KR100868235B1 - 수지상 세포에 특이적인 항원-결합 단편, 단편을 사용한조성물 및 방법, 그것에 의해 인식된 항원, 및 그것에의해 얻어진 세포 - Google Patents

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Abstract

본원발명은 수지상세포에 특이적이고 치료 및/또는 다양한 장애를 진단하는데 효과적인 항원-결합 단편을 제공한다. 이러한 항원 결합 단편 및 그것에 의해 얻어진 생산물을 스크리닝하는 방법과 같은 사용방법이 또한 제공된다.
Figure 112002014869824-pct00009
수지상 세포, 항원-결합 단편.

Description

수지상 세포에 특이적인 항원-결합 단편, 단편을 사용한 조성물 및 방법, 그것에 의해 인식된 항원, 및 그것에 의해 얻어진 세포{ANTIGEN-BINDING FRAGMENTS SPECIFIC FOR DENDRITIC CELLS, COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF ANTIGENS RECOGNIZED THEREBY AND CELLS OBTAINED THEREBY}
본원 발명은 수지상 세포(DC)의 아집단에 특이적인 항체 및 그것의 유도체에 관한 것이다. 또한 DC 및 그것의 아집단의 분리 및 정제와 항체 또는 리간드 매개 면역요법을 포함하는 그것의 조성물 및 사용방법이 제공된다. 본원발명은 또한 실질적으로 분리된 DC 아집단을 제공한다. 또한 DC-기초 면역요법, 다양한 질환의 특성화 및 예를 들어, flt3(FMS-like tyrosine kinase 3)-리간드로 생체내의 많은 DC 증대를 포함하는 그것의 사용방법이 제공된다.
강력한 항원 제시 세포인 수지상 세포(DC)의 조혈성 발달은 명백하고, 단핵세포에 어느정도 밀접하게 연결된 몇 개의 전구체 경로를 따를 수 있다. DC 는 림프 전구체로부터 유래될 수 있다. Thomas et al. (1993) J. Immunol. 150 : 821-834. 혈에서와 같이, 흉선에 존재하는 DC 의 3 개의 구별된 서브셋(subset):1) 형질세포 CD4+CDllc-DC; 2)CD4+CD1lc+DC 및 3) 서로 맞물린 DC이 있을 수 있다. DC 및 T 세포가 통상의 조혈 세포에서 발생할 수 있다는 것이 제안되었다. Thomas et al. (1996) Stem Cells 14 : 196-206.
효험있는 임상용도용의 많은 DC 의 발생이 최근에 사이토카인과 함께 전구체를 체외 배양함으로써 이루어졌다. 공자극과 관련하여 항원이 세포에 더욱 효과적으로 제시될 수 있도록 수지상세포에 항원을 도입하기 위한 다양한 전략이 채용되었다. 수지상 세포는 체액성 또는 전신성 경로 중 하나에 따라서 항원에 대한 T 세포 반응에 영향을 줄 수 있다는 것이 증명되었다.
T 세포는 비프로세싱 단백질에 반응할 수 없고, 오히려 T 세포는 MHC 분자와 융합한 세포 표면상에 제시된 펩티드 에피토프로서 항원을 제시하는 보조 세포를 요구한다. 세포질에서 내인성으로 발생한 항원은 전형적으로 클래스 I 경로에 제시되어 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 자극한다. 그러나, 외인성 단백질은 MHC 클래스 II 분획에서 프로세싱되어 헬퍼 (CD4) T 세포 반응을 유도한다. 천연 T 세포의 자극은 제1의 면역의 활성에서 2차 신호로서 작용하는 공자극 분자의 존재를 요구한다. B 세포 및 대식세포와 같은 APC(antigen presenting cells)는 전형적으로 제1의 반응을 유도할 수 없다. 대조적으로, 수지상 세포는 효과적인 세포성 면역 개시에 필수적인 공자극, 부착 및 MHC 클래스 I 및 II 분자의 구성적인 비조절 발현으로부터 그들의 효능을 증가시킨다. 개관을 위해, Avigan (1999) Blood Rev. 13 : 51-64 참조.
DC 는 1차 면역 반응의 개시 및 내성의 발생에 필수적인 APC 이다. DC 는 천연 T 세포집단의 자극에 필수적인 MHC 를 발현한다. DC 의 조혈발생은 분명하고, 몇몇의 전구체 경로를 거칠 수 있고, 이 중 몇개는 단핵세포와 밀접하게 연결된다. 예를 들어, 개관을 위해서 Avigan (1999) Blood Rev.13: 51-64 참조. 상이한 DC 서 브셋은 상이한 발생 경로를 가진다. 신개념은 DC 서브셋은 자가-항원에 대한 내성의 유도에 기여할 수 있는 조절 기능을 가진다는 것이다. Austyn (1998) Curr. Opin. Hematol. 5:3-15. 역으로, DC, 또는 그것의 서브셋은 또한 자가-단백질에 대한 면역반응의 유도에 관여할 수 있다. 어떤 자가면역 반응은 미세환경 조직 상해에 이어서, 국부성 DC 활성 및 면역반응을 개시하는 T 세포와의 일련의 상호작용때문으로 생각된다. Ibrahim et al. (1995) Immunol. Today 16 : 181-186.
T 세포 반응을 개시하는 DC 의 능력은 DC 암 백신에 사용된다. Hart et al. (1999) Sem. Hematol. 36 :: 21-25. 예를 들어, DC 는 종양-유래 펩티드 또는 단백질로 펄스된 CD34+ 세포 또는 단핵세포로부터 체외에서 발생되고, 암-특이적 T 세포 유도에서 APC 로 작용하도록 환자에게 반환된다. Brugger et al. (1999) Ann. N. Y. Acad. Sci. 872 : 363-371. 동물 모델은 DC 종양 백신이 T 세포 아네르기를 역위시키고, 일련의 종양 거부반응을 초래하는 것을 증명했다. Avigan (1999) ; 또한, Tarte et al.(1999) Leukemia 13 : 653-663 ; Colaco (1999) Molec. Med. Today 5 : 14-17 ; Timmerman et al. (1999) Ann. Rev. Med. 50 : 507-529 ; Hart et al. (1999) Semin. Hematol. 36 : 21-25 ; Thurnher et al. (1998) Urol. Int. 61 : 67-71 ; 및 Hermans et al. (1998) N. Z. Med. J. 111 : 111-113 참조. 한 접근법은 flt-리간드의 투여에 의해서 생체내에서 DC 를 증가시켰다. 이것은 VEGF-유도 DC 억제에 대한 보상 효과를 가진다. Ohm et al. (1999) J. Immunol. 163 : 3260-3268. DC 는 백신접종 및 재조합 백신에서 애쥬번트로서의 사용이 제안되었다. Fernandez et al. (1998) Cyto. Cell. Mol. Ther. 4 : 53-65; 및 Gilboa et al. (1998) Cancer Immunol. Immunother. 46 : 82-87. DC 는 또한 줄기세포 이식후에 면역을 증진시키는 것으로서의 용도가 제안되었다. Brugger et al. (1999) Ann. NY Acad. Sci. 363-371. DC 는 면역학에서 많은 효험있는 역할을 한다. 예를 들어, DC 는 사람 면역결핍 바이러스(HIV) 감염에 포함된다. Zoeteweij et al. (1998) J. Biomed. Sci. 5 : 253-259. DC 는 또한 HIV 요법의 사용에 적합한 것으로 제안되었다.Weissman et al. (1997) Clin. Microbiol. Rev. 10 : 358-367.
추가적인 면역 기능은 Th1(helper T-cell type 1) 또는 Th2 반응, 자가면역 반응 및 알레르기의 분화 유도와 같은 DC 에 관한 것이다. Rissoan et al. (1999) Science 283 : 1183-1186 ; Hermans et al. (1998) NZ Med. J. 111 : 111-113; 및 De Palma et al. (1999) J. Immunol. 162 : 1982-1987.
순환하는 IFN-α및 IFN-α유도 인자(항-DNA 항체 및 DNA 의 복합체와 같은 것)의 증가된 수준이 SLE(전신성 홍반성 낭창) 환자에서 발견되고, 질환 활성과 서로 관련된다. 더욱이, IFN-α로 치료된 비자가면역 장애를 가진 환자는 종종 자가항체 및 때때로 SLE 를 발생시킨다. Ronnblom et al. (1999) Clin. Exp. Immunol. 115 : 196-202 ; (1999) J. Immunol. 163 : 6306-6313 ; 및 (2000) J. Immunol. 165 : 3519-3526 의 몇몇 논문은 환자에게서 유래된 IFN-α유도 인자가 건강한 공여자의 PMBC 에서 IFN-α의 분비를 유도하고, 이들이 IFN-α생산 세포(NIPC=형질세포 DC) 를 선택적으로 활성화한다는 것을 보여준다.
혈내의 DC 에 대한 연구는 세포의 부족 및 DC-특이적 세포 표면 마커의 상대 적인 부족으로 좌절되었다. DC 분리 방법은 단기간의 배양 기간 후에 부력밀도의 획득과 같은 성숙 변화, 또는 DC 활성/성숙 항원의 발현에 기초한다(CD83, CMRF-44 및 CMRF-56). Young et al. (1988) Cell Immunol. 111 : 167 ; Van Voorhis et al. (1982) J. Exp. Med. 155 : 1172 ; Zhou et al. (1995) J. Immunol. 154 : 3821-3835 ; Fearnley et al. (1997) Blood 89 : 3708-3716 ; Mannering et al. (1988) J. Immunol. Met. 219 : 69-83 ; Hock et al. (1999) Tiss. Antigens 53 : 320-334 ; 및 Hock et al. Immunol. 83 : 573-581.
기능적 CDla+DC 는 전형적으로 단핵세포 및 CD34+ 조혈 전구 세포로부터 체외 발생된다. Bender et al. (1996) J. Immunol. Met. 196 : 121-135 ; Pickl et al. (1996) J. Immunol. 157 : 3850-3859 ; Romani et al. (1994) J. Exp. Med. 180 : 83-93 ; Sallusto et al. (1994) J. Exp. Med. 179 : 1109-1118 ; Caux et al. (1992) Nature 360 : 258-261 ; Mackensen et al. (1995) Blood 86 : 2699-2707 ; Szabolcs et al. (1995) J. Immunol. 154 : 5851-5861 ; Herbst et al. (1996) Blood 88 : 2541-2548 ; de Wynter et al.(1998) Stem Cells 16 : 387-396 ; Strunk et al. (1996) Blood 87 : 1292-1302 US 특허번호 6,010,905; 및 6, 004,807. 단핵세포 및 조혈 전구세포에서 체외 발생된 DC 가 체내 DC 의 모든 특징을 보유 또는 획득하는지는 밝혀지지 않았다.
게다가, 사람의 DC 에 특이적인 mAb 를 발생시키려는 몇몇의 시도가 실패했고, DC 및 다른 백혈구에 의해 발현된 항원에 결합하는 mAb 만이 생산된다. 사람의 DC 는 HLA(조직적합이식항원) 분자, CD18, CD29, CD31, CD43, CD44, CD45, CD54, 및 CD58 를 포함하는 다른 혈액 세포와 많은 면역원성 세포 표면 구조를 공유한다. 이러한 항원은 DC-특이적 항원에 대한 특이성을 가진 B 세포가 골수종 세포와 융합할 수 있는 능력을 가지는 B 세포 중에서 모두 또는 거의 표상되지 않는 수준에서 주사된 DC 에 대한 면역 반응에 우세할 수 있다.
많은 연구자들이 공유된 항원에 대한 특이성을 가진 B 세포를 제거하기 위해서 비-DC 및 시클로포스파미드를 가진 성체 마우스에 주사함으로써 본 과제를 극복하기 위한 시도를 했다. O'Doherty et al. (1993) Adv. Exp. Med. Biol. 329 : 165-172 ; 및 Yamaguchi et al. (1995) J. Immunol. Met. 181 : 115-124.
줄기 세포내의 DC 를 모니터하는 데 사용된 mAb 지시 CMRF44 를 환자에 이식한다. Fearnley et al. (1999) Blood 93 : 728-736. 이러한 CMRF44+ 세포가 면역 반응을 개시, 유지 및 지시에의 사용에 적합한 것으로 제안되었다. Fearnley et al.(1997). DC 는 매우 빈번하게 세포 표면 마커의 조합을 사용하여 분리되었다. 예를 들어, US 특허번호 5,972,627 은 "CD19, CD2, CD3, CD4, CD8, CD20, CD14, CD15, CD16 CD56 및 글리코포린은 아니지만 CD34, CD45RA, 및 CD10 을 적어도 80% 발현하는" "사람의 조혈 수지상 전구세포에 대해 농축된 조혈 세포"를 개시한다.
혈에서 DC 의 분리는 백혈구 직계(lin)-특이적 항원 패널(예를 들어, CD3, CD14, CD19 및 CD56)의 부재 및 HLA-DR, CD4 또는 CD33의 존재와 같은 다수의 면역표현형 기준에 기초한다. Romani et al. (1996) J. Immunol. Met. 196 : 137-151 ; Thomas et al. (1993) J. Immunol. 150 : 821-834 ; Thomas et al. (1994) J. Immunol. 153 : 4016-4028 ; O'Doherty et al. (1994) Immunol. 82 : 487-493 ; O'Doherty et al. (1993) J. Exp. Med. 178 : 1067-1076 ; Nijman et al. (1995) J. Exp. Med. 182 : 163-174 ; Ferbas et al. (1994) J. Immunol. 152 : 4649-4662 ; Heufler et al. (1996) Eur. J. Immunol. 26 : 659-668 ; Ito et al. (1999) J. Immunol. 163 : 1409-1419 ; Cella et al. (1999) Nature Med. 5 : 919-923 ; Robinson et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29 : 2769-2778 ; Olweus et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 : 12551-12556 ; Robert et al. (1999) J. Exp. Med. 189 : 627-636 ; 및 Kohrgruber et al. (1999) J. Immunol. 163 : 3250-3259.
비배양 혈액으로부터 분리된 DC 의 분석에서, 혈내의 DC 는 동형 세포 집단은 아니지만 적어도 2 집단의 혼합물인 것이 분명해졌다. Thomas et al.(1994); O'Doherty et al. (1994) ; Ito et al. (1999) ; Cella et al. (1999) ; Robinson et al. (1999) ; Olweus et al. (1997) ; Kohrgruber et al. (1999) ; Strobl et al. (1998) J. Immunol. 161 : 740-748 ; 및 Rissoan et al.(1999) Science 283 : 1183-1186. 첫번째 혈 DC 아집단은 CD123bright CDllc-DC이고, 이것은 형질세포 형태 및 효험있는 T 세포 자극 기능을 가진다. 두번째 혈 DC 아집단은 외관상 다소 단해세포양이고, CD45RO 를 발현하고, 어떤 외인성 사이토카인없이 배양된 경우에 조차 전형적인 성숙한 DC 로 자연 발생하는 CD123dim, CD11cbright 이다. 형질세포 CD123brightCD11C-DC 는 예비-T 세포 수용체 α사슬의 발현과 같은 어떤 특징을 나타내고, 이것은 림프 전구체에서 발생할 수 있음을 의미한다. Strobl et al. (1998) ; Rissoan et al. (1999) ; 및 Bruno et al. (1997) J. Exp. Med. 185 : 875-884. CD123dimCD1lcbrightDC 는 골수종 DC 의 모든 기준을 나타낸다. O'Doherty et al. (1994) ; 및 Ito et al. (1999). Robinson et al. (1999) ; Kohrgruber et al. (1999) ; 및 Strobl et al. (1998). 형질세포 CD123brightCD11c-DC 와 유사한 DC 는 림프 조직의 T 세포-풍부 영역에서 결실되었고, 그들의 형태 및 표현형때문에 초기에 형질세포 T 세포 또는 형질세포 단핵세포로 잘못 표시되었다. 백혈구 타이핑에서 Grouard et al. (1997) J. Exp. Med. 185 : 1101-1111 ; Lennert et al. (1975) Lancet 1 : 1031-1032 ; Lennert et al. (1984). 단일클론 항체에 의해 검출된 사람의 백혈구 분화. Bernard et al. eds. Springer-Verlag, Berlin ; 및 Facchetti et al. (1988) Am. J. Pathol. 133 : 15. CD123dimCD11cbright 혈 DC 와 유사한 DC 가 배중심의 암부 및 음부에서 발견되었다. Grouard (1996) Nature 384 : 364-367.
스플라이스 변이체
발현된 유전자의 추정된 총수는 40,000 내지 150,000 이상으로 분포한다. 많은 경우에, mRNA(transcriptome)로부터 하나 이상의 스플라이스 변이체가 이러한 유전자로부터 생산되었기 때문에, 숫자는 코딩된 많은 단백질의 정확한 반영은 아니다. 추정치는 또한 아마도 500,000 개의 상이한 mRNA 정도로 사람에서 생산된다. 적어도 30%의 사람 유전자가 몇 개의 스플라이스 변이체를 가진다는 것이 추정된 다. Mironov et al. (1999) Genome Research 9 : 1288-1293. 이들 수는 어느정도 보존적인 것으로 여겨진다. 이러한 수는 마우스 및 래트에도 적용되고, 택일적으로 스플라이싱은 Drosophila melanogaster 및 Caenorhabditis elegans 와 같은 하등생물에서도 발생한다고 여겨진다. 상이한 스플라이스 변이체로부터 번역된 단백질은 많은 증가일로의 논문에서 증명된 바와 같이, 의미있는 상이한 기능을 가질 수 있다. 상이한 스플라이스 변이체는 상이한 조직, 상이한 발생 단계 및 상이한 질환 상태에서 발현될 수 있다.
C-형 렉틴
C-형 렉틴은 그들의 탄수화물 인식 영역(CRD)에서 아미노산 서열 유사성을 나타내고, Ca2+-의존 방식으로 선택된 탄수화물에 결합하는 당단백질의 부류이다. C-형 렉틴은 4 범주로 더욱 세분화된다(Vasta et al., 1994 ; and Spiess 1990). 제1의 군은 아시아로당단백질 수용체, 대식세포 갈락토스 및 N-아세틸 글루코사민(GlcNac)-특이적 렉틴, 및 CD23(FcεRII)과 같은 II 형 멤브레인-통합 단백질을 포함한다. 이 집단의 많은 구성원은 갈락토스/퓨코스, 갈락토사민/GalNac 또는 GlcNac 잔기에 대한 특이성을 나타낸다. 제2의 군은 연골 및 섬유아세포 프로테오글리칸 코아 단백질을 포함한다. 제3의 군은 혈청 만노스-결합 단백질, 폐계면활성 단백질 SP-A, 및 교착소와 같은 소위 "콜렉틴"을 포함한다. 제4의 군은 LEC-CAM으로 알려진 어떤 부착 분자를 포함한다(예를 들어, Mel-14, GMP-140, 및 ELAM-1).
C-형 렉틴은 응집소, 옵소닌, 보체 활성제, 및 세포-결합 인식 분자로서 기능하는 것으로 알려진다(Vasta et al. 1994 ; Spiess 1990 ; and Kery 1991). 예를 들어, 대식세포 만노스 수용체는 스캐빈저 기능(Shepherd et al., 1990)뿐만 아니라, Pneumocystis carinii(Ezekowitz et al. 1991) 및 Candida albicans (Ezekowitz et al. 1990)를 포함하는 병원성 유기물의 섭취를 매개하는 기능을 한다. 혈청 만노스-결합 단백질은 전형적 경로를 통하여 보체를 활성화시키는 능력에서 Clq 를 모방한다. 렉틴에서 유전적 돌연변이로 중증의 재발성 감염, 설사, 및 성장장애에 걸리기 쉽다(Reid et al. 1994). 그러므로, C-형 렉틴은 생물학적 중요성을 가진 다양한 기능을 나타낸다.
탄수화물 부분은 반드시 C-형 렉틴에 대한 "천연" 리간드로 기능하는 것은 아니다. 예를 들어, Gal-Gal-Nac에 대한 그것의 결합(Kijimoto-Ochiai et al. 1994) 및 그것의 CRD 서열로서 확증된 바와 같이, C 형 렉틴에 속하는 CD23(FCεRII)가 현재 탄수화물-독립적 방식으로 IgE 를 인식하고; IgE 의 효소적 탈당화 형태뿐만 아니라 E.coli 에서 생산된 재조합(비글리코실화) IgE 모두 CD23 에 결합하는 것이 밝혀졌다. 그러므로, 어떤 C-형태 렉틴은 그들의 천연 리간드로 폴리펩티드 서열을 인식한다.
몇 개의 C-형 렉틴은 DC 표면상에서 동정되었다. 우선, Jiang et al. 은 뮤린 DC 에 대하여 가장 광범위하게 사용된 mAb 중 하나인, NLDC-145(nonlymphoid dendritic cells-145) mAB 에 의해서 인식된 단백질을 클로닝했다(Jiang et al., 1995). 현재 DEC-205 로 명명된 단백질은 10 개의 별개의 CRD 를 함유하는, C-형 렉티 부류의 새로운 구성원으로 밝혀졌다. 둘째로, Sallusto et al. 은 사람의 DC 가 역시 다수의 CRD 를 함유하는, 대식세포 만노스 수용체(MMR)를 발현한다는 것이 보고되었다(Sallusto et al., 1995). a) DEC-205 에 대한 다클론 래빗 항체는 DC 표면상의 DEC-205 에 결합될 뿐만 아니라, 순차적으로 내재화한다; b) DC 는 래빗 IgG 에 반응하는 T 세포계를 효과적으로 활성화시켰다; 그리고 c) DC 에 의한 FITC-덱스트란의 내재화는 만난, 만노스 수용체 경쟁자로 효과적으로 차단되었다는 관찰에 기초하여, 양 수용체는 DC 에 의하여 글리코실화 분자의 엔도시토시스를 매개하는 것으로 보고되었다(Jiang et al. 1995; 및 Sallusto et al. 1995). 세포 형태 특이성과 관련하여, DEC-205 는 더욱 낮은 수준이지만, 흉선, 창자, 및 폐에서 B 세포 및 내피 세포에 의해서 역시 발현되는 것으로 밝혀지고(Witmer-Pack et al. 1995 ; and Inaba et al. 1995) MMR 은 또한 대식세포에 의해서 더욱 풍부하게 발현된다(Stahl 1992). 다른 것은 DC 표면상에서 발견되었고, 이것은 DCIR(Dendritic Cell Immunoreceptor; 수지상세포 면역리셉터), MDL-1(Myeloid DAP12-associating Lectin-1), Dectin-1, Dectin-2, CLEC-1(C-type lectin domain family 1), CLEC-2, 랑게린(Langerin) ; 및 DC-sign(dendritic-cell-specific ICAM-3 grabbing non-integrin)을 포함한다.
알레르기
알레르기성 천식 및 알레르기성 비염 반응을 포함하는 알레르기 반응은 초기 반응의 특징이고, 이것은 알레르겐 노출의 수초 내지 수분내에 발생하고, 알레르겐 노출의 부위에 호산구 침윤을 특징으로 한다. 구체적으로, 알레르기 반응의 초기동안, Th2-형 림프구의 활성은 항원-특이적 IgE 항체의 생산을 자극하고, 이것은 차례로 히스타민 및 거대 세포 및 호염구로부터의 염증의 다른 매개자의 해리를 촉진 한다. 말기 반응동안, CD4+Th2 세포에 의한 IL-4 및 IL-5 생산이 증가된다. 이러한 사이토카인은 조직 손상 및 기능장애가 결과된 경우에 알레르기 노출 부위로의 호산구 동원에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다.
현재, 알레르기 장애에 대한 항원 면역요법은 소위 탈감작 요법으로 불리는 과정에서 적지만 점진적으로 증가하는 양으로 항원의 피하 주사를 포함한다. 항원 면역요법은 단지 완화하는 것이고 현재, 치료적이지 않다. Weber (1997) JAMA 278 : 1881-1887 ; Stevens (1998) Acta Clinica Beligica 53 : 6672 ; 및 Canadian Society of Allergy and Clinical Immunology (1995) Can. Med. Assoc. J. 152 : 1413-1419.
요법을 수용하는 많은 환자가 요법을 완결하지 않고, 만약 1 주 이상 주사하지 않는다면, 환자는 전치료 요법을 다시 시작해야만 한다. 다양한 항원이 동정되었고, 재조합 수단으로 생산되었다. 개관을 위해서, Baldo et al. (1989) Allergy 44 : 81-97 ; Baldo (1991) Curr. Opin. Immunol. 3 : 841-850 ; Blaser (1994) Ther. Umsch 51 : 19-23 ; 및 Valenta et al. (1996) Adv. Exp. Med. Bio. 409 : 185-196 참조.
항원 면역요법 치료는 잠재적으로 치명적인 IgE-매개 아나필락시를 유도하는 위험이 현존하고, 알레르기 후기 반응의 사이토카인-매개 사건에 접근하지 않는다. 본 요법은 " 불운에 대한 잠재성을 가지는 것"으로 개시되었다. Weber (1997). 항원 면역요법이 가지는 다른 심각한 문제는 역반응, 특히, 아나필락시의 위험이 투여당 허여된 양 및 투여시간동안 허여된 양 모두와 관련하여 항원의 투여량을 현저 히 감소시킨다는 것이다. 그러므로, 전통적인 알레르기 면역요법은 지연되고, 시간-소모적이고, 불편하고, 비용이 많이 든다.
알레르기와 같은 IgE 결합 장애의 치료에 관한 다른 접근법은 히스타민 해리를 억제하는 화합물의 투여를 포함한다. 많은 이러한 약물이 역치료제로서 이용가능하다. 다른 약제는 항-IgE 결합 항체를 포함한다. 그러나, 이러한 접근법의 단점은 그것은 단지 징후를 차폐하는 반면에, 어떤 종류의 영구적인 치료 또는 예방을 제공하지는 않는다는 것이다.
발명의 개요
본원 발명은 DC 및 그것의 서브셋에서 농축된 조혈 세포집단을 농축시키는 방법에 관한 것이다. 본원발명은 또한 세포 및 그로부터 얻어진 세포집단이 농축된 조성물을 제공한다. 유전적으로 변형된 DC 를 만드는 방법 역시 제공된다. 유전적으로 변형된 DC의 조성물 역시 제공된다. 세포의 사용 방법이 또한 포함된다. BDCA-2(Blood Dendritic Cell Antigen-2; 혈액 수지상세포 항원-2) 및 BDCA-3 및 그에 의해 인식된 항원에 특이적인 항원-결합 단편이 또한 제공된다.
본원발명은 항체 표시 AC144, AD5-1311, AD5-20E5, AD5-17F6, AD5-4B8, AD5-5E8, AD5-14H12 또는 AD5-8E7에 의해서 특이적으로 인식된 DC 의 서브셋에 특이적인 항원 결합 단편을 포함한다. 본원발명은 항원 표시 BDCA-2(SEQ ID NO:)의 에피토프에 특이적인 항원-결합 단편을 포함한다. 본원발명은 항원 표시 BDCA-3 의 에피토프에 특이적인 항원-결합 단편을 포함한다.
본원발명은 본원발명의 항원-결합 단편에 의해서 특이적으로 인식된 실질적 으로 분리 또는 농축 DC 집단 또는 아집단을 포함한다. 이러한 항원-결합 단편은 AC144, AD5-1311, AD5-20E5, AD5- 17F6, AD5-4B8, AD5-5E8, AD5-14H12 또는 AD5-8E7 중 어느 하나이거나 BDCA-1, BDCA-2, BDCA-3 또는 BDCA-4에 특이적인 항원 결합 단편일 수 있다. 뉴로필린-1 을 인식하는 항원-결합 단편이 또한 BDCA-4를 인식할 수 있고, 본원에의 사용에 적합하다.
본원발명은 더욱이 DC 의 집단 및 아집단을 포함하고, 여기에서 실질적으로 모든 세포는 BDCA-1, BDCA-2, BDCA-3 및 BDCA-4의 적어도 하나의 발현에 기초하여 분리, 농축 또는 계수된다. 이러한 세포는 생리적으로 허용가능한 부형제에서 현탁될 수 있다. 바람직하게, 부형제는 약학적으로 허용가능하다.
본원발명은 더욱이 분획내의 적어도 80%의 세포가 BDCA-1+ 인 분획으로 사람의 조혈세포의 혼합물을 분리함으로써 DC 가 농축된 조혈세포의 조성물을 얻는 방법을 포함한다.
본원발명은 더욱이 분획내의 적어도 80%의 세포가 BDCA-2+ 인 분획으로 사람의 조혈세포의 혼합물을 분리함으로써 DC 가 농축된 조혈세포의 조성물을 얻는 방법을 포함한다.
본원발명은 더욱이 분획내의 적어도 80%의 세포가 BDCA-3+ 인 분획으로 사람의 조혈세포의 혼합물을 분리함으로써 DC 가 농축된 조혈세포의 조성물을 얻는 방법을 포함한다.
본원발명은 더욱이 분획내의 적어도 80%의 세포가 BDCA-4+ 인 분획으로 사람의 조혈세포의 혼합물을 분리함으로써 DC 가 농축된 조혈세포의 조성물을 얻는 방법을 포함한다.
본원발명은 더욱이, a)사람의 조혈세포의 혼합물을 얻는 단계, 및 b)항원 표시 BDCA-2 에 특이적인 항원-결합 단편에 의해서 특이적으로 인식된 혼합물에서 실질적으로 세포를 분리하는 단계에 의해서 DC 의 실질적으로 순 서브셋을 분리하는 방법을 포함한다.
본원발명은 더욱이, a)사람의 조혈세포의 혼합물을 얻는 단계, 및 b)항원 표시 BDCA-3 에 특이적인 항원-결합 단편에 의해서 특이적으로 인식된 혼합물에서 실질적으로 세포를 분리하는 단계에 의해서 DC 의 실질적으로 순 서브셋을 분리하는 방법을 포함한다.
본원발명은 더욱이, a)사람의 조혈세포의 혼합물을 얻는 단계, 및 b)항원 표시 BDCA-4 에 특이적인 항원-결합 단편에 의해서 특이적으로 인식된 혼합물에서 실질적으로 세포를 분리하는 단계에 의해서 DC 의 실질적으로 순 서브셋을 분리하는 방법을 포함한다.
본원발명은 더욱이 a)세포의 혼합물을 얻는 단계, 및 b)어느 하나 이상의 항원 BDCA-1, BDCA-2, BDCA-3, 및 BDCA-4 에 대하여 특이적인 항원-결합 단편으로 세포를 표지하는 단계에 의해서 DC 를 계수하는 방법을 포함한다.
본원발명은 더욱이 DC 의 실질적으로 순집단 또는 아집단을 분리하는 단계; 및 DC 의 칼슘 이동을 조정하는 단계에 의해서 DC 의 면역능을 조정하는 방법을 포함한다.
본원발명은 더욱이 어느 하나 이상의 BDCA-1, BDCA-2, BDCA-3, 및 BDCA-4에 특이적인 항원-결합 단편을 가지는 실질적인 DC 의 순집단 또는 아집단을 분리하는 단계; 시험 약제로 분리된 세포를 스크리닝하는 단계; 약제에 대한 세포의 반응을 모니터하는 단계; 약제에 대한 세포의 반응과 대조군 약제에 노출된 세포에 대한 반응을 비교하는 단계; 및 시험 약제가 분리된 세포의 어떤 하나의 면역성질을 조정하였는지를 결정하는 단계에 의해서 약학적으로 유효약제의 존재 여부에 대한 시험 약제를 스크리닝하는 방법을 포함한다.
본원발명은 더욱이 칼슘을 이동시키는 DC 의 능력을 변형시킴으로써 DC 의 면역성질을 조정하는 방법을 포함한다.
본원발명은 더욱이 바람직하게는 생리적으로 허용가능한 부형제내에 DC 의 면역 및 면역조정 조성물을 포함한다.
본원발명은 더욱이 그것을 필요로 하는 피험자에 DC 의 면역 또는 면역조정 조성물의 유효량을 투여함으로써 생리 상태를 치료하는 방법을 포함한다.
본원발명은 더욱이 어느 하나 이상의 BDCA-1, BDCA-2, BDCA-3, 및 BDCA-4에 대하여 특이적인 항원-결합 단편을 가지는 DC 의 순집단 또는 아집단을 실질적으로 분리하고; 세포 또는 세포 생산물 또는 상청액에서 사이토카인을 분리함으로써 DC 사이토카인을 생산하는 방법을 포함한다.
본원발명은 더욱이 어느 하나 이상의 BDCA-1, BDCA-2, BDCA-3, 및 BDCA-4에 특이적인 항원-결합 단편을 가지는 DC 의 순집단 또는 아집단을 실질적으로 분리하고; DC 사이토카인 생산을 조절하는 약제로 세포를 치료함으로써 DC 사이토카인 생산을 조정하는 방법을 제공한다.
본원발명은 더욱이 DC 사이토카인 생산을 조정하는 약제의 유효량을 그것을 필요로 하는 피험자에 투여함으로써 생체내 DC 사이토카인 생산을 조정하는 방법을 포함한다.
본원발명은 더욱이 항원이 로딩되고, 어느 하나 이상의 BDCA-1, BDCA-2, BDCA-3, 및 BDCA-4에 특이적인 항원-결합 단편으로 분리되고, Th2 반응을 유도하도록 조정된, 실질적인 DC 의 순집단 또는 아집단의 유효량을 그것을 필요로 하는 피험자에 투여함으로써 항원에 특이적인 항체를 발생시키는 방법을 포함한다.
본원발명은 더욱이 항원이 로딩되고, 어느 하나 이상의 BDCA-1, BDCA-2, BDCA-3, 및 BDCA-4에 특이적인 항원-결합 단편으로 분리되고, Th1 반응을 유도하도록 조정된, 실질적인 DC 의 순집단 또는 아집단의 유효량을 그것을 필요로 하는 피험자에 투여함으로써 항원에 특이적인 T 세포 또는 체액성 면역 반응을 유도하는 방법을 포함한다.
본원발명은 더욱이 재조합 숙주 세포에서 SEQ ID NO:2 로부터 5 개의 인접한 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드를 발현시키고, 총 재조합 숙주 세포 성분으로부터 발현된 폴리펩티드를 정제함으로써 제조된 폴리펩티드를 포함한다.
본원발명은 더욱이 SEQ ID NO:2 로부터 약 5 개의 인접한 아미노산 잔기를 함유하는 정제된 폴리펩티드 및 그것의 조성물을 포함한다.
본원발명은 더욱이 SEQ ID NO:2 가 아닌 폴리펩티드 아미노산 서열에 연결된, SEQ ID NO:2 의 약 5 개의 인접한 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드 아미노산 서열의 융합 단백질을 포함한다.
본원발명은 BDCA-2의 적어도 하나의 스플라이스 변이체를 함유하는 폴리펩티드를 포함한다.
본원발명은 더욱이 BDCA-2의 적어도 5 개의 인접한 아미노산 잔기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 보체, 스플라이스 변이체 또는 그것의 단편을 포함한다.
본원발명은 더욱이 BDCA-2의 적어도 5 개의 인접한 아미노산 잔기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 보체, 스플라이스 변이체 또는 그것의 단편을 함유하는 재조합 숙주세포를 포함한다.
본원발명은 더욱이 BDCA-2, BDCA-3, 또는 BDCA-4 와 T 세포의 상호작용을 억제하는 약제의 유효량으로 DC 및 T 세포를 함유하는 조성물과 접촉시킴으로써 T 세포와 DC 의 상호작용을 억제하는 방법을 포함한다.
본원발명은 더욱이 피험자에서 염증을 감소시키기에 유효한 T 세포와 BDCA-2, BDCA-3, 또는 BDCA-4 의 상호작용을 억제하는 약제의 양으로 그것을 필요로 하는 환자에 투여함으로써 염증을 치료하는 방법을 포함한다.
본원발명은 더욱이 세포에서 BDCA-2 안티센스 폴리뉴클레오티드를 발현함에 의해서 세포에서 BDCA-2 의 발현을 억제하는 방법을 포함한다.
본원발명은 더욱이 BDCA-2의 적어도 5 개의 인접한 아미노산 잔기를 코딩하 는 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 보체, 스플라이스 변이체 또는 그것의 단편을 함유하는 트랜스제닉 동물을 포함한다.
도1은 Ficoll-플라크 밀도 구배 원심분리로 분리된 말초혈 단핵 세포(PBMC)의 분석으로부터의 도트 플럿을 도시한다. 도1에서, PBMC 상의 BDCA-2, BDCA-3 및 CD1c(BDCA-1)의 발현이 도시된다.
도1a는 각각 BDCA-2(AC144), BDCA-3(AD5-5E8) 및 CDIc(AD5-8E7)에 대한 FITC-융합 mAb, 및 TCRαβ헤테로다이머, CD14, CD19 및 CD56에 대한 PE-융합 mAb 로의 PBMC 염색을 도시한다. 숫자는 각 사분면상의 세포의 비율을 나타낸다. 프로피디움 요오드 형광 및 빛산란 신호를 간 세포의 통로에 사용했다.
도1b는 (a) PBMC, (b) 통로BDCA-2+세포, (c) 통로 BDCA-3+세포 및 (d) 통로 CDIc+ 세포의 산란 프로파일을 도시한다.
도2는 3 개의 별개의 혈 DC 서브셋에서 발현된 BDCA-2, BDCA-3, BDCA-4 및 CDlc(BDCA-1)을 도시한다. 혈 DC 는 CD3, CD1lb 및 CD16 양성 세포를 결핍시키고, 이어서 CD4 양성 세포를 농축시켜서 PBMC 로부터 분리했다. 혈 DC 의 순도를 빛 산란 성질(좌 도트플럿) 및 항 HLA-DR-Cy5 vs. 항-Lin-FITC(항-TCRαβ, CD14, CD19 및 CD56)염색(중간 상위 도트플럿)으로 나타낸다. lin+ 세포가 거의 존재하지 않음에 주목하라. 혈 DC 에서 BDCA-2, BDCA-3, BDCA-4 및 CDlc 의 발현은 CD11c, CD123 및 항원 그자체에 대한 PE- 및 FITC-융합 mAb 로의 일련의 이색 염색으로 특징화된다. BDCA-2, BDCA-3, BDCA-4 및 CDlc는 3 개의 구별되는 혈 DC 서브셋 각각 중 단지 하나에서 배타적으로 발현됨에 주목하라. 서브셋은 CD123-PE vs. CD11c-FITC(좌 도트플럿)로의 혈 DC 의 염색에 따라 정의된다 : CD11c-CD123bright 혈 DC ; CDl1cbrightCD123dim 혈 DC ; 및 CDllcdimCD123-혈 DC.
도3은 PBMC 상의 BDCA-4 의 발현을 도시한다. BDCA-2(AC144)에 대한 FITC 융합 및 mAb BDCA-4 (AD5-17F6)에 대한 PE-융합 mAb 로의 PBMC 의 이색 염색이 도시된다. 소량의 양성 (BDCA-2+BDCA-4-및 BDCA-2-BDCA-4+) PBMC 가 검출된다는 것에 주목하라.
도4는 IL-3 의 존재하에서 다양한 배양기간동안 정제된 혈 DC 상에서 BDCA-2, BDCA-3 및 BDCA-4 의 발현을 도시한다. 정제된 혈 DC 를 rIL-3 의 존재하에서 0 h, 1 h, 3 h, 6 h, 9 h, 12 h, 18 h, 24 h, 36 h, 및 48 h 동안 배양했고, 그 다음 유동 세포계측법으로 CDllc, BDCA-3, BDCA-2 및 BDCA-4의 발현을 분석했다. (a) 히스토그램은 각각 PE-융합 항-BDCA-2 mAb(AC144) 및 항-BDCA-4 mAb(AD5-17F6)(굵은 선), 및 PE 융합 이소형-매칭 대조 mAb(흐린 선)으로 통로 CDllc- 및 CDllc+ 혈 DC의 염색을 도시한다. 도트 플럿은 CD11c-PE 를 가진 혈 DC 의 염색 vs. 항-BDCA-3(AD5-5E8) 비오틴/스트렙타비딘-APC를 가진 혈 dc 의 염색을 도시한다. (b) 도표는 각각 항-BDCA-2-PE, 항-BDCA-4-PE, 및 항-BDCA-3 비오틴/스트렙타비딘-APC 염색의 CDllc(▲)및 CDllc+(■)DC 에 대한 평균 형광 강도(MFI)이다. BDCA-2 및 BDCA4의 경우에, MFI값은 각각 AC144 및 AD5-17F6 로 얻어진 값에서 이소형 대조 mAB 로 얻어진 값을 뺌으로써 계산한다. BDCA-3 의 경우에, MFI 값은 AD SE8 으로 얻어진 값에서 어떤 염색한 mAb(자가형광)이 없이 얻어진 값을 값을 뺌으로써 계산한다.
도5는 발현된 6 개의 엑손을 가지는 BDCA-2 의 하나의 이소형의 아미노산 서열을 도시한다(SEQ ID NO:2).
도6는 BDCA-1 특이적 mAb AD5-8E7 이 MOLT-4 세포에 대한 CD1c mAb M241 의 결합을 차단한다는 것을 도시한다. MOLT-4 세포(급성 림프액 아구성 백혈병 세포)는 AD5-8E7 mAb(굵은 선) 또는 동위원소 대조군 mAB(흐린 선)의 포화량으로 예비 인큐베이션했고, 그 다음 PE 융합 CD1c mAb(M241)로 염색했다.
도7은 Mo-DC 및 CD34+세포 유래 DC(CD34-DC)상에서 BDCA-2, BDCA-3 및 BDCA-4 의 발현을 도시한다. CD14+ 단핵세포 및 CD34+ 조혈 전구체 세포를 각각 CD14 및 CD34 mAb-융합 미세구슬로의 직접적인 자기 표지에 의해서 면역자기로 정제했다. 정제된 단핵세포를 rGM-CSF 및 rIL-4 의 존재하에서 7 일간 배양했고, 정제된 CD34-DC 를 rflt3-리간드, rTGF-βl, rTNF-α, rSCF 및 rGM-CSF 의 존재하에서 11 일간 배양했다. 배양기간후에, 세포를 CDla-FITC, CDlc-PE(AD5-8E7), 항-BDCA-2-PE (AC114), 항-BDCA-3-PE(AD5-SE8) 및 항-BDCA-4-PE(AD5-17F6)으로 염색했다. 히스토그램은 각각 (A)Mo-DC 및 (B)CD34-DC(굵은 선)로의 염색을 도시한다. 연한 선은 이소형 대조군 mAb 로의 염색을 도시한다. 가장 왼쪽의 히스토그램을 제외하고(CD1a 염색), 관문 CD1a+세포는 (b)에 도시된다.
도8은 항-BDCA-2 mAb-표지 BDCA-2+ 세포가 빠른 mAb 내재화를 초래한다는 것을 도시한다. PBMC 를 FITC-융합 항-BDCA-2 mAb(AC144, IgGl)로 4℃에서 표지했고, 지시된 시간동안 37℃에서 인큐베이션한 다음, PE-융합 래트 항-마우스 IgG1 mAb(X56) 및 Cy5-융합 CD123 mAb(AC145, IgG2a)로 4℃에서 염색했다. 관문 BDCA-2+CD123+ 세포를 염색하는 항-BDCA-2-FITC(■) 및 래트 항-마우스 IgG1 mAb-PE(▲)의 MFI 값이 도시된다.
도9는 면역자기로 정제된 CDlc+, BDCA-2+ 및 BDCA-3+ 혈 DC의 형태를 도시한다. CDlc+, BDCA-2+ 및 BDCA-3+ 세포를 PE-융합 제1의 mAb (AD5-8E7, AC144 및 AD5 5E8)와 항-PE mAb-융합 미세구슬로 간접 자기 표지하고 MACS로 표지된 세포를 농축시켜 PBMC로부터 분리했다. 도트플럿은 각각 CDIc+(상위 도트플럿) BDCA-2+ (중위 도트플럿) 및 BDCA-3+ (하위 도트플럿) 세포의 자기 농축 전(좌 도트플럿) 및 후 (우 도트플럿)에 HLA-DR-FTTC 및 PE-융합 mAb 로 PBMC 의 염색을 도시한다. 우측의 3 개의 도면은 도시는 세포원심후에 분리된 CD1c+(상위 도면), BDCA-2+(중간 도면) 및 BDCA-3 세포의 May Grunwald/Giemsa 염색을 도시한다. 작은 림프구가 농축된 CD1c+세포의 도면에 도시될 수 있다. 이들은 CDlc+ B 세포이다.
도10은 배양상의 CDlc+, BDCA-2+ 및 BDCA-3+ 에 대한 MHC 유형 II, CD83 및 공자극 분자의 상향-조절을 도시한다. 정제된 CDlc+(A), BDCA-2+ (C) 및 BDCA-3+ (B)를 CD32-트랜스펙션된 L 세포(BDCA-2+ DC)상에서 각각 (CDlc+ 및 BDCA-3+ BDC)배지에서 1 일동안, 또는 rIL-3 및 항-CD40 mAb 를 가진 배지에서 2일동안 배양했다.rGM-CSF 및 rIL-4 의 존재하의 배지에서 7 일동안 단핵세포의 배양으로 "미성숙"Mo-DC(D)가 발생되었다. TNFα가 존재하는 배지에서 또다른 3 일동안 미성숙 Mo-DC 의 배양으로 "성숙한" Mo-DC(E)가 발생되었다. 히스토그램은 각각 CDla-FITC, CD80-PE, CD83-PE, CD86-PE 및 HLA-DR-PE 로 염색하는 세포를 도시한다(굵은 선). 흐린 선은 이소형 및 형광색소-매칭 대조군 mAb 로 염색하는 세포를 도시한다.
도11은 정제된 CD3+ T 세포와 비교하여 새로 분리된 CDlc+, BDCA-2+ 및 BDCA-3+ 혈 DC의 엔도시토시스를 도시한다. 분리된 CD1c+DC(◆), BDCA-2+ BDC(▲), BDCA-3+DC(■) 및 CD3+T 세포(*)를 0, 15, 45 ALC 75 분동안 1 mg/ml Lucifer Yellow(LY)를 함유한 배지에서 37℃로 인큐베이션했고, 아이스 PBS/EDTA/BSA 에서 3 번 세척했고, 그다음 세포흘림 계수법으로 분석했다. LY 의 부재시에 4℃에서의 인큐베이션으로 얻은, MFI 값을 뺀 후에 LY 형광에 대한 MFI 값이 도시된다.
도12는 BDCA-2의 cDNA 서열을 도시한다(SEQ ID NO:1)
도13은 세포내 Ca2+ 이동이 면역자기로 정제된 BDCA-2+BDCA-4+ 혈 DC(A, B) 및 BDCA-2-트랜스펙션된 U937 세포(D)로 유도되지만, 항-BDCA-2 mAb 단독(A) 및/또는 항-BDCA-2 와 교차결합 제2의 mAb(B, D, E)에 의한 비트랜스펙션된 U937 세포(E)로는 유도되지 않는다는 것을 도시한다. 면역자기로 정제된 BDCA-2+BDCA-4+ BDC와 항 -BDCA-4 mAb 및 교차결합 제2의 mAb 의 연결은 세포간 Ca2+ 이동을 유도하지 않는다. 시간에 따라 인도-1-형광(Y축)의 Ca2+ 의존성 405nm/525nm 비가 도시된다(X-축, 1024 의 값은 204 에 해당한다, 80초). a 는 BDCA-2+BDCA-4+ 혈 DC, 항-BDCA-2 (AC144, IgGl)이다. b는 BDCA-2+BDCA-4+ 혈DC, 항-BDCA-2(AC144, IgG1)와 래트 항-마우스 IgG1(X56)이다. c는 BDCA-2+BDCA-4+ 혈DC, 항-BDCA-4(AD5-17F6, IgG1)과 래트 항 마우스 IgG1(X56)이다. d는 BDCA-2 트랜스펙션된 U937 세포, 항-BDCA-2 (AC144,'IgGI)와 래트 항-마우스 IgGI(X56)이다. e는 비트랜스펙션된 U937 세포, 항-BDCA-2(AC144, IgG1)와 래트 항-마우스 IgGI (X56)이다.
도14는 특이적 mAb 로 BDCA-4 가 아닌 BDCA-2 에의 연결에 이어서, 제2의 교차결합 mAb 는 인플루엔자 바이러스 균주 PR8 로의 자극에 반응하여 혈 또는 편도로부터 형질세포 BDCA-2+BDCA-4+DC 에 의해서 I 형 인터페론의 분비를 억제한다는 것을 도시한다. 새로 분리된 혈(a) 또는 편도(b)를 IL-3 단독(대조군), IL-3, 항-BDCA-2 mAb 및 래트 항-마우스 IgGI mAb (AC144+RamGl); IL-3, 항-BDCA-2 mAb, 래트 항-마우스 IgG1 mAb, 및 인플루엔자 바이러스 균주 PR8(AC144+RamGl+FLU); IL-3 및 인플루엔자 바이러스 균주 PR8(FLU); IL-3, 항-시토케라틴 mAb, 래트 항-마우스 IgG1 mAb, 및 인플루엔자 바이러스 균주 PR8(CK3+RamGl+FLU); IL-3, 항-BDCA-4 mAb, 래트 항-마우스 IgG1 mAb, 및 인플루엔자 바이러스 균주 PR8(17F6+RamGl+FLU)의 존재하에서 24 시간동안 배양했다. 배양 상청액에서 분비형 I 인터페론(U/ml)을 표준형 I 인터페론(U/ml)커브와의 관계에서 생체분석으로 측정했다.
도15는 분리된 BDCA-2 및 BDCA-4 발현 플라스미드양 DC 로 마우스 IgG1 에 특이적인 T 세포 클론에 항-BDCA-2 mAb(AC144, IgG1)의 제시를 도시한다. BDCA-2+BDCA-4+ 형질세포 DC 는 항-ILT-3 mAb (ZM3.8, IgG1,▲) 및 항-시토케라틴 mAb (CK3-llD5, IgG1,●)보다 더욱 효과적으로 T 세포에 항-BDCA-2 mAb(AC144, IgG1,■)를 제시한다.
도16은 편도 형질세포 CD123+DC 상의 BDCA-2 및 BDCA-4 의 발현을 도시한다.
도17은 뉴로필린-1(GenBank Accession No. 003873)이 뉴로필린-1-트랜스펙션된 PEA 세포(NP)의 세포 융해액으로부터 면역침전되지만, 항-BDCA-4 mAb AD5-17F6(항-NRP-1(ML))을 가진 비트랜스펙션된 PAE 세포(P)는 면역침전되지 않는다. 침전된 단백질을 SDS-PAGE 와 Shay Soker, Children's Hospital, Boston, MA (S)로부터의 BDCA-4 특이적 mAb AD5-17F6(ML) 또는 뉴로필린-1-특이적 mAb 와 함께 웨스턴 블럿으로 분석했다. .
도18은 특이적 mAb 와 함께 BDCA-4 가 아닌 BDCA-2 의 연결에 이어서 제2의 교차결합 mAb 가 폴리 I:C로의 자극에 반응하여 혈 또는 편도로부터 형질세포 BDCA-2+BDCA-4+DC 에 의한 INF-α의 분비를 억제한다는 것을 도시한다. 혈액유래 형 질세포 BDCA-2+BDCA-4+DC를 30 분동안 37℃에서 10㎍/ml 의 AC144 mAb(2 및 4) 또는 마우스 IgG1 mAb(CF6B, 항-TPO, 1 및 3)와 함께 배양했다.
도19는 CLONTECH (래인1: 심장; 래인2: 뇌; 래인3: 태반; 래인4 : 폐; 래인5 : 간; 래인6: 골격근; 래인7 : 신장; 래인8: 췌장; 래인9: 비장; 래인10: 흉선; 래인11: 고환; 래인12: 난소; 래인13: 작은 창자; 래인14: 림프절; 래인15: 골수; 래인16: 태아간; 래인17: 편도)로부터 사람의 다수 조직 cDNA 패널의 분석 및 BDCA-2 cDNA 에 대한 혈 백혈구(래인18: T 세포; 래인19: B 세포; 래인20: NK 세포; 래인21: 단핵세포 ; 래인22: CDllcbrightCD123lowBDC; 래인23: CD11c-CD123bright형질세포 DC)의 상이한 집단으로부터 제조된 cDNA의 분석을 도시한다. 대조군은 G3PDH 이다.
도20은 BDCA-2 전사체의 스플라이스 변이체를 도시한다. 스플라이스 변이체를 발현 분석에서 사용된 BDCA-2 에 대한 특정 프라이머를 사용하여 RT-PCR 에 의해 분석했다. 증폭된 단편을 플라스미드 벡터에 클로닝하였고, 서열결정했다.
도21은 Dectin-2 전사체의 스플라이스 변이체를 도시한다.
도22는 연역된 인트론의 정확한 위치가 표시된 BDCA-2 및 마우스 Dectin-2 의 mRNA 서열의 배열을 도시한다. 도23 에서, *는 모든 배열 서열에서 동일한 보존 잔기를 나타내고, : 는 보존 치환을 나타내며, . 는반보존 치환을 나타내고, 그늘진 영역은 보존 카르보히드레이트 인식 도메인(CRD)을 표시하고, 이탤릭체는 추정되는 트랜스멤브레인 도메인을 도시한다. 하기의 심벌은 CRD 내의 C-형 렉틴간에 가장 보존된 잔기를 강조한다.
H 소수성
A 지방족
C 시스테인
G 글리신
E 글루탐산
W 트립토판
△ 방향족 아미노산
+ 탄수화물의 칼슘-의존성 결합에 포함된 잔기
+P++ 탄수화물-결합 특이성을 결정하는 영역
도23은 사람 BDCA-2, 사람 DCIR 및 마우스 Dectin-2 의 아미노산 서열의 배열을 도시한다.
도24는 BDCA-3-특이적 mAb AD5-14H12(IgG1)로 표면 비오틴화 HD-MY-Z 세포의 세포 융해액으로부터 BDCA-3 면역침전을 도시한다. 특이성의 조절을 위해서, CD19-특이적 mAb SJ25-C1(IgGI)을 사용했다. 침전된 단백질을 SDS-PAGE(4-12%) 및 스트렙타비딘 과산화효소와 함께 웨스턴 블럿으로 분석했다. BDCA-3-특이적 mAb AD5-14H12는 HD-MY-Z 세포로부터 약 100 kD 의 세포 표면을 특이적으로 면역침전시킨다. 그러므로, BDCA-3 는 외관상 100 kD 의 분자량을 가진다.
본원발명은 DC 및 그것의 서브셋에서 농축된 세포집단을 농축시키는 방법에 관한 것이다. 본원발명에서 DC 및 그것으로부터 얻어진 세포집단으로 농축된 조성물이 제공된다. 변형된 세포에 대한 방법 및 조성물이 또한 제공된다. 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 변형된 세포의 조성물이 또한 제공된다. 변형 및 비변형 세포의 사용방법이 제공된다. 항원-결합 단편 및 그에 의해 인식된 항원이 또한 제공된다.
3 개의 DC 항원: BDCA-2, BDCA-3 및 BDCA-4 를 동정하는 면역자기로 정제된 CD4+lin-DC 에 대하여 유래된 새로운 mAb 의 패널이 본원에 개시된다. BDCA-2 및 BDCA-3 가 신규하다. BDCA-4 의 경우에, 이전에 DC-특이적 항원으로 개시되지 않았지만, 항원은 신경 세포 유도를 매개하는 콜랍신/세마포린 부류의 수용체, 뉴로필린-1 으로 동정되었다. He et al. (1997) Cell 90 : 739-751.
비배양 사람의 혈에서, BDCA-2 및 BDCA-4 의 발현은 형질세포 CD123bright CDllc-DC에 엄격하게 한정되는 반면에, BDCA-3의 발현은 CD123-CD11cdimDC 의 작은 집단에 제한된다. BDCA-3+ DC 집단은 전형적인 CD123dimCD11cbrightDC 와 많은 면역표현형 특징을 공유하지만, CD123dimCD11cbrightDC와 달리, BDCA-3+DC 는 CD1c(BDCA-1), CD2 및 몇몇의 Fc 수용체의 발현이 결핍된다.
DC 의 비정제원은 당업계에 알려진 골수, 또는 예를 들어, 태아 간, 말초혈 또는 탯줄 혈 편도, 림프절, 비막, 비장, 피부, 기도 상피세포, 폐, 간 장관, 페이어반등과 같은 태아, 신생아 또는 성체 또는 다른 조혈세포원일 수 있다. DC 는 또한 전구체 세포로부터 유래된 DC 와 같은 배양 세포로부터 분리될 수 있다. 다양한 기술이 세포를 분리하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 음성 선택 방법은 1차적 으로 비-DC 를 제거할 수 있다. mAb 는 특정 세포계와 연결된 마커 및/또는 양성 및 음성 선택 모두의 분화 상태를 동정하는데 특히 유용하다.
원한다면, 처음에 궁극적으로 분화된 세포의 많은 비율을 상대적으로 조(租)음성분류를 사용하여 제거할 수 있다. 예를 들어, 1차적으로 자기구슬 분류가 많은 수의 무관련 세포를 제거하는데 사용될 수 있다. 총세포의 적어도 약 80%, 일반적으로 적어도 70%가 DC 의 분리전에 제거될 것이다. 바람직하게, DC 는 양성 선택으로 세포원으로부터 직접 분리된다.
분리 과정은 제한은 없지만, 밀도 구배 원심분리; 로제트형성; 세포 밀도를 변형시키는 입자에의 결합; 항체-코팅 자기구슬 또는 항체 코팅 페로액(nonoporticle)으로 자기 분리; 친화성 크로마토그래피; 제한은 없지만, 보체 및 세포독소를 포함하는 mAb 와의 결합 또는 융합에 사용된 세포독성 약제; 및 예를 들어, 플레이트, 세광 또는 다른 어떤 용이한 기술과 같은 고체 매트릭스에 부착된 항체로의 패닝을 포함한다.
정학한 분리 및 분석을 제공하는 기술은 제한은 없지만 예를 들어, 다수의 색채널, 저각 및 둔광 산란 검출 채널, 임피던스 채널 등과 같은 다양한 정도의 정교화를 가질 수 있는 자기구슬 분리 및 유동 세포계측법을 포함한다.
세포는 프로피디움 요오드(PI)와 같은 사멸 세포와 결합된 염료를 사용하여 사멸 세포에 대하여 선택될 수 있다. 바람직하게, 세포는 태아 송아지 혈청(FCS) 또는, 사람 혈청 알부민(HSA) 또는 어떤 다른 적합한, 바람직하게는 무균, 등장성 배지와 같은 2% 혈청을 포함하는 배지에서 수거된다. 생리 지표의 경우에, HAS 가 바람직하다. 세포의 유전적 변형은 재조합 DNA 구성체를 가진 실질적으로 동형 세포 조성물의 형질전환, RNA로의 트랜스펙션, 세포 융합, 항원과 함께 로딩 및 당업계 및/또는 본원에 개시된 알려진 다양한 방법으로 유지동안 어떤 시점에서 이루어질 수 있다.
세포 변형의 경우에, 래트로바이러스 벡터가 사용될 수 있으나, 어떤 다른 적합한 벡터, 송달 시스템 또는 세포성 변형이 사용될 수 있다. 이것은 예를 들어, 아데노바이러스, 아데노 결합 바이러스, 효모로부터 유래된 인공 염색체 및 종양과 같은 항원 원으로부터 유래된 RNA 를 포함한다. 존재한다면, 성숙한 DC 가 제한된 수명을 가지는 것처럼 유전적 변형은 영구적일 필요가 없다. 유전적 접근법은 면역 또는 내성을 유도하기 위한 DC 내의 외래(종양, 바이러스, 기생충 등)항원 또는 자가항원을 발현하는데 사용될 수 있다. 변형의 지속성은 또한 요법을 제한하는 자살 유전자에 의해서 제어될 수 있다(T 세포와 함께).
형질전환 방법은 제한은 없지만, 당업계에 알려진 예를 들어, Bregni et al. (1992) Blood 80 : 1418-1422 에 개시된 방법과 같은 생산 세포를 가진 세포의 직접 공배양, 또는 Xu et al. (1994) Exp. Hemat. 22 : 223-230; 및 Hughes et al. (1992) J. Clin. Invest. 89 : 1817 에 개시된 방법과 같은 적합한 성장 인자 및 다가양이온의 존재 또는 부재로 단지 바이러스 상청액으로의 배양을 포함한다.
숙주에 항원을 제시하기 위해서 항원을 발현하거나 항원으로 로딩된 변형된 세포의 재도입의 경우에, T 세포는 활성화, 아네르기화 또는 결실되고, 항원에 대하여 특이적으로 지시된다. 일반적으로, 적합한 항원은 바이러스 감염 세포, 또는 암세포, 세균, 효모, 원충, 자가항원(면역관용원) 및 알레르겐으로 발현된 것을 포함한다. 더욱 구체적으로, 적합한 항원은 제한은 없지만, 바이러스 단백질, 암세포의 단백질, 조직-특이적 단백질 또는 관용원 단백질을 포함한다. T 세포의 "유도"는 결실 또는 아네르기에 의한 것과 같은 항원-특이적 T 세포의 불활성화를 포함할 수 있다. 불활성화는 특히 각각 기관 이식 및 자가면역 장애와 같은 내성을 확립 또는 재확립하는데 유용하다. 변형된 DC 는 정맥내, 피하내, 절내(intranodally) 및 직접 흉선으로의 투여를 포함하는 당업계에 알려진 어떤 방법으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 투여는 정맥내(IV)이다.
종종, 세포 면역요법은 골수 백혈구성분채집술 수확물 또는 사람 숙주에서 세포원의 제거, 원으로부터 세포를 분리하는 것을 포함한다. 그동안, 조혈 줄기세포 이식이 발생한다면, 숙주는 천연 조혈 수용력을 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 제거하도록 처리될 수 있다. 분리된 세포는 원하는 변형을 가지는 세포를 제공하도록 이 기간동안 변형될 수 있다. 완전한 조혈 제거의 경우에, 조혈 세포 증폭이 요구될 것이다. 그 다음, 세포 또는 변형된 세포는 새로운 수용력을 제공하도록 숙주에 재저장될 수 있다. 세포 제거, 숙주 제거 및 조혈/전구 세포 재집단의 방법이 당업계에 알려진다.
변형된 세포는 어떤 생리적으로 허용가능한 전파체로 일반적으로 혈관내, 절내 및 피하로 투여될 수 있다. 일반저긍로 적어도 1x105 세포가 투여될 것이고, 바람직하게는 1x106 또는 그 이상이다. 세포는 주사, 카테테르 등으로 투여될 수 있 다. 원한다면, 제한은 없지만 예를 들어, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, 및 flt-리간드와 같은 인터루킨뿐만 아니라 다른 인터루킨, G-, M-및 GM-CSF 와 같은 콜로니 자극 인자, 예를 들어, γ-인터페론과 같은 인터페론을 포함하는 인자가 포함될 수 있다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 어떤 길이의 아미노산 잔기의 폴리머를 말하는 것으로 상호교환적으로 사용된다. 폴리머는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이것은 변형된 아미노산 잔기 또는 아미노산 유사체를 포함할 수 있고, 아미노산 잔기와는 다른 화학 부분이 개입될 수 있다. 용어는 또한 제한은 없지만, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 표지 또는 생활성 성분과의 융합과 같은 어떤 다른 조작 또는 변형을 포함하는, 자연적으로 또는 개입으로 변형된 아미노산 폴리머를 포함한다. 다르게 언급되거나 정의되지 않는 한, 용어 항원-결합 단편은 본원에 개시된 순수한 항체, 및 더 작고 더 큰 기능상 등가의 폴리펩티드를 포함하는 면역 특이성을 가진 어떤 폴리펩티드 모노머 또는 폴리머를 포함한다.
1. 항원-결합 단편 및 그것의 조성물
본원발명은 DC 를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편을 포함한다. 즉, 항원은 DC 에서 발견되어서, 항원을 인식하는 항원-결합 단편은 DC 또는 그것의 서브셋을 우선적으로 인식하거나 결합한다. 또는, BDCA-4 를 가진 경우에, 항원은 다른 세포형에서 발견될 수 있으나, 조혈 세포내에서, 항원은 DC 상에 우세하게 제시된다.
본원발명은 적어도 하나의 DC 항원에 특이적으로 결합하는 분리된 항원-결합 단편을 포함하는 조성물 물질을 포함한다. 바람직하게, 항원-결합 단편은 mAb 지시 AC144, AD5-13A11, AD5-20E5, AD5-17F6, AD5-4B8, AD5-5E8, AD5-14H12 및 AD5-8E7이거나, 이로부터 유래된다. 표1은 각 mAb 및 DC 에 특이적인 mAb 의 이소형으로 인식된 항원 및 에피토프를 도시한다.
Figure 112002014869824-pct00001
비배양 사람혈에서, BDCA-2 및 BDCA-4 는 CD123brightCDC1lc-DC 집단에 의해 발현된다. DC 집단은 현재 일반적으로 형질세포 DC 로 지칭된다. 형질세포 DC 의 면역자기 분리 및/또는 유동 세포계측 동정에 대한 표면 마커로서 BDCA-2 또는 BDCA-4를 사용하여, 자주 본원에 제시된 결과는 많은 패널의 백혈구 항원이 사용된 경우에, 면역표현형, 형태학, 엔도시토시스능, 및 이러한 세포의 성숙은 이전의 보고와 완전히 일치한다. 이것은, 양 항원이 비배양 사람혈에서 형질세포 DC 의 유용한 마커라는 것을 분명히 예시한다. 편도 세포의 염색은(도16)말초 림프기관에서 형질세포 DC 에 결합된 T 세포대는 BDCA-2 및 BDCA-4 의 발현에 기초한 배중심 DC, 사지간 DC 및 여포 DC 와 같은 다른 림프 조직-결합 DC 집단으로부터 구별될 수 있다는 것을 도시한다.
BDCA-2와 달리, BDCA-4는 체외 분화 DC 집단에서 또한 발현된다: (1)BDCA-2에 대조적으로, BDCA-4 는 Mo-DC 및 CD34-DC에서 모두 발현된다; (2) BDCA-2 의 발현은 일단 배양에서 IL-3-매개 성숙을 경험한다면 형질세포 DC 에 대하여 완전한 하향-조절인 반면에, BDCA-4 의 발현은 배양된 형질세포 DC 에 대하여 사실상 상향-조절된다; 그리고 (3) BDCA-2 와 대조적으로, BDCA-4 는 대다수의 배양 CDllc+DC에 의해서 12h 내에 발현되어, 이것이 더욱 큰 CDlc+CDllCbright 집단에 적용되는 것인지 또는 더욱 작은 CDIc-CDllCdimCD123- 집단에도 적용되는 것인지 분명하지가 않다. 형질세포 DC 를 제외한 어떤 다른 BDCA-4+ 세포도 비배양 사람혈에 존재하지 않는다는 발견은 사실, 상기에 언급된 체외 분화 BDCA-4+DC 집단의 어떤 상응물도 혈내에 존재하지 않는다는 것을 나타낸다.
항-BDCA-2 mAb 에 의한 BDCA-2의 교차결합은 항원-Ab 복합체의 빠른 내재화를 유도한다. 랑게린과 같이 성숙에 대하여 하향조절되는 DC 상의 다른 엔도시토시 스 수용체와 유사하다. Valladeau et al. (2000) Immunity 12 : 71-81. 그러므로, BDCA-2 는 항원-포획 기능을 가진 수용체일 수 있다. BDCA-2는 연결후에 빠르게 내재화되는 C-형 렉틴(도8)이고, BDCA-2 리간드는 프로세싱되어 T 세포에 제시된다(도15). 그러므로, DEC-205와 같이, BDCA-2 는 항원 섭취 및 T 세포의 리간드에 대한 제시 기능을 가진다.
BDCA-3 의 발현은 비배양 사람 혈에서 CDlc-CDllcdimCD123-DC 의 작은 집단에 제한된다. 표현형, 형태학, 엔도시토시스, 및 성숙 획득에 관하여, DC 집단은 CDlc+CDllcbrightCD123dimDC 집단에 매우 유사하다. 그러나, BDCA-3 및 CD1c 발현 그자체에도 불구하고, 면역표현 분석은 CDlc+BDC 와 대조적으로, BDCA-3+BDC 는 Fc 수용체 CD32, CD64 및 EcORI을 발현하지 않고, 이들은 CD2 를 발현하지 않는다는 어떤 현격한 차이를 나타냈다. Fc 수용체 발현의 결핍은 CDlc+BDC 와 달리, BDCA-3+BDC 가 Ig-매개 항원 섭취능을 가지지 않는다는 것을 나타낸다. Fanger et al. (1996) J. Immunol. 157 : 541-548 ; Fanger et al. (1997) J. Immunol. 158 : 3090-3098 ; 및 Maurer et al. (1996) J. Immunol. 157 : 607-616. 본원에 개시된 대로, BDCA-3 는 100kD 단백질이다.
CD1c-CDllcdimDC 에 대조적으로 CD1c+CDl1CbrightDC 가 GM-CSF(granulocyte macrophage colony-stimulating factor), IL-4 및 TGF-β1과 함께 배양되는 경우에, 랑게르한스 세포 특징(Lag 항원, E-카드헤린 및 랑게린의 발현, 및 Birbeck 과립의 존재)을 획득하는 능력을 가진다는 증거가 있다. 만약, BDCA-3+DC 및 CDIc+DC 가 같은 세포형태의 성숙한 단계를 나타낸다면, 이것은 BDCA-3+DC가 랑게르한스 세포로의 분화능을 이미 손실했거나 또는 아직 획득하지 못한 것이라는 것을 나타낸다.
본원에 제시된 결과에 대조적으로, Ito et al.(1999)는 CDlc-CDllcdim DC와는 달리 CDlc+CDl1cbrightDC 는 CDla 를 발현한다는 것을 보고했다. 2개의 mAb BL-6 및 B-B5 를 사용하여 CDla 를 염색했고, 2개의 mAb 를 비교한 경우에 염색 강도에서의 차이가 실제로 관찰되었다(B-B5 로의 염색이 아마도 더 밝았다). 본원에 도시된 대로, DC 의 염색은 CD1a mAb BL-6 및 HI149 의 최적 적정을 사용한 경우에 분명히 음성이었지만 B-B5 를 사용하는 경우에 양성이었다. 더욱이, BL-6 및 HI149 와 달리 B-B5 는 혈내의 CD19+B 세포의 많은 비율을 염색했다. 그러므로, B-B 의 염색 패턴은 CD1a mAb 보다 CD1c mAb 의 기억성이었고, 사실 CD1c mAb AD5-8E7 은 MOLT-4 세포에의 B-B5 의 결합을 억제한다. 그러므로, 우리는 B-5 가 CD1c 를 인식하고 CDlc+DC 는 CDla 를 발현하지 않는다고 결론지었다.
CDlc, CD2 및 CD14 에 대한 cDlc+DC 의 염색은 DC 의 적은 부분이 다양한 정도로 CD14 를 발현하고, 이러한 세포상에서 CD1c 뿐만 아니라 CD2 발현 수준이 CD14 발현 수준에 역비례한다는 것을 나타내었다. 이러한 관찰은 CDlc+CD2+CDllcbrightCD14-DC 가 양 세포 형태의 일반적인 전구체의 자손이라기 보다 CD14+CDlc- CD2-의 자손인 경우에, 선형 분화 모델과 일치한다. 이러한 개념은 GM-CSF 및 IL-4 와 함께 배양된 경우에 CD14+ 단핵세포의 상당한 비율이 이미 낮은 수준의 CD2 를 발현하고, 전형적인 수지상 형태 및 효험있는 T 세포 자극 기능을 가진 성숙한 DC 로의 빠른 분화 능력을 가진다는 관찰에 의해서 더욱 뒷받침된다. Crawford et al. (1999) J. Immunol. 163 : 5920-5928.
CDlc(BDCA-1), BDCA-2, BDCA-3 및 BDCA-4 mAb 의 사용은 분명한 기능상의 방해없이 PBMC, 백혈구성분채집 물질, 전혈, 편도 등으로부터 DC 집단을 빠르게 검출, 계수 및 분리하는 용이하고 효율적인 방법을 제공한다. 이것은 그들의 더이상의 기능상 및 분자 특징에의 가치있는 보조이고, 그들의 상호관계를 밝히는데 유용할 수 있다. 더욱이, 동형성의 DC 집단을 쉽게 분리할 수 있는 능력은 그들의 임상 용도를 크게 촉진시킨다. 항원-결합 단편은 또한 비-조혈 조직(기도 내피세포, 피부, 장간, 폐, 및 간) 및 조혈 조직(편도, 비장, 림프절 및 흉선)모두의 조직으로부터 DC 를 검출, 계수 및/또는 분리하는데 유용하다.
항체를 분비하는 하이브리도마는 그것의 항원-결합 단편을 발현하는 다른 세포와 같이 본원발명에 포함된다. 본원발명에 의해서 또한 기대되는 것은 BDCA-2, 또는 BDCA-3 또는 BDCA-4를 특이적으로 인식하는 어떤 항원-결합 단편이다. 표 1 및 본원에 제공된 실시예에서 보여지는 바와 같이, 이러한 항원을 특이적으로 인식하는 mAb 의 다양한 형태가 생산될 수 있다. 본원에 제시된 결과로부터 보여진대로, 항원-결합 단편은 같은 항원상의 같은 에피토프를 인식할 필요가 없다. 모든 이러한 항원-결합 단편 및 그것의 조성물은 본원발명에 포함된다.
용어, "항원-결합 단편"은 DC 또는 그것의 아집단에 우선적으로 결합하는 어떤 부분을 포함한다. 적합한 부분은 제한은 없지만, 원하는 표적 분자(Hermann and Pantel (2000) Science 289 : 820-825), 탄수화물, 렉틴, Fab, F(ab')2, Fab', scFv 로서의 Ig 단편(둘다 모노머 및 폴리머 형태)에 결합하는 압토머로 알려진 올리고뉴클레오티드 및 분리된 H 및 L 사슬을 포함한다. 항원-결합 단편은 친화성이 변형될 수는 없지만 순수한 Ig 의 특이성을 보유한다.
본원에 개시된 어떤 화합물, 조성물 및 방법은 일반적으로 본원에서 항원 결정자를 제공하는, 표준 면역화학 기술에 의해서 일반적으로 발생할 수 있는 항체 및 유도체에 관한 것이다. 이것들은 제한은 없지만, 화학 융합으로 다른 화합물에 결합되거나, 또는 부형체 또는 애쥬번트와 혼합하여 결합된 항원 결합 단편을 포함한다. 특이적 융합 파트너 및 이것들을 만드는 방법이 본원에 개시되고 당업계에 알려진다.
항원-결합 단편(또는 그것의 "유도체" 포함)은 다른 방법 및 방법의 조합으로 다르게 얻을 수 있지만, 전형적으로 유전자 조작으로 발생된다. 이러한 분류는 제한은 없지만 유전자 조작된 펩티드 단편 및 융합 펩티드를 포함한다. 바람직한 화합물은 항-DC CDR을 함유하는 폴리펩티드 단편, 사이토카인 이펙터 성분, 애쥬번트 또는 약제를 함유하는 항체 융합 단백질, 종양 세포-유래 항원을 함유하는 항체 융합 단백질, 바이러스 항원, 세균 항원, 기생충 항원, 효모 항원, 그것으로부터 유래된 자가항원 또는 항원성 펩티드(T 세포 에피토프), 및 단일 사슬 V 영역 단백질을 포함한다. 항원-결합 단편은 사람원으로부터 분리된 경우에 사람원으로 여겨지고, 직접 사용되거나 클로닝되고, 다른 세포 형태 및 그것의 유도체 또는 전사람 염색체 또는 그것의 부분에서(VH, DH, JH, VL, JLL, CH, CL 유전자 절편을 코딩하는 사람 염색체를 가진 마우스) 발현된다.
"융합 폴리펩티드"는 천연에서 발견된 것과는 상이한 위치에서 연속적인 펩티드 영역을 포함하는 폴리펩티드이다. 영역은 일반적으로 별개의 부분에 존재하고, 융합 폴리펩티드내로 함께 모아지며; 일반적으로 같은 단백질에 존재할 수 있지만, 융합 폴리펩티드내에서 새로운 배열에 놓이거나; 또는 합성적으로 배열될 수 있다. 예를 들어, 본원발명은 항원-결합 단편의 기능적 부분과 독소와 같은 다른 펩티드로 구성되는 재조합 단백질(및 단백질 또는 그것에 대한 보체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)을 포함한다. 이러한 융합 단백질을 만드는 방법이 당업계에 알려지고, 예를 들어, WO93/07286 에 개시된다.
폴리펩티드의 "기능상 등가의 단편"은 본원에 사용된 것과 관련하여 단편의 적어도 하나의 기능상 특징을 보유하면서 어떤 첨가, 결실, 또는 치환의 조합으로 천연 서열과 다르다.
항원 결합 단편은 면역성 장애와 관련된 임상 상태를 완화하는데 유용하다. 본원발명은 더욱이 항원-결합 단편의 폴리펩티드 유도체 및 진단, 치료 및 신규한 시약의 제조에서 이러한 조성물의 사용을 위한 방법을 포함한다.
본원발명은 또한 화학적 기능 부분에 결합된 항원-결합 단편을 포함한다. 전형적으로, 부분은 검출가능한 신호를 생산할 수 있는 표지이다. 이러한 융합된 항원-결합 단편은 예를 들어, 조혈 세포 이식, 및 화학요법 및 방사선과 같은 면역제거요법에 이어서, 예를 들어, 화학요법 또는 자기면역요법의 조영 후에, 다양한 조직, 다양한 질환에서 DC 의 양과 같은 검출 시스템에서 유용하다. 이러한 표지는 제한은 없지만, 당업계에 알려지고, 방사선동위원소, 효소, 형광 화합물, 화학발광 화합물, 생(生)발광 화합물, 기질 보조인자 및 저해제 및 자기 입자를 포함한다. 이러한 표지의 사용을 교시하는 특허의 예는 U.S. 특허번호. 3,817,837 ; 3, 850,752 ; 3,939,350 ; 3,996,345 ; 4,277,437 ; 4,275,149 ; 및 4,366,241이다. 부분은 공유 결합, 재조합으로 연결될 수 있거나, 제2의 항체, 단백질 A, 또는 비오틴-아비딘 복합체와 같은 제2의 시약을 통해 결합(공유 또는 비공유)될 수 있다.
다른 기능적 부분의 예는 제한은 없지만, 신호 펩티드, 면역 반응성을 증진시키는 약제, 고형 지지체에의 결합을 촉진시키는 약체, 백신 담체, 생체반응 조절자, 상자기성 표지 및 약물을 포함한다. 신호 펩티드는 원핵 및 진핵 형태를 포함한다. 면역 반응성을 개선시키는 약제는 제한은 없지만 세균 초항원 및 애쥬번트를 포함한다. 고형 지지체에 결합을 촉진하는 약제는 제한은 없지만, 아비딘 또는 그것의 유도체를 포함한다. 면역원 담체는 제한은 없지만 어떤 생리적으로 허용가능한 완충액을 포함한다. 생체반응 조절자는 제한은 없지만, 사이토카인, 특히 종양 괴사 인자(TNF), IL-2, 인터루킨-4(IL-4), GM-CSF ; IL-10, IL-12, TGF-β및 어떤 인터페론, 및 케모카인(MIP-3β(Macrophage Inflammatory Protein-3β), SDF-1(Stromal Cell-Derived Factor-1), 림포택틴(Lymphotactin), DC-CK1(수지상 세포 특이 C-C chemokine 1), 에오택신(Eotaxin), IP-10, TARC(thymus and activation-regulated chemokine), Rantes(Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed and Secreted), MIP-1x, MIP-1B, SLC, 1-TAC, MIG, MDC, MCP-1, TCA-3, MCP-2,-3,-1)을 포함한다. 또한, US 특허 5,750,119 ; 및 WO 특허공개: 96/10411 ; 98/34641 ; 98/23735 ; 98/34642 ; 97/10000 ; 97/10001 ; 및 97/06821 참조. 이와 같이, 케모카인은 T 세포와 같은 다른 세포를 유인하는데 유용할 수 있다.
"신호 펩티드" 또는 "리더 서열"은 세포 막, 일반적으로 진핵세포의 소포체(ER), 및 세균의 내막 또는 내·외막 모두를 통해 새로이 합성된 단백질을 지시하는 짧은 아미노산 서열이다. 신호 펩티드는 전형적으로 폴리펩티드의 N-말단에 있고, 폴리펩티드의 생합성 및 분비 사이에서 세포 또는 ER 의 막으로부터 효소적으로 제거된다. 그러므로, 신호 펩티드는 분비된 단백질에 존재하는 것이 아니라 단백질 생산동안만 존재한다.
단일 사슬 결합체를 포함하는 면역독소는 재조합 수단으로 생산될 수 있다. 다양한 면역독소의 생산은 당업계에 잘 알려지고, 방법은 "Monoclonal Antibody-toxin Conjugates : Aiming the Magic Bullet," Thorpe et al. (1982) Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, pp. 168-190 ; Vitatta (1987) Science 238 : 1098-1104 ; 및 Winter and Milstein (1991) Nature 349 : 293-299 에 개시된다. 적합한 독소는 제한은 없지만, 리신, 방사성핵종, 억새풀 항바이러스 단백질, 녹농균 외독소 A, 디프테리아 독소, 리신 A 사슬, 겔로닌, 레스트릭토신과 같은 균류 리보솜 불활성화 단백질 및 포스포리파제 효소를 포함한다. 일반적으로, "키메라 독소", Olsnes and Pihl, Pharmac. Ther.15: 355-381(1981) ; 및 "암 검출 및 요법용 단일클론 항체""eds. Baldwin and Byers, pp. 159-179, 224-266, Academic Press (1985) 참조.
화학 기능적인 부분은 예를 들어, 항원-결합 단편 및 다른 유전자의 기능적 영역(예를 들어, 효소)을 코딩하는 융합 유전자을 제조하여 재조합적으로 만들 수 있다. 유전자 융합의 경우에, 2 개의 성분은 같은 유전자내에 존재한다. 택일적으로, 항원-결합 단편은 잘 알려진 다양한 화학 과정 중 어느 하나에 의해서 부분에 화학적으로 결합될 수 있다. 예를 들어, 부분이 단백질인 경우에, 동형 또는 이형 2기능성 교차 결합제, 예를 들어, SPDP(N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate), SMCC(succinimidyl 4-(N-malcimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), 카르보디마이드 글루타르알데히드 등에 의해서 연결될 수 있다. 부분은 제한은 없지만, 제2의 항체, 단백질 A, 또는 비오틴-아비딘 복합체를 포함하는 제2의 시약을 통해 공유로 결합 또는 융합될 수 있다. 상자성 부분 및 그것의 항체와의 융합은 당업계에 잘 알려진다. 예를 들어, Miltenyi et a. (1990) Cytometry 11:231-238.
여기에서, 우리는 최근 개시된 교차 족저(footpad) 면역반응으로 (O'Doherty et al.(1993); 및 Yamaguchi et al. (1995))에 개시된 문제를 해결했다. Yin et al. (1997) Blood 90 : 5002-5012. 시스템은 그들이 항원을 만나지 않는 한 말초 림프 기관 내에 계속 재순환하는 천연의 항원 특이적 T 및 B 세포를 이용하지만, 일단 그들이 항원에 의해서 활성화되면, 몇 주 동안은 아니지만, 몇일간 말초 림프 기관내에서 즉시 보유한다. Picker et al. (1992) Annu. Rev. Immunol. 10 : 561-591 ; Butcher et al. (1996) Science 272 : 60-66 ; Bradley et al. (1996) Curr. Opin. Immunol. 8 : 312 : 320 ; Watson et al. (1998) Cell. Adhes. Commun. 6 : 105-110 ; Kearney et al. (1994) Immunity 1 : 327-339 ; Jacob et al. (1992) J. Exp. Med. 176 : 679-687 ; Ridderstaad et al. (1998) J. Immunol. 160 : 4688-4695 ; 및 Tarlinton (1998) Curr. Opin. Immunol. 10 : 245-251. 본원에 제공된 실시예에서, 마우스의 좌족저에 브리스톨-8(Bristol) 림프아세포종 세포를 -3, 0, 4, 7, 11, 및 14 일에 주사한 반면에, 우족저에는 DC 를 0, 4, 7, 11 및 14일에 주사했다. 예를 들어, HLA 클래스 II 분자와 같은 공유 항원에 대한 특이성을 가진 천연 B 및 T 세포는 좌슬와 림프절에서 d -3 과 0 일간에 브리스톨-8 으로 활성화되고, 그 위에 보유되어야만하는 반면에, DC 에 유일한 항원 대한 특이성을 가진 모든 림프구는 우슬와 림프절에서 0 일 후에 활성을 위해 이용가능하게 존재하여야한다.
면역 기술은 많은 DC 의 빠른 분리를 위한 유력한 과정과 조합되었고, BDCA-2, BDCA-3 및 BDCA-4 와 같은 3 개의 신규한 DC 항원을 인식하는 mAb 패널의 생산을 허용했다. 추가의 DC-특이적 항체를 생산하는 항원의 사용은 항체 생산에 관한 종래의 방법이 더욱 성공의 기회로 사용될 수 있도록 허용한다.
항체 생산 및 분리의 방법이 당업계에 공지된다. 예를 들어, Harlow and Lane (1988) Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 참조. 일반적인 항체 정제 방법은 제한은 없지만 염 침전(예를 들어, 황산 암모늄); 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 중성 pH 상에서 전개하고, 증가하는 이온 강도의 단계식 구배로 용리된 양이온 또는 음이온 교환 컬럼); 겔 여과 크로마토그래피(겔 여과 HPLC 포함); 및 단백질 A, 단백질 G, 히드록시아파타이트(hydroxyapatite), 또는 항-Ig 와 같은 친화성 수지상에서의 크로마토그래피를 포함한다. 항원-결합 단편은 또한 DC 또는 그것의 항원 부분을 포함하는 친화성 컬럼에서 정제될 수 있다. 바람직하게 단편은 단백질-A-CL-Sepharose TM4B 크로마토그래피에 이어서, DEAE-Sepharose TM4B 이온 교환 컬럼으로 정제된다.
본원발명은 또한 한쌍의 H 및 L 사슬이 제1의 항체로부터 얻어진 반면에, 다른 한쌍의 H 및 L 사슬이 다른 제2의 항체로부터 얻어진, 하이브리드 항체를 포함한다. 본원발명의 목적을 이루기 위해서, 한쌍의 L 및 H 사슬은 항-DC 항체로부터 얻는다. 한 실시예에서, 각 L-H 사슬 쌍은 DC-특이적 항원의 상이한 에피토프에 결합한다. 이러한 하이브리드는 또한 인간화 H 또는 L 사슬을 사용하여 형성될 수 있다. 본원발명은 또한 그들의 불변 영역을 통해 공유로 연결된 2개의 분리 항체를 함유하는 것과 같은, 상이한 이중특이성 항체를 포함한다.
본원발명에 포함된 다른 항원-결합 단편은 H 또는 L 사슬이 추가의 성질을 제공하도록 변형된 항체이다. 예를 들어, 아미노산 서열상의 변화는 결과의 폴리펩티드의 감소된 면역원성을 초래할 수 있다. 변화는 하나 이상의 아미노산 잔기의 변화에서 C 영역 도메인과 같은 영역을 완전히 재설계하는 것에 이를 수 있다. 전형적인 변화는 제한은 없지만 보체 고정에 관한 것, 막 수용체와의 상호작용, 및 다른 이펙터 기능을 포함한다. 재조합 항체는 또한 세포에 기질(사이토카인)의 특이적 송달을 보조하도록 유전적으로 설계될 수 있다. 또한 본원발명에 포함된 것은 다양한 Ig 도메인이 천연에서 발생한 것보다 순서대로 배열된 펩티드이다.
항원-결합 단편의 크기는 원하는 기능을 제공하도록 획득된 최소 크기일 수 있다. 원하는 경우에, 선택적으로 항원-결합 단편에 천연적이거나, 또는 이형 원으로부터의 추가의 아미노산 잔기를 포함한다. 항-DC 항원-결합 단편은 항체 V 영역 서열로부터의 단지 5 개의 연속적인 아미노산을 함유할 수 있다. 항체 L 및 V 영영으로부터 7 개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 약 10 개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 약 15 개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 약 25 개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 25 개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 50 개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 75 개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드가 또한 포함된다. 더욱 바람직한 것은 전 항체 L 및 H 사슬 V 영역을 포함하는 폴리펩티드이다.
치환은 하나 이상의 아미노산 잔기를 변화 또는 변형시키는 것에서 V 영역과 같은 영역의 완전한 재설계에 이를 수 있다. 존재한다면, 아미노산 치환은 바람직하게는 접힘 및 펩티드의 기능상의 성질에 해로운 영향을 주지 않는 연속적인 치환이다. 연속적인 치환이 만들어질 수 있는 기능상 관련 아미노산 잔기의 군은 글리신/알라닌; 발린/이소루신/루신; 아스파라긴/글루타민; 아스파르트산/글루탐산; 세린/트레오닌/메티오닌; 리신/아르기닌; 및 페닐알라닌/티로신/트립토판이다. 항원-결합 단편은 글리코실화 또는 비글리코실화 될 수 있고, 번역 후 변형될 수 있고(예를 들어, 아세틸화, 및 인산화) 또는 합성상 변형될 수 있다(예를 들어, 표지기의 부착).
L 사슬 및 H 사슬 모두를 포함하는 폴리펩티드 유사체는 별개의 L 및 H 사슬로서 형성될 수 있고, 그 다음 양 사슬에 대한 발현 시스템으로서 조립되거나 제자리에서 조립된다. 이러한 발현 시스템은 L 및 H 사슬에 대한 별개의 전사가능한 영역을 포함하는 플라스미드로 트랜스펙션, 또는 각 사슬에 대한 플라스미드를 가진 같은 세포를 코트랜스펙션시킴으로써 생성될 수 있다. 제3의 방법에서, 영역을 코딩하는 H 사슬을 가진 적합한 플라스미드를 H 사슬 결실 돌연변이체에 트랜스펙션시킨다.
H 사슬 결실 돌연변이체를 공급자의 지시에 따른 형광-표지 래빗 항-마우스 IgG(H 사슬 특이적, DAKO Corporation,Carpinteria, CA)를 가지는 항-DC 생산 세포를 처리하여 얻을 수 있다. 염색 및 비염색 세포 집단을 유동 세포계측법으로 분석한다. 비염세 세포를 무균 튜브에서 수거했고, 희석을 제한하여 1세포/웰로 96-웰 플레이트에 놓았다. 그 다음 배양 상청액을 고우트 항-마우스 IgG(H 사슬 특이적) 및 고우트 항-마우스 카파를 사용하여 ELISA 로 분석한다. 카파-양성, IgG-음성 표현형을 가지는 클론을 적어도 3 번 아클론하여 안정한 항-DC(-H)돌연변이체를 얻는다. 추정 H 사슬 결실 돌연변이체로부터의 mRNA 가 분리될 수 있고, L 사슬 V 영역 cDNA 의 서열이 결정될 수 있다. VH 에 대한 mRNA 의 역 PCR 을 2 셋트의 5'-및 3'-프라이머와 함께 실행하여, 항-DC(-H) cDNA 의 클로닝에 사용한다. H 사슬 결실 돌연변이체는 이러한 프라이머를 가진 검출가능한 DNA 밴드가 나타내지 않는다. 세포의 트랜스펙션은 적합한 H 사슬 플라스미드로 진행한다.
본원발명에 포함되는 다른 항원-결합 단편 유도체는 H 또는 L 사슬의 불변 영역이 추가의 성질을 제공하도록 변형된 항체이다. 예를 들어, 아미노산 서열에서의 변화는 결과의 폴리펩티드의 변형된 면역원성을 초래할 수 있다. 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기에서 불변 영역 도메인의 완전한 재설계에 이른다. 기대된 변형은 보체 고정, 막 수용체와의 상호작용, 및 다른 이펙터 기능에 영향을 준다. 재조합 항체는 세포에 기질(림포카인 또는 항원 또는 종양으로부터 유래된 항원 펩티드, 바이러스, 기생충 또는 세균, 또는 내성(자가항원))의 특이적 송달을 돕도록 유전자 조작될 수 있다. 다양한 Ig 도메인이 천연에서 발생한 것과는 다른 순서로 배열된 단백질이 또한 본원발명에 포함된다.
본원발명은 또한 항-DC 항체의 단일 사슬 V 영역(scFv)을 포함한다. 단일 사슬 V 영역 단편은 짧은 연결 펩티드를 사용하여 L 및/또는 H 사슬 V 영역을 연결하여 만들어진다. Bird et al. (1988) Science 242 : 423-426. 충분한 이동성 및 길이를 가지는 어떤 펩티드는 scFv 에서 링커로 사용될 수 있다. 일반적으로 링커는 면역원성이 거의 없는 것이 선택되어야만 한다. 연결 펩티드의 예는 하나의 V 영역의 카르복시 말단과 다른 V 영역의 아미노 말단간의 대략 3.5nm 을 연결하는 (GGGGS)3 이다. 다른 연결 서열이 또한 사용될 수 있고, 세포에 약물 또는 고체 지지체에의 부착 또는 기질의 특이적 송달(림포카인 또는 항원 또는 종양에서 유래된 항원 펩티드, 바이러스, 기생충 또는 세균, 또는 내성(자가내성))과 같은 추가의 기능을 제공할 수 있다.
H 또는 L 사슬의 모든 또는 어떤 부분이 어떤 조합으로 사용될 수 있다. 전형적으로, 전체 V 영역이 scFv 에 포함된다. 예를 들어, L 사슬 V 영역이 H 사슬 V 영역에 연결될 수 있다. 택일적으로, L 사슬 V 영역의 부분이 H 사슬 V 영역, 또는 그것의 부분에 연결될 수 있다. 또한, H 사슬 V 영역이 본원에 개시된 항체로부터 유래되고, L 사슬 V 영역이 다른 Ig 로부터인 scFv 가 기대된다. 하나의 성분은 항원-결합 단편이고, 다른 성분은 T 세포 에피토프와 같은 다른 폴리펩티드인 이상성, scFv 가 만들어질 수 있다.
scFv 는 예를 들어, VH-(링커)-VL 또는 VL-(링커)-VH 와 같은 어떤 순서로 조립될 수 있다. 특정 발현 시스템에서 이러한 형태중의 어떤 하나가 선호될 수 있다면 이러한 2 개의 구성의 발현 수준에 차이가 존재할 수 있다. (X)-(링커)-(X)-(링커)-(X) 와 같은 탄뎀 scFv 가 만들어질 수 있고, 여기에서 X 는 scFv, 또는 다른 폴리펩티드를 가지는 그것의 조합이다. 다른 구체예에서, 단일 사슬 항체 폴리펩티드는 어떤 링커 폴리펩티드도 가지지 않거나, 또는 단지 짧은, 비가용성 링커를 가진다. 가능한 구성은 VL-VH 및 VH-VL이다. 연결이 너무 짧아서 사슬내의 VL 및 VH 간의 상호작용을 허용할 수 없고, 사슬은 각 말단에 VL/VH 항원-결합 부위를 가지는 호모다이머를 형성한다. 이러한 분자는 "디아바디(diabody)"로 지칭된다.
scFv 는 재조합으로 또한 합성으로 생산될 수 있다. scFv 의 합성 생산을 위해서, 자동 합성기가 사용될 수 있다. scFv 의 재조합 생산을 위해서, scFv 를 코딩하는 적합한 플라스미드-함유 폴리뉴클레오티드가 효모, 식물, 곤충 또는 포유동 물 세포와 같은 진핵생물, 또는 Escherichia coli와 같은 원핵생물과 같은 적합한 숙주 세포에 도입될 수 있고, 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 발현된 단백질이 분리될 수 있다. ScFv 를 파지 전개 라이브러리로부터 얻을 수 있다.
ScFv 생산을 위한 특히 유용한 시스템은 플라스미드 pET-22b(+) (Novagen, Madison, WI)이다. Escherichia coli pET-22b(+)는 발현된 단백질이 적합한 친화성 수지상에서 정제되도록 허용하는 6 개의 연속적인 히스티딘 잔기로 구성되는 니켈 이온 결합 도메인을 포함한다. 적합한 벡터의 다른 예는 pcDNA3(Invitrogen, SanDiego, CA)이다.
유전자 발현의 조건은 바람직하게는 scFv 가 최적의 4 차 구조를 추정하는 것을 보장한다. 사용된 플라스미드(특히 프로모터 활성), 및 숙주 세포에 따라서, 생산율을 조정하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 더 약한 프로모터의 사용, 또는 더 낮은 온도에서의 발현은 원핵 시스템내에서 적당하게 접힌 scFv 의 생산을 최적화하기 위해서 필요할 수 있고; 또는 진핵세포내에서 scFV 를 발현시키기 위해 사용될 수 있다.
본원발명은 또한 다수의 DC-특이적 항원-결합 단편을 함유하는 항원-결합 단편의 폴리머 형태를 포함한다. 하나의 구체예는 항원-결합 단편, 선택적으로 담체에 융합된 선형 폴리머이다. 이러한 선형 폴리머는 다수 카피의 단일 항원 결합 단편 폴리펩티드, 또는 상이한 폴리펩티드의 조합을 포함할 수 있고, 탄뎀 폴리펩티또는, 다른 아미노산 서열로 분리된 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
다른 구체예는 다수의 항원 펩티드(MAP)이다. MAP 는 많은 항원-결합 단편 폴리펩티드가 공유로 부착된 방사상 분지 리신 수지상돌기를 가지는 면역적으로 불활성인 작은 코아를 가진다. 예를 들어, Posnett et al. (1988) J. Biol. Chem. 263 : 1719-1725 ; and Tam (1989) Met. Enz. 168 : 7-15. 결과는 코아에 높은 몰비율의 항원-결합 단편 폴리펩티드를 가지는 큰 거대분자이다. MAP 는 효율적인 면역원이고, 면역분석법에 유용한 항원이다. MAP 를 제조하기 위한 코아는 표준 펩티드 합성 기술으로 만들어 질 수 있거나 상업적으로(Quality Controlled Biochemicals, Inc., Hopkinton, MA)얻을 수 있다. 전형적인 코아 매트릭스는 3 개 수준의 리신 및 8 개의 아미노산 잔기로 구성된다.
본원발명은 더욱이 본원발명의 DC 특이적 항원-결합 단편에 대한 항-요오드형 항원-결합 단편을 포함한다. 이러한 항-요오드형은 당업계에 알려진 어떤 방법으로 만들어질 수 있다.
암 환자는 종종 면역억제되고, 어떤 종양-결합 항원(TAA)에 내성이다. 이러한 TAA 에 대한 활성 면역반응 유발은 암요법에서 중요한 도전을 나타낸다. 허여된 항원으로의 면역은 CTL(cytotoxic T lymphocyte) 반응, 바람직하게는 강력한 CTL 반응을 포함하는 면역반응을 발생시킨다. 항원에 대한 항체의 생산은 종양 세포가 ADCC(항체-의존성 세포 세포독성)으로 죽는 경우에 유용할 수 있다. 본원발명은 당업계에 알려진 방법에 의한 특이적 면역반응을 유도하도록 본원발명의 항원-결합 단편의 사용으로 동정 및 분리된 DC 의 사용을 포함한다. 면역 반응은 제한은 없지만, 암, 감염성 바이러스, 감염성 세균, 감염성 기생충, 감염성 효모, 및 자가면역 질환(내성을 유도)과 관련된 것을 포함하는 어떤 항원에 특이적일 수 있다. 이러한 반응을 유도하는데 유일하게 적합한 아집단을 분리하는 능력은 아집단의 혼합물보다 더욱 유효한 DC 의 제조를 초래한다. 하이브리드 세포(예를 들어, DC/종양 세포)는 암-특이적 요법에 사용될 수 있다. 변형된 세포(활성, 그들의 T 헬퍼 세포 편광능에 관하여 활성, 체외 성숙, 조정된(Th1 v Th2 v Th3/Th-R), 그리고, 그들의 T 세포 자극 또는 아네르기화 또는 결실능에 관하여 조정된 것을 제한없이 포함)는 마찬가지로 본원발명에 포함되고, 제한은 없지만, 유전적으로 변형되거나 트랜스펙션된 세포 및 항원제시 또는 내재화에 적합한 펩티드 또는 단백질과 인큐베이션된 세포를 포함한다. 아집단은 제한은 없지만 한 계통 및 별개의 분화 계통내에서 특정 분화 단계를 포함한다.
본원발명은 더욱이 DC, 그것의 아집단 및 그것의 혼합물을 제공한다. 세포는 당업계에서 알려진 어떤 분리 방법으로 본원에서 제공된 항원-결합 단편을 사용하여 선택된다. 분리된 세포를 포함하는 조성물이 본원발명에 포함된다. 이들은 약학적 및 치료적 조성물 및 분리된 세포를 함유하는 어떤 다른 조성물을 포함한다. 본원에 개시된 방법으로 분리된 DC 아집단은 바람직하게는 실질적으로 동형이다. 즉, BDCA-특이적 항원-결합 단편으로 분리된 세포는 바람직하게는 약 80% BDCA+, 더욱 바람직하게는 약 90% BDCA+ 이고 가장 바람직하게는 약 95% BDCA+ 이상이다. 물론, 다른 DC, 또는 다른 조혈 세포와 세포의 연속적인 조합은 BDCA+ 세포의 비율을 감소시킬 수 있고, 이러한 조합이 또한 본원발명에 포함된다.
마찬가지로, 본원에 개시된 방법으로 얻어진 DC 는 당업계에 알려진 어떤 치료 방법에의 사용에 적합하다. 변형된 DC 를 얻는 방법이 또한 본원발명에 포함된 다. 이러한 방법은 제한은 없지만,
a) 자가면역질환, 알레르기, 이식 대 숙주 질환(GvHD), 동종이식 거부반응에서 특이적 T 세포 내성(자극 대신에 사멸 또는 아네르기)을 유도하도록 분리된 DC 로의 요법. 예를 들어, 이러한 T 세포에 특이적인 DC 는 CD95L 트랜스펙션과 같은 항원 표지 또는 유전적 변형으로 원하지 않는 면역 반응에 포함된 T 세포를 특이적으로 표적화하도록 하는 융해, 불활성화 또는 사멸-유도 부분을 함유하도록 변형될 수 있다. T 세포에의 DC 특이성은 1차적으로 MHCI 및 II 에 의해서 적합한 T 세포 에피토프(펩티드)의 제시에 의해서 야기된다. 내성-유도 기능을 가지는 DC 의 특정 서브셋은 환자에 직접 투여될 수 있다. 말초 내성은 결실(사멸), 아네르기 및 T 세포의 억제/조절을 포함하도록 변형된 DC 에 의해서 조절될 수 있다;
b) 특정 T 세포에서 특정 사이토카인 발현 프로파일을 유도하도록 분리된 DC 로의 면역조절 요법. 이것은 Th1(특이적 염증성 면역 반응용 사이토카인), Th2(특이적 체액성 면역반응용 사이토카인) 또는 Th3(특이적 면역억제용 사이토카인) 사이토카인의 생산에 영향을 주는 것에 특히 유용하다. 예를 들어, 알레르기 및 천식의 경우에 Th1 반응의 유도는 징후-생산 Th2 반응을 감소 또는 제거할 수 있다.
c) 제한은 없지만, 종양 항원, 바이러스 항원 및 세포성 항원을 포함하는 DC 제시 항원으로의 요법;
d) DC(제시 항원의 존재 또는 부존재) 및 면역반응을 조절하기에 충분한 양 및 조건하에서 제한은 없지만 사이토카인, 공자극 분자 및 이펙터 분자를 포함하는 다양한 보조인자로의 요법; 및
e) 항원-특이적 T 세포를 얻기 위해서 체외에서 T 세포 자극을 포함한다.
본원에 개시된 항원-결합 단편은 또한 많은치료 방법에 적합하다. 이러한 방법은 제한은 없지만,
a) 자가면역 또는 최적의 그리고 선택적 섭취/트랜스펙션을 위하여 DC 에 대한 항원 또는 핵산(바이러스, 플라스미드 DNA, RNA 등)의 생체내 표적화에 포함된 DC 의 리간드 또는 리간드-매개 면역요법을 모방하는 항체. BDCA-2 는 항원 섭취 및 프로세싱 기능을 가진 분자인 경우에 본원발명에서 특히 유용할 수 있다; 그리고,
b) 면역모니터: 예를 들어, flt3(FMS-like tyrosine kinase 3)-리간드 또는 G-CSF 와 같은 증식 유도 리간드로 다양한 질환 및 이동에서의 BDCA-2+, BDCA-3+ 및 BDCA-4+ DC 의 배열 및 특징.
숙주에 해롭지 않는 어떤 담체는 DC 에 사용될 수 있다. 적합한 담체는 단백질; 다당류(라텍스 기능화된 세파로스, 아가로스, 셀룰로스, 셀룰로스 비드 등); 폴리머 아미노산 잔기(폴리글루탐산, 폴리리신 등); 아미노산 코폴리머; 및 살모넬라와 같은 불활성 바이러스 입자 또는 약화된 세균.
2. 추가의 DC-특이적 항원-결합 단편을 얻는 방법.
본원발명은 DC-특이적 항원-결합 단편을 얻는 방법을 포함한다.
신규한 DC-특이적 결합 단편을 발생시키는 방법은 하기에 개시된 바와 같이 제한은 없지만, 1) 항체 레파토리를 코딩하는 cDNA 를 PCR 및 종-특이적 V 영역에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 림프구 또는 비장 RNA 에서 바람직하게 증폭시키는 것에 의한 파지 전개 기술을 사용하는 것; 2) 항원으로 포유동물을 면역화시키고 다클론 또는 mAb 를 발생시키는 것; 및 3) 매우 크고 다양한 V 유전자 레파토리를 파지상에서 전개시키는 것에 의해서 사전 면역화없이 항체를 만들 수 있는 파지 전개를 사용하는 것을 포함한다. 일반적으로 Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnol. 4 : 1-20 참조. 바람직하게는, 치료 목적용으로, 사람이 아닌 항원 결합 단편이 사용된 경우에, 당업계에 알려진 어떤 방법으로 인간화될 수 있다.
Medez et al. (1997) Nature Genetics 18 : 410 에 개시된 방법이 사용될 수 있다. 요약하면, 정제된 항원은 천연 뮤린 항체 레파토리가 결핍되고 대신에 배선(germ line) 구성에서 대부분의 사람 항체 V 유전자를 가지는 트랜스제닉 마우스를 면역화하는 데 사용된다. 사람 항체는 뮤린 B 세포에 의해서 연속적으로 생산된다. 항체 유전자는 PCR 라이브러리 선택 또는 전통적인 하이브리도마 기술으로 B 세포에 의해서 회복된다.
택일적으로, 항체는 정제된 DC-특이적 항원의 주사 후에 마우스(BALB/c)에서 얻을 수 있다. mAb는 표준 하이브리도마 기술을 사용하여 발생된다. Maiti et al. (1997) Biotechnol. Int. 1 : 85-93(사람 하이브리도마); 및 Kohler and Milstein (1975) Nature 256 : 495-497(마우스 하이브리도마). 뮤린 항체는 예를 들어, Rosok et al. (1996) J. Biol. Chem. 271 : 22611-22618 ; Baca et al. (1997) J. Biol. Chem. 272 : 10678-10684 ; Rader et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 : 8910-8915 ; 및 Winter and Milstein (1991) Nature 349 : 293-299에 개시된 방법으로 연속적으로 인간화될 수 있다.
파지 전개 접근법은 또한 DC 에 대하여 사람 항체를 빠르게 발생시키는데 사용될 수 있다. 이 접근법은 Henderikx et al. (1998) Cancer Res. 58 : 4324-32 에 개시된 방법을 사용할 수 있다. 파지상에 전개된 항체 단편은 고정화 항원 또는 DC 에 결합하는 것을 분리함으로써 상이한 단일 사슬 항체를 함유하는 거대한 천연 파지 항체/단편 라이브러리로부터 선택된다. 사람 항체 단편은 배선 V 영역으로부터 제조되거나 골격(framework) 및 CDR 영역 모두에서 많은 돌연변이(동형 유전자 재배열 또는 에러 프로운 PCR로 표적화된 돌연변이)를 가지도록 합성된 천연 레파토리부터 선택된다. DC와 특이적으로 반응하는 항원-결합 단편은 DC 특이적 항원-결합 단편을 동정하도록 본원에 개시된 종양 및 정상 세포에 대한 스크리닝으로 동정될 수 있다.
본원발명은 또한 적합한 파지 전개 라이브러리를 발생시키고; DC-특이적 항원을 분리하고; DC 에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편을 전개하는 파지를 얻기 위해서 표준 면역화학 기술에 따라서 항원을 가진 파지 전개 라이브러리를 스크리닝하고;또는 DC 특이적 항원-결합 단편에 대하여 얻어진 파지 전개 라이브러리를 스크링하고, DC 및 APC 와 같은 다른 관련 세포에 대하여 스크리닝하고 DC 에 우선적으로 결합하는 파지를 선택함으로써 DC 에 특이적인 항원 결합 단편을 동정하는 방법을 포함한다. 파지 전개에 의하여 항원 결합 단편을 발생시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. Hoogenboom et al. (1998).
전형적으로 림프구(PBL) 또는 비장 RNA 가 항체 단편 레퍼토리를 만드는데 사용된다. 동형 재편성 또는 에러 프로운 PCR 을 사용하는 돌연변이 유발은 다양성을 증가시킨다. 당업계에 알려진 어떤 방법이 사용될 수 있다.
항체 유전자의 레파토리는 PCR 을 사용하여 면역화된 마우스 또는 사람으로부터 증폭되고, 그것으로부터 얻어진 scFv 또는 Fab 항체가 클로닝되고 박테리오파지 표면상에서 발현될 수 있다. 항체 유전자 레파토리는 PCR 및 V 영역에 특이적인 숙주 동물에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 림프구 또는 비장 RNA 로부터 증폭된다. 파지 전개는 파지상에서 매우 크고 다양한 V 유전자를 전개함으로써 사전 면역없이 항체를 만드는데 사용될 수 있다. PBL 에 존재하는 천연 V 유전자 레파토리는 PCR 증폭으로 분리되고, VH 및 VL 영역은 PCR 을 사용하여 무작위로 함께 스플라이싱된다. 돌연변이는 동형 유전자 재편성 또는 에러 프로운 PCR 에 의해서 V 도메인 유전자에 표적화될 수 있다. Zhao et al. (1998) Nat. Biotechnol. 15 : 258 ; 및 Hoogenboom et al. (1998). 총 합성 사람 라이브러리가 제조될 수 있고, DC-특이적 항체 단편을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 파지 전개 라이브러리를 작동하는데 사용된 방법에 상관없이, 각 결과적인 파지가 그것의 표면상에 전개된 기능적인 항체 단편을 가지고, 파지 게놈내에 항체 단편을 코딩하는 유전자를 함유한다. WO97/02342 참조.
결합 항체가 비결합 항체로부터 제거될 수 있는 친화성 크로마토그래피가 어떤 시기에 확립되었다. Nissim et al. (1994) EMBO J. 13 : 692-698 ; 및 Vaughan et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14 : 309-314. 성공에 영향을 주는 중요한 매개변수는 특정 항원에 대하여 발생한 항체 단편의 수 및 친화력이다. 최근까지, 크고, 다양한 라이브러리의 생산에는 다소 어려움이 있었다. 조직학적으로, scFv 레파토리는 VH 및 VL RT-PCR 산물로부터 직접 조립되었다. RNA 이용가능성 및 RT-PCR 의 효율성은 이용가능한 V 유전자 수의 제한 요소이었다. 또한, 조립체는 3 개의 단편, 즉 VH 및 VL 및 링커 영역을 연결하여 얻었다. Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222 : 581-597.
개선된 라이브러리 구성 방법은 별개의 플라스미드 벡터내에 클로닝된 VH 및 VL 유전자 레파토리를 사용하여 scFv 조립체에 대한 안정되고 제한없는 물질의 공급을 제공한다. Sheets et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 : 6175-6162. 또한, 효율성은 VL 라이브러리의 5'말단에서 링커 영역을 코딩하는 DNA 를 가짐으로써 증가된다. 그러므로, 3 개 대신에 연결될 수 있는 단지 2 개의 단편이 있다.
항-DC-항원-결합 단편 역시 유래되거나 조작될 수 있다. 예를 들어, L 및 H 사슬의 V 영역의 면역활성은 전체 V 영역 아미노산 서열에 함께 분포하는 일련의 짧은 폴리펩티드를 준비함으로써 스크리닝될 수 있다. 길이면에서 20 또는 50 개의 아미노산 잔기의 일련의 폴리펩티드를 사용하여, 각 V 영역은 유용한 기능 성질에 운반될 수 있다. 잠재적 면연원성 폴리펩티드를 동정하기 위해서 단백질 서열의 컴퓨터 분석을 수행하는 것이 또한 가능하다. 그다음, 이러한 펩티드가 합성되고 시험될 수 있다.
본원발명은 더욱이 바람직한 성질을 가진 다른 항-DC 항원 결합 단편을 생산하도록 다양한 형태로 조합된 본원에 개시된 항원-결합 단편의 다양한 채택을 포함 한다. 예를 들어, 변형된 잔기를 가진 항원-결합 단편은 MAP 에 포함될 수 있다. 다른 예에서, scFv 는 IL-2 와 같은 사이토카인에 융합된다. 모든 이러한 조합은 본원발명에 포함된다.
항원-결합 단편이 단백질 가수분해, 재조합 방법 또는 화학 합성제를 포함하는 어떤 적합한 과정으로 만들어질 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 알려지므로 상세하게 개시할 필요가 없다. 단백질 가수분해 효소의 예는 트립신, 키모트립신, 펩신, 파파인, V8 프로테아제, 서브틸리신, 플라스민, 및 트롬빈을 제한없이 포함한다. 순수한항원-결합 단편은 하나 이상의 프로테아제와 동시에 또는 순차적으로 인큐베이션될 수 있다. 택일적으로, 또는 첨가하여, 순수한항체가 이황화 감소제로 처리될 수 있다. 그 다음, 펩티드는 겔 여과 크로마토그래피, 겔 전기영동, 및 역상 HPLC 를 제한없이 포함하는 당업계에 알려진 기술으로 서로 분리될 수 있다.
항-DC 항원-결합 단편은 당업계에 알려진 어떤 방법에 의해서 적합한 발현 시스템에서 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현으로 만들어질 수 있다. 전형적으로, 적합한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 적합한 프로모터의 조절하에서 발현 벡터에 연결되어 목적 숙주 세포를 유전적으로 변형시키는데 사용된다. 진핵 및 원핵 숙주 시스템 모두 사용될 수 있다. 그 다음 폴리펩티드는 융해 세포 또는 배양 배지로부터 분리되고 그것의 사용 목적에 필요한 정도로 정제된다. 본원발명의 사용에 적합한 원핵 숙주 세포의 예는 E. coli, Bacillus subtilis 및 어떤 다른 적합한 숙주 세포를 포함한다. 진핵 숙주 세포의 예는 효모, 조류, 곤충, 식물, 및 COS7, HeLa, 및 CHO 세포와 같은 동물세포를 제한없이 포함한다.
선택적으로, 매트릭스-코팅 채널 또는 비드 및 세포 공배양이 세포를 생산하는 항원-결합 단편의 성장을 증진시키기 위해 포함될 수 있다. 많은 양의 mAb 를 생산하기 위해서, 일반적으로 복수액을 얻는 것이 더욱 용이하다. 복수를 증가시키는 방법은 일반적으로 면역적으로 천연, 조직 적합성 또는 면역 내성 동물, 특히 마우스에 하이브리도마 세포를 주사하는 것을 포함한다. 포유동물은 예를 들어, 프리스탄(Pristane)과 같은 적합한 조성물의 사전 투여에 의해서 복수 생산이 프라이밍될 수 있다. 복수액을 동물로부터 제거하고 프로세싱하여 항체를 분리한다.
택일적으로, 항원-결합 단편은 아미노산 서열 데이타 및 본원에 제공된 다른 정보와 함께 표준 단백질 합성 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 적합한 방법은 고체상 메리필드(Merrifield) 기술이다. 자동화 펩티드 합성기는 Applied Bio systems, Inc. (Foster City, CA) 에서 제조된 것 등 상업적으로 입수가능하다.
항-DC 항원-결합 단편을 얻는 다른 방법은 BDCA-2, BDCA-3 및/또는 BDCA-4 로 적합한 숙주 동물을 면역화한 다음에 다클론 또는 mAb 생산 및 분리를 위한 표준 방법을 수행하는 것이다. 그러므로, mAb 는 당업계에 알려진 방법으로 "인간화"될 수 있다. 그러므로, 본원발명은 인간화 mAb 를 포함한다.
"인간화" 항체에서, 서열의 최소한의 부분이 그것의 최초의 형태로부터 변형되어서 그것을 더욱 사람 Ig 와 유사하게 한다. 제1의 버젼에서, H 사슬 및 L 사슬 C 영역이 사람 서열로 대체된다. 이것은 항-DC V 영역 및 이형 Ig(C) 영역을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 제2의 버젼에서, CDR 영역은 항-DC 아미노산 서열을 포함하는 반면에, V 골격 영역은 사람 서열로 전환되었다. 예를 들어, EP 0329400 참조. 제3의 버젼에서, V 영역은 사람 및 마우스 V 영역의 컨센서스 서열을 유전자 조작하고, 컨센서스 서열간의 상이한 CDR 외부의 잔기를 전환함으로써 인간화된다.
인간화 항체의 제조에서, 골격 잔기의 선택은 높은 결합 친화력을 보유하는데 도움이 될 수 있다. 원칙적으로, 어떤 사람 항체로부터의 골격 서열은 CDR 이식을 위한 주형으로 기능할 수 있지만, 이러한 골격으로의 직접적인 CDR 대체가 항원 결합 친화성의 의미있는 손실을 초래할 수 있다는 것이 증명되었다. Glaser et al. (1992) J. Immunol. 149 : 2606 ; Tempest et al. (1992) Biotechnol. 9 : 266 ; 및 Shalaby et al. (1992) J. Exp. Med. 17 : 217. 사람 항체가 순수한 뮤린 항체에 더욱 동형일 수록, 사람 골격은 친화성을 감소시킬 수 있는 뮤린 CDR 에의 왜곡을 도입할 가능성이 더욱 감소한다. 서열 상동성에 기초하여, 항체 서열 데이타베이스, 사람 항체 IC4 에 대한 연구는 muM4TS.22 에 대한 양호한 골격 상동성을 제공하지만, 다른 높은 동형 사람 항체, 특히 사람의 아그룹 I 으로부터의 кL 사슬 또는 사람의 아그룹 III 로부터의 H 사슬이 또한 적합하다. Kabat et al.(1987). ENCAD 와 같은 다양한 컴퓨터 프로그램은 V 영역에 대한 이상적인 서열을 예언한다. Levitt et al. (1983) J. Mol. Biol. 168 : 595. 그러므로, 본원발명은 상이한 V 영역을 가지는 사람 항체를 포함한다. 적합한 V 영역 서열을 결정하고, 이러한 서열을 최적화하는 것은 당업자의 기술범위내이다. 감소된 면역원성을 가진 항체를 업든 방법이 또한 U.S. 특허번호 5,270,202 및 EP 699,755 에 개시된다.
항원-결합 단편 또는 DCA 가 식물 종자와 같은 적합한 저장 배지에서 발현된 경우와 같은 어떤 응용에서, 항원-결합 단편은 정제없이 저장될 수 있다. Fiedler et al. (1995) Biotechnol. 13 : 1090-1093. 대부분의 경우에, 폴리펩티드가 다른 세포성분으로부터 적어도 부분적으로 정제되는 것이 일반적으로 바람직하다. 바람직하게는, 펩티드는 총 단백질의 무게비에 비하여 적어도 약 50% 순수하다. 더욱 바람직하게는, 펩티드는 적어도 약 50-75% 순수하다. 임상 사용을 위해서, 펩티드는 적어도 약 80% 순수하다.
펩티드가 피험자에 투여된다면, 바람직하게는 적어도 80% 순수하고, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 순수하고, 가장 바람직하게는 적어도 95% 순수하고 피로겐 및 다른 오염제가 없어야 한다. 본원에서, 백분율 순도는 제조된 총 단백질 함량의 무게비로 계산하고, 의도적으로 조성물 정제에 첨가된 성분은 포함하지 않는다.
본원발명은 또한 생체샘플내의 DC 및 그것의 서브셋을 검출, 계수 및/또는 동정하고, 체액에서 가용성 BDCA-2, BDCA-3 또는 BDCA-4 및/또는 DC 와 같은 항원을 측정하는 것을 포함한다. 본원발명의 방법은 생체샘플을 얻는 것, 항체-항원-결합을 허용하는 조건하에서 본원에 개시된 항원-결합 단편과 샘플을 접촉시키는 것, 및 가능하다면, 대조군, 생물 샘플과 비교하여 샘플에 대한 항체의 결합을 검출하는 것을 포함한다.
생물샘플이 적합하게 제조된 후에, 예를 들어, DC 농도 또는 항원 농도를 농축시킴으로써, 이것은 DC 또는 항원과 항체간의 복합체 형성을 허용하는 조건하에서 과량의 항원-결합 단편과 혼합된다. 그 다음, 형성된 복합체의 양 또는 DC 를 함유하는 복합체의 수가 결정되고, 최종적으로 기대되거나 알려진 DC 농도 범위에서 표적 항원의 공지된 양을 함유하는 표준 샘플과 형성된 복합체를 비교했다. 복합체 형성은면역침전 또는 혼탁측정법으로 관찰될 수 있지만, 125I 와 같은 방사성동위원소, 과산화효소 및 β-갈락토시다제와 같은 효소, 또는 플루오레세인과 같은 형광색소와 같은 표지로 표지된 시약을 사용하는 것이 일반적으로 더욱 감도가 좋다. 세포 및 항원을 검출하는 방법은 당업계에 잘 알려진다. 세포 검출용으로, 항원과 함께 유동 세포계측법이 특히 유용하고, ELISA 가 바람직하다.
항원에 대한 항-DC 항원-결합 단편의 특이적 인식은 당업계에 알려진 어떤 면역분석으로 시험될 수 있다. 직접 결합 분석의 어떤 형태가 적합하다. 이러한 분석에서, 하나의 결합 파트터, 항원 또는 추정되는 항원-결합 단편이 표지된다. 적합한 표지는 125I 와 같은 방사성동위원소, 과산화효소 및 β-갈락토시다제와 같은 효소, 또는 플루오레세인과 같은 형광 표지, 및 화학발광 표지를 제한없이 포함한다. 전형적으로, 다른 결합 파트너는 비결합 가용성 결합 파트너의 제거를 촉진하도록 (예를 들어, 마이크로타이터 플레이트와 같은 고체상에 코팅함으로써) 불용성이다. 표지된 결합 파트너와 비표지 결합 파트너를 결합한 후에, 고체상을 세척하고 결합 표지의 양을 결정한다.
면역요법에 사용된 경우에, 본원에 개시된 항원-결합 단편은 본원발명에 개시되고, 당업계에 알려진 대로 요법제와 함께 비표지 또는 표지될 수 있다. 이러한 약제는 본원발명 단편의 항원 결합 단편에 직접 또는 간접적으로 결합된다. 간접 결합의 한 예는 스페이서 부분의 사용에 의한 것이다. 이러한 스페이서 부분은 교대로, 불용성 또는 가용성 일 수 있고(Diener et al. (1986) Science 231 : 148) 표적 부위에서 약제 해리를 가능하게 하도록 선택될 수 있다. 면역요법용 항원-결합 단편에 결합될 수 있는 치료제의 예는 종양 항원을 포함하는 항원, 바이러스 항원, 세균 항원, 기생충-유래 항원 및 자가항원, 생체반응 조절자, 약제, 방사성동위원소, 렉틴, 및 독소를 제한없이 포함한다. 생체반응 조절자는 IL-2, IL-3, IL4, G-CSF, GM-CSF, IL-10, IL-12, TGF-P, MTP-AB, SDF-1, 림포택틴, DC-CK1, 에오톡신, IP-10, TARC, Rantes, MIP-lα, MIP-1β, SLC, ITAC, MIE, MDC, MCP-1, TCA-3, MCP-2,-3,-4 및 인터페론을 제한없이 포함하는 사이토카인 및 케모카인을 포함한다. 항원-결합 단편이 표지될 수 있는 인터페론은 IFN-α, IFN-β, 및 IFN-γ및 그들의 아형을 포함한다.
면역요법용으로 방사성동위원소로 융합된 항원-결합 단편을 사용하는 경우에, 어떤 이소형은 이소형 안정성 및 방출과 같은 인자에 의존하는 다른 것보다 더욱 바람직할 수 있다. 원한다면, 항원-결합 단편으로 인식된 세포 집단이 하기에 개시된 생체내 진단 기술으로 평가될 수 있다. 일반적으로, α및 β입자-방출 방사성동위원소가 면역요법에 바람직하다. 예를 들어, 90Y 와 같은 조직의 몇 ㎛에 침투할 수 있는 고에너지 β방출자가 바람직하다. 한편으로, 212Bi 와 같은 짧은 범위의 고에너지 α방출자가 바람직하다. 치료 목적을 위해서 본원발명의 항원-결합 단편에 결합할 수 있는 방사성동위원소의 예는 125I, 131I, 90Y, 67Cu, 212Bi, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd, 및 188Re 을 제한없이 포함한다.
렉틴은 일반적으로 식물 물질로부터 분리된 단백질이고, 특정 당부분에 결합한다. 많은 렉틴은 세포를 접합시킬 수 있고, 림프구를 자극한다. 그러나, 리신이 면역치료에 사용되어 온 독소 렉틴이다. 이것은 독소 효과의 부위 특이적 송달을 가능하게 하는 항체 분자에 독소에 대한 책임이 있는 리신의 α펩티드 사슬의 결합으로 이루어진다.
독소는 식물, 동물, 또는 미생물에 의해 충분한 양으로 생산된 유독 물질이고, 종종 치명적이다. 디프테리아 독소는 치료에 사용될 수 있는 Corynebacterium diphtheria 에 의해 생산된 물질이다. 이러한 독소는 적합한 조건하에서 분리될 수 있는 α및 β 서브유닛으로 구성된다. 독소 A 사슬 성분은 본원에 개시된 항원-결합 단편에 결합될 수 있고, DC 의 특적 서브셋에 대하 부위 특이적 송달에 사용될 수 있다.
재조합 방법이 당업계에 잘 알려진다. 본원발명의 실행은 달리 지적되지 않는 한, 당업계의 기술범위내인 (재조합 기술을 포함하는)분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 종래 기술을 사용한다. 이러한 기술은 "Molecular Cloning : A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989);"Oligonucleotide Synthesis" (Gait, ed., 1984);"Animal Cell Culture" (Freshney, ed., 1987);"Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.) ;"Handbook of Experimental Immunology" (Wei & Blackwell, eds.);"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller & Calos, eds., 1987);"Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel et al., eds.,1987);"PCR : The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994); 및 "Current Protocols in Immunology" (Coligan et al., eds., 1991)과 같은 문헌에 충분히 설명된다. 이러한 기술은 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 생산에 이용가능하고, 그 자체로 본원발명의 제조 및 실행으로 여겨질 수 있다. 특히 유용한 기술이 하기의 단락에 논의된다.
본원발명은 BDCA 항원을 코딩하는 다양한 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본원발명은 또한 이러한 항원과 기능적 등가의 변이체 및 유도체 및 폴리뉴클레오티드에 의해서 코딩된 폴리펩티드의 성질을 증진, 감소 또는 의미있는 영향을 미치지 않을 수 있는 그것의 기능적 등가의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 기능적 등가의 변이체, 유도체, 및 단편은 그들의 각각의 항체에 특이적으로 결합하는 능력을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 코딩 폴리펩티드의 성질에 의미있는 영향을 주지 않을 것인 변화는 코딩된 아미노산 서열을 변형시키지 않는 DNA 서열뿐만 아니라 아미노산 잔기의 보존적 치환을 초래하는 DNA 서열에서의 변화, 아미노산 유사체에 의한 아미노산 잔기의 하나 또는 몇몇의 아미노산 잔기 결실 또는 추가, 및 치환를 제한없이 포함한다. 보존적 치환은 보존적 아미노산 치환이 글리신/알라닌; 발린/이소류신/류신; 아스파라긴/글루타민; 아스타르트산/글루탐산; 세린/트레오닌 /메티오닌; 리신/아르기닌; 및 페닐알라닌/트립신/트립토판이다.
본원발명의 폴리뉴클레오티드는 동일 전사 단위내의 추가의 코딩 서열과 같 은 추가의 서열, 프로모터와 같은 조절 요소, 리보섬 결합 부위, 및 폴리아데닐화 부위, 동일 또는 상이한 프로모터의 조절하의 추가의 전사 단위, 클로닝, 발현, 및 숙주 세포의 형질전환을 허용하는 서열과 같은 추가의 서열을 포함할 수 있고, 이러한 구성체는 본원발명의 구체예를 제공하는데 바람직하다.
본원발명은 BDCA-2 및 BDCA-3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 도 12에서 밝혀진 cDNA 서열과 안정한 하이브리드를 형성할 수 있는, 적어도 15 개의 연속성 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 약 20 개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 약 25 개의 연속성 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 약 35 개의 연속성 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 약 50 개의 연속성 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 75 개의 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 100 개의 뉴클레오티드, 더욱더 바람직하게는 약 300 개의 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 적어도 한 셋트가 시험 폴리뉴클레오티드가 요구된 특이성을 나타내는 경우에 존재한다는 것을 조건으로, 어떤 조건 셋트든지 이 시험에 사용될 수 있다.
혼성화 반응은 상이한 "긴축성"의 조건하에서 수행될 수 있다. 혼성화 반응의 긴축성을 증가시키는 조건이 공개된다. 예를 들어, Sambrook and Maniatis 참조. 관련 상태의 예는 (긴축성을 증가시키는 순서로): 25℃, 37℃, 50℃및 68℃ 의 온도로 인큐베이션; 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0.1 x SSC 의 완충액 농도(SSC는 0.15 M NaCI 및 15 mM 시트레이트 완충액) 및 다른 완충 시스템을 사용하는 그것의 등가물; 0%, 25%, 50%, 및 75% 의 포름아마이드 농도; 5 분 내지 24 시간의 인큐베 이션 시간; 1, 2, 또는 그 이상의 세척 단계; 1,2, 또는 15분의 세척 인큐베이션 시간; 및 6 x SSC, 1 x SSC, 0.1 x SSC, 또는 탈이온수의 세척 용액.
본원발명은 또한 BDCA 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 바람직하게, 폴리펩티드는 도12에 도시된 것으로부터 유래된다.
본원발명은 또한 검출가능한 표지에 공유결합된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 관련 뉴클레오티드 서열의 검출용 프로브로서 사용된다.
본원발명의 폴리뉴클레오티드는 화학 합성, 재조합 클로닝 방법, PCR, 또는 그것의 어떤 조합을 사용하여 얻을 수 있다. 화합 폴리뉴클레오티드 합성의 방법이 당업계에 잘 알려지고, 본원에 더 상세히 개시할 필요가 없다. 당업자는 DNA 합성기 또는 상업원으로부터의 순서화를 사용하여 원하는 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해서 본원에 제공된 서열 데이타를 사용할 수 있다.
택일적으로, BDCA 를 코딩하는 뉴클레오티드 및 그것에 의해 코딩된 펩티드는 생산 세포라인, 클로닝 벡터, 또는 발현 벡터로부터 얻을 수 있다. 원하는 서열을 코딩하는 RNA 또는 DNA 는 표준 재조합 기술로 분리, 증폭 및 프로세싱될 수 있다. 이러한 기술은 제한 뉴클레아제로의 분해, 및 중합효소 연쇄반응(PCR)으로의 증폭, 또는 그것의 적합한 조합을 포함한다. PCR 기술은 U.S. 특허번호. 4,683, 195; 4,800,159; 4,754,065; 및 4,683,202, 뿐만아니라 PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston (1994)에 개시된다. 그것에 의해서 코딩된 펩티드의 분리 및 정제는 당업계에서 알려진 어떤 방법일 수 있다.
원하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 적합한 벡터로 삽입될 수 있고, 벡터는 차례로 복제 및 증폭을 위해 적합한 숙주 세포로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 당업계에 알려진 어떤 수단으로 숙주 세포에 삽입될 수 있다. 세포는 직접 섭취, 엔도시토시스, 트랜스펙션, f-메이팅 또는 일렉트로포레이션으로 외인성 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 형질전환된다. 일단 도입되면, 외인성 폴리뉴클레오티드는 비통합 벡터(플라스미드)로 세포에 유지될 수 있거나, 숙주 세포 게놈에 통합될 수 있다. 증폭된 DNA 는 표준 방법으로 숙주 세포로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, Sambrook et al.(1989)참조. RNA 는 또한 형질전환된 숙주 세포로부터 얻어질 수 있고, 이것은 DNA-의존성 RNA 폴리머라제를 사용하여 얻어질 수 있다.
본원발명은 더욱이 BDCA-2 및/또는 BDCA-3 을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 다양한 벡터를 포함한다. 이러한 벡터는 재조합체 폴리펩티드뿐만 아니라 BDCA-코딩 폴리뉴클레오티드의 원의 발현에 사용될 수 있다. 클로닝 벡터는 폴리뉴클레오티드의 복합체 카피를 얻는데 사용되거나 장래의 회수를 위해서 보관용으로 폴리뉴클레오티드를 저장하는데 사용될 수 있다. 발현 벡터(및 이러한 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포)는 함유하는 폴리뉴클레오티드로부터 생산된 폴리펩티드를 얻는데 사용될 수 있다. 그것들은 피험자에서 BDCA-2 및/또는 BDCA-3 를 발현하므로 유전자 요법과 같은 폴리펩티드를 합성할 수 있는 순수한세포를 가지는 것이 바람직한 경우에 사용될 수 있다. 적합한 클로닝 및 발현 벡터는 세균, 포유동물, 효 모 및 곤충 발현 시스템에서 사용하기 위한 것과 같은 당업계에 알려진 어떤 것을 포함한다. 특이적 벡터 및 적합한 숙주 세포가 당업계에 알려지고 본원에서는 상세하게 개시하지 않는다. 예를 들어, Gacesa and Ramji, Vectors, John Wiley & Sons(1994)참조.
클로닝 및 발현 벡터는 전형적으로 선택가능한 마커(예를 들어, 벡터로 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 코딩하는 유전자)를 함유하지만, 이러한 마커 유전자는 다른 폴리뉴클레오티드 서열 공도입으로 숙주 세포에 운반될 수 있다. 선택가능한 유전자가 도입된 단지 이러한 숙주 세포만이 선택적 조건하에서 배양될 것이다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항체 또는 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트와 같은 다른 독소 물질; (b) 보체 영양요구 결핍에 내성을 부여하거나; (c) 복합배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양분을 공급한다. 적합한 마커 유전자의 선택은 숙주 세포에 의존할 것이고, 상이한 숙주에 대한 적합한 유전자가 당업계에 알려진다. 벡터는 또한 전형적으로 숙주에 의해서 인식된 복제 시스템을 함유한다.
적합한 클로닝 벡터가 표준 기술에 따라서 구성될 수 있거나, 또는 본 분야에서 입수가능한 다수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택되는 클로닝 벡터는 사용될 숙주 세포에 따라서 변할 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자기-복제하는 능력을 가질 것이며, 특정한 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 지닐 수 있거나, 또는 벡터를 함유하는 클론을 선택하는데 사용될 수 있는 마커를 위한 유전자를 지닐 수 있다. 적합한 예는 플라스미드 및 박테리아 바이러 스, 예를 들어 pUC18, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 pSA3 및 pAT28과 같은 셔틀 벡터를 포함한다. 이들 및 많은 다른 벡터는 BioRad, Stratagene, 및 Invitrogen으로부터 입수가능하다.
발현 벡터는 일반적으로 관심의 BDCA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오티드 구성물이다. BDCA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터, 인핸서 및 터미네이터와 같은 적합한 전사 제어 요소에 작동가능하게 연결된다. 발현(즉, 번역)을 위해서, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위, 및 중지 코돈과 같은 하나 이상의 전사 제어 요소가 또한 통상적으로 필요하다. 이들 제어 요소(전사 및 번역)는 BDCA를 코딩하는 유전자로부터 유도될 수 있거나, 또는 이종성(즉, 다른 유전자 또는 다른 유기체로부터 유도)일 수 있다. 또한, 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 포함되어, BDCA가 세포 멤브레인을 가로지르거나 또는 세포 멤브레인에 머무르는 것을 허용하거나, 또는 세포로부터 분비되는 것을 허용할 수 있다. 이스트, 조류, 및 포유류 세포를 포함하는 진핵 세포에서의 발현에 적합한 많은 발현 벡터가 본 분야에 공지되어 있다. 발현 벡터의 한 예는 pcDNA3(Invitrogen, 캘리포니아 샌디에고)로서, 여기에서 전사는 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 프로모터/인핸서에 의해 유도된다. 또한, 이 벡터는 관심의 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위한 다중 제한 효소에 대한 인식 부위를 함유한다. 발현 벡터(시스템)의 다른 예는 바쿨로바이러스/곤충 시스템이다. BDCA 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항체-표적화 유전자 요법에의 사용에 적합하다. 적합한 시스템이 예를 들어 Brown 등 (1994) Virol. 198:477-488; 및 Miyamura 등 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8507-8511에 의해 설명된다.
관심의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터가 전기천공, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 또는 다른 기질을 사용하는 트랜스펙션, 미세발사 충격, 리포펙션, 및 감염을 포함하는 많은 적합한 수단 중 어느 것에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다. BDCA를 코딩하는 벡터 또는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 수단의 선택은 주로 숙주 세포의 특징에 의존할 것이다.
일단 적합한 숙주 세포에 도입되면, BDCA의 발현이 본 분야에 공지된 다른 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 그것들의 존재가 배양 상청액(폴리펩티드가 분비된 경우) 또는 세포 여액의 RIA 또는 ELISA에 의해 검출될 수 있다.
본 발명의 벡터는 BDCA를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 또한, 제한은 없지만 IL-2, IL-4, GM-CSF, TNF-α 및 IFN-γ를 포함하는 사이토카인과 같은, 원하는 결과를 증진하거나, 용이하게 하거나, 또는 조정하는 다른 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 또한, 본 발명에서는 재조합 BDCA를 코딩하는 우두 벡터가 구현된다.
본 발명의 다른 구체예는, 상술된 바와 같이, BDCA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포이다. 원핵 및 진핵 숙주 세포가 모두 사용될 수 있다. 원핵 숙주는 제한은 없지만 박테리아 세포, 예를 들어 E. coli 및 mycobacteria를 포함한다. 진핵 세포는 제한은 없지만 이스트, 곤충, 조류, 식물 및 포유류 세포를 포함한다. 숙주 시스템은 본 분야에 공지되어 있으며, 본원에서는 상세히 설명되지 않는다. 포유류 숙주 세포의 예는 제한은 없지만 European Collection of Cell Cultures(영국)으로부터 입수가능한 CHO 및 NS0를 포함한다. 예를 들어 CMV 프로모터에 의해 유도된 플라스미드로 NS0를 트랜스펙션한 후, 글루타민 신타제를 사용하여 이 플라스미드를 증폭하는 것은 단백질 생성에 유용한 시스템을 제공한다. Cockett 등 (1990) Bio/Techno logy 8:662-667.
본 발명의 숙주 세포는 특히, BDCA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 저장소로서, 또는 그것들의 생성을 위한 전파체로서 사용될 수 있다. 숙주 세포는 또한 생체내에서 BDCA의 발현을 위한 전파체로서 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 몇가지 용도를 가진다. 그것들은 예를 들어 BDCA의 생성을 위한 발현 시스템에 유용하다. 그것들은 또한 당업자에게 잘 공지된 방법을 사용하여 샘플에서 BDCA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 관련 서열의 존재를 분석하기 위한 혼성화 프로브로서 유용하다. 더욱이, 폴리뉴클레오티드는 또한 원하는 폴리뉴클레오티드의 증폭을 행하기 위한 프라이머로서 유용하다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 백신을 포함하는 제약학적 조성물 및 유전자 치료법에 유용하다.
또한, 폴리뉴클레오티드는 BDCA-코딩 서열의 검출을 위한 혼성화 프로브로서 사용될 수 있다. 적합한 혼성화 샘플은 유전자 치료법에 사용하기 위해 생체외에서 형질전환된 세포를 포함한다. 한 예에서, DNA 또는 RNA가 샘플로부터 추출되고, 선택적으로 겔위에 전개되거나 및/또는 제한 뉴클레아제로 잘려진다. 프로세 싱된 샘플 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 세척용의 적합한 배지로 옮겨진다. 다음에, 샘플 폴리뉴클레오티드는 샘플이 상보성 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 경우 안정한 듀플렉스가 형성되는 조건하에서 BDCA-코딩 폴리뉴클레오티드 프로브와 접촉된다. 형성된 어떤 안정한 듀플렉스는 어떤 적합한 수단에 의해 검출된다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 프로브가 표지된 형태로 공급될 수 있고, 세척 후에 샘플과 함께 잔류하는 표지가 형성된 안정한 듀플렉스의 양을 직접 반영할 것이다. 제 2 예에서, 혼성화가 제자리에서 수행된다. 적합하게 제조된 조직 샘플이 BDCA-코딩 서열의 위치를 나타내기 위해 표지된 프로브로 덮힌다.
또한, 짧은 뉴클레오티드가 특히 프라이머와의 혼성화 영역을 포함하는 더 긴 서열을 증폭하기 위한 PCR 반응의 프라이머로서 사용될 수 있다. 이것은 예비적으로 수행되어 더 이상의 유전적 조작을 위한 폴리뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 또한, 그것은 분석적으로 수행되어, 예를 들어 진단적 관심의 샘플에 BDCA-코딩 폴리뉴클레오티드가 존재하는지의 여부를 측정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 다른 사용은 백신 및 유전자 치료법에서이다. 일반적인 이론은, 폴리뉴클레오티드를 투여함으로써 그것에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현을 촉진하거나 또는 약화시키는 것이다. 따라서, 본 발명은 면역 반응을 유도하는 방법 및 개체에게 BDCA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유효량을 투여하는 것를 포함하는 치료 방법을 포함한다. 이들 방법에서, BDCA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 직접 또는 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션된 세포에 의하여 개체에게 투여된다. 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 원형 플라스미드의 형태이며, 바람직하게 초 선륜 입체구조이다. 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 세포 내부에서 복제된다. 따라서, 폴리뉴클레오티드는 표적 조직 종류의 세포에서 고유하게 활성화하는 이종성 프로모터와 같은 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 바람직하게, 일단 세포핵에 있으면, 플라스미드는 원형 비-복제 에피솜 분자로서 존속한다. 예를 들어 더 큰 친화성 및/또는 결합활성을 가지는 분자를 코딩하기 위해 시험관내 돌연변이가 플라스미드 구성물을 사용하여 수행될 수 있다.
BDCA 폴리뉴클레오티드를 함유하는 플라스미드가 진핵 세포에서 발현가능한지의 여부를 측정하기 위해서, COS-7, CHO, 또는 HeLa와 같은 세포가 플라스미드로 트랜스펙션될 수 있다. 다음에, 발현이 면역분석, 예를 들어 웨스턴 블롯에 의해 측정된다. 예를 들어 플라스미드를 구성함에 의해 더 적은 BDCA가 검출될 수 있으며, 결과의 폴리펩티드는 표적 에피토프 또는 효소 표지와 같은 표지와 융합된다. 발현된 폴리펩티드에 대한 더 이상의 특성화가, 펩티드의 정제 후 본원에 설명된 기능적 분석법 중 하나를 수행함에 의해 달성될 수 있다.
유전자 치료법의 한 방식에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 생체외에서 세포를 유전적으로 변경하기 위해 사용된다. 이 전략에서, 도너로부터 떼어내거나 또는 셀라인으로부터 얻어진 세포가 BDCA 벡터로 트랜스펙션 또는 트랜스덕션된 후 레시피언트에게 투여된다. 트랜스펙션에 적합한 세포는 말초혈 단핵 세포를 포함한다.
유전자 치료법의 다른 방식에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 생체내에서 세포를 유전적으로 변경하기 위해 사용된다. 이것은 제한은 없지만 다양한 종류의 암을 치료하기 위한 목적을 포함한다.
또한, 폴리뉴클레오티드는 BDCA-2를 발현하지 않는 세포, 및 BDCA-2를 발현하는 트랜스제닉 동물을 생성하는데 사용될 수 있다.
또한, BDCA-2를 발현하지 않거나 또는 유의하게 감소된 수준으로 발현하도록 조작된 세포가 본 발명으로부터 얻어진다. 그러한 세포는 세포, 바람직하게 DC를 선택하고, 이 세포에 BDCA-2 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 구성물을 제공함에 의해 생성될 수 있으며, 여기에서 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 대한 안티센스에 위치하여, 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 그러한 폴리뉴클레오티드의 발현은 BDCA-2에 결함을 가지는 세포를 효과적으로 생성한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 유의하게 감소된 양의 BDCA-2를 생성하거나, 또는 심지어 BDCA-2의 생성을 "녹아웃"하는 재조합 숙주 세포의 제조 방법을 제공한다. 이들 재조합 숙주 세포는 당업자에게 잘 공지된 하나 이상의 수단을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현은 안티센스 DNA 또는 RNA 구성물을 게놈에 결합시킴으로써 저해될 수 있다. 내인성 BDCA-2 유전자의 결실 또는 돌연변이는 그것들을 비기능성으로 만들 수 있다. BDCA-2 mRNA를 특이적으로 절단하는 리보자임--RNA-절단 효소--을 코딩하는 핵산이 재조합 숙주 세포에 도입될 수 있다.
용어 "녹아웃"은 세포에서 내인성 DNA 서열, 예를 들어 BDCA-2에 의해 코딩되는 단백질의 적어도 일부의 발현에 대한 부분적 또는 완전한 억제로 간주한다. 용어 "녹아웃 구성물"은 세포에서 내인성 DNA 서열에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 감소 또는 억제하도록 디자인된 핵산 서열로 간주한다.
이들 재조합 구성물은 녹아웃 포유류에 결합됨으로써 DC에서 BDCA-2의 생성을 억제할 수 있다. 녹아웃 및 트랜스제닉 동물의 제조는 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 5,434,340, 5,530,179 및 5,557,032에 설명된다.
본 발명은 BDCA-2를 과발현하는 동물의 제조 방법을 더 제공한다. 이들 방법은 일반적으로, BDCA-2 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 세그먼트가 동물 세포에 삽입되도록 시험관내에서 처리되어 동물 BDCA-2를 생체내에서 발현하는 동물 세포를 동물에 도입하는 것을 포함한다.
D. 키트
본 발명은 혈청 또는 다른 공급원에서 가용성 BDCA-2를 포함하는 BDCA-2(그것들의 동형을 포함)를 측정하기 위한, 항-DC-특이적 항원-결합 단편을 함유하는 키트를 포함한다. 키트를 사용하는 진단 과정은 진단 연구실, 실험 연구실, 개업의, 또는 사인에 의해 수행될 수 있다. 임상 샘플은 시험될 표적을 부화시키기 위해 선택적으로 전처리된다. 다음에, 사용자는 키트에 함유된 시약을 사용하여 진단 성분의 수준 변화 또는 진단 성분의 변경을 검출한다.
선택적으로, 시약은 표지와 콘쥬게이트되어 샘플에서 표적과 함께 형성된 어떤 착물의 검출을 허가할 수 있다. 다른 선택사항으로, 제 1 시약의 표적이 발견됨으로써 검출가능한 표지가 공급된 후, 제 1 시약과 조합할 수 있는 제 2 시약이 제공된다. 예를 들어, 표지된 항-뮤린 IgG가 제 2 시약으로서 제공될 수 있다. 제 1 시약이 비오틴과 콘쥬게이트된 경우, 표지된 아비딘이 제 2 시약이다.
키트는 액체 샘플, 세포 현탁액 및 조직 샘플을 모두 포함하는 여러 생물학 적 샘플에 사용될 수 있다. 키트 형태에 공급될 수 있는 적합한 분석법은 본원에 설명된 것들을 포함한다.
각 시약은 고체 형태로 공급되거나, 또는 재고품을 저장하고 나중에 시험이 수행될 때 반응 배지를 교환하거나 또는 반응 배지에 첨가하기에 적합한 액체 완충액에 용해/현탁된다. 적합한 패키징이 제공된다. 키트는 선택적으로 과정에 유용한 추가의 성분을 제공할 수 있다. 이들 선택적 성분은 제한은 없지만 완충액, 포착 시약, 전개 시약, 표지, 반응 표면, 검출 수단, 대조표준 샘플, 지시사항, 및 해석 정보를 포함한다.
E. 치료적 조성물
1. 문제의 조성물
본원에 설명된 제약학적 조성물의 제조는 제약학적 제제의 제조에 관해 일반적으로 허용된 과정에 따라서 수행된다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences 18th Edition (1990), E. W. Martin ed., Mack Publishing Co., PA 참조. 의도된 용도 및 투여 방식에 따라서, 제약학적 조성물의 제조에서 활성 성분을 더 프로세싱하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 프로세싱은 멸균, 적합한 비독성 및 비간섭성 성분과의 혼합, 용량 단위로 나누기, 및 송달 장치에 넣기를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 치료적 조성물은 DC, 그것들의 아집단, 또는 그것들의 혼합물을 함유한다. 다른 구체예에서, 조성물은 본원에 설명된 항원-결합 단편을 함유한다. 바람직하게, 항원-결합 단편이거나, 또는 유도 형태인 표 1에 열거된 mAb들이다. 바람직하게, DC 조성물은 이들 항원-결합 단편 중 하나와 함께 분리된 DC를 함유한다.
(a) 일반적 투여 방식
본 발명의 제약학적 조성물은 조성물의 형태에 적합한 방식으로 투여된다. 전형적인 경로는 정맥내, 피하, 근육내, 복막내, 피내, 경구, 비강내, 및 폐내(즉, 에어로졸에 의해)를 포함한다. 사람용의 제약학적 조성물은 전형적으로 비경구적 경로에 의해 투여되며, 가장 전형적으로 정맥내, 피하, 근육내로 투여된다. 필수적이지는 않지만, 제약학적 조성물은 바람직하게 정확한 양의 투여에 적합한 단위 투약량 형태로 공급된다. 또한, 본 발명은 느린 방출 또는 지속 방출 형태도 고려하며, 이로써 비교적 일정한 수준의 활성 화합물이 연장된 기간에 걸쳐 제공된다.
(b) 액체 조제물
제약학적으로 허용되는 액체 조성물은, 예를 들어 물, 살린, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 또는 에탄올과 같은 액체 부형제에 본원에서 구현된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 용해 또는 분산함에 의해 제조될 수 있다. 또한, 조성물은 다른 의약 제제, 제약학적 제제, 담체, 및 습윤제 또는 유화제, 및 pH 완충제와 같은 보조 물질을 선택적으로 함유한다. 주사용 조성물은 액체 용액 또는 현탁액, 에멀젼, 또는 주사 전에 액체에 용해 또는 현탁하기 적합한 고체 형태로서 공급될 수 있다.
경구, 비강내, 또는 국부 투여용 제약학적 조성물은 고체, 반고체 또는 액체 형태로 공급될 수 있으며, 정제, 캡슐, 분말, 액체, 및 현탁액을 포함한다. 기도에 의한 투여용의 바람직한 조성물은 고체, 분말, 또는 적합한 연무기 장치와 함께 사용되는 때 액체 에어로졸로 제공되는 것이다.
또한, 본 발명은 종양 영역 또는 이상형성 세포에, 또는 면역 시스템에 리포솜을 특이적으로 송달하기 위한, 멤브레인 결합된 펩티드를 가지는 리포솜을 포함하는 조성물을 포함한다. 이들 리포솜은 펩티드에 더하여 상술된 것들과 같은 면역치료제를 함유하도록 생성될 수 있으며, 다음에 이 면역치료제는 인식 부위에서 방출된다. Wolff 등 (1984) Biochem. Biophys. Acta 802:259. 다른 그러한 송달 시스템은 항원-결합 단편의 제시를 위한 키메라 파보바이러스 B19 캡시드를 이용한다. Brown 등 (1994) Virol. 198:477-488; 및 Miyamura 등 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8507-8511. 그러한 키메라 시스템은 본원에서 사용을 위해 포함된다.
본 발명에서 구현된 조성물은 많은 방식으로 그것들의 효능에 대해 평가될 수 있다. 따라서, 시험 화합물이 적합한 제약학적 조성물로서 제조되고, 시험 피험자에 투여된다. 초기 연구는 마우스 또는 토끼와 같은 작은 동물에서 행하는 것이 바람직하며, 선택적으로 다음에 비사람 영장류에서 행한 후, 궁극적으로 사람에서 행한다. 면역원성은 바람직하게 이전에 항체 반응이 없었던 개체에서 시험된다. 시험 조성물을 적합한 시험 용량으로 적합한 치료 스케쥴에 따라 투여한다. 예측된 범위내에서 상이한 용량 및 스케쥴을 비교하는 것이 적합할 수 있다. 항원 -결합 단편의 투여를 위한 투약량 범위는, 원하지 않는 교차반응 및 아나필락시성 반응과 같은 심한 부작용 없이 질환의 증상이 개선되는 원하는 효과를 생성할 만큼 충분히 크다. 일반적으로, 투약량은 환자의 나이, 상태, 성별 및 질환 정도에 따 라 변할 것이며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 투약량은 어떤 합병증 때문에 주치의에 의해 조정될 수 있다. 일반적으로, 조성물이 치료제와 콘쥬게이트되어 투여되는 경우, 생체내에서 면역진단 영상화에 사용되는 것에 필적하는 더 적은 투약량이 사용될 수 있다.
2. 항원-결합 단편
본 발명은 본원에 설명된 항원-결합 단편을 함유하는 제약학적 조성물을 포함한다. 그러한 제약학적 조성물은 단독으로 또는 WO98/23735; WO98/34642; WO97/ 10000; WO97/10001; 및 WO97/06821에 설명된 화학요법, 방사선요법 또는 면역요법과 같은 다른 형태의 치료법과 함께, 면역 반응을 유도하거나 또는 돕는데, 그리고 이상형성 질환을 치료하는데, 또는 자가면역 질환(GvHD, 동종이식 거부반응, 알레르겐 등)에 대한 내성을 유도하고 이를 치료하는데 유용하다. 다른 치료 방법은 본원에 설명되거나 및/또는 본 분야에 공지되어 있다. 적합한 질환은 제한은 없지만 바이러스, 기생충, 박테리아, 진균, 이상형성 및 자가면역을 포함한다.
뮤린 유방암 모델에서, DC 및 B 세포를 포함하여 여러 조혈 계통에 대한 자극 사이토카인인 Flt-3-리간드(Flt-3-L)가 백신으로서 뮤린 유방암 세포와 함께 사용된다. Chen 등 (1997) Cancer Res. 57:3511-6. 또한, DC는 종양 항원과 함께 로딩되거나, 또는 종양 항원을 발현하도록 트랜스덕션될 수 있다. 다음에, 이들 세포가 종양 백신접종에 애쥬번트로서 사용된다. DC는 적합한 MHC-제한 환경에서 수입 림프 시스템에 내인성으로 종양-관련 항원을 제시한다. Wan 등 (1997) Hum. Gene Ther. 8:1355-63; Peiper 등, (1997) Surgery 122:235-41; 및 Smith 등 (1997 ) Int. Immunol. 9:1085-93. 현재 흑색종 백신은 항원 제시 네트워크를 조작하고, 최선의 세포와 종양 보호 면역성을 매개하는데 효과적인 항체 항-종양 면역 반응을 조합한다. 이들 치료법은 퇴행, 질환 진행의 지연 또는 어떤 경우 생존 개선을 야기하며 소수의 부작용을 가진다. Kuhn 등 (1997) Dermatol. Surg. 23:649-54. 또한, 흑색종 백신은 Conforti 등 (1997) J. Surg. Oncol. 66:55-64에 검토된다.
백신은 본 분야에 공지된 애쥬번트 또는 다른 성분(사이토카인과 같은)과 혼합되어, 제약학적으로 허용되는 담체에 패키지될 수 있다. 수의사가 사용하는 백신은 Freund's 완전 또는 불완전 애쥬번트와 같은 박테리아 및 박테리아 성분을 함유하는 애쥬번트가 제제에 허용된다는 것을 제외하고는 사람의 것과 실질적으로 유사하다.
F. 치료 방법
또한, 본 발명은 본원에 설명된 및/또는 본 분야에 공지된 여러 장애를 치료하는 방법을 포함한다. 이 방법은 원하는 효과, 즉 나타난 상태의 완화 또는 재발 방지를 달성하는데 효과적인 양으로, 본 발명의 조성물을 함유하는 제약학적 조성물의 양을 투여하는 것을 포함한다. 암의 치료를 위하여, 투여되는 제약학적 조성물의 양은 원하는 효과를 야기하는데 효과적인 양이다. 효과적인 양은 1회 또는 일련의 투여로 제공될 수 있다. 효과적인 양은 거환약으로, 또는 연속 관류에 의해 제공될 수 있다. 적합한 활성제는 항-이상형성성 약물, 생물반응 변형제, 및 Douillard 등 (1986) Hybridomas(Supp. 1:5139)에 설명된 것들과 같은 이펙터 세포를 포함한다.
제약학적 조성물 및 치료 양식은 이상형성에 대한 면역 반응을 직접 또는 간접적으로 유도함에 의해 환자를 치료하는데 적합하다. "개체", "환자" 또는 "피험자"는 척추 동물, 바람직하게 포유류, 더 바람직하게 사람이다. 포유류는 제한은 없지만 사람, 야생 동물, 맹수, 가축, 변종 동물, 및 애완 동물을 포함한다. "암 피험자"는 악성종양 또는 이상형성물 또는 그것들의 위험한 상태로 진단된 포유류, 바람직하게 사람이다.
본원에 사용된 바와 같은, "치료"는 치료될 개체 또는 세포의 질환 진행과정을 변경하기 위한 시도에 있어서의 임상적 개입으로 간주하며, 예방을 위해, 또는 임상적 병리학의 진행과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 치료적 효과는 제한은 없지만 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 경감, 질환의 어떤 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환의 진행 속도 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함한다.
질환 상태에 관련된 "병리학"은 영향을 받은 개체의 행복, 정상적인 생리기능, 또는 삶의 질을 손상시키는 어떤 상태이다. 이것은 제한은 없지만 이전에 영향을 받지 않은 영역으로 영향을 받은 조직의 파괴적인 침입, 정상 조직 기능을 희생시키는 성장, 변칙적 또는 억제된 생리학적 활성, 염증성 또는 면역학적 반응의 악화 또는 억제, 다른 병적 유기체 또는 제제에 대한 감수성의 증가, 및 통증, 발열, 구역질, 피로, 기분 변화, 및 주치의에 의해 측정될 수 있는 그러한 다른 질환 관련 특징과 같은 바람직하지 않은 임상적 증상을 포함할 수 있다.
"유효량"은 치료시 유리한 또는 바람직한 임상적 결과를 행하기에 충분한 양 이다. 유효량은 1회 이상의 용량으로 환자에게 투여될 수 있다. 치료에 관해서, 유효량은 질환의 진행을 완화, 개선, 안정화, 역전, 또는 늦추는데, 또는 다르게는 질환의 병리학적 결과를 감소시키기에 충분한 양이다. 유효량은 일반적으로 의사에 의해 케이스-바이-케이스로 결정되며, 본 발명의 범위내이다. 유효량을 달성하기 위해 적합한 투약량을 결정할 때, 몇몇 요인이 전형적으로 고려된다. 이들 요인은 환자의 나이, 성별 및 체중, 치료될 상태, 상태의 심각성, 및 투여되는 항원-결합 단편의 형태 및 효과적인 농도를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "면역조정성" 또는 "면역 반응을 조정"은 면역자극 및 면역억제 효과를 포함한다. 면역자극 효과는 제한은 없지만 세포 또는 사람의 면역 반응을 직접 또는 간접적으로 증진시키는 것들을 포하만다. 면역자극 효과의 예는, 제한은 없지만, 항원-특이적 항체 생성의 증가; NK 세포, CD4+ 세포, CD8+ 세포, 마크로파지 등과 같은 림프구 집단의 활성화 또는 증식; 제한은 없지만 IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, 인터페론, TNF-α, IL-10, TGF-β 등을 포함하는 사이토카인 또는 케모카인 합성의 증가를 포함한다. 면역억제 효과는 세포 또는 사람의 면역 반응을 직접 또는 간접적으로 감소시키는 것들을 포함한다. 면역억제 효과의 예는, 제한은 없지만, IgE 생성 감소와 같은 항원-특이적 항체 생성의 감소; 면역 내성을 가져오는 것들과 같은 면역억제 활성을 가지는 림프구 또는 다른 세포 집단의 활성화; 및 제한은 없지만 IL-10 및 TGF-β를 포함하는 어떤 세포 기능을 향한 억제 효과를 가지는 사이토카인 합성의 증가를 포함한다. 이것의 한 예가 IFN-γ이며, 이것은 IgE 및 IgG1에 대한 IL-4 유도된 부류의 스위치를 차단함으로써, 이들 항체 하위부류의 수준을 감소시키는 것 같다.
암 치료법에 대한 적합한 사람 피험자는 2가지 치료 그룹을 더 포함하며, 이것은 임상적 기준에 의해 구별될 수 있다. "진행된 질환" 또는 "높은 종양 부담"을 가지는 환자는 임상적으로 측정가능한 종양을 지니는 환자이다. 임상적으로 측정가능한 종양은 종양 질량을 근거로 검출될 수 있는 것이다(예를 들어, 촉진, CAT 스캔, 소노그램, 맘모그램 또는 X-선에 의해; 양성 생화학 또는 조직병리학적 마커만으로는 이 집단을 동정하는데 불충분하다). 본 발명에서 구현된 제약학적 조성물은 환자의 상태를 완화시킬 목적으로 이들 환자에 투여되어 항-종양 반응을 유도한다. 이상적으로, 종양 질량의 감소가 결과적으로 일어나지만, 어떤 임상적 개선의 이익을 얻을 수도 있다. 임상적 개선은 위험 또는 진행 속도의 감소, 또는 병리학적 종양 결과의 감소를 포함한다.
제 2 그룹의 적합한 피험자는 "애쥬번트 그룹"으로 본 분야에 공지되어 있다. 이들은 암병력을 가졌었지만 다른 방식의 치료법에 반응했던 개체이다. 선행 치료법은 제한은 없지만 외과적 절제술, 방사선요법, 및 통상적 화학요법을 포함할 수 있다. 결과적으로, 이들 개체는 임상적으로 측정가능한 종양을 가지지 않는다. 그러나, 그들은 원래 종양 부위 근처에서, 또는 전이에 의해, 질환 진행의 위험에 처하기 쉽다.
본원에 사용된 바와 같은, "애쥬번트"는 몇가지 의미를 가지며, 이것 모두는 이 용어가 사용된 문맥에 따라 분명해질 것이다. 제약학적 제조물의 문맥에서, 애 쥬번트는 항원의 면역원성을 증진시키기 위해 항원과 조합(자발적이든 다른 식이든)하여 제공된, 또는 이러한 항원과 재조합적으로 융합된 화학적 또는 생물학적 제제이다. 예를 들어, Singh 등 (1999) Nature Biotech. 17:1075-1081 참조. 또한, 분리된 DC의 애쥬번트로서의 사용이 제안되었다. 거기에 사용되는 조성물이 본 발명에 포함된다. 암 진단 또는치료의 문맥에서, 애쥬번트는 임상적으로 측정가능한 종양 질량은 가지지 않지만, 재발의 위험에 처하기 쉬운 암환자의 부류로 간주한다.
이 그룹은 고-위험 및 저-위험 개체로 더 세분될 수 있다. 세분은 치료 개시 전 또는 후에 관찰된 특징을 근거로 한다. 이들 특징은 임상 분야에 공지되어 있으며, 각각의 상이한 암에 대해 적합하게 규정된다. 고-위험 서브그룹의 전형적인 특징은 종양이 이웃 조직으로 칩입하거나, 또는 림프절의 연루가 나타나는 것이다.
다른 적합한 그룹은 암에 대한 유전적 소인을 가지지만, 아직 암의 임상적 징후가 증명되지 않은 그룹이다. 예를 들어, 유방암에 관련된 유전적 돌연변이에 대해 양성 테스트를 받은 여성은, 아직 출산가능한 나이라면, 예방적인 수술을 수행하기 적합할 때까지, 암의 발생을 방지하기 위한 예방적인 치료에서, 본원에 설명된 항원-결합 단편을 1회 이상 받도록 권유할 수 있다.
제한은 없지만, 교모세포종, 흑색종, 신경모세포종, 선암종, 교종, 연조직육종, 및 다양한 암종(소세포 폐암을 포함함)을 포함하는 사람 암환자가 특히 적합한 피험자이다. 적합한 암종은, 제한은 없지만, 성상세포종, 섬유육종, 점액육종, 지 방육종, 핍지교종, 상의세포종, 수모세포종, 초기 신경외배엽 종양(PNET), 연골육종, 골원성육종, 췌장선암종, 소세포 및 대세포 폐선암종, 척삭종, 맥관육종, 내피육종, 편평세포암종, 기관지폐포성암종, 상피선암종, 및 그것의 간전이, 림프관육종, 림프관내피육종, 간암, 담관암종(cholangiocarcinoma), 활막종, 중피종, 유잉 종양, 횡문근육종, 결장암종, 기저세포암종, 한선암종, 유두상암종, 피지선암종, 유두상선암종, 낭선종암종, 수질성암종, 기관지원성암종, 신세포암종, 담관암종(b-ileduct carcinoma), 융모막암종, 정상피종, 태생암종, 윌름 종양, 고환 종양, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 신경모세포종, 망막모세포종, 백혈병, 다발성 골수종, 왈덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 중쇄병, 관 및 소엽 선암종과 같은 유방 종양, 자궁 경부의 편평 및 선암종, 자궁 및 난소 상피암종, 전립선 선암종, 방광의 이행성 편평세포암종, B 및 T 세포 림프종(소결절성 및 산재성), 형질세포종, 급성 및 만성 백혈병, 악성 흑생종, 연조직육종 및 평활근육종을 포함하는, 종양학 분야에 공지된 어느 것을 포함한다.
환자는 진행된 형태의 질환을 가질 수 있으며, 이 경우 치료 목적은 질환 진행의 완화 또는 역전, 및/또는 부작용의 개선을 포함할 수 있다. 환자는 그들이 치료되었던 상태의 병력을 가질 수 있으며, 이 경우 치료 목적은 전형적으로 재발 위험의 감소 또는 지연을 포함할 것이다.
자가면역 장애는 여러 세포, 조직 및 기관의 자체-파괴를 가져오는 잘못 지정된 면역 반응에 기인한다. 이들 장애의 원인은 알려져 있지 않다. MHC를 통한 자체적 인식이 면역 반응에 중요하다고 알려져 있다. 그러나, 자가면역 반응 및 자가면역에 대한 세포 반응성의 방지는 잘 이해되지 않고 있다.
자가면역은 유전적, 호르몬적, 및 환경적 영향을 포함하는 요인들이 조합된 결과이다. 많은 자가면역 장애는 B 세포 및 자기항체의 증식 및 고감마글로불린혈증에 의해 주목되는, B 세포 활동항진을 특징으로 한다. B 세포 활동항진은 아미도 T 세포의 비정상성과 관련된다. 호르몬 및 유전적 요인은 자가면역 장애의 발생에 강하게 영향을 미치는데, 예를 들어 홍반성 루프스는 출산가능한 나이의 여성에게 우세하게 영향을 미치고, 어떤 HLA 단상형은 특이적 자가면역 장애의 위험 증가에 관련된다.
통상의 자가면역 장애는, 제한은 없지만, 류마티스성 관절염, 연소성 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군, 홍반성 루프스, 구드패스츄어 증후군, 라이터 증후군, 피부경화증, 혈관염, 다발성 근염 및 피부근염을 포함한다. 이들 상태 중 대부분은 면역 장애와 관계된 이상 염증 반응을 포함한다. 본원에 설명된 DC는, 특히 이들 장애에 연루된 T 세포를 비활성화하거나 또는 T 세포의 내성원화를 유도하는데 사용될 때, 장애의 치료에 사용하기 적합하다. 치료 방법은 본 분야에 공지되어 있다. 본원에 논의된 바와 같이, 본원에 설명된 방법에 의해 얻어진 DC의 하위세트 중 하나 이상이 자가면역의 치료에 사용하기 적합하다.
항원-결합 단편의 "면역 활성"은 무손상 항체를 인식하는 항원을 특이적으로 결합시키는 것으로 간주한다. 그러한 결합은 면역 반응을 유도할 수 있거나, 또는 그럴 수 없다. 특이적 면역 반응은 항체, B 세포 반응, T 세포 반응, 그것들의 어떤 조합, 및 그것들로부터의 결과인 이펙터 기능을 유도할 수 있다. 포함되는 것은, 제한은 없지만, 항체-매개 기능인 ADCC 및 보체-매개 세포융해(CDC)이다. T 세포 반응은 제한은 없지만 T 헬퍼 세포 기능, 세포독성 T 세포 기능, 염증/유도원 T 세포 기능, 및 T 세포 매개 면역억제를 포함한다. 이들 기준 중 어느 것에 따라서 직접 또는 간접적으로 특이적 면역 반응을 유도할 수 있는 화합물(단독으로 또는 담체 또는 애쥬번트와 조합하여)이 "면역원성"으로 간주된다. 항원-결합 단편 "활성" 또는 "기능"은 암의 검출, 개선, 또는 완화를 포함하여, 항체의 면역 활성 중 어느 것으로 간주한다.
"면역 반응"은 악성 또는 병든 조직, 질환을 일으키는 제제, 및 신체가 노출되는 다른 외부적 제제에 대한 면역 반응의 유도 또는 증진으로 간주한다. 면역 반응은 항체 생성에 의해 증명된 체액성 면역 반응, 및/또는 자연살생세포 또는 사이토카인 T 림프구(CTL) 및 그것에 의해 생성된 사이토카인과 같은 세포에 의해 입증된 시토졸 반응에 의해 증명된 세포-매개 면역 반응일 수 있다. 면역 반응은 감염 또는 악성 종양 부위에서 단핵 세포 침윤에 의해 모니터될 수 있다. 전형적으로, 그러한 모니터링은 조직병리학에 의한다. "암-특이적 면역 반응"은 악성 종양에 대해서는 발생하지만, 비-암성 세포에 대해서는 발생하지 않는 것이다. 본원에 설명된 치료는 전형적으로 세포-매개 면역 반응을 유도 또는 증대하지만, 또한 항체-매개 면역 반응을 유도 또는 증대하기도 한다.
또한, 본 발명에 따르는 조성물은 항원-특이적 Th1 면역 반응을 유도하는데 사용하기 적합하다. Th1-형 면역 반응의 자극은 본 발명에 따라서 치료된 숙주에서 측정될 수 있으며, 제한은 없지만, 항원 참여 전과 후에 측정된 IL-4 수준의 감소; 본 발명의 조성물 없이 치료된, 항원이 초회 자극되거나(antigen-primed), 또는 초회 자극되어 참여된 대조표준과 비교하여, 치료된 숙주에서 더 낮은(또는 심지어 없는) 수준의 IL-4 검출; 항원이 초회 자극되거나, 또는 초회 자극되어 참여된 대조표준과 비교하여, 치료된 숙주에서 IL-12, IL-18 및/또는 IFN(α, β 또는 γ), 바람직하게 IFN-γ 수준의 감소; 치료되지 않은 대조표준과 비교하여, 치료된 숙주에서 IgG2a 항체 생성; 항원 참여 전과 후에 측정된 항원-특이적 IgE 수준의 감소 또는 항원이 초회 자극되거나, 또는 초회 자극되어 참여된 치료되지 않은 숙주와 비교하여, 치료된 숙주에서 더 낮은(또는 심지어 없는) 수준의 항원-특이적 IgE의 검출을 포함하는, 본 분야에 공지된 어떤 방법에 의해 측정될 수 있다. 여러 가지 이들 측정은, 본원에 설명되고 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 시험관내 또는 생체외에서, APC 및/또는 림프구, 바람직하게 DC 및/또는 T 세포에 의해 만들어진 사이토카인을 측정함에 의해 행해질 수 있다. 항체 생성을 측정하는 방법은 본 분야에 공지된 어느 것을 포함한다.
Th1으로 치우친 사이토카인 유도는, NK 세포, 세포독성 살생세포, Th1 헬퍼 및 기억 세포에 의해 수행되는 것과 같이, 증진된 세포 면역 반응을 생성한다. 이들 반응은 바이러스, 진균, 원생동물 기생충, 박테리아, 알러지 질환 및 천식, 그리고 종양에 대한 방어적 또는 치료적 백신접종에 사용하는데 특히 유리하다.
본 발명은 BDCA-2의 리게이션에 의한 I 형 인터페론 생성의 하향조절, BDCA- 2의 리게이션에 의한 Th1 면역 반응의 하향조절, 및 BDCA-2의 리게이션에 의한 Th2에 대한 면역 반응의 분극화를 더 포함한다. 이들 사항은 BDCA-2의 리게이션을 방해함으로써 역전될 수 있다. 본 발명은 BDCA-2의 리게이션을 방해하는 적합한 부분 및 이들 부분의 조성물에 대한 스크리닝을 더 포함한다.
항원-결합 단편이 다양한 치료제와 조합하여 사용될 때, 이 두가지의 투여는 보통 실질적으로 동시에 일어난다. 용어 "실질적으로 동시에"는 그것들이 시간에 관하여 함께 합리적으로 가깝게 투여된다는 의미이다. 치료제의 투여는, 예를 들어 불쾌함의 성질, 환자의 상태 및 제제의 반감기와 같은 요인에 따라, 매일, 또는 어떤 다른 적합한 간격일 수 있다.
치료적 조성물은 주사에 의해, 또는 시간에 걸친 점진적 관류에 의해 투여될 수 있다. 항원-결합 단편은 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 강내, 결절내, 경막내 또는 경피적으로 투여될 수 있다.
다른 투여 방법은 병소내적이며, 예를 들어 종양에 직접 주사함에 의한다. 암환자에 대한 다양한 형태의 면역치료법의 병소내 투여는 면역 제제의 전신적 투여에서 보이는 독성을 일으키지 않는다. Fletcher 등 (1987) Lymphokine Res. 6: 45; Rabinowich 등 (1987) Cancer Res. 47:173; Rosenberg 등 (1989) Science 233: 1318; 및 Pizz 등 (1984) J. Int. Cancer 34:359.
더 이상으로, 치료가 필요한 영역에 국부적으로 조성물을 투여하는 것이 바람직할 수 있으며, 이것은 예를 들어 주사, 카테테르, 또는 이식체에 의한 수술 동안의 국부적 주입에 의해 달성될 수 있고, 이식체는 플라스틱 멤브레인 또는 섬유 와 같은 멤브레인을 포함하여, 다공성, 비다공성 또는 젤라틴성이다. 적합한 그러한 멤브레인은 Guilford sciences에 의해 제공되는 Gliadel
Figure 112002014869824-pct00002
이다.
BDCA-2와 항-BDCA-2 단일클론 항체(AC144)의 리게이션이 세포내 Ca2+ 가동화를 유도한다는 사실은 세포질혈구 DC(및 BDCA-2를 발현하는 모든 다른 세포)가 BDC A-2 신호화 트리거링(triggering) 또는 BDCA-2 신호화 트리거링의 저해에 의해 기능적으로 조정될 수 있다는 것을 나타낸다. DC의 기능적 조정과 관련하여, 다음의 양태가 청구항에 의해 포함된다.
A) CD4+ 및 CD8+ 세포 반응의 유도 및 하향조절.
B) 내성 또는 면역을 향한 면역 반응의 분극화.
C) Th1 세포 발생, Th2 세포 발생, 또는 Th3/T-조절성-1 CD4+ 세포 발생을 향한 CD4+ T 세포 반응의 분극화. 후자는 아마도 TGF-β 및/또는 IL-10의 분비에 의해 면역 반응을 하향조절한다.
D) DC는 보통 T 세포에 대한 항원-제시 세포로 생각된다. 그러나, 몇몇 연구실로부터의 최근 연구는, 그것들이 B 세포 활성화 및 항체 합성의 조절에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타냈다. 따라서, B 세포 반응은 DC상에서 BDCA-2에 의해 조정될 수 있다. 또한, 동일한 사항이 NK 세포 반응에 대해서도 사실일 수 있다.
I 형 인터페론이 사람에서 Th1 형 면역 반응을 유도할 수 있기 때문에(Parr-onchi 등 (1996) Eur. J. Immunol. 26:697-703), BDCA-2의 트리거링은 Th2 세포 발 생을 향해 CD4+ T 세포 반응을 분극하며, 반대로 BDCA-2 신호화의 저해는 Th1 세포 발생을 향해 CD4+ T 세포 반응을 분극한다. 따라서, 본 발명은 각각 BDCA-2 신호화 트리거링 또는 BDCA-2 신호화 트리거링의 저해에 의한, Th2 또는 Th1 세포 발생을 향한 CD4+ T 세포 반응의 분극화를 포함한다.
본원에 인용된 모든 공보는 그 전체가 참고자료로서 본원에 포함된다. 다음의 실시예들은 예시를 제공하며, 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1
DC-특이적 mAb 생성
5마리의 6-8주된 암컷 Balb/c 마우스(Simonsen Laboratories, Gilroy, CA)를 대략 5x105 내지 1x106의 정제된 HLA-DR+lin- 혈액 DC로 마취하에 0, 4, 7, 11 및 14일째 오른쪽 앞발에 접종하고, 대략 1x106 HLA-A2+ Bristol-8 B 림프모구종 세포를 -3, 0, 4, 7, 11 및 14일째 왼쪽 앞발에 접종했다. 두가지 세포 종류 모두 실온에서 10분간 1:100 PHA(Gibco/BRL, Gaithersburg, MD)로 인큐베이션하고, 주사전에 PBS로 세척했다. 이 처리는 비-특이적 애쥬번트 효과를 제공하며, Freund's 애쥬번트와 같은 애쥬번트에 대한 필요성을 미연에 방지한다.
HLA-DR+lin- DC 주사 후 15일째에, 마우스 오른쪽 앞발 슬와 림프절을 제거했 다. 림프구 현탁액을 제조하고, 세포를 Kohler 및 Milstein (1975) Nature 256: 495에 설명된 방법의 변형을 사용하여 SP2/0 Ag14 흑색종 세포와 융합시켰다. 융합된 세포를 20% FCS(HyClone, Logan, UT), 2mmol/L L-글루타민, 15mmol/L Hepes, 10-4mmol/L 하이포크산틴(Gibco/BRL)으로 보충된 DMEM중에서 96-웰 플레이트에 플레이팅했고, 9% CO2를 가지는 37℃ 인큐베이터에 두었다.
눈에 보이는 하이브리도마 콜로니가 나타났을 때, 이들 웰로부터의 상청액을 항체 분비 및 PBMC에 대한 비-반응성(<1% 양성 세포)에 대해 유동 세포계측으로 스크린했다. 간단히 말해서, 래트 항-마우스 kappa mAB-콘쥬게이트 폴리스티렌 비드 (직경 2.5㎛, Interfacial Dynamics Corp., Portland, OR)와 PBMC의 혼합물을 실온에서 20분간 50㎕의 하이브리도마 상청액과 인큐베이션했다. 다음에, 비드/세포 혼합물을 5mmol/L EDTA 및 0.5% BSA를 함유하는 PBS pH 7.4(PBS/EDTA/BSA)로 2번 세척하고, 상청액으로부터의 마우스 IgM, IgG1, IgG2a 및 IgG2b와 비드 및 시험 세포의 결합을 PE-콘쥬게이트 래트 항-마우스 IgM mAb(clone X54, BD Biosciences, San Jose, CA), 래트 항-마우스 IgG1 mAb(clone X56, BD Biosciences) 및 래트 항-마우스 IgG2 mAb(clone X57, BD Biosciences)로 염색하여 검출했다. PBMC 및 폴리스티렌 비드는 산란 신호에 의해 유동 세포계측 분석에서 쉽게 구별할 수 있다.
다음에, 제 1의 스크리닝 기준을 만족하는 배양 상청액을 유의한 비율의 혈액 DC에 대한 반응성에 대해 유동 세포계측 분석에 의해 스크린했다. 간단히 말해서, 래트 항-마우스 mAb-콘쥬게이트 폴리스티렌 비드와 부화된 혈액 DC(B 세포, T 세포 및 단구가 고갈된 PBMC)의 혼합물을 실온에서 20분간 50㎕의 하이브리도마 상청액과 인큐베이션했다. 다음에, 혼합물을 PBS/EDTA/BSA로 2번 세척하고, PE-콘쥬게이트 래트 항-마우스 IgM mAb, 래트 항-마우스 IgG1 mAb 및 래트 항-마우스 IgG2 mAb로 염색하여, 상청액으로부터의 마우스 IgM, IgG1, IgG2a 및 IgG2b와 비드 및 부화된 혈액 DC의 결합을 검출했다. 유동 세포계측 분석에서 HLA-DR+ DC와 HLA-DR- 세포를 구별하기 위해, 비드/세포 혼합물을 한번 더 세척하고, PE-콘쥬게이트 래트 항-마우스 IgG2 mAb와 비드-콘쥬게이트 래트 항-마우스 κmAb의 자유 결합 부위를 실온에서 5분간 100㎍/ml 마우스 IgG2a와 인큐베이션하고, 혼합물을 항-HLA-DR-FITC(cloneAC122, IgG2a)로 대조염색했다.
선택된 하이브리도마 세포를 배양액에서 확장하고, 스톡을 액체 질소중에 냉동하고, 서브클론을 제한 희석에 의해 만들고, 일련의 양성 서브클론을 액체 질소중에 냉동했다. mAb의 이소형을 ISOTYPE Ab-STAT 키트(SangStat Medical Corp., Palo Alto, CA)로 측정했다.
mAb 생성을 위해서, 하이브리도마 세포를 Balb/c 마우스에서 복수 종양으로서 성장시켜 mAb-부화 복수 유액을 수집하거나, 또는 세포 배양물(롤러 배양 또는 중공-섬유 배양)에서 성장시켜 mAb-부화 배양 상청액을 수집했다. 순수한IgG mAb를 복수 유액 또는 세포 배양 상청액으로부터 단백질 A 친화성 크로마토그래피한 후, 어떤 경우 소수성 상호작용 크로마토크래피하여 제조하고, 4℃에서 5mmol/L EDTA 및 0.05% 나트륨 아지드를 가지는 PBS중에 저장했다. 정제된 mAb를 표준 기술에 따라서, FITC(Sigma, St. Louis, MO), PE(Cyanotech Corp., Kailua Kona, HI), Cy5(Amersham Life Science Inc., Arlington Heights, IL), APC(Europa Bioproducts Ltd., Cambridge, UK), 비오틴(Pierce, Rockford, IL) 및 콜로이드상 초-상자성 비드(직경이 대략 50nm, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany)와 콘쥬게이션시켰다. Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques. Academic Press Inc., San Diego, 785 pp; Aslam 등 (1998) Bioconjugation: protein coupling techniques ofr the biomedical sciences, Macmillan Reference Ltd., London, 833 pp; 및 Kantor 등 (1997) Magnetic cell sorting with colloidal superparamagnetic particles. In, Cell Separation Methods 및 Applications. Recktenwald 등, Eds. Marcel Dekker Inc. New York, pp. 153-173.
세포 제조물
정상적인 건강한 지원자의 연막을 Institute for Transfusionmedicine, Hospital Merheim, Cologne, Germany. PBMC로부터 얻었다. PBMC를 연막으로부터 표준 Ficoll-Paque(Pharmacia, Uppsala, Sweden) 밀도 구배 원심분리에 의해 제조했다.
말초혈 백혈구를 등장 염화암모늄 완충액(155mmol/L NH4Cl, 10mmol/L KHC03 및 0.1mM EDTA)중에 적혈구를 융해시켜 연막으로부터 제조했다. Hansel 등 (1991) J. Immunol. Met. 145:105-110. CD4+1in- 혈액 DC를 다른 곳에 상세히 설명된 바와 같은 2-단계 면역자기 세포 선렬(MACS)에 의해 PBMC로부터 분리했다. Robert 등 (1999); 및 Miltenyi 등 (1999), High gradient magnetic cell sorting. In, Flow cytometry and cell sorting. Ed., Radbruch. Springer-Verlag, Berlin. pp. 218-247. 간단히 말해서, 단구, T 세포, 및 NK 세포를 CD3(CloneBW264/56), CD11b(Clo neMl/70.15.11.5), CD16(CloneVEP-13), 및 소수의 실험에서는 B 세포 및 단구에 대해 발현된 불충분하게 규정된 항원(CloneL179)에 대한 mAb를 사용하여 고갈시켰다. 다음에, 고갈된 세포 분획으로부터의 혈액 DC를 DC4에 대한 항체(M-T321)를 사용하여 고순도로 부화시켰다. 하이브리도마 배양 상청액을 스크린하기 위해(상기 참조), 혈액 DC를 CD3 및 L179 항원 발현에 기초한 T 세포, B 세포 및 단구의 면역자기 고갈에 의해 단지 부분적으로 부화시켰다.
CD1c-, BDCA-2-, 및 BDCA-3-발현 세포를, 일차 시약으로서 PE- 또는 FITC-콘쥬게이트 mAb(AD5-8E7, AC144 및 AD6-5E8, 각각), 및 이차 시약으로서 항-PE 또는 항-FITC mAb-콘쥬게이트 마이크로비드(Miltenyi Biotec GmbH)를 사용하여 간접 자지 표지화하고, MACS에 의해 표지된 세포를 부화시켜 PBMC 또는 편도선으로부터 분리했다. 어떤 실험에서는 BDCA-3+ 세포를 항-BDCA-3 mAb(AD5-5E8)-콘쥬게이트 마이크로비드를 사용한 직접 자기 표지화를 기초로 분리했다. CD11c+ B 세포로 오염되지 않은 고도로 순수한CD1c+ 혈액 DC를, CD19 mAb-콘쥬게이트 마이크로비드 (Miltenyi Biotec GmbH)를 사용하여 CD18+ B 세포를 면역자기 고갈시키고, 이어서 CD1c+ 세포를 면역자기 부화시켜 얻었다.
자기 표지화 키트(Miltenyi Biotec)를 사용한 CD3-, CD7-, CD14-, CD15-, CD36-, CD45RA-, 및 HLA-DR-발현 세포의 간접 자기 표지화에 기초한 비-호염기성의 면역자기 고갈에 의해 PBMC로부터 호염기성을 정제했다. CD14+ 단구, CD34+ 조혈선조세포, 및 CD3+ T 세포를 각각 CD14, CD34 및 CD3 mAb-콘쥬게이트 마이크로비드를 사용한 직접 자기 표지화에 기초하여 면역자기적으로 정제했다.
세포 배양
"미성숙" 단구-유도 DC(Mo-DC)의 생성을 위해, 정제된 CD14+ 단구를 7일간 500-1000U/ml rIL-4(PeproTech, Rocky Hill, NJ) 및 100ng/ml rGM-CSF(PeproTech)의 존재하에, 습기가 있는 5% CO2-함유 분위기에서 37℃에서, 배지[2mmol/L L-글루타민, 10% FCS(Sigma), 100mmol/L 나트륨 피루베이트(Gibco/BRL), 100U/ml 페니실린(Gibco/BRL), 및 100㎍/ml 스트렙토마이신(Gibco/BRL)으로 보충된 RPMI 1640(Gib co/BRL)]중에서 5x105 내지 1x106세포/ml의 세포 밀도로 배양했다. "성숙한" Mo-DC의 생성을 위해, "미성숙" Mo-DC를 한번 세척하고, 20ng/ml TNF-α(PeproTech)의 존재하에 배지중에서 다시 3일간 배양했다. CD34+ 조혈선조세포-유도 DC(CD34-DC)의 생성을 위해, 정제된 CD34+ 세포를 11일간 100ng/ml rFlt3-리간드(PeproTech), 0.5 ng/mL rTGF-β1(PeproTech), 10ng/mI rTNF-α, 20ng/ml rSCF(PeproTech) 및 100ng/ ml rGM-CSF의 존재하에 배지중에서 5x104세포/ml의 세포 밀도로 배양했다. 신선하게 분리된 CD4+lin- 혈액 DC를 48시간까지 10ng/ml rIL-3(PeproTech)의 존재하에 배지중에서 5x105 내지 1x106세포/ml의 세포 밀도로 배양했다. 분리된 CD1c-, BDCA-2-, 및 BDCA-3-발현 DC를 어떤 사이토카인도 없이, 또는 10ng/ml rIL-3, 20ng/ml IL-4(PeproTech) 및 100ng/ml GM-CSF의 존재하에 배지중에서 48시간까지 5x105 내지 1x106세포/ml의 세포 밀도로 배양했다.
실시예 2
혈액 DC의 유동 세포계측 분석
FACScalibur(BD Biosciences)를 1-, 2-, 3-, 또는 4-색 유동 세포계측을 위해 사용했다. 샘플 당 5x103 내지 2x105 세포의 데이타가 리스트에 취득되었고, CellQuest 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 분석했다.
다음의 mAb(클론명)을 유동 세포계측의 연구에 사용했다: CD1a(HI149), CD10 (HI1Oa), CD11a(G43-25B), CD11c(B-ly6), CD25(M-A261), CD27(MT271), CD32(FL18.2 6), CD38(HIT2), CD40(5C3), CD43(IG10), CD54(HA58), CD62L(Dreg 56), CD64(10.1) , CD69(FN50), CD98(UM7F8), 항-HLA-DQ(TU169), 및 항-TCRαβ TIOB9.1A-31(PharM-ingen, San Diego, CA); CD2(S5.2), CD8(SK1), CD13(L138), CD14(MFP9), CD19(SJ25 -C1), CD33(P67.6), CD34(8G12), CD45RO(UCHL-1), CD56(NCAM16.2), CD71(L01.1), CD123(9F5), 항-IgD(TA4.1), 항-마우스 IgG1(X56), 항-마우스 IgG2(X57), 및 항-마 우스 IgM(X54)(BD Biosciences); CD5(CLBT11/11, 6G4), CD7(CLB-T-3A1/1, 7F3), CD 16(CLB-FcR gran/1, 5D2), CD45RA(F8-11-13), CD80(CLB-DALI)(CLB, Amsterdam, Netherlands); CD18(7E4), CD23(9P25); CD58(AICD58), CD77(38.13), CD83(HB15A), CD86(HA5. 2B7), CD116(SC06)(Coulter Immunotech, Marseilles, France); CD4(M-T3 21), CD11b(Ml/70.15.11.5), CD14(TUK4), CD15(VIMC6), 항-HLA-DR(910/D7), 항-AC1 33(AC133/1), 및 항-TCRap(BW242/412)(Miltenyi Biotec GmbH); CD36(AC106), CD123 (AC145), 항-HLA-DR(AC122 및 AC123) 및 항-GPA(AC107)(Amcell, Sunnyvale, CA); CD1c(M241)(Ancell, Bayport, MN); 다중클론 항-IgG, 항-IgM(SA-DA4), 다중클론 항 -kappa 및 다중클론 항-lambda(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, Alabama); CD61(VIPL2)(Knapp, Institute of Immunology, University of Vienna, Vienna, Austria); CD44(IM7)(J. Moll, Forschungszentrum Karlsruhe, Karlsruhe, Germany); CD20(H147)(Caltag Laboratories, Burlingame, CA); 항-CLA(HECA-452) (E. Butcher, Department of Pathology, Stanford University, Stanford, CA); 항-FcRI(15-1)(J. P. Kinet, Molecular Allergy and Immunology Section, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Rockville, Maryland);CD11c(Ki-M1)(M. R. Parwaresch, Department of Pathology, Christian Albrechts University, Kiel, Germany); CMRF-44 및 CMRF-56(D.N. Hart, Mater Medical Research Institute, Mater Misericordiae Hospitals, South Brisb-ane, Queensland, Australia); 및 항-HLA-A, -B, -C(W6/32)(Sigma).
모든 항체는 FITC-, PE-, 비오틴- 또는 Cy5-콘쥬게이트 mAb로서 사용했다. 비오틴화된 mAb를 사용하여 간접 면역형광 염색을 하기 위해, 스트렙토아비딘-APC(BD Biosciences)를 사용했다. 유동 세포계측 분석에서 죽은 세포를 배제하기 위해, 세포를 프로피듐 요디드로 염색했다. Fc 리셉터-매개 mAb 결합을 최소화하기 위해, 대부분의 실험에서 세포를 사람 IgG를 함유하는 FcR-차단 시약(Miltenyi Biotec GmbH)의 존재하에 염색했다.
현미경 분석
세포를 세포원심분리기(Cytospin 3, Shandon, Pittsburgh)의 슬라이드위에 회전시켜 모았다. 형광 현미경을 위해서 슬라이드를 세포원심분리 후 하룻밤 공기건조시키고, Fluoromount G(Southern Biotechnology Associates)로 장착했다. May Grunwald/Giemsa 염색을 위해서, 슬라이드를 세포원심분리 후 적어도 2시간 동안 공기건조시키고, 실온에서 2분간 May Grunwald/Giemsa 용액(Merck, Darmstadt, Ger many)에서 염색하고, 증류수로 완전히 헹구고, 실온에서 15분간 Giemsa용액(Merck)에서 염색하고, 증류수로 반복하여 세척하고, 적어도 2시간 동안 공기건조시켰다. Zeiss Axioscop 현미경(Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 분석했다. 디지탈 영상을 Xillix Microlmager M11400-12X(Xillix, Vancouver, Canada)를 사용하여 만들었다.
실시예 3
교차-저해, 공통-캡핑, 및 공통-내부이행 분석
2개의 상이한 mAb 클론이 동일한(또는 밀접하게 관련된) 항원 에피토프를 인 식하는지의 여부를 분석하기 위해서, 교차-저해 결합 분석을 수행했다. 1x106 내지 2x106 세포를 4℃에서 10분간 약 100㎍/ml 농도의 2개 mAb 클론 중 하나와 인큐베이션한 후, 4℃에서 다른 5분간 최적 역가로 PE-콘쥬게이트된 나머지 1개의 mAb 클론으로 염색했다. PBMC를 사용하여 BDCA-2-, BDCA-3-, 및 BDCA-4-특이적 mAb 클론의 교차-저해를 분석했고, MOLT-4 세포를 사용하여 CD1c-특이적 mAb 클론의 교차-저해를 분석했다. 세포 염색을 유동 세포계측에 의해 분석했다.
AD5-5E8 및 AD5-14H12가 동일한 항원(또는 동일한 항원-복합체)를 인식하는지의 여부를 평가하기 위해서, 공통-캡핑 분석을 수행했다. 간단히 말해서, BDCA-3-발현 세포를 PE-콘쥬게이트 AD5-14HI2 mAb 및 항-PE mAb-콘쥬게이트 마이크로비드를 사용한 간접 자기 표지화에 의해 PBMC로부터 분리하고, 분리된 세포를 30분간 37℃에서 인큐베이션하여, mAb-항원 복합체의 캡핑을 유도했다. 그 후, 세포를 얼음 냉각된 0.1% 나트륨 아지드로 보충된 PBS/EDTA/BSA(PBS/EDTA/BSA/아지드)로 세척하고, 4℃에서 10분간 PBS/EDTA/BSA/아지드중의 FITC-콘쥬게이트 AD5-5E8로 염색했다. 세포 염색을 형광 현미경에 의해 분석했다.
공통-내부이행 분석을 사용하여, AC144 및 AD5-17F6이 동일한 항원(또는 동일한 항원-복합체)을 인식하는지의 여부를 조사했다. 간단히 말해서, 1x106 PBMC를 PBS/BSA중에 실온에서 15분간 50㎍/ml AC144 mAb와 인큐베이션한 후, 30분간 37℃에서 세포 배양 배지중에서 인큐베이션했다. AC144 mAb가 배양중에 내부이행하는지의 여부를 분석하기 위해, 세포의 알리쿼트를 래트 항-마우스 IgG1-PE로 배양 전 후에 염색했다. 모든 AC144 mAb-결합 부위가 배양전에 콘쥬게이트되지 않은 AC144 mAb로 포화되는지의 여부와, 어떤 자유 결합 부위가 배양후 재현되는지의 여부를 측정하기 위해, 세포의 알리쿼트를 AC144-PE로 배양 전후에 염색했다. AD5-17F6 항원이 공통-내부이행하는지의 여부를 분석하기 위해, 알리쿼트들을 AD5-17F6-PE로 배양 전후에 염색했다. 모든 세포를 유동 세포계측 분석에서 CD123brightHLA-DR+ 형질세포 DC상을 통과할 수 있도록 CD123-FITC 및 HLA-DR-Cy5로 대조염색했다.
실시예 4
엔도시토시스 분석
혈액 DC 서브셋의 엔도시토시스를 평가하기 위해서, 정제된 CD1c+, BDCA-2+ 및 BDCA-3+ 혈액 DC, 및 (대조표준으로서) 정제된 CD3+ T 세포를 0, 15, 45 및 75분간 1mg/ml 루시퍼 옐로우(LY)를 가지는 배지중에서 37℃에서 인큐베이션했다. 그 후, 세포를 얼음 냉각된 PBS/EDTA/BSA로 3번 세척하고, 유동 세포계측으로 분석했다.
실시예 5
분리된 혈액 DC와 비-배양된 혈액 세포의 반응성
혈액 세포와의 반응성에 따라서, 표 1에 기재된 mAb는 (1) AC144, AD5-13A11 및 ADB-4B8; (2) AD5-17F6; (3) AD5-5E8 및 AD5-14H12; 및 (4) AD5-8E7의 4개 그룹으로 나눌 수 있다.
제 1 그룹의 mAb인 AC144, AD5-13A11 및 ADB-4B8는 모든 PBMC 중 대략 0.41 ±0.17%(n=10)를 염색한다(도 1A). 앞쪽과 측면의 산란 신호의 점선에서, 이들 희귀 세포는 작은 휴지 림프구와 단구 사이에 위치한 상동성 세포 집단을 구성한다(도 1B). 따라서, 이들 희귀 세포는 각각 T 세포, 단구, B 세포 및 NK 세포에 대해 발현되는 계통 마커인 αβ T 세포 리셉터(TCRαβ), CD14, CD19 및 CD56(도 1A)을 발현하지 않는다. 고도로 정제된 혈액 DC(>95% HLA-DR+, TCRαβ-, CD14- , CD19- 및 CD56-)의 염색은 제 1 그룹의 mAb가 CD11c-CD123bright 혈액 DC와는 반응하지만(도 2), CD11c+ 혈액 DC와는 반응하지 않는다는 것을 밝혔다. 이들 모두가 단일 항원과 반응하는지의 여부를 분석하기 위해서, 우리는 2-색 염색 및 교차-저해 연구를 수행했다. 결과는 이 그룹의 모든 mAb가 동일한 항원의 단일 에피토프를 인식한다는 것을 나타낸다. 이 항원을 BDCA-2로 명명했다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 제 2 그룹의 mAb인 AD5-17F6은 제 1 그룹의 BDCA-2-특이적 mAb 중 하나인 AC144처럼 PBMC 중에서 동일한 세포들을 인식한다. 그럼에도 불구하고, AD5-17F6는 BDCA-2와는 상이한 항원을 염색한다. 이것은 AD5-17F6가 BDCA-2의 항-BDCA-2 mAb-매개 내부이행 전후에 동일한 강도로 표면 염색을 나타냈던 공통-내부이행 실험에 의해, 그리고 AC144 mAb 및 AD5-17F6 mAb가 전체적으로 상이한 염색 패턴을 나타냈던 배양후의 DC 염색에 의해 모호하게 입증되었다(도4). AD5-17F6에 의해 인식되는 항원을 BDCA-4로 명명했으며, 이것은 뉴로필린-1과 동일하다. He 등 (1997).
제 3 그룹의 mAb인 AD5-5E8 및 AD5-14H12는 모든 PBMC 중 대략 0.04±0.01% (n=10)를 염색한다(도 1A). 산란 신호(도 1B) 및 TCRαβ, CD14, CD19 및 CD56에 대한 mAb를 사용한 대조염색(도 1A)에 따라서, 이들 세포는 림프구 및 단구와 구별되며, 제 1 그룹의 항체에 의해 인식되는 세포보다 약간 더 크다. 따라서, 혈액 DC의 염색은 상이한 서브셋, 즉 CD11cdimCD123- 혈액 DC가 AD5-5E8 및 AD5-14H12에 의해 인식된다는 것을 나타낸다(도 2). 2-색 염색에 따라서, 교차-차단 연구 및 공통-캡핑 실험은 모두 동일한 항원의 공간적으로 무관한 2개 에피토프를 인식하는 것 같다. 우리는 이 항원을 BDCA-3으로 명명했다.
제 4 그룹인 mAb AD5-8E7은 미분획 PBMC 중 2.39±0.96%(n=10)까지와 반응한다(도 1A). 광-산란 분석(도 1B) 및 계통 마커 TCRαβ, CD14, 및 CD19의 대조염색은 mAb가 T 세포 및 단구와는 반응하지 않지만, 작은 휴지 CD19+ B 세포의 주요 서브셋과는 반응한다는 것을 밝혔다. 정제된 DC의 염색은 B 세포에 더하여, AD5-8E7이 제 1 및 제 2 그룹에 의해 인식되는 서브셋과는 구별되는 제 3 서브셋의 혈액 DC, 즉 CD11cbrightCD123dim 혈액 DC를 염색한다는 것을 나타낸다. 유의한 비율의 CD11cbrightCD123dim 혈액 DC는 CD56을 발현한다(아래 참조). 이런 이유로, 동일한 AD5-8E7-반응성 PBMC는 CD56을 염색한다(도 1A). AD5-8E7은 정제된 NK 세포와는 반응하지 않는다. AD5-8E7에 의해 인식된 항원은 새로운 항원으로 여겨졌기 때문에 처음에 BDCA-1로 명명되었다. 그러나, 나중에 AD5-8E7가 CD1c mAb M241과 MOLT -4 세포의 결합을 완벽하게 차단하는 사건이 일어났다(도 6). 따라서, AD5-8E7에 의해 인식된 항원은 CD1c이다.
표 1에 기재된 mAb 중 어느 것도 과립구, 혈소판, 적혈구, 정제된 호염기성 및 정제된 CD34+ 조혈선조세포와 반응하지 않는다.
실시예 6
배양된 혈액 DC, Mo-DC 및 CD34 - DC에서 BDCA-2, BDCA-3 및 BDCA-4의 발현
신선하게 분리된 형질세포 CD11c- 혈액 DC는 생존 및 성숙을 위해 IL-3에 의존하며, 반대로 CD11c+ 혈액 DC의 생존 및 성숙은 사이토카인에 훨씬 덜 의존적이다. CD11c- 및 CD11c+ 혈액 DC에서 BDCA-2, BDCA-3 및 BDCA-4의 발현을 rIL-3의 존재하에 전체 혈액 DC의 배양 0h, 1h, 3h, 6h, 9h, 12h, 18h, 24h, 36h, 및 48h 후에 분석했다. 결과는 도 4에 나타낸다. BDCA-2의 발현은 CD11c- 혈액 DC에서 48시간내에 완벽하게 하향조절된다. 반면, BDCA-4는 CD11c- 혈액 DC에서 더 하향조절되며, 또한 BDCA-2와 달리, 전부는 아니지만 대부분의 CD11c+ DC에서 높은 수준으로 발현된다. BDCA-3의 발현은 CD11c- 혈액 DC에서 신속하게 유도되며, 24시간 후에는 최고 발현 수준에 도달한다. 그 후, BDCA-3 발현이 다시 하향조절되는 것 같다. CD11c+ 혈액 DC에서 BDCA-3의 발현의 분석은 BDCA-3-CD11cbright 및 BDCA-3 +CD11cdim 서브셋이 배양의 개시 때 존재하고 있다는 사실 때문에 복잡하다. BDCA-3의 발현은 BDCA-3+CD11cdim 혈액 DC 집단에서 적어도 배양 6시간까지 변하지 않으며, BDCA-3-CD11cbright 혈액 DC 서브셋 중 적어도 일부의 세포에 대해 3시간 내에 유도된다.
Mo-DC 및 CD34 - DC에서 BDCA-2, BDCA-3 및 BDCA-4의 발현
기능적 CD1a+ DC를 단구 및 CD34+ 조혈선조세포로부터 생체외에서 생성했다. Bender 등 (1996); Pickl 등 (1996); Romani 등 (1994); Sallusto 등 (1994); Caux 등 (1992); Mackensen 등 (1995); Szabolcs 등 (1995); Herbst 등 (1996); de Wynter 등 (1998); 및 Strunk 등 (1996). 도 7은 rGM-CSF 및 IL-4의 존재하에 7일간 단구를 배양함에 의해 생성된 Mo-DC, 및 rFlt3-리간드, rTGF-β1, rTNF-α, rSCF 및 rGM-CSF의 존재하에 11일간 CD34+ 조혈선조세포를 배양함에 의해 생성된 CD34-DC가 CD1a, CD1c 및 BDCA-4를 발현하며, BDCA-2 및 BDCA-3은 발현하지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 7
항-BDCA-2 mAb-매개 교차결합시 BDCA-2의 내부이행
37℃에서 항-DCA-2 mAb-표지 BDCA-2+ 세포를 인큐베이션 하는 것이 mAb 내부이행을 가져올 가능성에 대해 FITC-콘쥬게이트 AC144 mAb(IgGI)로 PBMC를 염색함에 의해 접근했다. 다음에, 37℃ 인큐베이션 후, 잔류하는 세포 표면 관련 mAb를 PE-콘쥬게이트 래트 항-마우스 IgG1 mAb로 염색하여 검출했다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 세포를 37℃에서 인큐베이션했을 때, 래트 항-마우스 IgG1-PE 염색의 강도는 백그라운드 수준까지 빠르게 극단적으로 감소했다. 반대로, AC144-FITC 염색의 강도는 대략 50% 수준까지 단지 일시적으로 감소한 후, 인큐베이션 전의 수준까지 거의 회복되었다. 이것은 BDCA-2가, 리셉터-매개 엔도시토시스와 유사한 키네틱으로, 항-BDCA-2 mAB 교차결합시 내부이행된다는 것을 입증한다. AC144-FITC 염색 강도의 일시적 감소는 아마도 엔도시토시스 전 BDCA-2/항-BDCA-2 mAb 복합체의 패칭 및 캡핑때문인 것 같다.
실시예 8
분리된 CD1c + . BDCA-2 + 및 BDCA-3 + 혈액 DC의 형태학
CD1c+, BDCA-2+ 및 BDCA-3+ 세포를 PE-콘쥬게이트 일차 mAb 및 항-PE Ab-콘쥬게이트 마이크로비드를 사용하여 간접 자기 표지화하고, MACS에 의해 표지된 세포를 부화시켜 PBMC로부터 분리했다(도 9). 세포원심분리 슬라이드의 May Grunwald/ Giemsa 염색시(도 9), 신선하게 분리된 BDCA-2-발현 세포는 혈액 및 편도선으로부터의 CD11c-CD4+1in- DC의 전형적인 림프형질세포 형태, 즉 타원형 또는 함입형 핵을 가지는 중간 크기의 둥근 세포를 나타낸다. 반대로, 신선하게 분리된 CD1c+ 혈액 DC 및 신선하게 분리된 BDCA-3+ 혈액 DC는 모두 혈액 및 편도선으로부터의 CD11c+CD 4+1in-DC의 전형적인 형태적 특성, 즉 짧은 세포 과정 및 더욱 초소엽화된 핵을 가 지는 덜 둥근 세포를 나타낸다. CD1c+ BDC에 더하여, 작은 휴지 림프구의 전형적인 형태를 가지는 CD1c+ B 세포를 분리된 CD1c+ PBMC의 세포원심분리 슬라이드에서 볼 수 있다. 만일 CD1c+ 세포의 부화 전에 CD19+ B 세포가 PBMC로부터 자기적으로 고갈된다면, 고도로 순수한CD1c+ BDC가 얻어진다.
실시예 9
CD1c + , BDCA-2 + 및 BDCA-3 + 혈액 DC의 표면 표현형
BDCA-2+ 및 BDCA-3+ 혈액 DC의 표현형을 PE- 및 FITC-콘쥬게이트 mAb를 사용하는 2-색 면역형광에 의해 분석했다. CD1c+ 혈액 DC의 분석을 위해서, 3-색 염색을 B 세포의 배제를 위해 CD19-Cy5를 사용하여 수행했다. 표현형 분석 결과를 표 2에 나타내며, 다음과 같이 요약할 수 있다: 혈액 DC 서브셋 중 어느 것도 CD1a, CD8, CD15, CD16, CD19, CD20, CD23, CD25, CD27, CD34, CD61, CD69, CD7.1, CD77, CD80, CD83, 글리코포린 A(GPA), TCRαβ, AC133, IgD, IgM 및 CMRF-56 항원을 발현하지 않는다. 모든 혈액 DC 서브셋은 CD43, CD44, CD54 및 MHC 클래스 I 분자를 유사한 수준으로 발현한다. BDCA-2+ 혈액 DC는 그것이 CD13, CD40, CD45RO, CD56은 발현하지 않지만, CD45RA 및 소량의 CD10를 발현하고, CD18, CD38, CD58, CD98, CD116 및 CLA은 낮은 수준으로 발현하지만, CD4는 높은 수준으로 발현한다는 점에 서 나머지 2개의 서브셋과 상이하다. CD1c+ 혈액 DC는 그것이 CD2, 높은 수준의 MHC 클래스 II 분자를 발현하지만, CD62L는 낮은 수준으로 발현하고, Fc 리셉터 CD32, CD64 및 FcεR1을 발현한다는 점에서 나머지 2개의 서브셋과 상이하다. 아마 Fc 리셉터-발현으로 인해, CD1c+ 혈액 DC는 또한 IgG, kappa 및 lambda에 대해 양성일 것이다. 더욱이, 어떤 CD1c+ DC는 CD14 및 CD11b에 대해 양성이며, 이로써 발현 수준이 CD1c 및 CD2 발현의 수준과 역으로 상호관련된다. BDCA-3+ 혈액 DC는 그것이 더 적은 수준으로 CD36을 발현하고, 낮은 수준의 CD5를 발현하는 것 같다는 점에서 나머지 2개의 서브셋과 상이하다. 마지막으로, CD11c 및 CD123과는 별도로, 적어도 1개의 추가적 항원 CD33이 모든 3개의 서브셋의 구별에 유용한데, CD33은 BDCA-2+ DC에서 낮은 수준으로, BDCA-3+ DC에서 중간 수준으로, 그리고 CD1c+ DC에서 높은 수준으로 발현된다.
Figure 112002014869824-pct00003
Figure 112002014869824-pct00004
Figure 112002014869824-pct00005
실시예 10
배양 후 CD1c + , BDCA-2 + 및 BDCA-3 + 혈액 DC에서 MHC 클래스 II, CD83 및 공통-자극성 분자의 발현
신선하게 분리된 CD1c+ 혈액 DC 및 BDCA-3+ 혈액 DC를 어떤 사이토카인으로도 보충되지 않은 배지중에서 1일간 배양하고, 신선하게 분리된 BDCA-2+ 혈액 DC를 IL-3 및 CD32-트랜스펙션 섬유아세포에 대한 CD40 mAb로 보충된 배지중에서 2일간 배양했다. 배양 후, 세포를 CD1a, CD80, CD83, CD86 및 HLA-DR의 발현에 대해 분석했다. 비교를 위해, GM-CSF 및 IL-4의 존재하에 7일간 단구를 배양시켜 생성한 "미성숙" Mo-DC, 및 TNF-α의 존재하에 3일간 "미성숙" Mo-DC를 배양시켜 생성한 "성숙한" Mo-DC를 또한 포함시켰다. Sallusto 등 (1995) J. Exp. Med. 182:389-400 ; 및 Sallusto 등 (1998) J. Immunol. 28:2760-2769. 도 10에 나타낸 바와 같이, "미성숙" Mo-DC 및 "성숙한" Mo-DC와는 대조적으로, 혈액 DC 서브셋 중 어느 것도 배양 후 CD1a을 발현하지 않았다. 그러나, 공통-자극성 분자 CD80 및 CD86, DC 활성화 항원 CD83(Zhou 등 (1995); Zhou 등 (1992) J. Immunol. 149:735-742; 및 Zhou 등 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2588-2592), 및 HLA-DR 분자는 성숙한 Mo-DC와 비교하여 유사한 수준으로, 모든 3개의 혈액 DC 서브셋에서 배양시 하향조절된다. 이 결과는 모든 3개 혈액 DC 서브셋이 IL-3, IL-4 및 GM-CSF로 보충된 배지중에서 2일간 배양된 다른 실험에서도 별다른 차이가 없었다. 혈액 및 편도선으로부터의 CD11c-CD4+1in- DC에 대해 이미 나타낸 바와 같이, IL-3가 없는 배지중에서 배양되었을 때 BDCA-2+ 혈액 DC는 빠르게 죽었다.
실시예 11
신선하게 분리된 CD1c + . BDCA-2 + 및 BDCA-3 + 혈액 DC의 엔토시토시스 용량
정제된 CD1c+, BDCA-2+ 및 BDCA-3+ 혈액 DC, 그리고 대조표준으로서 정제된 CD3+ T 세포의 엔도시토시스 용량을 LY의 존재하에 37℃에서 세포를 배양하고, 다양한 시간 후 유동 세포계측에 의해 LY의 섭취를 분석함에 의해 시험했다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 정제된 CD3+ T 세포와는 달리 정제된 CD1c+ 혈액 DC, BDCA-3+ 혈액 DC, 및 어떤 정도의 BDCA-2+ 혈액 DC는 LY를 엔도시토시스하는 능력을 가진다. 유사한 결과를 FITC-덱스트란을 사용하여 얻었다. 모든 혈액 DC 집단의 엔도시토시스 용량은 Mo-DC와 비교하면 훨씬 더 낮다.
BDCA-4의 아미노산 서열을 AD5-17F6 mAb를 가지는 항원을 정제하고(AD5-17F6 친화성 칼럼), MALDI TOF 질량분광기에 의해 정제된 항원을 분석함에 의해 얻었다. BDCA-4는 뉴로필린-1과 동일하다. He 등 (1997).
실시예 12
BDCA-2와 항-BDCA-2 단일클론 항체(AC144)의 리게이션은 세포내 Ca 2 + 이동을 유도하는 반면, BDCA-4(뉴로필린-1)와 항-BDCA-4의 리게이션은 Ca 2 + 이동을 유도하지 않는다
물질 및 방법
BDCA-2+BDCA-4+ BDC 및 BDCA-2-트랜스펙션 또는 비-트랜스펙션 U937 세포에서 시토졸 칼슘의 측정. BDCA-2+BDCA-4+ 혈액 DC 및 BDCA-2-트랜스펙션 또는 비-트랜스펙션 U937 세포를 Valitutti 등 (1993) Eur. J. Immunol. 23:790-795에 설명된 Indo-1 AM(Sigma, St. Louis, MO)과 함께 로딩했다. 항-BDCA-2(AC144, IgG1) 또는 항-BDCA-4(AD5-17F6, IgG1) mAb를 신선하게 분리된 BDCA-2+BDCA-4+ BDC 및 BDCA-2-트랜스펙션 또는 비-트랜스펙션 U937 세포에 각각 첨가한 후, 교차결합제로서 래트 항-마우스 IgG1 mAb(X56)를 첨가하거나 또는 첨가하지 않았다. 세포를 유동 세포형광계에서 분석하여 Ca2 + 유동을 검출했다. 단지 살아 있기만한(산란 평가에 근거하여) 세포 및 Indo-1-표지된 세포(405nm 대 525nm 방출 스펙트럼에 근거하여)를 분석에 포함시켰다.
도 13은 세포내 이동이 면역자기적으로 정제된 BDCA-2+BDCA-4+ BDC(A, B) 및 BDCA-2-트랜스펙션 U937 세포(D)에서 유도되지만, 비-트랜스펙션 U937 세포(E)에서는 항-BDCA-2 mAb만(A)에 의해, 및/또는 항-BDCA-2에 더하여 교차결합한 이차 mAb(B, D, E)에 의해 유도되지 않는다는 것을 나타낸다.
면역자기적으로 정제된 BDCA-2+BDCA-4+ BDC상의 BDCA-4와 항-BDCA-4 mAb 및 교차결합한 이차 mAb의 리게이션은 시토졸 Ca2 +-이동을 유도하지 않았다. 시간(X축, 1024의 값은 204에 상응한다, 80초)에 대한 Indo-1-형광물질(Y축)의 405nm/525 nm 비는 Ca2 +-의존성인 것으로 나타났다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 형질세포 BDC의 표면 BDCA-2(도 13A 및 B) 및 BDCA-2-트랜스펙션 U937세포(도 13D)와 특이적 mAb(AC144, IgG1), 이어서(도 13B 및 D) 또는 이어서가 아닌(도 13A) 이차 교차결합한 mAb(래트 항-마우스 IgGI, X56)의 리게이션은 시토졸 칼슘 농도의 빠르고 일시적인 상승을 유도했다. 반대로, 형질세포 DC와 항-BDCA-4 mAb(AD5-17F6), 이어서 이차 교차결합한 mAb(래트 항-마우스 IgGI, X56)(도 14C)의 인큐베이션, 또는 비-트랜스펙션 U937 세포와 항-BDCA-2 mAb(AC144, IgG1), 이어서 이차 교차결합한 mAb(래트 항-마우스 IgGI, X56) (도 13E)의 인큐베이션은 시토졸 칼슘 농도의 빠르고 일시적인 상승을 유도하지 않았다.
실시예 13
바이러스 자극(인플루엔자 바이러스 균주 PR8)에 반응한 정제된 BDCA-2 + BDCA-4 + BDC에 의한 I형 인터페론의 생성은 항-BDCA-2 mAb로 BDCA-2를 트리거링함에 의해 저해된다
CD4+CD123brightCD11c- 형질세포 DC는 외피로 덮힌 바이러스, 박테리아, 및 종양 세포에 반응하는 치프 I형 인터페론 생산자인 것으로 알려졌다. Fitgerald Bocarsly 등 (1993) Pharmacol. Ther. 60:39-62; Siegal 등 (1999) Science 284: 1835-1837; Cella 등 (1999) Nature Med. 5:919-923. 이런 이유로, 그들은 또한 내츄럴 I형 인터페론 생성 효소(NIPC)라고 불리고 있다. 형질세포 DC는 BDCA-2 및 BDCA-4를 발현한다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 형질세포 CD상의 표면 BDCA-2와 특이적 mAb, 이어서 이차 교차결합한 mAb(래트 항-마우스 IgG1, X56)의 리게이션은, 인플루엔자 바이러스 균주 PR8(5HAU/ml)를 사용한 자극에 반응한, 혈액 또는 편도선으로부터 면역자기적으로 정제된 형질세포 BDCA-2+BDCA-4+DC에 의한 I형 인터페론의 분비를 저해한다. 항-BDCA-2, 인플루엔자 바이러스 및 교차결합한 mAb를 가지는 배양물(도 14, AC144+RamG1+FLU)에서 I형 인터페론의 생성 수준은, 인플루엔자 바이러스만을 가지는 배양물(도 14, FLU), 또는 이소형 대조표준 mAb(항-시토케라틴 mAb CK3-11D5, IgGI), 인플루엔자 바이러스 및 교차결합한 mAb(도 14, CK3+Ram G1+FLU)를 가지는 배양물에서보다 훨씬 더 낮다.
역으로, 형질세포 CD상의 표면 BDCA-4와 특이적 mAb, 이어서 이차 교차결합한 mAb(래트 항-마우스 IgG1, X56)의 리게이션은, 인플루엔자 바이러스 균주 PR8(5 HAU/ml)를 사용한 자극에 반응한, 혈액 또는 편도선으로부터 면역자기적으로 정제된 형질세포 BDCA-2+BDCA-4+DC에 의한 I형 인터페론의 분비를 저해하지 않는다. 항-BDCA-4, 인플루엔자 바이러스 및 교차결합한 mAb를 가지는 배양물(도 14, 17F6+ RamG1+FLU)에서 I형 인터페론의 생성 수준은, 이소형 대조표준 mAb(항-시토케라틴 mAb CK3-11D5, IgGI), 인플루엔자 바이러스 및 교차결합한 mAb(도 14, CK3+Ram G1+FLU)를 가지는 배양물에서와 동일하다.
물질 및 방법
BDCA-2- 및 BDCA-4-발현 형질세포 DC를 항-BDCA-4(AD5-17F6)-콘쥬게이트 마이크로비드를 사용하여 직접 자기 표지화하고, MACS에 의해 표지된 세포를 부화시켜 PBMC(도 14A) 또는 편도선 세포(도 14B)로부터 분리했다. 분리된 BDCA-2- 및 BDCA-4-발현 형질세포 DC를 24시간 동안 a) IL-3 단독(도 14, 대조표준); b) IL-3, 항-BDCA-2 mAb(AC144, IgG1) 및 래트 항-마우스 IgG1 mAb(도 14, AC144+RamG1); c) IL-3, 항-BDCA-2 mAb(AC144, IgGI), 래트 항-마우스 IgG1 mAb, 및 인플루엔자 바이러스 균주 PR8(도 14, AC144+RamG1+FLU); d) IL-3 및 인플루엔자 바이러스 균주 PR8(도 14, FLU); e) IL-3, 항-시토케라틴 mAb(CK3-11D5, IgGI), 래트 항-마우스 IgG1 mAb, 및 인플루엔자 바이러스 균주 PR8(도 14, CK3+RamG1+FLU); 및 f) IL-3, 항-BDCA-4 mAb(AD5-17F6), 래트 항-마우스 IgG1 mAb, 및 인플루엔자 바이러스 균주 PR8(도 14, 17F6+RamG1+FLU)의 존재하에 배지중에서 배양했다.
배양 상청액에서 분비된 I형 인터페론을 표준 IFN-α 곡선을 참고하여 다우디 세포 증식(Nederman 등 (1990) Biologicals 18:29-34)의 저해를 평가함에 의해 측정했다.
BDCA-2+BDCA-4+ 형질세포 DC에 의한 I형 인터페론의 저해와 관련하여, 혈중 I형 인터페론 및 I형 인터페론 유도 인자(항-DNA 항체와 DNA의 복합체와 같은 어떤 것)의 수준 증가가 SLE 환자에서 발견되며, 이것은 질환의 활성과 상호관련있다. 더욱이, I형 인터페론으로 치료된 비-자가면역 장애를 가지는 환자는 자기항체가 빈번히 발생하며, 때로는 SLE도 발생한다. Ronnblom 등 (1999) Clin. Exp. Immun-ol. 115:196-202; (1999) J. Immunol. 163:6306-6313; 및 (2000) J. Immunol. 165: 3519-3526의 몇몇 논문은 환자로부터 유도된 I형 인터페론 유도 인자가 건강한 도너로부터의 PBMC에서 I형 인터페론의 분비를 유도하고, 그것들이 내츄럴 I형 인터페론 생성 세포(NIPC=형질세포 DC)를 선택적으로 활성화시킨다는 것을 나타낸다.
BDCA-2의 리게이션이 바이러스 자극에 의해 유도된 I형 인터페론의 생성을 억제한다는 본원에 제시된 발견은, BDCA-2와의 결합이, BDCA-2의 리게이션에 의해서뿐만 아니라 NIPC(=BDCA-2+BDCA-4+ 형질세포 DC)의 고갈에 의해서, 질환을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 NIPC의 생체내, 시험관내 및 생체외 고갈을 더 포함한다. 그러한 고갈은 자가면역 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 적합하다.
도 14는, BDCA-4가 아니라 BDCA-2와 특이적 mAb, 이어서 이차 교차결합한 mAb의 리게이션이 인플루엔자 바이러스 균주 PR8를 사용한 자극에 반응한, 혈액 또는 편도선으로부터의 형질세포 BDCA-2+BDCA-4+DC에 의한 I형 인터페론의 분비를 저해한다는 것을 나타낸다. 혈액(A) 또는 편도선(B)으로부터의 형질세포 BDCA-2+BD CA-4+DC를, IL-3 단독(대조표준); IL-3, 항-BDCA-2 mAb 및 래트 항-마우스 IgG1 mAb (AC144+RamGl); IL-3, 항-BDCA-2 mAb, 래트 항-마우스 IgG1 mAb, 및 인플루엔자 바이러스 균주 PR8(AC144+RamG1+FLU); IL-3 및 인플루엔자 바이러스 균주 PR8(FLU); IL-3, 항-시토케라틴 mAb, 래트 항-마우스 IgG1 mAb, 및 인플루엔자 바이러스 균주 PR8(CK3+RamG1+FLU); IL-3, 항-BDCA-4 mAb, 래트 항-마우스 IgG1 mAb, 및 인플루엔자 바이러스 균주 PR8(17F6+RamG1+FLU)의 존재하에 24시간 동안 배양했다. 배양 상청액에서 분비된 I형 인터페론을 표준 I형 인터페론 곡선을 참고하여 생물분석법에 의해 측정했다.
실시예 14
BDCA-2는 리간드를 엔도시토시스할 수 있을뿐 아니라, 그것을 항원-프로세싱 및 로딩 구획으로 송달하고, 그것을 CD4+ 클래스 II-제한 T 세포에서 제시할 수 있다
물질 및 방법
BDCA-2- 및 BDCA-4-발현 형질세포 DC를 항-BDCA-4(AD5-17F6)-콘쥬게이트 마이크로비드를 사용하여 직접 자기 표지화하고, MACS에 의해 표지된 세포를 부화시켜 PBMC로부터 분리했다. 분리된 BDCA-2- 및 BDCA-4-발현 형질세포 DC를 IgG1 mAb(0.2㎕/ml)의 존재하에 96-웰 플레이트-바닥 마이크로플레이트에서 4x104세포/웰의 B13 T 세포 클론(Lanzavecchia 등 (1988) J. Exp. Med. 167:345-352)과 함께 인큐베이션했다. 분석에 사용된 mAb는 다음과 같았다: AC144(항-BDCA-2, IgG1), ZM3.8(항-ILT3, IgG1) 및 CK3-11D5(항-시토케라틴, IgG1). 48시간 후, 배양물을 (3H)티미딘(1μCi/웰)으로 펄스하고, 결합된 방사성활성을 16시간 더 후에 측정했다. (3H)티미딘 섭취(cpm)를 배양물에 있는 분리된 BDCA-2- 및 BDCA-4-발현 형질세포 DC의 수에 대해 도시했다(도 15).
도 15는 분리된 BDCA-2- 및 BDCA-4-발현 형질세포 DC에 의한 마우스 IgG1에 대해 특이적인 T 세포 클론에서 항-BDCA-2 mAb(AC144, IgG1)의 제시를 나타낸다. BDCA-2+BDCA-4+ 형질세포 DC는, 항-ILT-3 mAb(ZM3.8, IgG1, ▲) 및 항-시토케라틴 mAb(CK3-11D5, IgG1, ●)보다 더더욱 효과적으로 T 세포에서 항-BDCA-2 mAb(AC144, IgG1, ■)를 제시한다.
37℃에서 항-BDCA-2 mAb(AC144, IgG1)-표지된 BDCA-2+BDCA-4+ 형질세포 DC의 인큐베이션은 세포 표면에서의 항-BDCA-2 mAb/BDCA-2 복합체의 극단적으로 빠른 내부이행을 가져온다(도 8 참조). 본원에, 항-BDCA-2 mAb(AC144, IgG1)가 항원-프로세싱 및 로딩 구획을 액세스하며, 항체로부터 유도된 단백질은 마우스 IgG1 펩티드 에피토프에 특이적인 CD4+ 클래스 II-제한 T 세포 클론(B13)에서 효과적으로 제시된다는 것을 나타낸다. 항-BDCA-2 mAb의 제시를, 프로세싱 및 펩티드-로딩 구획에 리간드(들)을 표적화할 수 있다고 공지된 리셉터(ILT3)에 결합하는 IgGI mAb의 제시, 및 BDCA-2+BDCA-4+ 형질세포 DC(항-시토케라틴 mAb CK3-11D5, IgG1)상의 세포-표면 분자에는 결합하지 않지만 유체상에서는 받아들일 수 있는 IgG1 mAb의 제시와 비교했다. 도 15에 나타낸 바와 같이, BDCA-2+BDCA-4+ 형질세포 DC는 항-ILT-3 mAb 및 항-시토케라틴 mAb보다 더더욱 효과적으로 T 세포에서 항-BDCA-2 mAb(AC144 )를 제시했다.
실시예 15
편도선 세포에서 BDCA-2의 발현은 CD123 + T 세포-구역 관련 형질세포 DC에 제한되는 반면, BDCA-4는 몇몇 다른 세포에서 낮은 수준으로 발현될 수 있다
도 16은 편도선 형질세포 CD123+ DC상의 BDCA-2 및 BDCA-4의 발현을 나타낸다. BDCA-2(AC144)에 대한 FITC-콘쥬게이트 mAb 및 CD123 및 BDCA-4(AD5-17F6)에 대한 PE-콘쥬게이트 mAb를 각각 사용한 편도선 세포의 2-색 염색을 나타냈다. BDCA-2의 발현이 CD123bright 형질세포 DC에 제한되는 반면, BDCA-4는 또한 몇몇 다른 세포에서 낮은 수준으로 발현된다는 것이 주목된다.
실시예 16
BDCA-4 mAb(AD5-17F6)는 뉴로필린-1을 인식한다
뉴로필린-1은 신경 세포 가이던스를 매개하는 콜랩신/세마포린 패밀리의 리셉터이다. 또한, 뉴로필린-1은 혈관 내피 성장 인자에 대한 동형-특이적 리셉터로서 내피 및 종양 세포에 의해 발현된다. 그러나, 전에는 뉴로필린-1이 혈액 및 편도선에 있는 형질세포 DC에서 발현되고, 적어도 신선한 배양되지 않은 혈액에서는 형질세포 DC에 대한 훌륭한 마커를 대표한다는 것이 알려지지 않았었다.
물질 및 방법
뉴로필린-1을 항-BDCA-4 mAb Ad5-17F6(항-NRP-1(ML))을 사용하여, 비-트랜스펙션 PAE 세포(P) 및 뉴로필린-1-트랜스펙션 PEA 세포(NP)(Soker 등 (1998) Cell 92:735-745)의 세포 융해액으로부터 면역침전시켰다. 침전된 단백질을 SDS-PAGE 하고, BDCA-4-특이적 mAb AD5-17F6(ML) 또는 Shay Soker(Children's Hospital, Boston, MA)로부터의 뉴로필린-1-특이적 mAb(S)로 웨스턴 블롯팅하여 분석했다.
도 17은 뉴로필린-1이 항-BDCA-4 mAb Ad5-17F6(항-NRP-1(ML))과 함께, 뉴로필린-1-트랜스펙션 PEA 세포(NP)의 세포 융해액으로부터는 면역침전되지만, 비-트랜스펙션 PAE 세포(P)의 세포 융해액으로부터는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. 침전된 단백질을 SDS-PAGE하고, BDCA-4-특이적 mAb AD5-17F6(ML) 또는 Shay Soker (Children's Hospital, Boston, MA)로부터의 뉴로필린-1-특이적 mAb(S)로 웨스턴 블롯팅하여 분석했다.
BDCA-4-특이적 mAb AD5-17F6이 뉴로필린-1-트랜스펙션 PEA 세포(NP)로부터의 약 130-140kDa의 특이적 밴드를 면역침전시키지만, 비-트랜스펙션 PAE 세포(P)로부터는 그렇지 않다는 것이 주목된다. 이 밴드는 Shay Soker로부터의 뉴로필린-1-특이적 mAb(S)를 사용하여 검출할 수 있으나, 항-BDCA-4 mAb AD5-17F6(ML)로는 검출할 수 없다. 따라서, 우리의 항-BDCA-4 mAb AD5-17F6은 표준 면역침전 실험에서 뉴로필린-1의 자생적 형태는 인식하지만, SDS-PAGE/웨스턴 블롯팅 실험에 사용되었을 때 뉴로필린-1의 변성된 형태는 검출할 수 없다.
흥미롭게도, 또한 뉴로필린-1은 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 대한 동형-특이적 리셉터로서 내피 및 종양 세포에 의해 발현된다. 더욱 흥미롭게도, 몇몇 논문(Gabrilovich 등 (1996) Nature Med. 2:1267; Nature Med. 2:1096-103; Gabrilo-vich 등 (1999) Clin. Cancer Res. 5:2963-70; Ohm 등 (1999). J. Immunol. 163: 3260-8; Oyama 등 (1998) J. Immunol. 160:1224-32; Gabrilovich 등 (1998). Blood 92:4150-66; Ishida 등 (1998) J. Immunol. 161:4842-51)은 많은 퍼센트의 종양에 의해 생성되는 VEGF가 생체내에서 DC 발생 및 기능을 감소시킨다는 것을 나타냈다. DC에 대한 이들 효과가 뉴로필린-1(BDCA-4)에 의해 매개되는지는 분명하지 않지만, 본 발명은 DC의 뉴로필린-1-매개 기능적 조정을 포함한다.
실시예 17
폴리 I:C를 사용한 자극에 반응한 정제된 BDCA-2 + BDCA-4 + BDC에 의한 I형 인터페론(IFN-α)의 생성은 항-BDCA-2 mAb로 BDCA-2를 트리거링함에 의해 저해된다
CD4+CD123brightCD11c- 형질세포 DC는 외피로 덮힌 바이러스, 박테리아 및 종양 세포에 반응하는 치프 I형 인터페론 생산자인 것으로 알려져 있다. Fitzgerald Bocarsly 등 (1993) Pharmacol. Ther. 60:39-62; Siegal 등 (1999) Science 284: 1835-1837; Cella 등 (1999) Nature Med. 5:919-923. 이런 이유로, 그들은 또한 내츄럴 I형 인터페론 생성 효소(NIPC)라고 불리고 있다. 형질세포 DC는 BDCA-2 및 BDCA-4를 발현한다. 도 19에 나타낸 바와 같이, 형질세포 CD상의 표면 BDCA-2와 특이적 mAb, 이어서 이차 교차결합한 mAb(염소 항-마우스 IgG1)의 리게이션은, 폴 리 I:C를 사용한 자극에 반응한, 혈액 또는 편도선으로부터 면역자기적으로 정제된 형질세포 BDCA-2+BDCA-4+DC에 의한 INF-α의 분비를 저해한다. 항-BDCA-2, 폴리 I:C 및 교차결합한 mAb를 가지는 배양물(도 18, AC144 + 염소 항-마우스 IgG + 폴리 I:C)에서 INF-α의 생성 수준은, 마우스 IgG1, 폴리 I:C 및 교차결합한 mAb(도 18, 마우스 IgG1 + 염소 항-마우스 IgG + 폴리 I:C)를 가지는 배양물에서만큼 낮다.
물질 및 방법
CD11c-CD123bright 형질세포 DC를 BDCA-4 마이크로비드를 사용하여 사람 말초혈 단핵 세포로부터 분리했다. CD11c-C123bright 형질세포 DC(1x106세포/ml)를 30분간 37℃에서 RPMI, 10% FCS, 1OmM HEPES, 50μM 2-ME, 20㎍/ml 젠타미신 중에서 10㎍/ml의 AC144 mAb 또는 마우스 IgG1 mAb(CF6B, 항-TPO)와 함께 배양했다. 염소 항-마우스 IgG(Chemicon International)를 20㎍/ml 첨가하고, 세포를 37℃에서 30분간 다시 인큐베이션했다. 이들 세포를 24시간 동안 37℃에서 폴리 I:C(Sigma) 20㎍과 함께 또는 폴리 I:C 없이 배양했다. 배양 상청액을 수집하고, IFN-α농도를 ELISA(Endogen)에 의해 측정했다. 분석 감도는 3pg/ml이다.
도 18은 BDCA-4가 아니라 BDCA-2와 특이적 mAb, 이어서 이차 교차결합한 mAb의 리게이션이, 폴리 I:C를 사용한 자극에 반응하여, 혈액 또는 편도선으로부터의 형질세포 BDCA-2+BDCA-4+DC에 의한 INF-α의 분비를 저해한다는 것을 나타낸다. 혈 액으로부터의 형질세포 BDCA-2+BDCA-4+DC를 30분간 37℃에서 10㎍/ml의 AC144 mAb (2 및 4) 또는 마우스 IgG1 mAb(CF6B, 항-TPO, 1 및 3)과 함께 배양했다. 20㎍/ml의 염소 항-마우스 IgG를 첨가하고, 세포를 30분간 37℃에서 다시 인큐베이션했다. 이들 세포를 24시간 동안 37℃에서 폴리 I:C(Sigma) 20㎍과 함께(3 및 4) 또는 폴리 I:C 없이(1 및 2) 배양했다. 배양 상청액을 수집하고, IFN-α농도를 ELISA에 의해 측정했다.
실시예 18
다양한 조직 및 정제된 혈액 세포 집단에서 RT-PCR에 의한 BDCA-2 mRNA 발현 분석
핵산 및 아미노산 서열
BDCA-2를 코딩하는 cDNA를 COS 세포에서 발현 클로닝에 의해 얻었다. 도 5는 BDCA-2(발현된 6개 액손을 모두 가지는 동형)의 아미노산 서열을 나타낸다. BDCA-2는 신규한 C-형 렉틴 II형 멤브레인 단백질이다. 그러한 렉틴은, 예를 들어 Bates 등 (1999) J. Immunol. 163:1973-1983에 설명된다. BDCA-2와 공지된 C-형 렉틴의 비교를 실시예 20에 나타낸다.
도 19는 Clonetech로부터의 사람의 다수 조직의 cDNA 패널 분석(레인 1: 심장; 레인 2: 뇌; 레인 3: 태반; 레인 4: 폐; 레인 5: 간; 레인 6: 골격근; 레인 7: 신장; 레인 8: 췌장; 레인 9: 비장; 레인 10: 흉선; 레인 11: 고환; 레인 12: 난소; 레인 13: 소장; 레인 14: 림프절; 레인 15: 골수; 레인 16: 태아간; 레인 17: 편도선), 및 BDCA-2 cDNA의 존재에 대한 상이한 집단의 혈액 림프구(레인 18: T 세포; 레인 19: B 세포; 레인 20: NK 세포; 레인 21: 단구; 레인 22: GD11cbrightCD123lowDC; 레인 23: CD11c-CD123bright 형질세포 BDC)로부터 제조된 cDNA의 분석을 나타낸다.
모든 cDNA는 몇개의 상이한 하우스키핑 유전자(글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로지나제, 포스포리파제 A2, α-튜뷸린, 및 β-액틴)의 mRNA 발현 수준으로 정규화했다. 정규화는 표적 mRNA의 조직 특이성 및 상대적 풍부함의 정확한 평가를 보장한다. 동일한 양의 cDNA(약 50pg)를 각 RT-PCR 반응에 사용했다. RT-PCR 반응을 BDCA-2에 대한 특이적 프라이머(포워드: 5'-TTGAAAGAACCACACCCCGAAAGT (SEQ ID NO: ) 및 리버스: 5'-TAGCTTTCTACAACGGTGGATGCC(SEQ ID NO: )), 및 상기 언급된 4개의 하우스키핑 유전자에 대한 프라이머(CLONTECH)를 사용하여, AdvanTaq Plus DNA 중합효소(CLONTECH)를 사용하여 수행했다.
사이클 조건은 다음과 같았다: 94℃ 30초 및 68℃ 2분. 34 사이클을 BDCA-2에 사용하고, 38 사이클을 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로지나제(G3PDH)에 사용했다. BDCA-2 mRNA 신호가 CD11c-CD123bright 형질세포 DC에서만 검출된다는 것이 주목된다. 4번 더 많은 PCR 사이클(34 사이클 대신 38 사이클)을 BDCA-2 cDNA의 증폭에 사용한 경우, 약한 신호가 또한 췌장, 고환, 난소, 골수 및 편도선에서 검출되었다. 고환으로부터의 cDNA(38 PCR 사이클)에 관해서, 짧은 전사체(스플라이스 변이체)의 신호가 CD11c-CD123bright 형질세포 DC로부터의 신호와 비교하여 더욱 우세했으며, 전-길이 전사체로부터의 신호는 더욱 더 많은 PCR 사이클을 사용하여서만이 실지로 검출가능했다.
실시예 19
BDCA-2의 엑손/인트론 구조 및 BDCA-2의 스플라이스 변이체
BDCA-2의 스플라이스 변이체에 대한 정보를 시작 코돈(포워드 프라이머: 5'-TTGAAAGAACCACACCCCGAAAGT(SEQ ID NO :)) 앞쪽 및 중지 코돈(리버스 프라이머: 5'-TAGCTTTCTACAACGGTGGATGCC(SEQ ID NO :)) 뒤쪽의 mRNA 서열에 상보하는 프라이머를 사용하여 형질세포 DC로부터의 mRNA를 RT-PCR 증폭하고, 플라스미드에 있는 결과의 단편을 클론하고, 삽입체를 서열화하여 얻었다. 결과를 도 20에 나타낸다. 비교를 위해, 마우스 수지상세포-관련 C-형 렉틴 2(Dectin-2)의 스플라이스 변이체를 도 21에 나타낸다.
도 22는 표시될 추론된 인트론의 위치에 있는 BDCA-2 및 마우스 Dectin-2의 mRNA 서열의 정렬을 나타낸다. 표 3은 엑손에 대한 파라미터를 나타낸다.
Figure 112002014869824-pct00006
인트론의 위치는 호모 사피엔스 염색체 12 클론 RP11-277J24, 워킹 드리프트 서열, 21 언오더드 피스(GenBank 기탁 번호 AC006517) 및 전사체의 스플라이싱 규칙에 근거한다. BDCA-2의 인트론/엑손 메이크업은 Dectin-2와 유사하다.
적어도 4개의 BDCA-2 스플라이스 변이체가 생성된다. 이들은 6개의 엑손을 모두 가지는 단백질을 코딩하는 mRNA; 엑손 1, 3, 4, 5, 및 6을 함유하는 단백질을 코딩하는 mRNA; 엑손 1, 2, 4, 5, 및 6을 함유하는 단백질을 코딩하는 mRNA; 및 엑손 1, 2, 3, 5, 및 6을 함유하는 단백질을 코딩하는 mRNA이다.
실시예 20
BDCA-2 상동성 및 단백질 도메인
사람 BDCA-2, 사람 DCIR(Dendritic Cell Immunoreceptor; 수지상세포 면역리셉터), 및 마우스 Dectin-2(수지상세포-관련 C-형 렉틴 2)의 아미노산 서열의 정렬을 도 23에 나타낸다.
사람 DCIR(GenBank 기탁 번호 AJ133532)은 사람 분자들 중에서 BDCA-2에 대한 최고의 상동성을 가지는 분자이며(Bates 등 (1999) J. Immunol 163:1973 참조), 191 aa의 스트레치에 걸쳐 약 51%의 aa 동일성을 가진다.
마우스 Dectin-2(GenBank 기탁 번호 AF240357)는 사람 BDCA-2의 가장 그럴듯한 뮤린 상동체이며(Ariizumi 등 (2000) J. Biol. Chem. 16:11957; WO 98/28332; PCT/US97/23761; 및 미국 특허 6,046,158 참조), 211 aa의 스트레치에 걸쳐 약 51%의 동일성을 가진다.
BDCA-2(213 aa), DCIR(237 aa) 및 Dectin-2(209 aa)는 모두 칼슘-의존성(C-형) 렉틴 패밀리의 II형 멤브레인 당단백질이다. 각각의 분자는 추정 세포질 도메 인(BDCA-2: aa 1-21; DCIR: aa 1-44; Dectin-2: aa 117), 추정 트랜스멤브레인 도메인(BDCA-2: aa 22-41; DCIR: 44-69; Dectin-2: 18-40), 및 추정 세포외 도메인 (BDCA-2: aa 42-213; DCIR: 70-237; Dectin-2: 40-209)을 함유한다. 추정 세포외 도메인내에, 각각의 분자는 COOH-말단부에 단일 탄수화물 인식 도메인(CRD)을 함유한다(BDCA-2: aa 83-206; DCIR: 106-230; Dectin-2: 79-202). 도 23은 사람 BDCA-2, 사람 DCIR 및 마우스 Dectin-2의 정렬을 나타낸다.
PROSITE 데이타베이스를 사용하여 밝혀진 추정 단백질 도메인/모티프를 표 4에 나타낸다.
Figure 112002014869824-pct00007
Figure 112002014869824-pct00008
BDCA-2는 3개의 추정 N-글리코실화 부위(aa 110-113 NCSV; aa 137-140 NSSY; aa 164-167 NVTF)를 함유하는 반면, Dectin-2(aa 131-134 NESL) 및 DCIR(aa 185-188 NESS)은 유일한 1개의 추정 N-글리코실화 부위를 함유한다. BDCA-2 및 Dectin-2의 추정 인산화 부위는 모두 추정 세포외 도메인에 위치한다. 따라서, 그것들이 세포내 키나제에 의해 인산화되는 것은 다소 불가능하다. 자연살생 유전자 복합체에서 코딩되는 많은 C-형 렉틴(예를 들어, CD94, Ly-49, 및 NKG2)과 같이, DCIR은 세포질 도메인(aa 5-10 ITYAEV)에 연속 면역리셉터 티로신-기제 억제성 모티프(ITIM 모티프; (I/V)XYXX(L/V))를 함유한다. 흥미롭게도, 이 ITIM 모티프는 BDCA-2 및 Dectin-2(BDCA-2: 21 aa; Dectin-2: 17 aa)의 상대적으로 짧은 세포질 꼬리에서는 발견되지 않는다.
실시예 21
BDCA-3 단백질 분석
BDCA-3-발현 HD-MY-Z 세포를 24시간 동안 10ng/ml PMA(Sigma) 및 0.5mg/ml Ionomycin으로 자극하여, BDCA-3-발현을 상향조절했다. 3x107 PMA/Ionomycin 자극된 HD-MY-Z 세포를 15분간 4℃에서 1mg/ml 술포-NHS-LC-비오틴(Pierce)과 함께 인큐베이션하고, 2번 세척하여 표면 비오틴화했다. 세포를 10% 수크로스 및 프로테이나제 저해제(Serva로부터의 페닐메틸술포닐플루오리드, 펩스타틴 A, 류펩틴, 및 아프로티닌)로 보충된 50mM 트리스-HCl pH 8.0에 재현탁하고 0℃에서 초음파처리했다(5x4초, 70% 아웃풋). 초음파처리된 세포를 10분간 4℃에서 900xg로 원심분리하여 핵 및 무손상 세포를 제거했다. 상청액을 2시간 동안 4℃에서 30,000xg으로 원심분리하여, 정제된 세포 멤브레인을 얻었다. 멤브레인을 0℃에서 1시간 동안 50mM 트리스-HCl pH 8.0, 프로테이나제로 보충된 150mM NaCl 및 1% NP-40에서 인큐베이션하여 융해시켰다. 용해되지 않은 멤브레인 단편을 4℃에서 30,000xg으로 원심분리하여 제거했다. 상청액에 각각 1mM의 최종 농도까지 MnCl2 및 CaCl2를 첨가했다. 세포 융해액을 ConA 세파로스 칼럼(1ml)상에 흡수시키고, 결합된 단백질을 10ml 용출 완충액(0.5M D(+) 만노스, 20mM 트리스-HCl pH 7.4, 0.5M NaCl, 1% NP-40)로 용출하고, Cetriprep-10 원심분리 농축기(Amicon)를 사용하여 1ml 부피로 농축했다.
이 단백질을 4℃에서 30분간 150㎕ 항-NIP mAb-콘쥬게이트 마이크로비드 (Miltenyi Biotec)와 함께 인큐베이션하고, μMACS 칼럼 분리하여 미리 투명하게 했다. BDCA-3의 특이적 면역침전을 위해서, 단백질을 일차 시약으로서 2㎍의 NIP-콘쥬게이트 BDCA-3-특이적 mAb AD5-14H12(IgG1) 또는 특이성에 대한 대조표준으로 2㎍의 NIP-콘쥬게이트 CD19-특이적 mAb SJ25-C1(IgG1)과 함께 4℃에서 14시간 동안 인큐베이션하고, 이차 시약으로서 항-NIP mAb-콘쥬게이트 마이크로비드와 함께 4℃에서 3시간 동안 인큐베이션했다. 침전된 단백질을 μMACS 칼럼 분리하여 분리했다. 잔류하는 단백질을 DTT를 함유하는 SDS-PAGE 완충액 70㎕로 용출했다. 침전된 단백질을 SDS-PAGE(4-12%) 및 스트렙토아비딘-퍼옥시다제로 웨스턴 블롯팅하여 분석했다.
도 24의 결과는 BDCA-3-특이적 mAb AD5-14H12가 HD-MY-Z 세포로부터 약 100kD의 세포 표면 단백질을 면역침전시킨다는 것을 나타낸다. 따라서, BDCA-3은 100kD의 겉보기 분자량을 가진다.
전술한 발명이 명쾌한 이해를 위하여 예시 및 실시예에 의해 일부 상세히 설명되었지만, 어떤 변화 및 변형이 실행될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 설명 및 실시예는 첨부된 청구항에 의해 서술된 본 발명의 범위를 제한하지 않아야 한다.






Claims (154)

  1. SEQ ID NO:1 에 의해 코딩된 BDCA-2(Blood Dendritic Cell Antigen-2) 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 도메인을 포함하며, 상기 BDCA-2 단백질은 SEQ ID NO:1의 엑손 1-6; 엑손 1 및 3-6; 엑손 1-2 및 4-6; 또는 엑손 1-3 및 5-6 에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 분리된 항원-결합 단편.
  2. 제 1 항에 있어서, 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 항원-결합 단편.
  3. 제 1 항에 있어서, 항체는 사람, 뮤린, 인간화 또는 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 항원-결합 단편.
  4. 제 1 항에 있어서, Fab, F(ab')2, scFv, 또는 융합 폴리펩티드이거나, 또는 파지 전개 라이브러리에 의해서 코딩되는 것을 특징으로 하는 항원-결합 단편.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 방사성동위원소, 형광 화합물, 화학발광 화합물, 생물발광 화합물, 효소 및 상자성 표지로 구성된 군으로부터 선택되는 화학적으로 기능적인 부분에 융합되는 것을 특징으로 하는 항원-결합 단편.
  6. 삭제
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, BDCA-2(Blood Dendritic Cell Antigen-2) 단백질에 결합되는 것을 특징으로 하는 항원-결합 단편.
  8. 제 7 항에 있어서, BDCA-2 단백질을 발현하는 수지상 세포 또는 말초혈 단핵세포에 결합하는 것을 특징으로 하는 항원-결합 단편.
  9. 제 8 항에 있어서, 세포는 수지상 세포인 것을 특징으로 하는 항원-결합 단편.
  10. 제 9 항에 있어서, 세포는 형질세포 수지상세포인 것을 특징으로 하는 항원-결합 단편.
  11. 제 10 항에 있어서, 수지상 세포는 BDCA-4+인 것을 특징으로 하는 항원-결합 단편.
  12. 제 11 항에 있어서, 수지상 세포는 사람인 것을 특징으로 하는 항원-결합 단편.
  13. 제 10 항에 있어서, 항-BDCA-4 항체는 수지상 세포에 또한 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 항원-결합 단편.
  14. 제 1 항 또는 제 2 항의 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 면역장애 치료, 면역조절 치료, 유전자 치료 또는 백신접종용 조성물로서, 상기 치료 또는 백신접종의 대상이 되는 질환이, 성상세포종, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 핍지교종, 상의세포종, 수모세포종, 초기 신경외배엽 종양(PNET), 연골육종, 골원성육종, 췌장선암종, 소세포 및 대세포 폐선암종, 척삭종, 맥관육종, 내피육종, 편평세포암종, 기관지폐포성암종, 상피선암종, 림프관육종, 림프관내피육종, 간암, 담관암종(cholangiocarcinoma), 활막종, 중피종, 유잉 종양, 횡문근육종, 결장암종, 기저세포암종, 한선암종, 유두상암종, 피지선암종, 유두상선암종, 낭선종암종, 수질성암종, 기관지원성암종, 신세포암종, 담관암종(b-ileduct carcinoma), 융모막암종, 정상피종, 태생암종, 윌름 종양, 고환 종양, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 신경모세포종, 망막모세포종, 백혈병, 다발성 골수종, 왈덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 중쇄병, 관 및 소엽 선암종의 유방 종양, 자궁 경부의 편평 및 선암종, 자궁 및 난소 상피암종, 전립선 선암종, 방광의 이행성 편평세포암종, B 및 T 세포 림프종(소결절성 및 산재성), 형질세포종, 급성 및 만성 백혈병, 악성 흑색종, 연조직육종 및 평활근육종으로부터 선택되는 암, 종양성 질환(neoplastic disease); 단독, 또는 화학요법, 방사선요법 또는 면역요법으로부터 선택되는 다른 형태의 요법과 함께 조합되는 이식 대 숙주 질환(GvHD), 동종이식 거부반응 또는 알레르기로부터 선택되는 자가면역질환; 류마티스성 관절염, 연소성 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군, 피부경화증, 홍반성 루프스, 전신성 홍반성 루프스, 구드패스츄어 증후군, 라이터 증후군, 혈관염, 다발성 근염, 피부근염, 알레르기, 알레르기성 천식, 알레르기성 비염, 염증; 바이러스, 기생충, 박테리아 또는 진균류의 감염성 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 2 항의 단일클론 항체를 생산하는 것을 특징으로 하는 하이브리도마.
  16. 사람 세포 혼합물과 제 1 항의 항원-결합 단편을 접촉시키는 단계 및 항원-결합 단편이 결합한 세포를 분리하는 단계를 포함하는 BDCA-2+ 세포가 농축된 세포 집단을 제조하는 방법.
  17. (a) BDCA-2 단백질과 항원-결합 단편간의 복합체 형성을 허용하는 조건하에서 BDCA-2 단백질을 제 1 항의 그것의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계; 및 (b) 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플내에서 BDCA-2를 검출하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, BDCA-2 단백질은 수지상 세포의 표면상에 전개되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 복합체의 형성을 검출하는 단계는 수지상 세포의 기능적 조정을 검출하는 단계를 포함하며, 기능적인 조정은
    A) CD4+ 및 CD8+ 세포 반응의 유도 및 하향조절.
    B) 내성 또는 면역을 향한 면역 반응의 분극화.
    C) Th1 세포(helper T-cell type 1) 발생, Th2 세포 발생, 또는 Th3/T-조절성-1 CD4+ 세포 발생을 향한 CD4+ T 세포 반응의 분극화.
    D) B 세포 반응 또는 NK(Natural Killer) 세포 반응, 또는 이들 반응 모두의 조정인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 복합체의 형성을 검출하는 단계는 I형 인터페론 생산의 하향-조절, Th1 면역반응의 하향-조절, 세포내 Ca2+ 이동의 유도, 또는 Th2 에 대한 면역반응의 분극화를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 세포를 제 1 항 또는 제 2 항의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는 수지상 세포상에 BDCA-2 항원을 연결시키는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, BDCA-2 항원의 연결은 I형 인터페론 생산의 하향-조절, Th1 면역 반응의 하향-조절, 세포내 Ca2+ 이동의 유도, 또는 Th2 에 대한 면역반응의 분극화를 초래하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 시험 약제의 존재하에서 BDCA-2 단백질 및 제 1 항 또는 제 2 항의 항원-결합 단편을 접촉시키는 단계 및 시험 약제가 단백질에 대한 항원-결합 단편의 결합을 감소시키는지를 검출하는 단계를 포함하는 BDCA-2의 연결을 방해하는 약제를 스크리닝하는 방법.
  24. 제 1 항 또는 제 2 항의 항원-결합 단편, 및
    BDCA-2 단백질, 완충액 및 상기 항원-결합 단편에 콘쥬게이트되거나 콘쥬게이트될 수 있는 표지로 구성된 군으로부터 선택된 성분
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  25. SEQ ID NO:1 에 의해서 코딩된 분리된 BDCA-2 단백질.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 BDCA-2 단백질은 SEQ ID NO:1 의 엑손 1-6; 엑손 1 및 3-6; 엑손 1-2 및 4-6; 또는 엑손 1-3 및 5-6 에 의해서 코딩되는 것을 특징으로 하는 BDCA-2 단백질.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항의 BDCA-2 단백질을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  28. (a) 도 12에 제시되고(SEQ ID NO:1), BDCA-2 단백질을 코딩하는 서열의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드;
    (b) (a)의 DNA 보체에 혼성화하고 BDCA-2 단백질을 코딩하는 적어도 50개의 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드; 및
    (c) (a) 및 (b)에 정의된 DNA 서열에 대한 유전자 코드의 결과로서 축퇴성이고, BDCA-2 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드
    로부터 선택된 BDCA-2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 제 5 항에 있어서, BDCA-2 단백질에 결합되는 것을 특징으로 하는 항원-결합 단편.
  32. SEQ ID NO:1 에 의해서 코딩된 재조합 BDCA-2 단백질.
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 제 25 항 또는 제 26 항의 BDCA-2 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 삭제
  61. 삭제
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 삭제
  65. 삭제
  66. 삭제
  67. 삭제
  68. 삭제
  69. 삭제
  70. 삭제
  71. 삭제
  72. 삭제
  73. 삭제
  74. 삭제
  75. 삭제
  76. 삭제
  77. 삭제
  78. 삭제
  79. 삭제
  80. 삭제
  81. 삭제
  82. 삭제
  83. 삭제
  84. 삭제
  85. 삭제
  86. 삭제
  87. 삭제
  88. 삭제
  89. 삭제
  90. 삭제
  91. 삭제
  92. 삭제
  93. 삭제
  94. 삭제
  95. 삭제
  96. 삭제
  97. 삭제
  98. 삭제
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  100. 삭제
  101. 삭제
  102. 삭제
  103. 삭제
  104. 삭제
  105. 삭제
  106. 삭제
  107. 삭제
  108. 삭제
  109. 삭제
  110. 삭제
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  115. 삭제
  116. 삭제
  117. 삭제
  118. 삭제
  119. 삭제
  120. 삭제
  121. 삭제
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  123. 삭제
  124. 삭제
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  126. 삭제
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  128. 삭제
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KR1020027006247A 1999-11-15 2000-11-15 수지상 세포에 특이적인 항원-결합 단편, 단편을 사용한조성물 및 방법, 그것에 의해 인식된 항원, 및 그것에의해 얻어진 세포 KR100868235B1 (ko)

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