JPH11505704A

JPH11505704A - アンチｃｄ−１９抗体の単鎖可変領域フラグメントを含む免疫コンジュゲート

Info

Publication number: JPH11505704A
Application number: JP8535008A
Authority: JP
Inventors: カーシー，ジョン・エイチ・ジュニア; ベジセック，ブルース・イー; ワン，デュオ; アックン，ファティー・エム
Original assignee: University of Minnesota
Current assignee: University of Minnesota
Priority date: 1995-05-17
Filing date: 1996-05-15
Publication date: 1999-05-25
Also published as: WO1996036360A1; CA2218898A1; EP0835134A1

Abstract

(57)【要約】ＣＤ１９に対するモノクロナール抗体の単鎖可変領域フラグメントをコードするポリヌクレオチドおよびそれを製造する方法を開示する。単鎖可変領域ポリペプチド、その製法、その修飾ポリペプチドおよびそれから誘導された二量体をも開示する。さらに、本発明のポリペプチドと細胞障害剤とから形成された免疫コンジュゲート、その製法および癌の処置での利用を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】アンチＣＤ−１９抗体の単鎖可変領域フラグメントを含む免疫コンジュゲート政府所有権の可能性ここに開示された情報を導いた研究は、承認番号ＣＡ４９７２１の下、アメリカ予防衛生研究所（ＮＩＨ）により援助された。従って、米国政府がここに開示された発明に対して一定の権利を所有し得る。発明の背景免疫コンジュゲートクラスター分化（ＣＤ）抗原により定義された細胞表面分子に対する抗体は、治療薬の開発に独特の可能性を示す。あるＣＤ抗原発現は特異的直系リンパ造血細胞に非常に限定的であり、過去数年にわたり、リンパ様−特異的ＣＤ抗原に対する抗体は、in vitroあるいは動物モデルにおいて有効な処置を開発するのに使用されてきた（Ghetie et al.,1988;Uckun et al.,1986;Myers et al.,1991;Jan sen et al.,1992）。しかしながら、サイズが大きいため、無傷の抗体および抗体−トキシンコンジュゲートは、その能力が制限される不都合をいくつか有する。それらは、血管系から移動する能力について限定的であり、免疫コンジュゲートとして異種的であり（一つの免疫グロブリン分子に対していくつかのトキシン分子の連鎖をもたらし得る）、その製造は高くつき、非常に労力を要する。参照、例えば、Ｕckunの米国特許第４,８３１,１１７およびＲodwell et al.,の米国特許第４,６７１,９５８（明細書は参考により特にここに合体される）。多くの非修飾モノクローナル抗体の限定された有効性は、細胞障害物質の担体としてのこれら薬剤の使用という別の方法をもたらした。多くの細菌および植物起源のトキシンが免疫トキシンの産生のためにモノクローナル抗体と結合されてきた（Schlom;Pastan et al.,1986）。その戦略は、トキシンが無差別に正常細胞と結合せず、殺さず、代わりにモノクローナル抗体によって同定された抗原を発現する細胞のみを殺すように、自然から毒性タンパク質を選択し、トキシンを修飾することである。免疫コンジュゲートにより細胞表面に標的されるトキシンの大部分は、細胞質において作用し、タンパク質合成を阻害する。細胞表面抗原との結合後、免疫トキシンはエンドサイトーシスにより取り込まれ、エンドソームへ移行される。いくつかのトキシン（例えば、ジフテリアトキシン）のフラグメントは、機能質の膜を通って転座される。他の免疫トキシン（例えば、リシン）は、さらにトランス−ゴルジ・ネットワークを経て、そこで少数が細胞質に転座する。都合の悪いことに、大部分がリソソームを経て、そこで減成する。細胞質において、臨床的に使用されるトキシンは、アデノシンジホスフェート（ＡＤＰ）−リボシレート延長因子２（例えば、Ｐseudomonas 外トキシン（ＰＥ））に対して作用するか、あるいは延長因子２（例えば、リシン）を結合する能力を減少させるように６０Ｓリボソームサブユニットを不活性化するために作用する。細胞質における１０以下のトキシン分子が細胞を殺すのに充分である；しかしながら、より多くの分子が内在化および転座における非効率性を補うために細胞表面に結合しなければならない。概念的に免疫トキシンは単純であるが、第１代免疫トキシンは比較的効果がなかった。いくつかの必要条件が免疫トキシンを効果的にするために満たされなければならない（Pastan et al.,1986）。特に：（ｉ）免疫コンジュゲートは、特異的であるべきであり、正常組織と反応すべきでない。抗原を発現しない組織との結合は、非特異的天然細胞結合サブユニットおよびトキシンの領域の除去により減少され得る。さらに、植物糖タンパク質トキシンは網内系の細胞と結合するマンノースオリゴ糖類を含み、いくつかの場合において、肝細胞のレセプターにより認識されるフコース残基も含むので、これらの細胞において速いクリアランスおよび潜在的な細胞トキシン作用を回避するために、植物毒素の解糖を必要とすることがある。（ii）抗体へのトキシンの連鎖は、抗原と結合する抗体の能力を低下すべきではない。（iii）免疫トキシンはエンドソーム小胞に内在化されなければならない。従って、通常内在化される表面レセプターへモノクローナル抗体により指示されたトキシンは、これらの非内在化細胞表面分子へ指示されたものより活性であり得る。（iv）トキシンの活性成分は細胞質に転座されなければならない。これらの種々の目的は矛盾することがある。従って、リシンのＢ鎖の除去は、非特異的結合を低下するだけでなく、残留Ａ−鎖モノクローナル抗体コンジュゲートのエンドソーム小胞膜を通り転座する能力をも低下する。（ｖ）in vivo治療のために、免疫トキシンが患者の組織からその細胞の作用部位へ通過する間、連鎖は無傷であるために充分に安定でなければならない。トキシンをモノクローナル抗体と結合するために使用されるヘテロ二機能性クロスリンカーの第１代は、in vivoで不安定なジスルフィド結合を形成した。この問題は、フェニルあるいはメチル基、あるいは両方を使用して、結合への接近を制限するジスルフィド結合と隣接する、より安定なクロスリンカーの合成によって、ある程度解決した。免疫トキシンの活性は、細胞をその表面に対する標的抗原で殺す能力を測定することにより、最初は査定される。トキシンは細胞内で作用するので、エンドサイトーシスにより自然に細胞に浸入するレセプターおよび他の表面タンパク質は普通、免疫トキシンに対して良い標的をつくるが、細胞表面上に固定された表面タンパク質はつくらない。しかしながら、同じ細胞表面タンパク質上の異なるエピトープを認識するいくつかの抗体が利用可能であれば、おそらく標的タンパク質の構造において立体配座を変化させることにより、いくつかは内在化を引き起こし、あるいは細胞内経路をトキシン転座に適切な部位へ指示するので、すべてを試験するのに有用である（May et al.,1991;Press et al.,1988）。また、免疫トキシンがＰＥあるいはリシンの形態を含むならば、標的表面タンパク質の内在化を引き起こすことは可能であり、そのような形態において、一部分のトキシンのレセプターとの結合は、化学的修飾により弱められるが、トキシンレセプターが効率的に内在化されるので、さらに内在化を引き起こし、促進する（Willin gham et al.,1987;Lambert et al.,1991;Colombatti et al.,1986）。いくつかの免疫トキシンがヒト試験のために開発され、承認されてきた。２つの異なる試験が行われた。第１の試験は、自己骨髄移植を受ける患者に再注入する前に汚染腫瘍細胞を除去するために、取得骨髄に免疫トキシンをex vivo添加することに関している。アンチＣＤ５およびアンチＣＤ７を含むリシンあるいはリシンＡ鎖と連結した種々の抗体が、この目的のために使用されてきた（Uckun et al.,1990b）。第２の試験は、局所的（例えば、腹膜腔）あるいは全身的に癌患者に免疫トキシンを非経口投与することに関している。これらは本来、従来の治療がうまくいかず、腫瘍負荷の大きい患者における第１相および第２相試験であった。これまで、癌腫あるいは他の固形腫瘍の治療のための免疫トキシンの製造に使用される抗体は、重要な正常ヒト組織（例えば、神経組織および骨髄）と反応し、顕著な臨床応答なしに用量限定毒性を生じることがわかっている（Wein er et al.,1989;Gould et al.,1989;Byers et al.,1989;Pai,in press）。細胞分化抗原ヒトＢＣＰｓの機能的Ｂリンパ球への成熟分裂は発展的に計画された多数段階の方法を表し、この方法は体細胞免疫グロブリン遺伝子再配列のカスケード（Ko rsmeyer et al.,1981）およびＢ−直系分化抗原の同等の取得と損失を伴う（Nad ler）。これらの抗原の特徴付けと分類は、第１回(フランス、パリ、１９８２) 、第２回（マサチューセッツ州、ボストン、１９８４）、第３回（イギリス、オックスフォード、１９８６）、および第４回(オーストリア、ウィーン、１９８９)ヒト白血球分化抗原に関する国際ワークショップにおいて標準化され、および世界保健機構（ＷＨＯ）認定ＣＤ（分化のクラスター）命名法がそれらの同定に導入されてきた（Nadler;Knapp et al.,1989a;Clark et al.,1989）。現在まで、２０以上の生化学的に異なる分化抗原が、表面免疫グロブリン（ｓＩｇ）、主要な組織適合（ＭＨＣ）抗原あるいは定義されたサイトカインに関するレセプタータンパク質を含まないＢ−直系細胞について同定された。Ｂ−直系分化抗原の多くはＢ−直系細胞の開発における機能的に重要な表面レセプターを表し、それらの発現は異なる外的シグナルにより調整されている（Knapp et al. ,1989a;Clark et al.,1989;Zola,1987）。細胞膜関連酵素を示すものがある一方（ＣＤ１０、ＣＤ４５、ＣＤ７３など）、骨髄ミクロ環境におけるＢ−細胞の発育における細胞対細胞の相互作用に重要な役割を演じ得る生理的に重要な細胞表面制限リガンドを表しそうなものもある（ＣＤ１９、ＣＤ２２、Ｂ７など）。後者の可能性は、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ１８／ＬＦＡ−１を含む多くのＴ−直系分化抗原が細胞表面制限リガンド（ＬＦＡ−３についてのＣＤ２、クラスII ＭＧＣについてのＣＤ４、クラスＩＭＨＣについてのＣＤ８、Ｉ−ＣＡＭ−１／ｇｐ８０についてのＣＤ１８／ＬＦＡ−１）として機能することを示す証拠がすでに公表されている。このような表面レセプター間の異好性認識は、リンパ造血組織におけるＢ−直系細胞およびＴ−細胞あるいは副細胞集団間の同種表面相互作用にとって重要であり得る。他のＢ−直系抗原（ＣＤ２３およびＣＤ４０など）は、未定義の溶性サイトカイン代わりに表面レセプターとして機能するであろう（Clark et al.,1989）。ＣＤ１９、ＣＤ２２およびＢ７抗原はＩｇ超遺伝子ファミリーのメンバーである（Knapp et al.,1989b;Stamenkovic,1988;Stamenkovic,1990;Freeman et al., 1989）。ＣＤ２１は、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）のレセプターと同様、Ｃ３ｄレセプターとして同定されてきた（Knapp et al.,1989b）。ＣＤ１９の細胞質領域はｉｎｔ−１癌遺伝子およびＥＢＶによりコードされるタンパク質に対して相同性を示す。ＣＤ１９は成熟Ｂ−細胞におけるｓＩｇ−媒介シグナルの形質導入に関して重要な架橋分子として提案されてきた（Pesando et a l.,1989;Carter et al.,1990）。シグナル形質導入サブユニットとしてのＣＤ１９およびＢ細胞を補体系と連結させるリガンド−結合サブユニットとしてのＣＤ２１は、ｓＩｇ−依存活性化に関係することもあるＢ細胞の表面上に複合体を形成することが報告されている。しかしながら、ＣＤ１９連結反応がホスホイノシチド転換（Uckun et al.,1989）およびｓＩｇ−ＣＤ２１−ＢＣＰ集団におけるカルシウム連動を刺激し、その増殖活性を調節するので、ＣＤ１９分子の機能はｓＩｇあるいはＣＤ２１の存在に依存していない（Uckun et al.,1988;Ledbette r et al.,1988）。ＣＤ２２はミエリン関連性糖タンパク質（ＭＡＧ）に対して高い相同性を示し、神経細胞表面接着分子がＢ細胞と単球間の細胞対細胞の相互作用を媒介する（Stamenkovic,1990）。さらに、ＣＤ２２はまた、ｓＩｇ媒介シグナルの形質導入においても重要である（Pezzutto et al.,1988）。最近、Ｂ７抗原の天然のリガンドは、Ｉｇスーパーファミリーの別のメンバーであるＣＤ２８Ｔ−細胞活性化抗原として同定されてきた。活性化Ｂ細胞およびＴ細胞間のＣＤ２８−Ｂ７媒介接着は、抗原−特異的Ｂ−細胞応答のＴ−細胞調節にとって重要であり得る。モノクローナル抗体およびフラグメントモノクローナル抗体は、癌の診断および治療と、自己免疫および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の処置のためおよび同種移植の拒絶反応の防止のために免疫抑制を産生する免疫応答の調節とに臨床的に広く適用されてきた。ヒトモノクローナル抗体はまた、サイトメガロウイルス、Ｖaricella zoster ウイルスおよびＰs eudomonas aeruginosa、Ｅscherichia coli およびＫlebsiella pneumoniae の種々の特異的血清型に対して臨床的に適用されてきた。また抗体あるいはそのフラグメントは、より迅速なクリアランスを有するように遺伝子学的に設計され得る。これはモノクローナル抗体が放射性免疫走査で使用される放射性核種にコンジュゲートされるとき、望ましい。例えば、抗原−結合フラグメント（Ｆａｂ）、Ｆ（ａｂ’）₂あるいはモノクローナル抗体の単鎖Ｆｖフラグメントは、５時間以下の生存半減期を有する。速い転換はまた、神経外胚葉起源のヒト腫瘍に発現するジスアロガングリオシドＧＤ２と反応する抗体 1990）。抗体および免疫コンジュゲートのアンチ腫瘍細胞障害の有効性を改善する試みにおいて、いくつかの研究所が単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントとして細菌における抗体の軽および重鎖可変領域の発現についての戦略を開発してきた（Past an et al.,1991;Huston et al.,1988）。一般的に、これらの分子は、不溶性であり、結合活性が検知され得る前に変性および再生される必要がある。この方法における抗体結合領域の産生における一つの問題は、高い親和性抗体結合がすべての場合においてうまく再形成され得ないことである。標的と結合し得るｓｃＦｖをつくる抗体の能力を支配するパラメーターは知られてなく、従って、候補抗体遺伝子セグメントの直接的なクローン化および分析を必要としている。ＣＤ１９抗原は、血漿細胞ではなく、成熟Ｂ細胞において発見されるが、多くのリンパ腫およびＢ直系白血病はこの分化マーカーを発現するので、免疫コンジュゲートの開発において非常に有用な標的であることが分かってきた（Uckun et a l.,1990a）。アンチＣＤ１９免疫コンジュゲートは、抗体とリシンのＡ鎖（Ghet ie et al.,1988）あるいはアメリカヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質（Uckun et al.,1986;Myers et al.,1991）のような修飾された触媒性トキシンとの化学的共役に依存している。本発明の開発に先行して、好結果をもたらすＣＤ１９抗原に対するｓｃＦｖの開発について報告はなされていない。 in vitroで効率的に細胞の特異的サブセットを殺す免疫トキシンの能力は、骨髄細胞の懸濁中の特別な細胞型の欠失において適用されるようになった（Thorpe et al.,1982;Seon,1984;Vallera et al.,1982;Filipovich et al.,1984;Valler a et al.,1983;Muirhead et al.,1983;Krolick et al.,1982）。最終目的は、癌および造血組織疾患の治療方法としてヒトにおける骨髄移植を容易にすることである。自己骨髄移植は、Ｘ線照射およびあるいは化学療法に対して非常に感受性の高いあるタイプの癌の治療において補助手段として使用される（Thomas,1982; Raso,1982）。その方法は、緩解状態にある患者から骨髄を取得して（好ましくは第一緩解において）、それを凍結しておくことである。後に再発した場合、患者は腫瘍を根絶するためにＸ線照射および／または化学療法による“超致死”療法を受ける。そして、患者は自己の骨髄の注入により死から免れる。もちろん、癌細胞−反応性免疫トキシンによるこのような癌細胞の骨髄を浄化することは非常に望ましい。このような免疫トキシンの唯一の必要条件は、患者の造血組織を再構成するために必要な幹細胞を損傷しないことである。免疫コンジュゲートは患者の骨髄移植片から腫瘍細胞をex vivo浄化するために使用されることもある。これらの自己移植片は、攻撃的な超致死的化学療法および照射の後、白血病患者に再導入される。すべての戦略の目的は、再注入の後、患者の骨髄を再定着せしめる多能性造血幹細胞が無傷のまま、腫瘍細胞を激減させることである。無傷の免疫コンジュゲートは、移植片に障害を与えることなく、および中毒を引き起こすことなく抗原−陽性標的を選択的に除去する。自己骨髄は、in vivoあるいはex vivoのいずれかで免疫コンジュゲートを使用することによって造血幹細胞を破壊することなく残留白血病細胞を浄化し得る。免疫コンジュゲートによるex vivo治療は、致死的に照射された受容体を再構成する骨髄の能力を損なうことなく、ヒト骨髄に存在するほとんどのＴあるいはＢ細胞を除去することが示されてきた。“最後の”白血病細胞を殺す免疫コンジュゲートの能力がまだ問題である一方、放射ラベル免疫コンジュゲートのさらに大きい効率は、治療の好結果の可能性を大いに増加するだろう。放射ラベル免疫コンジュゲート免疫トキシンは特に、過剰ヒト骨髄の存在下でさえ、クローン産生性白血病Ｔ細胞の９９.９９％以上を除去し得ることが報告されている。放射ラベル免疫トキシンの使用は、場合によっては５ｌｏｇあるいは９９.９９９％以上の割合で、より多くの白血病Ｔ細胞を除去し、放射ラベル免疫トキシンが自己ＢＭＴにおける白血病細胞のex vivo除去のために非常に有用であることを示している。放射ラベルモノクローナル抗体は、細胞を標的する細胞毒性作動因子の放出のため、および放射イメージングのために代替免疫コンジュゲートとして開発されてきた（Schlom;Kozak et al.,1985）。これらの種は免疫トキシンに観察される欠点を補う能力を有する。トキシンコンジュゲートは容易にエンドソームから細胞質基質へと移動しない。さらにトキシンは、免疫原であり、トキシンに対する抗体の開発の前には短い治療法しか提供しない。放射ラベルモノクローナル抗体の使用による放射免疫検出法は、最も多くは癌胎児性抗原に対するモノクローナル抗体によるが、腫瘍の他の検知方法を補足するために広く使用される。無傷のＩｇＧ抗体が腫瘍によりよく保持されており、治療により適しているようであるが、Ｆ（ａｂ'）₂およびＦａｂフラグメントは、ターゲッティングおよび血液クレアランスの両方とも最も速く、バックグラウンドを低下するので、イメージングにとって好ましい。０.５ｃｍほどの腫瘍は、他の放射方法では時々見逃されることがあるが、適切な放射性核種でラベルされた抗体あるいは抗体フラグメントでイメージされ得る。治療に関する放射ラベルモノクローナル抗体コンジュゲートの使用における一つの有利な点は、適切な放射性核種の選択により放射ラベルモノクローナル抗体が数細胞直径の距離から細胞を殺すことができ、従って抗原−発現細胞に隣接する抗原−陰性細胞を殺し得ることである。さらに、放射ラベル抗体は腫瘍細胞を殺すために内在化される必要がない。このような技術はＢuschbaum et al.,の米国特許第４,８３１,１２２の明細書に例示されており、ここに参考により合体される。放射ラベルモノクローナル抗体において、放射性核種は、抗体と直接的に、あるいは二機能性キレートによって固く連結しなければならない。有効なモノクローナル抗体−キレート複合体は、判定基準に適合し、さらにその判定基準はすべてのモノクローナル抗体に対して正確でなければならない：（ｉ）モノクローナル抗体と結合したキレート剤が抗体特異性を損なわず；（ii）キレート化および放射ラベル方法がモノクローナル抗体の分布および異化作用を変えず;および(ii i)二機能性キレートがin vivo放射ラベル金属の溶出および早期放出せしめない。この最後の必要条件を満たし得ないと、受容不可能な毒性となり、効果は減少する。多くの適切な∞−、β−、ｙ−放出放射性核種がある。同位体放出β粒子は、ｙ−放出放射性核種より優位であるが、比較的遠距離で放出される低い線エネルギー付与が遠い正常組織に対する毒性に結び付く標的細胞を非効率的に局部的に殺すことになるので、最適ではない。しかしながら、¹³¹Ｉ、⁹⁰Ｙ、¹⁸⁸Ｒｅおよび⁶⁷Ｃｕなどのβ−放出放射性核種は、免疫療法において有用である。例えば、肝癌患者はフェリチンに対する¹³¹ Ｉ−ラベル抗体により好結果の治療を受けた（Orden,1985）。さらに自己骨髄移植と組み合わせたフェリチンに対する⁹⁰Ｙ−ラベル抗体は、８人のうち４人のホジキン病患者に完全な緩解をもたらした（Order,1985）。⁹⁰Ｙ−ラベルアンチＴａｃは、類人霊長類モデルにおける心臓同種移植および異種移植の生存を延ばすことに効果的であった（Kozak et al.,1989）。後の試験において、⁹⁰Ｙ−ラベルアンチＴａｃは、ＨＴＬＶ−Ｉ関連、Ｔａｃ−発現ＡＴＬによる患者の治療について調べられた。使用量（患者一人につき５および１０ｍｉＣｉ）で６人のうち５人の試験患者に毒性が観察されなかった。わずかな顆粒球減少および血小板減少が一人の患者に観察された。これら６人のうち５人の患者が⁹⁰Ｙ−ラベルアンチＴａｃ治療の後、部分的あるいは完全な緩解を維持した。標的ＣＤ１９抗原、９５ｋＤａＢ直系制限リン糖タンパク質は、生命維持非造血組織、正常造血幹細胞あるいは最も未成熟な正常Ｂ−直系リンパ様幹細胞で発現せず、実質的に１００％Ｂ直系ＡＬＬｓによって発現する。本発明の要約本発明の第一点は、ＣＤ１９抗原に結合する単鎖可変領域ポリペプチドをコードする単離・精製されたポリヌクレオチドを提供することである。好ましくは、本発明の単離・精製されたポリヌクレオチドは、約２８ｋＤａの分子量を有するポリペプチドをコードする。より好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１ｘ１０⁹Ｍ^-1のＫａを有するＣＤ１９抗原に結合するポリペプチドをコードする。また、本発明は、ＣＤ１９抗原に結合する単鎖可変領域ポリペプチドをコードする単離・精製されたポリヌクレオチドを製造する方法を提供し、その方法は、（ａ）ＣＤ１９抗原に対するモノクローナル抗体をつくるハイブリドーマからＲＮＡを単離し、（ｂ）単離ＲＮＡをｃＤＮＡに転写し、（ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応によりモノクローナル抗体の重および軽可変領域をコードする単離ｃＤＮＡ配列を増幅し、（ｄ）重および軽可変領域をコードする単離・増幅産物をそれぞれベクター構築物にクローニングし、（ｅ）重および軽可変領域をコードするＤＮＡ（単離配列はリンカーヌクレオチド配列を通して連結している）をベクター構築物にクローニングし、（ｆ）クローンを適当な制限エンドヌクレアーゼで消化する、工程を含む。好ましくは、本発明の方法は、配列番号７に記載されたポリヌクレオチド配列であるリンカー配列を用いる。本発明はまた、（ａ）ＣＤ１９抗原に対するモノクローナル抗体をつくるハイブリドーマからＲＮＡを単離し、（ｂ）単離ＲＮＡをｃＤＮＡに転写し、（ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応によりモノクローナル抗体の重および軽可変領域をコードする単離ｃＤＮＡ配列を増幅し、（ｄ）重および軽可変領域をコードする単離・増幅産物をそれぞれベクター構築物にクローニングし、（ｅ）重および軽可変領域をコードするＤＮＡ（単離配列はリンカーヌクレオチド配列を通して連結している）をベクター構築物にクローニングし、（ｆ）クローンを適当な制限エンドヌクレアーゼで消化する、工程を含有する方法により製造され得る単離・精製されたポリヌクレオチドをも含む。更に、本発明は、（ａ）ＣＤ１９抗原に対するモノクローナル抗体をつくるハイブリドーマからＲＮＡを単離し、（ｂ）単離ＲＮＡをｃＤＮＡに転写し、（ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応によりモノクローナル抗体の重および軽可変領域をコードする単離ｃＤＮＡ配列を増幅し、（ｄ）重および軽可変領域をコードする単離・増幅産物をそれぞれベクター構築物にクローニングし、（ｅ）重および軽可変領域をコードするｃＤＮＡ（単離配列はリンカーヌクレオチド配列を通して連結している）を別々にベクター構築物にクローニングし、（ｆ）クローンを適当な制限エンドヌクレアーゼで消化する、工程を含有する方法により製造された単離・精製ポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、本発明の方法は、配列番号７に記載されたポリヌクレオチド配列であるリンカー配列を用いる。好ましくは、本発明の単離・精製されたポリヌクレオチドは、配列番号２０、２１または２２のアミノ酸残基配列を含むポリペプチドをコードする。より好ましくは、本発明の単離・精製されたポリヌクレオチドは配列番号２３、２４または２５のヌクレオチドを含む。他の実施態様において、本発明は、配列番号２３、２４または２５の少なくとも１０隣接ヌクレオチド塩基のセグメントに等しい、または相補的であるヌクレオチド塩基配列を含む単離・精製されたポリヌクレオチドを提供する。該ポリヌクレオチドはＣＤ１９抗原に結合する単鎖可変領域ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをハイブリダイズする。好ましくは、本発明のこの実施態様のポリヌクレオチドは、約２８ｋＤａの分子量を有するポリペプチドをコードする。より好ましくは、コードされたポリペプチドは、少なくとも１ｘ１０⁹Ｍ^-1のＫａを有するＣＤ１９抗原に結合する。他の特徴において、本発明の実施態様は、配列番号２３、２４または２５の２５または５０または１００隣接ヌクレオチド塩基のセグメントに等しい、または相補的であるヌクレオチド塩基配列を含む単離・精製されたポリヌクレオチドを提供する。該ポリヌクレオチドはＣＤ１９抗原に結合する単鎖可変領域ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをハイブリダイズする。更に他の実施態様において、本発明は、ＣＤ１９抗原に結合する単離・精製された単鎖可変領域ポリペプチドを含む。好ましくは、この実施態様のポリペプチドは約２８ｋＤａの分子量を有する。さらに好ましくは、ポリペプチドは少なくとも１ｘ１０⁹Ｍ^-1のＫａを有するＣＤ１９抗原に結合する。さらになお好ましくは、ポリペプチドは配列番号２０、２１または２２のアミノ酸残基配列を含む。この実施態様の他の特徴は、本発明の単離・精製されたポリペプチドがポリペプチドのＣ末にシステイン残基の部位特異的挿入によりさらに修飾される。本発明は単離・精製された単鎖可変領域ポリペプチドの二量体をも含み、この二量体はポリペプチドのＣ末でシステイン残基の部位特異的挿入により修飾された第一ポリペプチドをポリペプチドのＣ末でシステイン残基の部位特異的挿入により修飾された第二ポリペプチドと、各ポリペプチド上のＣ末システイン間のジスルフィド結合を通して連結することによりつくられる。さらに他の実施態様において、本発明は、ＣＤ１９抗原に結合する単離・精製された単鎖可変領域ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造する方法を提供し、その方法は、（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングし、（ｂ）Ｅ.coli細胞を発現ベクターで形質転換し、（ｃ）形質転換細胞をポリペプチドの発現に充分な生物的条件に維持する、工程を含む。好ましくは、この実施態様方法はＢＬ２１（ＤＥ３）株からのＥ.coliを用いる。本発明の他の実施態様は、ＣＤ１９抗原に結合する単離・精製された単鎖可変領域ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、そのポリペプチドは、（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングし、（ｂ）Ｅ.coli細胞を発現ベクターで形質転換し、（ｃ）形質転換細胞をポリペプチドの発現に充分な生物的条件に維持する、工程を含む方法によって製造され得る。好ましくは、本発明のこの特徴は、ＣＤ１９抗原に結合する単離・精製された単鎖可変領域ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、そのポリペプチドは、（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングし、（ｂ）Ｅ.coli細胞を発現ベクターで形質転換し、（ｃ）形質転換細胞をポリペプチドの発現に充分な生物的条件に維持する、工程を含む方法によって製造される。別の特徴において、本発明は、上記のように製造されたポリペプチドを含み、このポリペプチドは、ポリペプチドのＣ末でシステイン残基の部位特異的挿入によりさらに修飾されている。この特徴はまた、単離・精製された単鎖可変領域ポリペプチドの二量体を提供し、この二量体はポリペプチドのＣ末でシステイン残基の部位特異的挿入により修飾された第一ポリペプチドをポリペプチドのＣ末でシステイン残基の部位特異的挿入により修飾された第二ポリペプチドと、各ポリペプチド上のＣ末システイン間のジスルフィド結合を通して連結することによりつくられる。本発明によって、配列番号２０、２１または２２で定義されたポリペプチドのいかなる５から６０の隣接アミノ酸残基と同様の５から６０の隣接アミノ酸残基配列を含むポリペプチドが提供され、このポリペプチドは少なくとも１ｘ１０⁹ Ｍ^-1のＫａを有するＣＤ１９抗原に結合する能力を保有する。他の実施態様において、本発明は、ＣＤ１９抗原に結合する単鎖可変領域ポリペプチド（ポリペプチドは少なくとも１つの細胞障害剤と連結している）を含む癌の処置のための免疫コンジュゲートを提供する。好ましくは、本発明の免疫コンジュゲートでの処置に感受性の癌は、Ｂ細胞白血病である。さらに好ましくは、本発明の実施態様の免疫コンジュゲートは、配列番号２０、２１または２２のアミノ酸残基配列を含む。他方、本発明の免疫コンジュゲートの細胞障害剤は、単鎖、二重鎖および多重鎖トキシンよりなる群から選ばれる。他の観点から、本発明の免疫コンジュゲートの細胞障害剤は、ベータ放出金属放射性核種、アルファ放出体およびガンマ放出体よりなる群から選ばれる。さらに他の実施態様において、本発明は、単離・精製された単鎖可変領域ポリペプチドの二量体であるポリペプチドを含む癌処置のための免疫コンジュゲートを提供する。この二量体はポリペプチドのＣ末でシステイン残基の部位特異的挿入により修飾された第一ポリペプチドをポリペプチドのＣ末でシステイン残基の部位特異的挿入により修飾された第二ポリペプチドと、各ポリペプチド上のＣ末システイン間のジスルフィド結合を通して連結することによりつくられ、このポリペプチドは少なくとも１つの細胞障害剤に連結している。好ましくは、本発明のこの免疫コンジュゲートはＢ細胞白血病の処置に効果的である。さらに好ましくは、この免疫コンジュゲートの細胞障害剤は、単鎖、二重鎖および多重鎖トキシンよりなる群から選ばれる。他の観点から、本発明の細胞障害剤は、ベータ放出金属放射性核種、アルファ放出体およびガンマ放出体よりなる群から選ばれる放射性核種である。また、免疫コンジュゲートはトキシンおよび放射性核種の両者を含む。本発明はまた、ＣＤ１９抗原に結合する単鎖可変領域ポリペプチドを含む免疫コンジュゲートを製造する方法を提供し、その方法は、（１）（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングし、（ｂ）Ｅ.coli細胞を発現ベクターで形質転換し、（ｃ）形質転換細胞をポリペプチドの発現に充分な生物的条件に維持し、（２）適当なトキシンを準備し、（３）ポリペプチドをトキシンにコンジュゲートする、工程を含む。本発明によれば、この方法は免疫コンジュゲートを放射性核種でラベルする工程も含む。好ましくは、本発明の方法で用いられるトキシンは、単鎖、二重鎖および多重鎖トキシンよりなる群から選ばれる。同様に、本方法で用いられる放射性核種は、ベータ放出金属放射性核種、アルファ放出体およびガンマ放出体よりなる群から選ばれる。他の実施態様において、免疫コンジュゲートのポリペプチドは、配列番号２０、２１または２２のアミノ酸残査配列を含む。本発明はまた、ＣＤ１９抗原に結合する単鎖可変領域ポリペプチドを含む癌処置のための免疫コンジュゲートを提供し、その免疫コンジュゲートは、(１)(ａ) ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングし、（ｂ）Ｅ.coli細胞を発現ベクターで形質転換し、（ｃ）形質転換細胞をポリペプチドの発現に充分な生物的条件に維持し、（２）適当なトキシンを準備し、（３）ポリペプチドをトキシンにコンジュゲートする、工程を含む方法で製造され得る。好ましくは、ＣＤ１９抗原に結合する単鎖可変領域ポリペプチドを含む癌処置のための免疫コンジュゲートは、（１）（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングし、（ｂ）Ｅ.coli細胞を発現ベクターで形質転換し、（ｃ）形質転換細胞をポリペプチドの発現に充分な生物的条件に維持し、（２）適当なトキシンを準備し、（３）ポリペプチドをトキシンにコンジュゲートする、工程を含む方法で製造される。免疫コンジュゲートのポリペプチドが少なくとも１つの細胞障害剤に連結している、上記したような免疫コンジュゲートも提供される。好ましくは、細胞障害剤は単鎖、二重鎖および多重鎖トキシンよりなる群から選ばれ、あるいは、別法として、細胞障害剤はベータ放出金属放射性核種、アルファ放出体およびガンマ放出体よりなる群から選ばれ、または免疫コンジュゲートは細胞障害剤の各タイプのひとつを含む。このような免疫コンジュゲートはＢ細胞白血病の処置に効果的であると考えられる。本発明は、癌の処置の方法について追加の実施態様をさらに提供する。その方法は、（ａ）Ｂ細胞癌（癌は白血病およびＢ細胞リンパ腫よりなる群から選ばれる）の症状を明らかに示す患者を選択し、（ｂ）患者に免疫コンジュゲートの医療上有効量を生物適合の用量形態で投与する工程を含み、免疫コンジュゲートは、（１）（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングし、（ｂ）Ｅ.coli細胞を発現ベクターで形質転換し、（ｃ）形質転換細胞をポリペプチドの発現に充分な生物的条件に維持し、（２）適当なトキシンを準備し、（３）ポリペプチドをトキシンにコンジュゲートし、（４）免疫コンジュゲートを放射性核種でラベルする、工程を含む方法で製造される。好ましくは、免疫コンジュゲートがラベルされる放射性核種は¹³¹Ｉである。他の実施態様において、本発明は、（ａ）Ｂ細胞癌（癌は白血病およびＢ細胞リンパ腫よりなる群から選ばれる）の症状を明らかに示す患者を選択し、（ｂ）患者に単離・精製された単鎖可変領域ポリペプチドの二量体であるポリペプチドを含む免疫コンジュゲートの医療上有効量を生物適合の用量形態で投与する、工程を含む癌処置方法を提供する。この二量体は、ポリペプチドのＣ末でシステイン残基の部位特異的挿入により修飾された第一ポリペプチドをポリペプチドのＣ末でシステイン残基の部位特異的挿入により修飾された第二ポリペプチドと、各ポリペプチド上のＣ末システイン間のジスルフィド結合を通して連結することによりつくられ、このポリペプチドは、トキシンに連結し、放射性核種でラベルされる。図面の簡単な説明図１.アンチＣＤ１９ｓｃＦｖの生育についてのクローニング戦略重鎖の可変領域および（Ｇ₄Ｓ）₃をコードするリンカーをＸｈｏ１およびＳａｃ１部位でＢluescript Ｋ５プラスミド中に連結した。軽鎖の可変領域をリンカーに続いてＳｓｔ１およびＢｇｌII部位に挿入した。ｐＥＴ３６を修飾することにより構築されたｐＥＲＴベクターをｓｃＦｖの発現ベクターとして用いた。ｐＥＲＴのＮｄｃｌおよびＸｈｏｌ部位の間のヌクレオチドは４アミノ酸をコードし、これらのアミノ酸は、Ｖ_HのＦＲ１の部分であるが、Ｖ_HのＰＣＲ産物中に含まれない。ｓｃＦｖをコードするフラグメントは、ＸｈｏｌおよびＢｇｌII部位でｐＥＲＴベクター中にクローン化された。陽性クローンは制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定により同定された。図２.重および軽鎖から異なる可変領域のＤＮＡ配列の比較（２パネルにおける）Ａ：重鎖配列、Ｂ：軽鎖配列。重鎖ＣＤＲ３において、小文字はｎヌクレオチド追加であり、これらは細菌ラインコードＤ_H遺伝子配列を挟んでいる。大文字はＰＣＲで用いられるプライマーを示す。図３.３種の異なるハイブリドーマ：Ｂ４３、２５Ｃ１およびＢＬＹ３からの可変重および軽鎖領域のアミノ酸配列平衡整列（２パネルにおける）配列の相違は表示の通りである。ＰＣＲに用いられたプライマーからの推測タンパク質配列は太字で表す。図４.ｓｃＦｖの発現および精製第１欄、分子量マーカー（９７、６６、４５、３１、２１ＫＤ）；第２欄、非誘導細胞；第３欄、誘導細胞；第４欄、音波処理上清；第５欄、デタージェント溶解上清；第６欄、ペレット；第７欄、Ｑセファローズにより精製されたペレット。図５.ＦＡＣＳにおけるＦＶＳ１９１およびＦＶＳ１９２のＣＤ１９＋ＨＬＡＣｌａａｓＩ＋細胞に対する特異的結合Ｘ軸はＦＩＴＣラベル・クラスＩ抗体の結合を表し、Ｙ軸はフィコエリスリン・ラベルＣＤ１９抗体を表す。パネルＡ、陰性コントロール；パネルＢ、陽性コントロール；パネルＣ、ＦＶＳ１９１による特異的阻止；パネルＤ、ＦＶＳ１９２による特異的阻止。図６.ＦＶＳ１９１の結合のスキャッチャード解析結果について横軸に分子／細胞、縦軸に分子Ｌ／細胞モルをグラフに記入する。誘導されたＫａは２×１０⁹である。発明の詳細な説明現在の治療法で難治性の様々の疾患に対して、新規な薬剤を開発する必要性は大きい。これらの治療法の開発における一つの方法は、モノクローナル抗体の利用である。白血病にモノクローナル抗体を利用することは、細胞の特殊なサブセットが可能性の大きい特異的な標的となり得るので、とくに魅力的である。いくつかの試みが医療上モノクローナル抗体の利用についてなされ、それは、抗体をトキシンに化学的にコンジュゲートする能力にしばしば基づいている（Ghetie e t al.,1988;Uckun et al.,1986;Myers et al.,1991;Jansen et al.,1992）。しかし、抗体をそのまま用いることには欠点があり、それは特に分子のサイズが大きく、結果として組織に侵入する能力を比較的欠くことである（Pastan et al., 1991;Yokota et al.,1992）。単鎖フラグメントは、もとの抗体に関連する問題を解決するために開発されてきた。ｓｃＦｖｓは重および軽鎖から可変領域のみを含み、分子量がもとの抗体の１５０ｋＤａに比べて約２８ｋＤａである。しかし、細菌において発現されたｓｃＦｖｓは、不溶性であって、再生（折）するが難しく、望む抗原との結合を保持する能力は非常に変化しやすい。タンパク質再生に対する第１級アミノ酸配列の作用はよく分かっていないので、ｓｃＦｖとして機能する特定の抗体の能力を測定する優先的な方法は知られていない。そこで、Ｂ細胞のＣＤ１９抗原に結合する抗体を産生する３種のハイブリドーマから開発したｓｃＦｖｓをクローン化し、次いで発現した。本発明のポリヌクレオチドおよび方法，本発明の第一点は、ＣＤ１９抗原に結合する単鎖可変領域ポリペプチドをコードする単離・精製されたポリヌクレオチドを提供することである。好ましくは、本発明の単離・精製されたポリヌクレオチドは、約２８ｋＤａの分子量を有するポリペプチドをコードする。より好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１ｘ１０⁹Ｍ^-1のＫａを有するＣＤ１９抗原に結合するポリペプチドをコードする。本明細書で用いられる“ポリヌクレオチド”は、ホスホジエステル連鎖により結合されたヌクレオチドの配列を意味する。また、本発明は、ＣＤ１９抗原に結合する単鎖可変領域ポリペプチドをコードする単離・精製されたポリヌクレオチドを製造する方法を提供し、その方法は、（ａ）ＣＤ１９抗原に対するモノクローナル抗体をつくるハイブリドーマからＲＮＡを単離し、（ｂ）単離ＲＮＡをｃＤＮＡに転写し、（ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応によりモノクローナル抗体の重および軽可変領域をコードする単離ｃＤＮＡ配列を増幅し、（ｄ）重および軽可変領域をコードする単離・増幅産物をそれぞれベクター構築物にクローニングし、（ｅ）重および軽可変領域をコードするＤＮＡ（単離配列はリンカーヌクレオチド配列を通して連結している）をベクター構築物にクローニングし、（ｆ）クローンを適当な制限エンドヌクレアーゼで消化する、工程を含む。好ましくは、本発明の方法は、配列番号７に記載されたポリヌクレオチド配列であるリンカー配列を用いる。本発明はまた、（ａ）ＣＤ１９抗原に対するモノクローナル抗体をつくるハイブリドーマからＲＮＡを単離し、（ｂ）単離ＲＮＡをｃＤＮＡに転写し、（ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応によりモノクローナル抗体の重および軽可変領域をコードする単離ｃＤＮＡ配列を増幅し、（ｄ）重および軽可変領域をコードする単離・増幅産物をそれぞれベクター構築物にクローニングし、（ｅ）重および軽可変領域をコードするＤＮＡ（単離配列はリンカーヌクレオチド配列を通して連結している）をベクター構築物にクローニングし、（ｆ）クローンを適当な制限エンドヌクレアーゼで消化する、工程を含有する方法により製造され得る単離・精製されたポリヌクレオチドをも含む。更に、本発明は、（ａ）ＣＤ１９抗原に対するモノクローナル抗体をつくるハイブリドーマからＲＮＡを単離し、（ｂ）単離ＲＮＡをｃＤＮＡに転写し、（ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応によりモノクローナル抗体の重および軽可変領域をコードする単離ｃＤＮＡ配列を増幅し、（ｄ）重および軽可変領域をコードする単離・増幅産物をそれぞれベクター構築物にクローニングし、（ｅ）重および軽可変領域をコードするｃＤＮＡ（単離配列はリンカーヌクレオチド配列を通して連結している）を別々にベクター構築物にクローニングし、（ｆ）クローンを適当な制限エンドヌクレアーゼで消化する、工程を含有する方法により製造された単離・精製ポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、本発明の方法は、配列番号７に記載されたポリヌクレオチド配列であるリンカー配列を用いる。好ましくは、本発明の単離・精製されたポリヌクレオチドは、配列番号２０、２１または２２のアミノ酸残基配列を含むポリペプチドをコードする。より好ましくは、本発明の単離・精製されたポリヌクレオチドは配列番号２３、２４または２５のヌクレオチドを含む。他の実施態様において、本発明は、配列番号２３、２４または２５の少なくとも１０隣接ヌクレオチド塩基のセグメントに等しい、または相補的であるヌクレオチド塩基配列を含む単離・精製されたポリヌクレオチドを提供する。該ポリヌクレオチドはＣＤ１９抗原に結合する単鎖可変領域ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをハイブリダイズする。好ましくは、本発明のこの実施態様のポリヌクレオチドは、約２８ｋＤａの分子量を有するポリペプチドをコードする。より好ましくは、コードされたポリペプチドは、少なくとも１ｘ１０⁹Ｍ^-1のＫａを有するＣＤ１９抗原に結合する。他の特徴において、本発明の実施態様は、配列番号２３、２４または２５の２５または５０または１００隣接ヌクレオチド塩基のセグメントに等しいまたは相補的であるヌクレオチド塩基配列を含む単離・精製されたポリヌクレオチドを提供する。該ポリヌクレオチドはＣＤ１９抗原に結合する単鎖可変領域ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをハイブリダイズする。本発明のポリペプチドおよび方法ｓｃＦｖポリペプチドは細菌中で高レベルに発現された３種のハイブリドーマからつくられた。タンパク質の不安定性は、コーマシー着色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル検査により測定され、誘導期間（３時間）を越えて認められず、すべてのクローンがおよそ同じ量のタンパク質を産生した。しかし、標的抗原に結合するこれら各クローンからのｓｃＦｖ能力は非常に相違していた。ＢＬｙ３およびＢ４３ハイブリドーマが同じファミリーからの重鎖および軽鎖可変タンパク質を産生したが、Ｂ４３クローン（ＦＶＳ１９１）から産生されたタンパク質のみがＣＤ１９タンパク質に結合するなんらかの能力を示し得た。このことは、天然タンパク質構造の再生における全配列の重要性を表しているが、適当な生成と高い結合親和性のｓｃＦｖの発育については経験的に止まっていることを表している。ＦＶＳ１９１と同様に、２５Ｃｌ（ＦＶ１９２）からのｓｃＦｖクローンも抗原を認識し得るタンパク質を産生した。ＣＤ１９抗原に対するＦＶＳ１９２の特異的親和性は低く、スキャッチャード解析で定量できなかった。更に他の実施態様において、本発明は、ＣＤ１９抗原に結合する単離・精製された単鎖可変領域ポリペプチドを含む。好ましくは、この実施態様のポリペプチドは約２８ｋＤａの分子量を有する。さらに好ましくは、ポリペプチドは少なくとも１ｘ１０⁹Ｍ^-1のＫａを有するＣＤ１９抗原に結合する。さらになお好ましくは、ポリペプチドは配列番号２０、２１または２２のアミノ酸残基配列を含む。この実施態様の他の特徴は、本発明の単離・精製されたポリペプチドがポリペプチドのＣ末にシステイン残基の部位特異的挿入によりさらに修飾される。本発明は単離・精製された単鎖可変領域ポリペプチドの二量体をも含み、この二量体はポリペプチドのＣ末でシステイン残基の部位特異的挿入により修飾された第一ポリペプチドをポリペプチドのＣ末でシステイン残基の部位特異的挿入により修飾された第二ポリペプチドと、各ポリペプチド上のＣ末システイン間のジスルフィド結合を通して連結することによりつくられる。本明細書で用いられる“ポリペプチド”は、アミド連鎖により結合されたアミノ酸のポリマーを意味し、アミノ酸残基の数は約５から約１００万の範囲にあり得る。好ましくは、ポリペプチドは約１０から約１０００アミノ酸残基であり、さらに好ましくは、約２０から約５００アミノ酸残基である。このように、ポリペプチドは、オリゴペプチド（５ −１０アミノ酸残基）、ポリペプチド（１１−１００アミノ酸残基）およびタンパク質（＞１００アミノ酸残基）と現在技術で意味されているものを含む。コード領域によりコードされたポリペプチドは、翻訳後修飾にかけられて、炭水化物、脂質、核酸とコンジュゲートおよびグリコポリペプチド（例えば、グリコタンパク質）やリポポリペプチド（例えば、リポタンパク質）などを形成するような他の同様のコンジュゲートをつくることができる。ポリペプチドはアミノ酸残基配列として開示する。これらの配列はアミノからカルボキシ端末の方向に左から右に記載する。標準命名法に合わせて、アミノ酸残基配列は、表１以下に表すように単一文字または３文字コードのいずれかで表示する。修飾および変更が本発明のポリペプチドの構造においてなされ、同様の特性を有する分子をなお得ることができる。例えば、あるアミノ酸は、配列中の他のアミノ酸に活性の実質的な損失なしに置き換え得る。これはその生物的機能活性を定めるポリペプチドの相互活性能力および本質であるので、ある種のアミノ酸配列の置換はポリペプチド配列（またはもちろん、その下線したＤＮＡコード配列）においてなすことができ、同様の性質を有するポリペプチドがなお得られる。このような変更をなす場合に、アミノ酸の水治療指数が考慮される。ポリペプチドに相互活性的生物機能を付与する際のアミノ酸の水治療指数の重要性は当業者一般に理解されている（Doolittle et al.,1982）。あるアミノ酸は、同様の水治療指数またはスコアーを有する他のアミノ酸に代わり、同様の生物活性を有するポリペプチドとなり得る。各アミノ酸は、その疎水性と電荷特性を基に水治療指数が与えられている。その指数を以下の表２に示す。アミノ酸の比較水治療指数は得たポリペプチドの２次構造を決定づけ、その構造はポリペプチドと他の分子、例えば酵素、基質、受容体、抗体、抗原など、との相互作用を定める。アミノ酸が同様の水治療指数を有する他のアミノ酸で置換され、生物機能的に同等のポリペプチドがなお得られることは当業者で知られている。このような変更において、アミノ酸置換の水治療指数は±２の間にあることが望ましく、±１がさらに望ましく、±０.５がさらに一層望ましい。アミノ酸様の置換も水治療指数に基づいてなすことができ、特に、生物機能的に同等のペプチドまたはポリペプチドがつくられて、免疫実施態様における利用が意図されている。米国特許第４,５５４,１０１（参考としてここに合体する）はポリペプチドの最も大きい局所的平均水治療指数について述べており、それは、隣接アミノ酸の水治療指数に支配され、ポリペプチドの免疫原性および抗原性すなわち生物特性に相関する。米国特許第４,５５４,１０１に詳記されているように、次の水治療指数がアミノ酸残基に与えられている。アルギニン（＋３.０）；リジン（＋３.０）；アスパルテート(＋３.０±１);グルタメート(＋３.０±１)；セリン（＋０.３）；アスパラギン（＋０.２）；グルタミン（＋０.２）；グリシン（＋０）；プロリン（−０.５±１）；トレオニン（−０.４）；アラニン（−０.５）；ヒスチジン（−０.５）；システイン（−１.０）；メチオニン（−１.３）；バリン（−１. ５）；ロイシン（−１.８）；イソロイシン(−１.８)；チロシン(−２.３)；フェニルアラニン（−２.５）；トリプトファン（−３.４）。アミノ酸は類似の水治療指数価を有する他のアミノ酸に代わって置換され、生物的に同等な、特に免疫的に同等なポリペプチドを得ることができる。このような変更において、アミノ酸置換の水治療指数は±２の間にあることが望ましく、±１がさらに望ましく、±０.５がさらに一層望ましい。概記したように、従って、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基の比較類似性、例えば、その水治療指数、疎水性、電荷、大きさなどに一般に基づいている。前述の様々な特性を考慮した例示的置換は当業者によく知られており、次のものを含む。アルギニンとリジン、グルタメートとアルパルテート、セリンとトレオニン、グルタミンとアルパラギンおよびバリンとロイシンとイソロイシン。本発明は、請求されたポリペプチドの機能的均等物を含む。さらに他の実施態様において、本発明は、ＣＤ１９抗原に結合する単離・精製された単鎖可変領域ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造する方法を提供し、その方法は、（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングし、（ｂ）Ｅ.coli細胞を発現ベクターで形質転換し、（ｃ）形質転換細胞をポリペプチドの発現に充分な生物的条件に維持する、工程を含む。好ましくは、この実施態様方法はＢＬ２１（ＤＥ３）株からのＥ.coliを用いる。本発明の他の実施態様は、ＣＤ１９抗原に結合する単離・精製された単鎖可変領域ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、そのポリペプチドは、（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングし、（ｂ）Ｅ.coli細胞を発現ベクターで形質転換し、（ｃ）形質転換細胞をポリペプチドの発現に充分な生物的条件に維持する、工程を含む方法によって製造され得る。好ましくは、本発明のこの特徴は、ＣＤ１９抗原に結合する単離・精製された単鎖可変領域ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、そのポリペプチドは、（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングし、（ｂ）Ｅ.coli細胞を発現ベクターで形質転換し、（ｃ）形質転換細胞をポリペプチドの発現に充分な生物的条件に維持する、工程を含む方法によって製造される。別の特徴において、本発明は、上記のように製造されたポリペプチドを含み、このポリペプチドは、ポリペプチドのＣ末でシステイン残基の部位特異的挿入によりさらに修飾されている。この特徴はまた、単離・精製された単鎖可変領域ポリペプチドの二量体を提供し、この二量体はポリペプチドのＣ末でシステイン残基の部位特異的挿入により修飾された第一ポリペプチドをポリペプチドのＣ末でシステイン残基の部位特異的挿入により修飾された第二ポリペプチドと、各ポリペプチド上のＣ末システイン間のジスルフィド結合を通して連結することによりつくられる。本発明によって、配列番号２０、２１または２２で定義されたポリペプチドのいかなる５から６０の隣接アミノ酸残基と同様の５から６０の隣接アミノ酸残基配列を含むポリペプチドが提供され、このポリペプチドは少なくとも１ｘ１０⁹ Ｍ^-1のＫａを有するＣＤ１９抗原に結合する能力を保有する。本発明の免疫コンジュゲートおよび方法他の実施態様において、本発明は、ＣＤ１９抗原に結合する単鎖可変領域ポリペプチド（ポリペプチドは少なくとも１つの細胞障害剤と連結している）を含む癌の処置のための免疫コンジュゲートを提供する。好ましくは、本発明の免疫コンジュゲートでの処置に感受性の癌は、Ｂ細胞白血病である。さらに好ましくは、本発明の実施態様の免疫コンジュゲートは、配列番号２０、２１または２２のアミノ酸残基配列を含む。他方、本発明の免疫コンジュゲートの細胞障害剤は、単鎖、二重鎖および多重鎖トキシンよりなる群から選ばれる。他の観点から、本発明の免疫コンジュゲートの細胞障害剤は、ベータ放出金属放射性核種、アルファ放出体およびガンマ放出体よりなる群から選ばれる。トキシン植物および細菌トキシンにおける構造上の類似性はタンパク質合成を阻害する。すなわち、これは、標的細胞にトキシンを結合せしめるポリペプチド鎖（Ｂ鎖）と酵素活性を発揮する第２鎖（Ａ鎖）とからつくられるヘテロ二量体である（ Olsnes et al.,1982）。この２つの鎖はジスルフィド結合で連結している。ジフテリアは、ジスルフィド結合をするＡ鎖とＢ鎖を生成するのに、単一のタンパク質分解性開裂を要する僅かな例外である（Collier et la.,1971）。さらに、すべての植物トキシンのサブユニットが約３０,０００のほとんど同じ明白な分子量を有することは大変興味がそそられることであり（Olsnes et al.,1952;Olsne s et al.,1974）、Ａ鎖は６０Ｓリボソーム・サブユニットを攻撃し（Olsnes et al.,1982;Olsnes et al.,1974;Olsnes et al.,1984）、Ｂ鎖がガラクトースに結合する（Olsnes et al.,1982;Olsnes et al.,1974;Olsnes et al.,1984）。さらに、系統発生学的に遠い種類の植物からの２種トキシンであるアブリンおよびリシンのＡおよびＢ鎖は、比較的高い毒性のハイブリッド分子を産生するのに相互交換的である（Olsnes et al.,1982;Olsnes et al.,1984）。これらの知見は機能および構造における顕著な保存を示唆している。構造上の保存が三次元レベルのみにあるのか、あるいは第１級アミノ酸配列の相同性を反映しているのか、定まっていない。Ａ鎖のみからなっている植物トキシン、例えばゲロニン（Stir pe et al.,1980）およびアメリカゴボウ抗ウイルスタンパク質（Olsnes et al., 1982;Barnieri et al.,1982）の多様性もある。これらのＡ鎖は自然のままのトキシンのＡ鎖と同じように機能する。さらに他の実施態様において、本発明は、単離・精製された単鎖可変領域ポリペプチドの二量体であるポリペプチドを含む癌処置のための免疫コンジュゲートを提供する。この二量体はポリペプチドのＣ末でシステイン残基の部位特異的挿入により修飾された第一ポリペプチドをポリペプチドのＣ末でシステイン残基の部位特異的挿入により修飾された第二ポリペプチドと、各ポリペプチド上のＣ末システィン間のジスルフィド結合を通して連結することによりつくられ、このポリペプチドは少なくとも１つの細胞障害剤に連結している。好ましくは、本発明のこの免疫コンジュゲートはＢ細胞白血病の処置に効果的である。さらに好ましくは、この免疫コンジュゲートの細胞障害剤は、単鎖、二重鎖および多重鎖トキシンよりなる群から選ばれる。他の観点から、本発明の細胞障害剤は、ベータ放出金属放射性核種、アルファ放出体およびガンマ放出体よりなる群から選ばれる放射性核種である。また、免疫コンジュゲートはトキシンおよび放射性核種の両者を含む。本発明はまた、ＣＤ１９抗原に結合する単鎖可変領域ポリペプチドを含む免疫コンジュゲートを製造する方法を提供し、その方法は、（１）（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングし、（ｂ）Ｅ.coli細胞を発現ベクターで形質転換し、（ｃ）形質転換細胞をポリペプチドの発現に充分な生物的条件に維持し、（２）適当なトキシンを準備し、（３）ポリペプチドをトキシンにコンジュゲートする、工程を含む。本発明によれば、この方法は免疫コンジュゲートを放射性核種でラベルする工程も含む。好ましくは、本発明の方法で用いられるトキシンは、単鎖、二重鎖および多重鎖トキシンよりなる群から選ばれる。同様に、本方法で用いられる放射性核種は、ベータ放出金属放射性核種、アルファ放出体およびガンマ放出体よりなる群から選ばれる。他の実施態様において、免疫コンジュゲートのポリペプチドは、配列番号２０、２１または２２のアミノ酸残査配列を含む。本発明の実施に用い得るトキシンには、免疫トキシンの製造において使用されるすべてのトキシンが含まれる。一般的に、トキシンは、トキシンを標的細胞に糖を経て表面に結合せしめるポリペプチド鎖（Ｂ鎖）と、酵素活性を発揮する第２鎖（Ａ鎖）からつくられるヘテロ二量体である。この２つの鎖は典型的にはジスルフィド結合で連結している。２鎖トキシンの例として、リシン、アブリン、メデクシン、ジフテリアトキシンおよびヴィスクミンがある。しかし、単鎖トキシン、すなわちＡ鎖のみからなるトキシン、例えばゲロニン、Ｐseudomonas aer uginosa エキソトキシンＡおよびアマニチンも用いられる。他の単鎖トキシンはヘミトキシンであって、これも本発明で使用可能である。これには、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、サポニンおよびメモルジンが含まれる。他の有用な単鎖トキシンに２鎖トキシンのＡ鎖フラグメントがある。シゲラトキシンなどの多重Ｂ鎖を有する１鎖トキシンも本発明で使用可能である。ここで使用しているように、２鎖トキシンは２鎖から形成されるトキシンを意味し、単鎖は２鎖トキシンの分解によって得られるトキシンと１鎖のみを有するトキシンの両方を意味する。好ましいトキシンは、Ｒicinus communis の種子から抽出されるトキシンレクチンのリシンであって、これは、酵素的およびタンパク質合成阻害Ａ鎖とガラクトース結合部位含有のＢ鎖とを有している。レシンは非常に毒性があり、シトソール中のレシンの１分子が細胞を殺すことで測定されてきた。レシンは、米国特許第４,３４０,５３５（参考によりここに合体される）記載の方法により取得され、精製される。本発明はまた、ＣＤ１９抗原に結合する単鎖可変領域ポリペプチドを含む癌処置のための免疫コンジュゲートを提供し、その免疫コンジュゲートは、(１)(ａ) ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングし、（ｂ）Ｅ.coli細胞を発現ベクターで形質転換し、（ｃ）形質転換細胞をポリペプチドの発現に充分な生物的条件に維持し、（２）適当なトキシンを準備し、（３）ポリペプチドをトキシンにコンジュゲートする、工程を含む方法で製造され得る。好ましくは、ＣＤ１９抗原に結合する単鎖可変領域ポリペプチドを含む癌処置のための免疫コンジュゲートは、（１）（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングし、（ｂ）Ｅ.coli細胞を発現ベクターで形質転換し、（ｃ）形質転換細胞をポリペプチドの発現に充分な生物的条件に維持し、（２）適当なトキシンを準備し、（３）ポリペプチドをトキシンにコンジュゲートする、工程を含む方法で製造される。免疫トキシンを製造する一つの一般的な方法はチオール含有ヘテロ２機能性クロスリンカー、例えばＳＰＤＰを使用することであり、これは、抗原上の第１級アミノ基を攻撃し、ジスルフィド交換によって抗体に対するＳＨ含有Ａ鎖またはＳＰＤＰ−誘導ホロトキシンを攻撃できる（Cumber et al.,1984;Carlsson et a l.,1978）。ジスルフィド交換がｐＨ中性で行われると、比較的安定なジスルフィド結合が形成され、コンジュゲートはインビトロで新鮮マウス血液でインキュベートしたときに不活性である。Ａ鎖と抗体またはフラグメントとの連鎖の性質は毒性を決定づけるのに非常に重要である。結合がエンドソーム／ファゴリソソーム（Jansen et al.,1985;Ram akrishnan et al.,1984）中で容易に分裂することがなければ、例えば安定なチオエーテル結合、毒性が実際上消失する。他方、結合が非常に不安定であると、コンジュゲートは標的細胞に達する前か、あるいは標的細胞内で成熟する前に分解する。後者の場合、Ａ鎖は転座し得る前に減成する。免疫コンジュゲートのポリペプチドが少なくとも１つの細胞障害剤に連結している、上記したような免疫コンジュゲートも提供される。好ましくは、細胞障害剤は単鎖、二重鎖および多重鎖トキシンよりなる群から選ばれ、あるいは、別法として、細胞障害剤は、ベータ放出金属放射性核種、アルファ放出体およびガンマ放出体よりなる群から選ばれ、または免疫コンジュゲートは細胞障害剤の各タイプのひとつを含む。このような免疫コンジュゲートはＢ細胞白血病の処置に効果的であると考えられる。用いた放射性核種のうち、ガンマ−放出体、ポシトロン放出体およびＸ線放出体は局在および／または治療に適しており、一方、ベータ−放出体およびアルファ−放出体も治療に適している。本発明の免疫コンジュゲートを形成する適当な放射性核種には、¹²³Ｉ、¹²⁵Ｉ、¹³⁰Ｉ、¹³¹Ｉ、¹³³Ｉ、¹³⁵Ｉ、⁴⁷Ｓｃ、⁷²Ａｓ、⁷²Ｓｅ、⁹⁰Ｙ、⁸⁸Ｙ、⁹⁷Ｒｕ、¹⁰⁰Ｐｄ、^101mＲｈ、¹¹⁹Ｓｂ、¹²⁸Ｂａ、¹⁹⁷Ｈｇ、²¹¹Ａｔ、²¹²Ｂｉ、²¹²Ｐｂ、¹⁰⁹Ｐｄ、¹¹¹Ｉｎ、⁶⁷Ｇａ、⁶⁸Ｇａ、⁶⁷Ｃｕ、⁷⁵ Ｂｒ、⁷⁷Ｂｒ、^99mＴｃ、¹¹Ｃ、¹³Ｎ、¹⁵Ｏおよび¹⁸Ｆが含まれる。癌の処置方法本発明は、癌の処置の方法について追加の実施態様をさらに提供する。その方法は、（ａ）Ｂ細胞癌（癌は白血病およびＢ細胞リンパ腫よりなる群から選ばれる）の症状を明らかに示す患者を選択し、（ｂ）患者に免疫コンジュゲートの医療上有効量を生物適合の用量形態で投与する工程を含み、免疫コンジュゲートは、（１）（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングし、（ｂ）Ｅ.coli細胞を発現ベクターで形質転換し、（ｃ）形質転換細胞をポリペプチドの発現に充分な生物的条件に維持し、（２）適当なトキシンを供給し、（３）ポリペプチドをトキシンにコンジュゲートし、（４）免疫コンジュゲートを放射性核種でラベルする、工程を含む方法で製造される。好ましくは、免疫コンジュゲートがラベルされる放射性核種は¹³¹Ｉである。他の実施態様において、本発明は、（ａ）Ｂ細胞癌（癌は白血病およびＢ細胞リンパ腫よりなる群から選ばれる）の症状を明らかに示す患者を選択し、（ｂ）患者に単離・精製された単鎖可変領域ポリペプチドの二量体であるポリペプチドを含む免疫コンジュゲートの医療上効果量を生物適合性の用量形態で投与する、工程を含む癌処置方法を提供する。この二量体は、ポリペプチドのＣ末でシステイン残基の部位特異的挿入により修飾された第一ポリペプチドをポリペプチドのＣ末でシステイン残基の部位特異的挿入により修飾された第二ポリペプチドと、各ポリペプチド上のＣ末システイン間のジスルフィド結合を通して連結することによりつくられ、このポリペプチドは、トキシンに連結し、放射性核種でラベルされる。実施例実施例１：ｓｃＦｖのクローニングおよび発現Ａ．可変領域のクローニング（Ｖ_HおよびＶ_L）細胞：これらの研究で使用した３種のアンチ−ＣＤ１９ハイブリドーマは、前に発表されている：F.Uckun（Uckun et al.、1986）により作成されたＢ４３、S .Pieperにより作成されたＳＪ２５Ｃ１、およびS.Poppema（Knapp et al.、1989 b）により作成されたＢＬＹ３である。全て、１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０中に維持されていた。ＲＮＡをChomczynskiおよびSacchi（Chomczynski、1987）の方法で単離し、ＲＴ−ＰＣＲに直接使用するか、または、オリゴｄＴカラムクロマトグラフで更に精製した。実施例として、および制限することなく、以下のプロトコールは、上記に引用した方法に従って、ラットの乳房組織１００ｍｇからのＲＮＡの単離について記載する。動物から取り出した直後、組織を氷上で細かく砕き、ガラス−テフロン製ホモジナイザー中で、溶液Ｄの１ｍｌを用いてホモジナイズ（室温にて）し、続いて、４ｍｌポリプロピレンチューブに移した。順番に、２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）０.１ｍｌ、フェノール（水で飽和化）１ｍｌ、およびクロロホルム−イソアミルアルコール混合物（４９：１）０.２ｍｌを、各試薬を添加した後に生じる逆転層で完全に混合しながら、ホモジネートに加えた。最終懸濁液を１０秒間、激しく振り、氷上で１５分間冷却した。サンプルを１０,０００ｇで２０分間遠心分離した。遠心分離後、ＤＮＡおよびタンパク質は中間層およびフェノール層に存在したが、ＲＮＡは水層に存在した。水層を新しい試験管に移し、１ｍｌイソプロパノールと混合し、ついで、−２０℃で少なくとも１時間放置し、ＲＮＡを沈澱させた。再び、１０,０００ｇ、２０分間で沈降させ、得られたＲＮＡペレットを溶液Ｄの０.３ｍｌ中に溶解し、１.５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、−２０℃で１時間、１容量のイソプロパノールを用いて沈澱させた。４℃ で１０分間エッペンドルフ中で遠心分離した後、ＲＮＡペレットを７５％エタノール中に再び懸濁し、沈降させ、真空乾燥（１５分間）させ、６５℃で１０分間、０.５％ＳＤＳの５０μｌ中に溶解した。この時点で、ＲＮＡ調製物は、オリゴ（ｄＴ）クロマトグラフィー、ノーザンブロット解析、およびドットブロットハイブリダイゼーションにより、ポリ（Ａ）＋選別用に使用し得る。イソプロパノール沈澱は、２容量のエタノールを用いた沈澱で置き換えることもできる。単離ＲＮＡの逆転写は、ランダムヘキサマーを用いて、製造業者（Life Techn ologies）の説明に従って行い、ポリアデニル化ＲＮＡ１−２μｇまたは全ＲＮＡ５−１０μｌと共に、反応容量５０μｌ中で行った。逆転写産物の約１０μｌを、表１にリストした数種の異なるプライマーの一対を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応のために使用した。プライマーＺ２２１およびＺ２２２はそれぞれ、重鎖および軽鎖の定常領域に再生し、後にｓｃＦｖの創製において使用する可変領域の調製のためではなく、配列の確認用のクローンの単離のためにのみ使用された。サイクルパラメーターは、ＴａｑＩポリメラーゼを加える前に９４℃で５分間を１サイクル、ついで、９４℃で１分間３０秒、５４℃で１分間３０秒、７２℃ で１分間を３０サイクル、ついで、９４℃で１分間３０秒、５４℃で２分間３０秒、７２℃で１０分間を１サイクルであった。ＰＣＲ産物は、クレノウで処理しＳｍａＩ消化pBluescriptに入れた後、または融和性Ｔ突出を有するｐＣＲＩベクター（Invitrogen）を用いて直接クローン化した。クローンは、挿入物のサイズに基づき同定し（およそ、Ｖ_L遺伝子では３５０ｂｐ、Ｖ_H遺伝子では４５０ｂｐ）、標準的なジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーター技術（Sequenas e、US Biochemicals）を用いた配列決定により確認した。３種の異なるＰＣＲ反応由来の少なくとも３種の異なるクローンは、クローンをｓｃＦＶの創製に使用する前に、各可変領域について配列決定を行い、Ｔａｑポリメラーゼにより誘導された突然変異が全くないことを確認した。３種のハイブリドーマ由来の可変領域のクローンのＤＮＡおよび推測アミノ酸配列を図２および図３に示す。材料と方法について述べたように、Ｔａｑ誘導突然変異がｓｃＦｖ創製のために使用したクローン内には全く存在しないことを確認するために、３種の個々のＰＣＲ反応由来の少なくとも３種のクローンを配列決定した。３種のハイブリドーマ由来の全ての重鎖可変領域は、約５０％の全マウス重鎖可変領域遺伝子を含むＪ５５８ファミリー由来であった（Brodeur et a l.、1984）。クローン２５ＣＩはＪ_H２を使用するが、Ｂ４３およびＢＬｙ３のクローンはＪ_H４を使用する。期待された通り、Ｂ４３およびＢｌｙ３クローンは、Ｎ領域が異なるため、ＣＤＲ３領域内で最も異なっていた。軽鎖可変領域の配列決定により、Ｖ_K２１はＢ４３およびＢｌｙ３の両方に使用されるが、Ｖ_K１９は２５Ｃ１にしか使用されないことが示された。使用されたＪ_K領域は、Ｂ４３およびＢｌｙ３ではＪ_K１であり、２５Ｃ１ではＪ_K２であった（Sakano et al.、1979）。予期された通り、変動性の最も多い領域は、特異的なスプライシングおよびＮ領域添加のために、ＣＤＲ３領域に存在した。明らかなＰＣＲ誘導突然変異の全くないクローンを配列解析法により同定した後、ｓｃＦｖを構築した。Ｂ．Ｖ_HおよびＶ_Lを用いたｓｃＦｖのクローニングこれらの研究で使用したリンカーは、前に発表（Huston et al.、1988）されている(Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ)₃であった。ｓｃＦｖは、図１で概略を示した方法を使用して、リンカー領域オリゴヌクレオチド（表３）の連結反応により創製した。重鎖可変領域をリンカーおよびBluescriptと同時に混合し、図１で示されるＶ_Hリンカー構築物を得た。重鎖可変領域を含むクローンはＸｈｏＩおよびＢｓｔＥII で消化した。その方法が成功したか否かは、配列決定により確認した。ついで、重鎖可変領域を含むクローンおよびリンカーを、ＳｓｔＩおよびＢｇｌIIで消化し、同酵素で消化したゲル精製軽鎖可変領域に連結した。クローンは、ほぼ同じサイズの制限エンドヌクレアーゼフラグメントを用いて、および最後にヌクレオチド配列解析して同定した。ついで、ｓｃＦｖｓをＸｈｏＩおよびＢｇｌIIで消化し、ｐＥＲＴ発現ベクターに連結する前にゲル精製した。Ｃ．ｓｃＦｖの発現これらの研究でｓｃＦｖを発現するために使用されるベクターは、Studier et al.により確立されたｐＥＴ３ｂプラスミドを用いて開発された（Studier et a l.、1990）。このプラスミドベクターは、Ｔ７プロモーターの制御下で標的ＤＮＡをクローン化し発現するために開発され、ｐＥＴベクター（plasmid for expr ession by T7 RNA polymerase）と呼ぶ（Rosenberg et al.、1987）。これらのベクターは、転写が反時計回りの、ＴＥＴプロモーターとは逆の配向で、マルチコピープラスミドｐＢＲ３２２のＢａＭＨＩサイトに挿入したＴ７プロモーターを含む。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの非存在下では、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼによる標的ＤＮＡの転写は、非常に毒性のある遺伝子をこれらのベクター中でクローン化し得るほどに低い。しかしながら、いくらかの発現は検知し得るので、補助遺伝子は毒性がありすぎて、それらの中にクローン化ができないこともあり得る。記載のｐＥＴベクターの大部分はアンピシリンに対して耐性を示す。このようなベクターでは、ｂｌａ遺伝子は標的遺伝子と共にＴ７プロモーターから発現されるように志向されている。しかしながら、ｐＥＴ−９の系列のベクターでは、ｂｌａ遺伝子は逆方向でｋａｎ遺伝子により置き換えられている。これらのベクターにおいて、Ｔ７プロモーターから転写されたコード配列のみが標的遺伝子の配列である。ｐＥＴベクター中のＴ７プロモーターは、−１７から＋６の位置の同じヌクレオチド配列を有する（ただし、＋１はプロモーターから転写されたＲＮＡの始めのヌクレオチドの位置である）Ｔ７ＤＮＡ中の６つの強力なプロモーターの１つである、φ１０プロモーター由来である。ベクターが保持するφ１０プロモーターフラグメントは全て、ｂｐ−２３から始まり、ｂｐ＋２、＋３、＋２６、および＋９６またはそれ以上へと続く。いくつかのベクターはまた、転写末端シグナル、または標的ＤＮＡのクローニング部位の下流のＲＮａｓｅIII切断部位を含む。重鎖可変領域のアミノ末端に共通して見られる始めの４つのアミノ酸（ＬＥＳＧ）をコードするオリゴヌクレオチドを、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化したベクターに連結させることにより、本発明の構築物のクローニングおよび発現を可能とするように、ｐＥＴ３ｂを修飾した。このオリゴヌクレオチドはまた、ＸｈｏＩ、ＢｇｌII、ＢａｍＨＩ、およびＥｃｏＲＩの認識部位の配列を含み、ｓｃＦｖをＸｈｏＩおよびＢｇｌII部位でベクターにクローニングすることを可能とし、将来、その他の治療効果のある遺伝子のクローニングの可能性を有する（表３）。タンパク質の発現は、ｓｃＦｖクローンをＢＬ２１（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ大腸菌細胞のいずれかに導入することによりなされ得る。これらの宿主株により発現された組換えタンパク質の量には全く相違はみられなかった。タンパク質合成の誘導は、細胞を採取する前に、３時間１.０ｍＭのＩＰＴＧを用いて行った。ペレットはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動ローディング緩衝液中で煮沸し、変性ポリアクリルアミドゲル（Laemmli、1970）で電気泳動を行った。細菌は、標準的なエーレンマイヤーフラスコで成育させた場合には０.６−１.０の吸光度６００ｎｍで、フェルンバッハ（調節）フラスコで成育させた場合には２.５−３.０の吸光度６００ｎｍで誘導に成功した。細胞当たりのタンパク質の量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色（データは示さない）により決定したところによると、両方のフラスコで成育した細胞間に差は見られなかったが、タンパク質の総量は、容積が大きいために調節フラスコ中で成育した細胞の方が多かった。上記したように、大腸菌中でタンパク質合成を指示するために構築物を使用した。誘導後、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、クーマシーブリリアントブルーを用いた染色により検知した（図４）。結果により、期待された分子量（２７.５ｋＤａ）のタンパク質が、培養培地にＩＰＴＧを添加することにより特異的に誘導されたことが示される。このタンパク質は、対照細胞またはＩＰＴＧで処理しなかった細胞のいずれにも存在しなかった。実施例２：タンパク質の単離ｓｃＦｖの単離方法は以前に発表された方法に従った(Langley et al.、1987) 。下記のように、産生された全タンパク質は、おそらく封入体の不溶性細胞室画分にみられた。簡潔には、細胞を遠心分離により採取し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７.４、５０ｍＭのＮａＣｌの元の培養容量の５分の１までの量の中に再懸濁する前に水で洗浄した。元の培養容量が多ければ（１００ｍｌ以上）、この溶液は、細胞を完全に溶菌させるために−２０℃に凍結させた。混合物を音波処理し、３０,０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを音波処理により、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８.０および５ｍＭのＥＤＴＡの元の培養用量の２０分の１の量に再び懸濁した。再懸濁が完了した後、混合物を０.２％リゾチーム（シグマ）で最低１時間消化した。最後に、１０％デオキシコール酸ナトリウムの３分の１量を加え、混合物を３０,０００×ｇで３０分間遠心分離にかける前に、室温で１時間インキュベートした。上記のように音波処理および遠心分離でペレットを再懸濁することにより、ペレットを水中で３回洗浄した。ペレットを−２０℃で貯蔵するか、または０.１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８.０、６ＭグアニジンＨＣｌ、０.３ＭのＤＴＥ、２ｍＭのＥＤＴＡ中に室温で最低２時間溶解した。変性ｓｃＦｖの再構成は、Buchner et al.(15)の方法に従って行った。タンパク質濃度をBradford法を用いて測定し、ついで溶液を急速に少なくとも１００倍に希釈し、０.１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８.０、０.５ＭのＬ−アルギニン、８ｍＭのＧＳＳＧおよび２ｍＭのＥＤＴＡ中３０μｇ／ｍｌタンパク質濃度とした。１０℃で最低１２時間経過した後、再構成タンパク質は、Ｑセファロースおよび最後にスペロース７５でクロマトグラフィーする前に、アミコンンスパイラル濃縮器およびスピン濃縮器を用いて濃縮した。スペロースクロマトグラフィーに１本のピークが存在したこと、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色から判断して、タンパク質は純粋であった。実験に使用するにはタンパク質濃度が低すぎる場合には、タンパク質をアミコンスピン濃縮器で濃縮した。タンパク質濃度は標準物質としてウシ血清アルブミンと共に、Bradford法（BioR ad）を用いて測定した。タンパク質が不溶性画分に存在するか可溶性画分に存在するかを決定するために、細胞を音波処理して分解し、上清および不溶性物質を遠心分離により分離した。２つの画分を解析したところ、全てのタンパク質ではなくても、大部分のタンパク質が不溶性ペレットに存在した。タンパク質が不溶性であること、およびおそらくそれが封入体に所在するであろうことから、我々は以前に公表されているタンパク質の精製法に基づいて単離を行った。ついで再構成および精製タンパク質をＦＡＣＳおよびスキャッチャード解析に使用した。実施例３：ｓｃＦｖｓの解析Ｉ．ＦＡＣＳ解析ＦＡＣＳ解析は、ＣＤ１９およびＨＬＡクラスＩを発現し、４：１１転座を有するＲＳ４：１１（Stong et al.、1985）またはＢ１細胞系（Cohen et al.、19 91）のいずれかで行った。ＲＳ４：１１細胞系は、ｔ（４：１１）−関連急性白血病の患者の骨髄から確立した。ＲＳ４：１１の形態学的、免疫学的、および細胞化学的特徴は、ＡＬＬ（急性リンパ性白血病）に一致した。細胞はＴｄＴに対して強く陽性であった。ＲＳ４：１１の徹底的な解析により、リンパ系およびミエロイド系の両方の特徴が分かった。細胞を免疫グロブリン重鎖およびｋ鎖遺伝子に再編成すると、Ｂ細胞系への関与について強力な証拠を提供する。時折、重鎖遺伝子再編成がＴ細胞および骨髄性細胞にみられるが、軽鎖遺伝子再編成はＢ細胞系に限定されていた（Arnold e t al.、1983；Korsmeyer et al.、1983；Ford et al.、1983）。Ｂ４の発現はＢ系列分類をさらに支持するものである。なぜなら、造血系において、この抗原は、正常Ｂ細胞個体発生において非常に初期に発現され、Ｂ細胞系に限定されているからである（Nadler et al.、1983）。ＢＡ−１、ＢＡ−２およびＰＩ１５３／３との反応性はＢ系列分類と一致する。なぜなら、これらのＭｏＡｂは正常前駆ＢおよびＢ細胞並びに大部分の非−ＴＡＬＬ（急性リンパ性白血病）と反応するからである。なお、その結合はリンパ性白血病を確定すると考えることはできないものではあるが（LeBien et al.、1983）。これらのリンパの特徴に加えて、ＲＳ４：１１細胞は、顆粒球細胞、いくつかの単球（Bernstein et al.、1988）およびＣＦＵ−ＧＭ前駆細胞（Andrews et a l.、1983）と反応するｍＡｂである１Ｇ１０ｍに結合する。いくつかのＲＳ４：１１細胞は、単球前駆体（Andrews et al.、1983）および末梢血単球（LeBein e t al.、1980）にみられるｇｐ１７０,９５／ＴＡ−１抗原を弱く発現する。ＲＳ４：１１細胞の小集団における好塩基球／マスト細胞顆粒の超微細構造の検知およびペルオキシダーゼ活性は、骨髄拘束を支持する証拠である。同様の好塩基球／マスト細胞顆粒が慢性骨髄性白血病のリンパ芽発症のいくつかの症例およびフィラデルフィア−陽性ＡＬＬ（急性リンパ性白血病）において検知されている（ Parkin et al.、1982）。このＲＳ４：１１のより分化した部分集団の消失は、これらの細胞が増殖に不利な状況にあったか、またはインビトロの状態では表現型発現を維持できなかったことを示唆している。ＴＰＡ処理後に誘導したＲＳ４：１１の単球様の表現型は、ＲＳ４：１１の骨髄単球の特性についての説得力のある証拠である。いくつかの研究所が、ＴＰＡは、標的細胞の分化能力により本来指示されている、より分化した表現型へと、ヒト骨髄細胞およびリンパ性白血球細胞を誘導し得ることを報告している（Koef fler、1983；LeBien et al.、1982；Nadler et al.、1982；Nagasawa et al.、1 980）。ＴＰＡ（０.５〜１０.０ｎｇ／ｍｌ）に応答して、ＲＳ４：１１細胞は、ＴＡ−１、ＯＫＭ１、およびＭＣＳ２に反応を示すようになり、食細胞となり、単球細胞に特徴的な様式でＮＳＥ活性の顕著な亢進を示した。処理した細胞の部分集団は粘着性となったが、この応答は、例えばＨＬ−６０およびＫＧ−１（ Koeffler、1983；Goodwin et al.、1984）などの処理骨髄系が示した強力な粘着性よりも、特定のＴＰＡ処理リンパ系（Castagna et al.、1979）の弱い粘着性に近似している。超構造的に、処理細胞は単球形態を示した。Ｂ１細胞系を最初の再発時の１４才の子供から得た骨髄から確立した。診断時および再発時における患者の骨髄サンプルには、ｔ（４：１１）（ｑ２１；ｑ２３）染色体転座およびリンパ細胞および骨髄細胞マーカーの二重表現型発現（しばしば、この転座に関連する）により特徴づけられる悪性細胞が９５％以上含まれていた。細胞系は、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有する∞ＭＥＭ中で白血球細胞（１０⁶／ｍｌ）をインキュベートすることにより確立した。８週間後、細胞を半固形メチルセルロース中でクローン化し、単一コロニーを単離し、液体培養培地中で増殖させた。細胞系はドナーの白血球細胞に似たこのような方法で確立した。系の核型は全ての中期においてｔ（４：１１）（ｑ２１；ｑ２３）を示した。加えて、三染色体性６を含むその他の染色体異常der(1)t(1;8)(p36 ;q13)、der(10)t(1;10)(q11;p15)は、全ての中期に一貫して観察された。細胞化学的解析により、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）陽性、酸性ホスファターゼ陽性、非特異的エステラーゼ陽性、およびスダンブラック陰性染色の特性が示された。白血球細胞は、ＴおよびＢ細胞マーカー（Ｅ^-、ｓＩｇ^-、ｃＩｇ^-）を欠失し、ＣＤ１０−およびＣＤ２０−であったが、ＩｇＨ（μ）遺伝子再編成を受けた。フローサイトメーター解析により、Ｂ１細胞は、ＣＤ１９＋およびＨＬＡ−ＤＲ＋のように初期前駆Ｂ細胞マーカーを発現したことが示された。ＨＬＡ−ＤＲは、細胞の２０％の骨髄系のマーカーであるＭｙ−９（ＣＤ３３）と共に発現される。Ｍｙ−７、Ｍｏ−１およびＭｏ−２などの他の骨髄分化マーカーは、Ｂ１細胞の表面上で検知不可能であった。Ｂ１細胞系に発現されたこれらの分化マーカーは、再発時の患者由来の起源骨髄細胞の初期Ｂおよび骨髄二重表現型特性、および二重表現型白血球をもつ４：１１転座関連についての以前の報告と一致する。全ての反応は４℃で行った。細胞数を数え、約１０⁵個の細胞をポリスチレンチューブに等分割して入れた。ついで細胞は、抗体の非特異的付着を阻害するために２０分間ＦＡＣＳ緩衝液（１％仔ウシ血清を含むＰＢＳ）を用いてインキューベートした。細胞は、遠心分離し上清を廃棄する前に、全量２００μl中で２０分間、抗体またはｓｃＦｖで染色した。ついで、細胞は、ビオチニル化２５Ｃ１抗体およびフィコエリトリンに結合したストレプトアビジンを２００μl添加する前に、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。抗体を除去し、細胞は、ＦＩＴＣに結合したアンチＨＬＡ−クラスＩ抗体を添加する前に、再び洗浄した。最後の洗浄が終わった後、細胞は再び、０.４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳに再懸濁した。蛍光染色をフローサイトメーターで測定した。ＦＡＣＳ解析を使用してｓｃＦｖを調べた。Ｂ４３および２５Ｃ１ハイブリドーマ（これは、ＦＶＳ１９１（Fragment、Variable、Single chain、アンチＣＤ１９、番号１）と呼ぶ）由来のｓｃＦｖおよびＦＶＳ１９２は、それぞれ、ＣＤ１９＋、ＨＬＡクラス１＋である細胞への、ＦＩＴＣラベル２５Ｃ１の結合を阻害できるが、アンチＨＬＡクラスＩモノクローナル抗体のそれへの結合は阻害できなかった（図５）。ＢＬｙ３由来のｓｃＦｖ（ＦＶＳ１９３）は、競合抗体の結合を遮断しなかった。また、標的細胞への結合は、このハイブリドーマから生じたｓｃＦｖをビオチニル化し、ストレプトアビジンラベルフィコエリトリンと共にこの物質を用いることにより検知できなかった（データは示さない）。これら２つの解析におけるＢＬｙ３ｓｃＦｖの結合不能は、タンパク質が適切に構成されていないことを示す。 II．スキャッチャード解析タンパク質のヨウ素ラベル化を、ヨードビーズ（Pierce）で行い、比活性を測定した。ビーズをヨウ素化緩衝液で洗浄し、乾燥させ、担体のないＮａ１２５Ｉ溶液（１ｍＣｉ／１００μｇタンパク質）に加え、５分間反応させた。反応を停止し、ビーズを洗浄した。ゲル濾過（ファルマシアＰＤ５）を使用し、過剰のＮａ１２５Ｉを除去した。標準的な計算法を使用して比活性の測定を行い、続いて、ＴＣＡ沈澱を行った。続いて、免疫反応性分画を測定した（一般的に０.０５の範囲の試薬を用いて）。スッキャッチャード解析を、ＦＡＣＳ緩衝液、およびラベルタンパク質を段階的に非ラベルタンパク質で希釈し、最終濃度が２００ μｇ／ｍＬとなったものを用いて、行った。ヨウ素化タンパク質をダウエックス（Dowex）またはサイズ排除クロマトグラフィーで精製し、比活性を算出した。ＦＶＳ１９１およびＦＶＳ１９２がＣＤ１９抗原を発現する細胞に特異的に結合できることから、その親和性について測定した。タンパク質をヨウ素化し、材料と方法について述べたようにスッキャチャード解析に使用した。結果（図６）で、ＦＶＳ１９１は２×１０⁹Ｍ^-1のＫ_aを有することが実証された。ＦＶＳ１９２は、ＣＤ１９に結合している２５Ｃ１に完全に拮抗し得るが、スッキャチャード解析では十分な結合活性が実証されず、従って、そのＫ_aは決定できなかった。実施例４：アンチ−ＣＤ１９単鎖Ｆｖの二量体形成単鎖Ｆｖ抗体フラグメントは、無傷抗体よりも腫瘍貫通性が亢進しているという利点を有する。ｓｃＦｖの二量体は、より高い結合定数を有し、予防薬または治療薬として有効である。二量体の形成を促進するために、追加のシステイン残基を本発明のｓｃＦｖ構築物のＣ末端に部位特異的に挿入して、ｓｃＦｖ−ｃｙｓを形成した。ｓｃＦｖ −ｃｙｓタンパク質を細菌封入体から単離し、グアニジンで還元し、ＤＴＥおよびＧＳＳＧを含む酸化還元緩衝液中で再構成した。Ｑ−セファロース精製ｓｃＦｖ−ｃｙｓタンパク質を２ｍＭＤＴＴで処理した。ＤＴＴをファルマシアＰＤ１０カラムを用いて除去した。Ｃ末端システイン間のジスルフィド結合を、空気酸化により形成した。Ｂ４３ｓｃＦｖ−ｃｙｓおよび２５Ｃ１ｓｃＦｖ−ｃｙｓ両方の二量体形成は、還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認された。Ｃ末端システインのないｓｃＦｖは、これらの条件下で共有結合的に結合した二量体を形成せず、これは、実際、これらの二量体が、Ｃ末端システイン間の特異的なジスルフィド結合により形成されることを示している。実施例５：動物実験白血球は、放射線感受性を有し、抗体が骨髄にすぐに到達し得るので、放射ラベルアンチＣＤ１９ｓｃＦｖを用いて、うまく処理できる。臨床試験によると、ヨウ素ラベルアンチフェリチン抗体は、難治性ホジキン病をもつ７７％の患者の症候を回復させ、４０％の患者に目的とする腫瘍の減退をもたらした。その他の臨床試験については、放射ラベルアンチ−ＣＤ３３および−３５抗体を高用量のシクロホスファミドとの組合せで使用した場合、全体として１９％の完全な緩解および７５％の部分的緩解が血液学的に悪性の２１０人の診断可能な患者において見られた。ヨウ素ラベル抗体の使用に関連する主な副作用は、血小板減少症であると報告されており、これは、使用するヨウ素の用量を２００ｍＣｉ／患者以上にした場合により頻繁に起こる（Grossbard et al.の文献、1992を参照）。放射ラベル抗体は間接的に標的細胞を殺滅する。放射ラベル抗体の内在化は、おそらく望ましくない。内在化した放射ラベル抗体は、ずっと短い保持時間および、より速い脱ヨウ素化速度を有すことが示され、これは抗体の治療係数の効力を劇的に減少させるだろう（Richard et al.、1992）。単鎖抗体は小さく、抗原に対して比較的高い親和性をもち、標的細胞により内在化を受けないという利点を有する。Ａ．ＦＶＳ１９１およびＦＶＳ１９２単鎖抗体の調製抗体は封入体として大腸菌に発現される。封入体は、変性させ、再構成し、ＨＰＬＣクロマトグラフィーで精製する。抗体の内毒素含量は高いので、動物中で使用する前に除去しなければならない。内毒素は、アフィニティークロマトグラフィー（キットは商業的に入手可能である）で除去する。抗体調製物中の内毒素の量は、カブトガニ変形細胞溶解物アッセイ（Biowhittater Inc.、Walkersvill e、MD）でモニターした。ＵＳ基準に従って、最終抗体調製物中の内毒素含量は、＜１５内毒素単位（ＥＵ、１ＥＵ＝０.５ｎｇ／ｍｌ）にまで減少させなければならない。Ｂ．ヨウ素化単鎖抗体をヨウ素キット（Pierce、Rockford、IL）を用いて、Ｎａ¹³¹Ｉでラベルする。ヨウ素の抗体に対する比は、Badger et al.（1985）が記載したように、約１００μｇ：１ｍｇに調節する。ラベルされた抗体をゲル濾過で遊離¹³¹ Ｉから分離する。ラベル効率および比活性を環状無水物法（Hantowich et al.、 1983）により測定した。１.０Ｃｉ／ｇまたはそれ以下の比活性が、実験に適する。同量の全モノクローナル抗体および非関連抗体のＦａｂを対照と同じ方法で¹³¹ Ｉでラベルする。Ｃ．免疫反応性の測定免疫反応性を過剰の抗原への結合数パーセントとして定義する。簡潔には、標的細胞（ＣＤ１９＋、１０^6-7／ｍｌ）の連続希釈液を室温で１時間、ラベル抗体（４−５ｎｇ／ｍｌ）と共にインキュベートする。細胞を遠心分離し、上清の放射能を計測する。免疫反応性をラインウィーバー・バーク法により測定する。抗体の結合活性は、ラベル抗体の連続希釈液を用いて、室温で１時間、一定の細胞数（１０⁵／ｍｌ）をインキュベートすることにより測定する。細胞を洗浄し、細胞ペレットの放射能を使用して結合活性を計算する（会合定数および細胞当たりの結合部位数）。Ｄ．単鎖Ｆｖ代謝のインビトロ測定本実験で、ラベル抗体が内在化され、分解する速度を測定する。標的細胞を４５分間氷上で用量１００μl中、ラベル抗体（ｓｃＦｖおよび全Ｍａｂ、５ｎｇ／１０⁶細胞）と共にインキュベートする。細胞を洗浄し、３７℃で培養する。インキューベーション混合物を会合細胞および上清放射能について０、１、４、１０および２４時間において検定する。ＴＣＡ沈澱放射能パーセンテージを使用し、内在化の速度およびラベル抗体の細胞内代謝速度を計測する。１．薬物動態学試験薬物動態学試験は、尾部の静脈を介してラベル単鎖抗体を４ＢＡＬＢ／ｃマウスのグループに注入することにより行う。血液サンプルを様々な時間間隔で採血を、コンピューターシミュレーションにより計測する。対照として、親モノクローナル抗体をラベルし、上記のようにしてマウスに注入する。生物分布解析は、例えば単鎖抗体を¹³¹Ｉでラベルし、対照抗体を¹²⁵Ｉでラベルするといったように、対でラベルすることにより行う。我々の実験室では、アンチＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＦＶＳ１９１を、¹²⁵Ｉを用いてうまくラベルでき、免疫化学研究および薬物動態学研究に使用した。現行のプロトコールを用いて、このｓｃＦｖは比活性２.４ｍｃｉ／ｍｇを有する¹²⁵Ｉで容易にラベルすることができる。ラベル抗体の免疫反応性は５５％であった。ＦＶＳ１９１は無傷の抗体よりもラベル傷害に対してより抵抗性を有する。スキャッチャード解析によると、ＦＶＳ１９１のＣＤ１９抗原に対する親和性は７.２×１０⁸Ｍ^-1であった。この値は、親モノクローナル抗体（１.９３×１０⁸Ｍ^-1）の約４倍であり、これは、ｓｃＦｖが無傷抗体よりも良い標的薬剤であり得ることを示唆する。ｓｃＦｖがその親無傷モノクローナル抗体よりも高い親和性を示すという観察は、他者の所見と一致する。Ｂあった。要約すると、アンチＦＶＳ１９１の高特異的免疫反応性、高い親和性および急速な血液クリアランスから、このものは癌治療の使用における優れた候補となる。２．生物分布研究様々な濃度の特異的抗体および対照抗体を等量含む混合物を、ヒト白血病移植片を有する４匹のマウスのグループに静脈内注射する。注入の１、２４および４８時間後に、動物を殺戮する。血液、腫瘍、肺、脾臓および肝臓のサンプルの重量を測定し、ガンマ計測器で計測する。各同位体の組織グラム（％ＩＤ／ｇ）当たりの注入用量のパーセンテージを計測する。用量漸増研究のために、単一ラベル（¹³¹Ｉ）を行い、続く動物生存試験における適切な用量範囲を決定する。Ｅ．治療効力の証明２つの型の白血病動物モデルを実験に使用する−例えば、ＳＣＩＤマウスにおける急性ヒト白血病（Ｂ１またはＲＳ４：１１細胞）、またはＳＣＩＤマウスまたは無胸腺ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるヒト急性白血病移植片腫瘍モデル。ヒト白血病ＳＣＩＤモデルは本研究室でよく確立されており、実験にすぐ使用できる。移植片腫瘍モデルは、Richard et al.、1992に記載のように、ヒト白血病細胞をマウスの横腹に注入することにより確立される。０.５−１.０ｃｍの触診できる腫瘍群を腫瘍細胞注入の８−１０日後に検知する。放射ラベル抗体の様々な濃度（低、中および高）の単一注入液（静脈内注射）を４匹の動物のグループに与える。同量の¹³¹Ｉでラベルした対照抗体を同じように処理する。生存率を５０日間まで記録する。移植片を有する動物について、腫瘍の減退を記録する。完全減退および部分的減退の定義をなす必要がある。１．治療結果ＦＶＳ１９１およびＦＶＳ１９２単鎖抗体はＣＤ１９＋細胞に特異的であるので、放射ラベル抗体は対照抗体に比較して顕著な標的細胞殺戮効果を示す。放射ラベル抗体処理後の、完全または部分的な腫瘍の減退が期待される。単鎖抗体は、サイズが小さいため、腫瘍をより確実に貫通することが期待され、ラベル全ＭＡｂに比較してより良い結果を示す。２．ヒトＢ細胞癌の治療（白血病およびリンパ腫）アンチＣＤ１９ｓｃＦｖは、動物治療研究で記載したように、¹³¹Ｉに結合する。初めのヒト試験では、薬物動態学および生物分布研究に焦点を当てる。アンチＣＤ１９抗体は、例えばリシンまたはアメリカヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質などの毒素に結合した場合に、ヒトＢ細胞白血病またはリンパ腫の処置に効果がある（Vitetta、et al.、Uckun、et al.）。ＣＤ１９（例えばアンチ −ＣＤ２９）以外のＢ細胞抗体は、例えば¹³¹Ｉなどの放射性同位体に連結した場合に、効果があった。今までのデータにより、アンチ−ＣＤ１９ＦＶＳ１９１およびＦＶＳ１９２は結合後に細胞による内在化を受けず、従って、これらのｓｃＦｖは最適の安定性および細胞殺戮で細胞表面上にとどまる放射免疫コンジュゲートとして効果があることを示す。アンチ−ＣＤ１９ｓｃＦｖは、サイズが小さく半減期が短いことに基づき、大変効率的な生物分布および組織貫通性を有す全てのＢ細胞白血病およびリンパ腫（その９９％はＣＤ１９を有する）の優れた殺戮が可能である。小さなサイズの¹³¹ＩｓｃＦｖにより、骨髄リンパ節、および白血病並びにリンパ腫細胞の非侵入領域としてしばしば利用される骨髄外の部位における優れた殺戮が可能である。参考文献下記の参考文献およびここに引用したすべての参考文献は、研究方法、技術および／またはここに使用した組成物を補足し、説明し、その背景を提供し、教示する範囲に、参考により合体される。配列の簡単な記載下の表は明細書および請求の範囲に記載された配列を簡単に同定している。配列番号：１重鎖可変領域のＰＣＲに使用される５'オリゴヌクレオチド配列番号：２重鎖可変領域のＰＣＲに使用される３'オリゴヌクレオチド配列番号：３重鎖定常領域のＰＣＲに使用される３'オリゴヌクレオチド配列番号：４軽鎖可変領域のＰＣＲに使用される５'オリゴヌクレオチド配列番号：５軽鎖可変領域のＰＣＲに使用される３'オリゴヌクレオチド配列番号：６軽鎖定常領域のＰＣＲに使用される３'オリゴヌクレオチド配列番号：７可変軽および重鎖領域間のリンカーＤＮＡ配列番号：８Ｂ４３重鎖のｃＤＮＡ配列配列番号：９ＳＪ２５Ｃ１重鎖のｃＤＮＡ配列配列番号：10 ＢＬＹ３重鎖のｃＤＮＡ配列配列番号：11 Ｂ４３軽鎖のｃＤＮＡ配列配列番号：12 ＳＪ２５Ｃ１軽鎖のｃＤＮＡ配列配列番号：13 ＢＬＹ３軽鎖のｃＤＮＡ配列配列番号：14 Ｂ４３重鎖のタンパク質配列配列番号：15 ＳＪ２５Ｃ１重鎖のタンパク質配列配列番号：16 ＢＬＹ３重鎖のタンパク質配列配列番号：17 Ｂ４３軽鎖のタンパク質配列配列番号：18 ＳＪ２５Ｃ１軽鎖のタンパク質配列配列番号：19 ＢＬＹ３軽鎖のタンパク質配列配列番号：20 単鎖Ｂ４３抗体のタンパク質配列配列番号：21 単鎖ＳＪ２５Ｃ１抗体のタンパク質配列配列番号：22 単鎖ＢＬＹ３抗体のタンパク質配列配列番号：23 単鎖Ｂ４３抗体のｃＤＮＡ配列配列番号：24 単鎖ＳＪ２５Ｃ１抗体のｃＤＮＡ配列配列番号：25 単鎖ＢＬＹ３抗体のｃＤＮＡ配列配列番号：26 修飾された単鎖Ｂ４３抗体のタンパク質配列配列番号：27 修飾された単鎖ＳＪ２５Ｃ１抗体のタンパク質配列配列番号：28 二量体単鎖Ｂ４３抗体のタンパク質配列配列番号：29 二量体単鎖ＳＪ２５Ｃ１抗体のタンパク質配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 16/28 Ａ６１Ｋ 43/00 ＡＤＵＣ１２Ｐ 21/02 37/54 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ワン，デュオアメリカ合衆国55442ミネソタ州プリマス、フォーティフォース・アベニュー・ノース11600番 (72)発明者アックン，ファティー・エムアメリカ合衆国55110ミネソタ州ホワイト・ベア・レイク、イーサン・アベニュー・ノース12590番

Claims

【特許請求の範囲】１．ＣＤ１９抗原に結合する単鎖可変領域ポリペプチドをコードする単離・精製されたポリヌクレオチド。２．コードされたポリペプチドが配列番号２０、２１または２２のアミノ酸残基配列を含む、請求項１の単離・精製されたポリヌクレオチド。３．ポリヌクレオチドが配列番号２３、２４または２５のヌクレオチド配列を含む、請求項１の単離・精製されたポリヌクレオチド。４．配列番号２３、２４または２５の少なくとも１０の隣接ヌクレオチド塩基のセグメントに同等また相補的であるヌクレオチド塩基配列を含むポリヌクレオチドであり、該ポリヌクレオチドがＣＤ１９抗原に結合する単鎖可変領域ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズする、単離・精製されたポリヌクレオチド。５．コードされたポリペプチドが少なくとも１×１０⁹Ｍ¹のＫａを有するＣＤ１９抗原と結合する、単離・精製されたポリヌクレオチド。６．配列番号２３、２４または２５の少なくとも１００の隣接ヌクレオチド塩基のセグメントに同等または相補的であるヌクレオチド塩基配列を含むポリヌクレオチドであり、該ポリヌクレオチドがＣＤ１９抗原に結合する単鎖可変領域ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズする、単離・精製されたポリヌクレオチド。７．ＣＤ１９抗原に結合する単離・精製された単鎖可変領域ポリヌクレオチド。８．ポリペプチドが約２８ｋＤａの分子量を有する、請求項７の単離・精製されたポリペプチド。９．ポリペプチドが少なくとも１×１０⁹Ｍ^-1のＫａを有するＣＤ１９抗原に結合している、請求項７の単離・精製されたポリペプチド。１０．ポリペプチドが配列２０、２１または２２のアミノ酸残基配列を含む、請求項７の単離・精製されたポリペプチド。１１．ポリペプチドがポリペプチドのＣ末でシステイン残基の部位特異的挿入によりさらに修飾されている、請求項７の単離・精製されたポリペプチド。１２．請求項１１の第１ポリペプチドと請求項１１の第２ポリペプチドとを各ポリペプチド上のＣ末システイン残基間のジスルフィド結合を通して連結せしめることにより二量体が調製される、単離・精製された単鎖可変領域ポリペプチドの二量体。１３．（Ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングする、（Ｂ）発現ベクターでＥ.coli細胞を形質転換する、（Ｃ）形質転換細胞においてポリペプチドを発現する、工程を含む製法によりポリペプチドが調製される、ＣＤ１９抗原に結合する単離・精製された単鎖可変領域ポリペプチド。１４．ポリペプチドが少なくとも１つの細胞障害剤に連結している、ＣＤ１９抗原に結合する単鎖可変領域ポリペプチドを含む、癌処置のための免疫コンジュゲート。１５．ポリペプチドが配列番号２０、２１または２２のアミノ酸残基配列を含む、請求項１４の免疫コンジュゲート。１６．少なくとも１つの細胞障害剤が単鎖、二重鎖および多重鎖トキシンからなる群より選ばれる、請求項１４の免疫コンジュゲート。１７．少なくとも１つの細胞障害剤がβ−放出金属放射性核種。α−放出体およびγ−放出体からなる群より選ばれる放射性核種である、請求項１４の免疫コンジュゲート。１８．ポリペプチドが少なくとも１つの細胞障害剤に連結している、請求項１２のポリペプチドを含む癌処置のための免疫コンジュゲート。１９．少なくとも１つの細胞障害剤が単鎖、二重鎖および多重鎖トキシンからなる群より選ばれる、請求項１８の免疫コンジュゲート。２０．少なくとも１つの細胞障害剤がβ−放出金属放射性核種、α−放出体およびγ−放出体からなる群より選ばれる放射性核種である、請求項１８の免疫コンジュゲート。２１．（Ｄ）ｉ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクター中にクローニングし、 ii）発現ベクターでＥ.coliを形質転換し、 iii）ポリペプチドの発現に充分な生物的条件に形質転換細胞を保持する、工程を含む方法でポリペプチドを調製し、（Ｅ）適当なトキシンを準備し、（Ｆ）ポリペプチドをトキシンにコンジュゲートする、工程を含む、ＣＤ１９抗原に結合する単鎖可変領域ポリペプチドを含む免疫コンジュゲートを調製する方法。２２．方法が免疫コンジュゲートを放射性核種でラベルする工程をさらに含む、請求項２１の方法。２３．ポリペプチドが少なくとも１つの細胞障害剤に連結している、請求項１２のポリペプチドを含む癌処置のための免疫コンジュゲート。２４．少なくとも１つの細胞障害剤が単鎖、二重鎖および多重トキシンからなる群より選ばれる、請求項２３の免疫コンジュゲート。２５．少なくとも１つの細胞障害剤がβ−放出金属放射性核種。α−放出体およびγ−放出体からなる群から選ばれる放射性核種である、請求項２３の免疫コンジュゲート。２６．ポリペプチドが少なくとも１つの細胞障害剤に連結している、請求項１２のポリペプチドを含む癌処置のための免疫コンジュゲート。２７．少なくとも１つの細胞障害剤が単鎖、二重鎖および多重鎖トキシンからなる群より選ばれる、請求項１８の免疫コンジュゲート。２８．少なくとも１つの細胞障害剤がβ−放出金属放射性核種、α−放出体およびγ−放出体からなる群より選ばれる放射性核種である、請求項１８の免疫コンジュゲート。２９．（Ｇ）Ｂ細胞癌（癌は白血病およびＢ細胞リンパ腫からなる群から選ばれる）の症候を明示する患者を選択し、（Ｈ）生物適合性の用量形態で請求項２２の免疫コンジュゲートの医療上効果量を患者に投与する、工程を含む、癌処置方法。