PT1301539E - Pragmentos de ligação a antigénios específicos para células dendríticas, composições e métodos para a sua utilização antigénicos assim reconhecidos e células assim obtidas. - Google Patents

Pragmentos de ligação a antigénios específicos para células dendríticas, composições e métodos para a sua utilização antigénicos assim reconhecidos e células assim obtidas. Download PDF

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Andrzej Dzionek
David William Buck
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Miltenyi Biotec Gmbh
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Description

ΕΡ 1 301 539 /PT
DESCRIÇÃO "Fragmentos de ligação a antigénios específicos para células dendríticas, composições e métodos para a sua utilização, antigénios assim reconhecidos e células assim obtidas"
CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se a anticorpos e seus derivados, específicos para subpopulações de células dendríticas (DC). Também se proporcionam composições e métodos para a sua utilização, incluindo isolamento e purificação de DC e suas subpopulações e imunoterapia mediada por anticorpos ou ligandos. A invenção também proporciona subpopulações de DC substancialmente isoladas. Também se proporcionam métodos para a sua utilização, incluindo imunoterapia baseada em DC, caracterização de várias doenças e expansão de DC numérica in vivo, por exemplo com o ligando flt3.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O desenvolvimento hematopoiético de células dendríticas (DC), potentes células apresentadoras de antigénios (APC), é diferente e poderá seguir várias vias precursoras, algumas estreitamente ligadas a monócitos. As DC podem ser derivadas de um precursor linfóide. Thomas et al. (1993) J. Immunol. 150:821-834. Tal como no sangue, pode haver três subconjuntos diferentes de DC presentes no timo: 1) DC plasmocitóides CD4+CDllc-; 2) DC CD4+CDllc+ e 3) DC interdigitantes. Foi proposto que as DC tímicas e as células T são originárias de uma célula estaminal comum. Thomas et al. (1996) Stem Cells 14:196-206. A produção de grandes quantidades de DC para uma utilização clínica potencial foi conseguida recentemente através da cultura in vitro de progenitores com citóquinas. Adaptaram-se várias estratégias para introduzir antigénios em células dendríticas, de modo a que possam ser apresentados a células T de um modo mais eficaz no contexto da co-estimulação. Também se verificou que as células dendríticas podem influenciar a resposta de células T ao antigénio ou no sentido de uma via humoral, ou sistémica. 2
ΕΡ 1 301 539 /PT
As células T são incapazes de responder a proteínas não processadas, pelo contrário, requerem que células acessórias apresentem o antigénio como epítopos peptídicos apresentados na superfície celular em conjunção com moléculas de MHC. Os antigénios produzidos endogenamente no citoplasma da célula são tipicamente apresentados na via de classe I e estimulam reacções de linfócitos T citotóxicos (CTL), enquanto que as proteínas exógenas são processadas em compartimentos do MHC de classe li e induzem respostas de células T ajudantes (CD4). A estimulação de células T não previamente estimuladas requer a presença de moléculas co-estimulantes que actuam como sinais secundários na activação da imunidade primária. As APC, tais como as células B e macrófagos, são tipicamente incapazes de induzir respostas primárias. Pelo contrário, as células dendríticas conduzem a sua potência da expressão desregulada constitutiva de moléculas co-estimuladoras, de adesão e do MHC de classe I e II, essenciais para iniciar uma imunidade celular eficaz. Para revisão, veja-se Avigan (1999) Blood Rev. 13:51-64.
As DC são APC que são essenciais para iniciar as respostas imunitárias primárias e o desenvolvimento de tolerância. As DC expressam o MHC, necessário para estimulação de populações de células T não previamente estimuladas. 0 desenvolvimento hematopoiético de DC é diferente e poderá seguir várias vias precursoras, estando algumas destas estreitamente ligadas a monócitos. Para revisão, veja-se Avigan (1999) Blood Rev. 13:51-64. Diferentes subconjuntos de DC têm diferentes vias de desenvolvimento. O conceito emergente é que um subconjunto de DC tem funções reguladoras que podem contribuir para a indução de tolerância a auto-antigénios. Austyn (1998) Curr. Opin. Hematol. 5:3-15. Pelo contrário, as DC, ou um seu subconjunto, podem também estar envolvidas na indução de respostas imunitárias a autoproteínas. Pensa-se que algumas respostas auto-imunes podem ser devidas a danos tecidulares microambientais seguidos de activação local das DC e interacção subsequente com células T, para iniciar uma resposta imunitária. Ibrahim et al. (1995) Immunol. Today 16:181-186. A capacidade das DC iniciarem respostas de células T está a ser utilizada em vacinas contra o cancro de DC. Hart et al. 3
ΕΡ 1 301 539 /PT (1999) Sem. Hematol. 36:21-25. Por exemplo, as DC são produzidas in vitro a partir de células CD34+ ou monócitos, pulsadas com péptidos ou proteinas derivados de tumor e recolocadas no paciente para actuar como apc na indução de células T especificas para o cancro. Brugger et al. (1999) Ann. N.Y. Acad. Sei. 872:363-371. Alguns modelos animais demonstraram que as vacinas contra tumores de DC invertem a anergia de células T e resultam numa rejeição subsequente do tumor. Avigan (1999); veja-se também, Tarte et al. (1999)
Leukemia 13:653-663; Colaço (1999) Molec. Med. Today 5:14-17; Timmerman et al. (1999) Ann. Rev. Med. 50:507-529; Hart et al. (1999) Semin. Hematol. 36:21-25; Thumher et al. (1998) Urol. Int. 61:67-71; e Hermans et al. (1998) N.Z. Med. J. 111:111-113. Uma abordagem tem sido aumentar as DC in vivo por administração do ligando flt. Isto tem o efeito de compensar a supressão de DC induzida por VEGF. Ohm et al. (1999) J. Immunol. 163:3260-3268. Foi proposta a utilização de DC como adjuvantes na vacinação e em vacinas recombinantes. Fernandez et al. (1998) Cyto. Cell. Mol. Ther. 4:53-65; e Gilboa et al. (1998) Câncer Immunol. Immunother. 46:82-87. Também foi proposta a utilização de DC para aumentar a imunidade após transplante de células estaminais. Brugger et al. (1999) Ann. NY Acad. Sei. 363-371. As DC desempenham vários papéis potenciais na imunologia. Por exemplo, as DC estão envolvidas na infecção pelo virus da imunodeficiência humana (HIV). Zoeteweij et al. (1998) J. Biomed. Sei. 5:253-259. Também foi proposto que as DC são adequadas para utilização na terapia de HIV. Weissman et al. (1997) Clin. Microbiol. Rev. 10:358-367.
Outras funções imunológicas estão relacionadas com as DC, tais como a indução diferencial de respostas de Thl ou Th2, reacções auto-imunes e alergias. Rissoan et al. (1999) Science 283:1183-1186; Hermans et al. (1998) NZ Med. J. 111:111-113; e De Palma et al. (1999) J. Immunol. 162:1982-1987.
Em pacientes com SLE observam-se niveis circulantes aumentados de iFN-α e factor indutor de lFN-α (algo semelhante a um complexo de anticorpo anti-ADN e ADN) e os mesmos estão correlacionados com a actividade da doença. Além disso, pacientes sem distúrbios auto-imunes tratados com iFN-a desenvolvem frequentemente auto-anticorpos e ocasionalmente SLE. Vários artigos de Ronnblom et al. (1999) Clin. Exp. 4
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Irmunol. 115: 196-202; (1999) J. Immunol. 163: 6306-6313; e (2000) J. Immunol. 165: 3519-3526) mostram que os factores indutores de IFN-α derivados de pacientes induzem a secreção de IFN-α em PBMC de dadores saudáveis e activam selectivamente células produtoras de IFN-α naturais (NIPC = DC plasmocitóides).
Os estudos sobre DC no sangue têm sido impedidos pela escassez de células e falta relativa de marcadores de superfície celular específicos de DC. Os métodos para o isolamento de DC baseiam-se ou na alteração da maturação após um curto período de cultura, como a aquisição de baixa densidade de flutuação, ou a expressão de antigénios de activação/maturação de DC (CD83, CMRF-44 e CMRF-56). Young et al. (1988) Cell Immunol. 111:167; Van Voorhis et al. (1982) J. Exp. Med. 155:1172; Zhou et al. (1995) J. Immunol. 154:3821-3835; Fearnley et al. (1997) Blood 89:3708-3716; Mannering et al. (1988) J. Immunol. Met. 219:69-83; Hock et al. (1999) Tiss. Antigens 53:320-334; e Hock et al. Immunol. 83:573-581.
As DC CDla+ funcionais são tipicamente produzidas ex vivo a partir de monócitos e a partir de células progenitoras hematopoiéticas CD34+. Bender et al. (1996) J. Immunol. Met. 196:121-135; Pickl et al. (1996) J. Immunol. 157:3850-3859; Romani et al. (1994) J. Exp. Med. 180:83-93; Sallusto et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1109-1118; Caux et al. (1992) Nature 360:258-261; Mackensen et al. (1995) Blood 86:2699-2707; Szabolcs et al. (1995) J. Immunol. 154:5851-5861; Herbst et al. (1996) Blood 88:2541-2548; de Wynter et al. (1998) Stem Cells 16:387-396; Strunk et al. (1996) Blood 87:1292-1302 Patentes US Nos 6010905; e 6004807. Não se sabe se as DC produzidas in vitro a partir de monócitos e células progenitoras hematopoiéticas retêm ou obtêm todas as características das DC in vivo.
Além disso, várias tentativas para produzir mAc específicos para DC humanas falharam, obtendo-se apenas mAc que se ligam a antigénios expressos quer por DC, quer outros leucócitos. As DC humanas partilham um grande número de estruturas de superfície celular imunogénicas com outras células sanguíneas, incluindo moléculas HLA, CD18, CD29, CD31, CD43, CD44, CD45, CD54 e CD58. Estes antigénios podem dominar 5
ΕΡ 1 301 539 /PT a resposta imunitária a DC injectadas a um nível em que as células B com especificidade para antigénios específicos de DC não estão de todo, ou estão apenas muito raramente representadas entre as células B que têm capacidade para se fundir com células de mieloma.
Muitos investigadores tentaram ultrapassar este problema injectando ratinhos adultos com não-DC e ciclofosfamida, de modo a eliminar células B com especificidade para antigénios partilhados, ou injectando ratinhos recém-nascidos com não-DC de modo a tornar tolerantes as células B com especificidade para antigénios partilhados. 0'Doherty et al. (1993) Adv. Exp. Med. Biol. 329:165-172; e Yamaguchi et al. (1995) J. Immunol.
Met. 181:115-124.
Utilizou-se um mAc designado por CMRF$4 para monitorizar DC em pacientes de transplante de células estaminais. Fearnley et al. (1999) Blood 93:728-736. Foi proposto que estas células CMRF44+ são adequadas para utilização no início, manutenção e direccionamento de respostas imunitárias. Fearnley et al. (1997). As DC têm sido isoladas muitas vezes utilizando uma combinação de marcadores de superfície celular. Por exemplo, a patente US N.° 5972627 descreve que "células hematopoiéticas enriquecidas em células progenitoras dendríticas hematopoiéticas, humanas" têm "pelo menos 80% que expressam CD34, CD45RA, e CD10 mas não CD19, CD2, CD3, CD4, CD8, CD20, CD14, CD15, CD16 CD56 e glicoforina". O isolamento de DC a partir do sangue baseia-se em vários critérios imunofenotípicos, como a ausência de um painel de antigénios específicos para a linhagem dos leucócitos (lin) (e.g. CD3, CD14, CD19 e CD56) e a presença de HLA-DR, CD4 ou CD33. Romani et al. (1996) J. Immunol. Met. 196:137-151; Thomas et al. (1993) J. Immunol. 150:821-834; Thomas et al. (1994) J. Immunol. 153:4016-4028; 0'Doherty et al. (1994) Immunol. 82:487-493; 0'Doherty et al. (1993) J. Exp. Med. 178:1067-1076; Nijman et al. (1995) J. Exp. Med. 182:163-174; Ferbas et al. (1994) J. Immunol. 152:4649-4662; Heufler et al. (1996) Eur. J. Immunol. 26:659-668; Ito et al. (1999) J. Immunol. 163:1409-1419; Cella et al. (1999) Nature Med. 5:919-923; Robinson et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29:2769-2778; Olweus et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:12551- 6
ΕΡ 1 301 539 /PT 12556; Robert et al. (1999) J. Exp. Med. 189:627-636; e Kohrgruber et al. (1999) J. Immunol. 163:3250-3259. A partir das análises de DC isoladas de sangue não cultivado, tornou-se evidente que as DC do sangue não são uma população de células homogénea, mas uma mistura de pelo menos duas populações. Thomas et al. (1994); 0'Doherty et al. (1994); Ito et al. (1999); Cella et al. (1999); Robinson et al. (1999); Olweus et al. (1997); Kohrgruber et al. (1999);
Strobl et al. (1998) J. Immunol. 161:740-748; e Rissoan et al. (1999) Science 283:1183-1186. A primeira subpopulação de DC é DC CDl23bright CDllc~, que possui uma morfologia plasmocitóide e função estimuladora de células T potente. A segunda subpopulação de DC é CDl23dim CDllcbright, que é pelo contrário de aparência monocitóide, expressa CD45RO e desenvolve-se espontaneamente em DC tipicamente maduras, mesmo quando cultivadas sem quaisquer citóquinas exógenas. As DC CDl23bright CDllc” plasmocitóides apresentam algumas caracteristicas, como expressão da cadeia α do pré-receptor de células T, o que indica que poderão provir de percursores linfóides. Strobl et al. (1998); Rissoan et al. (1999); e Bruno et al. (1997) J. Exp. Med. 185:875-884. As DC CDl23dim CDllcbright apresentam todos os critérios das DC mielóides. 0'Doherty et al. (1994); e Ito et al. (1999). Robinson et al. (1999); Kohrgruber et al. (1999); e Strobl et al. (1998). Foram detectadas DC que se assemelham às DC CDl23bightCDllc~ plasmocitóides nas áreas ricas em células T de tecido linfóide e foram inicialmente, e erradamente, designadas por células T plasmocitóides ou monócitos plasmocitóides, devido à sua morfologia e fenótipo. Grouard et al. (1997) J. Exp. Med. 185:1101-1111; Lennert et al. (1975) Lancet 1:1031-1032; Lennert et al. (1984) em Leukocyte Typing. Human Leukocyte differentiation antigens detected by monoclonal antibodies. Bernard et al. eds. Springer-Verlag, Berlim; e Facchetti et al. (1988) Am. J. Pathol. 133:15. Foram encontradas DC que se assemelham a DC sanguíneas CDl23dimCDllcbright na zona escura e luminosa de centros germinais. Grouard (1996) Nature 384:364-367.
VARIANTES DE SPLICING
As estimativas do número total de genes expressos variam de 40 000 a mais de 150 000. Este número não é um reflexo 7 ΕΡ 1 301 539 /PT preciso do número de proteínas codificadas, uma vez que há, em muitos casos, mais do que uma variante de splicing dos ARNm (transcriptoma) produzidos a partir destes genes. As estimativas mais uma vez variam, mas talvez sejam produzidos tanto quanto 500 000 ARNm diferentes no ser humano. Estima-se que pelo menos 30% dos genes humanos têm várias variantes de splicing. Mironov et al. (1999) Genome Research 9:1288-1293). Alguns autores pensam que estes números são conservativos. Pensa-se que o ratinho e o rato terão números semelhantes e ocorre splicing alternativo também em organismos inferiores, tais como Drosophila melanogaster e Caenorhabditis elegans. As proteínas traduzidas de variantes de splicing diferentes podem ter funções significativamente diferentes, como evidenciado por um número crescente de artigos de investigação. Diferentes variantes de splicing podem ser expressas em diferentes tecidos, diferentes fases de desenvolvimento e diferentes estados de doença.
LECTINAS DO TIPO C
As lectinas do tipo C são uma família de glicoproteínas que exibem semelhanças de sequência de aminoácidos nos seus domínios de reconhecimento de hidratos de carbono (CRD) e que se ligam a hidratos de carbono seleccionados de um modo dependente de Ca2+. As lectinas do tipo C foram subdivididas em quatro categorias (Vasta et al., 1994; e Spiess 1990). O primeiro grupo compreende proteínas integradas na membrana do tipo II, tais como receptores de asialoglicoproteínas, galactose de macrófagos e lectina específica de N-acetilglucosamina (Glc-Nac) e CD23 (FceRII) . Muitos membros neste grupo exibem especificidade para galactose/frutose, galactosamina/GalNac ou resíduos GlcNac. O segundo grupo inclui cartilagem e proteínas de núcleo de proteoglicano de fibroblastos. O terceiro grupo inclui as designadas "colectinas", tais como proteínas de ligação a manose do soro, proteína tensioactiva pulmonar SP-A e conglutinina. O quarto grupo inclui algumas proteínas de adesão conhecidas como lec-CAM (e. g., Mel-14, GMP-140 e ELAM-l) .
As lectinas do tipo-C são conhecidas por funcionarem como aglutininas, opsoninas, activadores do complemento e moléculas de reconhecimento associadas a células (Vasta et al. 1994; 8
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Spiess 1990; e Kery 1991). Por exemplo, os receptores de manose de macrófagos têm uma função de limpeza (Shepherd et al., 1990), bem como de mediação da incorporação de organismos patogénicos, incluindo Pneumocystis carinii (Ezekowitz et al. 1991) e Candida albicans (Ezekowitz et al. 1990). A proteína de ligação a manose do soro mimetiza Clq na sua capacidade para activar o complemento através da via clássica. As mutações genéticas nesta lectina predispõem para infecções recorrentes graves, diarreia e incapacidade para medrar (Reid et al. 1994). Assim, as lectinas do tipo C exibem diversas funções com significado biológico.
As porções de hidrato de carbono não servem necessariamente como ligandos "naturais" para lectinas do tipo C. Por exemplo, sabe-se agora que o CD23 (FCSRII) que pertence à familia de lectinas do tipo C, como verificado pela sua ligação de Gal-Gal-Nac (Kijimoto-Ochiai et al. 1994) e pela sua sequência de CRD, reconhece IgE de um modo dependente de hidratos de carbono; uma forma desglicosilada de IgE, bem como IgE recombinante (não glicosilada) produzida em E. coli ligam-se ambas a CD23 (Vercelli et al. 1989). Assim, algumas lectinas do tipo C reconhecem sequências de polipéptido nos seus ligandos naturais.
Foram identificadas algumas lectinas do tipo C na superfície de DC. Primeiro, Jiang et al. clonaram a proteína reconhecida pelo mAc nldc-145, um dos mAc mais amplamente utilizados contra DC de murídeo (Jiang et al., 1995). Verificou-se que esta proteína, agora designada por DEC-205, é um novo membro da família de lectinas do tipo C, uma que contém dez CRD diferentes. Segundo, Sallusto et al. referiram que a DC humana expressa receptores de manose de macrófagos (MMR) que também contêm múltiplos CRD (Sallusto et al., 1995). Foi proposto que ambos os receptores medeiam a endocitose de moléculas glicosiladas por DC, com base na observação de que: a) anticorpos de coelho policlonais contra DEC-205 não só se ligaram a DEC-205 em superfícies de DC, mas foram subsequentemente internalizados; b) estas DC activaram eficazmente uma linha de células T reactiva com IgG de coelho e c) a internalização de FITC-dextrano por DC foi bloqueada eficazmente com manano, um competidor pelo receptor de manose (Jiang et al. 1995; e Sallusto et al. 1995). Em relação à 9
ΕΡ 1 301 539 /PT especificidade para o tipo de célula sabe-se agora que o DEC-205 também é expresso, apesar de a níveis inferiores, por células B e células epiteliais no timo, intestino e pulmão (Witmer-Pack et al. 1995; e Inaba et al. 1995) e o mmr também é expresso, mesmo mais abundantemente, pelos macrófagos (Stahl 1992). Também se encontraram outros na superfície de DC, incluindo DCIR, MDL-1, NURPIA, Dectina-1, Dectina-2, CLEC-1, CLEC-2, Langerina; e sinal-DC.
Alergias
As respostas alérgicas, incluindo as de asma alérgica e rinite alérgica, caracterizam-se por uma resposta de fase precoce que ocorre no espaço de segundos a minutos após a exposição ao alergénio e se caracteriza por infiltração de eosinófilos no local da exposição ao alergénio. Especificamente, durante a fase precoce da resposta alérgica, a activação de linfócitos do tipo Th2 estimula a produção de anticorpos igE específicos para o antigénio, o que por sua vez desencadeia a libertação de histaminas e outros mediadores de inflamação a partir de mastócitos e basófilos. Durante a resposta da fase tardia, a produção de IL-4 e IL-5 por células Th2 CD4+ é elevada. Estas citóquinas parecem desempenhar um papel significativo no recrutamento de eosinófilos para o local de exposição ao alergénio, onde ocorre dano e disfunção do tecido.
Actualmente, a imunoterapia de antigénios para distúrbios alérgicos envolve a injecção subcutânea de quantidades pequenas, mas gradualmente crescentes de antigénio, num processo designado por terapia de dessensibilização. A imunoterapia de antigénios é meramente paliativa e, actualmente, não curativa. Weber (1997) JAMA 278:1881-1887; Stevens (1998) Acta Clinica Beligica 53:66-72; e Canadian Society of Allergy and Clinicai Immunology (1995) Can. Med. Assoe. J. 152:1413-1419.
Muitos pacientes que começam a terapia não completam o regime e se falharem as injecções durante mais de uma semana o paciente deverá começar de novo todo o regime de tratamento. Vários antigénios foram identificados e produzidos por meios recombinantes. Para revisão veja-se, Baldo et ai. (1989) 10
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Allergy 44:81-97; Baldo (1991) Curr. Opin. Immunol. 3:841-850; Blaser (1994) Ther. Umsch 51:19-23; e Valenta et al. (1996) Adv. Exp. Med. Bio. 409:185-196.
Os tratamentos de imunoterapia com antigénios apresentam o risco de induzir anafilaxia mediada por igE potencialmente letal e não envolvem os fenómenos mediados por citóquinas da resposta alérgica de fase tardia. Esta terapia foi descrita como "tendo potencial para o infortúnio". Weber (1997). Outro problema significativo com a imunoterapia de antigénios é que o risco de reacções adversas, especialmente de anafilaxia, reduz significativamente a dosagem de antigénio, quer em relação à quantidade dada por administração, quer a quantidade dada ao longo de um periodo de tempo. Assim, a imunoterapia de alergia tradicional é prolongada e portanto morosa, inconveniente e dispendiosa.
Uma abordagem alternativa para o tratamento de distúrbios associados a igE, tais como as alergias, envolve a administração de compostos que inibem a libertação de histaminas. Muitas destas drogas estão disponíveis como medicamentos de venda livre. Outras drogas incluem um anticorpo de ligação a anti-IgE. No entanto, uma desvantagem desta abordagem é que esta apenas mascara os sintomas, não proporcionando nenhum tipo de cura ou protecção permanente.
Em EMBL A L 006517 (1999-02-05) de Muzny et al. está descrita uma sequência de nucleótidos de 218 414 pares de bases como sendo parte da sequência do cromossoma 12 humano. Esta é uma sequência esboço de 63 contigs não ordenados.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
A invenção refere-se a métodos para enriquecer populações de células hematopoiéticas em DC e seus subconjuntos. A invenção também proporciona composições enriquecidas em células e populações de células obtidas a partir destas. Também são proporcionados métodos para produzir DC geneticamente modificadas. Também são proporcionadas composições de DC geneticamente modificadas. Também se incluem métodos para utilização das células. Também são proporcionados 11
ΕΡ 1 301 539 /PT fragmentos de ligação a antigénio específicos para BDCA-2 e os antigénios reconhecidos por estes. A invenção inclui fragmentos de ligação ao antigénio específicos para um subconjunto de DC especificamente reconhecidos por um anticorpo designado por AC144, AD5-1311 ou AD5-4B8. A invenção inclui fragmentos de ligação ao antigénio específicos para um epítopo de um antigénio designado por BDCA-2. A invenção inclui uma população ou subpopulação de DC substancialmente isolada e concentrada, especificamente reconhecida por um fragmento de ligação ao antigénio da invenção. Estes fragmentos de ligação ao antigénio podem ser gualguer um de entre AC144, AD5-1311 ou AD5-4B8 ou fragmentos de ligação ao antigénio específicos para BDA-2. A invenção inclui também populações ou subpopulações de DC em gue substancialmente todas as células expressas ou são isoladas, concentradas ou enumeradas com base na expressão de BDCA-2. Estas células podem ser suspensas em qualguer excipiente fisiologicamente aceitável. De preferência, o excipiente é farmacologicamente aceitável. A invenção inclui também métodos para obter composições de células hematopoiéticas enriquecidas em DC por separação de uma mistura de células hematopoiéticas humanas numa fracção em que pelo menos 80% das células na fracção são BDCA-2+. A invenção inclui também métodos para isolar um subconjunto de DC substancialmente puras: a) obtendo uma mistura de células hematopoiéticas humanas; e b) isolando substancialmente as células a partir de uma mistura especificamente reconhecida por um fragmento de ligação ao antigénio específico para o antigénio designado por BDCA-2. A invenção inclui também métodos para enumerar DC: a) obtendo uma mistura de células; e b) marcando as células com um fragmento de ligação ao antigénio específico para o antigénio, BDCA-2. 12
ΕΡ 1 301 539 /PT A invenção inclui também métodos para modular a capacidade imunitária das DC por: isolamento de uma população ou subpopulação de DC substancialmente pura e modulação da mobilização de cálcio das DC. A invenção inclui também métodos para pesquisar agentes de teste quanto à presença de agentes farmaceuticamente eficazes, isolando uma população ou subpopulação de DC substancialmente pura com um fragmento de ligação ao antigénio especifico para o antigénio, BDCA-2, pesquisando as células isoladas com os agentes de teste; monitorando a resposta das células aos agentes, comparando a resposta das células aos agentes com a de células expostas a um agente de controlo e determinando se o agente de teste modulou qualquer propriedade imunológica da célula isolada. A invenção inclui também métodos para modular uma propriedade imunológica das DC alterando a capacidade das DC mobilizarem cálcio. A invenção inclui também composições imunogénicas e imunomoduladoras das DC, de preferência num excipiente fisiologicamente aceitável. A invenção inclui também métodos para tratar uma condição fisiológica administrando a um indivíduo necessitado uma quantidade eficaz de composições de DC imunogénicas ou imunomoduladoras.
A invenção inclui também métodos para produzir citóquinas de DC isolando uma população ou subpopulação de DC substancialmente pura com um fragmento de ligação ao antigénio específico para BDC-A e isolando citóquinas a partir das células, ou produtos celulares, ou sobrenadantes. A invenção inclui também métodos para modular a produção de citóquinas de DC isolando uma população ou subpopulação de DC substancialmente pura com um fragmento de ligação ao antigénio específico para BDCA-2 e tratando as células com agentes que modulam a produção de citóquinas de DC. 13
ΕΡ 1 301 539 /PT A invenção inclui também métodos para modular a produção de citóquinas de DC in vivo por administração a um indivíduo necessitado de uma quantidade eficaz de um agente que modula a produção de citóquinas de DC. A invenção inclui também métodos para produzir anticorpos específicos para um antigénio, administrando a um indivíduo necessitado uma quantidade eficaz de uma população ou subpopulação substancialmente pura de DC carregadas com o antigénio e isoladas com um fragmento de ligação ao antigénio específico para BDCA-2, em que as DC são moduladas para induzir uma resposta de Th2. A invenção inclui também métodos para produzir uma resposta imunitária de células T ou humoral, específica para um antigénio, por administração a um indivíduo necessitado de uma quantidade eficaz de uma população ou subpopulação substancialmente pura de DC carregadas com o antigénio e isoladas com um fragmento de ligação ao antigénio específico para qualquer um ou mais de BDCA-2, em que as células são moduladas para induzir uma resposta de Thl. A invenção inclui também polipéptidos preparados por expressão, numa célula hospedeira recombinante, dos polipéptidos e purificação do polipéptido expresso separando-o dos componentes totais da célula hospedeira recombinante, em que o polipéptido contém cerca de 5 resíduos de aminoácido contíguos de SEQ ID NO:2. A invenção inclui também polipéptidos purificados e suas composições, em que o polipéptido contém cerca de 5 resíduos de aminoácido contíguos de SEQ ID NO:2. A invenção inclui também proteínas de fusão de uma sequência de aminoácidos de polipéptido ligada a uma sequência de aminoácido de polipéptido que não é a SEQ ID NO:2, em que a sequência de aminoácidos contém cerca de 5 resíduos de aminoácido contíguos de SEQ ID NO:2. A invenção inclui também polipéptidos que contêm pelo menos uma variante de splicing de BDCA-2. 14
ΕΡ 1 301 539 /PT A invenção inclui também um polinucleótido ou um seu complemento que codifica para pelo menos 5 resíduos de aminoácido contíguos de BDCA-2, uma variante de splicing ou um seu fragmento. A invenção inclui também células hospedeiras recombinantes contendo um polinucleótido ou um seu complemento que codifica para pelo menos 5 resíduos de aminoácido contíguos de BDCA-2, uma variante de splicing ou um seu fragmento. A invenção inclui também um método para inibir uma interacção de uma DC com uma célula T por contacto de uma composição contendo DC e células T com uma quantidade eficaz de um agente que inibe a interacção de BDCA-2 com a célula T. A invenção inclui também um método para tratar a inflamação por administração a um indivíduo necessitado de uma quantidade de um agente que inibe a interacção de BDCA-2 com a célula T, eficaz para reduzir a inflamação no indivíduo. A invenção inclui também um método para suprimir a expressão de BDCA-2 numa célula por expressão de um polinucleótido de sentido inverso de BDCA-2 na célula. A invenção inclui também um animal transgénico contendo o polinucleótido ou um seu complemento que codifica para pelo menos 5 resíduos de aminoácido contíguos de BDCA-2, uma variante de splicing ou um seu fragmento.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra gráficos de pontos da análise de citometria de fluxo de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) isoladas por centrifugação em gradiente de densidade Ficoll-Paque. Na Figura 1 é apresentada a expressão de BDCA-2, BDCA-3 e CDlc (BDCA-1) em PBMC. A Figura IA mostra a coloração de PBMC com mAc conjugados com FITC contra BDCA-2 (AC144), BDCA-3 (AD5-5E8) e CDlc (AD5-8E7) e mAc conjugados com PE contra o heterodímero TCRap, CD14, CD19 e CD56, respectivamente. Os números indicam a 15 ΕΡ 1 301 539 /PT percentagem de células no quadrante respectivo. Os sinais de fluorescência de iodeto de propídio e dispersão de luz foram utilizados para discriminar as células vivas. A Figura 1B mostra o perfil de dispersão de (a) PBMC, (b) células BDCA-2+ discriminadas, (c) células BDCA-3+ discriminadas e (d) células CDlc+ discriminadas. A Figura 2 mostra que o BDCA-2, BDCA-3, BDCA-4 e CDlc (BDCA-1) são expressos em três subconjuntos de DC sanguíneas distintos. As DC sanguíneas foram isoladas de PBMC por eliminação de células positivas para CD3, CDllb e CD16, seguido de enriquecimento de células positivas para CD4. A pureza das DC sanguíneas é demonstrada por propriedades de dispersão de luz (gráfico de pontos superior esquerdo) e coloração anti-HLA-DR-Cy5 versus anti-Lin-FITC (anti-TCRap, CD14, CD19 e CD56) (gráfico de pontos superior médio). Note-se que apenas estão presentes algumas células lin+. A expressão de BDCA-2, BDCA-3, BDCA-4 e CDlc nas DC sanguíneas é caracterizada numa série de colorações de duas cores com mAc conjugado com PE e FITC contra CDllc, CD123 e os próprios antigénios. Note-se que BDCA-2, BDCA-3, BDCA-4 e CDlc são exclusivamente expressos em apenas um de três subconjuntos de DC sanguíneas distintos, cada. Os subconjuntos são definidos de acordo com a coloração das DC sanguíneas com CD123-PE versus CDllc-FITC (gráfico de pontos superior esquerdo): DC sanguíneas CDllc~CDl23bright; DC sanguíneas CDllcbrightCDl23dim; e DC sanguíneas CDllcdimCDl23~. A Figura 3 mostra a expressão de BDCA-4 em PBMC. É apresentada uma coloração de duas cores de PBMC com mAc conjugado com FITC contra BDCA-2 (AC144) e mAc conjugado com PE contra BDCA-4 (ADS-17F6) . Note-se que são detectados alguns PBMC positivos isolados (BDCA-2+BDCA-4- e BDCA-2-BDCA-4+).
A Figura 4 mostra a expressão de BDCA-2, BDCA-3 e BDCA-4 em DC sanguíneas purificadas após vários períodos de cultura na presença de IL-3. As DC sanguíneas purificadas foram cultivadas durante Oh, 1 h, 3 h, 6 h, 9 h, 12 h, 18 h, 24 h, 36 h, e 48 h na presença de rlL-3 e em seguida analisadas por citometria de fluxo quanto à expressão de CDllc, BDCA-3, BDCA-2 e BDCA-4. (A) histogramas que mostram a coloração de DC 16
ΕΡ 1 301 539 /PT sanguíneas CDllcT e CDllc+ discriminadas com mAc anti-BDCA conjugado com PE (AC144) e mAc anti-BDCA (AD5-17F6) (linhas a cheio) e mAc de controlo com correspondência de isotipo, conjugados com PE (linhas claras), respectivamente. Os gráficos de pontos mostram a coloração de DC sanguíneas com CDllc-PE versus anti-BDCA-3 (AD5-5E8) biotina/estreptavidina-APC. (B) os diagramas mostram os valores de intensidade de fluorescência média (MFI) para a coloração com anti-BDCA-2-ΡΕ, anti-BDCA-4-ΡΕ, e anti-BDCA-3 biotina/estreptavidina-APC de DC CDllc” (A) e CDllc+(·), respectivamente. Para BDCA-2 e BDCA-4, os valores de MFI foram calculados subtraindo os valores obtidos com o mAc de controlo do isotipo dos valores obtidos com AC144 e AD5-17F8, respectivamente. Para BDCA-3, os valores de MFI são calculados subtraindo os valores obtidos sem qualquer mAc de coloração (autofluorescente) dos valores obtidos com AD5-5E8. A Figura 5 mostra a sequência de aminoácidos de uma isoforma de bdca-2 em que todos os seis exões são expressos (SEQ ID NO:2). A Figura 6 mostra que o mAc específico de BDCA-1, AD5-8E7 bloqueia a ligação do mAc CDlc M241 a células MOLT-4. As células MOLT-4 foram pré-incubadas com quantidades saturantes de mAc AD5-8E7 (linha a cheio) ou um mAc de controlo do isotipo (linha clara) e em seguida corados com mAc CDlc conjugado com PE (M241). A Figura 7 mostra a expressão de BDCA-2, BDCA-3 e BDCA-4 em Mo-DC e DC derivadas de células CD34+ (CD34-DC) . Os monócitos CD14+ e as células progenitoras hematopoiéticas CD34+ foram purificados imunomagneticamente por marcação magnética directa com micropérolas conjugadas com mAc de CD14 e CD34, respectivamente. Os monócitos purificados foram cultivados durante 7 dias na presença de rGM-CSF e rlL-4 e as CD34-DC purificadas foram cultivadas durante 11 dias na presença do ligando rflt-3, rTGF-βΙ, rTNF-α, rSCF e rGM-CSF. Após o período de cultura, as células foram coradas com CDla-FITC, CDlc-ΡΕ (AD5-8E7), anti-BDCA-2-ΡΕ (AC114) anti-BDCA-3-ΡΕ (AD5-5E8) e anti-BDCA-4-ΡΕ (AD5-17F6). Os histogramas mostram a coloração de (A) Mo-DC e (B) CD34-DC (linhas a cheio), respectivamente. As linhas claras mostram a coloração com o 17
ΕΡ 1 301 539 /PT mAC de controlo do isotipo. Excepto para o histograma mais à esquerda (coloração com CDla), as células CDla+ discriminadas são apresentadas em (B). A Figura 8 mostra que a cultura de células BDCA-2+ marcadas com mAc anti-BDCA-2 resulta na internalização rápida de mAc. Marcaram-se PBMC a 4°C com mAc anti-BDCA-2 conjugado com FITC (AC144, IgGl) incubou-se a 37°C durante os períodos de tempo indicados e em seguida corou-se a 4°C com mAc de rato anti-IgGl de ratinho conjugado com PE (x56) e mAc CD123 conjugado com Cy5 (AC145, IgG2a). São apresentados valores de MFI de coloração com anti-BDCA-2-FITC () e mAc de rato anti-IgGl de ratinho-PE (A) de células BDCA-2+CD123+ discriminadas. A Figura 9 mostra a morfologia de DC sanguíneas CDlc+, BDCA-2+ e BDCA-3+ purificadas imunomagneticamente. As células CDlc+, BDCA-2+ e BDCA-3+ foram isoladas de PBMC por marcação magnética indirecta com mAc primários conjugados com PE (AD5-8E7, AC144 e AD5-5E8) e micropérolas conjugadas com mAc anti-PE, seguido de enriquecimento das células marcadas por MACS. Os gráficos de pontos mostram a coloração de PBMC com HLA-DR-FITC e o mAc conjugado com PE antes (gráficos de pontos da esquerda) e depois (gráficos de pontos da direita) do enriquecimento magnético de células CDlc+ (gráficos de pontos superiores) BDCA-2+ (gráficos de pontos do meio) e BDCA-3+ (gráficos de pontos inferiores), respectivamente. As três figuras do lado direito mostram a coloração de May Grunwald/Giemsa de células CDlc+ (figura superior), BDCA-2+ (figura do meio) e BDCA-3+ isoladas após citocentrifugação. Note-se que se podem observar pequenos linfócitos na figura das células CDlc+ enriquecidas. Estas são células B CDlc+. A Figura 10 mostra a supra-regulação de moléculas de MHC classe II, CD83 e co-estimuladoras em DC sanguíneas CDlc+, BDCA-2+ e BDCA-3+ após cultura. Cultivou-se CDlc+ (A), BDCA-2+ (C) e BDCA-3+ (B) purificadas durante 1 dia em meio (BDC CDlc+ e BDCA-3+) ou durante 2 dias em meio com rlL-3 e mAc anti-CD40 em células L transfectadas com CD32 (DC BDCA-2+), respectivamente. Produziram-se Mo-DC "Imaturas" (D) por cultura de monócitos durante 7 dias em meio, na presença de rGM-CSF e rIL-4. Produziram-se Mo-DC "Maduras" (E) por cultura de Mo-DC imaturas durante mais 3 dias em meio, na presença de 18
ΕΡ 1 301 539 /PT TNFa. Os histogramas mostram a coloração de células com CDla-FITC, CD80-PE, CD83-PE, CD86-PE e HLA-DR-PE, respectivamente (linhas a cheio). As linhas claras mostram a coloração de células com mAc de controlo com correspondência de isotipo e fluorócromo.
A Figura 11 mostra a capacidade endocitica de DC sanguíneas CDlc+, BDCA-2+ e BDCA-3+ isoladas de fresco em comparação com células T CD3+ purificadas. incubaram-se células DC CDlc+ (♦), BDC BDCA-2+ (A), DC BDCA-3+ () e T CD3+ (*) isoladas a 37°C em meio com 1 mg/ml de amarelo de Lucifer (LY) durante 0, 15, 45 e 75 min, lavou-se três vezes em PBS/EDTA/BSA arrefecido em gelo e analisou-se em seguida por citometria de fluxo. São apresentados os valores de MFI para a fluorescência de LY após subtracção dos valores de MFI, que são obtidos por incubação a 4°C, na ausência de LY. A Figura 12 mostra a sequência de ADNc de BDCA-2 (SEQ ID NO:1). A Figura 13 mostra que a mobilização de Ca2+ intracelular é induzida em DC sanguíneas BDCA-2+BDCA-4+ purificadas imunomagneticamente (A, B) e células U937 transfectadas com BDCA-2 (D), mas não em células U937 não transfectadas (E) via mAc anti-BDCA-2 isolado (A) e ou anti-BDCA-2 mais mAc mobilização 405nm/525nm secundário com reticulação (B, D, E) . A ligação de BDCA-4 a BDC BDCA-2+BDCA-4+ purificadas imunomagneticamente com mAc anti-BDCA-4 e mAc secundário com reticulação não induz a de Ca2+ intracelular. É apresentada a razão dependente de Ca2+ de fluorescência de Indo-1 (eixo do Y) em função do tempo (eixo do X, um valor de 1024 corresponde a 204,80 s). A é DC sanguínea BDCA-2+BDCA-4+, anti-BDCA-2 (AC144, IgGl). B é DC sanguínea BDCA-2+ BDCA-4+, anti-BDCA-2 (AC144, IgGl) mais anticorpo de rato anti-IgGl de ratinho (X56). C é DC sanguínea BDCA-2+ BDCA-4+, anti-BDCA-4 (AD5-17F6, IgGl) mais anticorpo de rato anti-IgGl de ratinho (X56). D são células U937 transfectadas com BDCA-2, anti- BDCA-2 (AC144,' IgGl) mais anticorpo de rato anti-IgGl de ratinho (X56). E são células U937 não transfectadas, anti- BDCA-2 (AC144, IgGl) mais anticorpo de rato anti-IgGl de ratinho (X56). 19
ΕΡ 1 301 539 /PT A Figura 14 mostra a ligação de BDCA-2 mas não de BDCA-4 com um mAc especifico seguido de um mAc secundário com reticulação que inibe a secreção do interferão tipo I pelas DC BDCA-2+BDCA-4+ plasmocitóides de sangue ou amígdalas, em resposta ao estimulo com a estirpe PR8 do virus influenza. As DC BDCA-2+BDCA-4+ plasmocitóides de sangue isolado de fresco (A) ou amígdalas (B) foram cultivadas durante 24 horas na presença de IL-3 isolado (controlo); IL-3, mAc anti-BDCA-2 e mAc de rato anti-lgGl de ratinho (ACl44+RamGl); IL-3, mAc anti-BDCA-2, mAc de rato anti-lgGl de ratinho e estirpe PR8 do vírus influenza (AC144+RamGl+FLU); IL-3 e estirpe PR8 do vírus influenza (FLU); IL-3, mAc anti-citoqueratina, mAc de rato anti-lgGl de ratinho e estirpe PR8 do vírus influenza (CK3+RamGl+FLU); IL-3, mAc anti-BDCA-4, mAc de rato anti-lgGl de ratinho e estirpe PR8 do vírus influenza (17F6+RamGl+FLU). Mediu-se o interferão tipo I segregado (U/ml) nos sobrenadantes da cultura por meio de um bioensaio com referência a uma curva padrão de interferão tipo I (U/ml). A Figura 15 mostra a apresentação de mAc anti-BDCA-2 (AC144, IgGl) a um clone de células T específico para IgGl de ratinho, por DC plasmocitóides que expressam BDCA-2 e BDCA-4 isoladas. As DC plasmocitóides BDCA-2+BDCA-4+ apresentam mAc anti-BDCA-2 (AC144, IgGl, ) a células T de um modo muito mais eficaz do que o mAc anti-ILT-3 (ZM3.8, IgGl, A) e mAc anti-citoqueratina (CK3-11D5, IgGl, ·). A Figura 16 mostra a expressão de BDCA-2 e BDCA-4 em DC CD123+plasmocitóides de amígdalas. A Figura 17 mostra que a neuropilina-1 (N.°. de acesso do GenBank 003873) é imunoprecipitada a partir de lisados celulares de células PEA transfectadas com neuropilina-1 (NP), mas não de células PAE não transf ectadas (P) com o mAc anti-BDCA-4 AD5-17F6 (anti-NRP-1 (ML)). As proteínas precipitadas foram analisadas por SDS-PAGE e transferência de Western com o mAc específico de BDCA-4 AD5-17F6 (ML) ou um mAc específico de neuropilina-1 do Shay Soker, Children's Hospital, Boston, MA (S) . A Figura 18 mostra que a ligação de BDCA-2 mas não a de BDCA-4 com um mAc específico, seguido de um mAc secundário com 20
ΕΡ 1 301 539 /PT reticulação inibe a secreção de INF-α por DC BDCA-2+BDCA-4+ plasmocitóides de sangue ou amígdalas em resposta ao estimulo com poli I:C. Fez-se a cultura de DC sanguíneas BDCA-2+ BDCA-4+ plasmocitóides com 10 pg/ml de mAc AC 144 (2 e 4) ou mAc IgGl de ratinho (CF6B, anti-TPO, 1 e 3) a 37°C durante 30 min. A Figura 19 mostra uma análise de vários painéis de ADNc de tecido humano da CLONTECH (pista 1: coração; pista 2: cérebro; pista 3: placenta; pista 4: pulmão; pista 5: fígado; pista 6: músculo esquelético; pista 7: rim; pista 8: pâncreas; pista 9: baço; pista 10: timo; pista 11: testículos; pista 12: ovários; pista 13: intestino delgado; pista 14: nódulo linfático; pista 15: medula óssea; pista 16: fígado fetal; pista 17: amígdala) e uma análise de ADNc preparados a partir de diferentes populações de leucócitos do sangue (pista 18: células T; pista 19: células B; pista 20: células NK; pista 21: monócitos; pista 22: BDC CDllcbrightCDl23low; pista 23: DC plasmocitóides CDllc-CDl23bright) para ADNc de bdca-2. O controlo é G3PDH. A Figura 20 mostra as variantes de splicing da molécula transcrita BDCA-2. As variantes de splicing foram analisadas por RT-PCR utilizando os iniciadores específicos para BDCA-2 utilizados na análise de expressão. Os fragmentos amplificados foram clonados em vectores plasmídicos e sequenciados. A Figura 21 mostra as variantes de splicing de moléculas transcritas de Dectina-2. A Figura 22 mostra um alinhamento das sequências de ARNm de BDCA-2 e dectina-2 de ratinho estando indicadas as posições precisas dos intrões deduzidos. Na Figura 23, * representa resíduos conservados idênticos em todas as sequências alinhadas, : representa substituições conservadas, representa substituições semi-conservadas, as áreas sombreadas denotam o domínio de reconhecimento de hidratos de carbono (CRD) conservado, em itálico estão os domínios transmembranares putativos. Os símbolos seguintes realçam resíduos fortemente conservados entre lectinas do tipo-C na CRD: 21
ΕΡ 1 301 539 /PT H Hidrófobo A Alifático C Cisteína G Glicina E Ácido glutâmico W Triptofano Δ Aminoácido aromático + Resíduos envolvidos na ligação de hidratos de carbono dependente de cálcio +P+ + Região que determina a especificidade de ligação a hidratos de carbono A Figura 23 mostra o alinhamento das sequências de aminoácidos de BDCA-2 humana, DCIR humana e Dectina-2 de ratinho. A Figura 24 mostra BDCA-3 imunoprecipitado a partir de lisados celulares de células HD-MY-z biotiniladas de superfície com o mAc específico de BDCA-3 AD5-14H12 (IgGl). Para controlo da especificidade utilizou-se o mAc específico de CD19, SJ25-C1 (IgGl). As proteínas precipitadas foram analisadas por SDS-PAGE (4-12%) e transferência de Western com estreptavidina-peroxidase. Note-se que o mAc específico de BDCA-3 AD5-14H12 imunoprecipita especificamente uma proteína de superfície celular de cerca de 100 kD a partir de células HD-MY-Z. Assim, o BDCA-3 tem um peso molecular aparente de 100 kD.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção refere-se a métodos de enriquecimento de populações de células em DC e seus subconjuntos. A invenção também proporciona composições enriquecidas em DC e populações de células obtidas a partir destas. Também são proporcionados métodos e composições para células modificadas. Também são proporcionadas composições de células modificadas, incluindo células geneticamente modificadas. São proporcionados métodos de utilização de células quer modificadas, quer não modificadas. Também são proporcionados fragmentos de ligação ao antigénio e os antigénios reconhecidos por estes. 22
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Descreve-se aqui um painel de novos mAc produzidos contra DC CD4+lin” purificados imunomagneticamente que identificam três antigénios de DC: BDCA-2, BDCA-3 e BDCA-4. Os BDCA-2 e BDCA-3 são novos. No caso do bdca-4, apesar de não ter sido anteriormente descrito como um antigénio especifico de DC, o antigénio foi identificado como neuropilina-1, um receptor para a família de colapsina/semaforina que medeia a orientação de células neuronais. He et al. (1997) Cell 90:739-751.
Em sangue humano não cultivado, a expressão de BDCA-2 e BDCA-4 está estritamente confinada a DC CDl23~CDllcdim plasmocitóides. Esta população de DC BDCA-3+ partilha muitas características imunofenotípicas com DC CDl23dimCDllcbright clássicas, mas, ao contrário das DC CD123dimCDllcdim, as DC BDCA-3+ não possuem expressão de CDlc (BDCA-1), CD2 e vários dos receptores de Fc. A fonte de DC não purificadas pode ser qualquer uma conhecida na arte, tal como a medula óssea, fetal, de recém-nascido ou adulto ou outra fonte de células hematopoiéticas, e.g. fígado fetal, sangue periférico ou sangue de cordão umbilical, amígdala, nódulo linfático, membrana nasal, baço, pele, epitélio das vias aéreas, pulmão, fígado, intestino, placas de Peyer, etc. As DC também podem ser isoladas a partir de células de cultura, tais como DC derivadas de células progenitoras. Podem-se utilizar várias técnicas para separar as células. Por exemplo, os métodos de selecção negativa podem remover não-DC inicialmente. Os mAc são particularmente úteis para identificar marcadores associados a linhagens celulares particulares e/ou fases de diferenciação quer para selecções positivas, quer negativas.
Se desejado, pode remover-se inicialmente uma grande proporção de células diferenciadas de fase terminal, utilizando uma separação negativa relativamente bruta. Por exemplo, podem-se utilizar inicialmente separações de pérolas magnéticas para remover quantidades elevadas de células irrelevantes. Pelo menos cerca de 80%, normalmente pelo menos 70% das células totais serão removidas antes do isolamento das DC. De preferência, as DC são directamente isoladas da fonte celular por selecção positiva. 23
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Os procedimentos para separação incluem, mas não se limitam a, centrifugação em gradiente de densidade; formação de rosetas, acoplamento a partículas que modificam a densidade celular; separação magnética com pérolas magnéticas revestidas com anticorpo ou ferro-fluidos revestidos com anticorpo (nanoparticulas); cromatografia de afinidade; agentes citotóxicos ligados a, ou utilizados em conjunção com um mAc, incluindo, mas não se limitando a complemento e citotoxinas; e panning com o anticorpo ligado a uma matriz sólida, e.g. placa, elutriação ou qualquer outra técnica conveniente.
As técnicas que proporcionam a separação e análise adequadas incluem, mas não se limitam a, separação de pérolas magnéticas e citometria de fluxo que podem ter vários graus de sofisticação, e.g., uma variedade de canais de cor, canais de detecção de dispersão de luz em ângulo baixo e obtuso, canais de impedância, etc.
As células podem ser seleccionadas contra células mortas utilizando corantes associados a células mortas, tais como iodeto de propidio (PI). De preferência, as células são recolhidas num meio compreendendo soro a 2%, tal como soro fetal de vitela (FCS) ou albumina de soro humano (HSA) ou qualquer outro meio isotónico adequado, de preferência estéril. Para indicações fisiológicas, prefere-se HAS. A modificação genética das células pode ser conseguida em qualquer altura durante a sua manutenção, por transdução de uma composição celular substancialmente homogénea com uma construção de ADN recombinante, transfectada com ARN, fusão celular, carga com antigénios e vários métodos conhecidos e/ou descritos aqui.
Para modificação das células pode-se utilizar um vector retroviral, no entanto pode-se utilizar qualquer outro sistema de fornecimento ou modificação celular. Estes incluem, e.g., adenovirus, vírus adeno-associados, cromossomas artificiais derivados de leveduras e ARN derivado de uma fonte de antigénio, tal como um tumor. A modificação genética, se existente, não tem que ser permanente, uma vez que as DC maduras têm um tempo de vida limitado. Utilizam-se abordagens genéticas para expressar antigénios estranhos (tumor, virai ou parasíticos, etc.) ou auto-antigénios em DC, de modo a induzir 24
ΕΡ 1 301 539 /PT imunidade ou tolerância. A longevidade da modificação também pode ser controlada por genes suicidas para limitar a terapia (tal como com células T).
Os métodos de transdução incluem qualquer um conhecido na arte incluindo, sem limitação, a co-cultura directa das células com células produtoras, e.g., pelo método descrito por Bregni et al. (1992) Blood 80:1418-1422, ou por cultura com sobrenadante virai isolado, com ou sem factores de crescimento e policatiões adequados, e.g., pelo método descrito por Xu et al. (1994) Exp. Hemat. 22:223-230; e Hughes et al. (1992) J. Clin. Invest. 89:1817.
Por reintrodução das células modificadas que expressam ou estão carregadas com um antigénio, de modo a apresentar o antigénio no hospedeiro, as células T são activadas, anergizadas ou eliminadas e são especificamente direccionadas contra o antigénio. Em geral, os antigénios adequados incluem os que são expressos por células infectadas viralmente ou células de cancro, bactérias, leveduras, protozoários, auto-antigénios (tolerogénios) e alergénios. Mais especificamente, os antigénios adequados incluem, mas não se limitam a, proteínas virais, proteínas de células de cancro, proteínas específicas de tecido ou proteínas tolerogénicas. A "indução" de células T pode incluir a inactivação de células T específicas de antigénio por eliminação ou anergia. A inactivação é particularmente útil para estabelecer ou restabelecer a tolerância, tal como num transplante de órgão e distúrbios auto-imunes, respectivamente. As DC modificadas podem ser administradas por qualquer método conhecido na arte, incluindo, mas não se limitando a, intravenosamente, subcutaneamente, intranodalmente e directamente no timo. De preferência, a administração é intravenosa (IV).
Muitas vezes a imunoterapia celular envolve a remoção de colheitas de leucoferese de medula óssea, ou outra fonte de células de um hospedeiro humano, isolando as células a partir da fonte. Entretanto, o hospedeiro pode ser tratado de modo a anular parcial, substancial ou completamente a capacidade hematopoiética nativa no caso de ocorrer um transplante de células estaminais hematopoiéticas. As células isoladas podem ser modificadas durante este período de tempo de modo a 25
ΕΡ 1 301 539 /PT proporcionar células com a modificação desejada. No caso de ablação hematopoiética completa, também é necessário o aumento de células estaminais. As células ou células modificadas podem ser então reintroduzidas no hospedeiro para lhe proporcionar a nova capacidade. São conhecidos na arte métodos de remoção de células, ablação e repopulação de células estaminais/ progenitoras do hospedeiro.
As células modificadas podem ser administradas em qualquer veículo fisiologicamente aceitável, normalmente intravascular, intranodal ou subcutaneamente. Normalmente, serão administradas pelo menos 1 x 105 células, de preferência 1 x 106 ou mais. As células podem ser introduzidas por injecção, cateter ou semelhantes. Se desejado, também se podem incluir factores, incluindo, mas não se limitando a interleucinas, e.g., IL-2, IL-3, IL-4, IL-12 e ligando flt, bem como outras interleucinas, factores estimuladores de colónias, tais como G-, M- e GM-CSF, interferões, e.g., interferão-γ.
Os termos "polipéptido", "péptido" e "proteína" são utilizados de forma interpermutável aqui para designar polímeros de resíduos de aminoácido de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender resíduos de aminoácido modificados ou análogos de aminoácidos e pode ser interrompido por porções químicas que não resíduos de aminoácido. Os termos também incluem um polímero de aminoácidos que foi modificado naturalmente, ou por intervenção, incluindo, mas não se limitando a, formação de ponte dissulfureto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de marcação ou bioactivo. Salvo indicado ou subentendido em contrário, o termo fragmento de ligação ao antigénio inclui qualquer monómero ou polímero de polipéptido com especificidade imunológica, incluindo o anticorpo intacto e polipéptidos funcionalmente equivalentes menores ou maiores, como aqui descrito. 1. Fragmentos de ligação ao antigénio e suas composições o A presente invenção inclui fragmentos de ligação ao antigénio que reconhecem especificamente DC. isto é, 26
ΕΡ 1 301 539 /PT antigénio encontra-se nas DC, de modo que os fragmentos de ligação ao antigénio que reconhecem o antigénio reconhecem ou ligam-se de preferência a DC ou um seu subconjunto. Ou, tal como com BDCA-4, o antigénio pode encontrar-se noutros tipos de células; mas entre as células hematopoiéticas o antigénio está predominantemente presente nas DC. A invenção inclui também uma composição de matéria compreendendo um fragmento de ligação ao antigénio isolado que se liga especificamente a pelo menos um antigénio de DC. De preferência, o fragmento de ligação ao antigénio é, ou é derivado de um mAc designado por AC144, AD5-13A11, AD5-20E5, AD5-17F6, AD5-4B8, AD5-5E8, AD5-14H12 e AD5-8E7. A tabela 1 mostra o antigénio e epitopo reconhecido por cada mAc e o isotipo dos mAc específicos para DC.
Tabela 1
Antigénio Anticorpo Epitopo Isotipo DC CDl lcbrlght CD123low DC CDl lclow CD123" DC CDllc" CD123bright Outros leucócitos CDlc AD5-8E7 IA IgG2a + Subconjunto de células B BDCA-2 AC144 2A IgGl - - + - BDCA-2 AD5-13A11 2A IgG2a - - + - BDCA-2 AD5-5B8 2A IgGl - - + - BDCA-3 AD5-5E8 3A IgGl - + - - BDCA-3 AD5-14H12 3B IgGl - + - - BDCA-4 AD5-17F6 4A IgGl - - + -
Em sangue humano não cultivado, o BDCA-2 e BDCA-4 são expressos por uma população de DC CDl23brightCDCllc~. Esta população de DC é agora comummente designada por DC plasmocitóides. Utilizando BDCA-2 e BDCA-4 como marcadores de superfície para o isolamento imunomagnético e/ou identificação por citometria de fluxo de DC plasmocitóides, os resultados aqui apresentados em frequência, imunofenótipo, morfologia, capacidade endocítica e maturação destas células eram totalmente consistentes com registos anteriores em que se utilizou um grande painel de antigénios de leucócitos. Isto 27 ΕΡ 1 301 539 /PT ilustra claramente que ambos os antigénios são marcadores úteis para DC plasmocitóides em sangue humano não cultivado. As colorações de células de amígdalas mostram (Figura 16) que a zona de células T associada com DC plasmocitóides em órgãos linfóides periféricos também pode ser discriminada de outras populações de DC associadas a tecido linfóide, tais como DC do centro germinal, DC interdigitantes e DC foliculares, com base na expressão de BDCA-2 e BDCA-4.
Ao contrário do BDCA-2, o BDCA-4 também é expresso em várias populações de DC diferenciadas in vitro: (1) ao contrário de BDCA-2, o BDCA-4 é expresso quer em Mo-Dc, quer CD34-DC; (2) enquanto que a expressão de BDCA-2 é completamente sub-regulada em DC plasmocitóides, uma vez que sofreram maturação mediada por IL-3 em cultura, a expressão de BDCA-4 é de facto supra-regulada em DC plasmocitóides cultivados; e (3) ao contrário do BDCA-2, o BDCA-4 é expresso no espaço de 12 h por uma maioria de DC CDllc+ em cultura, não sendo claro se isso é apenas verdade para a população CDlc+CDllcbright maior ou se é também verdade para a população CDlc~CDllCdimCDl23” menor. A constatação de que nenhumas outras células BDCA-4+ para além das DC plasmocitóides estão presentes em sangue humano não cultivado indica, de facto, que não estão presentes no sangue equivalentes das populações de DC BDCA-4+ diferenciadas in vitro acima mencionadas. A reticulação de BDCA-2 por meio de mAc anti-BCDA-2 induz a internalização rápida do complexo antigénio-Ac. Em analogia com outros receptores endociticos em DC que são sub-regulados aquando da maturação, tal como a langerina. Valladeau et ai. (2000) Immunity 12:71-81. Deste modo, o BDCA-2 pode ser um receptor com função de captura de antigénios. O BDCA-2 é uma lectina do tipo C, é rapidamente internalizada após ligação (Figura 8) e os ligandos BDCA-2 são processados e apresentados a células T (Figura 15) . Assim, tal como o DEC-205, o BDCA-2 tem uma incorporação de antigénios e função de apresentação para ligandos de células T. A expressão de BDCA-3 é restrita a uma pequena população de DC CDlc”CDllcdimCDl23” em sangue humano não cultivado. Em relação ao fenótipo, morfologia, capacidade endocitica e requisitos de maturação, esta população de DC é bastante 28 ΕΡ 1 301 539 /PT semelhante à população de DC CDlc+CDllcbrightCDl23dim. No entanto, além da própria expressão de BDCA-3 e CDlc a análise imunofenotípica revelou algumas diferenças marcantes: ao contrário das BDC CDlc+, as bdc bdca-3+ não expressam os receptores de Fc CD32, CD64 e EcORI e não expressam CD2. A ausência de expressão de receptor de Fc indica que as BDC BDCA-3+, ao contrário das BDC CDlc+, não têm a capacidade de incorporação de antigénios mediada por Ig. Fanger et al. (1996) J. Immunol. 157:541-548; Fanger et al. (1997) J. Immunol. 158:3090-3098; e Maurer et al. (1996) J. Immunol. 157:607-616. Como se pode ver aqui, o BDCA-3 é uma proteína de 100 kD. Há evidências de que as DC CDlc+CDllcbright, ao contrário das DC CDlcCDllcdim, têm a capacidade de adquirir características de células de Langerhans (expressão do antigénio Lag, E-caderina e Langerina e presença de grânulos de Birbeck) quando cultivadas com GM-CSF, IL-4 e TGF-βΙ. Se as DC BDCA-3+ e DC CDlc+ representam fases de maturação do mesmo tipo de célula, isto iria indicar que as DC BDCA-3+ ou já perderam ou ainda não adquiriram a capacidade de se diferenciar em células de Langerhans.
Em contradição com os resultados aqui apresentados, Ito et al. (1999) referiram que as DC CDlc+CDllcbright ao contrário das DC CDlc~CDllcdim expressam CDla. Utilizaram dois mAc BL-6 e B-B5 para coloração de CDla e observaram efectivamente uma diferença na intensidade de coloração quando se compararam os dois mAc (a coloração com B-B5 era provavelmente mais clara). Como se mostra aqui, a coloração de DC era claramente negativa utilizando títulos óptimos de mAc CDla BL-6 e HI149, mas positiva utilizando B-B5. Além disso, ο B-B5, ao contrário de BL-6 e HI149, corou uma proporção elevada de células B CD19 + no sangue. Assim, o padrão de coloração de B-B era bastante reminescente de um mAc CDlc em vez de um mAc CDla e, de facto, o mAc CDlc AD5-8E7 inibe a ligação de B-B5 a células MOLT-4. Deste modo, concluímos que o B-5 reconhece CDlc e que as DC CDlc+ não expressam CDla. A coloração de DC CDlc+ para CDlc, CD2 e CD14 revelou que uma proporção menor de DC expressa CD14 a um grau variável e que o nível de CDlc, bem como a expressão de CD2 nestas 29
ΕΡ 1 301 539 /PT células é inversamente proporcional ao nível de expressão de CD14. Esta observação está de acordo com um modelo de diferenciação linear em que as DC CDlc+CD2+CDllcbrightCDl4~ são a progénie de monócitos CDl4+CDlc“CD2~, em vez da progénie de um precursor comum de ambos os tipos de células. Este conceito também é suportado pela observação de que uma proporção considerável de monócitos CD14+ já expressa níveis muito baixos de CD2 e têm a capacidade de se diferenciar rapidamente em DC maduras com uma morfologia dendrítica típica e função estimuladora de células T potente quando cultivados com GM-CSF e IL-4. Crawford et al. (1999) J. Immunol. 163:5920-5928. A utilização do mAc BDCA-2 proporciona um meio conveniente e eficaz para detectar, enumerar e isolar rapidamente populações de DC a partir de PBMC, material de leucoferese, sangue total, amígdalas, etc., sem perturbação funcional aparente. Esta é uma boa ajuda para a sua posterior caracterização funcional e molecular e pode ser útil para elucidar as suas inter-relações. Além disso, a capacidade de isolar facilmente populações de DC até à homogeneidade facilita bastante a sua utilização clínica. Os fragmentos de ligação ao antigénio também são úteis par detectar, enumerar e/ou isolar DC a partir de tecidos, quer tecidos não hematopoiéticos (incluindo, sem limitação, epitélios das vias superiores, pele, intestino, pulmão e fígado), quer tecidos hematopoiéticos (incluindo, sem limitação, amígdalas, baço, nódulo linfático e timo).
Os hibridomas que segregam os anticorpos também estão incluídos na invenção, assim como outras células que expressam seus fragmentos de ligação ao antigénio. Também estão incluídos na invenção quaisquer fragmentos de ligação ao antigénio que reconhecem especificamente BDCA-2. Como se pode ver pela Tabela 1 e nos Exemplos aqui proporcionados, podem-se produzir vários tipos de mAc que reconhecem especificamente estes antigénios. Como também se pode ver a partir dos resultados aqui apresentados, não é necessário que os fragmentos de ligação ao antigénio reconheçam o mesmo epítopo no mesmo antigénio. Todos estes fragmentos de ligação ao antigénio e suas composições estão incluídos na invenção. 30
ΕΡ 1 301 539 /PT Ο termo "fragmento de ligação ao antigénio" inclui qualquer porção que se liga preferencialmente a uma DC ou uma sua subpopulação. Porções adequadas incluem, sem limitação, oligonucleótidos conhecidos como aptómeros que se ligam a moléculas alvo desejadas (Hermann e Pantel (2000) Science 289:820-825), hidratos de carbono, lectinas, fragmentos de Ig tais como Fab, F(ab')2/ Fab', scFv (quer formas monoméricas, quer poliméricas) e cadeias H e L isoladas. Um fragmento de ligação o antigénio retém a especificidade da ig intacta, embora a avidez e/ou afinidade possam estar alteradas.
Alguns compostos, composições e métodos aqui descritos referem-se em geral a anticorpos e seus derivados que uma vez proporcionados os determinantes antigénicos podem ser produzidos de forma rotineira por técnicas convencionais de imunoquimica. Estes incluem, mas não se limitam a, fragmentos de ligação ao antigénio acoplados a outro composto, e.g., por conjugação química, ou associados com ele por mistura com um excipiente ou adjuvante. Os parceiros de conjugação específicos e métodos para os produzir estão aqui descritos e são conhecidos na arte.
Os fragmentos de ligação ao antigénio (também incluindo os seus "derivados") são tipicamente produzidos por manipulação genética, embora possam ser obtidos alternativamente por outros métodos e combinações de métodos. Esta classificação inclui, mas não se limita a fragmentos de péptidos manipulados e péptidos de fusão. Os compostos preferidos incluem fragmentos de polipéptido contendo os CDR anti-DC, proteínas de fusão de anticorpos contendo componentes efectores de citóquinas, proteínas de fusão de anticorpos contendo adjuvantes ou drogas, proteínas de fusão de anticorpos contendo antigénios derivados de células de tumor, antigénios virais, antigénios bacterianos, antigénios de parasitas, antigénios de levedura, auto-antigénios ou péptidos antigénicos (epítopos de células T) seus derivados e proteínas da região V de cadeia simples. Os fragmentos de ligação ao antigénio são considerados de origem humana se são isolados a partir de uma fonte humana e utilizados directamente ou clonados e expressos noutros tipos de células e seus derivados, ou cromossomas humano totais ou suas porções (tais 31
ΕΡ 1 301 539 /PT como ratinhos com cromossomas humanos que codificam para segmentos de gene VH, DH, Jh, Vl, JLl, Ch, Cl) .
Um "polipéptido de fusão" é um polipéptido que compreende regiões de péptido contíguas numa posição diferente da que seria encontrada na natureza. As regiões podem existir normalmente em proteínas separadas e são reunidas nos polipéptidos de fusão; eles podem existir normalmente na mesma proteína, mas são colocados num novo arranjo no polipéptido de fusão; ou podem ser organizados sinteticamente. Por exemplo, a invenção inclui proteínas recombinantes (e os polinucleótidos que codificam para as proteínas ou seus complementares) que são constituídos por uma porção funcional de um fragmento de ligação ao antigénio e outro péptido, tal como uma toxina. Os métodos para produzir estas proteínas de fusão são conhecidos na arte e estão descritos, por exemplo, em WO 93/07286.
Um "fragmento funcionalmente equivalente" de um polipéptido varia em relação à sequência nativa por qualquer combinação de adições, eliminações ou substituições, preservando ao mesmo tempo pelo menos uma propriedade funcional do fragmento relevante no contexto em que é utilizado.
Os fragmentos de ligação ao antigénio são úteis na paliação de condições clínicas relacionadas com distúrbios imunológicos. A invenção compreende também derivados polipeptídicos dos fragmentos de ligação ao antigénio e métodos para utilizar estas composições no diagnóstico, tratamento e fabrico de novos reagentes. A invenção também inclui fragmentos de ligação ao antigénio conjugados com uma porção quimicamente funcional. Tipicamente, a porção é um marcador capaz de produzir um sinal detectável. Estes fragmentos de ligação ao antigénio conjugados são úteis, por exemplo, em sistemas de detecção, tais como a quantificação de DC em vários tecidos, em várias doenças, após transplante de células estaminais, e após terapia imunoablativa, tal como quimioterapia e radiação e imagiologia de DC, por exemplo para seguir a quimioterapia ou terapia auto-imune. Estes marcadores são conhecidos na arte e incluem, mas não se limitam a radio-isótopos, enzimas, 32
ΕΡ 1 301 539 /PT compostos fluorescentes, compostos quimiluminescentes, compostos bioluminescentes, co-factores de substractos e inibidores e partículas magnéticas. Para exemplos de patentes que ensinam a utilização destes marcadores, veja-se, por exemplo, as patentes US Nos 3817837; 3850752; 3939350; 3996345; 4277437; 4275149 4366241. As porções podem ser ligadas de forma covalente, ligadas de forma recombinante ou conjugadas (de forma covalente ou não covalente) através de um reagente secundário, tal como um anticorpo secundário, proteína A, ou um complexo de biotina-avidina.
Outras porções funcionais incluem, sem limitação, péptidos de sinal, agentes que aumentam a reactividade imunológica, agentes que facilitam o acoplamento a um suporte sólido, transportadores de vacinas, modificadores de biorrespostas, marcadores paramagnéticos e drogas. Os péptidos de sinal incluem formas procariotas e eucariotas. Os agentes que aumentam a reactividade imunológica incluem, mas não se limitam a, super-antigénios bacterianos e adjuvantes. Os agentes que facilitam o acoplamento a um suporte sólido incluem, mas não se limitam a, biotina, avidina ou seus derivados. Os transportadores de imunogénios incluem, mas não se limitam a, qualquer tampão fisiologicamente aceitável. Os modificadores de biorresposta incluem, mas não se limitam a citóquinas, em particular factor de necrose de tumor (TNF), IL-2, interleucina-4 (IL-4), GM-CSF; IL-10, IL-12, TGF-β e alguns interferões e quimioquinas (ΜΐΡ-3β, SDF-1, linfotactina, DC-CKl, Eotaxinas, IP-10, TARC, Rantes, MIP-lx, MIP-1B, SLC, 1-TAC, MIG, MDC, MCP-1, TCA-3, MCP-2, -3, -1.
Veja-se também a patente US 5750119; e as publicações de patente WO: 96/10411; 98/34641; 98/23735; 98/34642; 97/10000; 97/10001; e 97/06821. Estas quimioquinas podem ser úteis para atrair outras células, tais como células T.
Um "péptido de sinal" ou "sequência de comando" é uma sequência de aminoácidos curta que dirige uma proteína sintetizada de novo através de uma membrana celular, normalmente o retículo endoplasmático (RE) em células eucarióticas e, ou a membrana interna, ou ambas a membrana interna e externa de bactérias. Os péptidos de sinal estão tipicamente no terminal-N de um polipéptido e são removidos enzimaticamente entre a biossíntese e secreção do polipéptido 33
ΕΡ 1 301 539 /PT a partir de uma célula ou através da membrana do RE. Assim, o péptido de sinal não está presente na proteína segregada, mas está presente apenas durante a produção de proteínas.
As imunotoxinas, incluindo conjugados de cadeia simples, podem ser produzidas por meios recombinantes. A produção de várias imunotoxinas é bem conhecida na arte e podem-se encontrar métodos, por exemplo, em "Monoclonal Antibody-toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet," Thorpe et al. (1982) Monoclonal Antibodies in Clinicai Medicine, Academic Press, pp. 168-190; Vitatta (1987) Science 238:1098-1104; e Winter e Milstein (1991) Nature 349:293-299. As toxinas adequadas incluem, mas não se limitam a, ricina, radionuclidos, proteína antiviral de tintureira, exotoxina A de Pseudomonas, toxina de difteria, cadeia A de ricina, toxinas fúngicas, tais como proteínas inactivadoras de ribossomas fúngicas, tais como as enzimas gelonina, restrictocina e fosfolipase. Veja-se, em geral, "Chimeric Toxins," Olsnes e Pihl, Pharmac. Ther. 15:355-381 (1981); e "Monoclonal Antibodies for Câncer
Detection and Therapy," eds. Baldwin e Byers, pp. 159-179, 224-266, Academic Press (1985) .
As porções quimicamente funcionais podem ser produzidas de forma recombinante, por exemplo criando um gene de fusão que codifica para o fragmento de ligação ao antigénio e regiões funcionais de outros genes (e.g. enzimas). No caso de fusões de genes, os dois componentes estão presentes no mesmo gene. Alternativamente, os fragmentos de ligação ao antigénio podem ser quimicamente ligados à porção por qualquer um de uma variedade de procedimentos químicos bem conhecidos. Por exemplo, quando a porção é uma proteína, a ligação pode ser feita por meio de agentes de reticulação homo-, ou heterobifuncionais, e.g., SPDP, SMCC, carbodiimida gluteraldeído, ou semelhantes. As porções podem ser ligadas de forma covalente, ou conjugadas através de um reagente secundário, incluindo, mas não se limitando a um anticorpo secundário, proteína A ou um complexo de biotina-avidina. As porções paramagnéticas e a sua conjugação a anticorpos são bem conhecidas na arte. Veja-se, e.g., Miltenyi et al. (1990) Cytometry 11:231-238. 34
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Aqui, ultrapassamos os problemas descritos na arte (0'Doherty et al. (1993); e Yamaguchi et al. (1995)) com um procedimento de imunização da almofada da pata contralateral descrito recentemente. Yin et al. (1997) Blood 90:5002-5012. Este sistema utiliza células T e B especificas para o antigénio, não previamente estimuladas que recirculam continuamente entre órgãos linfóides periféricos, desde que não encontrem antigénio, mas ficam imediatamente retidas num órgão linfóide periférico durante vários dias, senão semanas, uma vez tendo sido activadas pelo antigénio. Picker et al. (1992) Annu. Rev. Immunol. 10:561-591; Butcher et al. (1996) Science 272:60-66; Bradley et al. (1996) Curr. Opin. Immunol. 8:312:320; Watson et al. (1998) Cell. Adhes. Commun. 6:105-110; Kearney et al. (1994) Immunity 1:327-339; Jacob et al. (1992) J. Exp. Med. 176:679-687; Ridderstaad et al. (1998) J. Immunol. 160:4688-4695; e Tarlinton (1998) Curr. Opin. Immunol. 10:245-251. Nos exemplos aqui proporcionados, as almofadas das patas da esquerda dos ratinhos foram injectadas nos dias -3, 0, 4, 7, 11, e 14 com células de linfoblastoma B Bristol-8, enquanto que as almofadas das patas da direita foram injectadas com DC nos dias 0, 4, 7, 11 e 14. As células B e T não previamente estimuladas, com especificidade para antigénios partilhados, e.g. moléculas HLA de classe II, deverão ser activadas pelas células Bristol-8 entre os dias -3 e 0 no nódulo linfático popliteal esquerdo e ficam assim ai retidas, enquanto que todos os linfócitos com especificidade para antigénios únicos das DC deverão permanecer disponíveis para activação após o dia 0 no nódulo linfático popliteal direito.
Esta técnica de imunização foi combinada com um procedimento poderoso para o isolamento rápido de grandes quantidades de DC e permitiu a produção de um painel de mAc que reconhecem três antigénios de DC novos: BDCA-2, BDCA-3 e BDCA-4. A utilização de antigénios na produção de anticorpos específicos de DC adicionais permite que sejam utilizados métodos mais tradicionais de produção de anticorpos com uma maior probabilidade de sucesso.
Os métodos para a produção e isolamento de anticorpos são bem conhecidos na arte. Veja-se, por exemplo, Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 35
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Laboratory, New York. Os métodos gerais de purificação de anticorpos incluem, mas não se limitam a, precipitação com sal (por exemplo com sulfato de amónio); cromatografia de troca iónica (por exemplo, num coluna de troca catiónica ou aniónica corrida a um pH neutro e eluida com gradientes faseados de força iónica crescente); cromatografia de filtração em gel (incluindo HPLC de filtração em gel) e cromatografia em resinas de afinidade, tais como proteína A, proteína G, hidroxiapatite ou anti-lg. Os fragmentos de ligação ao antigénio podem também ser purificados em colunas de afinidade compreendendo DC ou uma sua porção antigénica. De preferência, os fragmentos são purificados utilizando cromatografia em proteína-A-CL-Sepharose™ 4B seguida de cromatografia numa coluna de troca iónica DEAE-Sepharose™ 4B. A invenção também inclui anticorpos híbridos em que um par de cadeias H e L é obtido a partir de um primeiro anticorpo, enquanto que o outro par de cadeias H e L é obtido a partir de um segundo anticorpo diferente. Para os fins da presente invenção, um par de cadeias L e H é do anticorpo anti-DC. Num exemplo, cada par de cadeias L-H liga-se a epítopos diferentes de um antigénio específico de DC. Estes híbridos também podem ser formados utilizando cadeias H ou L humanizadas. A invenção também inclui outros anticorpos biespecíficos, tais como o que contêm dois anticorpos separados, ligados de forma covalente através das suas regiões constantes.
Outros fragmentos de ligação ao antigénio incluídos na presente invenção são anticorpos em que a cadeia H ou L foi modificada para se obterem propriedades adicionais. Por exemplo, uma alteração na sequência de aminoácidos pode resultar numa imunogenicidade reduzida do polipéptido resultante. As alterações variam desde alterar um ou mais resíduos de aminoácido até à reconstrução completa de uma região, tal como um domínio de região C. As alterações típicas incluem, mas não se limitam às relacionadas com a fixação do complemento, interacção com receptores de membrana e outras funções efectoras. Pode também conceber-se um anticorpo recombinante para auxiliar o fornecimento específico de uma substância (tal como uma citóquina) a uma célula. Também se 36
ΕΡ 1 301 539 /PT incluem na invenção péptidos em que vários domínios Ig foram colocados numa ordem diferente da que ocupam na natureza. O tamanho dos fragmentos de ligação ao antigénio pode ser apenas o tamanho mínimo necessário para se obter a função desejada. Pode opcionalmente compreender sequências de aminoácido adicionais, quer nativas em relação ao fragmento de ligação ao antigénio, quer de uma fonte heteróloga, como desejado. Os fragmentos de ligação ao antigénio anti-DC podem conter apenas 5 resíduos de aminoácido consecutivos de uma região V do anticorpo. Os polipéptidos que compreendem 7 : resíduos de aminoácido, mais preferencialmente cerca de 10 resíduos de aminoácido, mais preferencialmente cerca de 15 resíduos de aminoácido, mais preferencialmente cerca de 25 resíduos de aminoácido, mais preferencialmente cerca de 50 resíduos de aminoácido, mais preferencialmente cerca de 75 resíduos de aminoácido da região V da cadeia L ou H do anticorpo, também estão incluídos. São ainda mais preferidos os polipéptidos que compreendem toda a região v da cadeia L ou H de anticorpo.
As substituições podem ir desde alterações ou modificações de um ou mais resíduos de aminoácido até à reconstrução completa de uma região, tal como a região V. As substituições de resíduos de aminoácido, se existentes, são de preferência substituições conservativas que não afectam de forma prejudicial o enrolamento ou propriedades funcionais do péptido. Grupos de resíduos de aminoácido relacionados funcionalmente entre os quais se podem fazer substituições conservativas são glicina/valina; valina/isoleucina/leucina; asparagina/glutamina; ácido aspártico/ácido glutâmico; serina/ treonina/metionina; lisina/arginina e fenilalanina/tirosina/ triptofano. Fragmentos de ligação ao antigénio podem ser glicosilados ou não glicosilados, podem ser modificados pós-tradução (e.g., acetilação e fosforilação), ou podem ser modificados sinteticamente (e.g. ligação de um grupo marcador).
Podem-se formar derivados de polipéptido compreendendo quer uma cadeia L, quer uma cadeia H como cadeias L e H separadas e em seguida reorganizadas, ou reorganizadas in situ por um sistema de expressão para ambas as cadeias. Estes 37
ΕΡ 1 301 539 /PT sistemas de expressão podem ser criados transfectando com um plasmideo que compreende regiões que podem ser transcritas, separadas, para a cadeia L e H, ou co-transfectando a mesma célula com plasmideos para cada cadeia. Num terceiro método, um plasmideo adequado com uma região que codifica para a cadeia H é transfectado num mutante de perda da cadeia H.
Os mutantes de perda da cadeia H podem ser obtidos tratando células que produzem anticorpos anti-DC com anticorpo de coelho anti-IgG de ratinho marcado por fluoresceina (especifico da cadeia H, DAKO Corporation, Carpinteria, CA) de acordo com as instruções do fornecedor. As populações de células coradas e não coradas são analisadas por citometria de fluxo. As células não coradas são recolhidas num tubo esterilizado e colocadas em placas de 96 poços a 1 célula/poço, por diluição limitante. Os sobrenadantes de cultura são então testados por ELISA utilizando anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho (específico da cadeia H) e anticorpo de cabra anti-capa de ratinho. Os clones que têm um fenótipo capa-positivo, IgG-negativo são subclonados pelo menos 3 vezes para se obterem mutantes anti-DC(_H) estáveis. O ARNm para mutantes de perda de cadeia H putativos podem ser isolados e a sequência do ADNc da região V de cadeia L determinada. Faz-se PCR inversa do ARNm para VH com 2 conjuntos de iniciadores 5' e 3' e utiliza-se para clonagem de ADNc anti-DC(_H). Um mutante de perda de cadeia H não origina nenhuma banda de ADN detectável com estes iniciadores. A transfecção das células prossegue com um plasmideo de cadeia H adequado.
Outro derivado do fragmento de ligação ao antigénio abrangido pela presente invenção é um anticorpo em que a região constante da cadeia H ou L foi modificada para se obterem propriedades adicionais. Por exemplo, uma alteração na sequência de aminoácidos pode resultar numa imunogenicidade alterada do polipéptido resultante. As alterações vão desde um ou mais resíduos de aminoácido até à reconstrução completa do domínio da região constante. As alterações contempladas afectam a fixação do complemento, interacção com receptores de membrana e outras funções efectoras. Também se pode conceber um anticorpo recombinante para auxiliar no fornecimento específico de uma substância (tal como uma linfoquina ou um 38
ΕΡ 1 301 539 /PT antigénio, ou um péptido antigénico derivado de um tumor, vírus, parasita ou bactéria, ou tolerogénio (auto-antigénio)) a uma célula. Também se incluem na invenção proteínas em que foram colocados vários domínios Ig numa ordem diferente daquela que ocorre na natureza. A invenção também inclui fragmentos da região V de cadeia simples ("scFv") de anticorpos anti-DC. Os fragmentos da região v de cadeia simples são produzidos ligando regiões v de cadeia L e/ou H utilizando um péptido de ligação pequeno. Bird et al. (1988) Science 242:423-426. Pode-se utilizar qualquer péptido com flexibilidade e comprimento suficientes como ligante num scFv. Normalmente o ligante é seleccionado para ter pouca ou nenhuma imunogenicidade. Um exemplo de péptido ligante é (GGGGS)3, que faz uma ponte de aproximadamente 3,5 nm entre o terminal carboxilo de uma região V e o terminal amino de outra região V. Também se podem utilizar outras regiões ligantes e estas podem proporcionar funções adicionais, tais como para ligação a uma droga ou suporte sólido, ou para o fornecimento específico de uma substância (tal como uma linfoquina ou um péptido antigénico derivado de um tumor, vírus, parasita ou bactéria, ou tolerogénio (auto-antigénio)) a uma célula.
Toda ou qualquer porção da cadeia H ou L pode ser utilizada em qualquer combinação. Tipicamente, as regiões V completas estão incluídas no scFv. Por exemplo, a região V da cadeia L pode ser ligada à região V da cadeia H. Alternativamente, uma porção da região V da cadeia L pode ser ligada à região V da cadeia H, ou uma sua porção. Também se contemplam scFv em que a região V da cadeia H é de um anticorpo aqui descrito e a região V da cadeia L é de outra Ig. Pode-se produzir um scFv bifásico em que um componente é um fragmento de ligação ao antigénio e outro componente é um polipéptido diferente, tal como um epítopo de células T.
Os scFv podem ser organizados por qualquer ordem, por exemplo, VH-(ligante)-VL ou VL-(ligante)-VH. Pode haver uma diferença no nível de expressão destas duas configurações em sistemas de expressão particulares, caso em que uma destas formas pode ser preferida. Também se podem produzir scFv organizados uns a seguir aos outros, tais como (X)-(ligante)- 39
ΕΡ 1 301 539 /PT (X) - (ligante) - (X), em que X são scFv ou suas combinações com outros polipéptidos. Noutra concretização, os polipéptidos de anticorpo de cadeia simples não têm polipéptido ligante, ou apenas um ligante inflexível, curto. As configurações possíveis são VL-VH e VH-VL. A ligação é demasiado curta para permitir a interacção entre VL e VH dentro da cadeia e as cadeias formam homodímeros com um local de ligação ao antigénio VL/VH em cada extremidade. Estas moléculas são designadas por "diacorpos."
Os scFv podem ser produzidos de forma recombinante ou sintética. Para produção sintética de scFv pode-se utilizar um sintetizador automático. Para a produção recombinante de scFv pode-se introduzir um polinucleótido contendo um plasmídeo adequado que codifica para o scFv numa célula hospedeira adequada, quer células eucarióticas, tais como células de levedura, planta, insecto ou mamífero, ou células procarióticas, tais como Escherichia coli e a proteína expressa pode ser isolada utilizando técnicas convencionais de purificação de proteínas. Os scFv também podem ser obtidos a partir de uma biblioteca de apresentação em fagos.
Um sistema particularmente útil para a produção de scFv é o plasmídeo pET-22b( + ) (Novagen, Madison, wi) . A Escherichia coli pET-22b(+) contém um domínio de ligação ao ião níquel que consiste de 6 resíduos de histidina sequenciais, o que permite que a proteína expressa seja purificada numa resina de afinidade adequada. Outro exemplo de um vector adequado é pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA).
As condições de expressão de genes asseguram de preferência que o scFv assume uma estrutura terciária óptima. Dependendo do plasmídeo utilizado (em especial actividade promotora) e da célula hospedeira, poderá ser necessário modular a taxa de produção. Por exemplo, a utilização de um promotor mais fraco ou a expressão a temperaturas mais baixas pode ser necessária para optimizar a produção de scFv enrolado de forma adequada em sistemas procarióticos, ou ele pode ser utilizado para expressar scFv em células eucarióticas. A invenção também inclui formas poliméricas de fragmentos de ligação ao antigénio contendo vários fragmentos de ligação 40
ΕΡ 1 301 539 /PT ao antigénio específico de DC. Uma concretização é um polímero linear de fragmentos de ligação ao antigénio, opcionalmente conjugado ao transportador. Estes polímeros lineares podem compreender cópias múltiplas de um único polipéptido fragmento de ligação ao antigénio, ou combinações de diferentes polipéptidos e podem ter polipéptidos organizados uns a seguir aos outros, ou polipéptidos separados por outras sequências de aminoácidos.
Outra concretização refere-se a péptidos antigénicos múltiplos (MAP). Os MAP têm um núcleo inerte imunologicamente pequeno com dendrites de lisina radialmente ramificadas nas quais estão ligados de forma covalente vários polipéptidos fragmentos de ligação ao antigénio. Veja-se, por exemplo, Posnett et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:1719-1725; e Tam (1989) Met. Enz. 168:7-15. O resultado é uma macromolécula grande que tem uma razão molar elevada entre polipéptidos fragmento de ligação ao antigénio e núcleo. Os MAP são imunogénios eficazes e antigénios úteis para imunoensaios. O núcleo para criar MAP pode ser produzido por técnicas convencionais de síntese de péptidos, ou obtido comercialmente (Quality Controlled Biochemicals, Inc., Hopkinton, MA). Uma matriz nuclear típica é constituída por três níveis de lisina e oito resíduos de aminoácidos. A invenção inclui também fragmentos de ligação ao antigénio anti-idiotípicos para os fragmentos de ligação ao antigénio específicos para DC. Estes anti-idiotipos podem ser produzidos por qualquer métodos conhecido na arte.
Os pacientes de cancro são muitas vezes imunossuprimidos e tolerantes em relação a alguns antigénios associados a tumores (TAA). Desencadear uma resposta imunitária contra estes TAA representa um desafio importante na terapia do cancro. A imunização com um determinado antigénio origina uma resposta imunitária que inclui uma resposta de CTL, de preferência uma resposta de CTL forte. A produção de anticorpos contra o antigénio pode ser útil se as células de tumor são mortas por ADCC (citotoxicidade celular dependente de anticorpos). A invenção inclui a utilização de DC identificadas e isoladas utilizando fragmentos de ligação ao antigénio da invenção na indução de respostas imunitárias 41
ΕΡ 1 301 539 /PT específicas por métodos conhecidos na arte. As respostas imunitárias podem ser específicas para qualquer antigénio, incluindo, sem limitação, as que estão associadas com cancro, vírus infecciosos, bactérias infecciosas, parasitas infecciosos, leveduras infecciosas e doenças auto-imunes (que induzem tolerância). A capacidade de isolar subpopulações que são unicamente adequadas para induzir uma resposta deste tipo resulta em preparações de DC que são mais eficazes do que misturas de subpopulações. Também se podem utilizar células híbridas (e.g. DC/célula de tumor) como terapia específica de cancro. As células modificadas (incluindo, sem limitação, activadas, amadurecidas in vitro, moduladas em relação à sua capacidade de polarização de células T ajudantes (Thl v Th2 v Th3/Th-R) e moduladas em relação à sua capacidade de estimular, ou anergizar, ou eliminar células T) são igualmente contempladas pela invenção e incluem, mas não se limitam a, células geneticamente modificadas ou transfectadas e células que foram incubadas com péptidos ou proteínas adequados para apresentação de antigénios, ou para internalização. As subpopulações incluem, sem limitação, uma fase de diferenciação particular dentro de uma linhagem e uma linhagem de diferenciação separada. A invenção proporciona também DC, suas subpopulações e suas misturas. As células são seleccionadas utilizando os fragmentos de ligação ao antigénio aqui proporcionados por qualquer método de separação conhecido na arte. As composições que compreendem as células isoladas também são abrangidas pela invenção. Estas incluem composições farmacêuticas e terapêuticas e qualquer outra composição contendo as células isoladas. As subpopulações de DC isoladas pelos métodos descritos aqui são de preferência substancialmente homogéneas. Isto é, as células isoladas por fragmentos de ligação ao antigénio específicos de BDCA são de preferência mais do que cerca de 80% BDCA+, mais preferencialmente mais do que cerca de 90% BDCA+ e muito preferencialmente mais do que cerca de 95% BDCA+. Obviamente, as combinações subsequentes das células com outras DC, ou outras células hematopoiéticas podem diminuir a percentagem de células BDCA+, estando estas combinações também incluídas na invenção. 42
ΕΡ 1 301 539 /PT
De igual modo, as DC obtidas pelos métodos aqui descritos são adequadas para utilização em qualquer método de tratamento conhecido na arte, incluindo as referências aqui. As DC alteradas para se obterem estes métodos também são abrangidas pela invenção. Estes métodos incluem, mas não se limitam a: a) terapia com DC isoladas para induzir tolerância de células T especificas (morte ou anergia em vez de estimulação) em doenças auto-imunes, alergias, doença de enxerto versus hospedeiro, rejeição de aloenxerto. Por exemplo, as DC especificas para estas células T podem ser modificadas de forma a conter porções de lise, inactivação ou indução de morte, de modo a se dirigirem especificamente para as células T envolvidas na resposta imunitária indesejada, por exemplo por marcação do antigénio ou modificação genética, tal como por transfecção de CD95L. A especificidade das DC para células T é essencialmente causada por apresentação dos epitopos de células T adequados (péptidos) através de MHC I e II. Os subconjuntos particulares de DC com funções de indução de tolerância podem ser administrados directamente ao paciente. A tolerância periférica pode ser mediada por DC modificadas para induzir eliminação (morte), anergia e supressão/regulação de células T; b) terapia de imunomodulação com DC isoladas para induzir perfis de expressão de citóquinas particulares em células T especificas. Isto é particularmente útil para influenciar a produção de citóquinas Thl (citóquinas para respostas imunitárias inflamatórias especificas), Th2 (citóquinas para respostas imunitárias humorais especificas) ou Th3 (citóquinas para imunossupressão especifica). No caso de alergias e asma, por exemplo, a indução de uma resposta de Thl pode reduzir ou eliminar a resposta de Th2 que produz sintomas; c) terapia com DC que apresentam antigénios incluindo, mas não se limitando a, antigénios de tumor, antigénios virais e antigénios celulares; d) terapia com DC (com ou sem apresentação de antigénios) e vários co-factores, incluindo, mas não se limitando a citóquinas, moléculas co-estimuladoras e moléculas efectoras, em quantidades e sob condições suficientes para modular a resposta imunitária; e 43
ΕΡ 1 301 539 /PT e) estimular células T in vitro para obter células T especificas de antigénio.
Os fragmentos de ligação ao antigénio aqui descritos também são adequados para vários métodos de tratamento. Estes incluem, mas não se limitam a: a) anticorpos que mimetizam a imunoterapia de ligando ou mediada por ligando, por exemplo de DC envolvidas na auto-imunidade ou direccionamento in vivo de antigénios ou ácidos nucleicos (virus, ADN plasmídico, ARN, etc.) para DC, para incorporação/transfecção óptima e selectiva. O BDCA-2 pode ser particularmente útil neste contexto, uma vez que parece ser uma molécula com incorporação de antigénio e função de processamento; e b) imunomonitorização: e.g. enumeração e caracterização de DC BDCA-24, BDCA-3+ and BDCA-4+ em várias doenças e por mobilização, e.g., com um ligando indutor de proliferação, e.g. ligando flt3 ou G-CSF.
Pode-se utilizar para as DC qualquer transportador não prejudicial para o hospedeiro. Os transportadores adequados são tipicamente macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas, tais como proteínas; polissacáridos (tais como Sepharose funcionalizada com látex, agarose, celulose, pérolas de celulose e semelhantes); resíduos de aminoácido poliméricos (tais como poli(ácido glutâmico), polilisina e semelhantes); copolímeros de aminoácido e partículas de vírus inactivos ou bactérias atenuadas, tais como Samonella. 2. Métodos para obter fragmentos de ligação a antigénio específicos para DC adicionais A invenção inclui métodos para obter fragmentos de ligação a antigénio específicos de DC.
Os métodos para produzir novos fragmentos de ligação ao antigénio específicos para DC, como descrito em detalhe a seguir, incluem, mas não se limitam a: 1) utilização de técnicas de apresentação de fagos através das quais se amplificam preferencialmente ADNc que codificam para repertórios de anticorpos a partir de ARN de linfócito ou baço, utilizando PCR e iniciadores de oligonucleótidos 44
ΕΡ 1 301 539 /PT específicos para regiões V específicas da espécie; 2) imunização de mamíferos com o antigénio e produção de policlonais ou mAc e 3) utilização de apresentação em fagos para produzir anticorpos sem imunização prévia, apresentando em fagos repertórios muito grandes e diversos de genes V. Veja-se, em geral, Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnol. 4:1-20. De preferência, para fins terapêuticos, quando se pretendem utilizar fragmentos de ligação ao antigénio não humanos, estes podem ser humanizados por qualquer método conhecido na arte.
Pode-se utilizar o método descrito por Medez et al. (1997) Nature Genetics 18:410. Em resumo, utiliza-se antigénio purificado para imunizar ratinhos transgénicos que não possuem o repertório nativo de anticorpos de murídeo e, em vez disso, têm a maior parte dos genes V de anticorpo humano na configuração da linha germinativa. Os anticorpos humanos são subsequentemente produzidos pelas células B de murídeo. Os genes de anticorpo são recuperados das células B por selecção de biblioteca de PCR ou tecnologia clássica de hibridoma.
Alternativamente, os anticorpos podem ser obtidos a partir de ratinhos (tais como BALB/c) após injecção com antigénio específico para DC purificado. Os mAc são produzidos utilizando tecnologia de hibridoma convencional. Maiti et al. (1997) Biotechnol. Int. 1:85-93 (hibridomas humanos); e Kohler e Milstein (1975) Nature 256:495-497 (hibridomas de ratinho). Os anticorpos de murídeo podem ser subsequentemente humanizados, por exemplo, pelos métodos descritos por Rosok et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:22611-22618; Baca et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; Rader et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:8910-8915; e Winter e Milstein (1991) Nature 349:293-299.
Também se pode utilizar uma abordagem de apresentação em fagos para produzir rapidamente anticorpos humanos contra DC. Esta abordagem pode utilizar o método descrito por Henderikx et al. (1998) Câncer Res. 58:4324-32. Os fragmentos de anticorpo apresentados em fagos são seleccionados a partir de uma biblioteca grande de fago/fragmento de anticorpo não previamente estimulado contendo diferentes anticorpos de cadeia simples, separando os que se ligam ao antigénio 45
ΕΡ 1 301 539 /PT imobilizado ou DC. Os fragmentos de anticorpo humanos são seleccionados a partir de repertórios não previamente estimulados, construídos quer a partir de dominios V da linha germinativa, quer sintetizados com muitas mutações (as mutações são obtidas quer por reorganização de genes homólogos, quer PCR propensa a erro) quer nas regiões esqueleto, quer CDR. Os fragmentos de ligação ao antigénio especificamente reactivos com DC podem ser identificados pesquisando contra células de tumor e normais como descrito aqui, de modo a identificar fragmentos de ligação ao antigénio específicos de DC. A invenção também inclui métodos para identificar fragmentos de ligação ao antigénio específicos para uma DC, produzindo uma biblioteca de apresentação em fagos adequada; isolando antigénios específicos de DC; pesquisando a biblioteca de apresentação em fagos com os antigénios de acordo com técnicas imunoquimicas convencionais, para obter fagos que apresentam um fragmento de ligação ao antigénio que se liga especif icamente a DC; ou pesquisando a biblioteca de apresentação em fagos obtida para fragmentos de ligação ao antigénio específicos de DC pesquisando contra DC e outras células relacionadas, tais como APC, e seleccionando o fago que se liga preferencialmente às DC. Os métodos para produzir fragmentos de ligação ao antigénio por apresentação de fagos são bem conhecidos na arte. Hoogenboom et al. (1998).
Utiliza-se tipicamente ARN de linfócitos (PBL) ou baço
para produzir repertórios de fragmentos de anticorpo. A mutagénese utilizando reorganização homóloga ou PCR propensa a erro aumenta a diversidade. Pode-se utilizar qualquer método conhecido na arte.
Os repertórios de genes de anticorpo podem ser amplificados a partir de ratinhos imunizados ou humanos utilizando PCR e os fragmentos de anticorpo scFv ou Fab assim obtidos podem ser clonados e expressos na superfície de bacteriófagos. Os repertórios de genes de anticorpo são amplificados a partir de ARN de linfócito ou baço utilizando PCR e iniciadores de oligonucleótidos específicos para regiões V especificas para o animal hospedeiro. A apresentação em fagos também pode ser utilizada para produzir anticorpos 46
ΕΡ 1 301 539 /PT sem imunização prévia, apresentando repertórios de genes V muito grandes e diversos em fagos. Os repertórios de genes V naturais presentes em PBL são isolados por amplificação por PCR e as regiões vh e vl são reunidas por splicing aleatoriamente, utilizando PCR. As mutações podem ser direccionadas para os genes do dominio V por reorganização de genes homólogos ou PCR propensa a erro. Zhao et al. (1998) Nat. Bíotechnol. 15:258; e Hoogenboom et al. (1998). As bibliotecas humanas totalmente sintéticas também podem ser criadas e utilizadas para pesquisar fragmentos de anticorpo específicos para DC. Independentemente do método utilizado para operar a biblioteca de apresentação em fagos, cada fago resultante tem um fragmento de anticorpo funcional apresentado na sua superfície e contém o gene que codifica para o fragmento de anticorpo no genoma do fago. Veja-se e.q. WO 97/02342. A cromatografia de afinidade em que anticorpos de ligação podem ser subtraídos de anticorpos não ligantes foi estabelecida há algum tempo. Nissim et al. (1994) EMBO J. 13:692-698; e Vaughan et al. (1996) Nat. Bíotechnol. 14:309-314. Os parâmetros críticos que afectam o sucesso são o número e afinidade de fragmentos de anticorpo produzidos contra um antigénio particular. Até recentemente, a produção de bibliotecas grandes, diversas era algo difícil. Historicamente, os repertórios de scFv foram organizados directamente a partir de produtos de RT-PCR VH e vl. A disponibilidade de ARN e a eficácia da RT-PCR eram factores limitantes do número de genes V disponíveis. Além disso, a organização requeria ligar três destes fragmentos, nomeadamente VH e VL e as regiões ligantes. Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597.
Um método de construção de biblioteca melhorado utiliza repertórios de genes VH e VL clonados em vectores plasmídicos separados, para se obter um fornecimento de material estável e ilimitado para a organização de scFv. Sheets et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:6175-6162. Além disso, a eficácia é aumentada tendo ADN que codifica para a região ligante na extremidade 5' da biblioteca de VL. Deste modo, há apenas dois fragmentos a ser ligados, em vez de três. 47
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Os fragmentos de ligação ao antigénio anti-DC também podem ser derivados ou manipulados. Por exemplo, a actividade imunogénica das regiões V das cadeias L e H pode ser pesquisada preparando uma série de polipéptidos curtos que em conjunto abrangem toda a sequência de aminoácidos da região V. Utilizando uma série de polipéptidos de 20 ou 50 residuos de aminoácido de comprimento, cada região V pode ser analisada quanto a propriedades funcionais úteis. Também é possível realizar uma análise de computador de uma sequência de proteína para identificar polipéptidos potencialmente imunogénicos. Estes péptidos podem então ser sintetizados e testados. A invenção inclui também várias adaptações de fragmentos de ligação ao antigénio aqui descritos, combinados de vários modos para se obterem outros fragmentos de ligação ao antigénio anti-DC, com propriedades desejáveis. Por exemplo, nos MAP podem estar incluídos fragmentos de ligação ao antigénio com resíduos modificados. Noutro exemplo, um scFv é fundido com uma citóquina, tal como IL-2. Todas estas combinações estão incluídas na presente invenção.
Os fragmentos de ligação ao antigénio podem ser produzidos por qualquer procedimento adequado, incluindo proteólise, métodos recombinantes ou síntese química. Estes métodos são conhecidos na arte e não é necessário descrevê-los em detalhe. Exemplos de enzimas proteolíticas incluem, mas não se limitam a, tripsina, quimiotripsina, pepsina, papaína, protease V8, subtilisina, plasmina e trombina. Os fragmentos de ligação ao antigénio intactos podem ser incubados com uma ou mais proteases em simultâneo, ou sequencialmente.
Alternativamente, ou adicionalmente, o anticorpo intacto pode ser tratado com agentes redutores de dissulfureto. Os péptidos podem então ser separados uns dos outros por técnicas conhecidas na arte, incluindo, mas não se limitando a, cromatografia de filtração em gel, electroforese em gel e HPLC de fase inversa.
Os fragmentos de ligação ao antigénio anti-DC também podem ser produzidos por expressão a partir de um polinucleótido que codifica para o péptido, num sistema de expressão adequado, por qualquer método conhecido na arte. 48
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Tipicamente os polinucleótidos que codificam para um polipéptido adequado são ligados num vector de expressão sob o controlo de um promotor adequado e utilizados para alterar geneticamente a célula hospedeira pretendida. Podem-se utilizar quer sistemas hospedeiros eucarióticos, quer procarióticos. O polipéptido é então isolado a partir de células lisadas, ou do meio de cultura e purificado na extensão necessária para o seu uso pretendido. Exemplos de células hospedeiras procariotas adequadas para utilização na presente invenção incluem E. coli, Bacíllus subtilis e qualquer outra célula hospedeira adequada. Exemplos de células hospedeiras eucariotas incluem, mas não se limitam a, células de levedura, aves, insectos, plantas e animais, tais como células COS7, HeLa e CHO.
Opcionalmente, podem-se incluir canais ou pérolas revestidos com matriz e co-culturas de células para aumentar o crescimento das células que produzem fragmentos de ligação ao antigénio. Para a produção de grandes quantidades de mAc, é geralmente mais conveniente obter fluido de ascites. O método para produzir ascites compreende geralmente injectar células de hibridoma num mamífero histocompatível ou imunotolerante, não imunologicamente estimulado, em especial um ratinho. O mamífero pode ser estimulado a produzir ascites por administração prévia de uma composição adequada; e.g. Pristane. O fluido ascítico é removido do animal e processado para isolar os anticorpos.
Alternativamente, os fragmentos de ligação ao antigénio podem ser sintetizados quimicamente utilizando dados de sequência de aminoácidos e outra informação proporcionada nesta revelação, em conjunção com métodos convencionais de síntese de proteínas. Um método adequado é a técnica Merrifield de fase sólida. Os sintetizadores de péptidos automáticos estão disponíveis comercialmente, tais como os fabricados pela Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA).
Outro método para obter fragmentos de ligação ao antigénio anti-DC é imunizar animais hospedeiros adequados com BDCA-2, BDCA-3 e/ou BDCA-4 e seguir métodos convencionais para a produção e isolamento de anticorpos policlonais ou mAc. Os 49
ΕΡ 1 301 539 /PT mAc assim produzidos podem ser "humanizados" por métodos conhecidos na arte. A invenção abrange assim mAc humanizados.
Nos anticorpos "humanizados", pelo menos parte da sequência foi alterada a partir da sua forma inicial para a tornar mais semelhante às Ig humanas. Numa versão, as regiões de cadeia H e cadeia L são substituídas por uma sequência humana. Isto é um polipéptido de fusão compreendendo uma região v anti-DC e uma região Ig heteróloga (C). Noutra versão, as regiões CDR compreendem sequências de aminoácido anti-DC, enquanto que as regiões esqueleto V também foram convertidas em sequências humanas. Veja-se, por exemplo, EP0329400. Numa terceira versão, as regiões V são humanizadas concebendo sequências de consenso de regiões V humanas e de ratinho e convertendo resíduos fora das CDR que são diferentes entre as sequências de consenso.
Quando se produzem anticorpos humanizados, a escolha dos resíduos da sequência esqueleto pode ajudar a reter uma afinidade de ligação elevada. Em princípio, uma sequência esqueleto de qualquer anticorpo humano pode servir como modelo para o enxerto de CDR; no entanto, foi demonstrado que a substituição linear de CDR numa sequência esqueleto deste tipo pode levar a uma perda significativa da afinidade de ligação ao antigénio. Glaser et al. (1992) J. Immunol. 149:2606; Tempest et al. (1992) Biotechnol. 9:266; e Shalaby et al. (1992) j. Exp. Med. 17:217. Quanto mais homólogo for um anticorpo humano em relação ao anticorpo de murídeo original, menos provável é que a sequência esqueleto venha a introduzir distorções nas CDR de murídeo que poderão reduzir a afinidade. Com base numa pesquisa de homologia de sequência contra uma base de dados de sequências de anticorpo, o anticorpo humano IC4 tem uma boa homologia de sequência esqueleto com muM4TS.22, embora outros anticorpos humanos altamente homólogos também sejam adequados, em especial cadeias KL do subgrupo I humano ou cadeias H do subgrupo III humano. Kabat et al. (1987). Vários programas de computador, tais como ENCAD prevêem a sequência ideal para a região V. Levitt et al. (1983) J. Mol. Biol. 168:595. A invenção abrange assim anticorpos humanos com diferentes regiões V. Está dentro das capacidades de um perito na arte determinar sequências de região V adequadas e optimizar estas sequências. Os métodos 50
ΕΡ 1 301 539 /PT para obter anticorpos com imunogenicidade reduzida também estão descritos na patente US N.° 5270202 e EP 699755.
Nalgumas aplicações, tais como quando um fragmento de ligação ao antigénio ou DCA é expresso num meio de armazenamento adequado, tal como uma semente de planta, o fragmento de ligação ao antigénio pode ser armazenado sem purificação. Fiedler et al. (1995) Biotechnol. 13:1090-1093.
Para a maioria das aplicações, é geralmente preferível que o polipéptido seja pelo menos parcialmente purificado a partir de outros constituintes celulares. De preferência, o péptido é pelo menos cerca de 50% puro como uma percentagem em peso da proteína total. Mais preferencialmente, o péptido é pelo menos cerca de 50-75% puro. Para utilização clinica, o péptido é de preferência pelo menos cerca de 80% puro.
Se os péptidos são para ser administrados a um indivíduo, de preferência são pelo menos 80% puros, mais preferencialmente pelo menos 90% puros, ainda mais preferencialmente pelo menos 95% puros e isentos de pirogénio e outros contaminantes. Neste contexto, a percentagem de pureza é calculada como uma percentagem em peso do teor de proteína total da preparação e não inclui constituintes que são deliberadamente adicionados para a purificação da composição. A invenção também inclui métodos para detectar, enumerar e/ou identificar DC e seus subconjuntos numa amostra biológica e medir antigénios, tais como BDCA-2, BDCA-3 ou BDCA-4 solúveis e/ou DC nos fluidos corporais. Os métodos incluem obter uma amostra biológica, contactar a amostra com um fragmento de ligação ao antigénio descrito aqui sob condições que permitem a ligação anticorpo-antigénio e a detecção da ligação, se existente, do anticorpo com a amostra, em comparação com uma amostra biológica de controlo.
Após se preparar uma amostra biológica de forma adequada, por exemplo enriquecendo a concentração de DC ou concentração de antigénio, mistura-se com um excesso de fragmentos de ligação ao antigénio sob condições que permitem a formação de um complexo entre as DC ou antigénio e o anticorpo. A quantidade de complexo formado ou o número de complexos que 51
ΕΡ 1 301 539 /PT possuem DC são então determinados e eventualmente comparados com complexos formados com amostras convencionais contendo quantidades conhecidas de antigénio alvo na gama esperada, ou concentrações de DC conhecidas. A formação de complexo pode ser observada por imunoprecipitação ou nefelometria, mas é geralmente mais sensível utilizar um reagente marcado com estes marcadores, tais como radio-isótopos como 125I, enzimas como peroxidase e β-galactosidase ou fluorócromos como fluoresceína. Os métodos para detectar células e antigénios são bem conhecidos na arte. Para detecção de células, a citometria de fluxo é particularmente útil, com antigénio é preferido o ELISA. O reconhecimento específico de um fragmento de ligação ao antigénio anti-DC a um antigénio pode ser testado por qualquer imunoensaio conhecido na arte. Qualquer forma de teste de ligação directo é adequada. Em qualquer teste deste tipo, um dos parceiros de ligação, o antigénio ou o fragmento de ligação ao antigénio putativo, é marcado. Os marcadores adequados incluem, mas não se limitam a, radio-isótopos, tais como 125I, enzimas, tais como peroxidase, marcadores fluorescentes, tais como fluoresceína e marcadores de quimioluminescência. Tipicamente, o outro parceiro de ligação é insolubilizado (por exemplo revestindo uma fase sólida, tal como uma placa de microtítulo) para facilitar a remoção do parceiro de ligação solúvel, não ligado. Após se combinar o parceiro de ligação marcado com o parceiro de ligação não marcado, a fase sólida é lavada e a quantidade de marcador ligado é determinada.
Quando utilizados para imunoterapia, os fragmentos de ligação ao antigénio aqui descritos podem ser não marcados ou marcados com um agente terapêutico, como descrito aqui e como é conhecido na arte. Estes agentes podem ser acoplados, quer directa, quer indirectamente aos fragmentos de ligação ao antigénio da invenção. Um exemplo de acoplamento indirecto é a utilização de uma porção espaçadora. Estas porções espaçadoras, por sua vez, podem ser ou insolúveis, ou solúveis (Diener et al. (1986) Science 231:148) e podem ser seleccionadas para permitir a libertação de drogas no local alvo. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser acoplados a fragmentos de ligação ao antigénio para imunoterapia 52
ΕΡ 1 301 539 /PT incluem, mas não se limitam a, antigénios, incluindo antigénios de tumor, antigénios virais, antigénios bacterianos, antigénios derivados de parasitas e auto-antigénios, modificadores de biorresposta, drogas, radio-isótopos, lectinas e toxinas. Os modificadores de biorrespostas incluem citóquinas e quimioquinas que incluem, mas não se limitam a IL-2, IL-3, IL-4, G-CSF, GM-CSF, IL-10, IL-12, TGF-β, MTP-AB, SDF-1, linfotactina, DC-CKl, Eotoxinas, IP-10, TARC, Rantes, MIP-la, MIP-Ιβ, SLC, ITAC, MIE, MDC, MCP-1, TCA-3, MCP-2, -3, -4 e interferões. Os interferões com os quais os fragmentos de ligação ao antigénio podem ser ligados incluem iFN-a, lFN-β, e lFN-γ e seus subtipos.
Utilizando fragmentos de ligação ao antigénio conjugados radio-isotopicamente para imunoterapia, alguns isotipos podem ser mais preferíveis que outros, dependendo de factores como a estabilidade do isotipo e emissão. Se desejado, o reconhecimento da população de células pelo fragmento de ligação ao antigénio pode ser avaliado pelas técnicas de diagnóstico in vivo descritas a seguir. Em geral, preferem-se em imunoterapia os radio-isótopos emissores de partículas α e β. Por exemplo, pode ser preferível um emissor β de energia elevada capaz de penetrar vários milímetros de tecido, tal como 90Y. Por outro lado, pode ser preferível um emissor de energia elevada de curto alcance, tal como 212Bi. Exemplos de radio-isótopos que podem ser ligados aos fragmentos de ligação ao antigénio da invenção para fins terapêuticos incluem, mas não se limitam a, 125I, 131I, 90Y, 67Cu, 212Bi, 211At, 212Pb, 41Sc, 109Pd e 188Re.
As lectinas são proteínas, normalmente isoladas a partir de material de plantas que se ligam a porções de glícido específicas. Muitas lectinas são também capazes de aglutinar células e estimular linfócitos. No entanto, a ricina é uma lectina tóxica que tem sido utilizada imunoterapeuticamente. Isto é de preferência realizado ligando a cadeia de péptido α de ricina, que é responsável pela toxicidade, à molécula de anticorpo, para permitir o fornecimento específico do local, do efeito tóxico.
As toxinas são substâncias venenosas produzidas pelas plantas, animais ou microorganismos que, numa dose suficiente, 53
ΕΡ 1 301 539 /PT são muitas vezes letais. A toxina de difteria é uma substância produzida pela Corynebacterium diphtheria que pode ser utilizada terapeuticamente. Esta toxina consiste de uma subunidade α e β que sob condições adequadas podem ser separadas. O componente de cadeia A tóxica pode ser ligado a um fragmento de ligação ao antigénio aqui descrito e utilizado para o fornecimento especifico do local a um subconjunto especifico de DC.
Os métodos recombinantes são bem conhecidos na arte. A prática da invenção utiliza, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia que estão no âmbito dos conhecimentos na arte. Estas técnicas estão explicadas na sua totalidade na literatura, tal como em "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edição (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (Wei & Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller & Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994); e "Current Protocols in Immunology" (Coligan et al., eds., 1991). Estas técnicas são aplicáveis à produção dos polinucleótidos e polipéptidos e, como tal, podem ser consideradas na realização e prática da invenção. Técnicas particularmente úteis estão descritas nas secções que se seguem. A invenção proporciona vários polinucleótidos que codificam para antigénios BDCA. A invenção também inclui polinucleótidos que codificam para variantes e derivados funcionalmente equivalentes destes antigénios e seus fragmentos funcionalmente equivalentes que podem aumentar, diminuir ou não afectar de forma significativa as propriedades dos polipéptidos codificados pelos mesmos. Estas variantes, derivados e fragmentos funcionalmente equivalentes podem apresentar a capacidade para se ligar especificamente aos seus anticorpos respectivos. Por exemplo, as alterações que não irão afectar significativamente as propriedades do polipéptido 54
ΕΡ 1 301 539 /PT codificado incluem, mas não se limitam a alterações numa sequência de ADN que não alteram a sequência de aminoácidos codificada, bem como as que resultam em substituições conservativas de residuos de aminoácidos, uma ou algumas eliminações ou adições de residuos de aminoácido e substituição de residuos de aminoácido por análogos de aminoácido. As substituições conservativas são glicina/ alanina; valina/isoleucina/leucina; asparagina/glutamina; ácido aspártico/ácido glutâmico; serina/treonina/metionina; lisina/arginina; e fenilalanina/tirosina/triptofano.
Os polinucleótidos da invenção podem compreender sequências adicionais, tais como sequências codificantes adicionais na mesma unidade de transcrição, elementos de controlo, tais como promotores, locais de ligação ao ribossoma e locais de poliadenilação, unidades de transcrição adicionais sob o controlo do mesmo ou de um promotor diferente, sequências que permitem a clonagem, expressão e transformação de uma célula hospedeira e qualquer construção deste tipo, como pode ser desejável para se obterem concretizações da presente invenção. A invenção inclui um polinucleótido de pelo menos cerca de 15 nucleótidos consecutivos, de preferência pelo menos cerca de 20 nucleótidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 25 nucleótidos consecutivos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 35 nucleótidos consecutivos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 50 nucleótidos consecutivos, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 75 nucleótidos, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 100 nucleótidos, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 200 nucleótidos e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 300 nucleótidos, que formam um híbrido estável com um polinucleótido que codifica para BDCA-2 e BDCA-3, de preferência a sequência de ADNc apresentada na Figura 12. Pode-se utilizar qualquer conjunto de condições para este teste, desde que exista pelo menos um conjunto em que o polinucleótido de teste demonstra a especificidade necessária.
As reacções de hibridação podem ser realizadas sob condições de diferente "rigor". As condições que aumentam o rigor de uma reacção de hibridação estão publicadas. Veja-se, 55
ΕΡ 1 301 539 /PT por exemplo, Sambrook e Maniatis. Exemplos de condições relevantes incluem (por ordem de rigor crescente): temperaturas de incubação de 25°C, 37°C, 50°C e 68°C; concentrações de tampão de lOx SSC, 6x SSC, lx SSC, 0,lx SSC (em que SSC é NaCl 0,15 M e tampão citrato 15 mM) e seu equivalente utilizando outros sistemas tampão; concentrações de formamida de 0%, 25%, 50% e 75%; tempos de incubação de 5 minutos a 24 horas; 1, 2, ou mais passos de lavagem; tempos de incubação de lavagem de 1, 2, ou 15 minutos; e soluções de lavagem de 6x SSC, lx SSC, 0,lx SSC, ou água desionizada. A invenção também proporciona polinucleótidos que codificam para os polipéptidos BDCA. De preferência, os polipéptidos são, ou são derivados dos da Figura 12. A invenção também proporciona polinucleótidos ligados de forma covalente a um marcador detectável. Estes polinucleótidos são úteis, por exemplo, como sondas para detecção de sequências de nucleótidos relacionadas.
Os polinucleótidos da presente invenção podem ser obtidos utilizando síntese química, métodos de clonagem recombinante, PCR ou qualquer sua combinação. Os métodos de síntese química de polinucleótidos são bem conhecidos na arte e não é necessário descrevê-los em detalhe. Um perito na arte pode utilizar os dados de sequência aqui proporcionados para obter um polinucleótido desejado utilizando um sintetizador de ADN, ou fazendo a encomenda a um serviço comercial.
Alternativamente, os nucleótidos que codificam para BDCA e os péptidos codificados por estes podem ser obtidos a partir de uma linha celular produtora, vector de clonagem ou vector de expressão. O ARN ou ADN que codifica para a sequência desejada pode ser isolado, amplificado e processado por técnicas recombinantes convencionais. Estas técnicas incluem digestão com nucleases de restrição e amplificação por reacção em cadeia com polimerase (PCR) ou uma sua combinação adequada. A tecnologia de PCR está descrita nas Patentes US Nos 4683195; 4800159; 4754065; e 4683202, bem como em PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press. Boston (1994) . O isolamento e purificação dos péptidos codificados 56
ΕΡ 1 301 539 /PT por estes podem ser feitos por qualquer método conhecido na arte.
Os polinucleótidos que compreendem uma sequência desejada podem ser inseridos num vector adequado, o vector por sua vez pode ser introduzido numa célula hospedeira adequada para replicação e amplificação. Os polinucleótidos podem ser inseridos em células hospedeiras por qualquer meio conhecido na arte. As células são transformadas introduzindo um polinucleótido exógeno por incorporação directa, endocitose, transfecção, f-acasalamento ou electroporação. Uma vez introduzido, o polinucleótido exógeno pode ser mantido na célula como um vector não integrado (tal como um plasmídeo) ou integrado no genoma de célula hospedeira. O ADN amplificado pode ser isolado a partir da célula hospedeira por métodos convencionais. Veja-se, e.g. Sambrook et al. (1989). O ARN também pode ser obtido a partir da célula hospedeira transformada, pode ser obtido utilizando uma polimerase de ARN dependente de ADN. A presente invenção inclui também uma variedade de vectores compreendendo um polinucleótido que codifica para BDCA-2. Estes vectores podem ser utilizados para a expressão de polipéptidos recombinantes, e também como uma fonte de polinucleótidos que codificam para BDCA. Podem-se utilizar vectores de clonagem para obter cópias réplica dos polinucleótidos, ou para armazenar os polinucleótidos num depósito para posterior recuperação. Os vectores de expressão (e as células hospedeiras contendo estes vectores de expressão) podem ser utilizados para se obter polipéptidos produzidos a partir dos polinucleótidos que eles contêm. Também podem ser utilizados quando é desejável expressar BDCA-2 num indivíduo e ter assim células intactas capazes de sintetizar o polipéptido, tal como na terapia génica. Os vectores de clonagem e expressão adequados incluem qualquer um conhecido na arte, e.g. os utilizados em sistemas de expressão bacterianos, de mamifero, levedura e insecto. Os vectores específicos e células hospedeiras adequadas são conhecidos na arte e não estão descritos aqui em detalhe. Veja-se, e.g., Gacesa e Ramji, Vectors, John Wiley & Sons (1994) . 57
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Os vectores de clonagem e expressão contêm tipicamente um marcador seleccionável (por exemplo um gene que codifica para uma proteína necessária para a sobrevivência ou crescimento de uma célula hospedeira transformada com o vector), embora este gene marcador possa ser transportado noutra sequência de polinucleótido co-introduzida na célula hospedeira. Apenas as células hospedeiras nas quais foi introduzido um gene seleccionável irão crescer sob condições selectivas. Os genes de selecção típicos ou: (a) conferem resistência a antibióticos ou outras substâncias tóxicas, e.g., ampicilina, neomicina, metotrexato; (b) complementam deficiências auxotróficas; ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis de meios complexos. A escolha do gene marcador adequado dependerá da célula hospedeira e são conhecidos na arte genes adequados para diferentes hospedeiros. Os vectores também contêm tipicamente um sistema de replicação reconhecido pelo hospedeiro.
Podem-se construir vectores de clonagem adequados de acordo com técnicas convencionais, ou podem-se seleccionar a partir de um grande número de vectores de clonagem disponíveis na arte. Apesar do vector de clonagem seleccionado poder variar de acordo com a célula hospedeira que se pretende utilizar, os vectores de clonagem úteis terão geralmente a capacidade de auto-replicar, podem possuir um único alvo para uma endonuclease de restrição particular ou podem transportar genes para um marcador que pode ser utilizado na selecção de clones que contêm o vector. Exemplos adequados incluem plasmídeos e vírus bacterianos, e.g., pUC18, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColEl, pCRl, RP4, ADN fágico e vectores vaivém, tais como pSA3 e pAT28. Estes e muitos outros vectores de clonagem estão disponíveis de empresas comerciais, tais como a BioRad, Stratagene, e Invitrogen.
Os vectores de expressão são geralmente construções de polinucleótidos replicáveis que contêm um polinucleótido que codifica para um bdca de interesse. O polinucleótido que codifica para BDCA está ligado de forma operacional a elementos de controlo da transcrição adequados, tais como promotores, potenciadores e terminadores. Para expressão (í.e. tradução), é normalmente necessário um ou mais elementos de controlo de tradução, tais como locais de ligação ao 58
ΕΡ 1 301 539 /PT ribossoma, locais de iniciação da tradução e codões de terminação. Estes elementos de controlo (da transcrição e da tradução) podem ser derivados de um gene que codifica para um BDCA, ou podem ser heterólogos (i.e. derivados de outros genes ou outros organismos). Também se pode incluir uma sequência de polinucleótido que codifica para um péptido de sinal, para permitir que um BDCA atravesse ou se aloje em membranas celulares, ou seja segregado a partir da célula. São conhecidos na arte vários vectores de expressão adequados para expressão em células eucarióticas, incluindo células de levedura, aves e mamífero. Um exemplo de um vector de expressão é pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA), no qual a transcrição é dirigia pelo promotor precoce/potenciador de citomegalovírus (CMV). Este vector também contém locais de reconhecimento para várias enzimas de restrição, para inserção do polinucleótido de interesse. Outro exemplo de um vector de expressão (sistema) é o sistema de baculovírus/insecto. Outro adequado para utilização em terapia génica direccionada para anticorpos compreende um polinucleótido que codifica para BDCA. Os sistemas adequados estão descritos por exemplo em
Brown et al. (1994) Virol. 198:477-488; e Miyamura et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:8507-8511.
Os vectores que contêm os polinucleótidos de interesse podem ser introduzidos na célula hospedeira por qualquer um de vários meios adequados, incluindo electroporação, transfecção utilizando cloreto de cálcio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano ou outras substâncias, bombardeamento de microprojécteis; lipofecção e infecção. A escolha dos meios para introduzir os vectores ou polinucleótidos que codificam para BDCA irá muitas vezes depender das características da célula hospedeira.
Uma vez introduzido numa célula hospedeira, a expressão de BDCA pode ser determinada utilizando qualquer teste conhecido na arte. Por exemplo, a sua presença pode ser detectada por ria ou elisa do sobrenadante da cultura (se o polipéptido é segregado) ou lisados celulares.
Um vector da presente invenção pode conter um ou mais polinucleótidos que codificam para BDCA. Pode também conter sequências de polinucleótido que codificam para outros 59
ΕΡ 1 301 539 /PT polipéptidos que aumentam, facilitam ou modulam o resultado desejado, tais como citóquinas, incluindo, mas não se limitando a IL-2, IL-4, GM-CSF, TNF-α e IFN-γ. Também se incluem na presente invenção vectores de vacinia que codificam para BDCA recombinantes.
Outras concretizações da presente invenção são células hospedeiras transformadas com polinucleótidos que codificam para BDCA e vectores que compreendem sequências de polinucleótidos, como descrito acima. Podem-se utilizar quer células hospedeiras procarióticas, quer eucarióticas. Os hospedeiros procarióticos incluem, mas não se limitam a, células bacterianas, por exemplo E. coli e mycobacteria. Os hospedeiros eucarióticos incluem, mas não se limitam a células de levedura, insecto, aves, plantas e mamífero. Os sistemas hospedeiros são conhecidos na arte e não é necessário descrevê-los em detalhe aqui. Exemplos de células hospedeiras de mamífero incluem, mas não se limitam a, CHO e NSO obtidas da European Collection of Cell Cultures (Inglaterra). A transfecção de células NSO com um plasmídeo, por exemplo, que é dirigido por um promotor CMV, seguido de amplificação deste plasmídeo utilizando glutamina-sintetase proporciona um sistema útil para a produção de proteínas. Cockett et al. (1990) Bio/Technology 8:662-667.
As células hospedeiras da presente invenção podem ser utilizadas, inter alia, como repositórios e polinucleótidos que codificam para BDCA, ou como veículos para a sua produção. Podem também ser utilizadas como veículo para a expressão de BDCA in vivo.
Os polinucleótidos da presente invenção têm várias utilizações. São úteis, por exemplo, em sistemas de expressão para a produção de BDCA. São também úteis como sondas de hibridação para testar quanto à presença de polinucleótidos que codificam para BDCA ou sequências relacionadas numa amostra, utilizando métodos bem conhecidos dos peritos na arte. Além disso, os polinucleótidos são também úteis como iniciadores para efectuar a amplificação dos polinucleótidos desejados. Os polinucleótidos da presente invenção são úteis também em composições farmacêuticas, incluindo vacinas, e para terapia génica. 60
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Os polinucleótidos também podem ser utilizados como sondas de hibridação para a detecção de sequências que codificam para BDCA. As amostras de hibridação adequadas incluem células transformadas ex vivo para utilização em terapia génica. Numa ilustração, extrai-se ADN ou ARN de uma amostra e corre-se opcionalmente num gel e/ou digere-se com nucleases de restrição. O polinucleótido amostra processado é tipicamente transferido para um meio adequado para lavagem. O polinucleótido amostra é então contactado com a sonda de polinucleótido que codifica para BDCA, sob condições que permitem a formação de um dúplex estável se a amostra contém uma sequência de polinucleótido complementar. Quaisquer dúplices estáveis formados são detectados por qualquer meio adequado. Por exemplo, a sonda de polinucleótido pode ser fornecida na forma marcada e o marcador que permanece na amostra após lavagem irá reflectir directamente a quantidade de dúplex estável formado. Numa segunda ilustração, a hibridação é realizada in situ. Sobre uma amostra de tecido preparada de forma adequada sobrepõe-se uma sonda marcada, para indicar a localização de sequências que codificam para BDCA.
Pode-se utilizar um polinucleótido curto como iniciador para uma reacção de PCR, em particular para amplificar uma sequência maior compreendendo uma região que híbrida com o iniciador. Isto pode ser feito de forma preparativa, de modo a produzir um polinucleótido para posterior manipulação genética. Também pode ser realizado analiticamente, para determinar se está presente um polinucleótido que codifica para BDCA, por exemplo, numa amostra com interesse diagnóstico.
Outra utilização dos polinucleótidos é em vacinas e terapia génica. O princípio geral é administrar o polinucleótido de modo a que promova ou atenue a expressão do polipéptido codificado por ele. Assim, a presente invenção inclui métodos para induzir uma resposta imunitária e métodos de tratamento compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de polinucleótidos que codificam para BDCA a um indivíduo. Nestes métodos, administra-se a um indivíduo um polinucleótido que codifica para BDCA, quer directamente, quer através de células transfectadas com o polinucleótido. De 61
ΕΡ 1 301 539 /PT preferência, o polinucleótido é na forma de um plasmídeo circular, de preferência numa configuração super-enrolada. De preferência, o polinucleótido é replicado dentro de uma célula. Assim, o polinucleótido está ligado de forma operacional a um promotor adequado, tal como um promotor heterólogo que é intrinsecamente activo nas células do tipo de tecido alvo. De preferência, uma vez no núcleo das células os plasmideos persistem como moléculas epissómicas não replicantes, circulares. A mutação in vitro pode ser realizada com construções de plasmideo para codificar, por exemplo, moléculas com maior afinidade e/ou avidez.
Para determinar se os plasmideos contendo polinucleótidos BDCA são capazes de expressão em células eucarióticas, podem-se transfectar células como COS-7, CHO, ou HeLa com os plasmideos. A expressão é então determinada por imunoensaio; por exemplo, por transferência de Western. Os BDCA mais pequenos podem ser detectados, por exemplo, construindo o plasmideo de modo a que o polipéptido resultante seja fundido com um marcador, tal como um epitopo alvo ou marcador enzimático. Pode-se obter outra caracterização do polipéptido expresso purificando o péptido e realizando então um dos testes funcionais aqui descritos.
Num modo de terapia génica, os polinucleótidos da presente invenção são utilizados para alterar geneticamente células ex vivo. Nesta estratégia, as células removidas de um dador ou obtidas a partir de uma linha celular são transfectadas ou transduzidas com vectores BDCA e em seguida administradas a um receptor. As células adequadas para transfecção incluem células mononucleares de sangue periférico.
Noutro modo de terapia génica, os polinucleótidos da presente invenção são utilizados para alterar geneticamente células in vivo. A finalidade pode incluir, mas não se limita a tratar vários tipos de cancro.
Os polinucleótidos também podem ser utilizados para produzir células que não expressam BDCA-2 e animais transgénicos que expressam BDCA-2. 62
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Também se obtêm a partir da invenção células manipuladas para não expressar, ou para expressar BDCA-2 a niveis significativamente reduzidos. Estas células podem ser produzidas seleccionado uma célula, de preferência uma DC e proporcionando à célula uma construção de expressão compreendendo um polinucleótido que codifica para um gene de BDCA-2, em que o polinucleótido está posicionado no sentido inverso em relação a, e ligado de forma operacional a um promotor. A expressão de um polinucleótido deste tipo produz eficazmente uma célula deficiente em BDCA-2.
Noutras concretizações, a presente invenção proporciona um método para a preparação de células hospedeiras recombinantes que produzem quantidades significativamente reduzidas ou que "knockout" mesmo a produção de BDCA-2. Estas células hospedeiras recombinantes podem ser preparadas utilizando um ou mais meios que são bem conhecidos dos peritos na arte. Por exemplo, a expressão de genes pode ser inibida pela incorporação de construções para ADN ou ARN de sentido inverso no genoma. As eliminações ou mutações dos genes de BDCA-2 endógenos podem-nos tornar não funcionais. Os ácidos nucleicos que codificam para ribozimas-enzimas que clivam ARN-que clivam especificamente ARNm de BDCA-2 podem ser introduzidos nas células hospedeiras recombinantes. O termo "knockout" refere-se à supressão parcial ou completa da expressão de pelo menos uma porção de uma proteína codificada por uma sequência de ADN endógena, e.g. BDCA-2, numa célula. O termo "construção knockout" refere-se a uma sequência de ácido nucleico que é concebida para diminuir ou suprimir a expressão de uma proteína codificada por sequências de ADN endógenas numa célula.
Estas construções recombinantes podem ser incorporadas em mamíferos knockout, de modo que a produção de BDCA-2 é suprimida nas DC. A preparação de animais knockout e animais transgénicos é bem conhecida dos peritos na arte e está descrita em 5434340, 5530179 e 5557032. A invenção proporciona também métodos para produzir animais e os animais assim produzidos que sobre-expressam BBDCA-2. Estes métodos compreendem geralmente introduzir 63
ΕΡ 1 301 539 /PT células de um animal no animal, em que as células animais foram tratadas in vitro para ai inserir um segmento de ADN que codifica para um polipéptido BDCA-2, em que as células animais expressam o BDCA-2 in vivo, no animal. D. Kits A invenção inclui kits que contêm fragmentos de ligação ao antigénio específicos de anti-DC para medir BDCA-2, incluindo BDCA-2 solúvel, incluindo suas isoformas, no soro e outras fontes. Os procedimentos de diagnóstico utilizando os kits podem ser realizados por laboratórios de diagnóstico, laboratórios experimentais, técnicos ou indivíduos privados. A amostra clínica é opcionalmente pré-tratada para enriquecimento do alvo a ser testado. O utilizador aplica então um reagente contido no kit, de modo a detectar o nível alterado ou a alteração no componente de diagnóstico.
Opcionalmente, o reagente pode ser conjugado com um marcador para permitir a detecção de qualquer complexo formado com o alvo na amostra. Noutra opção, é proporcionado um segundo reagente que é capaz de combinar com o primeiro reagente após este ter encontrado o seu alvo, fornecendo assim o marcador detectável. Por exemplo, pode-se proporcionar anti-IgG de murídeo como um reagente secundário. A avidina marcada é um reagente secundário quando o reagente primário foi conjugado com biotina.
Os kits podem ser utilizados numa variedade de amostras biológicas incluindo, quer amostras líquidas, suspensões celulares e amostras de tecido. Os testes adequados que podem ser fornecidos na forma de kit incluem os aqui descritos.
Cada reagente é fornecido numa forma sólida ou dissolvido/suspenso num tampão líquido adequado para armazenamento e mais tarde para troca ou adição no meio de reacção quando o teste é realizado. É proporcionado um empacotamento adequado. O kit pode proporcionar opcionalmente componentes adicionais que são úteis no procedimento. Estes componentes opcionais incluem, mas não se limitam a, tampões, reagentes de captura, reagentes de desenvolvimento, 64
ΕΡ 1 301 539 /PT marcadores, superfícies reactivas, meios para detecção, amostras de controlo, instruções e informação interpretativa. E. Composições terapêuticas 1. Composições de matéria A preparação de composições farmacêuticas aqui descrita é realizada de acordo com procedimentos geralmente aceites para a preparação de preparações farmacêuticas. Veja-se, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences 18a Edição (1990), E.W. Martin ed., Mack Publishing Co., PA. Dependendo da utilização pretendida e modo de administração pode ser desejável processar melhor o ingrediente activo na preparação de composições farmacêuticas. O processamento adequado pode incluir esterilização, mistura com componentes não tóxicos e não interferentes adequados, dividindo-os em unidades de dosagem e inserindo num dispositivo de fornecimento. Numa concretização, as composições terapêuticas contêm DC, suas subpopulações ou suas misturas. Noutra concretização, as composições contêm os fragmentos de ligação ao antigénio aqui descritos. De preferência, os fragmentos de ligação ao antigénio são, ou são derivados dos mAc listados na Tabela 1. De preferência, as composições de DC contêm DC isoladas com um destes fragmentos de ligação ao antigénio. (a) Modos gerais de administração.
As composições farmacêuticas da invenção são administradas por um modo adequado para a forma da composição. As vias típicas incluem intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, oral, intranasal, intradérmica e intrapulmonar (í.e., por aerossol). As composições farmacêuticas para utilização em humanos são tipicamente administradas por uma via parentérica, muito tipicamente intravenosa, subcutânea, intramuscular. Embora não seja necessário, as composições farmacêuticas são preferencialmente fornecidas na forma de dosagem unitária adequada para administração de uma quantidade precisa. A invenção também contempla formas de libertação lenta ou controlada, em que se proporciona um nível relativamente constante do composto activo, durante um período alargado. 65 ΕΡ 1 301 539 /PT (b) Formulações líquidas
As composições líquidas farmaceuticamente aceitáveis podem, por exemplo, ser preparadas dissolvendo ou dispersando um polipéptido ou polinucleótido aqui concretizado num excipiente líquido, tal como água, solução salina, dextrose aquosa, glicerol ou etanol. A composição pode também conter opcionalmente outros agentes medicinais, agentes farmacêuticos, transportadores e substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes e agentes de tamponamento de pH. As composições para injecção podem ser fornecidas como soluções ou suspensões líquidas, como emulsões, ou como formas sólidas adequadas para dissolução ou suspensão num líquido antes de injecção.
As composições farmacêuticas para administração oral, intranasal ou tópica podem ser fornecidas nas formas sólida, semi-sólida ou líquida, incluindo comprimidos, cápsulas, pós, líquidos e suspensões. Para administração através do tracto respiratório, uma composição preferida é uma que proporciona um sólido, pó ou aerossol líquido quando utilizada com um dispositivo de aerossóis adequado. A invenção também inclui composições compreendendo lipossomas com péptido ligado à membrana para fornecer especificamente o lipossoma à área do tumor ou células neoplásicas, ou ao sistema imunitário. Estes lipossomas podem ser produzidos de modo a conter, além do péptido, agentes imunoterapêuticos, tais como os descritos acima que seriam então libertados no local de reconhecimento. Wolff et al. (1984) Biochem. Biophys. Acta 802:259. Outro sistema de fornecimento deste tipo utiliza cápsides de parvovírus B19 quimérico para a apresentação dos fragmentos de ligação ao antigénio. Brown et al. (1994) Virol. 198:477-488; e Miyamura et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Scl. USA 91:8507-8511. Estes sistemas quiméricos são incluídos aqui para utilização.
As composições concretizadas na presente invenção podem ser analisadas quanto à sua eficácia de vários modos. Assim, preparam-se compostos de teste como uma composição farmacêutica adequada e administram-se aos indivíduos de teste. Estudos iniciais são preferencialmente realizados em 66
ΕΡ 1 301 539 /PT animais pequenos, tais como ratinhos ou coelhos, opcionalmente em seguida em primatas não humanos e por fim em humanos. A imunogenicidade é preferencialmente testada em indivíduos sem uma resposta a anticorpo prévia. Administra-se uma composição de teste numa dose de teste adequada, num esquema de tratamento adequado. Poderá ser apropriado comparar diferentes doses e esquemas dentro da gama prevista. As gamas de dosagem para a administração de fragmentos de ligação ao antigénio são suficientemente grandes para produzir o efeito desejado, em que os sintomas da doença são melhorados sem provocar efeitos secundários indevidos, tais como reacções cruzadas indesejadas e reacções anafilácticas. Em geral, a dosagem irá variar com a idade, condição, sexo e extensão da doença no paciente e pode ser determinada por um perito na arte. A dosagem pode ser ajustada pelo médico do indivíduo no caso de alguma complicação. Em geral, quando as composições são administradas conjugadas com agentes terapêuticos, podem-se utilizar dosagens mais baixas, comparáveis com as utilizadas para imagiologia de imunodiagnóstico in vivo. 2. Fragmentos de ligação ao antigénio A invenção inclui composições farmacêuticas contendo os fragmentos de ligação ao antigénio aqui descritos. Estas composições farmacêuticas são úteis para induzir ou auxiliar uma resposta imunitária e tratar doenças neoplásicas ou incluindo tolerância e tratando doenças auto-imunes (GvHD, rejeição de aloenxertos, alergénios, etc.) quer isoladas, quer em conjunção com outras formas de terapia, tais como quimioterapia, radioterapia ou terapias imunitárias descritas em WO 98/23735; WO 98/34642; WO 97/10000; WO 97/10001; e WO 97/06821. Outros métodos de tratamento são aqui descritos e/ou conhecidos na arte. As doenças adequadas incluem, sem limitação, doenças virais, parasíticas, bacterianas, fúngicas, neoplásicas e auto-imunes.
Num modelo de cancro da mama de murídeo, utilizou-se o ligando Flt3 (Flt3-L) uma citóquina estimuladora para uma variedade de linhagens hematopoiéticas, incluindo DC e células B, em conjunção com células de cancro da mama de murídeo, como uma vacina. Chen et al. (1997) Câncer Res. 57:3511-6. As DC também podem ser carregadas com, ou transduzidas para 67
ΕΡ 1 301 539 /PT expressar antigénios de tumor; estas células são então utilizadas como adjuvantes para a vacinação de tumores. As DC apresentam antigénios associados a tumores endogenamente ao sistema linfático aferente, num contexto restrito a MHC adequado. Wan et al. (1997) Hum. Gene Ther. 8:1355-63; Peiper et al. (1997) Surgery 122:235-41; e Smith et al. (1997) Int. Irmunol. 9:1085-93. As vacinas de melanoma actuais manipulam redes de apresentação de antigénios e combinam a melhor resposta imunitária antitumoral de células e anticorpos eficaz na mediação da imunidade protectora contra tumores. Estas terapias causaram a regressão, atrasaram da progressão da doença ou melhoraram a sobrevivência nalguns casos, com ausência de efeitos secundários. Kuhn et al. (1997) Dermatol. Surg. 23:649-54. As vacinas de melanoma também estão revistas em Conforti et al. (1997) J. Surg. Oncol. 66:55-64.
As vacinas podem ser empacotadas em transportadores farmaceuticamente aceitáveis, misturadas com adjuvantes ou outros componentes (tais como citóquinas), como é conhecido na arte. As vacinas para utilização veterinária são substancialmente semelhantes às de humanos, com a excepção de que são permitidos nas formulações adjuvantes contendo bactérias e componentes bacterianos, tais como adjuvante de Freund completo ou incompleto. F. Métodos de tratamento
Também se incluem na presente invenção métodos para tratar uma variedade de distúrbios como aqui descrito e/ou conhecido na arte. Os métodos compreendem administrar uma quantidade de uma composição farmacêutica contendo uma composição da invenção numa quantidade eficaz para se obter o efeito desejado, quer este seja a paliação de uma condição existente ou a prevenção de recorrência. Para o tratamento do cancro, a quantidade de uma composição farmacêutica administrada é uma quantidade eficaz para produzir o efeito desejado. Pode-se proporcionar uma quantidade eficaz numa ou uma série de administrações. Pode-se proporcionar uma quantidade eficaz num bólus ou por perfusão contínua. Os agentes activos adequados incluem as drogas antineoplásicas, modificadores de biorrespostas e células efectoras, tais como 68
ΕΡ 1 301 539 /PT as descritas por Douillard et al. (1986) Hybridomas (Supp. 1:5139) .
As composições farmacêuticas e modalidades de tratamento são adequadas para tratar um paciente produzindo directa, ou indirectamente uma resposta imunitária contra a neoplasia. Um "indivíduo", "paciente" ou "sujeito" é um vertebrado, de preferência um mamífero, mais preferencialmente um humano. Os mamíferos incluem, mas não se limitam a: humanos, animais selvagens, animais ferozes, animais de criação, animais de desporto e animais de estimação. Um "sujeito com cancro" é um mamífero, de preferência um humano, a quem se diagnosticou uma malignidade ou neoplasia, ou que está em risco de as ter.
Tal como aqui utilizado, "tratamento" refere-se à intervenção clínica numa tentativa de alterar o curso da doença do indivíduo ou célula a ser tratada e pode ser realizado quer por profilaxia, quer no decorrer da patologia clínica. Os efeitos terapêuticos do tratamento incluem, sem limitação, prevenir a ocorrência ou recorrência da doença, aliviar os sintomas, diminuir quaisquer consequências patológicas da doença directas ou indirectas, prevenir metástases, diminuir a velocidade de progressão da doença, melhorar ou aliviar o estado de doença e a remissão ou um prognóstico melhorado. A "patologia" associada com uma condição de doença é qualquer condição que compromete o bem-estar, fisiologia normal ou qualidade de vida do indivíduo afectado. Isto pode envolver, mas não se limita a invasão destrutiva dos tecidos afectados em áreas não previamente afectadas, crescimento à custa da função de tecido normal, actividade biológica irregular ou suprimida, agravamento ou supressão de uma resposta inflamatória ou imunológica, maior susceptibilidade contra outros organismos ou agentes patogénicos e sintomas clínicos indesejáveis, tais como dor, febre, náusea, fadiga, alterações de humor e outras características relacionadas com a doença, tal como pode ser determinado por um médico assistente.
Uma "quantidade eficaz" é uma quantidade suficiente para originar um resultado clínico benéfico ou desejado por 69
ΕΡ 1 301 539 /PT tratamento. Uma quantidade eficaz pode ser administrada a um paciente numa ou mais doses. Em termos de tratamento, uma quantidade eficaz é uma quantidade que é suficiente para aliviar, melhorar, estabilizar, inverter ou retardar a progressão da doença, ou de outro modo reduzir as consequências patológicas da doença. A quantidade eficaz é em geral determinada pelo médico caso a caso e está no âmbito dos conhecimentos na arte. Consideram-se tipicamente vários factores quando se determina uma dosagem adequada para se obter uma quantidade eficaz. Estes factores incluem idade, sexo e peso do paciente, a condição a ser tratada, a gravidade da condição e a forma e concentração eficaz do fragmento de ligação ao antigénio administrado. O termo "imunomodulador" ou "modular uma resposta imunitária", tal como aqui utilizado, inclui efeitos imunoestimulantes, bem como imunossupressores. Os efeitos imunoestimulantes incluem, mas não se limitam aos que aumentam directa ou indirectamente as respostas imunitárias celulares ou humorais. Exemplos de efeitos imunoestimulantes incluem, mas não se limitam a maior produção de anticorpos específicos para o antigénio; activação ou proliferação de uma população de linfócitos, tais como células NK, células CD4+, células CD8+, macrófagos e semelhantes; maior sintese de citóquinas ou quimioquinas, incluindo, mas não se limitando a IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, interferões, TNF-a, il-10, TGF-β e semelhantes. Os efeitos imunossupressores incluem os que diminuem directa ou indirectamente as respostas imunitárias celulares ou humorais. Exemplos de efeitos imunossupressores incluem, mas não se limitam a uma redução na produção de anticorpos específicos para o antigénio, tais como menor produção de IgE; activação de linfócitos ou outras populações de células que têm actividades imunossupressoras, tais como as que resultam em tolerância imunitária; e maior síntese de citóquinas que têm efeitos supressores em relação a algumas funções celulares incluindo, mas não se limitando a IL-10 e TGF-β. Um exemplo disto é o IFN-γ que parece bloquear a troca de classe induzida por IL-4 para IgE e IgGl, reduzindo desse modo os níveis destas subclasses de anticorpo.
Os indivíduos humanos adequados para terapia de cancro compreendem também dois grupos de tratamento que podem ser 70
ΕΡ 1 301 539 /PT distinguidos por critérios clínicos. Os pacientes com "doença avançada" ou "carga de tumor elevada" são os que possuem um tumor clinicamente mensurável. Um tumor clinicamente mensurável é um que pode ser detectado com base na massa de tumor (e.g. por palpação, varrimento CAT, sonograma, mamograma ou raios-x; os marcadores bioquímicos ou histopatológicos positivos por si só são insuficientes para identificar esta população). Administra-se uma composição farmacêutica concretizada pela presente invenção a estes pacientes para desencadear uma resposta antitumoral, com o objectivo de melhorar a sua condição. Idealmente, ocorre como resultado a redução da massa do tumor, mas qualquer melhoria clínica é um benefício. A melhoria clínica inclui menor risco ou velocidade de progressão, ou redução nas consequências patológicas do tumor.
Um segundo grupo de indivíduos adequado é conhecido na arte como "grupo adjuvante". Estes são indivíduos que tiveram uma história de cancro mas responderam a outro modo de terapia. A terapia anterior pode ter incluído (mas não se restringe a, ressecção cirúrgica, radioterapia e quimioterapia tradicional). Como resultado, estes indivíduos não têm nenhum tumor clinicamente mensurável. No entanto, suspeita-se que estão em risco de progressão da doença, quer próximo do local original do tumor, quer por metástases. "Adjuvante", tal como aqui utilizado, tem vários significados, sendo todos eles claros, dependendo do contexto em que o termo é utilizado. No contexto de uma preparação farmacêutica um adjuvante é um agente químico ou biológico administrado em combinação (quer em simultâneo, quer de outro modo) com, ou fundido de modo recombinante com um antigénio, para aumentar a imunogenicidade do antigénio. Para revisão veja-se, Singh et al. (1999) Nature Biotech. 17:1075-1081. Também foi sugerido que as DC isoladas fossem utilizadas como adjuvantes. As composições para esta utilização estão incluídas na presente invenção. No contexto do diagnóstico ou tratamento do cancro, adjuvante refere-se a uma classe de pacientes de cancro sem nenhuma massa de tumor detectável clinicamente, mas que se suspeita que estão em risco de recorrência. 71
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Este grupo pode ser ainda subdividido em indivíduos de risco elevado e risco baixo. A subdivisão é feita com base em características observadas antes ou após o tratamento inicial. Estas características são conhecidas nas artes clínicas e são definidas de forma adequada para cada cancro diferente. As características típicas de subgrupos de risco elevado são aquelas em que o tumor invadiu tecidos vizinhos, ou que apresentam um envolvimento dos nódulos linfáticos.
Outro grupo adequado é o dos que têm uma predisposição genética para o cancro, mas que ainda não evidenciaram sinais clínicos de cancro. Por exemplo, as mulheres que testaram positivo para uma mutação genética associada a cancro da mama, mas que ainda estão em idade de engravidar, poderão desejar receber um ou mais fragmentos de ligação ao antigénio aqui descritos como tratamento profilático para prevenir a ocorrência de cancro, até ser adequado realizar uma cirurgia preventiva.
Os pacientes de cancro humanos, incluindo, mas não se limitando a glioblastoma, melanoma, neuroblastoma, adenocarcinoma, glioma, sarcoma de tecidos moles e vários carcinomas (incluindo cancro de pulmão de células pequenas) são indivíduos especialmente adequados. Os carcinomas adequados incluem também qualquer um conhecido no campo de oncologia, incluindo, mas não se limitando a, astrocitoma, fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, oligodendroglioma, ependimoma, meduloblastoma, tumor ectodérmico neural primitivo (PNET), condrossarcoma, sarcoma osteogénico, adenocarcinoma ductal pancreático, adenocarcinomas de pulmão de células pequenas e grandes, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma broncoalveolar, adenocarcinoma epitelial e suas metástases para o fígado, linfangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, hepatoma, colangiocarcinoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, rabdomiossarcoma, carcinoma do cólon, carcinoma de células basais, carcinoma da glândula sudorípara, carcinoma papilar, carcinoma da glândula sebácea, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renais, carcinoma do dueto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilms, tumor testicular, meduloblastoma, craniofaringioma, 72
ΕΡ 1 301 539 /PT ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, e doença das cadeias pesadas, tumores da mama, tais como adenocarcinoma ductal e lobular, carcinoma escamoso e adenocarcinomas do cérvix uterino, carcinomas epiteliais uterino e ovárico, adenocarcinomas prostáticos, carcinoma de células escamosas transitório da bexiga, linfomas de células B e T (nodular e difuso) plasmacitoma, leucemias aguda e crónica, melanoma maligno, sarcomas de tecido mole e leiomiossarcomas.
Os pacientes podem ter uma forma avançada da doença, caso em que o objectivo do tratamento pode incluir a mitigação ou reversão da progressão da doença e/ou melhoria de efeitos secundários. Os pacientes podem ter uma história da condição para a qual foram tratados, caso em que o objectivo terapêutico irá incluir tipicamente uma diminuição ou atraso no risco de recorrência.
Os distúrbios auto-imunes são causados por uma resposta imunitária mal direccionada que resulta na autodestruição de uma variedade de células, tecidos e órgãos. A causa destes distúrbios é desconhecida. Sabe-se que o reconhecimento do que é próprio através do MHC é importante numa resposta imunitária. No entanto, a prevenção de uma resposta auto-imune e as células responsáveis pela auto-imunidade não são bem compreendidas. A auto-imunidade resulta de uma combinação de factores, incluindo influências genéticas, hormonais e ambientais. Muitos distúrbios auto-imunes são caracterizados por hiperactividade de células B, marcada por proliferação de células B e auto-anticorpos e por hiperglobulinemia. A hiperactividade de células B está provavelmente relacionada com anomalias das células T. Os factores hormonais e genéticos influenciam fortemente a incidência de distúrbios auto-imunes; por exemplo, o lúpus eritematoso afecta predominantemente mulheres em idade de engravidar e alguns haplótipos de HLA estão associados com um maior risco de distúrbios auto-imunes específicos. 73
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Os distúrbios auto-imunes comuns incluem, mas não se limitam a, artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, artrite psoriática, espondilite anquilosante, sindrome de Sjõrgen, lúpus eritematoso, sindrome de Goodpasture, sindrome de Reiter, esclerodermia, vasculite, poliomiosite e dermatomiosite. Muitas destas condições incluem reacções inflamatórias aberrantes relacionadas com os distúrbios imunológicos. As DC aqui descritas são adequadas para utilização no tratamento destes distúrbios, em particular quando utilizadas para inactivar ou induzir tolerogenização em células T envolvidas no distúrbio. Os métodos de tratamento são conhecidos na arte. Como discutido aqui, um ou mais dos subconjuntos de DC obtidas pelos métodos aqui descritos são adequados para utilização no tratamento de auto-imunidade. "Actividade imunológica" de um fragmento de ligação ao antigénio refere-se a ligar especificamente o antigénio que o anticorpo intacto reconhece. Esta ligação pode ou não desencadear uma resposta imunitária. Uma resposta imunitária especifica pode desencadear anticorpos, respostas de células B, respostas de células T, qualquer sua combinação e funções efectoras dai resultantes. Incluem-se, sem limitação, as funções ADCC mediadas por anticorpo e a citólise mediada por complemento (CDC). As respostas de células T incluem, sem limitação, a função de células T ajudantes, função de células T citotóxicas, função de células T de inflamação/indução e supressão imunitária mediada por células T. Um composto (quer isolado, quer em combinação com um transportador ou adjuvante) capaz de desencadear quer directa, quer indirectamente uma resposta imunitária especifica de acordo com qualquer um destes critérios é designado por "imunogénico". "Actividade" ou "função" do fragmento de ligação ao antigénio refere-se a qualquer das actividades imunológicas de um anticorpo, incluindo detecção, melhoria ou paliação do cancro.
Uma "resposta imunitária" refere-se à indução ou melhoria de uma resposta imunológica a tecido maligno ou doente, agentes que causam doença e outros agentes estranhos contra os quais o organismo é exposto. As respostas imunitárias podem ser humorais, como evidenciado pela produção de anticorpos e/ou mediadas por células, como evidenciado pelas respostas 74 ΕΡ 1 301 539 /PT citolíticas demonstradas por células, tais como células assassinas naturais ou linfócitos T citotóxicos (CTL) e as citóquinas produzidas por elas. As respostas imunitárias podem ser monitorizadas por um infiltrado de células mononucleares no local da infecção ou malignidade. Tipicamente, esta monitorização é por histopatologia. Uma "resposta imunitária especifica de cancro" é uma que ocorre contra a malignidade, mas não contra células não cancerosas. Os tratamentos descritos aqui tipicamente induzem ou aumentam uma resposta imunitária mediada por células, mas podem também induzir ou aumentar uma resposta imunitária mediada por anticorpos. Os tratamentos podem também influenciar o tipo de resposta imunitária ao antigénio.
As composições de acordo com a invenção também são adequadas para utilização na indução de uma resposta imunitária Thl especifica do antigénio. A estimulação de uma resposta imunitária do tipo Thl pode ser medida num hospedeiro tratado de acordo com a invenção e pode ser determinada por qualquer método conhecido na arte, incluindo, mas não se limitando a uma redução nos níveis de IL-4 medidos antes e após o desafio com antigénio; ou a detecção de niveis inferiores (ou mesmo ausentes) de IL-4 num hospedeiro tratado, em comparação com um controlo estimulado com antigénio, ou estimulado e desafiado, tratado sem as composições da invenção; um aumento nos níveis de IL-12, IL-18 e/ou IFN (α, β ou γ, de preferência IFN-γ, num hospedeiro tratado, em comparação com um controlo estimulado com antigénio ou estimulado e desafiado; produção de anticorpo lgG2a num hospedeiro tratado, em comparação com um controlo não tratado; uma redução nos níveis de IgE específico para o antigénio, tal como medido antes e após desafio ou detecção de níveis inferiores (ou mesmo ausentes) de IgE específico de antigénio num hospedeiro tratado, em comparação com um hospedeiro não tratado, estimulado com antigénio ou estimulado e desafiado. Várias destas determinações podem ser feitas medindo as citóquinas produzidas pelas APC e/ou linfócitos, de preferência DC e/ou células T in vitro ou ex vivo, utilizando métodos aqui descritos e conhecidos na arte. Os métodos para determinar a produção de anticorpos incluem qualquer um conhecido na arte. 75
ΕΡ 1 301 539 /PT A indução de citóquinas baseadas em Thl produz respostas imunitárias celulares aumentadas, tais como as realizadas por células NK, células assassinas citotóxicas, células Thl ajudantes e de memória. Estas respostas são particularmente benéficas para utilização na vacinação protectora ou terapêutica contra virus, fungos, parasitas protozoários, bactérias, doenças alérgicas e asma, bem como tumores. A invenção também inclui a sub-regulação da produção de interferão do tipo I através da ligação de BDCA-2, sub-regulação de respostas imunitárias Thl através da ligação de BDCA-2 e polarização de uma resposta imunitária para Th2 através da ligação de BDCA-2. Estas indicações podem ser invertidas interferindo com a ligação de BDCA-2. A invenção inclui ainda pesquisar porções adequadas para interferir com a ligação de BDCA-2 e composições destas porções.
Quando se utilizam fragmentos de ligação ao antigénio em combinação com vários agentes terapêuticos, a administração de ambos ocorre normalmente de forma substancialmente contemporânea. O termo "substancialmente contemporâneo" significa que são administrados razoavelmente próximo um do outro, em termos de tempo. A administração de um agente terapêutico pode ser diária, ou a qualquer outro intervalo adequado, dependendo de factores como, por exemplo, a natureza do alimento, a condição do paciente e semivida do agente.
As composições terapêuticas podem ser administradas por injecção ou por perfusão gradual ao longo do tempo. Os fragmentos de ligação ao antigénio podem ser administrados intravenosamente, intraperitonealmente, intramuscularmente, subcutaneamente, intracavidade, intranodal, intratecal ou transdermicamente, isolados ou em combinação com outros agentes terapêuticos.
Outro método de administração é intralesionalmente, por exemplo por injecção directamente no tumor. A administração intralesional de várias formas de imunoterapia a pacientes de cancro não causa a toxicidade observada com a administração sistémica de agentes imunológicos. Fletcher et al. (1987) Lymphokine Res. 6:45; Rabinowich et al. (1987) Câncer Res. 76
ΕΡ 1 301 539 /PT 47:173; Rosenberg et al. (1989) Science 233:1318; e Pizz et al. (1984) J. Int. Câncer 34:359.
Além disso, poderá ser desejável administrar as composições localmente na área em necessidade de tratamento, o que pode ser conseguido, por exemplo, por infusão local durante a cirurgia, por injecção, por meio de um cateter, ou por meio de um implante, sendo o implante um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, tais como membranas silásticas ou fibras. Uma membrana deste tipo adequada é Gliadel® fornecida pela Guilford Sciences. O facto de a ligação de BDCA-2 com o anticorpo monoclonal anti-BDCA-2 (AC144) induzir a mobilização de Ca2+ intracelular indica que a DC plasmocitóide (e todas as outras células que expressam BDCA-2) pode ser funcionalmente modulada desencadeando a sinalização de BDCA-2 ou inibindo o desencadeamento da sinalização de BDCA-2. Em relação à modulação funcional de DC, os aspectos seguintes são abrangidos pelas reivindicações: A) Indução e sub-regulação de respostas de células T CD4+ e CD8+. B) Polarização da resposta imunitária no sentido da tolerância ou imunidade C) Polarização de respostas de células T CD4+ no sentido do desenvolvimento de células Thl, desenvolvimento de células Th2 ou desenvolvimento de células T Th3/T-reguladoras 1 CD4+. Estas últimas sub-regulam respostas imunitárias, possivelmente através da secreção de TGF-β e/ou IL-10. D) As DC são normalmente consideradas como células que apresentam antigénios para células T. No entanto, estudos recentes de vários laboratórios mostraram que têm papéis importantes na activação de células B e regulação da síntese de anticorpos. As respostas de células B podem assim ser moduladas através de BDCA-2 em DC. O mesmo também pode ser verdade para as respostas de células NK.
Uma vez que o interferão do tipo 1 pode induzir respostas imunitárias do tipo Thl em humanos (Parronchi et al. (1996) Eur. J. Immunol. 26:697-703), desencadear BDCA-2 polariza as respostas de células T CD4+ no sentido do desenvolvimento de 77
ΕΡ 1 301 539 /PT células Th2, enquanto que a inibição da sinalização de BDCA-2 polariza as respostas de células T CD4+ no sentido do desenvolvimento de células Thl. A invenção inclui assim a polarização de respostas de células τ CD4+ para o desenvolvimento de células Th2 ou Thl, desencadeando a sinalização de BDCA-2 ou inibindo o desencadear da sinalização de BDCA-2, respectivamente.
Exemplo 1
Produção de mAc específicos para DC 78
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Corp., Portland, OR) e PBMC com 50 μΐ de sobrenadante de hibridoma, durante 20 min à temperatura ambiente. A mistura de pérolas/células foi então lavada duas vezes com PBS, pH 7,4, contendo EDTA 5 mmol/L e BSA a 0,5% (PBS/EDTA/BSA), e ligação de IgM, IgGl, IgG2a e IgG2b de ratinho dos sobrenadantes às pérolas e as células de teste foram detectadas por coloração com mAc de rato anti-lgM de ratinho conjugado com PE (clone X54, BD Biosciences, San Jose, CA), mAc de rato anti-IgGl de ratinho (clone X56, BD Biosciences) e mAc de rato anti-igG2 de ratinho (clone X57, BD Biosciences) . Os PBMC e pérolas de poliestireno podem ser facilmente discriminados na análise de citometria de fluxo, por sinais de dispersão.
Os sobrenadantes de cultura gue preencheram os critérios de pesguisa do primeiro ciclo foram em seguida pesguisados por análise de citometria de fluxo quanto à reactividade para uma proporção significativa de DC sanguíneas. Em resumo, incubou-se uma mistura de pérolas de poliestireno conjugadas com mAc de rato anti-ratinho e DC sanguíneas enriquecidas (PBMC esgotadas em células B, células T e monócitos) com 50 μΐ de sobrenadante de hibridoma durante 20 min, à temperatura ambiente. A mistura foi em seguida lavada duas vezes com PBS/EDTA/BSA, e corada com mAc de rato anti-lgM de ratinho conjugado com PE, mAc de rato anti-IgGl de ratinho e mAc de rato anti-IgG2 de ratinho para detectar a ligação de IgM, IgGl, IgG2a e IgG2b de ratinho dos sobrenadantes às pérolas e DC sanguíneas enriquecidas. Para discriminação entre DC HLA-DR+ e células HLA-DR~ na análise de citometria de fluxo, a mistura de pérolas/células foi lavada uma vez, os locais de ligação livres do mAc de rato anti-lgG2 de ratinho conjugado com PE e o mAc de rato anti-κ de ratinho conjugado com pérolas foram saturados por incubação com 100 pg/ml de IgG2a de ratinho durante 5 min à temperatura ambiente e a mistura foi contra-corada com anti-HLA-DR-FlTC (cloneAC122, lgG2a).
As células de hibridoma seleccionadas foram expandidas em cultura, congelaram-se reservas em azoto líquido, estabeleceram-se subclones por diluição limitante e também se congelaram em azoto líquido séries de subclones positivos. O isotipo do mAc foi determinado pelo kit ISOTYPE Ab-STAT (SangStat Medicai Corp., Paio Alto, CA). 79
ΕΡ 1 301 539 /PT
Para produção de mAc, as células de hibridoma ou foram crescidas como tumor de ascites em ratinhos Balb/c com recolha de fluido de ascites rico em mAc, ou em cultura de células (cultura giratória ou em fibra oca) com recolha do sobrenadante de cultura rico em mAc. Preparou-se mAc IgG puro a partir do fluido de ascites ou sobrenadante de cultura de células por cromatografia de afinidade de proteína A, seguido nalguns casos de cromatografia de interacção hidrófoba e armazenado em PBS com edta 5 mmol/1 e azida de sódio a 0,05%, a 4°C. O mAc purificado foi conjugado a FITC (Sigma, St. Louis, MO), PE (Cyanotech Corp., Kailua Kona, Hl), Cy5 (Amersham Life Science Inc., Arlington Heights, IL), APC (Europa Bioproducts Ltd., Cambridge, RU), biotina (Pierce, Rockford, IL) e pérolas super-paramagnéticas coloidais (de aproximadamente 50 nm de diâmetro, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemanha) de acordo com técnicas convencionais. Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques. Academic Press Inc., San Diego, 785 pp.; Aslam et al. (1998) Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical Sciences. Macmillan Reference Ltd., London, 833 pp.; e Kantor et al. (1997) Magnetic cell sorting with colloidal superparamagnetic particles. Em, Cell Separation Methods and Applications. Recktenwald et al. Eds. Mareei Dekker Inc. Nova Iorque, pp. 153-173.
Preparações de células
Obteve-se a película amarela de voluntários saudáveis normais do Institute for Transfusionmedicine, Hospital Merheim, Colónia, Alemanha. Os PBMC foram preparados a partir da película amarela por centrifugação convencional em gradiente de densidade de Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Suécia).
Os leucócitos de sangue periférico foram preparados a partir da película amarela por lise de eritrócitos em tampão cloreto de amónio isotónico (NH4C1 155 mmol/L, KHCO3 10 mmol/L e EDTA 0,1 mM). Hansel et al. (1991) J. Immunol. Met. 145:105-110. Isolaram-se DC sanguíneas CD4+lin~ a partir de PBMC por discriminação imunomagnética de células de dois passos (MACS), como descrito em detalhe noutros trabalhos. Robert et al. (1999); e Miltenyi et al. (1999) High gradient magnetic cell 80
ΕΡ 1 301 539 /PT sorting. em, Flow cytometry and cell sorting. Ed., Radbruch. Springer-Verlag, Berlim, pp. 218-247. Em resumo, os monócitos, células T e células NK foram eliminados utilizando mAc contra CD3 (Clone BW264/56), CDllb (clone MI/70.15.11.5), CD16 (Clone VEP-13) e nalgumas experiências um antigénio fracamente definido expresso em células B e monócitos (clone L179) . A partir da fracção de células esgotada, as DC sanguíneas foram em seguida enriquecidas até uma pureza elevada utilizando um anticorpo contra CD4 (M-T321). Para pesquisar sobrenadantes de cultura de hibridomas (veja-se acima), as DC sanguíneas foram apenas parcialmente enriquecidas por depleção imunomagnética de células T, células B e monócitos, baseada na expressão de antigénio CD3 e L179.
As células que expressam CDlc, BDCA-2 e BDCA-3 foram isoladas a partir de PBMC ou amígdalas por marcação magnética indirecta com mAc conjugado com PE ou FITC (AD5-8E7, AC144 e AD6-5E8, respectivamente) como reagente primário e micropérolas conjugadas com mAc anti-PE ou anti-FlTC (Miltenyi Biotec GmbH) como reagente secundário e enriquecimento de células marcadas por MACS. Nalgumas experiências, as células BDCA-3+ foram isoladas com base na marcação magnética directa com micropérolas conjugadas com mAc anti-BDCA-3 (AD5-5E8) . Obtiveram-se DC sanguíneas CDlc+ de pureza elevada sem células B CDlc+ B contaminantes por depleção imunomagnética de células B CD18+ utilizando micropérolas conjugadas com mAc CD19 (Miltenyi Biotec GmbH) seguido de enriquecimento imunomagnético de células CDlc+. Os basófilos foram purificados a partir de PBMC por depleção imunomagnética de não-basófilos baseada na marcação magnética indirecta de células que expressam CD3, CD7, CD14, CD15, CD36, CD45RA e HLA-DR com um kit de marcação magnética (Miltenyi Biotec) . Os monócitos CD14+, células progenitoras hematopoiéticas CD34+ e células T CD3+ foram purificadas imunomagneticamente com base na marcação magnética directa com micropérolas conjugadas com mAc CD14, CD34 e CD3 (Miltenyi Biotec GmbH), respectivamente.
Cultura de células
Para a produção de DC derivadas de monócitos "imaturas" (Mo-DC), cultivaram-se monócitos CD14+ purificados a uma densidade celular de 5 x 105 a 1 x 106 células/ml em meio 81
ΕΡ 1 301 539 /PT
[RPMI 1640 (Gibco/BRL) suplementado com L-glutamina 2 mmol/L, FCS a 10% (Sigma), piruvato de sódio 100 mmol/L (Gibco/BRL), penicilina 100 U/ml (Gibco/BRL), e estreptomicina 100 pg/ml (Gibco/BRL)] a 37°C numa atmosfera humidificada contendo CO2 a 5%, na presença de rIL-4 500-1000 U/ml (PeproTech, Rocky Hill, NJ) e rGM-CSF 100 ng/ml (PeproTech) durante 7 dias. Para a produção de Mo-DC "maduras", as Mo-DC "imaturas" foram lavadas uma vez e cultivadas em meio na presença de TNF-a 20 ng/ml (PeproTech) por mais 3 dias. Para a produção de DC derivadas de células progenitoras hematopoiéticas CD34+ (CD34-DC), fez-se a cultura de células CD34+ purificadas a uma densidade celular de 5 x 104 células/ml em meio na presença de ligando rFlt3 100 ng/ml (PeproTech), rTGF-βΙ 0,5 ng/mL (PeproTech), rTNF-a 10 ng/ml, rSCF 20 ng/ml (PeproTech) e rGM-CSF 100 ng/ml durante 11 dias. As DC sanguíneas CD4+lin~ isoladas de fresco foram cultivadas a uma densidade celular de 5 x 105 a 1 x 106 células/ml em meio, na presença de rlL-3 10 ng/ml (PeproTech) durante até 48 h. As DC que expressam CDlc, BDCA-2 e BDCA-3 isoladas foram cultivadas a uma densidade celular de 5 x 105 a 1 x 106 células/ml num meio sem quaisquer citóquinas, ou na presença de rIL-3 10 ng/ml, IL-4 20 ng/ml (PeproTech) e GM-CSF 100 ng/ml durante até 48 h.
Exemplo 2
Análise de citometria de fluxo de DC sanguíneas
Utilizou-se um FACScalibur (BD Biosciences) para citometria de fluxo de uma, duas, três ou quatro cores. Adquiriram-se dados de 5 x 103 a 2 x 105 células por amostra no modo de listagem e analisaram-se utilizando o programa CellQuest (BD Biosciences).
Utilizaram-se neste estudo, para a citometria de fluxo, os seguintes mAc (nomes dos clones): CDla (Hl14 9), CD10 (HllOa), CDlla (G43-25B), CDllc (B-ly6), CD25 (M-A261), CD27 (M-T271), CD32 (FL18.26), CD38 (HIT2), CD40 (5C3), CD43 (IG10), CD54 (HA58), CD62L (Dreg 56), CD64 (10.1), CD69 (FN50), CD98 (UM7F8), anti-HLA-DQ (TU169), e anti-TCRap T10B9.1A-31 da PharMingen, San Diego, CA; CD2 (S5.2), CD8 (SKI), CD13 (L13 8), CD14 (MFP9), CD19 (SJ25-C1), CD33 (P67.6), CD34 (8G12) , CD45RO (UCHL-1), CD56 (NCAM16.2), CD71 (L01.1), CD123 (9F5), anti-lgD (TA4.1), anti-IgGl de ratinho (X56), 82 ΕΡ 1 301 539 /PT anti-IgG2 de ratinho (X57), e anti-lgM de ratinho (X54) da BD Biosciences; CD5 (CLB-Tll/11, 6G4), CD7 (CLB-T-3A1/1, 7F3), CD16 (CLB-FcR gran/1, 5D2), CD45RA (F8-11-13), CD80 (CLB-DALI) da CLB, Amsterdam, Holanda; CD18 (7E4), CD23 (9P25); CD58 (AICD58), CD77 (38.13), CD83 (HB15A), CD86 (HA5.2B7), CD116 (SCO 6) da Coulter Immunotech, Marseilles, França; CD4 (M-T321), CDllb (Ml/70.15.11.5), CD14 (TUK4), CD15 (VIMC6), anti-HLA-DR (910/D7), anti-AC133 (AC133/1), e anti-TCRap (BW242/412) da Miltenyi Biotec GmbH, CD36 (AC106), CD123 (AC145), anti-HLA-DR (AC122 e AC123) e anti-GPA (AC107) da Amcell, Sunnyvale, CA; CDlc (M241) da Ancell, Bayport, MN; anti-IgG, anti-lgM policlonal (SA-DA4), anti-capa policlonal, e anti-lambda policlonal da Southern Biotechnology Associates, Birmingham, Alabama; CD61 (VIPL2) do W. Knapp, Institute of Immunology, University of Vienna, Vienna, Áustria; CD44 (IM7) da J. Moll, Forschungszentrum Karlsruhe, Karlsruhe, Alemanha; CD20 (H147) da Caltag Laboratories, Burlingame, CA; anti-CLA (HECA-452) da E. Butcher, Department of Pathology, Stanford University, Stanford, CA; anti-Fc£Rl (15-1) do J.P. Kinet, Molecular Allergy and Immunology Section, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Rockville, Maryland; CDllc (Ki-Ml) da M.R. Parwaresch, Department of Pathology, Christian Albrechts University, Kiel, Alemanha; CMRF-44 e CMRF-56 do D.N. Hart, Mater Medicai Research Institute, Mater Misericordiae Hospitais, South Brisbane, Queensland, Austrália; e anti-HLA-A, -B, -C (W6/32) da Sigma.
Todos os anticorpos foram utilizados como mAc conjugados com FITC, PE, biotina ou Cy5. Para coloração imunofluorescente indirecta com mAc biotinilado, utilizou-se estreptavidina-APC (BD Biosciences). Para excluir células mortas na análise de citometria de fluxo, as células foram coradas com iodeto de propidio. Para minimizar a ligação de mAc mediada pelo receptor de Fc as células foram coradas na maioria das experiências na presença de reagente bloqueador de FcR (Miltenyi Biotec GmbH) contendo igG humana.
Análise microscópica
As células foram centrifugadas em lâminas numa citocentrifuga (Cytospin 3, Shandon, Pittsburgh, PA) . Para microscopia de fluorescência as lâminas foram secas ao ar 83 ΕΡ 1 301 539 /PT durante a noite, após citocentrifugação e montadas com Fluoromount G (Southern Biotechnology Associates). Para coloração com May Grunwald/Giemsa as lâminas foram secas ao ar durante pelo menos 2 h, após citocentrifugação, coradas em solução de May Grunwald/Giemsa (Merck, Darmstadt, Alemanha) durante 2 min à temperatura ambiente, bem lavadas em água destilada, coradas em solução de Giemsa (Merck) durante 15 min à temperatura ambiente, lavadas repetidamente em água destilada e secas ao ar durante pelo menos 2 h. Utilizou-se um microscópio Zeiss Axioscop (Zeiss, Oberkochen, Alemanha) para análise. As imagens digitais foram obtidas utilizando o Xillix Microlmager M11400-12X (Xillix, Vancouver, Canadá).
Exemplo 3
Análise de inibição cruzada, co-capping e co-internalização
Para analisar se dois clones de mAc diferentes reconhecem o mesmo (ou com relação estreita) epítopo de antigénio, fizeram-se testes de ligação de inibição cruzada. Incubaram-se previamente entre 1 x 106 e 2 x 106 células com um dos clones de mAc, a uma concentração de cerca de 100 pg/ml durante 10 min a 4°C e em seguida corou-se com um conjugado de PE de outro clone de mAc no seu titulo óptimo, por mais 5 min a 4°C. Utilizaram-se os PBMC para analisar a inibição cruzada de clones de mAc específicos para BDCA-2, BDCA-3 e BDCA-4 e utilizaram-se células MOLT-4 para analisar a inibição cruzada de clones de mAc específicos para CDlc. Analisou-se a coloração de células por citometria de fluxo.
Para determinar se o AD5-5E8 e o AD5-14H12 reconhecem o mesmo antigénio (ou o mesmo complexo de antigénio) fez-se um teste de co-capping. Em resumo, as células que expressam BDCA-3 foram isoladas de PBMC por marcação magnética indirecta com mAc AD5-14HI2 conjugado com PE e micropérolas conjugadas com mAc anti-PE e as células isoladas foram incubadas durante 30 min a 37°C para induzir o capping do complexo mAc-antigénio. Em seguida, as células foram lavadas com PBS/EDTA/BSA arrefecido em gelo suplementado com azida de sódio a 0,1% (PBS/EDTA/BSA/azida), e coradas com mAc AD5-5E8 conjugado com FITC em PBS/EDTA/BSA/azida durante 10 min a 4°C. A coloração de células foi analisada por microscopia de fluorescência. 84
ΕΡ 1 301 539 /PT Ο teste de co-internalização foi utilizado para investigar se o AC144 e AD5-17F6 reconhecem o mesmo antigénio (ou o mesmo complexo de antigénio). Em resumo, incubaram-se 1 x 106 PBMC com 50 pg/ml de mAc AC144 durante 15 min à temperatura ambiente em PBS/BSA, lavou-se duas vezes em PBS/BSA e em seguida incubou-se em meio de cultura de células a 37°C durante 30 min. Para analisar se o mAc AC144 é internalizado aquando da cultura, coraram-se aliquotas das células antes e depois do período de cultura com anticorpo de rato anti-IgGl de ratinho-PE. Para determinar se todos os locais de ligação ao mAc AC144 estavam saturados com mAc AC144 não conjugado antes da cultura e se quaisquer locais de ligação livres reaparecem após a cultura, coraram-se aliquotas de células antes e depois do período de cultura com AC144-PE. Para analisar se o antigénio AD5-17F6 é co-internalizado, coraram-se aliquotas antes e depois do período de cultura com AD5-17F6-PE. Todas as células foram contra-coradas com CD123-FITC e HLA-DR-Cy5 para serem capazes de discriminar DC plasmocitóides CDl23brightHLA-DR+ na análise de citometria de fluxo.
Exemplo 4
Teste de endocitose
Para determinar a endocitose de subconjuntos de DC sanguíneas, incubaram-se DC sanguíneas CDlc+, BDCA-2+ e BDCA-3+ purificadas e células T CD3+ purificadas (como controlo) a 37°C, em meio com amarelo Lucifer (LY) 1 mg/ml durante 0, 15, 45, e 75 min. Em seguida, as células foram lavadas três vezes em PBS/EDTA/BSA arrefecido em gelo e analisadas por citometria de fluxo.
Exemplo 5
Reactividade de DC sanguíneas isoladas com células sanguíneas não cultivadas
De acordo com a sua reactividade com células sanguíneas, os mAc enumerados na Tabela 1 puderam ser divididos em quatro grupos: (1) AC144, AD5-13A11 e ADB-4B8; (2) AD5-17F6; (3) AD5-5E8 e AD5-14H12; e (4) AD5-8E7. 85
ΕΡ 1 301 539 /PT OS mAc do primeiro grupo, AC144, AD5-13A11 e ADB-4B8, coram aproximadamente 0,41 ± 0,17% (n = 10) de todos os PBMC (Figura IA) . Num gráfico de pontos de sinais de dispersão frontal e lateral, estas células raras constituem uma população de células homogénea que se localiza entre linfócitos e monócitos em repouso, pequenos (Figura 1B). Deste modo, estas células raras não expressam o receptor de
células T αβ (TCRaP). Marcadores de linhagem CD14, CD19 e CD56 (Figura IA), que são expressos em células T, monócitos, células B e células NK, respectivamente. A coloração de DC sanguineas altamente purificadas (>95% HLA-DR+, TCRap~, CD14~, CDl9~ e CD56“) revela que os mAc do primeiro grupo são reactivos com DC sanguineas CDllc~CDl23bright (Figura 2), mas não são reactivos com DC sanguineas CDllc+. Para analisar se todas elas reagem com um único antigénio, fizemos colorações de duas cores e estudos de inibição cruzada. Os resultados mostram que todos os mAc deste grupo reconhecem um único epitopo do mesmo antigénio. Este antigénio foi designado por BDCA-2.
Como se pode ver na Figura 3, o mAc do segundo grupo, AD5-17F6, reconhece as mesmas células entre PBMC como AC144, um dos mAc específicos de BDCA-2 do primeiro grupo. Apesar de tudo, o AD5-17F6 cora um antigénio que é diferente de BDCA-2. Isto foi inequivocamente demonstrado por experiências de co-internalização, em que o AD5-17F6 apresentava coloração de superfície com uma intensidade igual, antes e depois da internalização de BDCA-2 mediada por mAc anti-BDCA-2 e por coloração de DC após a cultura, em que o mAc AC144 e mAc AD5-17F6 apresentavam padrões de coloração totalmente diferentes (Figura 4). O antigénio reconhecido por AD5-17F6 foi designado por BDCA-4 e é idêntico a neuropilina-1. He et al. (1997).
Os mAc do terceiro grupo AD5-5E8 e AD5-14H12 coram aproximadamente 0,04 ± 0,01% (n=10) de todos os PBMC (Figura IA) . De acordo com os sinais de dispersão (Figura 1B) e contra-coloração com mAc contra os TCRap, CD14, CD19 e CD56 (Figura IA), estas células são diferentes de linfócitos e monócitos e ligeiramente maiores do que as células reconhecidas pelos anticorpos do primeiro grupo. Deste modo, a coloração com DC sanguíneas mostra que um diferente subconjunto é reconhecido por AD5-5E8 e AD5-14H12, 86
ΕΡ 1 301 539 /PT nomeadamente DC sanguíneas CDllcdimCDl23~ (Figura 2). De acordo com colorações de duas cores, os estudos de bloqueio cruzado e experiências de co-capping, ambos os mAc parecem reconhecer dois epítopos espacialmente não relacionados do mesmo antigénio. Designámos este antigénio por BDCA-3. O quarto grupo, mAc AD5-8E7, reage com até 2,39 ± 0,96% (n = 10) dos PBMC não fraccionados (Figura IA) . A análise de dispersão de luz (Figura 1B) e contra-coloração dos marcadores de linhagem TCR-αβ, CD14, e CD19 revelou que o mAc não é reactivo com células T e monócitos, mas é reactivo com um subconjunto principal de células B CD19+ em repouso, pequenas. A coloração de DC purificadas mostra que o AD5-8E7, além das células B, cora um terceiro conjunto de DC sanguíneas diferente dos subconjuntos reconhecidos pelo mAc do primeiro e do segundo grupo, nomeadamente DC sanguíneas CDllcbrightCD123dim. Uma proporção significativa das DC sanguíneas CDllCbrightCDl23d;Lm expressa CD56 (veja-se a seguir). Por este motivo, alguns PBMC reactivos com AD5-8E7 coram para CD56 (Figura IA) . O AD5-8E7 não reage com células NK purificadas. O antigénio reconhecido por AD5-8E7 foi inicialmente designado por BDCA-1 uma vez que parecia ser um novo antigénio. No entanto, mais tarde verificou-se que o AD5-8E7 bloqueia completamente a ligação do mAc de CDlc, M241 a células MOLT-4 (Figura 6). Assim, o antigénio reconhecido por AD5-8E7 é CDlc.
Nenhum dos mAc listados na Tabela 1 é reactivo com granulócitos, plaquetas, eritrócitos, basófilos purificados e células progenitoras hematopoiéticas CD34+ purificadas.
Exemplo 6
Expressão de BDCA-2, BDCA-3 e BDCA-4 em DC sanguíneas Mo-DC e CD34-DC cultivadas
As DC sanguíneas CDllc~ plasmocitóides isoladas de fresco dependem de IL-3 para sobreviver e maturar, enquanto que a sobrevivência e maturação de DC sanguíneas CDllc+ é muito menos dependente de citóquinas. A expressão de BDCA-2, BDCA-3 e BDCA-4 em DC sanguíneas CDllc~ e CDllc+ foi analisada após 0 h, 1 h, 3 h, 6 h, 9 h, 12 h, 18 h, 24 h, 36 h, e 48 h de cultura das DC sanguíneas totais, na presença de rIL-3. Os resultados são apresentados na Figura 4. A expressão de BDCA-2 87
ΕΡ 1 301 539 /PT
é completamente sub-regulada no espaço de 48 h em DC sanguíneas CDllc". Pelo contrário, o BDCA-4 é ainda mais supra-regulado em DC sanguíneas CDllc- e, ao contrário do BDCA-2, também é expresso a um nível elevado na maioria, senão todas as DC CDllc+. A expressão de BDCA-3 é rapidamente induzida em DC sanguíneas CDllc-, atingindo o nível de expressão mais elevado após 24 h. Em seguida, a expressão de BDCA-3 parece ser sub-regulada mais uma vez. A análise da expressão de bdca-3 em DC sanguíneas CDllc+ é complicada pelo facto de os subconjuntos BDCA-3-CDllcbright e BDCA-3+CDllcdim estarem presentes no início da cultura. A expressão de BDCA-3 permanece inalterada pelo menos até 6 h de cultura na população de DC sanguíneas BDCA-3+CDllcdim e é induzida no espaço de 3 h em pelo menos algumas células do subconjunto de DC sanguíneas BDCA-3-CDllcbright.
Expressão de BDCA-2, BDCA-3 e BDCA-4 em Mo-DC e CD34"DC
Produziram-se DC CDla+ funcionais ex vivo a partir de monócitos e células progenitoras hematopoiéticas CD34+. Bender et al. (1996); Pick] et al. (1996; Romani et al. (1994); Sallusto et al. (1994); Caux et al. (1992); Mackensen et al. (1995); Szabolcs et al. (1995); Herbst et al. (1996); de Wynter et al. (1998); e Strunk et al. (1996). A Figura 7 mostra que as Mo-DC, que foram produzidas por cultura de monócitos durante 7 dias na presença de rGM-CSF e il-4 e CD34-DC, produzidas por cultura de células progenitoras hematopoiéticas CD34+ durante 11 dias na presença de ligando rFlt3, rTGF-βΙ, rTNF-α, rSCF e rGM-CSF, expressam CDla, CDlc e BDCA-4, mas nem BDCA-2, nem BDCA-3.
Exemplo 7
Internalização de BDCA-2 por reticulação mediada por mAc anti-BDCA-2 A possibilidade de a incubação a 37°C de células BDCA-2+ marcadas com mAc anti-DCA-2 resultar na internalização de mAc foi analisada por coloração de PBMC com mAc AC144 (IgGl) conjugado com FITC. Em seguida, após incubação a 37°C, os mAc associados à superfície celular remanescentes foram detectados por coloração com mAc de rato anti-IgGl de ratinho conjugado com PE. Como se pode ver na Figura 8, quando as células foram incubadas a 37°C, a intensidade de coloração do anticorpo de 88
ΕΡ 1 301 539 /PT rato anti-IgGl de ratinho-PE diminuiu de forma extremamente rápida para níveis de ruído de fundo. Pelo contrário, a intensidade da coloração de AC144-FITC diminuiu apenas temporariamente para um nível de aproximadamente 50%, mas em seguida retorna praticamente para o nível de pré-incubação. Isto demonstra que o BDCA-2 é internalizado por reticulação de mAc anti-BDCA-2 com cinéticas semelhantes à endocitose mediada por receptores. A diminuição transitória na intensidade de coloração de AC144-FITC é provavelmente devida a patching e capping do complexo BDCA-2/mAc anti-BDCA-2 antes da endocitose.
Exemplo 8
Morfologia de DC sanguíneas CDlc+, BDCA-2+ e BDCA-3+ isoladas
As células CDlc+, BDCA-2+ e BDCA-3+ foram isoladas de PBMC por marcação magnética indirecta com mAc primários conjugados com PE e micropérolas conjugadas com Ac anti-PE e enriquecimento de células marcadas por MACS (Figura 9) . Por coloração com May Grunwald/Giemsa de lâminas de citocentrifuga (Figura 9), as células que expressam BDCA-2 isoladas de fresco apresentam a morfologia linfoplasmocitóide típica de DC CDllc” CD4+lin” de sangue e amígdalas: isto é, células redondas de tamanho médio, com núcleos ovais ou indentados. Pelo contrário, quer as DC sanguíneas CDlc+ isoladas de fresco, quer as DC sanguíneas BDCA-3+ isoladas de fresco apresentam as características morfológicas típicas de DC CDllc+CD4+lin“ de sangue ou amígdalas: isto é, células menos redondas com processos celulares curtos e núcleos mais hiper-lobulados. Além das células BDC CDlc+, podem-se observar células B CDlc+ com a morfologia típica de linfócitos em repouso pequenos nas lâminas de citocentrifuga de PBMC CDlc+ isolados. Obtêm-se BDC CDlc+ altamente puras se antes do enriquecimento de células CDlc+, as células B CD19+ forem magneticamente esgotadas das PBMC .
Exemplo 9
Fenótipo de superfície de DC sanguíneas CDlc+, BDCA-2+ e BDCA-3+ O fenótipos de DC sanguíneas BDCA-2+ e BDCA-3+ foi analisado por imunofluorescência de duas cores com mAc conjugado com PE e FITC. Para análise de DC sanguíneas CDlc+, 89
ΕΡ 1 301 539 /PT fizeram-se colorações de três cores utilizando CD19-Cy5 para exclusão de células B. Os resultados da análise fenotipica são apresentados na Tabela 2 e podem ser resumidos como se segue: nenhum dos subconjuntos de DC sanguíneas expressa CDla, CD8, CD15, CD16, CD19, CD20, CD23, CD25, CD27, CD34, CD61, CD69, CD7.1, CD77, CD80, CD83, glicoforina A (GPA), TCRap, AC133, igD, IgM e o antigénio CMRF-56. Todos os subconjuntos de DC sanguíneas expressam CD43, CD44, CD54 e moléculas de MHC de classe I a um nível semelhante. As DC sanguíneas BDCA-2+ diferem dos outros dois subconjuntos na medida em que não expressam CD13, CD40, CD45RO, CD56, mas CD45RA e pequenas quantidades de CD10, e expressam níveis mais baixos de CD18, CD38, CD58, CD98, CD116 e CLA, mas níveis mais elevados de CD4. As DC sanguíneas CDlc+ diferem dos outros dois subconjuntos, na medida em que expressam CD2, níveis mais elevados de moléculas de MHC de classe II, mas níveis mais baixos de CD62L, e expressam os receptores de Fc CD32, CD64 e
FcsRl. Provavelmente devido à expressão do receptor de Fc, as DC sanguíneas CDlc+ também são positivas para igG, capa e lambda. Além disso, algumas DC CDlc+ são positivas para CD14 e CDllb sendo que o nível de expressão se correlaciona inversamente com o nível quer da expressão de CDlc, quer de CD2. As DC sanguíneas BDCA-3+ diferem dos outros dois subconjuntos, na medida em que expressam CD36 a um nível muito inferior e parecem expressar níveis baixos de CD5. Por fim, além de CDllc e CD123, pelo menos um antigénio adicional, CD33, é útil para discriminação de todos os três subconjuntos: o CD33 é expresso a níveis baixos em DC BDCA-2+, a níveis intermédios em DC BDCA-3+ e a níveis elevados em DC CDlc+.
Tabela 2
Antigénio Clone BDCA-2+ BDCA-3+ CDlc+ CDla HI149 - - - CDlc M241 - - + CD2 S5.2 “/subconj.menor+ - + CD4 M-T321 + + + + CD5 CLB-T1/1, 6G4 - 7+ - CD7 CLB-T3A1, 7F3 7 subconj,menor+ + CD8 SKI - - - CD10 HllOa - /+ - - CDlla G43-25B + ++ + 90
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Antigénio Clone BDCA-2+ BDCA-3+ CDlc+ CDllb Ml/70.15.11.5 - - 7 + CDllc Ki-Ml - + ++ CD13 L138 - + + CDl 4 TUK4 - - 7 + CD15 VIMC6 - - - CD16 CLB-FcR Gran/1 CD18 7E4 + + + ++ CD19 SJ25-C1 - - - CD20 HI47 - - - CD23 9P25 - - - CD25 M-A251 - - - CD27 M-T271 - - - CD32 FL18.26 (2003) + CD33 P6 7.6 7 + + ++ CD34 8G12 - - - CD36 AC106 + 7 + + CD38 HIT2 + ++ ++ CD40 FC3 - 7 + 7 + CD43 1G10 + + + CD44 IM7 + + + CD45RA F8-11-13 + - - CD45RO UCHL-1 - + + CD54 HA58 + + + CD56 NCAM16.2 - 7subcon j. + 7subcon j. + CD58 AICD58 + + + + + CD61 VIPL2 - - - CD62L DREG56 - + + CD64 10.1 + + + + + CD69 FN50 - - - CD71 LOl.l - - - CD77 38.13 - - - CD80 DAL-1 - - - CD83 HB15A - - - CD86 HA5.2B7 + + + +++ CD98 HIM6 + + + + + +++ CD116 SC06 + + + + + 91
ΕΡ 1 301 539 /PT
Antigénio Clone BDCA-2+ BDCA-3+ CDlc+ CD123 AC145 + + - + HLA-DR AC122 + + + + HLA-DQ TU169 + + + + HLA-A,B,C W6/32 + + + GPA AC107 - - - TCRoíP T10B9.1A-31 - - - AC133 AC133 - - - FcsR I 15-1 - - + IgD TA4.1 - - - IgG policlonal - - + IgM SA-DA4 - - - Capa policlonal - - + Lambda policlonal - - + CLA HECA-452 + + + + + +++ CMRF44 CMRF44 /subconj.menor+ CMRF56 CMRF56 - - -
Exemplo 10
Expressão de mhc de classe II, CD83 e moléculas co-estimuladoras em DC sanguíneas CDlc+, BDCA-2+ e BDCA-3+ após cultura
Fez-se a cultura de DC sanguíneas CDlc+ e DC sanguíneas BDCA-3+ isoladas de fresco durante 1 dia em meio sem quaisquer citóquinas suplementadas e as DC sanguíneas BDCA-2+ isoladas de fresco foram cultivadas durante 2 dias em meio suplementado com IL-3 e mAc CD40 em fibroblastos transfectados com CD32. Após o período de cultura, as células foram analisadas quanto à expressão de CDla, CD80, CD83, CD86 e HLA-DR. Para
comparação, as designadas Mo-DC "imaturas", produzidas por cultura de monócitos durante 7 dias na presença de GM-CSF e IL-4 e as designadas Mo-DC "maduras", produzidas por cultura de Mo-DC "imaturas" durante 3 dias na presença de TNF-a, também foram incluídas. Sallusto et al. (1995) J. Exp. Med. 182:389-400; e Sallusto et al. (1998) J. Immunol. 28:2760-2769. Como se pode ver na Figura 10, ao contrário das Mo-DC "imaturas" e Mo-DC "maduras", nenhum dos subconjuntos de DC 92
ΕΡ 1 301 539 /PT sanguíneas expressa CDla após o período de cultura. No entanto, as moléculas co-estimuladoras CD80 e CD86, o antigénio de activação de DC CD83 (Zhou et al. (1995); Zhou et al. (1992) J. Immunol. 149:735-742; e Zhou et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:2588-2592), e as moléculas HLA-DR são supra-reguladas por cultura em todos os três subconjuntos de DC sanguíneas, a um nível semelhante, em comparação com Mo-DC maduras. Os resultados não eram significativamente diferentes noutra experiência em que todos os três subconjuntos de DC sanguíneas foram cultivados durante 2 dias em meio suplementado com IL-3, IL-4 e GM-CSF. Tal como foi anteriormente mostrado para DC CDllc”CD4+lin" de sangue e amígdalas, as DC sanguíneas BDCA-2+ morrem rapidamente quando cultivadas em meio sem IL-3.
Exemplo 11
Capacidade endocítica de DC sanguíneas CDlc+, BDCA-2+ e BDCA-3+ isoladas de fresco A capacidade endocítica das DC sanguíneas CDlc+, BDCA-2+ e BDCA-3+ purificadas e, como controlo, de células T CD3+ purificadas foi analisada por cultura das células a 37°C na presença de LY e análise da incorporação de LY após vários períodos de tempo por citometria de fluxo. Como se pode ver na Figura 11, ao contrário das células T CD3+ purificadas, as DC sanguíneas CDlc+ purificadas, DC sanguíneas BDCA-3+ e, nalguma extensão, também as DC sanguíneas BDCA-2+ têm a capacidade de endocitar LY. Obtiveram-se resultados semelhantes utilizando FITC-Dextrano. As capacidades endocíticas de todas as populações de DC sanguíneas são muito menores quando comparadas com Mo-DC. A sequência de aminoácidos de BDCA-4 foi obtida purificando o antigénio com o mAc ADS-17F6 (coluna de afinidade AD5-17F6) e analisando o antigénio purificado por espectrometria de massa MALDI TOF. O BDCA-4 é idêntico à neuropilina-1. He et al. (1997). 93
ΕΡ 1 301 539 /PT
Exemplo 12 A ligação de BDCA-2 com o anticorpo monoclonal anti-BDCA-2 (AC144) induz a mobilização de Ca2+ intracelular, enquanto que a ligação de BDCA-4 (neuropilina-1) com anti-BDCA-4 não induz a mobilização de Ca2+.
Materiais e Métodos:
Medição de cálcio citosólico em BDC BDCA-2+BDCA-4+ e células U937 transfectadas com BDCA-2 ou não transfectadas. As DC sanguíneas BDCA-2+BDCA-4+ e células U937 transfectadas com BDCA-2 ou não transfectadas foram carregadas com Indo-1 AM (Sigma, St. Louis, MO) como descrito por Valitutti et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:790-795. Adicionou-se mAc anti-BDCA-2 (AC144, IgGl) ou anti-BDCA-4 (ADS-17F6, IgGl) a BDC BDCA-2+BDCA-4+ isoladas de fresco e células U937 transfectadas com BDCA-2 ou não transfectadas, respectivamente, seguido ou não seguido de mAc de rato anti-IgGl de ratinho (X56) como reticulador. As células foram analisadas num citofluorímetro de fluxo para detectar fluxos de Ca2+. Apenas as células vivas (com base nos critérios de dispersão) e células marcadas com Indo-1 (com base nos espectros de emissão a 405 nm versus 525 nm) foram incluídas na análise. A Figura 13 mostra que a mobilização intracelular é induzida em BDC BDCA-2+BDCA-4+ purificadas imunomagneticamente (A, B) e células U937 transfectadas com BDCA-2 (D), mas não em células U937 não transfectadas (E) através de mAc anti-BDCA-2 isolado (A) e ou anti-BDCA-2 mais mAc secundário com reticulação (B, D, E). A ligação de BDCA-4 em BDC BDCA-2+BDCA-4+ purificadas imunomagneticamente com mAc anti-BDCA-4 e mAc secundário com reticulção não induz a mobilização de Ca2+ citosólico. É apresentada a razão 405nm/525nm dependente de Ca2+ de fluorescência de Indo-1 (eixo dos Y) em função do tempo (eixo dos X, um valor de 1024 corresponde a 204, 80 s) .
Como se pode ver na Figura 13, a ligação de BDCA-2 de superfície em BDC plasmocitóides (Figura 13A e B) e células 94
ΕΡ 1 301 539 /PT U937 transfectadas com BDCA-2 (Figura 13D) com um mAc específico (AC144, igGl) seguido (Figura 13B e D) ou não seguido (Figura 13A) por um mAc secundário com reticulação (anticorpo de rato anti-lgGl de ratinho, X56) originou um aumento rápido e transitório na concentração de cálcio citosólico. Pelo contrário, a incubação de DC plasmocitóides com mAc anti-BDCA-4 (AD5-17F6) seguida de um mAc secundário com reticulação (anticorpo de rato anti-lgGl de ratinho, X56) (Figura 14C), ou de células U937 não transfectadas com mAc anti-BDCA-2 (AC144, IgGl) seguido de um mAc secundário com reticulação (anticorpo de rato anti-lgGl de ratinho, X56) (Figura 13E) não induziu um aumento rápido e transitório na concentração de cálcio citosólico.
Exemplo 13 A produção de interferão tipo I por BDC BDCA-2+, BDCA-4+ purificadas em resposta a estimulação virai (estirpe PR8 do vírus influenza) é inibida desencadeando BDCA-2 com mAc anti- BDCA-2
Verificou-se que as DC plasmocitóides CD4+CDl23brightCDllc~ são os principais produtores de interferão tipo I em resposta a vírus de envelope, bactérias e células de tumor. Fitgerald-Bocarsly et al. (1993) Pharmacol. Ther. 60:39-62; Siegal et al. (1999) Science 284:1835-1837; Cella et al. (1999) Nature Med. 5:919-923. Por este motivo, também foram designadas por células produtoras de interferão tipo I naturais (NIPC). As DC plasmocitóides expressam BDCA-2 e BDCA-4. Como se pode ver na Figura 14, a ligação de BDCA-2 de superfície em DC plasmocitóides com um mAc específico, seguido de um mAc secundário com reticulação (anticorpo de rato anti-lgGl de ratinho, X56), inibe a secreção do interferão tipo I por DC plasmocitóides BDCA-2+BDCA-4+ purificadas imunomagneticamente de sangue ou amígdalas, em resposta à estimulação com a estirpe PR8 do vírus influenza (5 HAU/ml). O nível de produção de interferão tipo I em culturas com anti-BDCA-2, vírus influenza e mAc com reticulação (Figura 14, AC144+RamGl+FLU) é muito menor do que nas culturas apenas com vírus influenza (Figura 14, FLU), ou com um mAc de controlo de isotipo (mAc anti-citoqueratina CK3-11D5, IgGl), vírus influenza e mAc com reticulação (Figura 14, CK3+RamGl+FLU). 95
ΕΡ 1 301 539 /PT
Pelo contrário, a ligação de BDCA-4 de superfície em DC plasmocitóides com um mAc específico, seguido de um mAc secundário com reticulação (anticorpo de rato anti-IgGl de ratinho, X56), não inibe a secreção de interferão do tipo I por DC plasmocitóides BDCA-2+BDCA-4+ de sangue ou amígdalas em resposta ao estímulo com a estirpe PR8 do vírus influenza (5 HAU/ml). O nível de produção de interferão tipo I em culturas com anti-BDCA-4, vírus influenza e mAc com reticulação (Figura 14, 17F6+RamGl+FLU) é o mesmo que em culturas com um mAc de controlo do isotipo (mAc anti-citoqueratina CK3-11D5, IgGl), vírus influenza e mAc com reticulação (Figura 14, CK3+RamGl+FLU).
Materiais e Métodos:
Isolaram-se DC plasmocitóides que expressam BDCA-2 e BDCA-4 a partir de PBMC (Figura 14A) ou células de amígdala (Figura 14B) por marcação magnética directa com micropérolas conjugadas com anti-BDCA-4 (AD5-17F6) e enriquecimento de células marcadas por MACS. As DC plasmocitóides que expressam BDCA-2 e BDCA-4 isoladas foram cultivadas durante 24 horas em meio na presença de: a) IL-3 isolado (Figura 14, controlo); b) IL-3, mAc anti-BDCA-2 (AC144, IgGl) e mAc de rato anti-IgGl de ratinho (Figura 14, AC144+RamGl); c) IL-3, mAc anti-BDCA-2 (AC144, IgGl), mAc de rato anti-IgGl de ratinho e estirpe PR8 do vírus influenza (Figura 14, AC144+RamGl+FLU); d) IL-3 e estirpe PR8 do vírus influenza (Figura 14, FLU); e) IL-3, mAc anti-citoqueratina (CK3-11D5, IgGl), mAc de rato anti-IgGl de ratinho e estirpe PR8 do vírus influenza (Figura 14, CK3+RamGl+FLU); e f) IL-3, mAc anti-BDCA-4 (AD5-17F6), mAc de rato anti-IgGl de ratinho e estirpe PR8 do vírus influenza (Figura 14 17F6+RamGl+FLU). O interferão do tipo I segregado nos sobrenadantes de cultura foi medido avaliando a inibição da proliferação de células Daudi (Nederman et al. (1990) Biologicals 18:29-34) com referência a uma curva de lFN-α padrão.
Em relação à inibição da produção de interferão do tipo I por DC plasmocitóides BDCA-2+BDCA-4+, encontram-se níveis elevados de interferão tipo I circulante e de factor indutor de interferão tipo I (algo semelhante a um complexo de 96 ΕΡ 1 301 539 /PT anticorpo anti-ADN e ADN) em pacientes com SLE e correlacionam-se com a actividade da doença. Além disso, os pacientes com distúrbios não auto-imunes tratados com interferão do tipo I desenvolvem frequentemente auto-anticorpos e ocasionalmente SLE. Vários artigos de Ronnblom et âl. (1999) Clin. Exp. Immunol. 115: 196-202; (1999) J. Immunol. 163: 6306-6313; e (2000) J. Immunol. 165: 3519-3526) mostram que os factores indutores de interferão do tipo I derivados de pacientes induzem a secreção de interferão do tipo I em PBMC de dadores saudáveis e activam selectivamente células produtoras de interferão tipo I naturais (NIPC = DC plasmocitóides).
As observações aqui apresentadas de que a ligação de BDCA-2 suprime a produção de interferão do tipo I induzida por estimulação virai mostra que a ligação a BDCA-2 pode ser aplicada para tratar a doença, não apenas por ligação de BDCA-2, mas também por depleção de NIPC (=Dc plasmocitóides BDCA-2+ BDCA-4+). A invenção inclui assim também a depleção de NIPC In vivo, In vitro e ex vivo. Esta depleção é adequada para utilização no tratamento ou profilaxia de doenças auto-imunes . A Figura 14 mostra que a ligação de BDCA-2, mas não de BDCA-4 com um mAc especifico, seguido de um mAc secundário com reticulação inibe a secreção de interferão do tipo I por DC plasmocitóides BDCA-2+BDCA-4+ de sangue ou amígdalas, em resposta ao estímulo com a estirpe PR8 do vírus influenza. As DC plasmocitóides BDCA-2+BDCA-4+ de sangue (A) ou amígdalas (B) foram cultivadas durante 24 horas na presença de IL-3 isolado (controlo); IL-3, mAc anti-BDCA-2 e mAc de rato anti-igGl de ratinho (ACl44+RamGl); IL-3, mAc anti-BDCA-2, mAc de rato anti-IgGl de ratinho e estirpe PR8 do vírus influenza (AC144+RamGl+FLU); IL-3 e estirpe PR8 do vírus influenza (FLU); IL-3, mAc anti-citoqueratina, mAc de rato anti-IgGl de ratinho e estirpe PR8 do vírus influenza (CK3+RamGl+FLU); EL-3, mAc anti-BDCA-4, mAc de rato anti-IgGl de ratinho e estirpe PR8 do vírus influenza (17F6+RamGl+FLU). O interferão do tipo I segregado (U/ml) nos sobrenadantes da cultura foi medido por um bioensaio com referência a uma curva padrão de interferão do tipo I. 97
ΕΡ 1 301 539 /PT
Exemplo 14 O BDCA-2 é não só capaz de endocitar um ligando, mas também de o fornecer a um compartimento de processamento e carga de antigénio e de o apresentar a células T restritas a classe II-CD4+
Materiais e métodos:
As Dc plasmocitóides que expressam BDCA-2 e BDCA-4 foram isoladas de PBMC por marcação magnética directa com micropérolas conjugadas com anti-BDCA-4 (ADS-17F6) e enriquecimento de células marcadas por MACS. As DC plasmocitóides que expressam BDCA-2 e BDCA-4 foram co-cultivadas com 4xl04 células/poço do clone de células T B13 (Lanzavecchia et al. (1988) J. Exp. Med. 167:345-352) em microplacas de fundo plano de 96 poços, na presença de mAc IgGl (0,2 pg/ml). Os mAc utilizados no teste eram os seguintes: AC144 (anti-BDCA-2, IgGl), ZM3.8 (anti-lLT3, IgGl) e CK3-11D5 (anti-citoqueratina, IgGl). Após 48 horas, as culturas foram pulsadas com (3H)timidina (1 pCi/poço) e a radioactividade incorporada foi medida após mais 16 horas. A incorporação de (3H)Timidina (cpm) foi representada graficamente contra o número de DC plasmocitóides que expressam BDCA-2 e BDCA-4 isoladas nas culturas (Figura 15). A Figura 15 mostra a apresentação de mAc anti-BDCA-2 (AC144, IgG 1) a um clone de células T especifico para IgGl de ratinho por DC plasmocitóides que expressam BDCA-2 e BDCA-4 isoladas. As DC plasmocitóides BDCA-2+BDCA-4+ apresentam mAc anti-BDCA-2 (AC144, IgGl, ) a células T de um modo muito mais eficaz do que o mAc anti-ILT-3 (ZM3.8, IgGl, A) e mAc anti-citoqueratina (CK3-11D5, IgGl, ·). A incubação das DC plasmocitóides BDCA-2+BDCA-4+ marcadas com mAc anti-BDCA-2 (AC144, IgGl) a 37°C resulta na internalização extremamente rápida de complexos mAc anti-BDCA-2/BDCA-2 na superfície celular (veja-se Figura 8) . Aqui, demonstra-se que o mAc anti-BDCA-2 (AC144, IgGl) acede a um compartimento de processamento e carga de antigénios e os péptidos derivados do anticorpo são eficazmente apresentados a um clone de células T restritas a classe II CD4+ (B13) 98
ΕΡ 1 301 539 /PT específico para um epítopo do péptido igGl de ratinho. A apresentação do mAc anti-BDCA-2 foi comparada com a de um mAc IgGl que se liga a um receptor (ILT3) conhecido por ser capaz de direccionar o(s) seu ligando(s) para compartimentos de processamento e carga de péptidos e com a de um mAC IgGl que não se liga a uma molécula de superfície celular em DC plasmocitóides BDCA-2+BDCA-4+ (mAc anti-citoqueratina CK3-11D5, IgGl), mas pode ser incorporado na fase fluida. Como se pode ver na Figura 15, as DC plasmocitóides BDCA-2+BDCA-4+ apresentaram mAc anti-BDCA-2 (AC144) a células T de um modo muito mais eficaz do que o mAc anti-ILT-3 e o mAc anti-citoqueratina .
Exemplo 15
Em células de amígdala, a expressão de bdca-2 é restrita a DC plasmocitóides associadas à zona de células T CD123+, enquanto que o BDCA-4 também pode ser expresso a níveis baixos nalgumas outras células. A Figura 16 mostra a expressão de BDCA-2 e BDCA-4 em DC plasmocitóides CD123+ de amígdala. São apresentadas colorações de duas cores de células de amígdala com um mAc conjugado com FITC contra BDCA-2 (AC144) e um mAc conjugado com PE contra CD123 e BDCA-4 (AD5-17F6), respectivamente. Note-se que a expressão de BDCA-2 é restrita a DC plasmocitóides CDl23bright, enquanto que o BDCA-4 também é expresso a níveis baixos nalgumas outras células.
Exemplo 16 0 mAc BDCA-4 (AD5-17F6) reconhece a neuropilina-1 A neuropilina-1 é um receptor para a família de colapsina/semaforina que medeia a orientação de células
neuronais. A neuropilina-1 também é expressa por células endoteliais e de tumor como um receptor específico da isoforma para o factor de crescimento endotelial vascular. No entanto, não se sabia antes que a neuropilina-1 é expressa em DC plasmocitóides no sangue e amígdalas e que representa um marcador excelente para DC plasmocitóides, pelo menos em sangue não cultivado, fresco. 99
ΕΡ 1 301 539 /PT
Material e métodos: A neuropilina-1 foi imunoprecipitada a partir de lisados celulares de células pae não transfectadas (P) e células pea transfectadas com neuropilina-1 (NP) (Soker et al. (1998) Cell 92:735-745) utilizando o mAc anti-BDCA-4 AD5-17F6 (anti-NRP-1 (ML)). As proteínas precipitadas foram analisadas por SDS-PAGE e transferência de Western com o mAc específico de BDCA-4 AD5-17F6 (ML) ou um mAc específico de neuropilina-1 do Shay Soker, Children's Hospital, Boston, MA (S). A Figura 17 mostra que a neuropilina-1 foi imunoprecipitada a partir de lisados celulares de células PEA transfectadas com neuropilina-1 (NP), mas não de células PAE não transfectadas (P) com o mAc anti-BDCA-4 AD5-17F6 (anti-NRP-1 (ML)). As proteínas precipitadas foram analisadas por SDS-PAGE e transferência de Western com o mAc específico de BDCA-4- AD5-17F6 (ML) ou um mAc específico de neuropilina-1 do Shay Soker, Children's Hospital, Boston, MA (S).
Note-se que o mAc específico de BDCA-4 AD5-17F6 imunoprecipita uma banda específica de cerca de 130-140 kDa de células PEA transfectadas com neuropilina-1 (NP), mas não de células PAE não transfectadas (P) . A banda pode ser detectada com o mAc específico de neuropilina-1 do Shay Soker (S) mas não com o mAc anti-BDCA-4 AD5-17F6 (ML) . Assim, o nosso mAc anti-BDCA-4 ADS-17F6 reconhece a forma nativa de neuropilina-1 em experiências convencionais de imunoprecipitação, mas não detecta a forma desnaturada de neuropilina-1 quando utilizado em experiências de SDS-PAGE/ transferência de Western.
Com interesse, a neuropilina-1 também é expressa por células endoteliais e de tumor como um receptor específico da isoforma para o factor de crescimento endotelial vascular VEGF). Com maior interesse, alguns artigos (Gabrilovich et al. (1996) Nature Med. 2:1267; Nature Med. 2: 1096-103; Gabrilovich et al. (1999) Clin. Câncer Res. 5: 2963-70; Ohm et al. (1999). J. Immunol. 163: 3260-8; Oyama et al. (1998) J. Immunol. 160:1224-32; Gabrilovich et al. (1998). Blood 92:4150-66; Ishida et al. (1998) J. Immunol. 161:4842-51) mostraram que o VEGF produzido por uma grande percentagem de tumores diminui a produção e função das DC in vivo. Não é 100 ΕΡ 1 301 539 /PT claro se estes efeitos nas DC são mediados por neuropilina-1 (BDCA-4), mas a invenção inclui a modulação funcional de DC mediada por neuropilina-1.
Exemplo 17 A produção do interferão tipo I (IFN-α) por BDC BDCA-2+BDCA-4+ purificadas em resposta ao estímulo com poli l:C é inibida desencadeando BDCA-2 com mAc anti-BDCA-2
Verificou-se que as DC plasmocitóides CD4+CDl23brightCDllc“ são os produtores principais de interferão I em resposta a vírus de envelope, bactérias e células de tumor. Fitzgerald-Bocarsly et al. (1993) Pharmacol. Ther. 60:39-62; Siegal et al. (1999) Science 284: 1835-1837; Cella et al. (1999) Nature Med. 5:919-923. Por este motivo, também foram designadas por células produtoras de interferão do tipo I naturais (NIPC). As DC plasmocitóides expressam BDCA-2 e BDCA-4. Como se pode ver na Figura 19, a ligação de BDCA-2 de superfície em DC plasmocitóides com um mAc específico seguido de um mAc secundário com reticulação (anticorpo de cabra anti-lgG de ratinho), que inibe a secreção de IFN-α por DC plasmocitóides BDCA-2+BDCA-4+ purificadas imunomagneticamente de sangue ou amígdalas, em resposta ao estímulo com poli I:C. O nível de produção de IFN-α em culturas com anti-BDCA-2, poli I:C e mAc com reticulação (Figura 18, AC144 + anticorpo de cabra anti-lgG de ratinho + Poli I:C) é inferior ao de culturas com IgGl de ratinho, poli I:C e mAc com reticulação (Figura 18, IgGl de ratinho + anticorpo de cabra anti-lgG de ratinho + Poli I:C).
Materiais e Métodos:
As DC plasmocitóides CDllc” CDl23bright foram separadas de células mononucleares de sangue periférico utilizando micropérolas de BDCA-4. As DC plasmocitóides CDllc“C123bright (lxlO6 células/ml) foram incubadas com 10 pg/ml de mAc AC144 ou mAc IgGl de ratinho (CF6B, anti-TPO) em RPMI, FCS a 10%, hepes lOmM, 2-ME 50 μΜ, gentamicina 20 pg/ml a 37°C durante 30 min. Adicionaram-se 20 pg/ml de anticorpo de cabra anti-lgG de ratinho (Chemicon International) e as células foram mais uma vez incubadas a 37°C durante 30 min. Estas células foram cultivadas com ou sem 20 pg de poli I:C (Sigma) a 37°C durante 24 horas. Os sobrenadantes de cultura foram recolhidos e 101
ΕΡ 1 301 539 /PT determinaram-se as concentrações de IFN-α por ELISA (Endogen). A sensibilidade do teste é de 3 pg/ml. A Figura 18 mostra que a ligação de BDCA-2, mas não de BDCA-4 com um mAc específico, seguido de um mAc secundário com reticulação inibe a secreção de IFN-α por DC plasmocitóides BDCA-2+BDCA-4+ de sangue ou amígdalas, em resposta ao estímulo com poli I:C. As DC plasmocitóides BDCA-2+ BDCA-4+ de sangue foram cultivadas com 10 pg/ml de mAc AC144 (2 e 4) ou mAc igGl de ratinho (CF6B, anti-TPO, 1 e 3) a 37°C durante 30 min. Adicionaram-se 20 pg/ml de anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho e as células foram mais uma vez incubadas a 37°C durante 30 min. Estas células foram cultivadas com (3 e 4) ou sem (1 e 2) 20 pg de poli l:C a 37°C durante 24 horas. Os sobrenadantes da cultura foram recolhidos e as concentrações de IFN-α foram determinadas por ELISA.
Exemplo 18
Análise da expressão de ARNm de BDCA-2 por RT-PCR em vários tecidos e populações de células sanguíneas purificadas
Sequências de ácido nucleico e aminoácidos O ADNc que codifica para BDCA-2 foi obtido por clonagem de expressão em células COS. A Figura 5 mostra a sequência de aminoácidos de BDCA-2 (a isoforma com todos os seis exões expressos). O BDCA-2 é uma nova proteína de membrana do tipo II de lectina tipo C. Estas lectinas estão descritas, por exemplo, em Bates et al. (1999) J. Immunol. 163:1973-1983. A comparação de BDCA-2 com lectinas do tipo C conhecidas é apresentada no Exemplo 20. A Figura 19 mostra uma análise de painéis de vários ADNc de tecido humano da Clonetech (pista 1: coração; pista 2: cérebro; pista 3: placenta; pista 4: pulmão; pista 5: fígado; pista 6: músculo esquelético; pista 7: rim; pista 8: pâncreas; pista 9: baço; pista 10: timo; pista 11: testículos; pista 12: ovário; pista 13: intestino delgado; pista 14: nódulo linfático; pista 15: medula óssea; pista 16: fígado fetal; pista 17: amígdala) e uma análise de ADNc preparados a partir de diferentes populações de leucócitos sanguíneos (pista 18: células T; pista 19: células B; pista 20: células NK; pista 21: monócitos; pista 22: DC CDllcbrightCDl23l0W; pista 23: 102
ΕΡ 1 301 539 /PT BDC plasmocitóides CDllc-CD123bright) quanto à presença de ADNc de BDCA-2.
Todos os ADNc foram normalizados para o nível de expressão de ARNm de vários genes de manutenção (gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, fosfolipase A2, α-tubulina e β-actina). A normalização assegura uma determinação precisa da especificidade de tecido e abundância relativa de ARNm alvo. Utilizou-se a mesma quantidade de ADNc (cerca de 50 pg) para cada reacção RT-PCR. As reacções RT-PCR foram realizadas com iniciadores específicos para BDCA-2 (directo: 5'-TTGAAAGAACCACACCCCGAAAGT (SEQ ID NO:) e inverso: 5'-TAGCTTTCTACAACGGTGGATGCC (SEQ ID NO:)) e iniciadores para os quatro genes de manutenção {“housekeeping”, da CLONTECH) mencionados acima, utilizando ADN-polimerase AdvanTaq Plus (CLONTECH).
As condições dos ciclos eram as seguintes: 94°C durante 30 s e 68°C durante 2 min. Utilizaram-se 34 ciclos para BDCA-2 e 38 ciclos para gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (G3PDH). Note-se que os sinais de ARNm de BDCA-2 são apenas detectados em DC plasmocitóides CDllc“CD123britht. Quando se utilizaram mais quatro ciclos de PCR para amplificação de ADNc de BDCA-2 (38 ciclos em vez de 34 ciclos), também se detectaram sinais fracos no pâncreas, testículos, ovários, medula óssea e amígdalas. Com o ADNc de testículos (38 ciclos de PCR), os sinais das moléculas transcritas mais curtas (variantes de splicing) eram mais fortes em comparação com os sinais das DC plasmocitóides CDllc” CDl23bright e os sinais da molécula transcrita de comprimento total foram efectivamente apenas detectados com mais ciclos de PCR.
Exemplo 19
Estrutura de exão/intrão de BDCA-2 e variantes de splicing de BDCA-2 A informação sobre variantes de splicing de BDCA-2 foi obtida por amplificação por RT-PCR de ARNm de DC plasmocitóides com iniciadores complementares a sequências de ARNm em frente ao codão de iniciação (iniciador directo: 5'-TTGAAAGAACCACACCCCGAAAGT (SEQ ID NO:)) e atrás do codão de terminação (iniciador inverso: 5'-TAGCMCTACAACGGTGGATGCC (SEQ ID NO:)), clonagem dos fragmentos resultantes em plasmídeos e sequenciação das inserções. Os resultados são apresentados na 103
ΕΡ 1 301 539 /PT
Figura 20. Para comparação, as variantes de splicing de lectina-2 do tipo C (Dectina-2) associada a células dendriticas de ratinho são apresentadas na Figura 21. A Figura 22 mostra um alinhamento das sequências de ARNm de BDCA-2 e Dectina-2 de ratinho, estando indicadas as posições dos intrões deduzidas. A Tabela 3 mostra os parâmetros dos exões.
Tabela 3
Exão ARNm Resíduos de aminoácido codificados Número de resíduos de aminoácido codificados 0 0-361 0 1 362-522 1-10 10 2 523-615 11-41 31 3 616-726 42-78 37 4 727-872 78-127 49 5 873-988 128-166 39 6 989-1283 167-213 47
As posições dos intrões baseiam-se no clone RP11-277J24 do cromossoma 12 de Homo sapiens, sequência esboço de trabalho, 21 pedaços desordenados (número de acesso da GenBank AC006517) e nas regras para o splicing de moléculas transcritas. A composição de intrões/exões de BDCA-2 é semelhante à de Dectina-2.
Produzem-se pelo menos quatro variantes de splicing de BDCA-2. Estas são um ARNm que codifica para uma proteína com todos os seis exões; um ARNm que codifica para uma proteína que contém os exões 1, 3, 4, 5, e 6; um ARNm que codifica para uma proteína contendo os exões 1, 2, 4, 5, e6eum ARNm que codifica para uma proteína contendo os exões 1, 2, 3, 5, e 6.
Exemplo 20
Homoloqia de BDCA-2 e domínios de proteína
Na Figura 23 é apresentado um alinhamento das sequências de aminoácidos de BDCA-2 humana, DCIR (imunorreceptor de 104
ΕΡ 1 301 539 /PT células dendríticas) humano e dectina 2 de ratinho (lectina-2 tipo C associada a células dendríticas) . O DCIR humano (número de acesso da GenBank AJ133532) é a molécula com a homologia mais elevada em relação a BDCA-2 entre moléculas humanas (veja-se Bates et al. (1999) J. Immunol. 163:1973) sendo cerca de 51% dos aa idênticos, numa porção de 191 aa. A Dectina-2 de ratinho (número de acesso da GenBank AF240357) é muito provavelmente o homólogo de murídeo da BDCA-2 humana (veja-se Ariizumi et al. (2000) J. Biol. Chem. 16:11957; WO 98/28332; PCT/US97/23761; e patente dos Estados Unidos 6046158) sendo cerca de 51% dos aa idênticos numa porção de 211 aa. O BDCA-2 (213 aa), DCIR (237 aa) e Dectina-2 (209 aa) são todos glicoproteínas de membrana do tipo II da família de lectinas dependentes de cálcio (tipo C) . Cada uma das moléculas contém um domínio citoplasmático putativo (BDCA-2: aa 1-21; DCIR: aa 1-44; Dectina-2: aa 1-17), um domínio transmembranar putativo (BDCA-2: aa 22-41; DCIR: 44-69;
Dectina-2: 18-40), e um domínio extracelular putativo (BDCA-2: aa 42-213; DCIR: 70-237; Dectina-2: 40-209). Dentro do domínio extracelular putativo, cada uma das moléculas contém um único domínio de reconhecimento de hidratos de carbono (CRD) na extremidade de terminal COOH (BDCA-2: aa 83-206; DCIR: 106-230; Dectina-2: 79-202). A Figura 23 mostra o alinhamento de BDCA-2 humana, DCIR humana e Dectina-2 de ratinho.
Os domínios/motivos de proteína putativos tal como encontrados utilizando a base de dados PROSTTE são apresentados na Tabela 4. 105
ΕΡ 1 301 539 /PT
Tabela 4
Domínio BDCA-2 Dectina-2 DCIR Glicosilação ASN 110-113 NCSV 131-134 NESL 185-188 NESS 137-140 NSSY 164-167 NVTF Local de fosforilação para proteína-quinase dependente de AMPc e GMPc 53-56 KRLS 78-81 KKTT 135-138 SQK Local de fosforilação para proteína-quinase C 51-53 TVK 15-17 TLR 80-82 TTK 107-109 SQK 49-51 SRR 130-132 SEK 72-74 SEK 211-213 SPK 94-96 STK Local de fosforilação para caseína-quinase II 123-126 TREE 94-97 STKE 1-9 TYAE 187-190 SSEE 101-104 STSE 80-83 TTKE 119-122 TEAE 87-90 TTLE 200-203 SICE 126-129 SWQD 130-133 SEKD 146-149 TQEE 168-171 SDPE 228-231 SVCE Local de fosforilação para tirosina-quinase 57-64 KLREYQQY 50-58 RRLYELHTY Local de amidação 148-151 GGRR Local de N-miristilação 11-16 GVCWTL 20-25 GINTAS 68-73 GTMVSE 77-82 GCCPNH Assinatura do domínio de lectina tipo C 180-206 11-17 176-202 203-230 O BDCA-2 contém três locais de N-glicosilação putativos (aa 110-113 NCSV; aa 137-140 NSSY; aa 164-167 NVTF), enquanto que a Dectina-2 (aa 131-134 NESL) e DCIR (aa 185-188 NESS) contêm apenas um local de N-glicosilação putativo. Todos os locais de fosforilação de BDCA-2 e Dectina-2 putativos estão localizados no domínio extracelular putativo. Assim, é bastante improvável que se tornem fosforilados por quinases intracelulares. Tal como muitas lectinas do tipo C (e.g. CD94, Ly-49, e NKG2) que estão codificadas no complexo de genes assassinos naturais, o DCIR contém o motivo de consenso inibidor baseado em tirosina, imunorreceptor (motivo ITIM; (I/V)XYXX(L/V)) no dominio citoplasmático (aa 5-10 ITYAEV). 106
ΕΡ 1 301 539 /PT
Com interesse; este motivo ITIM não é encontrado na cauda citoplasmática relativamente curta de BDCA-2 e Dectina-2 (BDCA-2: 21 aa; Dectina-2: 17 aa).
Exemplo 21
Análise de proteína BDCA-3 107
ΕΡ 1 301 539 /PT como reagente secundário, durante 3 horas a 4°C. As proteínas precipitadas foram isoladas por separação em coluna pMACS. As proteínas retidas foram eluídas com 70 μΐ de tampão SDS-PAGE contendo DTT. As proteínas precipitadas foram analisadas por SDS-PAGE (4-12%) e transferência de Western com estreptavidina-peroxidase.
Os resultados na Figura 24 mostram que o mAc AD5-14H12 específico de BDCA-3 imunoprecipita especificamente uma proteína de superfície celular de cerca de 100 kD das células HD-MY-Z. Assim, o BDCA-3 tem um peso molecular aparente de 100 kD.
Embora a invenção tenha sido descrita nalgum detalhe a título ilustrativo e de exemplo para fins de clareza e compreensão, será evidente para os peritos na arte que se podem fazer algumas alterações e modificações. Assim, a descrição e exemplos não deverão ser entendidos como limitativos do âmbito da invenção que é delineada pelas reivindicações anexas.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Schmitz, et ai. <120> FRAGMENTOS DE LIGAÇÃO A ANTIGÉNIOS ESPECÍFICOS PARA CÉLULAS DENDRÍTICAS, COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA A SUA UTILIZAÇÃO,
ANTIGÉNIOS ASSIM RECONHECIDOS E CÉLULAS ASSIM OBTIDAS
<130> 830003-2002.1WO <140> PCT/IB00/01832 <141> 2000-11-15 <150> 60/165,555 <151> 1999-11-15 <160> 38 <170> Patentln versão 3.0
<210> 1 <211> 1312 <212> ADN <213> Homo sapiens < 2 2 0 > <221> misc_feature <222> (1)..(1312) <223> sequência de ADN de BDCA-2 108
ΕΡ 1 301 539 /PT < 4 0 0 > 1 cagtgattct cgtgcctcag cctcctgagt agccgaaatt acagacgtgt gccaccatgc 60 ttggctaatt ttttggattt ttagtagaga tggggtttca ctatgttggc caggctagtc 120 ttgaactcct ggcctgaagc aatccgccca cctcagcctc ccaaagtgct gagattatag 180 gcacgagcca ctacacctgg ccacaaaatt ctttaaagaa gccaatccca tcctccctca 240 agagccaagg ggccacctca ccctcttgtt acagcagatc ctgcctccac agtcaccctg 300 ctcccaagtg caacctctgt ctgaccctgc atggtgtgcg gtgccctcct gcctcaggcc 360 gcgaagaagg atctaagggc ttggcttgtt tgaaagaacc acaccccgaa agtaacatct 420 ttggagaaag tgatacaaga gcttctgcac ccacctgata gaggaagtcc aaagggtgtg 480 cgcacacaca atggtgcctg aagaagagcc tcaagaccga gagaaaggac tctggtggtt Ξ40 ccagttgaag gtctggtcca tggcagtcgt atccatcttg ctcctcagtg tctgtttcac 600 tgtgagttct gtggtgcctc acaattttat gtatagcaaa actgtcaaga ggctgtccaa 660 gttacgagag tatcaacagt atcatccaag cctgacctgc gtcatggaag gaaaggacat 720 agaagattgg agctgctgcc caaccccttg gacttcattt cagtctagtt gctactttat 780 ttctactggg atgcaatctt ggactaagag tcaaaagaac tgttctgtga tgggggctga 840 tctggtggtg atcaacacca gggaagaaca ggatttcatc attcagaatc tgaaaagaaa 900 ttcttcttat tttctggggc tgtcagatcc agggggtcgg cgacattggc aatgggttga 960 ccagacacca tacaatgaaa atgtcacatt ctggcactca ggtgaaccca ataaccttga 1020 tgagcgttgt gcgataataa atttccgttc ttcagaagaa tggggctgga atgacattca 1080 ctgtcatgta cctcagaagt caatttgcaa gatgaagaag atctacatat aaatgaaata 1140 ttctccctgg aaatgtgttt gggttggcat ccaccgttgt agaaagctaa attgattttt 1200 taatttatgt gtaagttttg tacaaggaat gcccctaaaa tgtttcagca ggctgtcacc 1260 tattacactt atgatataat ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1312
< 210 > 2 <211> 213 < 212 > PRT <213> Homo sapiens <220> <221> INCERTO <222> (1)..(213) <223> sequência de aminoácidos de uma das isoformas de BDCA-2 com todos os seis exões expressos 109 ΕΡ 1 301 539 /PT < 4 0 0 > 2
Met Vai Pro Glu Glu Glu Pro Gin Asp Arg Glu Lys Gly Leu Trp Trp 15 10 15
Phe Gin Leu Lys Vai Trp Ser Met Ala Vai Vai Ser Ile Leu Leu Leu 20 25 30
Ser Vai Cys Phe Thr Vai Ser Ser Vai Vai Pro His Asn Phe Met Tyr 35 40 45
Ser Lys Thr Vai Lys Arg Leu Ser Lys Leu Arg Glu Tyr Gin Gin Tyr 50 55 60
His Pro Ser Leu Thr Cys Vai Met Glu Gly Lys Asp Ile Glu Asp Trp 65 70 75 80
Ser Cys Cys Pro Thr Pro Trp Thr Ser Phe Gin Ser Ser Cys Tyr Phe 85 90 95
Ile Ser Thr Gly Met Gin Ser Trp Thr Lys Ser Gin Lys Asn Cys Ser 100 105 110
Vai Met Gly Ala Asp Leu Vai Vai Ile Asn Thr Arg Glu Glu Gin Asp 115 120 125
Phe Ile Ile Gin Asn Leu Lys Arg Asn Ser Ser Tyr Phe Leu Gly Leu 130 135 140
Ser Asp Pro Gly Gly Arg Arg His Trp Gin Trp Vai Asp Gin Thr Pro 145 150 155 160
Tyr Asn Glu Asn Vai Thr Phe Trp His Ser Gly Glu Pro Asn Asn Leu 165 170 175
Asp Glu Arg Cys Ala Ile Ile Asn Phe Arg Ser Ser Glu Glu Trp Gly 180 -18.5- 1-90 . -___
Trp Asn Asp Ile His Cys His Vai Pro Gin Lys Ser Ile Cys Lys Met 195 200 205
Lys Lys Ile Tyr Ile 210
<210> 3 <211> 1227 <212> ADN <213> Mus musculus <220>
<221> CDS <222> (146) .. (775) <223> sequência de codificação de Dectina-2 de ratinho <300> <308> AF240357 <309> 2000-05-02 <313> (1)..(1227) 110
ΕΡ 1 301 539 /PT < 4 0 0 > 3 cattggcccg ctctgtggca tttaactcaa gtgtgtgtgg aagttgattc 1 tgaactctgg 60 cctctttgac ι agaagccagg tccctgagtc gtattttgga gacagatgca i agaaacccct 120 gaccttctga i acatacacct caaca atg gtg cag gaa aga caa tcc caa ggg 172 Met 1 Vai Gin Glu Arg 5 Gin Ser Gin Gly aag gga gtc tgc tgg acc ctg aga ctc tgg tca gct gct gtg att tcc 220 Lys Gly Vai Cys Trp Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ala Ala Vai Ile Ser 10 15 20 25 atg tta ctc ttg agt acc tgt ttc att gcg age tgt gtg gtg act tac 268 Met Leu Leu Leu Ser Thr Cys Phe Ile Ala Ser Cys Vai Vai Thr Tyr 30 35 40 caa ttt att atg gac cag ccc agt aga aga cta tat gaa ctt cac aca 316 Gin Phe Ile Met Asp Gin Pro Ser Arg Arg Leu Tyr Glu Leu HiS Thr 45 50 55 tac eat tcc agt ctc acc tgc ttc agt gaa ggg act atg gtg tca gaa 364 Tyr His Ser Ser Leu Thr Cys Phe Ser Glu Gly Thr Met Vai Ser Glu 60 65 70 aaa atg tgg gga tgc tgc cca aat cac tgg aag tca ttt ggc tcc age 412 Lys Met Trp Gly Cys Cys Pro Asn His Trp Lys Ser Phe Gly Ser Ser 75 80 85 tgc tac ctc att tct acc aag gag aac ttc tgg age acc agt gag cag 450 Cys Tyr Leu Ile Ser Thr Lys Glu Asn Phe Trp Ser Thr Ser Glu Gin 90 95 100 105 111
ΕΡ 1 301 539 /PT aac tgt gtt cag atg ggg gct cat ctg gtg gtg ate aat act gaa geg Αεη Cys Vai Gin Met Gly Ala His Leu Vai Vai Ile Asn Thr Glu Ala 110 115 120 gag cag aat_ttc atc-acc cag-cag—ctg .aat gag_tca—c.tt~tc.t_tac_t.t.c.
Glu Gin Asn Phe Ile Thr Gin Gin 125 ctg ggt ctt teg gat cca caa ggt Leu Gly Leu Ser Asp Pro Gin Gly 140 145 gat act cct ttc agt caa aat gtc Asp Thr Pro Phe Ser Gin Asn Val 155 160 aat ctt cca gaa gag cgg tgt gtt Asn Leu Pro Glu Glu Arg Cys Val 170 175 aaa tgg ggc tgg aat gat gtt ttc Lys Trp Gly Trp Asn Asp Vai Phe 190 tgt gaa atg aag aag att tac cta Cys Glu Met Lys Lys Ile Tyr Leu 205
Leu Asn Glu Ser Leu Ser Tyr Phe 130 135 aat ggc aaa tgg caa tgg ate gat Asn Gly Lys Trp Gin Trp Ile Asp 150 agg ttc tgg cac ccc cat gaa ccc Arg Phe Trp His Pro His Glu Pro 165 tea ata gtt tac tgg aat cct teg Ser Ile Val Tyr Trp Asn Pro Ser 180 185 tgt gat agt aaa cac aat toa ata Cys Asp Ser Lys His Asn Ser Ile 195 200 tga gtgcctgtta ttcattaata tctttaaagt tcagacctac caagaagcca ccgttctttt cctagccact attetttact ^SCclCaaaCt aaggaattgc ctctgtcagc ttgaccagtc gattgttgta agagggtcca ggtggtaagc gggagcatca tccatccatc tctgccctca ctttctatga actgctgtta cttgaaagta aaaaaaaaaa aa taacttcttg gcctgtacat ctgacagagg caaacagaat gagccctttc tccttctgat agsgtcacct ggggagtagg atetteaget agcatgtctg ggggcatttt cttgattaat aaaggtgtta aacccatgaa gagcaagcca ggtttctgcc ccagggtctt gccctggttt taagatgaat aaacaatttc atccaaaaaa S08 556 604 652 700 746 795 855 915 375 1035 1095 1155 1215 1227 <210> 4 <211> 209 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4
Met Val Gin Glu Arg Gin Ser Gin Gly Lys Gly Val Cys Trp Thr Leu 1 5 10 15 Arg Leu Trp Ser Ala Ala Val Ile Ser Met Leu Leu Leu Ser Thr Cys 20 25 30 Phe Ile Ala Ser Cys Val Val Thr Tyr Gin Phe Ile Met Asp Gin Pro 112
ΕΡ 1 301 539 /PT 35 40 45
Ser Arg Arg Leu Tyr Glu Leu His Thr Tyr His Ser Ser Leu Thr Cys -50- 55 OO-
Phe Ser Glu Gly Thr Met Vai Ser Glu Lys Met Trp Gly Cys Cys Pro 65 70 75 80
Asn His Trp Lys Ser Phe Gly Ser Ser Cys Tyr Leu Ile Ser Thr Lys 85 90 95
Glu Asn Phe Trp Ser Thr Ser Glu Gin Asn Cys Vai Gin Met Gly Ala 100 105 110
His Leu Vai Vai Ile Asn Thr Glu Ala Glu Gin Asn Phe Ile Thr Gin 115 120 125
Gin Leu Asn Glu Ser Leu Ser Tyr Phe Leu Gly Leu Ser Asp Pro Gin 130 135 140
Gly Asn Gly Lys Trp Gin Trp Ile Asp Asp Thr Pro Phe Ser Gin Asn 145 150 155 160
Vai Arg Phe Trp His Pro His Glu Pro Asn Leu Pro Glu Glu Arg Cys 165 170 175
Vai Ser Ile Vai Tyr Trp Asn Pro Ser Lys Trp Gly Trp Asn Asp Vai 180 185 190
Phe Cys Asp Ser Lys His Asn Ser Ile Cys Glu Met Lys Lys Ile Tyr 195 200 205
Leu
<210> 5 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens < 2 2 0 > <221> INCERTO <222> (1)..(237) <223> sequência de aminoácidos de DCIR humano < 3 0 0 > <308> AJ133532 <30 9> 1999-09-01 <313> (1)..(237) 113
ΕΡ 1 301 539 /PT < 4 0 0 > 5 —Met—Th-r—Ser-Gl-u—Il-e—T-hr—T-yr—Al-a-Glu—Vai—Arg—Phe—Lys-Asn Glu -Phe- 15 10 15
Lys Ser Ser Gly lie Asn Thr Ala Ser Ser Ala Ala Ser Lys Glu Arg 20 25 30
Thr Ala Pro His Lys Ser Asn Thr Gly Phe Pro Lys Leu Leu Cys Ala 35 40 45
Ser Leu Leu lie Phe Phe Leu Leu Leu Ala Xle Ser Phe Phe lie Ala 50 55 60
Phe Vai Ile Phe Phe Gin Lys Tyr Ser Gin Leu Leu Glu Lys Lys Thr 65 70 75 80
Thr Lys Glu Leu Vai His Thr Thr Leu Glu Cys Vai Lys Lys Asn Met 85 90 95
Pro Vai Glu Glu Thr Ala Trp Ser Cys Cys Pro Lys Asn Trp Lys Ser 100 105 110
Phe Ser Ser Asn Cys Tyr Phe Ile Ser Thr Glu Ser Ala Ser Trp Gin 115 120 125
Asp Ser Glu Lys Asp Cys Ala Arg Met Glu Ala His Leu Leu Vai Ile 130 135 140
Asn Thr Gin Glu Glu Gin Asp Phe Ile Phe Gin Asn Leu Gin Glu Glu 145 150 155 160
Ser Ala Tyr Phe Vai Gly Leu Ser Asp Pro Glu Gly Gin Arg His Trp 165 170 175
Gin Trp Vai Asp Gin Thr Pro Tyr Asn Glu Ser Ser Thr Phe Trp His 180 185 190
Pro Arg Glu Pro Ser Asp Pro Asn Glu Arg Cys Vai Vai Leu Asn Phe 195 200 205
Arg Lys Ser Pro Lys Arg Trp Gly Trp Asn Asp Vai Asn Cys Leu Gly 210 215 220
Pro Gin Arg Ser Vai Cys Glu Met Met Lys Ile His Leu 225 230 235 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial < 2 2 0 > <223> unidade básica de um péptido de ligação <400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 7 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial 114 ΕΡ 1 301 539 /PT <22 0> <223> iniciador < 4 0 0 > 7 ttgaaagaac cacaccccga aagt 24 <210> 8 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial < 2 2 0 > <223> iniciador < 4 0 0 > 8 tagctttcta caacggtgga tgcc 24
<210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9
Asn Cys Ser Vai 1
<210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 10
Asn Ser Ser Tyr 1
<210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 11
Asn Vai Thr Phe 1
<210> 12 <211> 4 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 12
Asn Glu Ser Leu 1
<210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens 115
ΕΡ 1 301 539 /PT < 4 0 0 > 13
Asn Glu Ser Ser 1
<210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14
Lys Arg Leu Ser 1
<210> 15 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 15
Lys Lys Thr Thr 1
<210> 16 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 16
Thr Arg Glu Glu 1
<210> 17 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 17
Ser Ser Glu Glu 1
<210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18
Ser Thr Lys Glu 1
<210> 19 <211> 4 <212> PRT <213> Mus musculus 116
ΕΡ 1 301 539 /PT < 4 0 0 > 19
Ser Thr Ser Glu 1
<210> 20 <211> 4 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20
Thr Glu Ala Glu 1
<210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 21
Ser Ile Cys Glu 1
<210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Thr Tyr Ala Glu 1
<210> 23 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23
Thr Thr Lys Glu 1
<210> 24 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24
Thr Thr Leu Glu 1
<210> 25 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens 117 ΕΡ 1 301 539 /PT <400> 25
Ser Trp Gin Asp 1
<210> 26 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26
Ser Glu Lys Asp 1
<210> 27 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27
Thr Gin Glu Glu 1
<210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens < 2 2 0 > <221> INCERTO <222> (1)..(8) <223> local de fosforilação para tirosina-quinase em BDCA-2 humana <400> 28
Lys Leu Arg Glu Tyr Gin Gin Tyr 1 5
<210> 29 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29
Ser Val Cys Glu 1
<210> 30 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 —Ser Val—Cys-Glu— 1 118
ΕΡ 1 301 539 /PT
<210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <22 0> <221> INCERTO <222> (1)..(9) <223> local de fosforilação para tirosina-quinase em dectina-2 de ratinho < 4 0 0 > 31
Arg Arg Leu Tyr Glu Leu His Thr Tyr 1 5
<210> 32 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32
Gly Gly Arg Arg 1
<210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus < 2 2 0 > <221> INCERTO <222> (1)..(6) <223> local de N-miristilação em dectina-2 de ratinho <400> 33
Gly Vai Cys Trp Thr Leu 1 5
<210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus < 2 2 0 > <221> INCERTO <222> (1)..(6) <223> local de N-miristilação em dectina-2 de ratinho <400> 34
Gly Thr Met Vai Ser Glu 1 5
<210> 35 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus 119 ΕΡ 1 301 539 /PT <22 0> <221> INCERTO <222> (1)..(6) <223> local de N-miristilação em dectina-2 de ratinho <400> 35
Gly Cys Cys Pro Asn His 1 5
<210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens < 2 2 0 > <221> INCERTO <222> (1)..(6) <223> local de N-miristilação em DCIR humano <400> 36
Gly Ile Asn Thr Ala Ser 1 5
<210> 37 <211> 6 <212> PRT <213> Desconhecido < 2 2 0 > <223> motivo ITIM de consenso < 2 2 0 > <221> misc_feature <222> (2)..(5) <223> motivo inibidor de imunorreceptores à base de tirosina (motivo ITIM) de consenso (L/V)XYXX(L/V), o aminoácido "X" da posição 2, 3 e 5 pode ser qualquer aminoácido < 2 2 0 > <221> misc_feature <222> (1)..(1) ou <223> o aminoácido "X" na posição 1 pode ser o aminoácido "I" "V" < 2 2 0 > <221> misc_feature <222> (6)..(6) <213> Homo sapiens <400> 30 _S_er-_Val_Cys_Glu-_ 1
<210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus 120 ΕΡ 1 301 539 /PT <220> <221> INCERTO <222> (1)..(9) <223> local de fosforilação para tirosina-quinase em dectina-2 de ratinho < 4 0 0 > 31
Arg Arg Leu Tyr Glu Leu His Thr Tyr 1 5
<210> 32 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32
Gly Gly Arg Arg 1
<210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus < 2 2 0 > <221> INCERTO <222> (1)..(6) <223> local de N-miristilação em dectina-2 de ratinho <400> 33
Gly Vai Cys Trp Thr Leu 1 5
<210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> INCERTO <222> (1)..(6) <223> local de N-miristilação em dectina-2 de ratinho <400> 34
Gly Thr Met Vai Ser Glu 1 5
<210> 35 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus < 2 2 0 >
<221> INCERTO <222> (1)..(6) <223> local de N-miristilação em dectina-2 de ratinho 121 ΕΡ 1 301 539 /PT <400> 35
Gly Cys Cys Pro Asn His 1 5
<210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens < 2 2 0 > <221> INCERTO <222> (1)..(6) <223> local de N-miristilação em DCIR humano <400> 36
Gly Ile Asn Thr Ala Ser 1 5
<210> 37 <211> 6 <212> PRT <213> Desconhecido < 2 2 0 > <223> motivo ITIM de consenso < 2 2 0 > <221> misc_feature <222> (2)..(5) <223> motivo inibidor de imunorreceptores à base de tirosina (motivo ITIM) de consenso (L/V)XYXX(L/V), o aminoácido "X" da posição 2, 3 e 5 pode ser qualquer aminoácido <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> o aminoácido "X" da posição 1 pode ser o aminoácido "I" ou "V" < 2 2 0 > <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> o aminoácido "X" da posição 6 pode ser o aminoácido "L" ou "V" <400> 37
Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa 1 5
<210> 38 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens 122 ΕΡ 1 301 539 /PT <22 0> <221> INCERTO <222> (1)..(6)
<223> motivo inibidor de imunorreceptores à base de tirosina (motivo ITIM) em DCIR <400> 38
Ile Thr Tyr Ala Glu Vai 1 5
Lisboa,

Claims (29)

  1. ΕΡ 1 301 539 /PT 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Fragmento de ligação ao antigénio isolado compreendendo um domínio polipeptídico que se liga especificamente a uma proteína BDCA-2 codificada pela SEQ ID NO:l, em que a referida proteína BDCA-2 é codificada pelos exões 1-6; exões 1 e 3-6; exões 1-2 e 4-6; ou exões 1-3 e 5-6 de SEQ ID NO:1.
  2. 2. Fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 1 que é um anticorpo monoclonal.
  3. 3. Fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo é um anticorpo humano, de murídeo, humanizado ou biespecífico.
  4. 4. Fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 1 que é um Fab, F(ab')2, scFv, ou polipéptido de fusão, ou é codificado por uma biblioteca de apresentação em fagos.
  5. 5. Fragmento de ligação ao antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 que é conjugado com uma porção quimicamente funcional.
  6. 6. Fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 5, em que a porção quimicamente funcional é seleccionada do grupo constituído por um radioisótopo, composto fluorescente, composto quimioluminescente, composto bioluminescente, enzima e um marcador paramagnético.
  7. 7. Fragmento de ligação ao antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 que está ligado a uma proteína BDCA-2.
  8. 8. Fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 7 que está ligado a uma célula dendrítica ou a uma célula mononuclear de sangue periférico que expressa uma proteína BDCA-2.
  9. 9. Fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 8, em que a célula é uma célula dendrítica. ΕΡ 1 301 539 /PT 2/4
  10. 10. Fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 9, em que a célula é uma célula dendritica plasmocitóide.
  11. 11. Fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 10, em que a célula dendritica é BDCA-4+.
  12. 12. Fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 11, em que a célula dendritica é humana.
  13. 13. Fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 10, em que um anticorpo anti-BDCA-4 também está ligado à célula dendritica.
  14. 14. Composição compreendendo o fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 1 ou 2 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
  15. 15. Hibridoma que produz um anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 2.
  16. 16. Método para preparar uma população de células enriquecida em células BDCA-2+, compreendendo contactar uma mistura de células humanas com um fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 1 e isolar as células às quais se liga o fragmento de ligação ao antigénio.
  17. 17. Método para detectar uma proteína BDCA-2 numa amostra biológica compreendendo (a) contactar a proteína BDCA-2 com o seu fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 1, sob condições que permitem a formação de um complexo entre a proteína BDCA-2 e o fragmento de ligação ao antigénio; e (b) detectar a formação do complexo.
  18. 18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que a proteína BDCA-2 é apresentada na superfície de uma célula dendritica.
  19. 19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o passo para detectar a formação do complexo compreende a detecção da modulação funcional da célula dendritica, em que a modulação funcional é: ΕΡ 1 301 539 /PT 3/4 A. indução e sub-regulação de respostas de células T CD4+ e CD8+; B. polarização da resposta imunitária no sentido de tolerância e imunidade; C. polarização das respostas de células T CD4+ no sentido do desenvolvimento de células Thl, desenvolvimento de células Th2 ou desenvolvimento de células T CD4+ Th3/T-regulador-l; D. modulação de respostas de células B e/ou respostas de células NK.
  20. 20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o passo de detecção da formação do complexo compreende a detecção da sub-regulação da produção de interferão tipo I, sub-regulação de respostas imunitárias de Thl, indução da mobilização de Ca2+ intracelular, ou polarização de uma resposta imunitária contra Th2.
  21. 21. Método de ligação de antigénio BDCA-2 numa célula dendritica, compreendendo contactar a célula com o fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 1 ou 2.
  22. 22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a ligação do antigénio BDCA-2 resulta numa alteração metabólica seleccionada de entre sub-regulação da produção de interferão tipo I, sub-regulação de respostas imunitárias de Thl, indução da mobilização de Ca2+ intracelular ou polarização de uma resposta imunitária contra Th2.
  23. 23. Método para pesquisar agentes que interferem com a ligação de BDCA-2, em que o referido método compreende contactar uma proteína BDCA-2 e um fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 1 ou 2 na presença de um agente de teste e determinar se o agente de teste reduz a ligação do fragmento de ligação ao antigénio à proteína.
  24. 24. Kit compreendendo um fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 1 ou 2 e um componente seleccionado do grupo constituído por: proteína BDCA-2, um tampão e um marcador conjugado, ou que pode ser conjugado, ao fragmento de ligação ao antigénio. ΕΡ 1 301 539 /PT 4/4
  25. 25. Proteína BDCA-2 isolada ou recombinante codificada pela SEQ ID NO:l, ou um seu fragmento polipeptídico capaz de se ligar a um anticorpo anti-BDCA-2.
  26. 26. Proteína BDCA-2 de acordo com a reivindicação 25, em que a referida proteína BDCA-2 é codificada pelos exões 1-6; exões 1 e 3-6; exões 1-2 e 4-6; ou exões 1-3 e 5-6 de SEQ ID NO: 1.
  27. 27. Polinucleótido isolado ou recombinante que codifica para uma proteína BDCA-2 de acordo com a reivindicação 25 ou 26.
  28. 28. Polinucleótido que codifica para uma proteína ou fragmento de BDCA-2 seleccionados de entre: (a) um polinucleótido compreendendo pelo menos 15 nucleótidos consecutivos da sequência apresentada na Figura 12 (SEQ ID NO:l) e que codifica para uma proteína ou fragmento de BDCA-2; (b) um polinucleótido com pelo menos 50 nucleótidos que híbrida com o complemento do ADN de (a) e que codifica para uma proteína ou fragmento de proteína BDCA-2; e (c) um polinucleótido com uma sequência que é degenerada como resultado do código genético em relação às sequências de ADN definidas em (a) e (b) e que codifica para um polipéptido ou fragmento de BDCA-2.
  29. 29. Proteína BDCA-2 isolada ou recombinante, ou um seu fragmento polipeptídico, capaz de se ligar a um anticorpo anti-BDCA-2, codificada por: (a) um polinucleótido compreendendo pelo menos 15 nucleótidos consecutivos da sequência apresentada na Figura 12 (SEQ ID NO:1); ou (b) um polinucleótido com pelo menos 50 nucleótidos que híbrida com o complemento do ADN de (a); ou (c) um polinucleótido com uma sequência que é degenerada como resultado do código genético em relação a sequências de ADN definidas em (a) e (b). Lisboa
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