH 8,5) blandet med 3,4 x 10"<8 >mol av a-[2-(4-isotiocyanatfenyl)etyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraeddiksyre, samariumkompleks (fremstilt som beskrevet i eksempel VI), etterfulgt av tilsetning av en natriumkarbonatløsning (1,0M, om lag 17 pl for å heve pH til om lag 8,9. Omsetningen fikk fortsette i 2 timer ved romtemperatur. Etter fullføring ble <153>Sm-merket IgG isolert ved sentrifugalgelfiltrering på Sephadex™ G-25 (2,2 ml) engangskolonner, og ytterligere renset ved HPLC på GF-250-kolonne, eluert med citratbuffer (0,25M, pH 7,4). De fraksjonene som inneholdt det merkede IgG ble slått sammen, konsentrert og utvekslet (3 ganger) til PBS ved anvendelse av Centricon™-konsentratorer. Den spesifikke aktiviteten for <153>Sm-merket IgG fremstilt på denne måten, var om lag 0,16 pci/pg protein. Homogeniteten og integriteten for a-[2-(4-isotiocyanatfenyl)-etyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksyre, samarium-153 kompleks-IgG-preparatet ble verifisert ved HPLC og standard biokjemiske fremgangsmåter som i eksempel IX.

Det følgende eksemplet er et alternativ for å lage merkede antistoffkonjugater, som først medfører konjugering av BFC til antistoffet, og påfølgende chelatering for å gi det radionuklid-BFC-merkede Ab.

Eksempel XIIA

Fremstilling av a-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4 ,7 , 10-tetraeddiksyre Ab CC49~konjugat (IgG CC49-PA-DOTA); og påfølgende chelatering med 153Sm for å danne <153>Sm-merket antistoff (IgG CC49<->PA-DOTA-153Sm).

Det <153>Sm(PA-DOTA) merkede antistoffet kan fremstilles ved først å koble BFC, f.eks. a-[2-4-isotiocyanatfenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,7,10-tetraeddiksyre (SCN-PA-DOTA), til et antistoff ved pH 8-9, etterfulgt av chelatering med <153>Sm ved pH 6 ved romtemperatur i flere timer.

I et typisk éksperiment ble IgG CC-49 konsentrert og utvekslet tre ganger til en karbonatbuffer (50 mM, pH 9,1) i en Centricon™ konsentrator (molekylvektgrense på 30 K) for å etterlate en løsning med antistoffkonsentrasjon høyere enn 1,5

x 10~<4>M. For å danne konjugatet ble 161 pl av antistoff-løsningen, inneholdende 25 x 10~<9> mol av IgG CC-49 blandet med 5 pl av SCN-PA-DOTA (5 mM konsentrasjon i den samme karbonatbufferen, fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 18). Blandingen fikk stå ved romtemperatur i 5 timer, og avsluttet ved filtrering gjennom 30 K membranen i Centricon™ konsentra-toren ved 5000 rpm i Sorvall RT sentrifugen. Antistoff-konjugatet ble dessuten vasket med 2 ml av en 0,25M DPA-løsning i PBS ved pH 7,4 og fem ganger (2 ml hver gang) med MES-buffer (20 mM, pH 5,8); sentrifugert i 30 min. etter hver vasking.

Til slutt ble PA-DOTA-IgG-konjugatet konsentrert til et minimumsvolum (om lag 100 pl) og dets integritet kontrollert ved HPLC-analyse på en GF-250-kolonne. Til det rensede konjugatet ble tilsatt en blanding av <153>Sm i 0,1N HCl (50 pl) og 20 pl av en MES buffer (1,0M, pH 6), blandet i en vortex-blander, og tillatt å stå ved romtemperatur over natten. Etter avslutning ved sentrifugalgelfiltrering var den innførte mengden av <153>Sm, anslått ved HPLC-analyse, 0,22BFC-Sm/antistoff . At <153>Sm var tilknyttet antistoffet ved chelatering med BFC, som var bundet kovalent til antistoffet, og ikke p.g.a. ikke-spesifikk binding, ble demonstrert ved sammenligning med resultater fra kontrolleksperimentet. I kontrolleksperimentet ble IgG CC-49-løsning blandet med <153>Sm-blanding under identiske betingelser. Antistoffet isolert på lignende måte hadde ingen merkbar mengde av <153>Sm tilknyttet seg. Dette viste derfor at ikke-spesifikk binding av Sm-153 til antistoffet ikke foregikk under disse betingelsene.

Eksempel XIII

Konjugering av a-[2-(4-isotiocyanatfenyl)-etyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksyre, samarium-153 kompleks til fragment F(ab')2 i CC-49; [153Sm(SCN-PA-DOTA)]-F(ab')2-fragment.

F(ab')2-fragmentet i CC-49 [fremstilt ved enzymatisk spalting ifølge fremgangsmåten beskrevet av (E. Lamoyi et al. , J. Immunol. Methods 56, 235-243 (1983)], (225 pl av 1 x 10"<4>M i 50 mmol HEPES, pH 8,5) ble blandet med 2,9 x IO"<8> mol av oc-[2-(4-isotiocyanatfenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraeddiksyre, samarium-153 kompleks fremstilt som beskrevet i eksempel VI. Natriumkarbonat (1,0M, om lag 9 pl) ble tilsatt for å bringe pH til om lag 8,9, og reaksjonen ble fortsatt i om lag 2,5 timer. <153>Sm-merket fragment ble isolert og karakterisert som beskrevet i eksempel IX. Den spesifikke aktiviteten var omkring 0,4 pCi/pg.

Eksempel XIV( A oa B)

In vivo lokalisering av konjugatet med cx-[2-(4-isotiocyanat-fenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,7,10-tetraeddiksyre, samarium-153-kompleks merket IgG og F(ab')2; [<153>Sm(SCN-PA-DOTA]-IgG og [15<3>Sm(SCN-PA-DOTA)]-F(ab')2•

Brukbarheten av konjugatet av cx-[2-(4-isotiocyanatfenyl) - etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,7,10-tetraeddiksyre, samarium-153-kompleks merket IgG og F(ab')2 med CC-49 (fra eksempel XII og XIII) ble demonstrert ved opptak av de merkede stoffene ved human tumor xenograft i atymiske mus. Biolokali-seringen ble bestemt ved bruk av fremgangsmåten beskrevet i eksempel XI. Resultater er vist i figurene 1 til 7 for IgG og figurene 8 til 14 for F(ab')2, også tabellene IIA og IIB.

Konjugatet av 153Sm(SCN-Bz-DTPA) med IgG og F(ab')2-merkede stoffer (fremstilt fra eksempel ZA) ble tatt med i studien for sammenligning. (Se tabellene IC og ID.)

Eksempel XV

Konjugering av a-(4-isotiocyanatfenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksyre, samarium-153 kompleks med antistoff [153Sm(SCN-BA-DOTA)]-IgG.

Hel IgG fra CC-49 (174 pl av 1,2 X 10"<4>M i 0,25M HEPES, pH 8,7) ble blandet med 2,0 x 10~<8> mol av cx-(4-isotiocyanatfenyl) - 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,7,10-tetraeddiksyre, samarium-153 (2,8 mCi) fremstilt etter eksempel VIII, etterfulgt av tilsetning av en natriumkarbonatløsning (1,0M, om lag 2 pl) for å holde pH på om lag 8,7. Omsetningen fikk fortsette i 2,5 timer ved romtemperatur. Etter avslutning ble <153>Sm merket IgG isolert ved sentrifugal gelfiltrering på Sephadex™ G-25 (2,2 ml) engangskolonner, og ytterligere renset ved HPLC på GF-250 kolonne, eluert med citrat buffer (0.025M, pH 7,4). De fraksjonene som inneholdt det merkede IgG ble slått sammen, konsentrert og utvekslet (3 ganger) til PBS ved anvendelse av Centricon™ konsentratorer. Homogenitet og integritet for samarium-153 merket IgG preparat ble verifisert ved HPLC og standard biokjemiske fremgangsmåter som beskrevet i eksempel IX.

Eksempel XVI

Konjugering av a-(4-isotiocyanatfenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksyre, samarium-153 kompleks med fragment F(ab')2 i CC-49; [153Sm(SCN-BA-DOTA)]-fragment F(ab')2

i CC-49.

F(ab')2 i CC-49 (84 pl av 2,4 x 10'<4>M i 0.25M HEPES

buffer, pH 8,7), fremstilt ved enzymatisk spalting ifølge fremgangsmåten beskrevet av Lamoyi et al. ble blandet med 2,1 x 10~28 mol av a-(4-isotiocyanatfenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksyre, samarium-153-kompleks (fremstilt ved fremgangsmåten i eksmpel VIII). Natriumkarbonat (1.0M, om lag 2 pl ) ble tilsatt for å bringe pH til 8,7, og omsetningen ble fortsatt i om lag 2 timer. Ved avslutning ble 153Sm merket fragment isolert og karkaterisert som besrkevet i eksempel IX.

Eksempel XVII fA oa B^

In vivo lokalisering av a-(4-isotiocyanatfenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksyre, samarium-153-kompleks merket IgG (eksempel XV) og F(ab')2 (eksempel XVI); [15<3>Sm(BA-DOTA)]-IgG og [153Sm(BA-D0TA]-F(ab')2.

In vivo studien ble utført ifølge protokoll beskrevet i eksempel XI, og resultatene er vist i figurene 1 til 14 og

tabellene HIA og UIB.

Eksempel XVIII ( A oa B)

In vivo lokalisering av cx-[2-(4-isotiocyanatfenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,7,10-tetraeddiksrye 177Lu-kompleks merket IgG og F(ab</>)2; [<177>Lu(PA-DOTA)]-IgG og [<177>Lu(PA-DOTA)]-F(ab/)2-

Tittelforbindelsene ble fremstilt og in vivo studier ble utfort ifølge protokoll beskrevet i eksemplene V, VI, XI, XII

og XIII og resultatene er vist i tabellene IVA og IVB.

Eksempel XIX ( A oa B)

In vivo lokalisering av cx-[2-(4-isotiocyanatfenyl) etyl] - 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,7,10-tetraeddiksyre, yttrium-90 kompleks merket IgG og F(ab')2; [<9>°Y(PA-DOTA)]-IgG og [<90>Y(PA-DOTA)]-F(ab')2.

Tittelforbindelsene ble fremstilt og in vivo studier ble utført ifølge protokoll beskrevet i eksempel XI, med det unntaket at vevene ble spaltet og telt med væskescintillasjon og resultatene er vist i tabellene VA og VB.

Eksempel XX

In vitro pH stabilitet for t<153>Sm(BFC)]-CC-49-IgG og [<177>LU(BFC)]-CC-49-IgG.

[<153>Sm(BFC)]-CC-49-)IgG eller [17<7>Lu(BFC)]-CC-49-IgG fikk stå i en 0,2M NaOAc buffer ved pH 6,0, 4,0 og 2,8 ved romtemperatur, ved en proteinkonsentrasjon på om lag 5 x 10~<6>M med om lag 0,5 kompleks/antistoff. Prøver ble trukket ut ved bestemte tidsintervaller og analysert ved HPLC (GF-250 kolonne) på dissosiasjon av 15<3>Sm eller <177>Lu aktivitet fra proteinet. Vanligvis ble studien utført i fem døgn eller inntil 90% av radioisotopene var blitt dissosiert. Resultatene er uttrykt som begynnelseshastigheten for tap av radioisotop pr. døgn. Resultatene viser den overlegne stabiliteten av 153Sm(PA-DOTA), <177>Lu(PA-DOTA, 15<3>Sm(BA-DOTA), <153>Sm(PA-DOTMA) og 153Sm(MeO-BA-DOTA), sammenlignet med standarden [<153>Sm(Bz-DTPA)]-kompleks ved sur pH. Resultatene er vist i tabellen nedenfor.

Denne større stabiliteten av kompleksene in vitro korrelerer også godt med den raskere clearance av 153Sm og 177Lu fra kroppen og ikke-målrettet vev (f.eks. nyrer og lever); se figurene 1-34.

Eksempel XXI fA oa B)

In vivo lokalisering av a-(2-metoksy-5-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,7,10-tetraeddiksyre, samarium-153 kompleks merket IgG og F(ab')2; [<153>Sm(MeO-BA-DOTA)]-IgG og [<153>Sm(MeO-BA-DOTA)]-F(ab')2.

Tittelforbindelsene ble fremstilt ifølge fremgangsmåtene beskrevet i eksemplene V, VI, XII og XIII, og in vivo-studiene ble utført ved fremgangsmåtene i eksempel XI. Resultatene er vist i tabellene VIA og VIB.

Eksempel XXII

Fremstilling av 15<3>Sm(PA-DOTMA)-kompleks.

Til 100 mikroliter (pl) av <153>Sm (0,3 x 10-3M i 0,01N HCl;

5 mCi) ble tilsatt 6 pl av PA-DOTMA (høy Rf diastereomer fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 29; 5 mM i MilliQ™ vann), 20 pl av en MES buffer (1.0M, pH 6) og 1 pl av en HEPES-buffer (0,5M, pH 8,7). Denne løsningen ble blandet på en vortex-blander, og den endelige pH i blandingen var om lag 6. Etter oppvarming av blandingen ved 90°C i 30 min., ble den analysert ved HPLC på GF-250 kolonne for komplekseringsgrad, og utbytter på 90% eller bedre ble vanligvis oppnådd. Karkateri-sering av <153>Sm-PA-DOTMA-komplekset ble utført ved sammenligning med det ikke-radioaktive-Sm-komplekset, som var blitt syntetisert og karakterisert uavhengig som beskrevet i eksempel 42

Eksempel XXIII

Fremstilling av 15<3>Sm(SCN-PA-DOTMA).

Til <153>SmPA-DOTMA-komplekset fremstilt i eksempel XXII og som var blitt avkjølt i 20 min. ved romtemperatur, ble tilsatt 10 pl av en 1% tiofosgenløsning i 90% acetonitril-vannmedium. Blandingen ble kraftig blandet på en vortex-blander, og fikk

stå ved romtemperatur i mellom 5 og 20 min.. Omsetningen fant sted øyeblikkelig som fulgt ved HPLC-analyse. For å rense det aktiverte <153>Sm-komplekset, ble det ekstrahert 3 ganger (200 pl hver) med kloroform, og det vandige sjiktet ble ledet gjennom en PRP-patron (PRP patron = Mini-clean™ patron fra Alltech Associates, Deerfield, IL) forbehandlet med 5 ml metanol og 5 ml av en MES-buffer (20 mM, pH 5,8). Etter vasking med 5 ml av MES-bufferen og 5 ml av Milli-Q™-vann, ble det ekstrahert med 900 pl av 90% acetonitril for å gjenvinne om lag 90% av <153>Sm-aktiviteten, med de første 100 pl kastet. Blandingen ble inndampet til tørrhet under redusert trykk ved temperaturer under 40°C, og residuet som inneholdt mesteparten av tittelproduktet, ble anvendt for konjugering med antistoffet.

Eksempel XXIV fA og B)

Konjugering av 153Sm(SCN-PA-DOTMA) med IgG og F(ab')2 CC49.

Vanligvis ble antistoffet konsentrert og utvekslet til en karbonatbuffer (pH 9,1 eller 9,5, 50 mM) i en Centricon™ konsentrator (molekylvektgrense på 3OK) for å resultere i en proteinkonsentrasjon på 1,5 x 10~<4>M eller høyere. For å konjugere blir et lite volum av karbonatbufferen, det som er nødvendig for å bringe den endelige proteinkonsentrasjonen til 1,5 x 10~<4>M, tilsatt til isotiocyantderivatet av 15<3>Sm(PA-DOTMA) (fremstilt i eksempel XXIII), etterfulgt av det konsen-trerte antistoffet, ekvimolart med BFC-<153>Sm-komplekset. Det ble

blandet på en vortex-blander og fikk reagere ved romtemperatur

i 1 time eller inntil 40 til 50% av et <153>Sm ble bundet til antistoffet, som vist ved HPLC-analyse på en GF-250 kolonne. Det merkede antistoffet ble isolert ved to på hverandre følgende sentrifugalgelfiltreringer på Sephadex<T>2M G-25-kolonner

(2,2 ml). Homogeniteten, integriteten og immunreaktiviteten for det merkede antistoffet ble analysert ved HPLC-analyse og standard biokjemiske teknikker beskrevet tidligere.

Eksempel XXV ( A og B)

Biodistribusjonsstudier av <153>Sm(PA-DOTMA) merket IgG og F(ab')2 CC49.

Studiene ble utført på lignende måte som beskrevet i eksempel XI. Resultatene er vist i tabellene VHA og VIIB. Se figurene 15-28.

Eksempel XXVI

Fremstilling av <177>Lu (PA-DOTMA)-kompleks.

Til 30 pl av 17<7>Lu (6 x 10"<3>M i 1,1N HCl; 4 mCi) ble tilsatt 36 pl av PA-DOTMA (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 29); 5 mM løsning i milli-Q™ vann). Løsningen ble blandet på en vortex-blander, og 115 pl av en MES-buffer (1,0M, pH 6,0) ble tilsatt for å nøytralisere løsningen til om lag pH 5,5 til 6. Denne ble oppvarmet ved 90°C i 30 min. for å resultere i bedre enn 90% chelatering. Blandingen ble ledet gjennom en PRP-patron forbehandlet med 5 ml metanol og 5 ml av en MES-buffer (20 mM, pH 5,8). Den ble vasket med 5 ml av milli-Q™ vann. Komplekset ekstrahert i 1000 pl av 90% acetonitril var ansvarlig for 78% av opprinnelig <177>Lu-aktivitet (idet de første 100 pl av ekstraktet ble kastet).

Eksemle XXVII

Fremstilling av 177Lu(SCN-PA-DOTMA).

Til <177>Lu (PA-DOTMA) komplekset i 90% acetonitril oppnådd

i eksempel XXVI ble tilsatt 6 pl av en 10% tiofosgen i 90%

acetonitril. Denne løsningen ble blandet på en vortex-blander, og etter 20 min. analysert for dannelse av isotiocyanatderivatet ved HPLC. Omsetningen er vanligvis kvantitativ. Fjerning av løsningsmidlet og overskuddet av tiofosgen ble oppnådd ved inndamping under redusert trykk ved temperaturer under 40°C i 1 til 2 timer. Residuet ble brukt for konjugering med antistoffet.

Eksempel XXVIII

Konjugering av 17<7>Lu(PA-DOTMA) til IgG CC49.

Antistoffet IgG CC49 i karbonatbuffer (50 mM, pH 9,1) ble blandet med en ekvimolar mengde av isotiocyantderivatet (fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel XXVII) i den samme bufferen. Reaksjonen ble fortsatt i 70 min. ved en antistoffkonsentrasjon på 1,5 x 10~<4>M, og det merkede antistoffet ble isolert og karakterisert ifølge fremgangsmåtene beskrevet i eksempel IX.

Eksempel XXIX

Langtidsbiodistribusjonsstudier av <177>Lu(PA-DOTMA) og <177>Lu(PA-DOTA) merket IgG CC49.

Langtidsdyretesten ble utført med <177>Lu merket antistoff, idet man høstet fordelen av dets lange halveringstid (161 timer). Den ble utført med Balb/c-mus over en tre ukers periode, ifølge protokoller beskrevet i eksempel XI. Resultatene er vist i tabell VIIIA. Se figurene 29-34.

I figurene som plotter data fra følgende tabeller, var de anvendte symbolene:

I de medfølgende figurene skal de gitte data representere følgende:

Andre utførelser av oppfinnelsen vil være åpenbare for fagfolk i denne teknologien utifrå en betraktning av denne beskrivelsen eller praktiseringen av den oppinnelsen som er beskrevet heri. Det er hensikten at beskrivelsen og eksemplene betraktes utelukkende som eksempler, med den virkelige ramme og ånd i oppfinnelsen indikert ved følgende krav.

Claims

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av et konjugat inneholdende et kompleks av en forbindelse med formelen hvor M er et ion av et metall valgt fra La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y og Sc, hver Q uavhengig er hydrogen eller (CH<5>)pC02R; Q<1> er hydrogen eller (CH<5>)wC02<R; > hver R uavhengig er hydrogen, benzyl eller C1-C4alkyl; under den forutsetning at minst to av summen av Q og Q<1> må være forskjellig fra hydrogen, <p>g at når Q<1> er hydrogen, må R<3 >være forskjellig fra hydrogen; hver R<5> uavhengig er hydrogen eller C1-C4alkyl; X og Y begge uavhengig er hydrogen eller kan sammen med en nærliggende X og Y danne en ytterligere karbon-karbon-binding; n er 0 eller 1; m er et helt tall fra 0 til og med 10; p er 1 eller 2; r er 0 eller 1; w er 0 eller 1; med det forbehold at n er bare 1 når X og/eller Y danner en ytterligere karbon-karbon-binding, og summen av r og w er 0 eller 1; R<2> er hydrogen, nitro, amino. isotiocyanat, semikarbazid, tiosemikarbazid, maleinsyreimid, bromacetamid eller karboksyl; R<3> er <C>1-C4alkoksy, -OCH2C02H, hydroksy eller hydrogen; R<4> er hydrogen, nitro, amino, isotiocyanat, semikarbazid, tiosemikarbazid, maleinsyreimid, bromacetamid eller karboksyl; med det forbehold at R<2> og R<4> ikke begge kan være hydrogen, men én av R<2> og R<4> må være hydrogen; et farmasøytisk akseptabelt salt derav, karakterisert ved at man kovalent binder komplekset som er definert ovenfor til et antistoff eller antistoff-fragment.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffet eller antistoff-fragmentet omsettes med 1-[2-(isotiocyanat-fenyl)etyl]-1,4,7,lO-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyre-komplekset, med 1-(2-metoksy-5-aminobenzyl)-1,4,7,10- tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyrekomplekset, med 1-(2-hydroksy-5-aminobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-4,7,10-trieddiksyrekomplekset, med a-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l- (R, S) -eddiksyre 4,7,10-tris-(R)-metyleddiksyre, 1-isopropyl-4,7,10-trimetylester-komplekset, med a-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l- (R,S)-eddiksyre 4,7,10-tris-(R)-metyleddiksyre, med a-[2-(4-isotiocyanat-fenyl)etyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododekan-l- (R,S)-eddiksyre-4,7,10-tris-(R)-metyleddiksyre, med a-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,7-trieddiksyre, med a-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,10-trieddiksyre, med a-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetra-azacyklododekan-1,4,7,10-tetraeddiksyre, med a-(4-isotiocyanatfenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l, 4,7,10-tetraeddiksyre, med a-[2-(4-nitrofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraeddiksyre, 1,4,7,10-tetrametylester, med a-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksyre, 1,4,7,10-tetrametylester, med a-[2-(4-aminofenyl)etyl]- 1,4,7,10-tetraazacyklo-dodekan-l,4,7,10-tetraeddiksyre, med a-[2-(4-isotiocyanatfenyl)etyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododekan-l, 4,7,10-tetraeddiksyre, med a-(2-metoksy-5-nitrofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-tetraeddiksyre, med a-(2-metoksy-5-aminofenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l , 4 ,7,10-tetraeddiksyre, tetra-ammoniumsalt, eller med a-(2-metoksy-5-isotiocyanatfenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraeddiksyre, tetraammoniumsalt.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at man som metallion anvender <153>Sm, 166Ho, 90Y, <149>Pm; 159Gd, 140La, 177Lu, 1<7>5Yb, <47>Sc, eller <142>Pr.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at man som metallion anvender <153>Sm, <177>Lu eller <90>Y.

5. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1-4, karakterisert ved at man som antistoff eller antistoff-fragment anvender et monoklonalt antistoff eller fragment derav.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at man som antistoff aller antistoff-fragment anvender CC-49, CC-49 F(ab')2, CC-83, CC-83 F(ab')2 eller B72.3.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 2, 5 og 6 ved fremstilling av 177Lu-PA-D0TA-CC49, - karakterisert ved at a-[2(4-isotiocyanat-fenyl )etyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,7,10-tetraeddiksyre-17<7>Lu-kompleks omsettes med CC-49.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffet eller antistoff-fragmentet omsettes med a-[2-(4-isotiocyanat-fenyl) etyl-l,4,7,10-tetraacacyklododekan-l-(R,S)-eddiksyre-4,7,10-tris-(R-metyleddiksyre)-komplekset.