JP2002509158A - アーム付きリガンドの送達向上のための抗体と受容体ターゲティング部分 - Google Patents

アーム付きリガンドの送達向上のための抗体と受容体ターゲティング部分

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Abstract

(57)【要約】 悪性腫瘍、免疫性または炎症性状態の診断および治療のための、薬剤または他の作用剤の細胞間送達の方法。抗体と選択したサイトカイン受容体のリガンド結合領域のターゲティング部分を使用する。ターゲティング部分は、特異性細胞個体群の表面抗原を標的とする。ターゲティング部分は、被験者に投与し、既定の間隔の後、同種のサイトカインに結合された治療または診断作用剤を投与した。本発明により、サイトカイン受容体抗体／抗原複合体の迅速で有効なインターナリゼーションが行える。二重特異性融合タンパク質を用いる高レベルの細胞表面抗原のターゲティングによって、サイトカイン受容体の数が実質的に低いバックグラウンドレベル以上に増加する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） 本発明は、内在化性(internalizing)受容体複合体の成分および細胞の特定の 表面抗原に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の接合体、好ましくは融合タ
ンパク質と、内在化性受容体系の放射性核種または毒素とリガンドの接合体と、
このような遺伝的および化学的接合体を用いた診断または治療の方法に関する。
【０００２】 現在、ｍＡｂの腫瘍治療への使用例は、かなり多数にのぼり、さらに増加して
いる。異なる抗原を標的としたいくつかの研究で有望な結果が得られている。こ
れらの研究では、放射線標識されたｍＡｂや、数は少ないがｍＡｂと毒素の接合
体が用いられている。
【０００３】 腫瘍の診断および治療に用いるｍＡｂは、同種の抗原に結合したり、内在化す
る能力が異なる。例えば、ＣＤ２２が十分なインターナリゼーション（内在化）
を示すのはもちろんのこと、インターナリゼーション後にこの抗原の再発現も行
う。しかし、ＣＤ２２は、一部のＢ細胞悪性に対する発現レベルが比較的低くな
っている。すなわち、Ｂ細胞リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）の症例のわずか３０
〜５０％に対してのみ発現される。
【０００４】 ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ２０抗原などの他の細胞表面は、ＣＤ２２抗原とは対
照的に、広範囲のＢ細胞悪性腫瘍で発現される比較的高発現性のＢ細胞抗原であ
り、その範囲は急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）からより分化したＢ細胞（Ｂ−Ｃ
ＬＬ）および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、そしてヘアリー細胞白血病（ＨＣ
Ｌ）にまでにわたる。これらの抗原は一般に、これらの悪性の大多数の症例にお
いて、高い抗原濃度で細胞に対して発現される。これら抗原の最大の欠点は、イ
ンターナリゼーションが遅いことである。この特徴が、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ
２０を毒素ベース治療に用いる際に、著しく影響を及ぼす。
【０００５】 ＨＬＡ−ＤＲとＣＤ２０に関する別の問題は、Ｂ細胞悪性腫瘍では、結合され
た抗ＨＬＡ−ＤＲおよび抗ＣＤ２０ｍＡｂが表面から、非リンパ腫瘍の場合より
もさらに速く解離することである。このことは、Ｂ細胞制限抗原、特に、緩徐な
インターナリゼーションを特徴とする抗原を対象とした治療は、これらの問題に
対処すれば改善される可能性があることを意味している。
【０００６】 種々のｍＡｂと毒素の構築体について生体外実験とヒト治験の両方によって試
験を行った。これらの研究によって、これらの試薬の強力で特殊な効果が証明さ
れた。使用した毒素分子の大半は、植物源または細菌源に由来するため、患者に
中和抗毒素抗体反応を引き起こす。これにより、治療の持続時間が厳しく制限さ
れる。
【０００７】 （発明の要約） したがって、本発明の目的は、癌および免疫性または伝染性の疾病に対する、
さらに有効な診断および／または治療方法を提供することである。
【０００８】 本発明の別の目的は、緩徐に内在化する表面抗原の抗原標的としての価値を向
上させることである。
【０００９】 本発明のまた別の目的は、腫瘍細胞の表面に結合された抗体が、その細胞表面
から解離する傾向を低下させることである。
【００１０】 本発明の、これらの、または他の目的は、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−４Ｒα、ＩＬ
−１３ＲαおよびＩＬ−１５αより成る群から選択される受容体サブユニットの
リガンド結合領域に結合された抗体の接合体より成るターゲティング部分を提供
することによって実現される。その抗体は、標的細胞への特異性を持つ細胞抗原
に対して特異的である。ターゲティング部分(targeting moiety)は、抗体がリガ
ンド結合領域、抗体およびリガンド結合領域の融合タンパク質、または、標的細
胞に対して特異的な細胞抗原に対する第１特異性と、急速なインターナリゼーシ
ョンを起こす受容体複合体に対する第２特異性を持つ二重特異性抗体に共有結合
的に結合された共有結合性接合体を含んでいてもよい。ある実施形態では、抗体
は、例えばＣＥＡなどの固形腫瘍により発現される抗原に対して特異性で、ＩＬ
−１３Ｒαのリガンド結合領域に結合している。別の実施形態では、抗体はＨＬ
Ａ−ＤＲに対して特異的で、ＩＬ−１５Ｒαのリガンド結合領域に結合している
。本発明によるターゲティング部分と薬学的に許容可能な担体より成る組成物も
提供する。
【００１１】 本発明は、薬剤、放射性核種または毒素に結合したＩＬ−１３の接合体と、Ｉ
Ｌ−１３Ｒαのリガンド結合領域に結合し、標的細胞に特異性を持つ細胞マーカ
ーに対して特異性の抗体を含むターゲティング部分とを含むキットを提供する。
本発明はまた、薬剤、放射性核種または毒素に結合したＩＬ−１５の接合体と、
ＩＬ−１５Ｒαのリガンド結合領域に結合した、標的細胞に特異性を持つ細胞マ
ーカーに対して特異性の抗体を含むターゲティング部分とを含む第２のキットを
提供する。
【００１２】 本発明は、癌の治療方法を提供する。この治療方法は、そのような治療を必要
とする被検者に、標的細胞に対して特異性を持つ抗原に対して特異性である抗体
を含み、ＩＬ−１３Ｒαのリガンド結合領域に結合したターゲティング部分をま
ず投与し、次に、既定の間隔の後に、その被験者に対し、治療的に有効な量の薬
剤、放射性核種または毒素に結合したＩＬ−１３の接合体を投与することを含む
。癌や、免疫性または伝染性の疾患に対する別の治療方法は、そのような治療を
必要とする被検者に、標的細胞に対して特異性を持つ抗原に対して特異性である
抗体を含み、ＩＬ−１５Ｒαのリガンド結合領域に結合したターゲティング部分
をまず投与し、次に、その被験者に対し、治療的に有効な量の薬剤、放射性核種
または毒素に結合したＩＬ−１５接合体を投与することを含む。
【００１３】 本発明の他の目的、特徴および利点は、以下に詳しく述べる説明によって明ら
かになる。しかし、詳しく述べた説明と具体例は、本発明の好ましい実施形態を
示しているが、当業者にとって本発明の精神と範囲を超えない種々の変更および
修正が明白となるため、例示のみを目的として記載することを理解すべきである
。
【００１４】 （好ましい実施形態の説明） 意外なことに、抗原標的としての表面抗原の価値は、抗親和性の内在化性の受
容体系にこれらの表面抗原を機能的に結合することにより、著しく高めることが
できる。本発明は、有用な細胞表面抗原がゆっくりとしたインターナリゼーショ
ンを引き起こす場合に特に有利である。
【００１５】 本発明は、サイトカインおよび成長因子受容体の基本的特性、すなわち、迅速
で効率よく内在化する能力に基づいている。受容体とリガンドの迅速なインター
ナリゼーションの例として、トランスフェリンと低密度リポタンパク質（ＬＤＬ
）受容体と同様に、栄養分の細胞内輸送が挙げられる。インシュリンや上皮成長
因子（ＥＧＦ）などの成長因子受容体は、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４Ｒ
などのサイトカイン受容体と同様に、迅速に内在化する。トランスフェリンを除
いて、研究したすべての例で、リガンドは、低ｐＨ、プロテアーゼ／酸加水分解
酵素をリソソーム含む区画に対して輸送された結果、タンパク分解される。ＬＤ
Ｌまたは薬剤、毒素、放射性核種に結合したコレステロールといった、リガンド
に関連した分子は、他のリガンドに結合して、それらの分子が効果を発揮する超
過リソソーム区画(extra-lysosomal compartment)に流出することができる。
【００１６】 インターナリゼーション後の受容体の運命は、受容体系によって変わる。例え
ば、トランスフェリンやＬＤＬ受容体と同様に、細胞表面に再循環する場合もあ
れば、受容体自体が分解する場合もある。受容体のリソソーム分解は、ＥＧＦ受
容体などの受容体について報告されており、引き続いて起こるリガンド刺激に対
する受容体の反応抑制および減感作に有効である。
【００１７】 一部のリガンド／受容体系では、新規ｍＲＮＡおよびタンパク質合成による受
容体の再発現が見られる。例えば、ＣＤ２２は、同種のＬＬ２２ｍＡｂの結合の
後、迅速に内在化され、特異性ｍＡｂによる同種の抗原の抗原飽和結合のサイク
ルが完了し、３７℃で内在化された２時間後に、ただちに再発現される。再発現
はさらに、数ヶ月あるいは数年もの間維持される、サイトカイン／成長因子に依
存する一連の細胞系の能力によって証明され、要求性リガンド結合はもちろんの
こと、情報伝達タンパク質の、進行中の再合成および再発現も示唆されている。
総合すれば、これらの観察結果によって、サイトカイン受容体は、複数回のイン
ターナリゼーション（内在化）と再発現のサイクルを迅速に行うことが可能なた
め、リガンドの細胞内送達に関して高い能力を備えている。
【００１８】 本発明に基づいて、内在化が遅い抗原を、より迅速に内在化する複合体に並置
することによって迅速に内在化させることが可能である。例えば、ＩＬ−２受容
体型は、アルファ（ＩＬ−２Ｒα、以前のＴａｃ抗体）、ベータ（ＩＬ−２Ｒβ
）、ガンマ（γc）鎖より成る。ＩＬ−２Ｒαはゆっくりと内在化するが、ＩＬ −２リガンドの存在により、ＩＬ−２Ｒβやγcに物理的に結合または連合する ようになると、ＩＬ−２Ｒβ／γc二量体の迅速な固有速度で、三量体タンパク 質複合体全体が内在化されるようになる。これは、受容体が２つ以上のサブユニ
ットで構成され、その１つが通常、個別の特殊なα鎖である、サイトカインの生
化学特質における再循環パターンに従う。ＩＬ−６−ＩＬ−ＧＲ系は、アルファ
サブユニットの細胞外領域が、ｇｐ１３０情報伝達分子に関連した固有能力を持
つという点で特に注目に値する。この能力とは、ＩＬ−６と溶解性のＩＬ−６α
をｇｐ１３０のみを発現する細胞に加えると、情報伝達反応が発生するというも
のである。ＩＬ−２とＩＬ−６受容体系はそれぞれ、２つの主要なサイトカイン
情報伝達サブユニットであるγc（ＩＬ−２、４、７、９、１５の受容体複合体 が使用）とｇｐ１３０（ＩＬ−６、１１、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、カージオ
トロフィン−１の受容体複合体が使用）の好例である。
【００１９】 受容体系は、アーム付きリガンドの細胞間送達を向上させるために、本発明に
従って利用することができる。サイトカイン受容体は、ｍＡｂ受容体接合体を用
いて、通常そのような受容体を持たない細胞表面を標的にすることができる。例
えば、ＩＬ−６と繊毛神経栄養性因子（ＣＮＴＦ）受容体のアルファ鎖は、ＣＤ
３４、ＣＤ４５、ＣＤ６４細胞表面抗原に方向付けられたｍＡｂによって、以前
の陰性細胞の表面を標的とした。このようなｍＡｂ−Ｒα接合体を因子依存性細
胞に加えると、ＩＬ−６またはＣＮＴＦに対する新規の特異的な応答性が付与さ
れた。
【００２０】 本発明によるターゲティング部分は、Ｆ（ａｂ1）2サイズまでのＭＡｂフラグ
メントに結合された受容体より成る。適切な抗体フラグメントとしては、ハイブ
リッドフラグメントを含め、Ｆ（ａｂ1）2、Ｆ（ａｂ）2、Ｆａｂ1、Ｆａｂ、Ｆ
ｖなどが挙げられる。免疫グロブリンの高頻度可変性の抗原結合領域を持つサブ
フラグメントも、すべて有用である。これには、単一鎖、複数鎖にかかわらず、
遺伝子組換および／または組換タンパク質が含まれる。これらは、天然のガンマ
グロブリンフラグメントと本質的には同様の方法で、抗原結合部位と、標的媒体
としての別の生体内機能を備えている。単一鎖結合分子は、米国特許４，９４６
，７７８で開示されており、この文献は引用することにより本明細書の一部をな
すものとする。Ｆａｂ1抗体フラグメントは、無傷の免疫グロブリンのペプシン 消化によって作成されるＦ（ａｂ1）2フラグメントが、還元性開裂することによ
って簡単に作成できる。Ｆａｂ抗体フラグメントは、還元性条件下で無傷の免疫
グロブリンをパパイン消化させて作成するか、Ｉｇ全体を注意してパパイン消化
させて得られたＦ（ａｂ）2フラグメントを開裂させて作成してもよい。このフ ラグメントは、遺伝子組換によっても作成できる。本明細書で「抗体」という語
を用いる場合、これには上記のすべての種類のフラグメントが含まれる。
【００２１】 単一鎖抗体ｓｃＦなどのＭＡｂフラグメントはさらに、血液および器官を迅速
に浄化し、腫瘍小結節によく浸透するという利点を備え、好ましい実施形態にお
いて、必要な標的抗原に対するＭＡｂのｓｃＦvは、受容体のリガンド結合領域 に結合される。ＭＡｂの分子工学技術を用いて、ｓｃＦvを作成することができ る。この分子は、興味のあるｍＡｂのＶHとＶLセグメントをクローニングし、そ
の間に置かれた短いリンカー領域によってともにスプライスすることによって作
成できる。これらの分子は、正しく設計、復元された後に、親ｍＡｂの抗原結合
活性を保持し、大腸菌ベースの昆虫または哺乳類の発現システムにおいて、高い
レベルで発現可能である。そして、これらの作成物は、エフェクタ細胞または分
子を再度標的にするために、第２の部分（受容体または第２の単一鎖抗体）を第
１の部分に結合可能な二機能性単一鎖分子に関する技術の基盤となる。
【００２２】 抗体の混合物は、ハイブリッド抗体と同様に使用できる。このハイブリッドは
、２つの特異性を備えることができる。すなわち、１つのアームが標的細胞の１
つの抗原に結合され、別のアームが標的細胞の別の抗原に結合されるか、１つの
アームが、受容体サブユニットのリガンド結合領域を保持することができる。２
つの特異性を備えたハイブリッド抗体フラグメントは、米国特許４，３６１，５
４４で開示された抗腫瘍マーカーハイブリッドと同様に作成できる。ハイブリッ
ド抗体を作成する他の技術は、例えば、米国特許４，４７９，８９５、米国特許
４，４７４，８９３、米国特許４，７１４，６８１、Ｍｉｌｓｔｅｉｎらによる
、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ５：２９９（１９８４）に開示されており、こ
れらはすべて引用することにより本明細書の一部をなすものとする。上記は単に
説明のためであり、本発明の範囲内に含まれる、特異性の他の組み合わせも想定
できる。
【００２３】 抗体は、受容体の細胞外領域に結合される。細胞外領域全体が大規模であるた
め、リガンド結合部位を含む領域を切断したものを使用できる。抗体／受容体接
合体は、共有結合接合体を作成するために、抗体を受容体に直接、または、長短
のリンカー部分を通じて、すなわち、抗体および／または酵素にある、アミン基
、カルボキシル基、フェノール基、チオール基またはヒドロキシル基などの１つ
以上の官能基を通じて受容体に共有結合的に結合することによって作成できる。
例えば、ジイソシアネート、ジイソチオシアネート、ビス（ヒドロキシスクシン
イミド）エステル、カルボジイミド、ビスマレイミド、ジチオール、マレイミド
−ヒドロキシスクシンイミドエステル、グルタルアルデヒドなどの、従来の各種
リンカーも使用できる。抗体作成物は、所与の用途においてリガンドを使用する
かどうかによって、１つのアームをリガンド結合領域、または、リガンド結合部
位から離れた部位のどちらに結合させてもよい。
【００２４】 抗体／受容体接合体を作成する簡単な方法は、グルタルアルデヒドの存在下で
、抗体をリガンド結合領域と混合することである。最初のシッフ塩基結合は、水
素化ボロン還元で２級アミンに還元することによって安定化できる。この方法は
、例えば、免疫組織化学的用途やイムノアッセイ用のペルオキシダーゼと抗体の
接合体を作成するのに従来から用いられている。グルタルアルデヒドの代わりに
、ジイソオシアネート、ビスヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミ
ド、または他の二機重能性架橋剤を用いることができる。
【００２５】 さらに選択的な結合を作成するには、マレイミド−ヒドロキシスクシンイミド
エステルなどのヘテロ二重機能性リンカーを用いる。マレイミド−ヒドロキシス
クシンイミドエステルと、受容体のリガンド結合領域との反応は、受容体にアミ
ン基を誘導体化させ、誘導体は、例えば、自由スルフヒドリル基を持つ抗体Ｆａ
ｂフラグメント（または、トラウト試薬により、それに追加された自由スルフヒ
ドリル基を持つ、さらに大型のフラグメント）と反応することができる。
【００２６】 受容体サブユニットのリガンド結合領域を、リガンド結合部位から離れた抗体
の部位に結合させることは有利である。これは、上で注目したように、例えば開
裂した鎖内のスルフヒドリル基への結合によって実現できる。別の方法には、炭
水化物部分が酸化された抗体と、少なくとも１つの自由１級アミノ基を含むリガ
ンド結合領域との反応が含まれる。これによって生じる初期のシッフ塩基（イミ
ン）結合は、最終接合体を生成するために、２級アミンへの還元、すなわち水素
化ボロン還元によって安定化させることが好ましい。
【００２７】 代わりの方法では、抗体／受容体接合体が、受容体のリガンド結合領域に免疫
学的に結合されている二重特異性抗体接合物を含む。二重特異性抗体または抗体
フラグメントは、標的細胞に対して特異性を持つ細胞抗原に関する第１の特異性
と、受容体複合体のリガンド結合サブユニットまたは別のサブユニットの細胞外
領域に関する第２の特異性を備えている。
【００２８】 最も好ましくは、抗体／受容体接合体が、融合タンパク質より成ることである
。融合タンパク質において、受容体のリガンド結合領域に結合された抗体で構成
されている融合配列は、組換、ビリオンをベースとする哺乳類発現系か、他の哺
乳類、昆虫、酵母または大腸菌をベースとする発現系において発現される。抗体
をリガンド結合領域に結合させるのに適したリンカーは、例えば、（ＧＧＳＧＳ
）3か、ＫｕｒｕｃｚらのＪ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４：４７５６−４５８ ２（１９９５）で開示された２３−アミノ酸リンカーである。
【００２９】 抗体／受容体接合体はどれでも、放射線同位体または磁気共鳴画像促進剤を用
いて直接標識するか、放射線同位体または磁気共鳴画像促進剤に接合させるため
に、共役または順応させることができる。好ましい実施形態では、抗体／受容体
二重機能性作成物に標識しない。これを投与し、標的部位に局在化させるととも
に、哺乳類の循環系からクリアランスされるのに十分な既定の間隔の後、アーム
付き接合体リガンドを与える。このことは、ボロン複合体を治療目的で使用する
場合に、特に重要である。代わりの方法では、接合体に、例えば放射線標識、蛍
光標識などの標識でタグを付ける。これらの標識によって、体液、例えば血液や
尿中での検出および定量化が可能となるため、ターゲティングおよび／またはク
リアランスを測定および／または推測できる。
【００３０】 放射線標識の従来の方法は、生体内で用いるタンパク質の標識化に適しており
、一般にこれらの抗体／受容体接合体の標識に適している。この標識は、例えば
Ｉ−１３１、Ｉ−１２４またはＩ−１２３などを用いた直接標識によって行える
。Ｉ−１３１、Ｉ−１２４またはＩ−１２３のいずれかを用いた標識は、酸化手
順を用いるとただちに作用する。この手順では、例えば、Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄら
がＢｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．、 ８９： １１４（１９６３）で報告し、ＭｃＣｏ
ｎａｈｅｙらがＩｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ． Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．、 ２９： １８５（１９６９）で修正したように、放射性のヨウ化カ
リウムまたはヨウ化ナトリウムの混合物と抗体をクロラミン−Ｔで処理する。こ
れにより、ヨウ素原子が、試薬と反応条件によって、おそらく大半はチロシン残
基の、場合によってはトリプトファン残基の、あるいはフェニルアラニン残基の
、抗体分子の水素原子に直接置換される。代わりの方法では、Ｆｒａｋｅｒらが
Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ ８０：８４９−８
５７、 １９７８で述べたヨードゲンによる方法か、Ｆｅｔｅａｎｕによる ｓ
ｕｐｒａ、 ３０３ページに説明されたような、ラクトペルオキシダーゼヨウ素
化のどちらかを用いてもよく、参考文献はその中に引用されている。
【００３１】 Ｉ−１３１、Ｉ−１２４またはＩ−１２３の代わりに、例えばＴｃ−９９ｍま
たは銅イオンなどを用いた金属化によって、従来の技術によって、あるいは放射
性金属または常磁性イオンのキレート剤を付着させることによって、接合体に標
識することができる。このようなキレート剤と、抗体への付着方法は、当業者に
は周知である。
【００３２】 抗体／受容体接合体は本発明により、患者に投与すると、ターゲティング部分
として働く。この後、ターゲティング部分が目的の標的細胞に結合し、通常の組
織からクリアランスされるためのターゲティング・クリアランスのための間隔を
置き、その後、アーム付きリガンドを投与する。アーム付きリガンドは、ターゲ
ティング部分の受容体と同種のリガンドで構成され、放射性核種、薬剤および毒
素に接合する。放射性核種は、診断用または治療用放射性核種のどちらにもなり
うる。
【００３３】 診断用放射線核種の例として、ヨウ素１２３、ヨウ素１２４、ヨウ素１３１、
インジウム１１１、ガリウム６７、ガリウム６８、ルテニウム９７、テクネチウ
ム９４、テクネチウム９９ｍ、銅６４、銅６７、コバルト５７、コバルト５８、
クロム５１、鉄５９、イットリウム８６、セレン７５、タリウム２０１、イッテ
ルビウム１６９が挙げられる。治療用放射線核種の例として、例えばビスマス２
１２、アスタチン２１１などのアルファ放射体、例えばイットリウム９０、レニ
ウム１８６、ネニウム１８８、銅６７、ヨウ素１３１などのベータ放射体；ある
いは、ヨウ素１２５、インジウム１１１、ガリウム６７などの電子捕獲またはオ
ージェ変換電子放射放射線核種が挙げられる。放射性核種は、好ましくは１０−
５０００ｋｅＶの範囲、さらに好ましくは５０−１５００ｋｅＶの範囲、最も好
ましくは５０−５００ｋｅＶの範囲で放射する。放射線核種は、上で述べた標識
技術はもちろんのこと、当業者に周知の他の従来技術によって、特異性抗体に含
めてもよい。
【００３４】 一般にヒトや哺乳類を苦しめる腫瘍細胞または微生物に対して細胞障害効果を
持つ、多くの薬剤および毒素が知られている。これらは、メルクインデックスな
どの薬剤および毒素の概要に記載されている。好ましい毒素は、オンコナーゼな
どのリボヌクレアーゼである。オンコナーゼは、Ｒａｎａ ｐｉｐｉｅｎｓ卵母
細胞から精製された非哺乳類リボヌクレアーゼである。臨床試験において、ヒト
膵臓癌に対して抗腫瘍活性を持つことが判明したが、Ｂ細胞リンパ腫または白血
病などの、Ｂ細胞悪性腫瘍に対しては、最小限の抗腫瘍活性のみ持つことが分か
った。
【００３５】 アーム付きリガンド（特にＩＬ−２またはＩＬ−１５）を添加すると、標的細
胞表面にあるβ／γc鎖サブユニットと受容体のα鎖サブユニットより成る、三 量体複合体が生成する。これは、抗体／受容体接合体によって、標的細胞表面に
付着する。このことにより、毒素および／または放射線核種が標的細胞内に迅速
に内在化する。ＩＬ−４またはＩＬ−１３の添加後、類似性の二量体または三量
体複合体が集合する。治療用放射線核種を有効にするためにインターナリゼーシ
ョンが不要ならば、これらの複数量体複合体は、リガンドを標的細胞にさらに安
定に結合させ、インターナリゼーションも促進する。
【００３６】 同一のリガンドは、放射性核種、薬剤および毒素を装備可能であり、別個のリ
ガンドは、放射性核種、薬剤および毒素を装備可能である。放射性核種、薬剤お
よび毒素を装備した別個のリガンドの場合は、これらは同時か、順番に投与でき
る。
【００３７】 抗体／受容体接合体およびアーム付きリガンド接合体は、薬学的に許容可能な
担体を持つ組成物の形で投与される。この点について、薬学的に許容可能な担体
は、融合タンパク質またはアーム付きリガンドを投与するための媒体として使用
できる材料である。なぜなら、この材料は不活性であるか、不活性でない場合は
医学的に許容可能であることはもちろんのこと、融合タンパク質またはアーム付
きリガンドに対して適合性であるためである。
【００３８】 抗体が結合される、好ましい高親和性を備えた内在化性の受容体系として、Ｉ
Ｌ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５受容体系が挙げられる。ＩＬ−２／
ＩＬ−２Ｒ（ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒ系に関連）とＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒ（Ｉ
Ｌ−１３／ＩＬ−１３Ｒシステムに関連）のインターナリゼーション速度のｔ1/ 2 値は、約１５−３０分である。本発明で使用する特に好ましい受容体系は、Ｉ Ｌ−１３およびＩＬ−１５受容体系である。
【００３９】 ＩＬ−１３／ＩＬ−１３受容体系は、広範囲に及ぶ発現と上皮起源の癌（腎臓
細胞癌などの重要なＣＥＡ−上皮癌と同様に、圧倒的にＣＥＡ＋）に対する情報
伝達能力により、固形腫瘍に対処するための有力候補である。ＩＬ−１３／ＩＬ
−１３受容体系は、複数の特徴をＩＬ−４／ＩＬ−４受容体系と共有している。
ＩＬ−４とＩＬ−１３リガンドは構造的に、約３０％のタンパク質配列が相同で
あり、この値はインターロイキンの中で最高である。どちらの受容体も、細胞外
領域の半分のＮ−末端に正準の保存された４つのシステイン残基を保持している
のはもちろんのこと、細胞外領域の傍膜領域にＷＳＸＷＳモチーフも保持してお
り、ヘマトポイエチンスーパーファミリーのメンバーである。ＩＬ−１３Ｒαは
、ＩＬ−４Ｒαよりも全体のサイズが小さいが、細胞外領域が多少大きく、これ
につれて細胞内領域が短くなっている。
【００４０】 その上、ＩＬ−１３とＩＬ−４は、機能的にかなり類似している。両方とも、
マクロファージによって炎症誘発性サイトカインの生成を抑制し、Ｂ細胞増殖に
対して共刺激性であり、免疫グロブリンのアイソタイプ転換を誘導する。両方と
も、単球とＢ細胞の両者に対するＣＤ２３およびＭＨＣクラスＩＩのアップレギ
ュレーションを誘導する。ＩＬ−１３とＩＬ−４は、癌細胞系などの非造血細胞
を高い親和性で結合し、生物学的な効果を与える。ＩＬ−４は、未修飾のこれら
の上皮癌細胞系の成長を、生体外と生体内の両方で抑制する。未修飾のＩＬ−１
３には、乳癌細胞系に対する生体外での成長抑制効果があり、そのためこの特性
を共有している。
【００４１】 複数の細胞の種類の中で、ＩＬ−１３はＩＬ−４結合に、そしてＩＬ−４はＩ
Ｌ−１３結合に匹敵しているため、ＩＬ−４とＩＬ−１３は受容体構成成分を共
有していることが示唆される。さらに、ＩＬ−４の突然変異形であるＹ１２４Ｄ
は、リンパ細胞と非リンパ細胞型におけるＩＬ−４とＩＬ−１３の生物学的反応
を抑制することができる。非リンパ細胞型は、γcに対して主に陰性であるが、 これらすべての細胞型は、変動量のＩＬ−１３ＲαとＩＬ−４αを発現する。Ｉ
Ｌ−４αとＩＬ−１３Ｒαのどちらも単独で発現させた場合、同様の高い親和性
によって、約１０10Ｍ-1のＫaＳにて同種のリガンドを結合させる。ＩＬ−４Ｒ αの溶解形は、このリガンド結合能力を保持することがわかっている。ＩＬ−１
３Ｒαの溶解形は、生体外と生体内の両方でリガンド結合能力を保持することが
わかっている。ＩＬ−４ＲαとＩＬ−１３Ｒαを同時発現させると、両方のリガ
ンドはもちろん、ＩＬ−４−Ｙ１２４Ｄなどの拮抗リガンドによっても影響を受
ける複合体を生成することができる。
【００４２】 ヒトＩＬ−１３Ｒαは、ｍＲＮＡとタンパク質レベルの両方が低レベルまたは
中程度のレベルである場合に、さまざまな造血および上皮細胞系によって発現さ
れる。大腸癌細胞では、特殊な情報伝達イベント、すなわちＪａｋ２チロシンキ
ナーゼ活性化が、ＩＬ−４の生物学的効果とともに発生することがわかっている
。
【００４３】 ＩＬ−４−シュードモナス菌体外毒素（ＩＬ−４−ＰＥ）とＩＬ−１３−ＰＥ
融合分子が示す細胞障害活性によってさらに、広範にわたる癌細胞系がこれらの
細胞毒素に対して高い感受性を持っているため、これらの受容体系のインターナ
リゼーションが有効であることが証明される。生体外とマウス異種移植モデルで
活性である、複数の異なるＩＬ−４−ＰＥ作成物が作成され、類似性のＩＬ−１
３−ＰＥ作成物は、同様に強力な生体外活性を持つことが示された。同様に、ジ
フテリア−ＩＬ−４融合タンパク質（例えば、ＤＡＢ380ＩＬ−４）は生体外細 胞障害活性を示す。
【００４４】 ＩＬ−１３の効果は、未修飾形とＰＥ結合形の両方でＩＬ−４に匹敵する。し
かし、未修飾のＩＬ−１３は、ＩＬ−４よりも多量に投与することが可能で、Ｉ
Ｌ−１３−ＰＥは、造血細胞に対して、ＩＬ−４−ＰＥよりも低い毒性を示す。
上皮癌細胞系は、該当するＩＬ−４毒素によるのと同じくらい迅速に、ＩＬ−１
３毒素によってターゲティングして、殺すことができる。このことは、ＩＬ−１
３受容体複合体が、ＩＬ−４受容体複合体と同じくらい効率よく内在化されるこ
とを示している。ＩＬ−１３はＩＬ−４とは異なり、Ｔ細胞に対する生物学的効
果は持たない。このため生体内の診断および治療用途には、ＩＬ−１３受容体系
が、ＩＬ−４受容体系よりも好ましい。
【００４５】 好ましい実施形態において、ＩＬ−１３受容体系は、機能性抗体とともに、好
ましくは癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対する単一鎖ｍＡｂ（ｓｃＦv）とともに使 用される。ＣＥＡは、複数の理由により、魅力的な抗原性標的となる。ＣＥＡは
、通常の組織によっては非存在であるか、わずかに発現し、大腸、肺、乳房、膵
臓、胃、卵巣、延髄甲状腺起源の大多数の癌によって大きく発現する腫瘍結合抗
原である。これらの癌の高い発生率と死亡率は、最適以下の診断および治療方法
と結びついて、深刻で永続的な総合公衆衛生問題を引き起こしている。
【００４６】 ＣＥＡは約１８０ｋＤａのグリコシル化細胞表面タンパク質であり、画像診断
および治療のために、循環腫瘍マーカーと放射線標識ｍＡｂの抗原標的の両方と
して、臨床的に幅広く研究されてきた固形腫瘍抗原である。多数の抗ＣＥＡ抗体
が、フェーズＩ−ＩＩＩの臨床診断および治療試験にて研究されている。抗ＣＥ
ＡｍＡｂの例として、ＮＭ−１４ｍＡｂがある。このｍＡｂをヒト化したｈＭＮ
−１４は、定常領域と枠組領域を対応するマウスの配列と置き換えたものである
が、作成・発現され、ｍＡｂであり、これらの臨床試験で使用されている。別の
関連する抗ＣＥＡ ｍＡｂである99mＴｃ標識Ｆａｂ1フラグメント、Ｉｍｍｕ−
４は、大腸がんの発見とステージングに関してＦＤＡの承認を受けた。
【００４７】 治療形式の放射線標識抗ＣＥＡ ｍＡｂは、画像診断剤として将来性があるが
、以前はわずかな反応しかなかった。転移性大腸癌の患者のグループに対して、
抗ＣＥＡ ｍＡｂを抗ＴＡＧ−７２ｍＡｂとともに投与したときでも反応速度は
低く、両方の抗原をアップレギュレートする第２の、明確に高度に発現した腫瘍
結合抗原が、ＩＦＮ−αとともに認識された。同様に進行した大腸癌は、現在ま
でに試験を行った化学療法のすべての組み合わせに対して、完全に耐性を備えて
いる。
【００４８】 本発明では、大半の固形癌に共通でである、これらの治療障壁をＣＥＡのイン
ターナリゼーションを向上させることによって克服しようとしている。ｓｈＩＬ
−１３Ｒα−抗ＣＥＡ ｓｃＦv融合タンパク質などの抗ＣＥＡターゲティング 部分は被験者に投与され、ターゲティング部分が腫瘍部位に局在化した後に、治
療または診断部分を装備したＩＬ−１３リガンドを送達する。この系は、肺癌、
大腸癌、乳癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌を含む多数のＣＥＡ＋悪性腫瘍に対する診
断および治療手段を提供し、その多くはＣＥＡとＩＬ−１３受容体構成成分を発
現する。ＩＬ−１３受容体構成成分は、高レベルの細胞障害剤を大規模な腫瘍群
に選択的に送達するために、アーム付きリガンドの迅速なインターナリゼーショ
ンを可能にする。ＣＥＡなどの高度に発現された抗原をｓＩＬ−１３Ｒα−抗Ｃ
ＥＡ ｓｃＦv融合タンパク質によってターゲティングすることにより、通常は 少数のサイトカイン受容体が最大２桁増加する。
【００４９】 ＩＬ−１５／ＩＬ−１５受容体システムは、Ｂ細胞およびＴ細胞悪性腫瘍、正
常または活性化Ｂ細胞、活性化Ｔ細胞のターゲティングのための有力な候補であ
る。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５受容体システムは、ＩＬ−２／ＩＬ−２受容体シス
テムと共通の特徴をいくつか共有している。ＩＬ−２ＲαおよびＩＬ−４Ｒαの
両者には、生体外と生体内において同種のリガンドを結合させる溶解形がある。
ＩＬ−２／ＩＬ−２受容体システムには、三量体受容体がある。ＩＬ−１５はＩ
Ｌ−２と同様に、ＩＬ−２Ｒβとγcを使用するが、ＩＬ−２Ｒα（以前のＴａ ｃ）を使用しない。ＩＬ−１５（ＩＬ−１５Ｒα）の特殊なアルファ鎖には、Ｉ
Ｌ−２Ｒαに相同性があり、同様の構造組織を備えている。ＩＬ−１５Ｒαは構
造的にＩＬ−２Ｒαと相同性であるが、同種のリガンドに対し、Ｋaが−１０10 Ｍ-1という著しく高い親和性を持つ。
【００５０】 ＩＬ−２Ｒαは他の２つの鎖がない場合にはゆっくりと内在化するが、リガン
ドの存在によって他のサブユニットに並置される場合、リガンド／αβγ複合体
全体は、ＩＬ−２Ｒβ／γc二量体に固有の迅速な速度で内在化する（約１５分 のｔ1/2）。比較すると、ＩＬ−１５Ｒαは、同種のリガンドに対して親和性を 持つ（Ｋa ≧ １０10Ｍ-1）。この親和性は、ＩＬ−２に対するＩＬ−２Ｒα の親和性よりも少なくとも２桁以上大きい。
【００５１】 Ｔ、Ｂ、ＮＫ、単球の個体群はＩＬ−１５に反応し、これに相応してＩＬ−２
ＲＢ／γc ＋／− ＩＬ−１５Ｒαに対して養成である。さらに、Ｂリンパ腫 ／白血病はＩＬ−２Ｒβを発現するが、γcは、すべての正常および悪性造血細 胞によって、ほぼ均一に発現される。ＩＬ−２およびＩＬ−１５の最小機能受容
体構造には、ＩＬ−２Ｒβおよびγcの同時発現が必要である。したがって、正 常な白血球個体群はどちらも、病原性であっても、免疫／炎症状態でターゲティ
ングされていても、Ｂ細胞とＴ細胞の悪性対応物と同様に本発明に従ってターゲ
ティングできる。多くの点で似ているものの、ＩＬ−１５受容体系は、ＩＬ−２
受容体システムより優れた少なくとも１つの利点を備えており、臨床的に明白な
血管透過性を引き起こす能力が多少低い。
【００５２】 好ましい実施形態では、ＩＬ−２またはＩＬ−１５受容体システムは、ＨＬＡ
−ＤＲに対する機能性単一鎖ｍＡｂ（ｓｃＦv）とともに使用される。ＨＬＡ− ＤＲは、有利な抗原標的である。これは、一連の造血性悪性腫瘍（特にＢリンパ
腫およびＢ白血病）はもちろんのこと、Ｂ細胞、単球、樹状および活性化Ｔ細胞
などの特定の正常な免疫細胞によって発現される。ＣＥＡと同様に、１０6部位 ／細胞に到達可能なレベルで発現され、低い速度で内在化される。
【００５３】 多能性骨髄幹細胞などの多くの重要な正常細胞個体群によるＨＬＡ−ＤＲ抗原
がないため、その臨床的有用性が増している。この未分化型の肝細胞個体群は、
癌化学療法や骨髄移植などの骨髄障害状態で見られる、分化型の正常細胞個体群
の枯渇を補充することができる。さらに、免疫性疾患のある重篤な症例では、こ
れらの細胞個体群を除去するか、著しく減弱させる必要がある。
【００５４】 Ｂ細胞悪性腫瘍の治療に、ＣＤ１９−２２とＣＤ３７を含む、ＨＬＡ−ＤＲを
標的としたｍＡｂ（Ｌｙｍ−１ ｍＡｂを使用）を、他のＢ細胞特異性ｍＡｂと
同様に用いた臨床経験が多数ある。これらの研究では、放射線標識ｍＡｂまたは
毒素に結合されたｍＡｂが、悪性Ｂ細胞に対して治療的に用いられた。免疫毒素
は、無関係のドナーの骨髄移植における病原性Ｔ細胞の除去にも用いられている
。
【００５５】 本発明の、ＩＬ−１５受容体および単一鎖ｍＡｂ（ｓｃＦv）によるＨＬＡ− ＤＲに対する有効で選択的な細胞毒性は、Ｂ細胞リンパ腫および白血病を含む、
広範囲にわたる癌はもちろんのこと、自己免疫性糖尿状態、炎症性腸疾患、全身
性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎および重篤な乾癬を含む自己免疫性およ
び炎症性疾病を含む多くの免疫性疾病、臓器移植拒絶反応および骨髄移植におけ
る移植片対宿主疾病などの同種移植片反応にも、臨床上の著しい利益をもたらす
。高度に発現されたＨＬＡ−ＤＲ抗原の活性化Ｔ細胞個体群に対する、ｓＩＬ−
１５Ｒα−抗ＨＬＡ−ＤＲ ｓｃＦvターゲティング部分を用いた特異性ターゲ ティングによって、反応性Ｔ細胞個体群の除去がさらに特異的に、効率よく行わ
れる。
【００５６】 本発明に従って、抗ＨＬＡ−ＤＲターゲティング部分、例えば、ｓＩＬ−１５
Ｒα−Ｌｙｍ−２ ｓｃＦvなどのｓｈＩＬ−１５Ｒα−抗ＨＬＡ−ＤＲ ｓｃ Ｆv融合タンパク質が、被験者に投与される。ターゲティング部分が治療部位に 局在化された後に、治療または診断部分を装備したＩＬ−１５リガンドが送達さ
れる。ＩＬ−１５受容体は、ＨＬＡ−ＤＲのインターナリゼーションを促進し、
高レベルの細胞障害剤を選択的に送達することが予測されている。ここで再度、
ｓｃＦvなどのＭＡｂフラグメントを用いると、血液および器官が迅速に浄化さ れるという利点がさらにもたらされる。成分を注意深く選択すれば、最小限の免
疫原性を持つ送達系が得られる。アーム付きリガンド、Ｒ−α部分、ｍＡｂ ｓ
ｃＦvは、特定の疾病の特徴に合うように作り変えることができる。
【００５７】 本発明は、アビジンまたはストレプトアビジン、ビオチンを利用し、これらの
系に関連するある問題を除去する従来のプリターゲティング系によって実現可能
な、さらに高い腫瘍／非腫瘍比を備えるように設計されている。アビジン−ビオ
チン系は、非常に高い親和性を備えているが、臨床経験は、患者の約２０−３０
％が、アビジンに対する抗体反応を持ち、最大７０％がストレプトアビジンに対
する抗体を生成することを示している。本発明は、アビジンとビオチンの免疫原
性を回避している。ＭＮ−１４の抗原結合部位に対して反応性であるため、ＭＮ
−１４のヒト化バージョンすべてにも反応性である、抗イディオタイプｍＡｂ、
ＷＩ２を用いて、３段階の手法を実施できる。ＷＩ２ ｍＡｂは、ガラクトシレ
ートされており、それによって肝アシアロ糖タンパク質受容体による未標識ＭＮ
−１４ベース試薬を迅速に血液中からクリアランスできる。これらのプレターゲ
ティング手法は、アーム付き診断剤または治療剤への正常な組織の露出を最小限
に抑え、アーム付き薬剤の腫瘍／通正常組織の割合を最大限にするために、第２
または第３段階のアーム付き試薬を投与する前に、第１段階の未標識プレターゲ
ティング試薬を血液および臓器から最大限にクリアランスしようとするものであ
る。
【００５８】 要約すれば、本発明の手法は、いくつかの理由で、現在の手法に対して潜在的
に有利な代わりの手法を提供する。最初に、代わりの手法は、免疫原性を減じた
薬剤を使用する。ＭＡｂフラグメントは、特に、ヒト化されたｈＭＮ−１４ｍＡ
ｂでは、固有に低い免疫原性を備えている。受容体とリガンド成分は未変性で、
非免疫原性である。第２に、本発明は、アーム付きリガンドを腫瘍部位や病原性
細胞個体群にさらに高い特異性で送達するプレターゲティング戦略を使用する。
第３に、本発明は、アーム付きリガンドの細胞間濃度をさらに高めたり、診断ま
たは治療効果を向上させるために、リガンドを最大限にインターナリゼーション
させる。第４に、本発明によって、薬剤、毒素、放射線核種、アンチセンスおよ
び抗原試薬を含む、様々な薬剤を用いた組み合わせまたは配列による治療手法が
可能になる。これを実現するために、同一リガンドの異なるアーム付き形が用い
られる。最後に、本発明は、毒性の性質が好ましいと考えられ、広範囲の疾病に
適用可能なサイトカインを使用する。
【００５９】 以下の例は本発明の例示のためであり、限定として解釈されないものとする。
【００６０】 ［例１． 二官能性の可溶性ＩＬ−１３Ｒα−ＭＮ−１４ｓｃＦv融合タンパク 質の組み立て］ ＭＮ−１４ｓｃＦvは、人体で作られたものと同じ性質にしたＭＮ−１４トラ ンスフェクトーマによるｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応の増幅によって作り出
された。ＭＮ−１４ｓｃＦvに使われたリンカーは、１５−アミノ酸リンカー（ ＧＧＳＧＳ）3であり、その定位はＶL−リンカー−ＶHであった。ＤＮＡの配列 を確認した後に、単鎖構造物を他のｓｃＦvに使用される適切に制限された含有 発現プラスミドの中にサブクローンした。次いで、この構造物を、発現のために
ＢＬ２１（λＤＥ３）大腸菌の中にサブクローンした。
【００６１】 そのタンパク質を可溶性にして、封入体から正常の状態に戻し、そして連続的
陰イオン交換およびゲルろ過クロマトグラフィーによって精製した。官能性を評
価した後に、ｓｃＦv断片をＰＥ４０とコード化されたＤＮＡ断片に結合した。 この免疫毒素は、ＣＥＡ＋の細胞系に特異な細胞毒性を持っていることが証明さ
れた。
【００６２】 もう一つの単鎖構成物も作った。これは、重鎖および軽鎖の反対側の５’−３
’定位で作られ、ｐＣＡＮＴＡＢＥＳＥ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ
社、ニュージャージー州ピスカタウェー）内で組み立てられ、そしてバクテリオ
ファージに発現された。このｓｃＦvを発現する組換え型バクテリオファージの 特異な結合は ＥＬＩＳＡによって実証された。
【００６３】 そのＶL−リンカー−ＶH配列は、下に図表で示したように、 ＩＬ−１３Ｒα
−ＭＮ−１４融合タンパク質の組み立てのために使われる。２３−アミノ酸リン
カーは、ＫｕｒｕｃｚらによってｓｈＩＬ−１３ＲαとｓｃＦvの間に使われて いる（１９９５）。代わりに、上記のＭＮ−１４ｓｃＦvの組み立てに使われた （ＧＧＳＧＳ）3リンカーを使用する。この融合タンパク質の構造は次の通りで ある。
【００６４】 ｓｈＩＬ−ｓｌ３Ｒα−リンカー−− ＶL−（ＧＧＳＧＳ）3−−ＶH
【００６５】 ＩＬ−１３Ｒαの可溶性の細胞外領域をコード化するＤＮＡ断片は、陽性細胞
系、一般に Ｃａｋｉ−１、 ＨｕＴ １０２Ｂ２および Ａ５４９からポリメ
ラーゼ連鎖反応の増幅によって得られる。ＲＴ−ＰＣＲのためのポリメラーゼ連
鎖反応のプライマー対が合成され、クローン化のためのプライマー対を含んでい
る。そのプライマー対は、受容体の殆ど全ての細胞外領域に及ぶ。
【００６６】 プライマーは、ｐＳｉｎｒｅｐ ５という発現保菌生物の中に方向性のあるク
ローン化ができるように、独特な限定酵素サイトを含んでいる。この保菌生物は
、高水準のシンドビスウイルスに基づく哺乳動物の発現システムの一部である（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，カリフォルニア州サンディエゴ）。組み換えプラスミ
ドは、野生型単一配列を含むだろう。それ故に、それを細胞培養培地の中に分泌
することができる。その配位子結合部位は、ｓｃＦv領域からかなり離れている 、分子のＮ末端の半分にあると予測されており、従って上記の構造が選ばれた。
バイスペシフィックの単一鎖タンパク質、すなわち２つのｓｃＦvの融合につい て記述されているように、個々の領域の妨害されていない折り畳みができるよう
に、２３−アミノ酸リンカーが含まれている。
【００６７】 ＩＬ−４Ｒのようなパートナーのタンパク質とＩＬ−１３Ｒの相互作用にとっ
て潜在的に重要な配列を保持するためには、ＷＳＸＷＳ領域および全ての保存さ
れたシステイン残留分を、細胞外領域のほぼ全部と一緒に保持することが好まし
い。これは、膜組織中の関連したタンパク質との相互作用の可能性を最大にし、
それによりＩＬ−１３／ＩＬ−１３の受容体複合体の結合および内在化を促進す
る。
【００６８】 ［例２． 二官能性の可溶性ＩＬ−１３Ｒα−ＭＮ−１４ｓｃＦv融合タンパク 質の発現および精製］ 組み換え型ｐＳｉｎＲｅｐ５プラスミドを含む細菌性のクローンをふるい分け
し、そして正しい配列を持つクローンを発現に使用する。組み換え型ウイルス粒
子を作って、より高い発現と多発性形質導入のために安定で再使用可能な蓄えを
提供する。これは、組み換え型プラスミドから試験管内で転写されたＲＮＡに再
現が不充分なヘルパーウイルスのＤＮＡ鋳型を加えたものの共移入によって達成
される（製造者の説明書による）。代わりに、ＭＮ−１４ｓｃＦvの生産のため に使われるシステムに似ている、大腸菌に基づく発現システムが使われる。
【００６９】 組み換え型シンドビスウイルス粒子を使うと、ＲＮＡの転写は、組み換え型プ
ラスミド（初期のｐＳｉｎＲｅｐ５プラスミドから調整された）および標準のキ
ットに含まれているヘルパーウイスルプラスミドにより行われる（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ社、 カリフォルニア州サンディエゴ）。ＲＮＡの収率は、アガロース
ゲル電気泳動法によって評価される。それから、そのＲＮＡはＢＨＫ細胞系を共
移入するのに使われる。それは、カチオンリポソーム及び／又は電気穿孔法を使
って行われる。培養の３日の後に、移入による上澄液を集めて、新鮮なＢＨＫ細
胞を形質導入するために使用して、ビールス力価をおよび組み換え型タンパク質
の発現レベルを評価する。全ての形質導入の場合、まずＦＣＳを含む媒体中で細
胞に細菌を塗布する。おおよそ２Ｏ時間後に、媒体を漿液のない媒体に変更する
。３日後に、組み換え型と非組み換え対照からの上澄液を集め、そして総タンパ
ク質の測定のために遠心限外ろ過によって分割サンプルを濃縮する（Ｃｏｏｍａ
ｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ（登録商標）、Ｐｉｅｒｃｅ社、イリノイ州ロックフォード
）。
【００７０】 濃縮した上澄液の分割サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分別する。その
ゲルを、ウェスタンブロッティング用のＰＶＤＦ上にＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色お
よび電気ブロッテイングするために分ける。化学発光によってｈＭＮ−１４の配
列と発達を検出するために、ヤギの反人間的ＩｇＧ−ペルオキシダーゼでｓＩＬ
−１３Ｒα−ＭＮ−１４ｓｃＦvの発現を検出する。写真フィルムに暴露した後 、そのブロットを検査して、おおよそ７０ ｋＤａの明確に染色されたバンドを
さがす。
【００７１】 いったん発現が確認されると、形質導入を拡大する。大規模な発現の流れのた
めに、精製計画には、陰イオン交換、ゲルろ過、および／または最終的な回収と
純度の測定を備えた他のＨＰＬＣ法が含まれる。初期の遺伝子構造物では、Ｃ末
端のヘキサヒスチジンまたは関連した不活性の親和性タグ配列が精製を促進する
ために、加えられるだろう。
【００７２】 ［例３． 可溶性ＩＬ−１３Ｒα−ＭＮ−１４ｓｃＦv融合タンパク質の抗原お よび配位子の結合活性についての検定］ 精製したｓＩＬ−１３Ｒα−ＭＮ−１４ｓｃＦvをＩｏｄｏｇｅｎ（Ｐｉｅｒ ｃｅ社）法によっておおよそ５〜１０ μＣｉ／μｇに125Ｉ標識付けする。結 合研究にＬＳ１７４Ｔ細胞系を使用するのは、それがＣＥＡの高いレベルを発現
し、そしてＩＬ−１３の結合を抑えるのが弱いからである。
【００７３】 量が１×１０6／管の洗浄されたＬＳ１７４Ｔ細胞が１００μｌの結合緩衝液 （ＲＰＭＩ １６４０／１０％ ＦＣＳ）中に懸濁している。標識付けされたｓ
ＩＬ−１３Ｒα−ＭＮ−１４ｓｃＦvを１０ ｎＭで単独、または標識付けされ たｓＩＬ−１３Ｒα−ＭＮ−１４ｓｃＦvを１０ ｎＭで２００倍モル過剰の標 識付けされていないタンパク質と一緒したもののどちらかを加えて、管を複製す
る。抗原を結合する全体的な能力を、トレーサー濃度（５０〜２００ ｐＭ）の
標識付けされた融合タンパク質および多数のＬＳ１７４Ｔ細胞を使って評価する
。結合可能留分は、５０％を超える抗原過剰であるべきである。
【００７４】 ＩＬ−１３の結合能力を、125Ｉ−ＩＬ−１３（すでに述べたように標識付け したＩｏｄｏｇｅｎ）を使って評価する。１×１０6のＬＳ１７４Ｔ細胞を含む 管を複製するために、標識付けされていない融合タンパク質または緩衝液のいず
れかを加える。４℃で３０〜４０分経ってから、冷たいＩＬ−１３の存在下また
は不在下のいずれかで、細胞を洗浄し、125Ｉ−ＩＬ−１３を加える。特定のＩ Ｌ−１３の結合におけるかなりの正の増分は、官能性ＩＬ−１３Ｒα成分を示す
。
【００７５】 ［例４． 可溶性ＩＬ−１３Ｒα−ＭＮ−１４ｓｃＦv融合タンパク質のＣＥＡ を吸収する能力の検定］ ｓＩＬ−１３Ｒα−ＭＮ−１４ｓｃＦvを放射性ヨウ素化して、ほぼ５〜１０ （μＣｉ／μｇ）の比放射能にする。１０ ｎＭの配位子を加えてＬＳ１７４Ｔ
細胞が２．５×１０5／管の管を複製し、４℃で１時間培養する。細胞を、結合 緩衝液で２回洗浄し、２４のウエルプレート中で細菌を塗布する。いくつかの管
には、２００倍モル過剰の冷たい配位子を加えて特定の結合を評価する。他の管
には、１ｎＭの標識付けしていないｒｈＩＬ−１３を加えて、内在化および加工
に対する影響を評価する。
【００７６】 分離する標識対吸収され、異化されそして放出される標識を区別するために、
多くの時点で上澄液を除いて、１０％ＴＣＡに入れてその標識をそのまま析出さ
せる。プレートを緩衝液で３回洗浄する。細胞を数えるために、０．４ｍｌの２
Ｎ ＮａＯＨで可溶性にする。
【００７７】 ［例５． 放射性標識したＩＬ−１３の生体内分布］ ＩＬ−１３の生体内分布を、ＣＥＡ＋の腫瘍を持っているヌードマウスで、Ｌ
Ｓ１７４ＴまたはＨＴ−２９モデル系を使って研究する。５週齢の雌のヌードマ
ウスに、ＬＳ１７４７ＴまたはＨＹ−２９細胞系からの５×１０6細胞を注入す ると、皮下腫瘍の発生という結果になる。類似のＫDＳおよびＭＷｓを有する131 Ｉ−標識したＭＮ−１４Ｆａｂ1またはＭＮ−１４ｓｃＦvを同時に注入されたマ
ウスにおける125Ｉ−ＩＬ−１３の生体内分布を比較する。
【００７８】 ＩＬ−４およびＭＮ−１４Ｆａｂ1で放射性ヨウ素化したＩＬ−１３を対照と して使用した２つの標識の生体内分布実験を、ＬＳ１７４ＴおよびＨＴ−２９腫
瘍異種移植モデル系の両者で実施して、これらの作用剤の腫瘍および正常器官に
よる摂取を評価した。観察された摂取値は、その作用剤の分子質量およびその腫
瘍中の相当する結合タンパク質（ＭＮ−１４Ｆａｂ1のサイトカインおよびＣＥ Ａのための同種の受容体タンパク質）の発現レベルの両方と一致していた。要約
すると、これら結腸腫瘍のＩＬ−１３摂取は、一般的には、組織１グラム当たり
の注入投与量（％ＩＤ／ｇ）の０．２〜１．０％の範囲であったが、一方ＭＮ−
１４Ｆａｂ1の相当する摂取値は、ＨＴ−２９では４．０〜７．５、そしてＬＳ １７４Ｔ腫瘍では７．０〜２０未満であった。ＩＬ−４の対照は、ＩＬ−１３と
類似の挙動を示した。これらの結果は、これらの腫瘍の両者における同種のサイ
トカイン受容体の低レベル（刈取られた腫瘍細胞に結合している放射性トレーサ
ーによって評価されるように）、ＨＴ−２９上のＣＥＡの中間レベル、およびＬ
Ｓ１７４Ｔ上のＣＥＡの高レベルと一致している。腫脹の摂取値は、サイトカイ
ンとＦａｂ1の両方とも注入の５時間後に最大であった。そのことは、その両者 の低分子質量の結果である急速な除去と一致している。全ての作用剤の腎臓によ
る摂取は高く、やはり１〜５時間でピークに達した。そのことは、そのような作
用剤についての腎臓による既知の除去メカニズムに合っている。肝臓は、他の正
常な器官の中でＩＬ−１４およびＩＬ−１４の最も高い摂取を示した。そのこと
は、これら作用剤の高い投与量で見られる既知の症状発現前肝毒性および臨床的
肝毒性と一致している。
【００７９】 Ｒａｍｏｓ Ｂ細胞腫瘍異種移植モデルを使った相等しい一組の実験を、サイ
トカインの対照としてＩＬ−２およびそれらの対照としてＬＬ２ Ｆａｂ1（Ｃ Ｄ２２ Ｂ細胞抗原を認識する）を持つ、放射性ヨウ素化したＩＬ−１５を使っ
て行った。肝臓の摂取値が、ＩＬ−１３およびＩＬ−１４と比べて、これらのサ
イトカインで低かったことを除いて、全般的な結果は、このモデル系で同じであ
った。これらの実験では、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−２、およびＩＬ−１５
サイトカイン作用剤の予期された薬動力学的および薬力学的な挙動が確認された
。その結果は、腫瘍による摂取がリンパ種の外に両方のＣＥＡ＋の癌腫における
同種のサイトカイン受容体の低い基底レベルの発現を反映していることを示して
おり、その発現を抗体−Ｒα融合タンパク質による最初の目標腫瘍によって増加
させることができる。いったんこの二官能性作用剤で目標を定めると、強化され
た同種のサイトカインを投与することにより、その抗体−Ｒα作用剤で前もって
目標に定めなくても、その抗体またはサイトカインのいずれかで起こるよりも高
い摂取という結果になることが予測される。
【００８０】 ［例６． ＩＬ−１３／オンコナーゼ免疫毒素の組み立て］ ｍＡｂ−オンコナーゼ融合タンパク質の生産のためのＲｙｂａｋによって概説
された手順に従って、ＩＬ−１３とオンコナーゼから成る融合タンパク質を、遺
伝学的に設計する。Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ １：１４１〜１４７（１
９９５）。手短に言えば、成熟しているＩＬ−１３タンパク質に相当する配列が
確認された断片が、他の定位も評価することができるが、５′に位置するＩＬ−
１３配列を持つオンコナーゼの配列に結合されている。オンコナーゼ遺伝子を、
２以上のカエルの種からクローン化する。融合配列を表す本物の断片を、Ｃ末端
のヘキサヒスチジンのタグを使ってｐＥＴ２ｌｄ保菌生物の中に再度サブクロー
ンする。全体のＩＬ−１３−オンコナーゼ融合タンパク質をコード化する完全な
配列が、前述のようなＸＬ１青色菌種のｐＥＴ保菌生物中に確認された。適切な
クローンを、ＡＤ４９４（ＤＥ３）大腸菌の発現菌種の形質転換のためのプラス
ミドを作り出すのに拡大する。
【００８１】 形質転換したクローンを、小規模培養に選び出して育て、ＩＰＴＧで誘発し、
ＳＤＳサンプル緩衝剤に溶解し、そして反ＩＬ−１３抗体および反オンコナーゼ
抗体の両方で検出用にＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色してトランスブロットするために
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの上に分離する。封入体の分離と洗浄、それら封入対の加
溶化、再生およびその後の精製を、上に概説した手段を使って行なう。最終生成
物を、ＩＬ−１３受容体を結合するその能力について、上述した細胞の結合評価
において、125Ｉで標識することによっておよびそれを等モル濃度の同様に標識 されたＩＬ−１３と比較することによって検査する。ＩＬ−１３を結合する能力
を持つ接合体を、ＩＬ−１３のための受容体を発現することが知られている細胞
系に対する細胞毒性について検査する。
【００８２】 その接合体を、ｓＩＬ−１３Ｒα−ｈＭＮ−１４ｓｃＦv融合タンパク質の存 在下および不存在下に検査して、毒性と多量の免疫毒素を結合および吸収する能
力とを測定する。各実験条件および対照条件についての投与量応答曲線が作られ
る。
【００８３】 ［例７． 結腸、肺、胸、膵臓、胃、卵巣、骨髄および甲状腺の癌腫の療法］ 結腸、肺、膵臓、胃、卵巣、胸、骨髄または燥甲状腺の癌腫を持っている患者
の静脈内に、例１および２に従って調製したｓＩＬ−１３Ｒα−ｈＭＮ−１４ｓ
ｃＦv融合タンパク質をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に含む殺菌した発熱物質 のない溶液を注入する。その融合タンパク質が悪性腫瘍細胞に結合するように、
そして患者の血行を実質的にきれいにするように時間をかける。
【００８４】 次いで、予め決められたスケジュールで、その患者の静脈内に、例６に従って
調製した、放射性同位体に関して標識したまたは薬を複合したＩＬ−１３、ある
いはＩＬ−１３／オンコナーゼ免疫毒素接合体を含む殺菌した発熱物質を含まな
い溶液を注入する。それから、その後に続く放射性物質による方法または放射免
疫検出法を使って抗腫瘍性反応を評価する。
【００８５】 本発明を特に好ましい実施形態について詳細に記述したが、そのような記述は
説明のために示されたものであり、それに限定されるものではないということを
理解すべきである。本発明の範囲内で多くの変更および修正が、その精神から外
れることなく行われてよい。そして本発明はそのような全ての修正を包含するも
のである。例えば、ｓＩＬ−１５Ｒα−Ｌｙｍ−２ ｓｃＦv融合タンパク質を 、例１から３において可溶性ＩＬ−１３Ｒα−ＭＮ−１４ｓｃＦv融合タンパク 質について記述したのと同様の方法論を使って、組み立て、発現、精製そして評
価することができる。受容体成分のための同種の配位子であるＩＬ−１５を、薬
、毒素または放射性核種で同様に強化または標識することができる。この場合、
Ｂ細胞系のＲａｍｏｓおよびＲＬを、試験管内のおよび症状発現前のマウスの腫
瘍異種移植モデルとして使うことができる。処理されるだろう最終的な臨床的な
悪性腫瘍は、Ｂ細胞およびＴ細胞のリンパ種／白血病、ホジキン病および他のＨ
ＬＡ−ＤＲ＋癌である。この手法を、免疫疾患または炎症性疾患を仲介するＨＬ
Ａ−ＤＲ＋細胞群を抑圧するためにも使うことができる。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１１年１２月１３日（１９９９．１２．１３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/30 Ｃ０７Ｋ 16/30 19/00 19/00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ゴールデンバーグ，デイヴィッド・エム アメリカ合衆国ニュージャージー州07945， メンダム，プレザント・ヴァリー・ロード 330 Ｆターム(参考） 4C076 AA11 BB11 CC27 EE41 EE59 FF34 4H045 AA11 AA30 BA10 BA41 CA40 DA51 DA76 EA22 EA28

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα、ＩＬ−１５
    Ｒαより成る群から選択される受容体サブユニットのリガンド結合領域に結合し
    た抗体の接合体から成り、該抗体が標的細胞への特異性を持つ細胞抗原に対して
    特異的である、ターゲティング部分。
  2. 【請求項２】 共有結合接合体から成り、上記抗体が受容体のリガンド結合
    領域に共有結合されている、請求項１に記載のターゲティング部分。
  3. 【請求項３】 上記抗体の融合タンパク質と受容体のリガンド結合部分から
    成る、請求項１に記載のターゲティング部分。
  4. 【請求項４】 標的細胞に特異的である細胞抗原に対する第１の特異性と、
    ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒより成る群から選択され
    る受容体サブユニットに対する第２の特異性とを持つ二重特異性抗体を有する請
    求項１に記載のターゲティング部分。
  5. 【請求項５】 抗体が固形腫瘍によって発現された抗原に対して特異性を有
    し、ＩＬ−１３Ｒαのリガンド結合領域に結合している、請求項１に記載のター
    ゲティング部分。
  6. 【請求項６】 抗体がＣＥＡに対して特異性を有し、請求項５に記載のター
    ゲティング部分。
  7. 【請求項７】 抗体がＨＬＡ−ＤＲに対して特異性を有し、ＩＬ−１５Ｒα
    のリガンド結合領域に結合されている、請求項１に記載のターゲティング部分。
  8. 【請求項８】 請求項１に記載のターゲティング部分と薬学的に許容可能な
    担体から成る組成物。
  9. 【請求項９】 薬剤、放射線核種または毒素に結合されたＩＬ−１３の接合
    体と、ＩＬ−１３Ｒαのリガンド結合領域に結合し、標的細胞に特異性を持つ細
    胞抗原に対する特異性を有する抗体を含むターゲティング部分とを含むキット。
  10. 【請求項１０】 薬剤、放射線核種または毒素に結合されたＩＬ−１５の接
    合体と、ＩＬ−１５Ｒαのリガンド結合領域に結合し、標的細胞に特異性を持つ
    細胞抗原に対する特異性を有する抗体のターゲティング部分とを含むキット。
  11. 【請求項１１】 治療を必要とする被験者に、標的細胞に特異性がある細胞
    抗原に対して特異性の抗原を含み、ＩＬ−１３Ｒαのリガンド結合領域に結合し
    ているターゲティング部分をまず投与することと、 次に、前記被験者に、治療的に有効な量の、薬剤、放射性核種または毒素に結
    合されたＩＬ−１３の接合体を投与することと を含んでなる癌治療の方法。
  12. 【請求項１２】 癌または免疫性または炎症性疾患の治療の方法であって、 治療を必要とする被験者に、標的細胞に特異性がある細胞マーカーに対して特
    異性の抗原から成り、ＩＬ−１５Ｒαのリガンド結合領域に結合されているター
    ゲティング部分をまず投与することと、 次に、前記被験者に、治療的に有効な量の、薬剤、放射性核種または毒素に結
    合されたＩＬ−１５の接合体を投与することと を含んでなる治療の方法。
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