ES2280264T3 - Fragmentos de union a antigeno especificos de celulas dendriticas, composiciones y metodos de uso de los mismos, antigenos reconocidos y celulas asi obtenidas. - Google Patents

Fragmentos de union a antigeno especificos de celulas dendriticas, composiciones y metodos de uso de los mismos, antigenos reconocidos y celulas asi obtenidas. Download PDF

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Abstract

Fragmento de unión a antígeno aislado que comprende un dominio de polipéptido que une específicamente una proteína BDCA-2 codificada por SEC ID NO:1, en donde dicha proteína BDCA-2 está codificada por los exones 1-6; exones 1 y 3-6; exones 1-2 y exones 4-6; o exones 1-3 y 5-6 de SEC ID NO: 1.

Description

Fragmentos de unión a antígeno específicos de células dendríticas, composiciones y métodos de uso de los mismos, antígenos reconocidos y células así obtenidas.
Campo de la técnica
La presente invención se refiere a anticuerpos y sus derivados específicos de subpoblaciones de células dendríticas (DCs).También se proporcionan composiciones y métodos de uso de los mismos que incluyen el aislamiento y purificación de las DCs y sus subpoblaciones e inmunoterapia mediada por anticuerpos o ligandos. La invención también se refiere a subpoblaciones de DCs sustancialmente aisladas. También se proporcionan métodos de uso que incluyen inmunoterapia basada en DCs, caracterización de varias enfermedades y expansión de DCs numéricas in vivo por ejemplo con el ligando Flt3.
Estado de la técnica
El desarrollo hematopoyético de las células dendríticas (DCs), células presentadoras de antígenos (APCs) potentes es distinto y puede seguir varias vías de precursores, algunos estrechamente ligadas a monocitos. Las DCs pueden proceder de un precursor linfoide. Thomas y col. (1993) J. Immunol. 150:821-834. Al igual que en la sangre, pueden existir tres subgrupos distintos de DCs presentes en el timo: 1) DCs de CD4+CD11c-plasmacitoides; 2) DC de CD4+CD11c+ y 3) DCs interdigitantes. Se ha propuesto que las DCs de timo y las células T proceden de una célula madre común. Thomas y col. (1996) Stem Cells 14:196-206.
La producción de un gran número de DCs para su uso potencial clínico se ha conseguido recientemente por medio del cultivo in vivo de progenitores con citoquinas. Se han adoptado diversas estrategias para introducir antígenos en las células dendríticas para que puedan presentarse más eficazmente a las células T en el contexto de la coestimulación. También se ha demostrado que las células dendríticas pueden influir en la respuesta de las células T al antígeno que sigue o a una vía humoral o sistémica.
Las células T no son capaces de responder a proteínas sin procesar, sino que necesitan células accesorias para presentar antígenos como epítopos de péptidos expuestos en la superficie celular conjuntamente con moléculas MHC. Los antígenos generados de forma endógena en el citoplasma celular se presentan típicamente en la vía de Clase I y estimulan las reacciones de los linfocitos T citotóxicos (CTL) mientras la proteína exógena está procesada en los compartimentos de MHC Clase II e inducen respuestas de células T (CD4) auxiliares. La estimulación de células T naive requiere la presencia de moléculas coestimuladoras que actúen como señales secundarias en la activación de inmunidad primaria. Las APC tales como las células B y macrófagos son típicamente incapaces de inducir respuestas primarias. Por el contrario, las células dendríticas impulsan su potencia desde la expresión constitutiva no regulada de las moléculas MHC Clase I y II y de adhesión coestimuladoras que son esenciales para el inicio de inmunidad celular efectiva. Avigan (1999) Blood Rev. 13:51-64.
Las DCs son APC las cuales son esenciales para el inicio de respuestas inmunes primarias y para el desarrollo de tolerancia. Las DCs expresan las moléculas MHC que son necesarias para la estimulación de las poblaciones de células T naive. El desarrollo hematopoyético de las DCs es distinto y puede seguir varias vías de precursores, algunas de ellas estrechamente unidas a monocitos. Véase para revisión, Avigan (1999) Blood Rev. 13:51-64. Los diferentes subgrupos de DCs tienen rutas de desarrollo distintas. Un concepto conocido es el de que un subgrupo de DCs posee funciones reguladoras que pueden contribuir a la inducción de tolerancia a los autoantígenos. Austyn (1998) Curr. Opin. Hematol. 5:3-15. De forma inversa, las DCs, o un subgrupo de las mismas, pueden también estar implicadas en la inducción de respuestas inmunes a autoproteínas. Se considera que ciertas respuestas autoinmunes pueden ser debidas a una lesión de tejido microambiental seguida de activación local de DCs y posterior interacción con células T para iniciar una respuesta inmune. Ibrahim y col. (1995) Immunol. Today 16:181-186.
Está siendo utilizada la capacidad de las DCs para iniciar respuestas de las células T en vacunas tumorales de DCs. Hart y col. (1999) Sem. Hematol. 36:21-25. Por ejemplo, las DCs se generan in vitro a partir de células CD34^{+} o monocitos, pulsadas con péptidos y proteínas tumorales y vuelven al paciente para actuar como APC en la inducción de células T específicas de tumor. Brugger y col. (1999) Ann. N.Y. Acad. Sci. 872:363-371. Los estudios en animales han demostrado que las vacunas tumorales de DCs invierten la energía de las células T y causan el posterior rechazo del tumor. Avigan (1999); véase también, Tarte y col. (1999) Leucemia 13:653-663; Colaco (1999) Molec. Med. Today 5:14-17; Timmerman y col. (1999) Ann. Rev. Med. 50:507-529; Hart y colo. (1999) Semin. Hematol. 36:21-25; Thumher y col. (1998) Urol. Int. 61:67-71; y Hermans y col. (1998) N.Z. Med. J. 111:111-113. Otro planteamiento ha sido el aumentar las DCs in vivo mediante la administración del ligando flt. Esto aporta el efecto de compensar la supresión de DC inducida por VEGF. Ohm y col. (1999) J. Immunol. 163:3260-3268. Se han propuesto las DCs para su empleo como adyuvantes en vacunación y en vacunas recombinantes. Fernandez y col. (1998) Cyto. Cell. Mol. Ther. 4:53-65; y Gilboa y col. (1998) Cancer Immunol. Immunother. 46:82-87. También se han propuesto las DCs para su empleo en inmunidad intensificadora después de transplante de células madres. Brugger y col. (1999) Ann. NY Acad. Sci. 363-371. Las DCs desempeñan varios papeles potenciales en inmunología. Por ejemplo, las DCs están implicadas en la infección por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Zoeteweij y col. (1998) J. Biomed. Sci. 5:253-259. También se han propuesto las DCs como adecuadas para su uso en terapia contra el VIH. Weissman y col. (1997) Clin. Microbiol. Rev. 10:358-367.
Las funciones inmunológicas adicionales se relacionan con las DCs, tales como la inducción diferencial de respuestas Th1 o Th2., reacciones autoinmunes y alergias. Rissoan y col. (1999) Science 283:1183-1186; Hermans y col. (1998) NZ Med. J. 111:111-113; y De Palma y col. (1999) J. Immunol. 162:1982-1987.
Los niveles elevados de IFN-\alpha circulante y del factor inductor del IFN-\alpha (algo parecido a un complejo del anticuerpo anti-ADN y ADN) se encuentran en pacientes con SLE y tienen correlación con la actividad de la enfermedad. Además, los pacientes con trastornos no autoinmunes tratados con IFN-\alpha desarrollan frecuentemente anticuerpos y ocasionalmente SLE. Diversos estudios efectuados por Ronnblom y col. (1999) Clin. Exp. Immunol. 115:196-202; (1999) J. Immunol. 163:6306-6313; y (2000) J. Immunol. 165:3519-3626 han demostrado que los factores inductores de IFN-\alpha procedentes de pacientes inducen secreción de IFN-\alpha en las PBMCs de donantes sanos y éstas activan selectivamente las células productoras de IFN-\alpha natural (NIPC = DC plasmacitoide).
Se han restringido estudios sobre DCs sanguíneas por escasez de las células y la relativa falta de marcadores de superficie celular DC-específicos. Los procedimientos para aislar de DCs se basan en el cambio de maduración después de un periodo corto de cultivo, como la adquisición de baja densidad de flotación, o en la expresión de antígenos en activación-maduración de DCs (CD83, CMRF-44 y CMRF-56). Young y col. (1988) Cell Immunol. 111:167; Van Boris y col. (1982) J. Exp. Med. 155:1172; Zhou y col. (1995) J. Immunol. 154:3821-3835; Feamley y col. (1997) Blood 89:3708-3716; Mannering y col. (1988) J. Immunol. Met. 219:69-83; Hock y col. (1999) Tiss. Antigens 53:320-334; y Hock y col. Immunol. 83:573-581.
Las DCs CD1a^{+} funcionales se generan típicamente ex vivo a partir de monocitos y de células CD34^{+} progenitoras hematopoyéticas. Bender y col. (1996) J. Immunol. Met. 196:121-135; Pickl y col. (1996) J. Immunol. 157:3850-3859; Romani y col. (1994) J. Exp. Med. 180:83-93; Sallusto y col. (1994) J. Exp. Med. 179:1109-1118; Caux y col. (1992) Nature 360:258-261; Mackensen y col. (1995) Blood 86:2699-2707; Szabolcs y col. (1995) J. Immunol. 154:5851-5861; Herbst y col. (1996) Blood 88:2541-2548; de Winter y col. (1998) Stem Cells 16:387-396; Strunk y col. (1996) Blood 87:1292-1302; Patente US Nº 6,010,905; y Patente US Nº 6,004,807. No se sabe si las DCs generadas in vitro a partir de monocitos y células progenitoras hematopoyéticas retienen o obtienen todas las características de las DCs in vivo.
Además, han fracasado varios intentos de generar anticuerpos monoclonales (mAb) específicos para DCs humanas, produciendo solamente mAb con unión a antígenos expresados tanto por DC como por otros leucocitos. Las DCs humanas comparten un gran número de estructuras de superficie celular inmunogénicas con otras células sanguíneas, incluyendo las moléculas HLA, y antígenos CD18, CD29, CD31, CD43, CD44, CD45, CD54, y CD58. Estos antígenos pueden dominar la respuesta inmune a las DCs inyectadas a un nivel donde las células B con especificidad para antígenos de DC específicas no están, en absoluto o solo muy raramente, representados entre las células B que tienen la capacidad de fusionarse con las células del mieloma.
Muchos investigadores han tratado de solucionar dicho problema inyectando no DC y ciclofosfamida a ratones adultos con objeto de extirpar células B con especificidad para antígenos compartidos, o inyectando no DC a ratones neonatales con objeto de tolerizar células B con especificidad para antígenos compartidos. O'Doherty y col. (1993) Adv. Exp. Med. Biol. 329:165-172; y Yamaguchi y col. (1995) J. Immunol. Met. 181:115-124.
Se ha utilizado un mAb designado CMRF44 para monitorizar las DCs en pacientes con transplante de células madres. Feamley y col. (1999) Blood 93:728-736. Se han propuesto estas células CMRF44^{+} como adecuadas para su uso en iniciar, mantener y dirigir respuestas inmunes. Feamley (1997). Las DCs se han aislado con mayor frecuencia por medio de una combinación de marcadores de superficie celular. Por ejemplo, la Patente US Nº 5,972,627 describe "células hematopoyéticas enriquecidas para células progenitoras dendríticas hematopoyéticas humanas", las cuales tienen "al menos un 80% de expresión de CD34, CD45RA, y CD10 pero no CD19, CD2, CD3, CD4, CD8, CD20, CD14, CD15, CD16, CD56 y glucoforina".
El aislamiento de las DCs sanguíneas cuenta con múltiples criterios inmunofenotípicos, tales como la ausencia de un panel de antígenos leucocitarios de linaje (lin) específico (p.ej., CD3, CD14, CD19 y CD56) y la presencia de HLA-DR, CD4 o CD33. Romani y col. (1996) J. Immunol. Met. 196:137-151; Thomas y col. (1993) J. Immunol. 150: 821-834; Thomas y col. (1994) J. Immunol. 153:4016-4028; O'Doherty y col (1994) Immunol. 82:487-493; O'Doherty y col. (1993) J. Exp. Med. 178:1067-1076; Nijman y col. (1995) J. Exp. Med. 182:163-174; Ferbas y col. (1994) J. Immunol. 152:4649-4662; Heufler y col. (1996) Eur. J. Immunol. 26:659-668; Ito y col. (1999) J. Immunol. 163:1409-1419; Cella y col. (1999) Nature Med. 5:919-923; Robinson y col. (1999) Eur. J. Immunol. 29:2769-2778; Olweus y col. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12551-12556; Robert y col. (1999) J. Exp. Med. 189:627-636; y Kohrgruber y col. (1999) J. Immunol. 163:3250-3259.
Se ha demostrado por medio de análisis de DCs aisladas de sangre no cultivadas que las DCs sanguíneas no son una población celular homogénea sino una mezcla de por lo menos dos poblaciones. Thomas y col. (1994); O'Doherty y col. (1994); Ito y col. (1999); Cella y col. (1999); Robinson y col. (1999); Olweus y col. (1997); Kohrgruber y col. (1999); Strobl y col. (1998) J. Immunol. 161:740-748; y Rissoan y col. (1999) Science 283:1183-1186. La primera subpoblación de DCs sanguíneas es la CD123^{bright} CD11c^{-}, la cual posee una morfología plasmacitoide y una potente función estimuladora de las células T. La segunda subpoblación de DCs sanguíneas es la CD123^{dim} CD11c^{bright}, la cual siendo más bien monocitoide en apariencia expresa CD45RO y se transforma espontáneamente en típicas DCs maduras, incluso cuando se cultivan sin citoquinas exógenas. Las DC CD123^{bright} CD11c^{-} plasmacitoides exhiben algunas características, tales como la expresión de la cadena \alpha del receptor de célula pre-T, las cuales indican que pueden provenir de precursores linfoides. Strobl y col. (1998); Rissoan y col. (1999); y Bruno y col. (1997) J. Exp. Med. 185:875-884. Las DC CD123^{dim} CD11c^{bright} muestran todos los criterios de DCs mieloides. O'Doherty y col. (1994); e Ito y col. (1999). Robinson y col. (1999); Kohrgruber y col. (1999); y Strobl y col. (1998). Se han detectado DCs que se parecen a las DC CD123^{bright} CD11c^{-} plasmacitoides en las zonas ricas en células T del tejido linfoide, las cuales fueron en un principio designadas erróneamente células T plasmacitoides o monocitos plasmacitoides debido a su morfología y fenotipo. Grouard y col. (1997) J. Exp. Med. 185:1101-1111; Lennert y col. (1975) Lancet 1:1031-1032; Lennert y col. (1984) en ``Leukocyte Typing. Human Leukocyte Differentiation Antigens Detected by Monoclonal Antibodies. Bernard y col. Editores. Spring-Verlag, Berlin; y Facchetti y col. (1988) Am. J. Pathol. 133:15. Se han localizado DCs que se parecen a las DC CD123^{dim} CD11c^{bright} sanguíneas en la zona oscura y clara de los centros germinales. Grouard y col. (1996) Nature 384:364-367.
Variantes de empalme
Las estimaciones del número total de genes expresados oscilan entre 40,000 y más de 150,000, Dicha cantidad no es un reflejo exacto del número de proteínas codificadas ya que, en muchos casos, más de una variante de empalme procedente de los ARNm (transcriptoma) se producía a partir de estos genes. Las estimaciones nuevamente varían, pero quizás tanto como 500,000 ARNm diferentes son producidos en los humanos. Se calcula que al menos un 30% de los genes humanos poseen diversos variantes de empalme. Mironov y col. (1999) Genome Research 9:1288-1293. Algunos creen que estas cifras son conservadoras. Se cree que son ciertas cifras similares para el ratón y la rata y tiene lugar también un empalme alternativo en organismos inferiores, tales como la Drosophila melanogaster y Caenorhabditis elegans. Las proteínas traducidas de diferentes variantes de empalme pueden poseer funciones significativamente diferentes, tal como ha quedado evidente en un número creciente de estudios de investigación. Las diferentes variantes de empalme pueden ser expresadas en tejidos diferentes, fases de desarrollo diferentes y estados de enfermedad diferentes.
Lectinas de tipo C
Las lectinas de tipo C son una familia de glucoproteínas que muestran similitudes de secuencia de aminoácidos en sus dominios de reconocimiento de hidratos de carbono (CRD) y que se unen a hidratos de carbono seleccionados de una manera dependiente de Ca^{2+}. Las lectinas de tipo C se han subdividido en cuatro categorías (Vasta y col. 1994; y Spiess 1990). El primer grupo comprende proteínas integradas en membrana de tipo II, tales como los receptores de asialoglucoproteína, galactosa de macrófagos y lectina específica de N-acetil-glucosamina (Glc-Nac), y CD23 (Fc_{\varepsilon}RII). Muchos miembros de este grupo exhiben especificidad por residuos de galactosa/fucosa, galactosamina/GalNac o GlcNac. El segundo grupo incluye proteínas con núcleo de proteoglucano de fibroblasto y cartílago. El tercer grupo incluye las llamadas "colectinas" tales como las proteínas de unión a manosa en suero, proteína de surfactante pulmonar SP-A y conglutinina. El cuarto grupo incluye ciertas moléculas de adhesión conocidas como LEC-CAM (p. ej., Mel-14, GMP-140 y ELAM-1).
Se sabe que las lectinas de tipo C actúan como aglutininas, opsoninas, activadores del complemento, y moléculas de reconocimiento asociadas a células (Vasta y col. 1994; Spiess 1990; y Kary 1991). Por ejemplo, los receptores de manosa de macrófagos hacen una funcióndepuradora ("scavenger") (Shepherd y col. 1990), así como mediar en la captación de organismos patógenos, incluyendo Pneumocystis carinii (Ezekowitz y col. 1991) y Candida albicans (Ezekowits y col. 1990). La proteína de unión a manosa en suero imita Clq en su capacidad de activar el complemento a través de la ruta clásica. Las mutaciones genéticas en esta lectina predispone a las infecciones recurrentes severas, diarrea, y retraso de crecimiento (Reid y col. 1994). De esta manera, las lectinas muestran diversas funciones con significancia biológica.
Los grupos de hidratos de carbono no sirven necesariamente como ligandos "naturales" para las lectinas de tipo C. Por ejemplo, CD23 (FC_{\varepsilon}RII), que pertenece a la familia de la lectina de tipo C tal como se ha comprobado por su unión de Gal-Gal-Nac (Kijimoto-Ochial y col. 1994) y por su secuencia CRD, se sabe actualmente que reconoce la IgE de una forma independiente de los hidratos de carbono; tanto una forma enzimáticamente desglucosilada de IgE así como la IgE (no glucosilado) recombinante producida en E. coli ambos se unen a CD23 (Vercelli y col. 1989. De este modo, las lectinas de tipo C reconocen las secuencias de polipéptidos en sus ligandos naturales.
Se han identificado varias lectinas de tipo C en la superficie de las DCs. En primer lugar, Jiang y col. clonaron la proteína reconocida por la NLDC-145 mAb, una de los mAb más extensamente utilizados frente a la DC murina (Jiang y col. 1995 ). Se observó que dicha proteína, actualmente denominada DEC-205, era un nuevo miembro de la familia de las lectinas de tipo C, la cual contiene diez CRD distintas. En segundo lugar, Sallusto y col. describieron que las DCs humanas expresan receptores de manosa de macrófagos (MMR), las cuales contienen también múltiples CRD (Sallusto y col. 1995). Se ha sugerido que ambos receptores median la endocitosis de las moléculas glucosiladas por DC, en base a las observaciones que: a) anticuerpos de conejo policlonales frente a DEC-250 no sólo se unían a DEC-205 en superficies de DC sino que se internalizaban posteriormente; b) dichas DC activaban eficazmente una línea de células T reactiva a la IgG de conejo; y c) la internalización de FITC-dextrano por DC era bloqueada eficazmente con mannan, un competidor de los receptores de manosa (Jiang y col. 1995; y Sallusto y col. 1995). Con respecto a la especificidad del tipo de células, se sabe actualmente que DEC-250 también está expresada, aunque a niveles inferiores, por células B y células epiteliales de timo, intestino, y pulmón (Witmer-Pack y col. 1995; e Inaba y col. 1995) y MMR también está expresada incluso más abundantemente por macrófagos (Stahl 1992). También se han encontrado en superficies de DCs, incluyendo DCIR, MDL-1, NURPIA, Dectin-1, Dectin-2, CLEC-1, CLEC-2, Langerin, y DC-sign.
Alergias
Las respuestas alérgicas, incluyendo las de asma y rinitis alérgicas, se caracterizan por una respuesta de fase temprana, que tiene lugar en segundos a minutos de la exposición a alérgenos y se caracteriza por la infiltración de eosinófilos en el lugar de exposición del alérgeno. Concretamente, durante la fase temprana de la respuesta alérgica, la activación de linfocitos de tipo Th2 estimula la producción de anticuerpos IgE específicos de antígenos, lo cual a su vez desencadena la liberación de histamina y otros mediadores de la inflamación de mastocitos y basófilos. Durante la respuesta de fase tardía, es elevada la producción de IL-4 y IL-5 por las células CD4+ Th2. Estas citoquinas parecen desempeñar un papel significante en el reclutamiento de eosinófilos en el lugar de exposición a alérgeno, donde se produce la lesión y disfunción tisular.
Actualmente, la inmunoterapia con antígenos para los trastornos alérgicos comprende la inyección subcutánea de cantidades pequeñas, pero gradualmente crecientes de antígeno en un proceso llamado terapia de desensibilización. La inmunoterapia con antígenos es meramente paliativa y, hoy en día, no es curativa. Weber (1997) JAMA 278:1881-1887; Stevens (1998) Acta Clinica Beligica 53:66-72; y Canadian Society of Allergic and Clinical Immunology (1995) Can. Med. Assoc. J. 152:1413-1419.
Muchos pacientes que inician la terapia no completan el régimen de dosis, y si se dejan de administrar las inyecciones durante más de una semana, el paciente puede empezar de nuevo el tratamiento entero. Se han identificado diversos antígenos que se han producido por medios recombinantes. Para revisiones, véase Baldo y col. (1989) Allergy 44:81-97; Baldo (1991) Curr. Opin. Immunol. 3:841-850; Blazer (1994) Ther. USMC 51:19-23; y Valenta y col. (1996) Adv. Exp. Bio. 409:185-196.
Los tratamientos de inmunoterapia con antígenos presentan el riesgo de inducir potencialmente anafilaxis mediada por IgE letal y no se aplican a los casos de respuesta de fase tardía alérgica mediados por citoquina. Se ha descrito esta terapia como que "es potencialmente accidental". Weber (1997). Otro problema significativo de la inmunoterapia con antígenos es que el riesgo de reacciones adversas, en especial anafilaxis, reduce significativamente la dosificación de antígeno tanto con respecto a la cantidad dada por administración como por la cantidad dada durante un periodo de tiempo. De este modo, la inmunoterapia alérgica tradicional se prolonga haciéndola muy duradera, poco práctica y costosa.
Un planteamiento alternativo para el tratamiento de trastornos asociados a IgE, tales como las alergias, implica la administración de compuestos que inhiben la liberación de histamina. Muchos de dichos fármacos están disponibles como medicamentos sin receta médica. Otros fármacos incluyen un anticuerpo de unión anti-IgE. Sin embargo, un inconveniente de este planteamiento es que meramente enmascara los síntomas, mientras que no proporciona ninguna clase de cura o protección permanente.
Muzny y col. describen en EMBL A L 006517 (1999/02/05) una secuencia de nucleótidos de 218414 pares de bases que es parte de la secuencia del cromosoma 12 humano. Esta es una secuencia preliminar de trabajo de 63 contigs sin ordenar.
Breve descripción de la invención
La invención se refiere a procedimientos para enriquecer poblaciones de células hematopoyéticas enriquecidas con DCs y subgrupos de las mismas. La invención también se refiere a composiciones enriquecidas para las células y poblaciones de células obtenidas de las mismas. Se describen también procedimientos para producir DCs modificadas genéticamente. Las composiciones de DCs modificadas genéticamente también se describen. También se incluyen los métodos de uso de las células. También se presentan fragmentos de unión a antígeno específicos de BDCA-2 y los antígenos reconocidos por los mismos.
La invención abarca fragmentos de unión a antígeno específicos de un subgrupo de DCs específicamente reconocidos por un anticuerpo designado AC144, AD5-1311 o AD5-4B8. La invención incluye fragmentos de unión a antígeno específicos para un epítopo de un antígeno designado BDVA-2.
La invención abarca una población o subpoblación de DCs sustancialmente aislada o concentrada específicamente reconocida por un fragmento de unión a antígeno de la invención. Dichos fragmentos de unión a antígeno pueden ser cualquiera de los siguientes: AC144, AD5-1311 o AD5-4B8, o fragmentos de unión a antígeno específicos de
BDCA-2.
La invención abarca además poblaciones o subpoblaciones de DCs donde sustancialmente todas las células se expresan o son aisladas, concentradas o enumeradas en base a la expresión de BDCA-2. Dichas células pueden ser suspendidas en cualquier excipiente fisiológicamente aceptable. Preferiblemente, el excipiente es farmacológicamente aceptable.
\newpage
La invención abarca además procedimientos para obtener composiciones de células hematopoyéticas enriquecidas con DCs por medio de la separación de una mezcla de células hematopoyéticas humanas en una fracción donde al menos un 80% de las células en la fracción son BDCA-2^{+}.
La invención abarca además procedimientos para aislarun subgrupo de DCs sustancialmente puro por medio de a) la obtención de una mezcla de células hematopoyéticas humanas; y b) por el aislamiento sustancial de las células de la mezcla específicamente reconocida por un fragmento de unión a antígeno específico del antígeno designado BDCA-2.
La invención abarca además procedimientos para enumerar las DCs por medio de a) obtención de una mezcla de células; y b) marcaje de las células con una fragmento de unión a antígeno específico de BDCA-2.
La invención abarca además procedimientos para modular la capacidad inmune de las DCs por medio de aislamiento de una población o subpoblación de DCs sustancialmente puras, y modulación de la movilización de calcio de las DCs.
La invención abarca además procedimientos para seleccionar agentes de ensayo para la detección de ingredientes farmacéuticamente activos por medio del aislamiento de una población o subpoblación de DCs sustancialmente puras con un fragmento de unión a antígeno específico de BDCA-2; selección de las células aisladas con agentes de ensayo; seguimiento de la respuesta de las células a los agentes; comparación de la respuesta de las células a los agentes a las células expuestas a un agente control, y determinación de si el agente de ensayo modula cualquier propiedad inmunológica de la célula aislada.
La invención abarca además procedimientos para modular una propiedad inmunológica de las DCs por medio de la alteración de la capacidad de la DC en movilizar el calcio.
La invención abarca además composiciones inmunogénicas e inmunomoduladoras de las DC, preferiblemente en un excipiente fisiológicamente aceptable.
La invención incluye además procedimientos para tratar una condición fisiológica mediante la administración de una cantidad efectiva de composiciones de DCs inmunogénicas o inmunomoduladoras a un sujeto que lo requiera.
La invención abarca además procedimientos para producir citoquinas de DCs mediante el aislamiento de una población o subpoblación de DCs sustancialmente puras con un fragmento de unión a antígeno específico de BDCA-2, y aislamiento de las citoquinas de las células o productos celulares o sobrenadantes.
La invención abarca además procedimientos para modular la producción de citoquinas de DCs mediante el aislamiento de una población o subpoblación de DCs sustancialmente puras con un fragmento de unión a antígeno específico de BDCA-2, y tratamiento de las células con agentes que modulen la producción de citoquinas de DCs.
La invención abarca además procedimientos para modular la producción de citoquinas de DCs in vivo mediante la administración de una cantidad efectiva de un agente que module la producción de citoquinas de DCs, a un sujeto que lo requiera.
La invención abarca además procedimientos para generar anticuerpos específicos de un antígeno mediante la administraciónde una cantidad efectiva de población o subpoblación de DCs cargadas con el antígeno y aisladas con un fragmento de unión a antígeno específico de BDCA-2, donde las DCs son moduladas para inducir una respuesta de Th2.
La invención abarca además procedimientos para generar una respuesta inmune humoral o de célula T específica de un antígeno mediante la administración de una cantidad efectiva de una población o subpoblación de DCs sustancialmente pura cargada con el antígeno y aislada con un fragmento de unión a antígeno específico de uno o más BDCA-2, a un sujeto que lo requiera, donde las células son moduladas para inducir una respuesta de Th1.
La invención abarca además polipéptidos preparados mediante la expresión de polipéptidos en una célula hospedadora recombinante y purificación del polipéptido expresado de los componentes totales de la célula hospedadora recombinante, donde el polipéptido contiene aproximadamente 5 residuos de aminoácidos contiguos de SEC ID NO:2.
La invención abarca además polipéptidos purificados y composiciones de los mismos, donde el polipéptido contiene aproximadamente 5 residuos de aminoácidos contiguos de SEC ID NO:2.
La invención abarca además proteínas de fusión de una secuencia de aminoácidos de polipéptidos enlazada a una secuencia de aminoácidos de polipéptidos que no es SEC ID NO:2, donde la secuencia de aminoácidos contiene aproximadamente 5 residuos de aminoácidos contiguos de SEC ID NO:2.
La invención abarca además polipéptidos que contienen al menos una variante de empalme de BDCA-2.
La invención abarca además un polinucleótido o un complemento del mismo que codifica al menos 5 residuos de aminoácidos contiguos de BDCA-2, una variante de empalme o un fragmento de los mismos.
La invención abarca además células hospedadoras recombinantes que contienen un polinucleótido o un complemento del mismo que codifica al menos 5 residuos de aminoácidos contiguos de BDCA-2, una variante de empalme o un fragmento de los mismos.
La invención abarca además un procedimiento para inhibir una interacción de una DC con una célula T mediante la puesta en contacto de una composición que contiene DC y células T con una cantidad efectiva de un agente que inhiba la interacción de BDCA-2 con la célula T.
La invención abarca además un procedimiento para tratar la inflamación mediante la administración a un sujeto, que lo requiera, de una cantidad de un agente que inhiba la interacción de BDCA-2 con la célula T siendo efectiva para reducir la inflamación en el sujeto.
La invención abarca además un procedimiento para suprimir la expresión de BDCA-2 en una célula mediante la expresión de un polinucleótido antisentido de BDCA-2 en la célula.
La invención abarca además un animal transgénico que contiene el polinucleótido o un complemento del mismo que codifica al menos 5 residuos de aminoácidos contiguos de BDCA-2, una variante de empalme o un fragmento de los mismos.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra las distribuciones de frecuencia de puntos ("dot plots") del análisis por citometría de flujo de las células mononucleares en sangre periférica (PBMC) aisladas por centrifugación del gradiente de densidad de Ficoll-Paque. En la Figura 1 se presenta la expresión BDCA-2, BDCA-3 y CD1c (BDCA-1) en PBMC.
La Figura 1A muestra la tinción de PBMC con mAb conjugado con FITC frente a BDCA-2(AC144), BDCA-3(AD5-5E8) y CD1c(AD5-8E7), y mAb conjugado con PE frente al heterodímero TCR\alpha\beta, CD14, CD19 y CD56, respectivamente. Los números indican el porcentaje de células en el respectivo cuadrante. La fluorescencia de yoduro de propidio y las señales de dispersión de luz se utilizaron para el establecimiento de ventanas de análisis de las células vivas.
La Figura 1B muestra el perfil de dispersión de (a) PBMC, (b) células BDCA-2^{+}, distribuidas en ventanas (c) células BDCA-3^{+} distribuidas en ventanas y (d) células CD1c^{+} distribuidas en ventanas.
La Figura 2 muestra que BDCA-2, BDCA-3, BDCA-4 y CD1c(BDCA-1) se expresan en tres subgrupos de DCs sanguíneas distintos. Las DCs sanguíneas se aislaron de PBMC por depleción de células CD3, CD11b y CD16 positivas seguidas de enriquecimiento de las células CD4 positivas. La pureza de las DCs sanguíneas se demuestra mediante las propiedades de dispersión de luz (trazos de puntos superior izquierda) y la tinción de anti-HLA-DR-Cy5 vs. anti-Lin-FITC (anti- TCR\alpha\beta, CD14, CD19 y CD56 (trazos de puntos superior media). Obsérvese que solamente están presentes unas pocas células lin^{+}. La expresión de BDCA-2, BDCA-3, BDCA-4 y CD1c en DCs sanguíneas se caracteriza en una serie de tinciones de dos colores con PE- y mAb conjugado con FITC frente a CD11c, CD123 y los mismos antígenos. Obsérvese que BDCA-2, BDCA-3, BDCA-4 y CD1c se expresan solamente en uno de los tres subgrupos de DCs sanguíneas cada uno. Los subgrupos se definen de acuerdo con la tinción de las DCs sanguíneas con CD123-PE vs. CD11c-FITC (trazos de puntos superior izquierda): DC sanguínea CD11c^{-}CD123^{bright}; DC sanguínea CD11c^{bright}CD123^{dim}; y DC sanguínea CD11c^{dim}CD123^{-}.
La Figura 3 representa la expresión de BDCA-4 en PBMC. Se muestra la tinción de dos colores de PBMC con mAb conjugado con FITC frente a BDCA-2(AC144) y mAb conjugado con PE frente a BDCA-4 (ADS-17F6). Obsérvese que se detectan pocas PBMC individuales positivas (BDCA-2+BDCA-4- y BDCA-2-BDCA-4+).
La Figura 4 muestra la expresión de BDCA-2, BDCA-3 y BDCA-4 en DC sanguínea purificada después de varios períodos de cultivo en presencia de IL-3. Las DC sanguíneas purificadas se cultivaron durante 0, 1, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 36 y 48 horas en presencia de rIL-3 y a continuación se analizaron por citometría de flujo para la expresión de CD-11c, BDCA-3, BDCA-2 y BDCA-4. (A) Los histogramas muestran la tinción de las DC CD11c^{-} y CD11c^{+} de ventana con mAb anti-BDCA-2 conjugado con PE (AC144) y mAb anti-BDCA-4 (AD5-17F6) (líneas en negrita) y mAb de isotipo control conjugado con PE (líneas tenues), respectivamente. Los trazos de puntos muestran la tinción de DC sanguínea con CD11-c-PE vs. anti-BDCA-3 (AD5-5E8) biotina/estreptavidina-APC. (B) Los diagramas muestran los valores de la intensidad de fluorescencia media (MFI) para la tinción anti-BDCA-2-PE, anti-BDCA-4-PE y anti-BDCA-3 biotina/estreptavidina-APC de las DC CD11c^{-} (\ding{115}) y CD11c^{+} (\blacksquare), respectivamente. Para BDCA-2 y BDCA-4, los valores MFI fueron calculados restando los valores obtenidos con mAb de isotipo control de los valores obtenidos con AC144 y AD5-17F6, respectivamente. Para BDCA-3, los valores MFI se calcularon restando los valores obtenidos sin ninguna tinción de mAb (autofluorescencia) de los valores obtenidos con AD5-5E8.
La Figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos de una isoforma de BDCA-2 con todos los seis exones expresados (SEC ID NO:2).
\newpage
La Figura 6 demuestra que el mAb AD5-8E7 específico de BDCA-1-bloquea la unión de mAb CD1c M241 a las células MOLT-4. Las células MOLT-4 se preincubaron con cantidades saturantes de mAb AD5-8E7 (línea en negrita) o mAb de isotipo control (línea tenue) y a continuación se tiñeron con mAb CD1c conjugado con PE (M241).
La Figura 7 muestra la expresión de BDCA-2, BDCA-3 y BDCA-4 en DCs derivadas de células Mo-DC y CD34^{+} (CD34-DC). Los monocitos CD14^{+} y las células progenitoras hematopoyéticas CD34^{+} se purificaron inmunomagnéticamente por medio de marcaje magnético directo con microesferas conjugadas con mAb de CD14 y CD34, respectivamente. Los monocitos purificados se cultivaron durante 7 días en presencia de rGN-CSF y rIL-4, y las DC CD34 purificadas se cultivaron durante 11 días en presencia de rflt3-ligando, eTGF-\beta1, rTNF-\alpha y rGM-CSF. Después del periodo de cultivo, las células se tiñeron con CD1a-FITC, CD1c-PE (AD5-8E7), anti-BDCA-2-PE(AC114), anti-BDCA-3-PE/(AD5-5E8) y anti-BDCA-4-PE(AD5-17F6). Los histogramas muestran la tinción de (A) Mo-DC y (B) CD34-DC (líneas en negrita), respectivamente. Las líneas tenues muestran la tinción con mAb de isotipo control. Con excepción del histograma izquierdo-superior (tinción de CD1a), las células CD1a^{+} de ventana se muestran en (B).
La Figura 8 muestra que el cultivo de las células BDCA-2^{+} marcadas con mAb anti-BDCA-2 da por resultado una rápida internalización de mAb. Las PBMC se marcaron a 4ºC con mAb anti-BDCA-2 conjugado con FITC (AC144, IgG1), se incubaron a 37ºC durante los tiempos indicados y se tiñeron después a 4ºC con mAb IgG1 anti-ratón de rata conjugado con PE (X56) y mAb CD123 conjugado con Cy5 (AC145, IgG2a). Se muestran los valores de MFI de la tinción anti-BDCA-2-FITC (\blacksquare) y mAb-PE de IgG1 anti-ratón de rata (\ding{115}) de las células BDCA-2^{+}CD123^{+} de ventana.
La Figura 9 muestra la morfología de las DC en sangre CD1c^{+}, BDCA-2^{+} y BDCA-3^{+} purificadas inmunomagnéticamente. Las células CD1c^{+}, BDCA-2^{+} y BDCA-3^{+} se aislaron de PBMC por marcaje magnético indirecto con mAb primario conjugado con PE (AD5-8E7, AC144 y ADS5-5E8) y microesferas conjugadas con mAb anti-PE seguido de enriquecimiento de células marcadas por MAC. Los trazos de puntos muestra la tinción de PBMC con HLA-DR-FITC y mAb conjugado con PE antes (puntos parte izquierda) y después (puntos parte derecha) del enriquecimiento magnético de las células CD1c^{+} (puntos parte superior), BDCA-2^{+} (puntos parte media) y BDCA-3^{+} (puntos parte inferior), respectivamente. Los tres cuadros a la derecha muestran la tinción de May-Grunwald/Giemsa de las células aisladas CD1^{+} (cuadro superior), BDCA-2^{+} (cuadro medio) y BDCA-3^{+} (cuadro inferior) después de la citocentrifugación. Obsérvese que se pueden ver pequeños linfocitos en el cuadro de las células CD1c^{+} enriquecidas Estas son células B CD1c^{+}.
La Figura 10 muestra la sobrerregulación de MHC clase II, CD83 y moléculas coestimaduladoras sobre las DCs sanguíneas CD1c^{+}, BDCA-2^{+} y BDCA-3^{+} en cultivo. Las células CD1c^{+} (A), BDCA-2^{+} (C) y BDCA-3^{+} (B) purificadas se cultivaron durante 1 día en medio (CD1c^{+} y BDCA-3^{+} BDC) o durante 2 días en medio con rIL-3 y mAb anti-CD40 en células L transfectadas con CD32 (BDCA-2^{+} DC), respectivamente. Mo-DC "inmaduras" (D) fueron generadas por cultivo de monocitos durante 7 días en medio en presencia de rGM-CSF y rlL-4. Mo-DC "maduras" (E) fueron generadas por cultivo de Mo-DC inmaduras durante otros 3 días en medio en presencia de TNF\alpha. Los histogramas muestran la tinción de las células con CD1a-FITC, CD80-PE, CD83-PE, CD86-PE y HLA-DR-PE, respectivamente (líneas en negrita). Las líneas tenues muestran la tinción de las células con mAb de isotipo control y fluorocromo.
La Figura 11 muestra la capacidad endocítica de las DCs sanguíneas CD1c^{+}, BDCA-2^{+} y BDCA-3^{+} recién aisladas en comparación con las células T CD3^{+} purificadas. Las células T (*)CD3^{+},CD1c^{+} DC (\blacklozenge), BDCA-2^{+} BDC (\ding{115}), BDCA-3^{+} (\blacksquare) aisladas se incubaron a 37ºC en medio con 1 mg/ml de Amarillo de Lucifer (LY) durante 0, 15, 45 y 75 minutos, se lavaron tres veces en hielo frío PBS/EDTA/BSA y se analizaron, a continuación, por citometría de flujo. Se muestran los valores MFI para la fluorescencia LY después de restar los valores MFI, los cuales se obtienen en incubación a 4ºC en ausencia de LY.
La Figura 12 representa la secuencia ADNc de BDCA-2 (SEC id no 1).
La Figura 13 muestra que la movilización de Ca^{2+} intracelular es inducida en las DC BDCA-2^{+}BDCA-4^{+} purificadas inmunomagnéticamente (A, B) y células U937 transfectadas con BDCA-2 (D), pero no en células U937 no transfectadas (E) por medio de mAb anti-BDCA-2 solo (A) y o anti-BDCA-2 más mAb secundario reticulado (B, D, E). La ligación de BDCA-4 en BDCA-2^{+}BDCA-4^{+} BDC purificadas inmunomagnéticamente con mAb anti-BDCA y mAb secundario reticulado no induce movilización de Ca^{+} intracelular. Se muestra la relación 405nm/525nm dependiente del Ca^{+} de la Indo-1-fluorescencia (eje Y) frente al tiempo (eje X, un valor de 1024 corresponde a 204.8 segundos). A es DC sanguínea BDCA-2+BDCA-4+, anti-BDCA-2 (AC144, IgG1). B es DC sanguínea BDCA-2+BDCA-4+, anti-BDCA-2 (AC144, IgG1) más IgG1 (X56) anti-ratón de rata. C es DC sanguínea BDCA-2+BDCA-4+, anti-BDCA-2 (AD5-17F6, IgG1) más IgG1 (X56) anti-ratón de rata. D es células U937 tranfectadas con BDCA-2, anti-BDCA-2(AC144, IgG1) más IgG1 (X56) anti-ratón de rata. E son células U937 no tranfectadas con U937, anti-BDCA-2 (AC144, IgG1) más IgG1 (X56) anti-ratón de rata.
La Figura 14 muestra que la ligación de BDCA-2, pero no de BDCA-4 con un mAb específico seguido de un mAb secundario reticulado inhibe la secreción de interferón tipo I por las DCs BDCA-2^{+}BDCA-4^{+}DC plasmacitoides procedentes de sangre o amígdalas en respuesta a la estimulación con la cepa del virus de la gripe PR8. Las DC BDCA-2^{+}BDCA-4^{+} plasmacitoides procedentes de sangre (A) recién aislada o amígdalas (B) se cultivaron durantes 24 horas en presencia de IL-3 solo (control); IL-3, mAb anti-BDCA-2 y mAb de IgG1 anti-ratón de rata (AC144+RamG1); IL-3, mAb anti-BDCA-2, mAb de IgG1 anti-ratón de rata y cepa del virus de la gripe PR8 (AC144+Ram-G1+FLU); IL-3 y cepa del virus de la gripe PR8 (FLU); IL-3, mAb anti-citoqueratina, mAb de IgG1 anti-ratón de rata, y cepa del virus de la gripe PR8 (CK3+Ram-G1-FLU); IL-3, mAb anti-BDCA-4, mAb de IgG1 anti-ratón de rata, y cepa del virus de la gripe PR8 (17F6+RamG1+FLU). El interferón tipo I secretado (U/ml) en los sobrenadantes del cultivo se determinó por medio de un bioensayo con referencia a una curva estándar (U/ml) de interferón tipo I.
La Figura 15 muestra la presentación de mAb anti-BDCA-2 (AC144, IgG1) a un clon de célula T específico de IgG1 de ratón por DCs plasmacitoides que expresa BDCA-2 y BDCA-4 aisladas. Las DCs plasmacitoides de BDCA-2^{+} y BDCA-4^{+} presentan mAb anti-BDCA-2 (AC144, IgG1, \blacksquare) a las células T mucho más eficientemente que el mAb anti-ILT-3 (ZM3.8 IgG1, \ding{115}) y el mAb anti-citoqueratina (CK3-11D5, IgG1 \bullet).
La Figura 16 muestra la expresión de BDCA-2 y BDCA-4 en las DC CD123^{+} plasmacitoides amigdalinos.
La Figura 17 demuestra que la neuropilina-1 (GenBank No. de Acceso 003873) se inmunoprecipita de lisados celulares de células PEA transfectadas con neuropilina-1 (NP), pero no de células PAE no transfectadas con el mAb (AD5-17F6) anti-BDCA-4 (anti-NRP-1 (ML)). Las proteínas precipitadas se analizaron por medio del análisis SDS-PAGE y Western-blotting con el mAb AD5-17F6 (ML) o un mAb específico de neuropilina-1 procedente de Shay Soker, Children's Hospital, Boston MA (S).
La Figura 18 muestra que la ligación de BDCA-2 pero no de BDCA-4 con un mAb específico seguido de un mAb secundario reticulado inhibe la secreción de INF-\alpha por las DCs BDCA-2^{+}BDCA-4^{+} plasmacitoides procedentes de sangre o amígdalas en respuesta a la estimulación con poli I:C.Las DC BDCA-2^{+}BDCA-4^{+} plasmacitoides procedentes de sangre se cultivaron con 10 \mug/ml de mAb AC144 (2 y 4) o mAb IgG1 de ratón (CF6B, anti-TPO, 1 y 3) a 37ºC durante 30 minutos.
La Figura 19 muestra un análisis de paneles de ADNc de múltiples tejidos humanos procedentes de CLONTECH (banda 1: corazón; banda 2: cerebro; banda 3: placenta; banda 4: pulmón; banda 5: hígado; banda 6: músculo esquelético; banda 7: riñón; banda 8: páncreas; banda 9: bazo; banda 10: timo; banda 11: testículos; banda 12: ovario; banda 13: intestino delgado; banda 14: ganglio linfático; banda 15: médula espinal; banda 16: hígado fetal; banda 17: amígdala) y un análisis de ADNc preparado a partir de diferentes poblaciones de leucocitos en sangre (banda 18: células T; banda 19: células B; banda 20: células NK; banda 21: monocitos; banda 22: CD11c^{bright}CD123^{low}BDC; banda 23: DC CD11c-CD123^{bright} plasmacitoide) para el ADNc de BDCA-2. El control es G3PDH.
La Figura 20 muestra las variantes de empalme del trascrito de BDCA-2. Las variantes de empalme se analizaron por RT-PCR con cebadores específicos para el BDCA-2 utilizado en el análisis de expresión. Los fragmentos amplificados se clonaron en vectores plasmídicos y se secuenciaron.
La Figura 21 muestra las variantes de empalme de los transcritos de Dectin-2.
La Figura 22 muestra una alineación de las secuencias de ARNm de BDCA-2 y Dectin-2 de ratón con las posiciones exactas de los supuestos intrones indicados. En la Figura 23, *representa residuos conservados idénticos en todas las secuencias alineadas, : representa sustituciones conservadas, representa sustituciones semiconservadas, áreas en sombra significan el dominio de reconocimiento de hidratos de carbono (CRD), en cursiva se muestran los dominios transmembrana. Los siguientes símbolos resaltan los residuos sólidamente conservados entre las lectinas tipo C en el CRD:
1
La Figura 23 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de BDCA-2 humano, DCIR humano y Dectin-2 de ratón.
La Figura 24 muestra las células BDCA-3 inmunoprecipitadas a partir de lisados de las celúlas HD-MY-Z biotiniladas de superficie con el mAb AD5-14H12 (IgG1) específico de BDCA-3. Para el control de especificidad se empleó el mAb SJ25-C1 (IgG1) específico de CD19. Se analizaron las proteínas precipitadas por medio del análisis SDS-PAGE (4-12%) y Western-blotting con estreptavidina-peroxidasa. Obsérvese que el mAb AD5-14H12 específico de BDCA-3 inmunoprecipita específicamente una proteína de superficie celular de aproximadamente 100 kD a partir de células HD-MY-Z. De este modo, BDCA-3 tiene un peso molecular aparente de 100 kD.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos para enriquecer poblaciones de células enriquecidas en DCs y subgrupos de las mismas. La invención también proporciona composiciones enriquecidas para las DC y poblaciones de células obtenidas de las mismas. También se proporcionan procedimientos y composiciones para células modificadas. También se proporcionan composiciones de células modificadas, incluyendo células manipuladas genéticamente. También se proporcionan métodos de uso de las células tanto modificadas como no modificadas. También se proporcionan fragmentos de unión a antígeno y los correspondientes antígenos reconocidos.
Se describe un panel de nuevos mAb obtenidos frente a las DCs CD4^{+}lin purificados inmunomagnéticamente que identifican tres antígenos de las DC: BDCA-2, BDCA-3 y BDCA-4. BDCA-2 y BDCA-3 son nuevos. En el caso de BDCA-4, aunque no se ha descrito anteriormente como un antígeno específico de las DCs, el antígeno ha sido identificado como neuropilina-1, un receptor de la familia colapsina/semaforina que media la guía celular neuronal. He y col. (1997) Cell 90:739-751.
En sangre humana no cultivada, la expresión de BDCA-2 y BDCA-4 se limita estrictamente a las DC CD123^{bright}
CD11c^{-} plasmacitoides, mientras que la expresión de BDCA-3 se limita a una pequeña población de DC CD123^{-}
CD11c^{dim}. Esta población de DCs de BDCA-3^{+} comparte muchas características inmunofenotípicas con las clásicas DC CD123^{dim}-CD11c^{bright}, pero, a diferencia de las DC CD123-CD11c^{dim}CD11c^{dim}, la DC de BDCA-3^{+} carece de la expresión de CD1c (BDCA-1), CD2 y varios de los receptores Fc.
El origen de las DCs sin purificar puede estar descrito en el estado de la técnica, tal como el origen de células hematopoyéticas de la médula espinal, de feto, de neonatos o adultos u otras, por ejemplo, hígado fetal, sangre periférica o sangre del cordón umbilical, amígdala, ganglio linfático, membrana nasal, bazo, piel, epitelios de las vías respiratorias, pulmón, tubo digestivo del hígado, placas de Peyers, etc. Las DCs se pueden aislar también de células cultivadas tales como las DCc derivadas de células progenitoras. Se pueden emplear diversas técnicas para la separación de las células. Por ejemplo, los métodos de selección negativa pueden extraer no DCs inicialmente. Los mAb son particularmente útiles para identificar los marcadores asociados a linajes celulares en particular y/o fases de diferenciación tanto para las selecciones positivas como negativas.
Si se desea, se puede extraer inicialmente una gran proporción de células terminalmente diferenciadas por medio de una separación negativa relativamente en bruto. Por ejemplo, se pueden utilizar inicialmente separaciones con esferas magnéticas para extraer grandes cantidades de células inadecuadas. Como mínimo, alrededor de un 80%, normalmente un 70% de las células totales se extraerán antes del aislamiento de las DCs. Preferentemente, las DCs se aíslan directamente de la fuente celular por selección positiva.
Los procesos para la separación incluyen, pero no se limitan a, la centrifugación por gradiente de densidad, separación en roseta, acoplamiento a partículas que modifican la densidad celular, separación magnética con esferas magnéticas recubiertas con anticuerpos o fero fluídos recubiertos con anticuerpos (nonopartículas), cromatografía de afinidad, agentes citotóxicos unidos o empleados conjuntamente con un mAb, incluyendo, pero no limitando a, un complemento y citotoxinas, y lavado con anticuerpo unido a una matriz sólida, por ej., placa, elutriación o cualquier otra técnica adecuada.
Las técnicas que proporcionan una separación y análisis exactos incluyen, pero no se limitan a, separación con esferas magnéticas y citometría de fujo, las cuales pueden tener grados de sofisticación diversos, por ej., una pluralidad de canales de color, canales detectores de dispersión de luz obtusos y de ángulo bajo, canales de impedancia, etc.
Las células se pueden seleccionar frente a células muertas, empleando colorantes asociados con células muertas tales como el yoduro de propidio (PI). Preferiblemente, las células se recogen en un medio que comprende suero al 2%, tal como suero bovino fetal (FCS) o albúmina de suero humano (HSA) o cualquier otro adecuado, preferentemente un medio isotónico, estéril. Para indicaciones fisiológicas se prefiere el HSA. La modificación genética de las células se puede conseguir en cualquier punto durante su mantenimiento por transducción de una composición celular sustancialsustancialmente homogénea con una construcción de ADN recombinante, transfectado con RNA, fusión celular, carga con antígenos y varios procedimientos conocidos en el estado de la técnica y/o aquí descritos.
Para la modificación de las células se puede emplear un vector retrovíricol, sin embargo, puede utilizarse cualquier otro vector adecuado, un sistema de distribución o modificación celular. Estos incluyen, por ejemplo, adenovirus, virus adeno-asociados, cromosomas artificiales, derivados de levaduras y RNA derivado de una fuente de antígeno, tal como un tumor. La modificación genética, si se desea, no necesita ser permanente ya que las DCs maduras tienen un término medio de vida limitado. Las aproximaciones genéticas se utilizan para expresar antígenos (tumorales, víricos, parasíticos, etc.) extraños o autoantígenos en las DCs con objeto de inducir inmunidad o tolerancia. La longevidad de la modificación puede también controlarse mediante los genes suicidas para limitar la terapia (al igual que las células T).
Los procedimientos de transducción comprenden cualquiera conocido en el estado de la técnica incluyendo, sin limitación, co-cultivo directo de las células con células productoras, p.e., por el procedimiento descrito por Bregni y col. (1992) Blood 80:1418-1422, o cultivo con sobrenadante vírico solo con o sin factores de crecimiento y policationes, p. e., por el método descrito por Xu y col. (1994) Exp. Herat. 22:223-230; y Hughes y col. (1992) J. Clin. Invest. 89:1817.
En la reintroducción de las células modificadas que expresan o se cargan con un antígeno para presentar el antígeno en el hospedador, las células T se activan, anergizan o suprimen y son dirigidas específicamente contra el antígeno. Generalmente, antígenos adecuados son aquéllos expresados por las células infectadas víricamente, o células cancerígenas, bacterias, levaduras, protozoarios, autoantígenos (tolerógenos) y alérgenos. Más específicamente, los antígenos adecuados incluyen, pero no se limitan a, proteínas víricas, proteínas de células cancerígenas, proteínas específicas de tejido o proteínas tolerogénicas. La "inducción" de las células T puede incluir inactivación de células T específicas de antígeno, tal como por deleción o anergia. La inactivación es particularmente útil para establecer o reestablecer tolerancia, tal como en el transplante de órganos y trastornos autoinmunes respectivamente. La DCs modificadas pueden administrarse por cualquiera de los procedimientos conocidos en el estado de la técnica incluyendo, pero no limitando a, la vía intravenosa, subcutánea, intranodal y directamente en el timo. Preferiblemente, la administración es intravenosa (IV).
A menudo, la inmunoterapia celular implica la extracción mediante leucoféresis de médula espinal u otras fuentes de células de un hospedador humano, aislando las células de la fuente. Mientras tanto, el hospedador puede ser tratado para la ablación parcial, sustancial o completa de la capacidad hematopoyética innata si tiene que ocurrir el transplante de células madres hematopoyéticas. Las células aisladas se pueden modificar durante dicho periodo de tiempo, a fin de proporcionar células que tengan la modificación deseada. En el caso de la ablación hematopoyética completa, será también necesario un aumento de las células madres. Las células o células modificadas pueden entonces ser reestablecidas en el hospedador para proporcionar la nueva capacidad. Son conocidos en el estado de la técnica los procedimientos de extracción de células, ablación del hospedador y repoblación de células madres/progenitoras.
Las células modificadas pueden ser administradas en cualquier vehículo fisiológicamente aceptable, normalmente por vía intravascular, intranodal y subcutánea. Generalmente, se administrarán al menos 1 x 10^{5} células, preferiblemente 1 x 10^{6} o más. Las células se pueden introducir por inyección, catéter, o similares. Si se desea, se pueden incluir también factores, incluyendo, pero no limitando a, interleuquinas, p. e., IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, y flt-Ligando, así como otras interleuquinas, factores estimuladores de colonias, tales como G-, M- y GM-CSFG, interferones, p. e., \gamma-interferón.
El término "polipéptido", "péptido" y "proteína" se emplean aquí intercambiablemente para referirse a polímeros de residuos de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender residuos de aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos, y se puede interrumpir por porciones químicas diferentes de residuos de aminoácidos. Los términos también incluyen un polímero de aminoácidos que ha sido modificado naturalmente o por intervención, incluyendo, pero no limitando a, la formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como la conjugación con una fracción ("moiety") de marcaje o bioactivo. A menos que se indique o implique lo contrario, el término fragmento de unión a antígeno comprende cualquier monómero o polímero polipeptídico con especificidad inmunológica, incluyendo el anticuerpo intacto, y polipéptidos funcionalmente equivalentes menores y mayores, tal como aquí se describe.
1. Fragmentos de unión a antígeno y composiciones de los mismos
La presente invención incluye fragmentos de unión a antígeno que reconocen específicamente las DCs. Es decir, el antígeno se encuentra en las DCs de manera que los fragmentos de unión a antígeno que reconocen el antígeno, preferentemente reconocen o se unen a las DCs o a un subgrupo de las mismas. O, como en el caso de BDCA-4, el antígeno puede encontrarse en otros tipos de células; si bien en células hematopoyéticas, el antígeno está presente predominantemente en las DCs.
La invención incluye además una composición que comprende un fragmento de unión a antígeno aislado que se une específicamente como mínimo a un antígeno de DC. Preferiblemente, el fragmento de unión a antígeno es o se deriva de un mAb designado AC144, AD5-13A11, AD5-20E5, AD5-17F6, AD5-4B8, AD5-5E8, AD5-14H12 y AD5-8E7. La Tabla 1 muestra el antígeno y epítopo reconocido por cada mAb y el isotipo de los mAbs específicos de DC.
TABLA 1
2
En sangre humana no cultivada, BDCA-2 y BDCA-4 son expresadas por una población de DC CD123^{bright}CD11c^{-}. Esta población de DC es referida comúnmente hoy en día como DC plasmacitoide. Utilizando BDCA-2 o BDCA-4 como un marcador de superficie para el aislamiento inmunomagnético y/o la identificación citométrica de DC plasmacitoides, los resultados presentados en el presente doucmento sobre la frecuencia, inmunofenotipo, morfología, capacidad endocítica, y maduración de estas células concuerdan completamente con los presentados en estudios anteriores, donde se empleó un gran panel de antígenos leucocitarios. Ello ilustra claramente que ambos antígenos son marcadores útiles para las DC plasmacitoides en sangre humana no cultivada. Las tinciones de células amigdalinas muestran (Figura 16) que las DCs plasmacitoides asociadas a la zona de células T en órganos linfoides periféricos pueden ser también discriminadas de otras poblaciones de DCs asociadas a tejido linfoide, tal como las DCs del centro germinal, DC de interdigitación y DC foliculares basadas en la expresión de BDCA-2 y BDCA-4.
A diferencia de BDCA-2, BDCA-4 se expresa también en varias poblaciones de DCs diferenciadas in vitro: (1) en comparación a BDCA-2, BDCA-4 se expresa tanto en Mo-DC como CD34-DC; (2) mientras la expresión de BDCA-2 está infrarregulada completamente en DC plasmacitoides una vez han experimentado la maduración mediada por IL-3 en cultivo, la expresión de BDCA-4 está, en realidad, sobrerregulada en DC plasmacitoides cultivadas; y (3) en comparación a BDCA-2, BDCA-4 consigue expresarse en el espacio de 12 horas por una mayoría de DC CD11c^{+} cultivadas, por lo cual no queda claro si ello es solamente cierto para la población mayor de CD1c^{+}CD11c^{bright} o también es cierto para la población menor de CD1c^{-}CD11c^{dim}CD123^{-}. El hallazgo que ninguna otra célula BDCA-4^{+} más que las DC plasmacitoides están presentes en sangre humana no cultivada, de hecho indica que ninguna otra población homóloga de las poblaciones de DC BDCA-4^{+} diferenciadas in vitro mencionadas anteriormente están presentes en sangre.
La reticulación de BDCA-2 por medio del mAb anti-BDCA-2 induce una rápida internalización del complejo antígeno-Ab. Por analogía a otros receptores endocíticos en DC, que están infrarregulados en la maduración, al igual que la Langerina. Valladeau y col. (2000) Immunity 12:71-81. Por lo tanto, BDCA-2 puede ser un receptor con función de captación de antígeno. BDCA-2 es una lectina de tipo C, se internaliza rápidamente después de la ligación (Figura 8), y el ligando o ligandos de BDCA-2 se procesan y presentan a las células T (Figura 15). De este modo, al igual que DEC-205, BDCA-2 tiene una captación de antígeno y función de presentación de ligandos a las células T.
La expresión de BDCA-3 se restringe a una pequeña población de DC CD1c^{-}CD11c^{dim}CD123^{-} en sangre humana no cultivada. Con respecto a requisitos de fenotipo, morfología, capacidad endocítica, y maduración, dicha población de DC es bastante similar a la población de DC CD1c^{+}CD11c^{bright}CD123^{dim}. Sin embargo, aparte de la expresión misma de BDCA-3 y CD1c, el análisis inmunofenotípico ha revelado algunas diferencias notables: al contrario de CD1c^{+}BDC, BDCA-3^{+}BDC no expresan los receptores Fc CD32, CD64 y EcORI, y no expresan CD2. La falta de expresión de los receptores Fc indica que BDCA-3^{+}BDC, a diferencia de CD1c^{+}BDC no poseen la capacidad de captación de antígeno mediada por Ig. Fanger y col. (1996) J. Immunol. 157:541-548; Fanger y col. (1997) J. Immunol. 158:3090-3098; y Maurer y col. (1996) J. Immunol. 157:607-616. Tal como se demuestra, BDCA-3 es una proteína 100 kD.
Existen indicios de que las DC CD1c^{+}CD11c^{bright}, en comparación a las DC CD1cCD123^{dim}, tienen la capacidad de adquirir las características de las células de Langerhans (expresión del antígeno Lag, E-cadherina y Langerina, y presencia de gránulos de Birbeck) cuando se cultivan con GM-CSF, IL-4 y TGF-\beta1. Si las DC BDCA-3^{+} y DC CD1^{+} representan fases de maduración del mismo tipo de células, esto indicaría que las DC BDCA-3^{+} ya han perdido o no han adquirido todavía la capacidad de diferenciarse a células de Langerhans.
En contradicción a los resultados aquí presentados, Ito y col. (1999) informaron que las DC CD1c^{+}CD11c^{bright}, a diferencia de las DC CD1c^{-}CD123^{dim}, expresan CD1a. Se emplearon dos mAb, Bl-6 y B-B5, para la tinción de CD1a, observándose realmente una diferencia en la intensidad de la tinción cuando se compararon los dos mAb (la tinción con B-B5 fue probablemente más brillante). Tal como se indica, la tinción de DC fue claramente negativa utilizando títulos óptimos del mAb CD1a Bl-6 y HI149, pero positiva utilizando B-B5. Por otra parte, B-B5, a diferencia de BL-6 y HI149, tiñeron una alta proporción de células B CD19^{+} en sangre. De este modo, el patrón de tinción de B-B fue bastante reminiscente de un mAb CD1c, más que de un mAb CD1a y, de hecho, el mAb CD1c AD5-8E7 inhibe la unión de B-B5 a células MOLT-4. Por lo tanto, se concluye que B-5 reconoce CD1c y las DC CD1c^{+} no expresan CD1a.
La tinción de DC cD1c^{+} para CD1c, CD2 y CD14 reveló que una proporción menor de DC expresa CD14 a un grado variable y que el nivel de CD1c así como la expresión de CD2 en estas células es inversamente proporcional al nivel de la expresión de CD14. Esta observación está de acuerdo con un modelo de diferenciación lineal, donde las DC CD1c^{+}CD2^{+}CD11c^{bright}CD14^{-} son la progenie de los monocitos CD14^{+}CD1c^{-}CD2^{-} más que la progenie de un precursor común de ambos tipos de célula. Este concepto encuentra más apoyo en la observación de que una proporción considerable de monocitos CD14^{+} ya expresan niveles muy bajos de CD2, y que tienen la capacidad de diferenciarse rápidamente en DC maduras con una morfología dendrítica típica y una potente función estimuladora de las células T, cuando se cultivan con GM-CSF y IL-4. Crawford y col. (1999) J. Immunol. 163:5020-2028.
El uso de BDCA-2, mAb proporciona una forma eficiente y adecuada de detectar, enumerar y aislar rápidamente poblaciones de DC de PBMC, material de leucoféresis, sangre total, amígdala, etc., sin perturbación funcional aparente. Esto es una ayuda valiosa para su caracterización molecular y funcional adicional y puede ser útil en elucidar sus interrelaciones. Además, la capacidad de aislar fácilmente poblaciones de DC a homogeneidad facilita enormemente su uso clínico. Los fragmentos de unión a antígeno son también útiles en la detección, enumeración y/o aislamiento de las DC de tejidos, tanto tejidos no hematopoyéticos (incluyendo, sin limitación, epitelios de las vías respiratorias, piel, intestino, pulmón e hígado) como tejidos hematopoyéticos (incluyendo, sin limitación, amígdala, bazo, ganglio linfático y timo).
Los hibridomas que secretan los anticuerpos también se incluyen en la invención como otras células que expresan los correspondientes fragmentos de unión a antígeno. También queda incluido en la invención cualquier fragmento de unión a antígeno que reconozca específicamente BDCA-2. Tal como se indica en la Tabla 1 y en los Ejemplos aportados más adelante, se pueden producir múltiples tipos de mAbs que reconocen específicamente dichos antígenos. Asimismo, tal como se observa en los resultados presentados aquí, los fragmentos de unión a antígeno no necesitan reconocer el mismo epítopo en el mismo antígeno. Todos estos fragmentos de unión a antígeno y composiciones de los mismos están incluidos en la invención.
El término "fragmento de unión a antígeno" incluye cualquier componente que se une preferentemente a una DC o una subpoblación de la misma. Componentes adecuados incluyen, sin limitación, oligonucleótidos conocidos como aptómeros que se unen a las moléculas diana deseadas (Hermann y Pantel (2000) Science 289:820-825), hidratos de carbono, lectinas, fragmentos de Ig como Fab, F(ab')_{2}, Fab', scFv (tanto la forma monómera como polimérica) y cadenas H y L aisladas. Un fragmento de unión a antígeno retiene la especificidad de la Ig intacta, aunque se puede alterar la avidez y/o afinidad.
Ciertos compuestos, composiciones y procedimientos descritos en la invención generalmente se refieren a anticuerpos y derivados de los mismos que, habiendo proporcionado los determinantes antigénicos de la invención, pueden ser generados de forma rutinaria mediante técnicas inmunoquímicas estándar. Estas incluyen, pero no se limitan a, fragmentos de unión a antígeno acoplados a otro compuesto, p.e., por conjugación química, o asociados bajo mezcla con un excipiente o un adyuvante. Las parejas de conjugación específicos y procedimientos para producirlos se describen en la invención y son conocidos en el estado de la técnica.
Los fragmentos de unión a antígeno (incluyendo también los "derivados" de los mismos) son generados típicamente mediante ingeniería genética, aunque pueden ser obtenidos alternativamente por otros procedimientos y combinaciones de procedimientos. Esta clasificación incluye, pero no se limita a, fragmentos de péptidos de fusión y péptidos obtenidos por manipulación genética. Los compuestos preferidos incluyen fragmentos de polipéptidos que contienen las CDRs anti-DC, proteínas de fusión de anticuerpos que contienen componentes efectores de citoquina, proteínas de fusión de anticuerpos que contienen adyuvantes o fármacos, proteínas de fusión de anticuerpos que contienen antígenos derivados de células tumorales, antígenos víricos, antígenos bacterianos, antígenos de parásitos, antígenos de levaduras, autoantígenos o péptidos antigénicos (epítopos de células T) derivados de los mismos, y proteínas de región V de cadena única. Los fragmentos de unión a antígeno se consideran que son de origen humano si son aislados de una fuente humana, y utilizados directamente o clonados y expresados en otros tipos celulares y derivados de los mismos o cromosomas humanos totales o porciones de los mismos (tal como ratones con cromosomas humanos que codifican los segmentos de genes V_{H}, D_{H}, J_{H}, V_{L}, JL_{L}, C_{H}, C_{L}).
Un "polipéptido de fusión" es un polipéptido que comprende regiones de péptido contiguas en una posición diferente de la que se encontraría en la naturaleza. Las regiones pueden existir normalmente en proteínas separadas y se reúnen en el polipéptido de fusión; pueden existir normalmente en la misma proteína pero se sitúan en una nueva disposición en el polipéptido de fusión: o se pueden disponer sintéticamente. Por ejemplo, la invención incluye proteínas recombinantes (y los polinucleótidos que codifican las proteínas o el complemento de las mismas) que están compuestas de un componente funcional de un fragmento de unión a antígeno y otro péptido, tal como una toxina. Los procedimientos para producir dichas proteínas de fusión son conocidos en el estado de la técnica y están descritos por ejemplo en la Patente WO93/07286.
Un "fragmento funcionalmente equivalente" de un polipéptido varía de la secuencia nativa debido a cualquier combinación de adiciones, deleciones, o sustituciones, mientras se conserve como mínimo una propiedad funcional del fragmento pertinente al contexto en el cual está siendo empleado.
Los fragmentos de unión a antígeno son útiles en paliar las enfermedades clínicas relacionadas con trastornos inmunológicos. La invención comprende además derivados de polipéptidos de los fragmentos de unión a antígeno y métodos para usar dichas composiciones en el diagnóstico, tratamiento y fabricación de nuevos reactivos.
La invención también incluye fragmentos de unión a antígeno conjugados a una fracción químicamente funcional. Típicamente, la fracción es un marcador capaz de producir una señal detectable. Estos fragmentos de unión a antígeno conjugados son útiles, por ejemplo, en sistemas de detección, tal como la cuantificación de DCs en varios tejidos, en varias enfermedades, después del transplante de células madre, y después de terapia inmunoablativa y radiación, y toma de imágenes de DCs por ejemplo en quimioterapia o terapia autoinmune. Dichos marcadores son conocidos en el estado de la técnica e incluyen, pero no se limitan a, radioisótopos, enzimas, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes, compuestos bioluminiscentes, cofactores de sustrato e inhibidores y partículas magnéticas. Para ejemplos de patentes que describen el uso de tales marcadores, véase, por ejemplo, las Patentes US Nº 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.346; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241. Las fracciones pueden enlazarse de manera covalente, enlazarse de manera recombinante, o conjugarse (covalentemente o no covalentemente) a través de un reactivo secundario, tal como un anticuerpo secundario, proteína A o un complejo de biotina-avidina.
Otras fracciones funcionales incluyen, sin limitación, péptidos señal, agentes que aumentan las reactividad inmunológica, agentes que facilitan el acoplamiento a un soporte sólido, portadores de vacunas, modificadores de biorrespuesta, marcadores paramagnéticos y fármacos. Los péptidos señal incluyen las formas procariotias y eucariotas. Los agentes que aumentan la reactividad inmunológica incluyen, pero no se limitan a, superantígenos bacterianos y adyuvantes. Los agentes que facilitan el acoplamiento a un suporte sólido incluyen, pero no se limitan a, biotina, avidina o sus derivados. Los portadores inmunogénicos incluyen, pero no se limitan a, cualquier tampón fisiológicamente aceptable. Los modificadores de biorespuesta incluyen, pero no se limitan a, citoquinas, en particular el factor de necrosis tumoral (TNF), IL-2, interleuquina-4 (IL-4), GB-CSF; IL-10, IL-12, TGF-\beta y ciertos interferones, y quimioquinas (MIP-3\beta, SDF1, linfotactina, DC-CK1, eotaxinas, IP-10, TARC, Rantes, MIP-1x, MIP-1B, SLC, 1-TAC, MIG, MDC, MCP-1, TCA-3, MCP-2, -3, -1. Véase también la Patente US 5.750.199; y publicaciones de patentes WO: 96/10411; 98/34641; 98/23735; 98/34642; 97/10000; 87/10001; y 97/06821. Dichas quimioquinas pueden ser útiles para atraer otras células tales como células T.
Un "péptido señal" o "secuencia líder" es una secuencia de aminoácidos corta que dirige una proteína recién sintetizada a través de una membrana celular, habitualmente el retículo endoplasmático (ER) en células eucariotas, y las membrana interior o tanto la membrana interior como la exterior de las bacterias. Los péptidos señal se encuentran típicamente en la región N-terminal de un polipéptido y se extraen enzimáticamente entre la biosíntesis y la secreción del polipéptido de la célula o a través de la membrana del ER. De este modo, el péptido señal no está presente en la proteína de secreción, sino que está presente solamente durante la producción de las proteínas.
Las inmunotoxinas, que incluyen conjugados de cadena única, pueden producirse por medios recombinantes. La producción de diversas inmunotoxinas es muy conocida en el estado de la técnica, y los procedimientos se pueden localizar, por ejemplo, en "Monoclonal Antibody-toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet", Thorpe y col. (1982) Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academia Press, pp. 168-190; Vitatta (1987) Science 238:1098-1104; y Winter y Milstein (1991) Nature 349:293-299. Las toxinas adecuadas, incluyen, pero no se limitan a, ricina, radionúclidos, proteína antivírica pokeweed de Phytolacca americana, exotoxina A de Pseudomonas, toxina de la difteria, cadena A de la ricina, toxinas fúngicas tales como las proteínas inactivadoras de ribosoma, p.e., gelonina, restrictocina y enzimas de fosfolipisa. Véase, en general, "Chimeric Toxins", Olsnes y Phil, Pharmac. Ther. 15:355-381 (1981); y "Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy", Eds. Baldwin y Byers, pp. 159-179, 224-266, Acadamic Press (1985).
Las fracciones químicamente funcionales pueden ser producidas de manera recombinante, por ejemplo creando un gen de fusión que codifique el fragmento de unión a antígeno y las regiones funcionales de otros genes (p. e., enzimas). En el caso de fusiones de genes, los dos componentes están presentes en el mismo gen. Alternativamente, los fragmentos de unión a antígeno pueden enlazarse químicamente a la fracciónpor medio de cualquiera de los diversos procesos químicos conocidos. Por ejemplo, cuando la fracción es una proteína, la unión puede ser mediante reticuladores homo- o heterobifuncionales, p. e., SPDP, SMCC, glutaraldehido, carbodiimida, y similares. Las fracciones pueden estar enlazadas covalentemente, o conjugados, a través de un reactivo secundario, incluyendo, pero sin limitar a, un anticuerpo secundario, proteína A, o complejo de biotina-avidina. Las fracciones paramagnéticas y la conjugación de los mismos a anticuerpos son conocidos en el estado de la técnica. Véase, p. ej, Miltenyi y col. (1990) Cytometry 11:231-238.
Aquí hemos solucionado los problemas descritos en el estado de la técnica (O'Doherty y col. (1993); y Yamaguchi y col. (1995)) con un proceso de inmunización contralateral de las plantas de las patas recientemente descrito. Yin y col. (1997) Blood 90:5002-5012. Este sistema utiliza células T y B naive específicas de antígeno las cuales recirculan continuamente entre los órganos linfoides periféricos mientras no encuentran antígeno, pero quedan retenidas inmediatamente dentro de un órgano linfoide periférico durante varios días, si no semanas, una vez son activadas por el antígeno. Picker y col. (1992) Ann. Rev. Immunol. 10:561-591; Butcher y col. (1996) Science 272:60-66; Bradley y col. (1996) Curr. Opin. Immunol. 8:312-320; Watson y col. (1998) Cell-Adhes. Comun. 6:105-110; Kearney y col. (1994) Immunity 1:327-339; Jacob y col. (1992) J. Exp. Med. 176:679-687; Ridderstaad y col. (1998) J. Immunol. 160:4688-4695; y Tarlinton (1998) Curr. Opin. Immunol. 10:245-251. En los ejemplos presentados en el presente documento, las células B de linfoblastoma Bristol-8 se inyectaron en las plantas de las patas izquierdas de ratones, en los días -3, 0, 4, 7, 11 y 14, mientras que en las plantas de las patas derechas se inyectaron con DC en los 0, 4, 7, 11 y 14. Las células B y T naive con especificidad por antígenos compartidos, p. e., moléculas HLA de clase II, deberían quedar activadas por las células Bristol-8 entre el día -3 y 0 en el ganglio linfático poplíteo izquierdo y por tanto quedan retenidas ahí, mientras que todos los linfocitos con especificad por antígenos únicos a DC deberían permanecer disponibles para su activación después del día 0 en el ganglio linfático poplíteo derecho.
Esta técnica de inmunización se combina con un proceso potente para el rápido aislamiento de grandes números de DC, y facilita la producción de un panel de mAb que reconocen tres nuevos antígenos de DC: BDCA-2, BDCA-3 y BDCA-4. El uso de antígenos para producir anticuerpos específicos de DC adicionales permite que sean utilizados más procedimientos tradicionales para la producción de anticuerpos con mayores probabilidades de éxito.
Los procedimientos para producir y aislar anticuerpos son conocidos en el estado de técnica. Véase por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Los procedimientos de purificación de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, precipitación de sales (por ejemplo, con sulfato de amonio); cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, en una columna de intercambio aniónico o catiónico a pH neutro eluída con etapas de gradiente de fuerza iónica creciente); cromatografía de filtración en gel (incluyendo HPLC de filtración en gel); y cromatografía de resinas de afinidad tales como proteína A, proteína G, hidroxiapatita, o anti-Ig. Los fragmentos de unión a antígeno pueden ser también purificados en columnas de afinidad que comprendan DCs o una porción antigénica de las mismas. Preferiblemente los fragmentos se purifican por medio de cromatografía en proteína A-Sepharose™ CL 4B seguida de cromatografía en una columna de intercambio iónico DEAE-Sepharose™ 4B.
La invención también incluye anticuerpos híbridos, en los cuales se obtiene un par de cadenas H y L de un anticuerpo primario, mientras que el otro par de cadenas H y L se obtiene de un segundo anticuerpo diferente. Para el objeto de esta invención, un par de cadenas L y H procede de un anticuerpo anti-DC. En un ejemplo, cada par de cadenas L-H se une a epítopos diferentes de un antígeno DC-específico. Se pueden formar también dichos híbridos con cadenas H o L humanizadas. La invención también incluye otros anticuerpos biespecíficos, tales como los que contienen dos anticuerpos separados unidos covalentemente a través de sus regiones constantes.
Otros fragmentos de unión a antígeno incluidos en esta invención son anticuerpos en los cuales la cadena H o L ha sido modificada para proporcionar propiedades adicionales. Por ejemplo, un cambio en la secuencia de aminoácidos puede dar como resultado una inmunogenicidad reducida del polipéptido resultante. Las variaciones van desde cambiar uno o más residuos aminoácidos al rediseño completo de una región tal como el dominio de la región C. Cambios típicos incluyen, pero no se limitan a, aquéllos relacionados con la fijación del complemento, interacción con receptores de membrana, y otras funciones efectoras. Se puede también diseñar un anticuerpo recombinante para ayudar en la liberación específica de una sustancia (tal como una citoquina) a una célula. También se incluyen en la invención péptidos en los que se han situado varios dominios Ig en un orden diferente al que tiene lugar en la naturaleza.
El tamaño de los fragmentos de unión a antígeno puede ser solamente el tamaño mínimo requerido para proporcionar una función deseada. Puede comprender opcionalmente una secuencia de aminoácidos adicional nativa al fragmento de unión a antígeno o de una fuente heteróloga, según se desee. Los fragmentos de unión a antígeno anti-DC pueden contener solamente cinco residuos de aminoácidos consecutivos de una secuencia de región V del anticuerpo. También se incluyen los polipéptidos que contienen 7 residuos de aminoácidos, más preferiblemente alrededor de 10 residuos de aminoácidos, más preferiblemente alrededor de 15 residuos de aminoácidos, más preferiblemente alrededor de 25 residuos de aminoácidos, más preferiblemente alrededor de 50 residuos de aminoácidos, más preferiblemente alrededor de 75 residuos de aminoácidos procedentes de la región V de la cadena L o H del anticuerpo. Incluso son más preferidos los polipéptidos que contienen la región V completa de la cadena H o L de
anticuerpos.
Las sustituciones pueden ir desde cambiar o modificar uno o más residuos de aminoácidos hasta el rediseño completo de una región, tal como la región V. Las sustituciones de residuos de aminoácidos, si tiene lugar, son preferentemente sustituciones conservativas que no afectan perjudicialmente a las propiedades de plegamiento o funcionales del péptido. Los grupos de residuos de aminoácidos funcionalmente relacionados, dentro de los cuales se pueden efectuar sustituciones conservativas son: glicina/alanina; valina/isoleucina/leucina; asparagina/glutamina, ácido aspártico/ácido glutámico; serina/treonina/metionina; lisina/arginina; y fenilalanina/tirosina/triptófano. Los fragmentos de unión a antígeno pueden ser glucosilados o no glucosilados, pueden ser modificados por post-traduccionalmente (p. e., acetilación y fosforilación) o pueden ser modificados sintéticamente (p. e., la ligación de un grupo de marcaje).
Los derivados de polipéptidos que contienen tanto una cadena L como una cadena H pueden formarse como cadenas L y H separadas y luego ensamblarse o ensamblarse in situ mediante un sistema de expresión para ambas cadenas. Tales sistemas de expresión pueden ser creados por transfección con un plásmido que contiene regiones transcribibles separadas para la cadena L y H, o por cotransfección de la misma célula con plásmidos para cada cadena. En un tercer procedimiento, se transfecta un plásmido adecuado con una región codificante de la cadena H en un mutante con pérdida de cadena H.
Los mutantes con pérdida de cadena H se pueden obtener por tratamiento de las células productoras de anticuerpos anti-DC con IgG anti-ratón de conejo anti-ratón marcado con fluoresceína (específica de cadena H, DAKO Corporation, Carpintería, CA) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Las poblaciones de células teñidas o no teñidas se analizan por citometría de flujo. Las células no teñidas se recogen en un tubo esterilizado y se depositan en placas de 96 pocillos a 1 célula/pocillo por dilución restrictiva. Los sobrenadantes del cultivo se someten a continuación al ensayo ELISA utilizando IgG anti-ratón de cabra (específica de cadena H) y kappa anti-ratón de cabra. Los clones que poseen un fenotipo positivo a kappa, negativo a IgG se subclonan por lo menos 3 veces para obtener mutantes anti-DC^{(-H)} estables. Se puede aislar el mRNA de mutantes putativos con pérdida de cadena H y determinar la secuencia del cDNA de la región V de la cadena L. La PCR (reacción de cadena de polimerasa) inversa del mRNA para V_{H} se efectúa con 2 grupos de cebadores 5' y 3', y se utilizan para clonar cDNA anti-DC^{(-H)}. Un mutante con pérdida de cadena H no produce ninguna banda de DNA detectable con dichos cebadores. La transfección de las células prosigue con un plásmido de cadena H adecuado.
Otro derivado de fragmento de unión a antígeno incluido en esta invención es un anticuerpo en el cual la región constante de la cadena H o L ha sido modificada para que aporte propiedades adicionales. Por ejemplo, un cambio en la secuencia de aminoácidos puede resultar en una inmunogenicidad alterada del polipéptido resultante. Los cambios van desde uno o más residuos de aminoácidos hasta el rediseño completo del dominio de la región constante. Los cambios indicados afectan a la fijación del complemento, la interacción con receptores de membrana, y otras funciones efectoras. También se puede diseñar un anticuerpo recombinante para ayudar en la liberación específica de una sustancia (tal como una linfoquina o un antígeno o un péptido antigénico procedente de un tumor, virus, parásito o bacteria, o tolerógeno (autoantígeno)) a una célula. También se incluye en la invención proteínas en las cuales se han situado varios dominios Ig en un orden diferente al que se encuentra en la naturaleza.
La invención también incluye fragmentos de la región V de cadena única ("scFv") de anticuerpos anti-DC. Los fragmentos de la región V de la cadena única se producen enlazando las regiones de cadena H y/o L mediante un enlace peptídico corto. Bird y col. (1988) Science 242:423-426. Se puede utilizar cualquier péptido que tenga suficiente flexibilidad y longitud como un engarce en el fragmento scFv. Habitualmente el engarce que se selecciona tiene poca o ninguna inmunogenicidad. Un ejemplo de enlace peptídico es (GGGGS)_{3}, el cual tiende un puente de aproximadamente 3,5 nm entre el carboxi terminal de una región V y el amino terminal de otra región V. Se pueden emplear otras secuencias de engarce, que pueden proporcionar funciones adicionales como para el acoplamiento a un fármaco o soporte sólido o distribución específica de una sustancia (tal como una linfoquina o un antígeno o un péptido antigénico procedente de un tumor, virus, parásito o bacteria, o tolerógeno (autoantígeno)) a una célula.
Toda o cualquier porción de la cadena H o L se puede utilizar en cualquier combinación. Típicamente, las regiones V completas están incluidas en el fragmento scFv. Por ejemplo, la región V de la cadena L puede estar enlazada a la región V de la cadena H. Alternativamente, una porción de la región V de la cadena L puede estar unida a la región de la cadena H, o una porción de la misma. También quedan contemplados los fragmentos scFv en los cuales la región V de la cadena H procede de un anticuerpo descrito en la invención, y la región V de la cadena L procede de otra Ig. Se puede formar un fragmento scFv bifásico en el cual un componente es un fragmento de unión a antígeno y otro componente es un polipéptido diferente, tal como un epítopo de células T.
Los scFv se pueden ensamblar en cualquier orden, por ejemplo, V_{H}-(engarce)-V_{L} o V_{L}-(engarce)-V_{H}. Puede haber una diferencia en el nivel de expresión de estas dos configuraciones, en particular los sistemas de expresión, en cuyo caso se puede preferir una de dichas formas También se pueden formar fragmentos scFv en tándem, tales como (X)-(engarce)-(X)-(engarce)-(X), donde X son los fragmentos scFv, o combinaciones de los mismos con otros polipéptidos. En otra realización de la invención, los polipéptidos de anticuerpos de cadena única no tienen ningún polipéptido de engarce, o únicamente un engarce inflexible corto. Las posibles configuraciones son V_{L}-V_{H} y V_{H}-V_{L}. El enlace es demasiado corto para permitir una interacción entre V_{L} y V_{H} dentro de la cadena, y las cadenas forman homodímeros con un lugar de unión a antígeno V_{L}/V_{H} en cada extremo. Estas moléculas son referidas como "diabodies".
Los scFv se pueden producir de manera recombinante o sintética. Para la producción sintética de scFv, se puede emplear un sintetizador automático. Para la producción recombinante de scFv, se puede introducir en una célula hospedadora adecuada un plásmido adecuado que contiene un polinucleótido que codifique los scFv ya sea eucariota, tal como levadura, planta, insecto o células de mamífero, o procariotas, tal como Escherichia coli, y se puede aislar la proteína expresada usando técnicas de purificación de proteínas estándar. Los fragmentos scFv se pueden obtener también de una biblioteca de exposición de fago.
Un sistema particularmente útil en la producción de scFv es el plásmido pET-22b(+) (Novagen, Madison, WI). El Escherichia coli pET-22b(+) contiene un dominio de unión a ión de níquel que consta de 6 residuos de histidina secuenciales, el cual permite que la proteína expresada sea purificada en una resina de afinidad adecuada. Otro ejemplo de un vector adecuado es el pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA).
Las condiciones de expresión de genes garantizan preferiblemente que scFv adopte una estructura terciaria óptima. Dependiendo del plásmido empleado (actividad promotora especialmente) y de la célula hospedadora, puede ser necesario modular la velocidad de producción. Por ejemplo, el empleo de un promotor más débil, o expresión a temperaturas más bajas, puede ser necesario para optimizar la producción de scFv plegados de manera adecuada en los sistemas procariota; o puede ser utilizado para expresar scFv en las células eucariotas.
La invención también abarca las formas poliméricas de los fragmentos de unión a antígeno, que contienen una pluralidad de fragmentos de unión a antígeno específicos de DC. Una realización es un polímero lineal de fragmentos de unión a antígeno, conjugados opcionalmente al portador. Estos polímeros lineales pueden comprender múltiples copias de un único polipéptido de fragmentos de unión a antígeno o combinaciones de diferentes polipéptidos, y pueden tener polipéptidos en tándem, o polipéptidos separados por otras secuencias de aminoácidos.
Otro aspecto de la invención son péptidos de antígeno múltiples (MAPs). Los MAPs disponen de un pequeño núcleo inmunológicamente inerte que posee dendritos de lisina ramificados radialmente, en los cuales se encuentran covalentemente enlazados varios polipéptidos de fragmentos de unión a antígeno. Véase por ejemplo, Posnett y col. (1988) J. Biol. Cem. 263:1719-1725; y Tam (1989) Met. Enz. 168:7-15. El resultado es una gran macromolécula que posee una alta proporción molar de los polipéptidos de fragmentos de unión a antígeno hacia el núcleo. Los MAPs son inmunogénos eficientes y antígenos útiles para los inmunoensayos. El núcleo para crear MAPs puede ser preparado por técnicas de síntesis de péptidos u obtenerse comercialmente (Quality Controlled Biochemicals Inc., Hopkintion, MA). Una matriz de núcleo típica está hecha de tres niveles de lisina y ocho residuos de aminoácidos.
La invención incluye además fragmentos de unión a antígeno antiidiotípicos a los fragmentos de unión a antígeno específicos de DC de la invención. Tales anti-idiotopos pueden prepararse por cualquier procedimiento conocido en el estado de la técnica.
Los pacientes con cáncer muestran a menudo inmunosupresión y tolerancia a algunos antígenos asociados a tumor (TAA). El desencadenamiento de una respuesta inmune activa a tales TAA representando un reto importante en la terapia del cáncer. La inmunización con un determinado antígeno genera una respuesta inmune que incluye una respuesta CTL, preferiblemente una fuerte respuesta CTL. La producción de anticuerpos frente al antígeno puede ser útil si las células tumorales son destruidas por ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos). La invención incluye el uso de DCs identificadas y aisladas mediante el uso de los fragmentos de unión a antígeno de la invención en la inducción de respuestas inmunes específicas mediante procedimientos conocidos en el estado de la técnica. Las respuestas inmunes pueden ser específicas a cualquier antígeno incluyendo, sin limitación, las asociadas con cáncer, virus infecciosos, bacterias infecciosas, parásitos infecciosos, levaduras infecciosas, y enfermedades autoinmunes (para inducir tolerancia). La capacidad de aislar subpoblaciones que son adaptadas únicamente para inducir tal respuesta da como resultado preparaciones de DCs que son más efectivas que las mezclas de subpoblaciones. Las células híbridas (p. e., célula tumoral/DC) podrían utilizarse también como terapia específica de cáncer. Las células modificadas (incluyendo, sin limitación, las que son activadas, maduradas in vitro, moduladas con respecto a su capacidad polarizante de células T auxiliares (Th1 v Th2 v Th3/th-R), y moduladas con respecto a su capacidad estimuladora o anergizante o de supresión de células T) se incluyen asimismo en la invención y comprenden, pero no se limitan a, células genéticamente modificadas o transfectadas y células que han sido incubadas con péptidos o proteínas adecuados para la presentación de antígeno o para la internalización. Las subpoblaciones incluyen, sin limitación, una fase de diferenciación particular dentro de un linaje y un linaje individual de diferenciación.
La invención también proporciona DCs, subpoblaciones de las mismas y mezclas de las mismas. Las células se seleccionan con los fragmentos de unión a antígeno proporcionados en la presente invención por medio de cualquier procedimiento de separación conocido en el estado de la técnica. Las composiciones que comprenden las células aisladas también están incluidas en la invención. Estas incluyen composiciones farmacéuticas y terapéuticas y cualquier otra composición que contenga las células aisladas. Las subpoblaciones de DCs aisladas mediante los métodos aquí descritos son con preferencia sustancialmente homogéneas. Es decir, las células aisladas por los fragmentos de unión a antígeno específicos de BDCA son preferiblemente más de aproximadamente el 80% de BDCA^{+}, más preferiblemente más de aproximadamente el 90% de BDCA^{+} y más preferiblemente más de aproximadamente el 95% de BDCA^{+}. Naturalmente, las combinaciones subsiguientes de las células con otras DCs u otras células hematopoyéticas pueden disminuir el porcentaje de células BDCA^{+}, estando incluidas tales combinaciones también en la invención.
Asimismo, las DCs obtenidas por los procedimientos aquí descritos son adecuadas para su uso en cualquier método de tratamiento conocido en el estado de la técnica incluyendo las referencias citadas. Las DCs alteradas para conseguir estos métodos también se incluyen en la invención. Dichos métodos incluyen, pero no se limitan a:
a)
terapia con DCs aisladas para inducir tolerancia a células T específicas (destrucción o anergia en lugar de estimulación) en enfermedades autoinmunes, alergias, enfermedad injerto contra hospedador (GvHD), rechazo de aloinjerto. Por ejemplo, las DCs específicas de las células T se pueden modificar para que contengan componentes de lisis que inactivan o inducen la destrucción con el fin de dirigir específicamente las células T implicadas en la respuesta inmune no deseada, por ejemplo, por marcaje de antígenos o modificación genética tal como por transfección de CD15L. La especificidad de las DC por las células T está causada en primer lugar por la presentación de los epítopos de células T apropiados (péptidos) mediante MHC I y II. Los subgrupos particulares de DCs con funciones inductoras de tolerancia pueden administrarse directamente al paciente. La tolerancia periférica puede ser mediada por las DC modificadas para inducir deleción (destrucción), anergia y supresión/regulación de las células T;
b)
terapia de inmunomodulación con DCs aisladas para inducir perfiles de expresión de citoquinas particulares en células T específicas. Esto es particularmente útil para influenciar en la producción de Th1 (citoquinas para las respuestas inmunes inflamatorias específicas), Th2 (citoquinas para las respuestas inmunes humorales específicas) o Th3 (citoquinas para la inmunosupresión específica). En el caso de las alergias y asma, por ejemplo, la inducción de una repuesta Th1 puede inducir o eliminar la repuesta Th2 productora de los síntomas.
c)
terapia con DCs que presentan antígenos, incluyendo, pero no limitando a, antígenos tumorales, antígenos víricos y antígenos celulares;
d)
terapia con DCs (con o sin antígenos presentadores) y varios cofactores incluyendo, pero no limitando a, citoquinas, moléculas co-estimuladoras y moléculas efectoras en cantidades y bajo condiciones suficientes para modular la repuesta inmune; y
e)
estimulando células T in vitro para obtener las células T específicas de antígeno.
Los fragmentos de unión a antígeno aquí descritos son también adecuados para diversos métodos de tratamiento, los cuales incluyen, pero no se limitan a:
a)
anticuerpos que imitan la inmunoterapia de ligandos o mediada por ligandos, por ejemplo, de las DCs implicadas en autoinmunidad o direccionamiento in vivo de antígenos o ácidos nucleicos (virus, DNA de plásmidos, RNA, etc.) a las DCs para una captación/transfección óptima y selectiva. El BDCA-2 puede ser particularmente útil en este contexto, ya que parece ser una molécula con captación de antígenos y función procesadora; y
b)
inmunoseguimiento: p.e.,enumeración y caracterización de las DC BDCA-2^{+}, BDCA-3^{+}y BDCA-4^{+} en varias enfermedades y bajo movilización con un ligando inductor de proliferación, p.e., ligando Flt3 o G-CSF.
Se puede utilizar cualquier portador no nocivo para el hospedador para las DC. Los portadores adecuados son típicamente grandes macromoléculas metabolizadas lentamente tal como proteínas; polisacáridos (tales como Sepharose de latex funcionalizada, agarosa, celulosa, esferas de celulosa y similares); residuos de aminoácidos poliméricos (tales como ácido poliglutámico, polilisina, y similares); copolímeros de aminoácidos; y partículas de virus inactivas o bacterias atenuadas, tal como la Salmonella.
2. Procedimientos de obtención de fragmentos de unión a antígeno específicos de DC adicionales
La invención incluye procedimientos de obtención de fragmentos de unión a antígeno específicos de DC.
Los procedimientos para generar nuevos fragmentos de unión a antígeno específicos de DC, como se detallan a continuación, incluyen, pero no se limitan a: 1) empleo de técnicas de exposición de fagos por las cuales los cDNA que codifican repertorios de anticuerpos son preferiblemente amplificados a partir del RNA de linfocitos o de bazo utilizando PCR y cebadores de oligonucleótidos específicos de las regiones V específicas de especies; 2) inmunización de mamíferos con el antígeno y generación de anticuerpos policlonales o mAbs: y 3) utilización de la exposición de fagos para producir anticuerpos sin inmunización previa por exposición en el fago de repertorios de genes V muy grandes y diversos. Véase, en general, Hoogenboom y col., (1998) Immunotechnol. 4:1-20. Preferiblemente, a efectos terapéuticos, si deben utilizarse fragmentos de unión a antígeno no humanos, éstos pueden ser humanizados por cualquier procedimiento conocido en el estado de la técnica.
El procedimiento descrito por Medez y col. (1997) Nature Genetics 18:410 puede ser utilizado. En resumen, un antígeno purificado se utiliza para inmunizar ratones transgénicos que carecen del repertorio de anticuerpos murino nativos y en su lugar poseen la mayoría de los genes V de anticuerpos humanos en la configuración de la línea germinal. Los anticuerpos humanos son producidos posteriormente por las células B murino. Los genes de los anticuerpos se recuperan de las células B por selección de la biblioteca de PCR o por la tecnología de hibridoma clásica.
Alternativamente, los anticuerpos pueden obtenerse de ratones (tal como BALB/c) después de inyección con antígeno específico de DC purificado. Los mAbs se generan utilizando la tecnología de hibridomas estándar. Maiti y col. (1997) Biotechnol. Int. 1:85-93 (hibridomas humanos); y Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497 (hibridomas de ratón), Los anticuerpos murino pueden ser humanizados posteriormente por ejemplo mediante los procedimientos descritos por Rosok y col (1996) J. Biol. Chem. 2171:22611-22618; Baca y col. (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; Arder y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8910-8915; y Winter y Milstein (1991) Nature 349:293-299.
Se puede también utilizar una exposición de fagos para generar rápidamente anticuerpos humanos en frente de DCs. Esta aproximación puede emplear el procedimiento descrito por Henderikx y col. (1998) Cancer Res. 58:4324-32. Los fragmentos de anticuerpos humanos se seleccionan de repertorios naive construidos a partir de dominios V de la línea germinal o sintetizados con muchas mutaciones (las mutaciones son dirigidas por medio de recolecciones de genes homólogos o PCR propensa a error) tanto en la estructura como en las regiones CDR. Los fragmentos de unión a antígeno específicamente reactivos con las DCs pueden ser identificados por cribado frente a células tumorales y normales según se describe aquí con objeto de identificar los fragmentos de unión a antígeno específicos de DC.
La invención también incluye procedimientos para identificar fragmentos de unión a antígeno específico de DCs mediante de la generación de una biblioteca de exposición de fagos adecuada; aislamiento de los antígenos específicos de DCs; el cribado de la biblioteca de exposición de fagos con los antígenos de acuerdo con técnicas inmunoquímicas estándar para obtener fagos que exhiben un fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a las DCs; o el cribado de la biblioteca de exposición de fagos obtenidos para los fragmentos de unión a antígeno específicos de DC, por medio del cribado frente a las DCs y otras células relacionadas tales como las APCs y selección del fago que se une preferentemente a las DCs. Los procedimientos para generar fragmentos de unión a antígeno por exhibición de fagos son conocidos en el estado de la técnica. Hoogenboom y col. (1998).
El RNA de linfocitos (PBL) o de bazo se utiliza típicamente para preparar repertorios de fragmentos de anticuerpos. La mutagénesis que utiliza recolección homóloga o PCR propensa a error aumenta la diversidad. Se puede utilizar cualquier procedimiento conocido en el estado de la técnica.
Pueden amplificarse los repertorios de genes de anticuerpos procedentes de ratones o humanos inmunizados utilizando PCR y los fragmentos de anticuerpos scFv o Fab obtenidos de ese modo pueden ser clonados y expresados en la superficie del bacteriófago. Los repertorios de genes de anticuerpos se amplifican a partir del RNA de linfocitos o de bazo utilizando PCR y cebadores oligonucleótidos específicos de regiones V específicas del animal hospedador. También se puede emplear la exposición de fagos para producir anticuerpos sin inmunización previa exponiendo numerosos y diversos repertorios de genes V sobre el fago. Los repertorios de genes V naturales presentes en PBL se aíslan por amplificación de PCR y las regiones VH y VL se empalman aleatoriamente usando PCR. Las mutaciones se pueden dirigir hacia los genes de dominio V por recolecciones de genes homólogos o PCR propensa a error. Zhao y col. (1998) Nst. Biotechnol. 15:258; y Hoogenboom y col. (1998). Se pueden crear y emplear bibliotecas humanas enteramente sintéticas para seleccionar fragmentos de anticuerpo específicos de DC. Sin tener en cuenta el procedimiento utilizado para manejar la biblioteca de exposición de fagos, cada fago resultante dispone de un fragmento de anticuerpo funcional expuesto en su superficie y contiene el gen que codifica el fragmento del anticuerpo en el genoma del fago. Véase, p. ej., la Patente WO97/02342.
Durante algún tiempo la cromatografía de afinidad ha establecido que los anticuerpos que se unen pueden ser sustraídos de los anticuerpos que no se unen. Nissin y col. (1994) EMBO J. 13:692-698; y Vaughan y col. (1996) Nat. Biotecnol. 14:309-314. El número y afinidad de los fragmentos de anticuerpo generados frente a un antígeno particular son parámetros críticos que afectan su a éxito. Hasta muy recientemente, la producción de bibliotecas extensas y diversas seguía siendo algo muy difícil. Históricamente, los repertorios de scFv se han ensamblado directamente a partir de productos de RT-PCR de VH y VL. La disponibilidad del RNA y la eficiencia de la RT-PCR fueron factores restrictivos del número de genes B disponibles. Asimismo, el ensamblaje requería la ligación de tres fragmentos, a saber, VH y VL y sus regiones de engarce. Marks y col. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597.
Un procedimiento perfeccionado de construcción de bibliotecas emplea repertorios de genes VH y VL clonados en vectores plásmidos individuales para proporcionar un suministro de material estable e ilimitado para el ensamblaje de scFv. Sheets y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6175-6162. Asimismo, la eficiencia aumenta por disponer de DNA que codifica la región de engarce en el extremo 5' y de la biblioteca de VL. Por lo tanto, hay solamente dos fragmentos para ser ligados en lugar de tres.
Los fragmentos de unión a antígeno anti-DC también se pueden derivar o manipular. Por ejemplo, se puede cribar la actividad inmunogénica de las regiones V de las cadenas L y H preparando una serie de polipéptidos cortos que conjuntamente se extienden a la secuencia de aminoácidos de la región V entera. Con el empleo de una serie de polipéptidos de 20 ó 50 residuos de aminoácidos de longitud, cada región V puede ser inspeccionada en busca de propiedades funcionales útiles. También es posible realizar un análisis por ordenador de una secuencia de proteínas para identificar polipéptidos potencialmente inmunogénicos. Tales péptidos pueden ser sintetizados y ensayados a continuación.
La invención incluye además varias adaptaciones de fragmentos de unión a antígeno aquí descritos combinados de varias maneras para producir otros fragmentos de unión a antígeno anti-DC con las propiedades deseables. Por ejemplo, los fragmentos de unión a antígeno con residuos modificados pueden estar comprendidos en MAPs. En otro ejemplo, un scFv se fusiona a una citoquina, tal como IL-2. Todas estas combinaciones se incluyen en la invención.
Los fragmentos de unión a antígeno pueden ser producidos por medio de cualquier proceso adecuado, incluyendo proteolisis, procedimientos recombinantes o síntesis químicas. Estos procedimientos son conocidos en el estado de la técnica y no requieren una descripción detallada. Ejemplos de enzimas proteolíticos incluyen, pero no se limitan a, tripsina, quimotripsina, pepsina, papaina, proteasa V8, subtilisina, plasmina, y trombina. Los fragmentos de unión a antígeno intactos se pueden incubar con una o más proteasas simultáneamente o secuencialmente. Alternativa o adicionalmente, el anticuerpo intacto se puede tratar con agentes reductores de disulfuro. Los péptidos se pueden separar a continuación de cada uno mediante técnicas conocidas en el estado de la técnica, incluyendo, pero no limitando a, cromatografía de filtración en gel, electroforesis en gel, y HPLC de fase inversa.
Los fragmentos de unión a antígeno anti-DC pueden ser también producidos por expresión de un polinucleótido que codifica el péptido, en un sistema de expresión adecuado mediante cualquier procedimiento conocido en el estado de la técnica. Típicamente, los polinucleótidos que codifican un polipéptido adecuado se ligan a un vector de expresión bajo control de un promotor adecuado y se utilizan para alterar genéticamente la célula hospedadora deseada. Se puede utilizar tanto el sistema hospedador eucariota como procariota. El polipéptido se aísla, a continuación, de las células lisadas o del medio de cultivo y se purifica hasta el punto requerido para su uso deseado. Ejemplos de células hospedadoras procarióticas apropiadas para su empleo en esta invención incluyen E. coli, Bacillus subtilis y cualquier otra célula hospedadora adecuada. Ejemplos de células hospedadoras eucarióticas incluyen, pero no se limitan a, células de levadura, ave, insecto, planta, y animales tales como las células COS7, HeLa, y CHO.
Opcionalmente, los canales o esferas con recubrimiento de matriz y los co-cultivos de células se pueden incluir para intensificar el crecimiento de células productoras de fragmentos de unión a antígeno. Para la producción de grandes cantidades de mAbs, es en general más conveniente obtener fluido ascítico. El procedimiento de producir ascitis comprende generalmente inyectar células de hibridoma a un mamífero inmunológicamente naive, histocompatible o inmunotolerante, en particular el ratón. El mamífero puede ser cebado para la producción de ascitis mediante la administración previa de una composición adecuada, p.ej., Pristano. El fluido ascítico se extrae del animal y se procesa a anticuerpos aislados.
Alternativamente, los fragmentos de unión a antígeno se pueden sintetizar químicamente utilizando los datos de secuencias de aminoácidos y otra información facilitada en esta descripción, conjuntamente con procedimientos estándar de la síntesis de proteínas. Un procedimiento adecuado es la técnica de Merrifield de fase sólida. Los sintetizadores automáticos de péptidos están disponibles comercialmente, tal como los fabricados por Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA).
Otro procedimiento de obtención de fragmentos de unión a antígeno anti-DC es el de inmunizar animales hospedadores adecuados con BDCA-2, BDCA-3 y/o BDCA-4 y continuar con procedimientos estándar para la producción y el aislamiento de policlonales o mAb. Los mAbs producidos así se pueden "humanizar" por procedimientos conocidos en el estado de la técnica. La invención incluye por lo tanto mAbs humanizados.
En anticuerpos "humanizados" al menos parte de la secuencia ha sido alterada desde su forma inicial para hacerla más similar a Igs humanas. En una versión, las regiones C de la cadena H y cadena L son reemplazadas por secuencia humana. Esto es un polipéptido de fusión que comprende una región V anti-DC y una región (C) heteróloga de la Ig. En otra versión, las regiones CDR comprenden secuencias de aminoácidos anti-DC, mientras que las regiones estructurales V se han convertido también en secuencias humanas. Véase, por ejemplo, la Patente EP 0329400. En una tercera versión, las regiones V son humanizadas designando secuencias consenso de las regiones V de humanos y ratón, y convirtiendo los residuos fuera de las CDRs que son diferentes entre las secuencias consenso.
Al producir anticuerpos humanizados, la elección de residuos del entramado ("framework") puede ayudar a retener una alta afinidad de unión. En principio, la secuencia de entramado de cualquier anticuerpo humano puede servir como plantilla para injertar CDR; sin embargo, se ha demostrado que la sustitución directa de CDR por dicho entramado puede llevar a una pérdida significativa de afinidad de unión a antígeno. Glaser y col. (1992) J. Immunol. 149:2606; Tempest y col. (1992) Biotechnol. 9:266; y Shalaby y col. (1992) J. Exp. Med. 17:217. Cuanto más homólogo es un anticuerpo humano al anticuerpo murino original, menos probable es que el entramado humano introduzca distorsiones en los CDRs murino que puedan afectar la afinidad. En base a una búsqueda de homología de secuencias ante un base de datos de secuencias de anticuerpos, el anticuerpo humano IC4 proporciona una buena homología de entramado con muM4TS.22, si bien son adecuados también otros anticuerpos sumamente homólogos, especialmente las cadenas L \kappa del subgrupo humano I o de las cadenas H del subgrupo humano III. Kabat y col. (1987). Varios programas informáticos tales como ENCAD predicen la secuencia ideal para la región V. Levitt y col. (1983) J. Mol. Biol. 166:595. La invención abarca de esta manera anticuerpos humanos con diferentes regiones V. Está dentro del ámbito del experto en la materia determinar secuencias de la región V y optimizar estas secuencias. Los procedimiento para obtener anticuerpos con inmunogenicidad reducida se describen también en la Patente US No. 5,270,202 y EP 699,755.
En ciertas aplicaciones, tales como cuando un fragmento de unión a antígeno o DCA se expresa en un medio de almacenaje tal como una semilla de planta, el fragmento de unión a antígeno puede ser almacenado sin purificación. Fiedler y col. (1995) Biotechnol. 13:1090-1093. Para la mayoría de aplicaciones, es generalmente preferible que el polipéptido esté por lo menos parcialmente purificado de otros constituyentes celulares. Preferiblemente, el péptido es por lo menos un 50% puro en porcentaje de peso de proteína total. Más preferiblemente, el péptido es por lo menos aproximadamente un 50-75% puro. Para el uso clínico, es preferible que el péptido sea por lo menos aproximadamente un 80% puro.
Si un péptido tiene que administrarse a un individuo, preferiblemente estará al menos un 80% puro, más preferiblemente al menos un 90% puro, incluso más preferiblemente al menos un 95% puro y libre de pirógenos y otros contaminantes. En este contexto, el % de pureza se calcula como el porcentaje en peso del contenido de proteína total de la preparación, y no incluye los constituyentes que son añadidos deliberadamente para la purificación de la composición.
La invención también incluye los procedimientos para detectar, enumerar y/o identificar las DCs y los subgrupos de las mismas, en una muestra biológica y cuantificar los antígenos tales como DC y/o BDCA-2, BDCA-3 o BDCA-4 solubles en fluidos corporales. Los procedimientos incluyen la obtención de una muestra biológica, poner en contacto de la muestra con un fragmento de unión a antígeno aquí descrito, bajo condiciones que permitan la unión anticuerpo-antígeno y detectar la unión, si tiene lugar, del anticuerpo a la muestra en comparación a una muestra biológica control.
Después de preparar convenientemente una muestra biológica, por ejemplo, por enriquecimiento de la concentración de DC o concentración de antígeno, se mezcla con un exceso de fragmentos de unión a antígeno bajo condiciones que permitan la formación de un complejo entre las DCs o antígeno y el anticuerpo. A continuación, se determina la cantidad de complejo formado o el número de complejo que lleva DCs, y se compara finalmente con los complejos formados con muestras estándar que contienen cantidades conocidas de antígeno diana en el rango de las concentraciones supuestas o conocidas de DCs. La formación del complejo se puede observar por inmunoprecipitación o nefelometría, pero es generalmente más sensible emplear un reactivo marcado con tales marcadores como radioisótopos como el ^{125|}, enzimas como la peroxidasa y \beta-galactosidasa, o fluorocromos como la fluoresceína. Los procedimientos de detección de células y antígenos son conocidos en el estado de la técnica. Para la detección celular, la citometría de flujo es particularmente útil; con antígeno, se prefiere el ELISA.
Se puede determinar el reconocimiento específico de un fragmento de unión a antígeno anti-DC por un antígeno mediante cualquier inmunoensayo conocido en la técnica. Es adecuada cualquier forma del ensayo de unión directa. En uno de tales ensayos, uno de parejas de unión, se marca el antígeno o fragmento de unión a antígeno putativo. Marcadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, radioisótopos como el I^{125}, enzimas como la peroxidasa, marcadores fluorescentes como la fluoresceína y marcadores quimioluminiscentes. Típicamente, la otra pareja de unión está insolubilizada (por ejemplo mediante recubrimiento en una fase sólida tal como una placa de microtitulación) para facilitar la eliminación de la pareja de unión soluble no unida. Después de combinar la pareja de unión marcada con la pareja de unión sin marcar, se lava la fase sólida y se determina la cantidad de marcador unido.
Cuando se emplean para inmunoterapia, los fragmentos de unión a antígeno aquí descritos pueden estar sin marcar o marcados con un agente terapéutico tal como aquí se describe y conocido en el estado de la técnica. Estos agentes se pueden acoplar directa o indirectamente a los fragmentos de unión a antígeno de la invención. Un ejemplo de acoplamiento indirecto es mediante el uso de un componente espaciador. Dichos componentes espaciadores, a su vez, pueden ser insolubles o solubles (Diener y col. (1986) Science 231:148) y pueden ser seleccionados para facilitar la liberación del fármaco en el lugar diana. Ejemplos de agentes terapéuticos que pueden acoplarse a fragmentos de unión a antígeno para inmunoterapia incluyen, pero no se limitan a, antígenos, incluyendo antígenos tumorales, antígenos víricos, antígenos bacterianos, autoantígenos y antígenos derivados de parásitos, modificadores de biorespuesta, fármacos, radioisótopos, lectinas, y toxinas. Los modificadores de biorespuesta incluyen las citoquinas y quimioquinas, las cuales incluyen, pero no se limitan a, IL-2, IL-3, IL-4, G-CSF, GM-CSF, IL-10, IL-12, TGF-\beta, MTP-AB, SDF-1, linfotactina, DC-CK1, eotoxinas, IP-10, TARC, Rantes, MIP-1\alpha, MIP-1\beta, SLC, ITAC, MIE, MDC, MCP-1, TCA-3, MCP-2, ,-3, -4 e interferones. Los interferones con los cuales se pueden marcar los fragmentos de unión a antígeno incluyen IFN-\alpha, IFN-\beta, y IFN-\gamma y sus subtipos.
Al utilizar los fragmentos de unión a antígeno radioisotópicamente conjugados, ciertos isotipos pueden ser más preferidos que otros dependiendo de tales factores como la estabilidad y emisión de los isotipos. Si se desea, se puede evaluar el reconocimiento de la población celular por el fragmento de unión a antígeno mediante técnicas de diagnóstico in vivo descritas más abajo. En general, los radioisótopos emisores de partículas \alpha y \beta se prefieren en inmunoterapia. Por ejemplo, un emisor \beta de alta energía capaz de penetrar varios milímetros de tejido, tal como el ^{90}Y, puede ser preferible. Por otra parte, un emisor de alta energía y de corto alcance, tal como el ^{212}Bi, puede ser preferible. Ejemplos de radioisótopos, que pueden unirse a los fragmentos de unión a antígeno de la invención a efectos terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, ^{125}I, ^{131}I, ^{90}Y,^{ 67}Cu,^{ 212}At, ^{212}Pb, ^{41}Sc, ^{109}Pd y ^{188}Re.
Las lectinas son proteínas, normalmente aisladas de plantas, que se unen específicamente a unidades de azúcar. Muchas lectinas son también capaces de aglutinar las células y estimular los linfocitos. Sin embargo, la ricina es una lectina tóxica que se ha utilizado inmunoterapéuticamente, lo cual se consigue preferiblemente por la unión de la cadena \alpha péptica de la ricina, la cual es responsable de la toxicidad, a la molécula de anticuerpo que facilita la distribución específica del lugar de unión del efecto tóxico.
Las toxinas son sustancias tóxicas producidas por plantas, animales o microorganismos que, a una dosis suficiente, son a menudo letales. La toxina de la difteria es una sustancia producida por Corynebacterium diphteria que puede emplearse terapéuticamente. Esta toxina consiste en una subunidad \alpha y \beta que en las condiciones apropiadas se pueden separar. El componente tóxico de la cadena A puede estar unido a un fragmento de unión a antígeno aquí descrito y utilizado para la distribución específica de lugar a un subgrupo específico de DCs.
Los procedimientos recombinantes son conocidos en el estado de la técnica. La práctica de la invención utiliza, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, las cuales entran en el ámbito del experto en la materia. Dichas técnicas se han descrito ampliamente en la literatura ("Molecular Cloning; A Laboratory Manual", 2nd Edition, Sambrook et al., 1989; "Oligonucleotides Síntesis", Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture", Freshney, ed., 1987; "Methods in Enzymology", Academic Press, Inc.; "Handbook of Experimental Immunology", Wei & Blackwell, eds.; "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells", Miller & Calos, eds., 1987; "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al., eds., 1987; "PCR: The Polymerase Chain Reaction", Mullis et al., eds., 1994; y "Current Protocols in Immunology", Coligan et al., eds., 1991). Estas técnicas son aplicables para la producción de los polinucleótidos y polipéptidos y, como tales, se pueden tomar en consideración para la preparación y puesta en práctica de la invención. Son particularmente útiles las técnicas que se comentan en las secciones que siguen.
La invención proporciona varios polinucleótidos que codifican antígenos BDCA. La invención también incluye polinucleótidos que codifican derivados y variante funcionalmente equivalentes de dichos antígenos y fragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos que pueden aumentar, disminuir o no afectar significativamente las propiedades de los polipéptidos codificados por los mismos. Estos derivados, fragmentos y variantes funcionalmente equivalentes pueden presentar la capacidad de unirse específicamente a sus respectivos anticuerpos. Por ejemplo, los cambios que no afectarán significativamente a las propiedades del polipéptido codificado incluyen, pero no se limitan a, los cambios en una secuencia de DNA que no varíen la secuencia de aminoácidos codificada, así como los cambios que resultan en sustituciones conservativas de los residuos de aminoácidos, una o pocas delecciones o adiciones de los residuos de aminoácidos, y sustituciones de residuos de aminoácidos por análogos de aminoácidos. Las sustituciones conservativas son aquéllas en las que las sustituciones aminoacídicas conservativas son glicina/alanina, valina/isoleucina/leucina, asparagina/glutamina, ácido aspártico/ácido glutámico; serina/treonina/metionina, lisina/arginina, y fenilalanina/tirosina/triptófano.
Los polinucleótidos de la invención pueden comprender secuencias adicionales, tales como secuencias codificantes adicionales dentro de la misma unidad de trascripción, elementos controladores tal como promotores, lugares de unión de ribosoma y lugares de poliadenilación, unidades adicionales de trascripción bajo control del mismo promotor o diferente, secuencias que permitan la clonación, expresión, y transformación de una célula hospedadora, y cualquier entidad que pueda ser deseable para proporcionar las realizaciones de la invención.
La invención incluye un polinucleótido de al menos aproximadamente 15 nucleótidos consecutivos, preferiblemente al menos aproximadamente 20 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos aproximadamente 25 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos aproximadamente 35 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos aproximadamente 50 nucleótidos consecutivos, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 75 nucleótidos, todavía más preferiblemente al menos aproximadamente 100 nucleótidos, todavía más preferiblemente al menos aproximadamente 200 nucleótidos, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 300 nucleótidos que forma un híbrido estable con un polinucleótido que codifica BDCA-2 y BDCA-3, preferiblemente la secuencia de cDNA encontrada en la Figura 12. Se puede utilizar en este ensayo cualquier conjunto de condiciones, con tal que por lo menos exista un conjunto donde el polinucleótido de ensayo demuestre la especificidad requerida.
Las reacciones de hibridación se pueden efectuar en condiciones de "rigurosidad" diferente. Se han publicado las condiciones que aumentan la rigurosidad de una reacción de hibridación. Véase, por ejemplo, Sambrook y Maniatis. Ejemplos de condiciones pertinentes incluyen (en orden de estrigencia creciente): temperaturas de incubación de 25ºC, 37ºC, 50ºC y 68ºC; concentraciones del tampón de 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC (donde SSC es 0,15 M NaCl y 15 mM de tampón citrato) y sus equivalentes utilizando otros tipos de tampón; concentraciones de formamida de 0%, 25%, 50% y 75%. Tiempos de incubación de 5 minutos a 24 horas; 1, 2 o más fases de lavado; tiempos de incubación del lavado de 1, 2 o 15 minutos; y soluciones de lavado de 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC, o agua desionizada.
La invención también proporciona polinucleótidos que codifican los polipéptidos de BDCA. Preferiblemente, los polipéptidos son o se derivan de los presentados en la Figura 12.
La invención también proporciona polinucleótidos unidos covalentemente a un marcador detectable. Tales polinucleótidos son útiles, por ejemplo, como sondas para la detección de secuencias de nucleótidos relacionadas.
Los polinucleótidos de la invención pueden obtenerse mediante síntesis química, técnicas de clonación recombinante, PCR, o cualquier combinación de las mismas. Los procedimientos de síntesis química de los polinucleótidos son conocidos en el estado de la técnica y no es necesaria su descripción detallada. Cualquier experto en la materia puede utilizar los datos de secuencias aquí proporcionados para obtener un polinucleótido deseado con la ayuda de un sintetizador de DNA o solicitarlo a un servicio comercial.
Alternativamente, se pueden obtener los nucleótidos que codifican los BDCA y los péptidos codificados por los mismos a partir de una línea celular productora, vector de clonación, o vector de expresión. El RNA y DNA que codifica la secuencia deseada se puede aislar, amplificar y procesar mediante técnicas recombinantes estándar. Dichas técnicas incluyen digestión con nucleasas de restricción, y amplificación por la reacción de la polimerasa en cadena (PCR), o una combinación adecuada de las mismas. La tecnología PCR está descrita en la Patentes USA Nºs. 4,683,195; 4,800,159; 4,754,065; y 4,683,202, así como en "PCR: The Polymerase Chain Reaction", Mullis et al. Eds., Birkauswer Press. Boston (1994). El aislamiento y purificación de los péptidos aquí codificados pueden ser efectuados por cualquier procedimiento conocido en el estado de la técnica.
Los polinucleótidos que comprenden una secuencia deseada pueden ser insertados en un vector adecuado, pudiéndose introducir a su vez el vector en una célula hospedadora adecuada para su replicación y amplificación. Los polinucleótidos se pueden insertar en las células hospedadoras mediante cualquier medio conocido en el estado de la técnica. Las células son transformadas introduciendo un polinucleótido exógeno por captación directa, endocitosis, transfección, acoplamiento-f o electroporación. Una vez introducido, el polinucleótido exógeno puede mantenerse dentro de la célula como un vector no integrado (tal como un plásmido) o integrado en el genoma de la célula hospedadora. El DNA amplificado puede obtenerse también de la célula hospedadora transformada; puede obtenerse con la RNA polimerasa dependiente de DNA.
La presente invención incluye además diversos vectores que comprenden un polinucleótido que codifica el BDCA-2. Estos vectores pueden emplearse para la expresión de los polipéptidos recombinantes así como una fuente de polinucleótidos codificantes de BDCA. Los vectores de clonación se pueden emplear para obtener copias replicadas de los polinucleótidos, o para guardar los polinucleótidos en un almacén para una futura recuperación. Los vectores de expresión (y células hospedadoras que contienen dichos vectores de expresión) pueden emplearse para obtener polipéptidos producidos a partir de los polinucleótidos que los contienen. También se pueden utilizar, cuando sea deseable, para expresar BDCA-2 en un individuo y de este modo tener células intactas capaces de sintetizar el polipéptido, tal como en terapia génica. Los vectores de clonación y expresión adecuados incluyen cualquier vector que sea conocido en el estado de la técnica, p. ej., aquéllos que se usan en los sistemas de expresión de bacterias, mamíferos, levaduras e insectos. Vectores específicos y células hospedadora adecuadas son conocidos en el estado de la técnica y no se describen detalladamente en la invención. Véase, p. ej., Gacesa y Ramji, "Vectors", John Wiley & Sons
(1994).
Los vectores de clonación y expresión contienen típicamente un marcador seleccionable (por ejemplo, un gen que codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de una célula hospedadora transformada con el vector), aunque tal gen marcador puede ser transportado en otra secuencia del polinucleótido co-introducida en la célula hospedadora. Solamente aquellas células hospedadoras en las cuales se ha introducido un gen seleccionable crecerán bajo condiciones selectivas. Los genes de selección típicos: (a) confieren resistencia a antibióticos u otras substancias tóxicas, p. ej., ampicilina, neomicina, metotrexato; (b) complementan las deficiencias auxotróficas; o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de los medios complejos. La elección del gen marcador correcto dependerá de la célula hospedadora, y los genes apropiados para los diferentes hospedadores son conocidos en el estado de la técnica. Los vectores también contienen típicamente un sistema de replicación reconocido por el hospedador.
Los vectores de clonación adecuados pueden ser construidos según técnicas estándar, o pueden ser seleccionados de un número elevado de vectores de clonación disponibles en el estado de la técnica. Mientras que el vector de clonación seleccionado puede variar según la célula hospedadora destinada para su uso, los vectores de clonación útiles tendrán generalmente la capacidad de autorreplicarse, pueden poseer una única diana para una endonucleasa de restricción particular, o pueden transportar genes para un marcador que pueda ser utilizado en la selección de clones que contengan el vector. Ejemplos adecuados incluyen plásmidos y virus bacterianos, p.ej., pUC18, mp18, mp19, pBR322, pMB9, CoIE1, pCR1, RP4, DNAs de fagos, y vectores lanzadera tales como pSA3 y pAT28. Estos y muchos otros vectores de clonación están disponibles comercialmente (BioRad, Stratagene, Invitrogen).
Los vectores de expresión son generalmente construcciones de polinucleótidos replicables que contienen un polinucleótido que codifica un BDCA de interés. El polinucleótido que codifica BDCA se uneoperativamente a elementos de control trascripcional adecuados, tales como promotores, intensificadores y terminadores. Para la expresión (p.ej., traducción), son necesarios normalmente uno o más elementos de control traduccionales, tales como los lugares de unión a ribosomas, lugares de iniciación de la traducción, y codones de parada. Estos elementos de control (transcripcional y traduccional) pueden derivarse de un gen que codifica un BDCA, o pueden ser heterólogos (es decir, son derivados de otros genes u otros organismos). También se puede incluir una secuencia de polinucleótidos que codifique un péptido señal para que el BDCA atraviese o se aloje en las membranas celulares o sea secretado de la célula. Son conocidos en el estado de la técnica varios vectores de expresión adecuados para la expresión en células eucariotas incluyendo células de levadura, ave y mamífero. Un ejemplo de un vector de expresión es pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA), en el cual la trascripción es conducida por el promotor/intensificador temprano del citomegalovirus. Este vector contiene también lugares de reconocimiento de los enzimas de restricción múltiples para la inserción del polinucleótido de interés. Otro ejemplo de un vector de expresión (sistema) es el sistema baculovirus/insecto. Otro vector adecuado para su uso en la terapia génica dirigida por anticuerpos comprende un polinucleótido que codifica un BDCA. Por ejemplo, Brown y col. (Virol. 198:477-488, 1994) y Miyamura y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. ISA 91:8507-8511, 1994) han descrito sistemas adecuados.
Los vectores que contienen los polinucleótidos de interés pueden ser introducidos en la célula hospedadora por medio de varias técnicas apropiadas, incluyendo electroporación; transfección usando cloruro cálcico, cloruro de rubidio, fosfato cálcico, dextrano DEAE, u otras sustancias; bombardeo de microproyectiles; lipofección; e infección. La elección del medio de introducción de los vectores o polinucleótidos que codifican los BDCAs dependerá a menudo de las características de la célula hospedadora.
Una vez introducidos en una célula hospedadora adecuada, se puede determinar la expresión de un BDCA mediante cualquier ensayo conocido en el estado de la técnica. Por ejemplo, la presencia de los mismos se puede detectar mediante RIA o ELISA del sobrenadante del cultivo (si se secreta el polipéptido) o lisatos de células.
Un vector de esta invención puede contener uno o más polinucleótidos que codifican un BDCA. También puede contener secuencias de polinucleótidos que codifican otros polipéptidos, los cuales intensifican, facilitan o modulan el resultado deseado, tal como las citoquinas, que incluyen, pero no se limitan a, IL-2, IL-4, GM-CSF, TNF-\alpha y IFN-\gamma. También se incluyen en la invención, los vectores de vaccinia que codifican los BDCAs recombinantes.
Otros aspectos de esta invención son las células hospedadoras transformadas con polinucleótidos que codifican BDCAs y vectores que comprenden las secuencias de polinucleótidos tal como se han descrito más arriba. Se pueden utilizar tanto las células hospedadoras procariotas como eucariotas. Los hospedadores procariotas incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas, por ejemplo, E. coli y mycobacteria. Los hospedadores eucariotas incluyen, pero no se limitan a, células de levadura, insecto, ave, planta y mamífero. Los sistemas hospedadores son conocidos en el estado de la técnica y no es necesaria aquí su descripción en detalle. Ejemplos de células hospedadoras de mamífero incluyen, pero no se limitan a, CHO y NS0, obtenibles de la colección ``European Collection of Cell Culture (England). La transfección de las células NS0 con un plásmido, por ejemplo, la cual es conducida por un promotor CMV, seguida de amplificación de este plásmido al utilizar glutamina sintetasa, proporciona un sistema útil para la producción de proteínas. Cockett y col. (1990) Biol. Technology 8:662-667.
Las células hospedadoras de esta invención se pueden utilizar, entre otros, como repositorios de polinucleótidos que codifican BDCAs, o como vehículos para la producción de los mismos. También se pueden utilizar como vehículos para la expresión in vivo de los BDCAs.
Los polinucleótidos de esta invención poseen varios usos. Son útiles, por ejemplo, en los sistemas de expresión para la producción de BDCA. Son también útiles como sondas de hibridación para el ensayo de presencia de polinucleótidos que codifican los BDCAs o las secuencias relacionadas en una muestra mediante procedimientos conocidos en el estado de la técnica. Además, los polinucleótidos también son útiles como cebadores para efectuar la amplificación de los polinucleótidos deseados. Los polinucleótidos de esta invención también son útiles en composiciones farmacéuticas incluyendo las vacunas y para la terapia génica.
También se pueden utilizar los polinucleótidos como sondas de hibridación para la detección de secuencias codificantes de BDCA. Muestras de hibridación adecuadas incluyen las células transformadas ex vivo para su uso en la terapia génica. En una ilustración, el DNA o RNA se extrae de una muestra y, opcionalmente, se hace correr en un gel y/o se digiere con nucleasas de restricción. El polinucleótido de la muestra procesada es típicamente transferido a un medio adecuado para su lavado. El polinucleótido de la muestra se pone en contacto a continuación con la sonda de polinucleótidos que codifican BDCA bajo condiciones que permiten la formación de un dúplex estable, si la muestra contiene una secuencia de polinucleótidos complementaria. Cualquier dúplex formado se detecta por cualquier medio adecuado. Por ejemplo, la sonda de polinucleótidos puede ser suministrada en forma marcada, y el marcador que permanece con la muestra después del lavado reflejará directamente la cantidad de dúplex estable formado. En una segunda ilustración, la hibridación se realiza in situ. Se cubre una muestra de tejido convenientemente preparada con una sonda marcada para indicar la localización de las secuencias codificadoras de BDCA.
También se puede utilizar un polinucleótido corto como cebador de una reacción PCR, en particular para amplificar una secuencia más larga que comprende una región que se hidridiza con el cebador. Esto se puede llevar a cabo en forma preparativa con el fin de producir polinucleótidos para la manipulación genética adicional. También se puede llevar a cabo analíticamente para determinar si está presente un polinucleótido codificante de BDCA, por ejemplo, en una muestra de interés diagnóstico.
Otro uso de los polinucleótidos es en vacunas y terapia génica. El principio general es administrar el polinucleótido para que se promueva o atenúe la expresión del polipéptido codificado por el mismo. Así, la presente invención incluye procedimientos para inducir una respuesta inmune y los métodos de tratamiento que comprenden la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de polinucleótidos que codifican los BDCAs. En estos métodos, se administra un polinucleótido que codifica BDCA a un sujeto directamente o mediante células transfectadas con el polinucleótido. Preferiblemente, el polinucleótido está en forma de plásmido circular, preferiblemente en una configuración superenrollada. Preferiblemente, el polinucleótido es replicado dentro de una célula. De este modo, el polinucleótido se une operativamente a un promotor adecuado, tal como un promotor heterólogo que es intrínsicamente activo en las células del tipo de tejido diana. Preferiblemente, una vez en los núcleos celulares, los plásmidos se mantienen como moléculas circulares episomales no replicativas. La mutación in vivo se puede llevar a cabo con construcciones de plásmidos que codifican, por ejemplo, las moléculas con mayor afinidad y/o avidez.
Para determinar si los plásmidos que contienen polinucleótidos de BDCA son capaces de expresarse en las células eucariotas, se pueden transfectar células tales como COS-7, CHO, o HeLa con los plásmidos. A continuación se determina la expresión por inmunoensayo, por ejemplo, por el análisis Western-blot. Se pueden detectar BDCAs más pequeños, por ejemplo, construyendo el plásmido para que el polipéptido resultante se fusione con un marcador, tal como un epítopo diana o marcador enzimático. Se consigue una caracterización adicional del polipéptido expresado purificando el péptido y luego realizando uno de los ensayos funcionales aquí descritos.
En un modo de terapia génica, los polinucleótidos de la invención se utilizan para alterar genéticamente las células ex vivo. En esta estrategia, las células extraídas de un donante u obtenidas de una línea celular se transducen con vectores de BDCA, y a continuación se administran a un receptor. Las células adecuadas para la transfección incluyen las células periféricas sanguíneas mononucleares.
En otro modo de terapia génica, los polinucleótidos de la invención se utilizan para alterar genéticamente las células in vivo. El objetivo incluye, pero no se limita a, tratar varios tipos de cáncer.
Los polinucleótidos también se pueden utilizar para producir células que no expresen BDCA-2, y animales transgénicos que expresen BDCA-2.
Obtenidas también de la invención son las células manipuladas genéticamente para no expresar o para expresar BDCA a niveles significativamente reducidos. Dichas células se pueden producir seleccionando una célula, preferiblemente una DC, y proporcionando a la célula una construcción de expresión que comprende un polinucleótido codificante de un gen de BDCA-2, donde el polinucleótido está posicionado antisensentido y unido operativamente a un promotor. La expresión de dicho polinucleótido produce eficazmente una célula deficiente de BDCA-2.
En otros aspectos, la presente invención proporciona un procedimiento para la preparación de células hospedadoras recombinantes que producen cantidades significativamente reducidas o incluso un "knockout" de la producción de BDCA-2. Se pueden preparar estas células hospedadoras recombinantes por uno o más medios que son conocidos para los expertos en la materia. Por ejemplo, la expresión de genes puede ser inhibida por la incorporación de construcciones de DNA o RNA antisentido en el genoma. Las deleciones o mutaciones de los genes de BDCA-2 endógenos pueden volverlos no funcionales. Los ácidos nucleicos que codifican ribozimas-enzimas de segmentación de RNA-que segmentan específicamente el mRNA de BDCA-2 se pueden introducir en las células hospedadoras recombinantes.
El término "knockout" se refiere a la supresión parcial o completa de la expresión de por lo menos una porción de una proteína codificada por una secuencia de DNA endógena, p.ej., BDCA-2, en una célula. El término "construcción knockout" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que es diseñada para disminuir o suprimir la expresión a una proteína codificada por las secuencias de DNA endógenas en una célula.
Estas construcciones recombinantes pueden ser incorporadas en mamíferos knockout de manera que la producción de BDCA-2 se suprime en las DCs. La preparación de animales knockout y transgénicos es bien conocida por los expertos en la materia y se describe en las Patentes USA 5,434,340; 5,530,179 ; y 5,557,032.
La invención proporciona además procedimientos para producir animales y los animales así producidos que sobreexpresen BDCA-2. Estos procedimientos comprenden generalmente introducir células de animales en un animal, células de animales que han sido tratadas in vitro para insertar allí un segmento de DNA que codifica un polipéptido de BDCA-2, y células de animales que expresan BDCA-2 in vivo en el animal.
D. Kits
La invención abarca kits que contienen fragmentos de unión a antígeno específicos de DCs para determinar BDCA-2 incluyendo BDCA-2 soluble, incluyendo isoformas de los mismos, en suero u otras fuentes. Los procedimientos de diagnóstico que utilizan los kits pueden ser efectuados por laboratorios de diagnóstico, laboratorios experimentales, médicos o individuos particulares. La muestra clínica se pretrata opcionalmente para el enriquecimiento de la diana para la que está siendo probada. A continuación, el usuario aplica un reactivo contenido en el kit con el fin de detectar el nivel modificado o alteración en el componente diagnóstico.
Opcionalmente, el reactivo puede estar conjugado con un marcador que permite la detección de cualquier complejo formado con la diana en la muestra. En otra opción, se proporciona un segundo reactivo que es capaz de combinarse con el primer reactivo después de que haya encontrado su diana y de ese modo suministra el marcador detectable. Por ejemplo, se puede proporcionar IgG antimurino marcado como reactivo secundario. La avidina marcada es un reactivo secundario cuando el reactivo primario ha sido conjugado a biotina.
Los kits pueden ser empleados en diversas muestras biológicas que incluyen, tanto muestras líquidas, suspensiones celulares como muestras de tejidos. Los ensayos adecuados que pueden ser suministrados en forma de kit incluyen los aquí descritos.
Cada reactivo se suministra en una forma sólida o disuelta/suspendida en un tampón líquido para su almacenaje para inventario y posteriormente para intercambio o adición en el medio de reacción cuando se efectúa la prueba. Se proporciona un envasado adecuado. El kit puede proporcionar opcionalmente componentes adicionales que son útiles en el procedimiento. Estos componentes opcionales incluyen, pero no se limitan a, tampones, reactivos de captura, reactivos de revelado, marcadores, superficies reactivas, modos de detección, muestras control, instrucciones, e información interpretativa.
E. Composiciones terapéuticas 1. Composiciones de sustancias
La preparación de composiciones farmacéuticas aquí descritas se lleva a cabo de acuerdo con procedimientos generalmente aceptados para la elaboración de preparaciones farmacéuticas. Véase, por ejemplo, la publicación Remington's Pharmaceutical Science 18th Edition (1990), E.W. Martin ed., Mack Publishing Co., PA. Dependiendo del uso y modo de administración deseado, puede ser deseable procesar más el ingrediente activo en la preparación de composiciones farmacéuticas. Un procesamiento apropiado puede incluir la esterilización, la mezcla con los componentes no tóxicos y no interferentes apropiados, la división en unidades de dosis, y la introducción en una forma de presentación. En una realización, las composiciones terapéuticas contienen DCs, subpoblaciones de las mismas o mezclas de las mismas. En otro aspecto, las composiciones contienen los fragmentos de unión a antígeno aquí descritos. Preferiblemente, los fragmentos de unión a antígeno son, o se derivan de, los mAbs indicados en la Tabla 1. Preferiblemente, las composiciones de DCs contienen DCs aisladas con uno de estos fragmentos de unión a antígeno.
(a) Modos generales de administración
Las composiciones farmacéuticas de la invención se administran mediante un modo apropiado para la forma de composición. Las rutas típicas incluyen la intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intradermal, oral, intranasal, e intrapulmonar (p. ej., aerosol). Las composiciones farmacéuticas para uso humano son administradas típicamente por la vía parenteral, más típicamente por la vía intravenosa, subcutánea o intramuscular. Aunque no es preceptivo, las composiciones farmacéuticas se suministran preferiblemente en forma de monodosis adecuada para la administración de una cantidad exacta. También se contemplan en esta invención las formas de liberación lenta o de liberación sostenida, a través de la cuales se proporciona un nivel del compuesto activo relativamente constante durante un periodo prolongado.
(b) Formulaciones líquidas
Las composiciones líquidas farmacéuticamente aceptables pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo o dispersando un polipéptido o polinucleótido descritos en la invención en un excipiente líquido, tal como agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol o etanol. La composición puede también contener opcionalmente otros agentes medicamentosos, agentes farmacéuticos, vehículos, y sustancias auxiliares tales como los agentes humectantes o emulsificantes, y agentes tamponantes de pH. Las composiciones inyectables se pueden suministrar como soluciones o suspensiones líquidas, como emulsiones, o como formas sólidas para disolución o suspensión en líquido antes de la inyección.
Las composiciones farmacéuticas para la administración oral, intranasal, o tópica se pueden suministrar en formas sólidas, semisólidas o líquidas, incluyendo los comprimidos, cápsulas, polvos, líquidos, y suspensiones. Para la administración a través de las vías respiratorias, una composición preferida es la que proporciona un sólido, polvo, o aerosol líquido cuando se utiliza con un dispositivo nebulizador adecuado.
La invención también abarca composiciones que comprenden liposomas con péptido unido a membrana para distribuir específicamente el liposoma en el área del tumor o células neoplásicas o en el sistema inmune. Se pueden producir estos liposomas de tal manera que contengan, además del péptido, agentes inmunoterapéuticos tales como los descritos más arriba los cuales serían liberados después en el lugar de reconocimiento. Wolf y col. (1984) Biochem. Acta 802:259. Otro sistema de distribución utiliza cápsides quiméricas del parvovirus B19 para la presentación de los fragmentos de unión a antígeno. Brown y col. (1994) Virol. 198:477-488; y Miyamura y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9507-8511. Dichos sistemas quiméricos se incluyen para su uso.
La eficacia de las composiciones incluidas en esta invención puede ser valorada de varias maneras. Por consiguiente, los compuestos de ensayo se preparan como una composición farmacéutica adecuada y se administran a los sujetos en ensayo. Los estudios iniciales son realizados preferiblemente en animales pequeños tales como ratones o conejos, opcionalmente después en primates no humanos y por último en humanos. Preferiblemente, el ensayo de inmunogenicidad se efectúa en individuos sin una respuesta previa a anticuerpos. Se administra una composición de ensayo en una dosis de ensayo apropiada según una pauta de tratamiento apropiada. Puede ser apropiado comparar diferentes dosis y pautas dentro del rango previsto. Los rangos de dosis para la administración de los fragmentos de unión a antígeno son suficiente amplios como para producir el efecto deseado, por el cual se mejoran los síntomas de la enfermedad sin causar efectos secundarios indeseados tales como reacciones cruzadas no deseadas y reacciones anafilácticas. Generalmente, la dosificación variará con la edad, condición, sexo y extensión de la enfermedad en el paciente y puede ser determinada por un experto en la materia. La dosificación puede ser ajustada por el médico del paciente en caso de cualquier complicación. Generalmente, cuando las composiciones se administran conjugadas con agentes terapéuticos, se pueden utilizar dosis más bajas comparables a las utilizadas in vivo en el inmunodiagnóstico por imagen.
2. Fragmentos de unión a antígeno
La invención abarca composiciones farmacéuticas que contienen los fragmentos de unión a antígeno aquí descritos. Tales composiciones farmacéuticas son útiles para inducir o facilitar una respuesta inmune y tratar enfermedades neoplásicas, o incluir tolerancia y tratar enfermedades autoinmunes (GvHD, rechazo de aloinjertos, alérgenos, etc.) solas o conjuntamente con otras formas de terapia, tales como quimioterapia, radioterapia o las terapias descritas en las patentes WO98/23735; WO98/34642; WO97/10000; WO97/10001; y WO97/06821. Otros métodos de tratamiento se describen en la invención y/o son conocidos en el estado de la técnica. Las enfermedades indicadas incluyen, sin limitación, enfermedades víricas, parasitarias, bacterianas, fúngicas, neoplásicas y autoinmunes.
En un modelo de cáncer mamario murino, se ha utilizado el ligando Flt3 (Flt3-L), una citoquina estimuladora de diversos linajes hematopoyéticos, conjuntamente con células de cáncer mamario murino como vacuna. Chen y col. (1997) Cancer Res. 57:3511-6. Las DCs se pueden cargar también con o transducir para expresar antígenos; estas células se utilizan después como adyuvantes en la vacunación de tumores. Las DCs presentan antígenos asociados a tumores de forma endógena al sistema linfático aferente en el contexto restrictivo apropiado de MHC. Wan y col. (1997) HUm. Gene Ther. 8:1355-63; Peiper y col. ((1997) Surgery 122:235-41; y Smith y col. (1997) Int. Immunol. 9:1085-93. Las vacunas de melanoma actuales manipulan las redes de presentación de antígeno y combinan la mejor respuesta inmune celular y antitumoral a anticuerpos efectiva en mediar la inmunidad protectora contra tumores. Estas terapias han causado regresión, progresión retardada de la enfermedad o una mejoría en la supervivencia de algunos casos, con escasos efectos secundarios. Kuhn y col. (1997) Dermatol. Surg. 23:649-54. Las vacunas de melanoma también han sido estudiadas por Conforti y col. (1997) J. Surg. Oncol. 66:55-64.
Las vacunas mezcladas con adyuvantes u otros componentes (tales como citoquinas) se acondicionan en vehículos farmacéuticamente aceptables tal como está descrito en el estado de la técnica. Las vacunas para uso veterinario son sustancialmente similares a las de los humano con la excepción de que los adyuvantes contienen bacterias y componentes bacterianos tales como los adyuvantes de Freund completos o incompletos, son permitidos en las
formulaciones.
F. Métodos de tratamiento
También se incluyen en esta invención los métodos para tratar diversos trastornos tal como aquí se describen y/o son conocidos en el estado de la técnica. Los métodos comprenden la administración de una cantidad de una composición farmacéutica que contiene una composición de la invención en una cantidad efectiva para conseguir el efecto deseado, ya sea la paliación de una afección existente o la prevención de la repetición. Para el tratamiento del cáncer, la cantidad de composición farmacéutica administrada es una cantidad efectiva para producir el efecto deseado. Se puede proporcionar una cantidad efectiva en una o una serie de administraciones. Se puede proporcionar una cantidad efectiva en un bolo o por perfusión continua. Agentes activos adecuados incluyen los fármacos antineoplásicos, modificadores de biorespuesta y células efectoras tales como las descritas por Douillard y col. (1986) Hybridomas (Suppl. 1:5139).
Las composiciones farmacéuticas y modalidades de tratamiento son adecuadas para tratar un paciente provocando directa o indirectamente una respuesta inmune frente a una neoplasia. Un "individuo", "paciente", o "sujeto" es un vertebrado, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un humano. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, humanos, animales salvajes, animales asilvestrados, animales de granja, animales en deportes, y mascotas. Un "sujeto canceroso" es un mamífero, preferiblemente un humano, diagnosticado de tener una neoplasia maligna o estar en riesgo de la misma.
Tal como aquí se utiliza, "tratamiento" se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar el curso de la enfermedad del individuo o célula que están siendo tratados, y se puede efectuar por profilaxis o durante el curso de la patología clínica. Los efectos terapéuticos del tratamiento incluyen, sin limitación, la prevención de la incidencia o repetición de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, reducción de la relación de progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad o prognosis mejorada.
La "patología" asociada con una condición de la enfermedad es cualquier condición que compromete el bienestar, la fisiología normal, o la calidad de vida del individuo afectado. Esto puede implicar, pero no se limita a, invasión destructiva de los tejidos afectados en las áreas previamente inafectadas, crecimiento en el gasto de la función de tejido normal, actividad biológica irregular o suprimida, agravamiento o supresión de una respuesta inflamatoria o inmunológica, susceptibilidad aumentada a otros organismos o agentes patógenos, y síntomas clínicos indeseable tales como dolor, fiebre, náuseas, fatiga, alteraciones de ánimo, y aquellas otras características relacionadas con la enfermedad que pueden ser determinados por el médico que asiste.
Una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente para obtener un resultado clínico beneficioso o deseado al tratamiento. Se puede administrar una cantidad efectiva a un paciente en una o más dosis. En términos de tratamiento, una cantidad efectiva es una cantidad que es suficiente para paliar, mejorar, estabilizar, invertir o ralentizar la progresión de la enfermedad, o si no reducir las consecuencias patológicas de la enfermedad. La cantidad efectiva es determinada generalmente por el médico sobre una base caso por caso y está dentro del ámbito del experto en la materia. Varios factores se toman en cuenta típicamente cuando se determina una dosificación apropiada para conseguir una cantidad efectiva. Estos factores incluyen la edad, sexo y peso del paciente, la afección que está siendo tratada, la severidad de la afección y la forma y concentración efectiva del fragmento de unión a antígeno administrado.
El término "inmunomodulador" o "modulando una respuesta inmune" tal como aquí se emplea incluye los efectos inmunoestimuladores así como los inmunosupresivos. Los efectos inmunoestimuladores incluyen, pero no se limitan a, aquéllos que directa o indirectamente intensifican las respuestas inmunes humorales o celulares. Ejemplos de efectos inmunoestimuladores incluyen, pero no se limitan a, producción aumentada de anticuerpos específicos de antígenos; activación o proliferación de una población de linfocitos tales como células NK, células CD4^{+}, células CD8^{+}, macrófagos y similares; síntesis aumentada de citoquinas o quimioquinas incluyendo, pero no limitando a, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, interferones, TNF-\alpha, IL-10, TGF-\beta y similares. Los efectos inmunosupresivos incluyen aquéllos que directa o indirectamente disminuyen las respuestas inmunes celulares o humorales. Ejemplos de efectos inmunosupresivos incluyen, pero no se limitan a, una reducción en la producción de anticuerpos específicos de antígenos tal como la producción de IgE reducida; activación de poblaciones de linfocitos u otras poblaciones celulares que tienen actividades inmunosupresivas tales como aquéllas que causan tolerancia inmune; y síntesis aumentada de citoquinas que tienen efectos supresivos hacia ciertas funciones celulares, pero no limitadas a IL-10 y TGF-\beta. Un ejemplo de esto es IFN\gamma, que parece bloquear el "switch" de clase inducido por IL-4 a IgE y IgG1, reduciendo por lo tanto los niveles de estas subclases de anticuerpos.
Los sujetos humanos adecuados para la terapia del cáncer comprenden además dos grupos de tratamiento, los cuales se pueden diferenciar mediante criterios clínicos. Pacientes con "enfermedad avanzada" o "carga tumoral alta" son aquéllos que son portadores de un tumor clínicamente apreciable. Un tumor clínicamente apreciable es un tumor que puede ser detectado en base a la masa del tumor (p. ej., por palpación, escáner CAT, sonograma, mamograma o rayos X; los marcadores positivos bioquímicos o histopatológicos por sí mismos son insuficientes para identificar esta población). Una composición farmacéutica objeto de esta invención se administra a estos pacientes para provocar una respuesta antitumoral, con el objetivo de paliar su condición. Idealmente, la reducción de la masa del tumor ocurre por consiguiente, pero cualquier mejoría clínica constituye un beneficio. La mejoría clínica incluye un riesgo o velocidad de progresión reducida o reducción en las consecuencias patológicas del tumor.
Un segundo grupo de sujetos adecuados se conoce en el estado de la técnica como "grupo coadyuvante". Estos son individuos que han tenido un historial de cáncer, pero han respondido a otra clase de terapia. La terapia previa puede haber incluido pero no está restringida a, resección quirúrgica, radioterapia, y quimioterapia tradicional. Por consiguiente, estos individuos no tienen un tumor clínicamente apreciable. Sin embargo, están bajo sospecha de correr un riesgo en la progresión de la enfermedad, cerca del lugar original del tumor o por metástasis.
"Coadyuvante" tal como aquí se utiliza tiene varios significados, todos los cuales serán claros dependiendo del contexto en el cual se utiliza el término. En el contexto de una preparación farmacéutica, un coadyuvante es un agente químico o biológico empleado en combinación (tanto simultáneamente como de otra manera) con, o fusionado de manera recombinante a, un antígeno para intensificar la inmunogenicidad del antígeno. Véase la revisión de Singh y col. (1999) Nature Biotech. 17:1075-1081. Se ha sugerido el uso de DCs aisladas como coadyuvantes. Las composiciones de uso de las mismas están incluidas en esta invención. En el contexto de diagnosis o tratamiento del cáncer, coadyuvante se refiere a una clase de pacientes con cáncer sin masa tumoral clínicamente detectable, pero son sospechosos de estar en riesgo de repetir.
Este grupo puede subdividirse además en individuos de bajo riesgo y de alto riesgo. La subdivisión se efectúa en base a las características observadas antes o después del tratamiento inicial. Dichas características son conocidas en clínica, y son definidas adecuadamente para cada cáncer diferente. Las características típicas de los subgrupos de alto riesgo son aquéllas en las que el tumor ha invadido los tejidos circundantes, o muestran implicación de los ganglios linfáticos.
Otro grupo adecuado es el de aquellos pacientes con predisposición genética al cáncer pero que no han evidenciado todavía los signos clínicos del cáncer. Por ejemplo, las mujeres que dan positivo en una mutación genética asociada a cáncer mamario, pero todavía con edad para tener hijos, pueden necesitar recibir uno o más de los fragmentos de unión a antígeno aquí descritos en el tratamiento para prevenir profilácticamente la incidencia del cáncer hasta que sea adecuado efectuar cirugía preventiva.
Son sujetos especialmente apropiados los pacientes humanos con cáncer, incluyendo, pero no limitando a, glioblastoma, melanoma, neuroblastoma, adenocarcinoma, glioma, sarcoma de tejido blando, y varios carcinomas (incluyendo cáncer pulmonar de células pequeñas). Carcinomas adecuados incluyen además cualquiera que sea conocido en el campo de la oncología, incluyendo, pero no limitando a, astrocitoma, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, oligodendroglioma, ependimoma, meduloblastoma, tumor neuro-ectodérmico primitivo (PNET), condrosarcoma, sarcoma osteogénico, adenocarcinoma ductal pancreático, adenocarcinomas pulmonares de células pequeñas y grandes, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma broncoalveolar, adenocarcinoma epitelial, y metástasis del hígado de los mismos, linfangiosarcoma, linfangiosarcoma endotelial, hepatoma, colangiocarcinoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, carcinoma de células basales, carcinoma de glándula sudorípara, carcinoma papilar, carcinoma de glándula sebácea, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de las células renales, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, tumor testicular, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, y enfermedad de cadena pesada, tumores mamarios tales como adenocarcinoma ductal y lobular, escamosos y adenocarcinomas del cuello uterino, carcinomas epiteliales de útero y ovario, adenocarcinomas prostáticos, carcinoma de células escamosas transicionales de vejiga, plasmacitoma (nodular y difuso) de linfomas de células B y T, leucemias aguda y crónica, melanoma maligno, sarcomas de tejido blando y leiomiosarcomas.
Los pacientes pueden tener una forma avanzada de la enfermedad, en cuyo caso el objetivo del tratamiento puede incluir atenuación o reversión de la progresión de la enfermedad, y/o mejoría de los efectos secundarios. Los pacientes pueden tener un historial de la condición, para la cual han sido tratados, en cuyo caso el objetivo terapéutico incluirá típicamente una disminución o retraso en el riesgo de repetición.
Los trastornos autoinmunes son los causados por una respuesta inmune mal dirigida que resulta de la autodestrucción de diversas células, tejidos y órganos. Es desconocida la causa de estos trastornos. Se sabe que el reconocimiento de lo propio a través de MHC es de importancia en una repuesta inmune. Sin embargo, la prevención de una respuesta autoinmune y las células responsables de autoinmunidad no se comprenden muy bien.
La autoinmunidad resulta de una combinación de factores que incluyen las influencias genéticas, hormonales, y ambientales. Muchos trastornos autoinmunes se caracterizan por la hiperactividad de células B, marcadas por la proliferación de células B y autoanticuerpos y por hipergammaglobulinemia. La hiperactividad de las células B está probablemente relacionada con anormalidades de las células T. Los factores hormonales y genéticos influencian fuertemente en la incidencia de los trastornos autoinmunes; por ejemplo, el lupus eritematoso afecta predominantemente a las mujeres con edad de tener hijos, y ciertos haplotipos de HLA están asociados con un elevado riesgo de trastornos autoinmunes específicos.
Los trastornos autoinmunes comunes incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis psoríatica, espondilitis anquilosante, síndrome de Sjögren, lupus eritematoso, síndrome de Goodpasture, síndrome de Reiter, escleroderma, vasculitis, polimiositis y dermatomiositis. Muchas de estas condiciones incluyen reacciones inflamatorias aberrantes relacionadas con los trastornos inmunológicos. Las DCs aquí descritas son adecuadas para su uso en el tratamiento de estos trastornos en particular cuando se utilizan para inactivar o inducir tolerogenización en las células T implicadas en el trastorno. Los métodos de tratamiento son conocidos en el estado de la técnica. Tal como aquí se ha tratado, uno o más de los subconjuntos de DCs obtenidas por los procedimientos aquí descritos son adecuados para su uso en el tratamiento de autoinmunidad.
"Actividad inmunológica" de un fragmento de unión a antígeno se refiere a unir específicamente el antígeno que el anticuerpo intacto reconoce. Tal unión puede o no puede provocar una respuesta inmune. Una respuesta inmune específica puede provocar anticuerpo, repuestas de la célula B, respuestas de la célula T, cualquier combinación de las mismas, y funciones afectoras que resultan de las mismas. Incluidas, sin limitación, están las funciones ADCC mediadas por anticuerpo y citólisis mediada por complemento. La respuesta de células T incluye, sin limitación, la función de la célula T auxiliar, función de la célula T citotóxica, función de inflamación/inductora de células T, y supresión inmune mediada por células T. Se considera "inmunogénico" un compuesto (sólo o en combinación con un vehículo o coadyuvante) capaz de provocar directa o indirectamente una respuesta inmune específica de acuerdo con cualquiera de estos criterios. La "actividad" o "función" del fragmento de unión a antígeno se refiere a cualquiera de las actividades inmunológicas de un anticuerpo, incluyendo la detección, mejoría o paliación del cáncer.
Una "respuesta inmune" se refiere a la inducción o intensificación de una respuesta inmunológica al tejido maligno o enfermo, agentes causantes de enfermedades y otros agentes extraños a los cuales se expone el cuerpo. Las respuestas inmunes pueden ser humorales, como es evidente por la producción de anticuerpos; y/o mediadas por células, como es evidente por las respuestas citolíticas demostradas por dichas células como células asesinas naturales o linfocitos T citotóxicos (CTLs) y las citoquinas producidas por las mismas. Las respuestas inmunes se pueden seguir por medio de un infiltrado celular mononuclear en el lugar de la infección o malignidad. Típicamente, tal seguimiento se efectúa por histopatología. Una "respuesta inmune específica de cáncer" es una respuesta que se produce contra la malignidad pero no contra las células no cancerosas. Los tratamientos aquí descritos inducen o aumentan típicamente una respuesta inmune mediada por células pero también pueden inducir o aumentar una respuesta inmune mediada por anticuerpos. Los tratamientos también pueden influenciar el tipo de respuesta inmune al antígeno.
Las composiciones según la invención son también adecuadas para inducir una respuesta inmune Th1 específica de antígeno. La estimulación de una respuesta inmune del tipo Th1 se puede medir en un hospedador tratado de acuerdo con la invención y se puede determinar mediante cualquier método conocido en el estado de la técnica incluyendo, pero no limitando a, una reducción en los niveles de IL-4 medidos antes y después del estímulo del antígeno; o detección de niveles inferiores (o incluso ausentes) de IL-4 en el hospedador tratado en comparación a un control, cebado ("primed") con antígeno, o cebado y estimulado, sin las composiciones de la invención; un aumento en los niveles de IL-12, IL-18 y/o IFN (\alpha, \beta o \gamma), preferiblemente IFN- g en un hospedador tratado en comparación a un control cebado con antígeno o cebado o estimulado; producción de anticuerpos IgG2a en un hospedador tratado en comparación a un control no tratado; una reducción en los niveles de IgE específico de antígeno medidos antes y después del estímulo del antígeno; o detección de niveles más bajos (o incluso ausentes) de IgE específico de antígeno en un hospedador tratado en comparación a un hospedador no tratado cebado con antígeno o cebado y estimulado. Varias de estas determinaciones se pueden efectuar midiendo las citoquinas producidas por las APCs y/o linfocitos, preferiblemente las DCs y/o células T, in vitro o ex vivo mediante procedimientos aquí descritos y conocidos en el estado de la técnica. Los procedimientos para determinar la producción de anticuerpos incluyen cualquiera conocido en el estado de la técnica.
La inducción de citoquina parcial Th1 produce respuestas inmunes celulares intensificadas, tal como las efectuadas por las células NK, células asesinas citotóxicas, células auxiliares Th1 y células de la memoria. Estas respuestas son particularmente beneficiosas para su uso en la vacunación protectora o terapéutica contra virus, hongos, protozoos parásitos, bacterias, asma y enfermedades alérgicas, así como tumores.
La invención incluye además la infrarregulación de la producción de interferón tipo I por ligación de BDCA-2, infrarregulación de respuestas inmunes de Th1 por ligación de BDCA-2, y polarización de una respuesta inmune a Th2 por ligación de BDCA-2. Estas indicaciones se pueden revertir interfiriendo con la ligación de BDCA-2. La invención abarca además el cribado ("screening") de componentes adecuados para interferir en la ligación de BDCA-2 y las composiciones de estos componentes.
Cuando los fragmentos de unión a antígeno se utilizan en combinación con varios agentes terapéuticos, la administración de ambos se efectúa sustancialmente de forma simultánea. El término "sustancialmente de forma simultánea" significa que ambos se administran razonablemente muy próximos con respecto al tiempo. La administración del agente terapéutico puede ser diaria, o a cualquier otro intervalo adecuado, dependiendo de tales factores tales como, por ejemplo, la naturaleza de la enfermedad, el estado del paciente y la vida media del agente.
Las composiciones terapéuticas se pueden administrar por inyección o por perfusión gradual prolongada. Los fragmentos de unión a antígeno se pueden administrar por vía intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intracavidad, intranodal, intratecal o transdérmica, solos o en combinación con otros agentes terapéuticos.
Otro método de administración es la intralesional, por ejemplo, mediante inyección directa en el tumor. La administración intralesional de varias formas de inmunoterapia a pacientes con cáncer no causa la toxicidad observada con la administración sistémica de agentes inmunológicos. Fletcher y col. (1987) Lymphokine Res. 6:45; Rabinowich y col. (1987) Cancer Res. 47:173; Rosenberg y col. (1989) Science 233:1318; y Pizz y col. (1984) J. Int. Cancer 34:359.
Además, puede ser deseable administrar las composiciones localmente en el área que requiere tratamiento; esto se puede conseguir, por ejemplo, por infusión local durante cirugía, por inyección, por medio de un catéter, o por medio de un implante, siendo el implante de un material poroso, no poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como las membranas de silastic, o fibras. Una membrana adecuada es la Gliadel® suministrada por Guilford Sciences.
El hecho de que la ligación de BDCA-2 con el anticuerpo monoclonal anti-BDCA-2 (AC144) induce movilización de Ca_{2}^{+} intracelular indica que la DC plasmacitoide (y todas las otras células que expresan BDCA-2) puede ser modulada funcionalmente por el desencadenamiento de la señalización de BDCA-2 o inhibición del desencadenamiento de la señalización de BDCA-2. Por lo que se refiere a la modulación de DC, los siguientes aspectos son abarcados por las reivindicaciones:
A)
Inducción e infrarregulación de las respuestas de las células T CD4^{+} y CD8^{+}.
B)
Polarización de la respuesta inmune hacia la tolerancia o inmunidad.
C)
Polarización de respuestas de células T CD4^{+} hacia el desarrollo de células Th1, desarrollo de células Th2 o desarrollo de células T 1 CD4^{+} reguladora de Th3/T. Esta última infrarregula las respuestas inmunes, posiblemente mediante secreción de TGF-\beta y/o IL-10,
D)
Por lo general se piensa en las DCs como células presentadoras de antígeno a las células T. Sin embargo, estudios recientes de varios laboratorios han demostrado que desempeñan papeles importantes en la activación de las células B y en la regulación de las respuestas de células B en la síntesis de anticuerpos puede ser modulada por lo tanto mediante BDCA-2 en DCs. Lo mismo puede ser cierto para las respuestas de las células NK.
Como el interferón tipo I puede inducir respuestas inmunes de tipo Th1 en humanos (Parronchi y col. (1996) Eur. J. Immunol. 26:697-703), el desencadenamiento de BDCA-2 polariza las respuestas de células T CD4^{+} hacia el desarrollo de las células Th2, mientras que la inhibición de la señalización de BDCA-2 polariza las respuestas de células T CD4^{+} hacia el desarrollo de las células Th1. La invención abarca así la polarización de las respuestas de células T CD4^{+} hacia el desarrollo de las células Th2 o Th1 mediante el desencadenamiento de la señalización de BDCA-2 o inhibición del desencadenamiento de la señalización de BDCA-2, respectivamente.
Ejemplo 1 Generación de mAb específico de DCs
Se inocularon cinco ratones Balb/c hembras de 6-8 semanas de edad (Simonsen Laboratorios, Gilroy, CA) con aproximadamente 5 x 10^{5} a 1 x 10^{6} de DC sanguíneas purificadas HLA-DR^{+}lin^{-} bajo anestesia los días 0, 4, 7, 11 y 14 en la planta de la pata derecha delantera, y aproximadamente 1 x 10^{6} de células B de linfoblastoma Bristol-8 HLA-A2^{+} en la planta de la pata izquierda delantera los días -3, 0, 4, 7, 11 y 14. Ambos tipos de células se incubaron con 1:100 PHA (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) durante 10 minutos a temperatura ambiente y se lavaron con PBS antes de la inyección. Este tratamiento proporciona efectos coadyuvantes no específicos y obvia la necesidad de coadyuvantes tales como el coadyuvante de Freund.
El día 15, un día después de la quinta inyección de DC HLA-DR^{+}lin, los ganglios linfáticos del poplíteo del lado derecho del ratón fueron extirpados. Se preparó una suspensión de linfocitos y las células se fusionaron a las células de mieloma SP2/0 Ag14 empleando una modificación de la técnica descrita por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495. Las células fusionadas se depositaron en placas de 96 pocillos en DMEM suplementado con 20% de FCS (HyClone, Logan, UT), 2 mmol/L de L-glutamina, 15 mmol/L de Hepes, 10^{-4} mmol/L de hipoxantina (Gibco/BRL), y se colocaron en un incubador a 37ºC con 9% de CO_{2}.
Cuando fueron evidentes las colonias de hibridomas visibles, los sobrenadantes de estos pocillos se examinaron por citometría de flujo en búsqueda de secreción de anticuerpos y de no reactividad (<1% células positivas) a PBMC. En resumen, una mezcla de esferas de poliestireno conjugadas con mAb kappa anti-ratón de rata (2.5 \mum de diámetro, Interfacial Dynamics Corp., Portland, OR) y PBMC se incubó con 50 \mul de sobrenadante de hibridoma durante 20 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de esferas/células se lavó después dos veces con PBS, pH 7,4, que contenía 5 mmol/L de EDTA y 0,5% de BSA (PBS/EDTA/BSA), y la unión de IgM, IgG1, IgG2a y IgG2b de ratón de los sobrenadantes a las esferas y las células de ensayo se detectó mediante tinción con mAb IgM anti-ratón de rata conjugado con PE (clon X54, BD Biosciences, San Jose, CA), mAb IgG1 anti-ratón de rata (clon X56, BD Biosciences) y mAb IgG2 anti-ratón de rata (con X57, BD Biosciences). El PBMC y las esferas de poliestireno pueden ser fácilmente discriminadas en el análisis por citometría de flujo mediante señales de dispersión.
\newpage
Los sobrenadantes de los cultivo que cumplían con los criterios de selección de la primera ronda fueron sometidos a continuación a un análisis por citometría de flujo para detectar reactividad a una proporción significativa de DC sanguíneas. En resumen, una mezcla de esferas de poliestireno conjugadas con mAb anti-ratón de rata y DC sanguíneas enriquecidas (PBMC depletadas de células B, células T y monocitos) se incubó con 50 \mul de sobrenadante de hibridoma durante 20 minutos a temperatura ambiente. La mezcla fue lavada a continuación dos veces con PBS/EDTA/BSA y teñida con mAb IgM anti-ratón conjugado con PE, mAb IgG1 anti-ratón de rata, y mAb IgG2 anti-ratón de rata para detectar la unión de IgM, IgG1, IgG2a y IgG2b de ratón de los sobrenadantes a las esferas y a las DC sanguíneas enriquecidas. Para la discriminación de DC HLA-DR^{+} de las células HLA-DR^{-} en el análisis por citometría de flujo, la mezcla de esferas/células se lavó una vez, los lugares de unión libre del mAb IgG2 anti-ratón de rata conjugado con PE y el mAb \kappa anti-ratón de rata conjugado a esferas fueron saturados por incubación con 100 \mug/ml de IgG2a de ratón durante 5 minutos a temperatura ambiente, y la mezcla se contratiñó a continuación con anti-HLA-DR-FITC (clon AC122, IgG2a).
Las células de hibridoma fueron expandidas en cultivo, los stocks fueron congelados en nitrógeno líquido, los subclones fueron establecidos por dilución limitante, y las series de subclones positivos también fueron congelados en nitrógeno líquido. El isotipo del mAb se determinó mediante el Kit ISOTYPE Ab-STAT (SangStat Medical Corp. Palo Alto, CA).
Para la producción de mAb, las células de hibridoma se desarrollaron como un tumor ascítico en ratones Balb/c, con recogida del fluido ascítico rico en mAb, o en cultivo celular (cultivo "roller" o cultivo de fibra hueca), con recogida del sobrenadante de cultivo rico en mAb. El mAb IgG puro se preparó a partir del fluido ascítico o sobrenadante del cultivo celular mediante cromatografía de afinidad con Proteína A seguida en algunos casos de cromatografía de interacción hidrofóbica y se conservó en PBS con 5 mmol/L de EDTA y 0,05% de azida sódica a 4ºC. Los mAb purificados fueron conjugados con FITC (Sigma, St. Louis, MO), PE (Cyanotech Corp., Kailua Kona, HI), Cy5 (Amersham Life Science Inc., Arlington Heights, IL), APC (Europa Bioproducts Ltd., Cambridge, UK), biotina (Pierce, Rockford, IL) y esferas superparamagnéticas coloidales (aproximadamente 50 nm en diámetro, Miltenyi Bistec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemania) de acuerdo con técnicas estándar. Hermanson (1996) "Bioconjugate Techniques". Acadamic Press Inc., San Diego, 785 pp.; Aslam y col. (1998) ``Bioconjugation: protein coupling technologies for the biomedical sciences. Macmillan Reference Ltd., London, 833 pp.; y Kantor y col. (1997) "Magnetic cell sorting with colloidal superparamagnetic particles". En, "Cell preparation Methods and Applications". Recktenwald y col. Eds. Marcel Dekker Inc. New York, pp. 153-173.
Preparaciones celulares
Las muestras de sangre de capas leuco-plaquetarias ("buffy coats") de voluntarios sanos normales fueron obtenidas del Institute for Transfusionmedicine, Hospital Merheim, Cologne, Alemania. Las PBMC se prepararon a partir de las capas leuco-plaquetarias por centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Paque estándar (Pharmacia, Uppsala, Suecia).
Los leucocitos de sangre periférica fueron preparados a partir de las capas leuco-plaquetarias mediante lisis de eritrocitos en tampón de cloruro amónico isotónico (155 mmol/L de NH_{4}Cl, 10 mmol/L de KHCO_{3} y 0,1 mM de EDTA). Hansel y col. (1991) J. Immunol. Met. 145:105-110, Las DC sanguíneas CD4^{+}lin^{-} se aislaron de PBMC por separación celular inmunomagnética en dos etapas (MACS) tal como se ha descrito en detalle en otra parte. Robert y col. (1998); y Miltenyi y col. (1999) "High gradient magnetic cell sorting". En "Flow cytometry and cell sorting". Ed., Radbruch, Springer-Verlag, Berlin. pp. 216-247. En resumen, los monocitos, células T y células NK fueron depletadas utilizando mAb contra CD3 (Clon BW264/56), CD11b (clone MI/70, 15.11.5), CD16 (Clon VEP-13) y en unos pocos experimentos un antígeno escasamente definido expresado en células B y monocitos (clon L179). De la fracción de células depletadas, las DC sanguíneas fueron enriquecidas a alta pureza utilizando un anticuerpo contra CD4 (M-T321). Para examinar los sobrenadantes de cultivo de hibridoma (ver más arriba), las DC sanguíneas fueron meramente enriquecidas parcialmente mediante la depleción inmunomagnética de las células T, células B y monocitos en base a la expresión del antígeno CD3 y L179.
Las células que expresan CD1c^{-}, BDCA-2^{-} y BDCA-3^{-} fueron aisladas de PBMC o amígdalas mediante marcaje magnético indirecto con mAb conjugado a PE o FITC (AD5-8E7, AC144 y AD6-5E8, respectivamente) como reactivo primario y microesferas conjugadas con mAb anti-PE o anti-FITC (Miltenyi Bikotec GmbH) como reactivo secundario, y el enriquecimiento de las células marcadas por MACS. En algunos experimentos, las células BDCA-3^{+} se aislaron en base al marcaje magnético directo con microesferas conjugadas a mAb (AD5-5E8) anti-BDCA-3. Se obtuvieron DC sanguíneas CD1c^{+} altamente puras sin contaminantes CD1c^{+} mediante depleción inmunomagnética de las células B CD18+ utilizando microesferas conjugadas con mAb CD19 (Miltenyi Bistec GMBH) seguida de enriquecimiento inmunomagnético de células CD1c^{+}. Los basófilos fueron purificados de PBMC por depleción inmunomagnética de no basófilos en base al marcaje magnético indirecto de células que expresan CD3, CD7, CD14, CD15, CD36, CD45RA, y HLA-DR con un kit de marcaje magnético (Miltenyi Bistec). Los monocitos CD14^{+}, las células progenitoras hematopoyéticas CD34^{+} y las células T CD3^{+} fueron purificadas inmunomagnéticamente en base al marcaje magnético directo con microesferas conjugadas con mAb CD14, CD34 y CD3 (Miltenyi Bistec GMBH), respectivamente.
Cultivo celular
Para la generación de DCs "inmaduras" derivadas de monocitos (DC-Mo), se cultivaron monocitos CD14^{+} purificados a una densidad celular de 5 x 10^{5} a 1 x 10^{6} células/ml en medio [RPMI 1640 (Gibco/BRL) suplementado con 2 mmol/L de L-glutamina, 10% de FCS (Sigma), 100 mmol/L de piruvato sódico (Gibco/BRL), 100 U/ml de penicilina (Gibco/BRL), y 100 \mug/ml de estreptomicina (Gibco/BRL)] a 37ºC en una atmósfera humidificada que contiene un 5% de CO_{2} en presencia de 500-1000 U/ml de rIL-4 (Pepro Tech, Rolcky Hill, NJ) y 100 ng/ml de rGM-CSF (Pepro Tech) durante 7 días. Para la generación de DC-Mo "maduras", se lavaron las DC-Mo "inmaduras" una vez y se cultivaron en medio en presencia de 20 ng/ml de TNF-\alpha (Pepro Tech) durante otros 3 días. Para la generación de las DCs derivadas de células progenitoras hematopoyéticas CD34^{+} (DC-CD34), las células CD34+ purificadas se cultivaron a una densidad celular de 5 x 10^{4} células/ml en un medio en presencia de 100 ng/ml de ligando rFlt3 (PeproTech), 0,05 ng/mL de mrTGF-\beta1 (PeproTech), 10 ng/ml de rTNF-\alpha, 20 ng/ml de rSCF (PeproTech) y 100 ng/ml de rGM-CSF durante 11 días. Las DC CD4^{+}lin^{-} sanguíneas recién aisladas fueron cultivadas a una densidad celular de 5 x 10^{5} a 1 x 10^{6} células/ml en un medio en presencia de 10 ng/ml de rlL-3 (PeproTech) durante hasta 48 horas. Las DC aisladas que expresaban CD1c, BDCA-2, y BDCA-3 fueron cultivadas a una densidad celular de 5 x 10^{5} a 1 x 10^{6} células/ml en un medio sin citoquina o en presencia de 10 ng/ml de rIL-3, 20 ng/ml de IL-4 (PeproTech) y 100 ng/ml de GM-CSF durante hasta 48 horas.
Ejemplo 2 Análisis por citometría de flujo de DCs sanguíneas
Se ha utilizado un citómetro de flujo FACScalibur (BD Biosciences) de uno, dos, tres o cuatro colores. Los datos de 5 x 10^{3} a 2 x 10^{5} células por muestra fueron adquiridos en modo de lista y analizados utilizando un software CellQuest (BD Biosciences).
Los siguientes mAb (nombres de clon) se utilizaron en este estudio de citometría de flujo: CD1a (HI149), CD 10 (HI10a), CD11a (G43-25B), CD11c (B-ly6), CD25 (M-A261), CD27 (M-T271), CD32 (FL18.26), CD38 (HIT2), CD40 (5C3), CD43 (IG10), CD54 (HA58), CD62L (Dreg 56), CD64 (10,1), CD69 (FN50), CD98 (UM7F8), anti-HLA-DQ (TU169), y anti-TCR\alpha\beta T1OB9. 1A-31 de PharMingen, San Diego, CA; CD2 (S5.2), CD8 (SKI), CD13 (L138), CD14 (MFP9), CD19 (SJ25-CI), CD33 (P67.6), CD34 (8G12), CD45RO (UCHL-1), CD56 (NCAM16.2), CD71 (L01.1), CD123 (9F5), anti-IgD (TA4.1), IgG1 anti-ratón (X56), IgG2 anti-ratón (X57) y IgM anti-ratón (X54) de BD Biosciences; CD5 (CLB-T11/11, 6G4), CD7 (CLB-T-3A1/1, 7F3), CD16 (CLB-FcR gran/1, 5D2), CD45RA (F8-11-13), CD80 (CLB-DALI) de CLB Amsterdam, Holanda; CD18 (7E4), CD23 (9P25); CD58 (AlCD58), CD77 (38.13), CD83 (HB15A), CD86 (HA5.2B7), CD116 (SC06) de Coulter Immunotech, Marsella, Francia; CD4 (M-T321), CD11b (M1/70,15.11.5), CD14 (TÜK4), CD15 (VIMC6), anti-HLA-DR (910/D7), anti-AC133 (AC133/1) y anti-TCR\alpha\beta (BW242/412) de Miltenyi Bistec GMBH, CD36 (AC106), CD123 (AC145), anti-HLA-DR (AC122 y AC123) y anti-GPA (AC107) de Amcell, Sunnyvale, CA; CD1c (M241) de Ancell, Bayport, MN; anti-IgG policlonal, anti-IgM (SA-DA4), anti-kappa policlonal y anti-lambda policlonal de Southern Biotechnology Associates, Birmingham, Alabama; CD61 (VIPL2) de W. Knapp, Institute of Immunology, University of Veinna, Viena, Austria; CD44 (IM7) de J. Moll, Forschungszentrum Karlsruhe, Alemania; CD20 (H147) de Caltag Laboratorios, Burilingame, CA; anti-CLA (HECA-452) de E. Butcher, Department of Pathology, Standford University, Stanford, CA; anti-Fc_{\varepsilon}RI (15-1) de J.P. Kinet. Molecular Allergy and Immunology Section, National Institute of Allery and Infectious Diseases, National Institute of Health, Rockville, Maryland; CD11c (ki-M1) de M.R. Parwaresch, Department of Pathology, Christian Albrechts University, Kiel, Alemania; CMRF-44 y CMRF-56 de D.N. Hart, Mater Medical Research Institute, Mater Misericordiae Hospitals, South Brisbane, Queensland, Australia; y anti-HLA-A, -B, -C (W6/32) de Sigma.
Todos los anticuerpos fueron utilizados como mAb conjugados a FITC, PE, biotina o Cy5. Para la tinción inmunofluorescente indirecta con mAb biotinilado, se empleó APC-estreptavidina (BD Biosciences). Para excluir las células muertas en el análisis por citometría de flujo, las células se tiñeron con yoduro de propidio. Para minimizar la unión de mAb mediada por el receptor Fc, las células se tiñeron en la mayoría de los experimentos en presencia de reactivo bloqueante de FcR (Miltenyi Bistec GMBH) que contenía IgG humano.
Análisis microscópico
Las células fueron centrifugadas sobre portaobjetos en una citocentrífuga (Cytospin 3, Shandon, Pittsburg, PA). Para la microscopia de fluorescencia, los portaobjetos se secaron al aire durante toda una noche después de la citocentrifugación y se montaron con Fluoromount G (Southern Biotechnology Associates). Para la tinción de May Grunwald/Giemsa, los portaobjetos se secaron al aire durante al menos 2 horas después de la citocentrifugación, se tiñeron en la solución de May Grunwald/Giemsa (Merck, Damstadt, Alemania) durante 2 minutos a temperatura ambiente, se enjuagaron a fondo en agua destilada, se tiñeron en solución de Giemsa (Merck) durante 15 minutos a temperatura ambiente, se lavaron repetidamente en agua destilada, y se secaron al aire durante al menos 2 horas. Se utilizó un microscopio Zeiss Axioscop (Zeiss, Oberkochen, Alemania) para el análisis. Las imágenes digitales fueron hechas con el Microimager Xillix (Xillix, Vancouver, Canada).
Ejemplo 3 Inhibición cruzada, coaglutinación y análisis de cointernalización
Para analizar si dos clones mAb diferentes reconocen el mismo epítopo del antígeno (o estrechamente relacionado), se efectuaron ensayos de unión de inhibición cruzada. Entre 1 x 10^{6} y 2 x 10^{6} células se preincubaron con uno de los dos clones de mAb a una concentración de aproximadamente 100 \mug/ml durante 10 minutos a 4ºC, y luego se tiñeron con un conjugado de PE del otro clon a su titulación óptima durante otros 5 minutos a 4ºC. Las PBMC se utilizaron para analizar la inhibición cruzada de clones de mAb específicos de BDCA-2, BDCA-3 y BDCA-4, y se utilizaron células MOLT-4 para analizar la inhibición cruzada de los clones de mAb específicos de CD1c. La tinción de las células se analizó por citometría de flujo.
Para averiguar si AD5-5E8 y AD5-14H12 reconocen el mismo antígeno (o el mismo complejo de antígeno), se efectuó un ensayo de coaglutinación. En resumen, Las células que expresaban BDCA-3 fueron aisladas de PBMC por marcaje magnético indirecto con mAb AD5-14HI2 conjugado a PE y microesferas conjugadas con mAb anti-PE, y las células aisladas se incubaron durante 30 minutos a 37ºC para inducir la aglutinación del complejo antígeno-mAb. Después, las células se lavaron con PBS/EDTA/BSA frío suplementado con 0,1.% de azida sódica (PBS/EDTABSA/azida), y se tiñeron con mAb AD5-5E8 conjugado a FITC en PBS/EDTABSA/azida durante 10 minutos a 4ºC. La tinción de las células se analizó por microscopia de fluorescencia.
Se empleó un ensayo de cointernalización para investigar si AC144 y AD5-17F6 reconocen el mismo antígeno (o el mismo complejo de antígeno). En resumen, 1 x 10^{6} de PBMC se incubaron con 50 \mug/ml de mAb AC144 durante 15 minutos a temperatura ambiente en PBS/BSA, se lavaron dos veces en PBSBSA, y luego se incubaron en el medio de cultivo celular a 37ºC durante 30 minutos. Para analizar si el mAb AC144 se internaliza en el cultivo, se tiñeron alícuotas de las células antes y después del periodo de cultivo con IgG1-PE anti-ratón de rata. Para determinar si todos los lugares de unión a mAb AC144 fueron saturados con mAb AC144 no conjugado antes del cultivo y si cualquier lugar de unión libre reaparecía después del cultivo, se tiñeron alícuotas de las células antes y después del periodo de cultivo con AC144-PE. Para analizar si el antígeno AD5-17F6 se cointernaliza, se tiñeron alícuotas antes y después del periodo de cultivo con AD5-17F6-PE. Todas la células fueron contrateñidas con CD123-FITC y HLA-DR-Cy5 para poder establecer ventanas sobre DC CD123^{bright}HLA-DR^{+} plasmicitoide en el análisis de citometría de flujo.
Ejemplo 4 Ensayo de endocitosis
Para evaluar la endocitosis de los subconjuntos de DC sanguíneas, se incubaron DC sanguíneas CD1c^{+}, BDCA-2^{+} y BDCA-3^{+} purificadas, y (como control) células T CD3^{+} purificadas a 37ºC en un medio con 1 mg/ml de amarillo de Lucifer (LY) durante 0, 15, 45 y 75 minutos. Después, las células se lavaron tres veces con PBS/EDTA/BSA frío y se analizaron por citometría de flujo.
Ejemplo 5 Reactividad de las DCs sanguíneas aisladas con células sanguíneas no cultivadas
De acuerdo con su reactividad con las células sanguíneas, los mAb indicados en la Tabla 1 podrían dividirse en cuatro grupos: (1) AC144, AD5-13A11 y ADB-4B8; (2) AD5-17F6; (3) AD5-5E8 y AD5-14H12; y (4) AD5-8E7.
Los mAb del primer grupo, AC144, AD5-13A11 y ADB-4B8, tiñen aproximadamente 0,41 \pm 0,17% (n = 10) de todas las PBMC (Figura 1A). En un trazado de puntos de las señales de dispersión delantera y lateral, estas células raras constituyen una población de células homogéneas que está localizada entre linfocitos pequeños en reposo y monocitos (Figura 1B). Por consiguiente, estas células raras no expresan el receptor de células T \alpha\beta (TCR\alpha\beta). CD14, CD19 y CD56 (Figura 1A), marcadores de linaje que son expresados en las células T, monocitos, células B y células NK, respectivamente. La tinción de DC sanguíneas altamente purificadas (>95% de HLA-DR^{+}, TCR\alpha\beta^{-}, CD14^{-}, CD19^{-} y CD56^{-}) revela que los mAb del primer grupo son reactivos con DC sanguíneas CD11c^{-}CD123^{bright} (Figura 2) pero no son reactivos con DC sanguíneas CD11c. Para analizar si todas ellas reaccionan con un único antígeno, efectuamos tinciones de dos colores y estudios de inhibición cruzada. Los resultados demuestran que todos los mAb de este grupo reconocen un único epítopo del mismo antígeno. Este antígeno fue denominado BDCA-2.
Tal como indica la Figura 3, el mAb del segundo grupo, AD5-17F6, reconoce las mismas células entre las PBMC, como el AC144, uno de los mAb específicos de BDCA-2 del primer grupo. No obstante, el AD5-17F6 tiñe un antígeno que es diferente de BDCA-2. Esto fue demostrado inequívocamente mediante los experimentos de cointernalización, donde AD5-17F6 mostró tinción de superficie con igual intensidad antes y después de la internalización de BDCA-2 mediada con mAb anti-BDCA-2, y por la tinción de DC después de cultivo, donde mAb AC144 y mAb AD5-17F6 mostraron patrones de tinción completamente diferentes (Figura 4). El antígeno reconocido por AD5-17F6 fue denominado BDCA-4 y es idéntico a neuropilina-1. He y col. (1997).
Los mAb del tercer grupo, AD5-5E8 y AD5-14H12, tiñen aproximadamente 0,04 \pm 0,01% (n = 10) de todas las PBMC (Figura 1A). De acuerdo con las señales de dispersión (Figura 1B) y la contratinción con mAb frente a TCR\alpha\beta, CD14, CD19 y CD56 (Figura 1A), estas células son distintas de los linfocitos y monocitos y ligeramente más grandes que las células reconocidas por los anticuerpos del primer grupo. Por consiguiente, la tinción de DC sanguínea demuestra que un subconjunto diferente es reconocido por AD5-5E8 y AD5-14H12, a saber DC sanguíneas CD11c^{dim}CD123^{-} (Figura 2). De acuerdo con las tinciones de dos colores, los estudios de bloqueo cruzado y los experimentos de coaglutinación, los dos mAb parecen reconocer dos epitopos espacialmente no relacionados del mismo antígeno. Llamamos a este antígeno BDCA-3.
El cuarto grupo, mAb AD5-8E7, reacciona con hasta 2,39 \pm 0,96% (n = 10) de PBMC no fraccionado (Figura 1A). El análisis de dispersión de luz (Figura 1B) y la contratinción de los marcadores de linaje TCR\alpha\beta, CD14 y CD19 revelan que el mAb no es reactivo a las células T y monocitos, pero es reactivo a un subconjunto principal de células B CD19^{+} pequeñas en reposo. La tinción de DC purificadas muestra que AD5-8E7, además de las células B, tiñe un tercer subgrupo de DC sanguíneas distinto de los subgrupos reconocidos por los mAb del primer y segundo grupo, es decir, DC sanguíneas CD11c^{bright}CD123^{dim}. Una proporción importante de las DC sanguíneas CD11c^{bright}CD123^{dim} expresa CD56 (ver más abajo). Por esta razón, algunos PBMC reactivos a AD5-8E7 tiñen CD56 (Figura 1A). AD5-8E7 no es reactivo a las células NK purificadas. El antígeno reconocido por AD5-8E7 fue inicialmente denominado BDCA-1 ya que parecía ser un antígeno nuevo. Sin embargo, posteriormente se supo que AD5-8E7 bloquea completamente la unión de mAb CD1c M241 a células MOLT (Figura 6). De este modo, el antígeno reconocido por AD5-8E7 es CD1c.
Ningunos de los mAb indicados en la Tabla 1 es reactivo a granulocitos, plaquetas, eritrocitos, basófilos purificados y células progenitoras hematopoyéticas CD34^{+} purificadas.
Ejemplo 6 Expresión de BDCA-2, BDCA-3 y BDCA-4 en DC DC-Mo sanguíneas cultivadas y DC CD34
Las DC sanguíneas CD11c^{-} plamacitoides recién aisladas dependen de IL-3 para su supervivencia y maduración, mientras que la supervivencia y maduración de las DC sanguíneas CD11c^{+} es mucho menos dependiente de citoquina. La expresión de BDCA-2, BDCA-3 y BDCA-4 en DC sanguíneas CD11c^{-} y CD11^{+} fue analizada después de 0, 1, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 36 y 48 horas de cultivo de DC sanguíneas totales en presencia de rIL-3. Los resultados se muestran en la Figura 4. La expresión de BDCA-2 está completamente infrarregulada en el espacio de 48 horas en las DC sanguíneas CD11c^{-}. En comparación, BDCA-4 está sobrerregulada incluso más en las DC sanguíneas CD11c^{-} y, a diferencia de BDCA-2, se expresa también a un nivel alto en la mayoría, si no todas, DC CD11c^{+}. La expresión de BDCA-3 es rápidamente inducida en DC sanguíneas CD11c^{-}, alcanzando el nivel de expresión más alto después de 24 horas. Después de eso, la expresión de BDCA-3 parece ser infrarregulada de nuevo. Es complicado analizar la expresión de BDCA-3 en DC sanguíneas CD11c^{+} por el hecho que los subconjuntos BDCA-3^{-}CD11c^{bright} y BDCA-3^{+}CD11c^{dim} están presentes al inicio del cultivo. La expresión de BDCA-3 permanece invariable al menos hasta 6 horas de cultivo en la población de las DC sanguíneas de BDCA-3^{+}CD11c^{dim}, y es inducida en el espacio de 3 horas en al menos algunas células del subconjunto de las DC sanguíneas de BDCA-3^{-}CD11c^{bright}.
Expresión de BDCA-2, BDCA-3 y BDCA-4 en DC-Mo y DC CD34^{-}
Las DC CD1a^{+} funcionales se generaron ex vivo a partir de monocitos y de células progenitoras hematopoyéticas CD34^{+}. Bender y col. (1996); Pick y col. (1996); Romani y col. (1994); Sallusto y col. (1994), Caux y col. (1992); Mackensen y col. (1995); Szabolcs y col. (1995); Herbst y col. (1996); de Wynter y col. (1998); y Strunk y col. (1996). La Figura 7 muestra que las DC-Mo, las cuales fueron generadas por cultivo de monocitos durante 7 días en presencia de rGM-CSF e IL-4 y CD34-DC, generadas por cultivo de células progenitoras hematopoyéticas CD34^{+} durante 11 días en presencia de ligando rFlt3, rTGF-\beta1, rTNF-\alpha, rSCF y rGM-CSF, expresan CD1a, CD1c y BDCA-4, pero ni BDCA-2 ni BDCA-3.
Ejemplo 7 Internalización de BDC-2 sobre la reticulación mediada por mAb anti-BDCA-2
Se abordó la posibilidad que la incubación a 37ºC de las células BDCA-2^{+} marcadas con mAb anti-BDCA-2 resulte en la internalización de mAb mediante tinción de PBMC con mAb AC144 conjugado con FITC (IgG1). A continuación, tras incubación a 37ºC, se detectó el mAb asociado a la superficie celular remanente mediante tinción con mAb IgG1 anti-ratón de rata conjugado con PE. Tal como se muestra en la Figura 8, cuando las células se incubaron a 37ºC, la intensidad de la tinción de PE-IgG1 anti-ratón de rata descendió con extrema rapidez a los niveles basales. Por el contrario, la intensidad de la tinción de AC144-FITC desciende solo temporalmente a un nivel de aproximadamente 50%, pero después casi vuelve al nivel de preincubación. Esto demuestra que el BDCA-2 se internaliza una vez tiene lugar la reticulación de mAb anti-BDCA-2, con una cinética similar a la endocitosis mediada por receptor. El descenso transitorio en la intensidad de la tinción de AC144-FITC es probablemente debido al parcheamiento y aglutinación del complejo de mAb BDCA-2/anti-BDCA-2 antes de la endocitosis.
Ejemplo 8 Morfología de DC sanguíneas CD1c^{+}, BDCA-2^{+} y BDCA-3^{+}
Las células CD1c^{+}, BDCA-2^{+} y BDCA-3^{+} fueron aisladas de PBMC por marcaje magnético indirecto con mAb primario conjugado a PE y microesferas conjugadas a mAb anti-PE y enriquecimiento de las células marcadas por MACS (Figura 9). A la tinción de May Grunwald/Giemsa de los portaobjetos de la citocentrífuga (Figura 9), las células que expresan BDCA-2 recién aisladas exhiben la típica morfología linfoplasmacitoide de DC CD11c^{-}CD4^{+}lin^{-} procedentes de sangre y amígdalas: es decir, células redondas de tamaño mediano con núcleos ovales o dentados. Por el contrario, tanto las DC sanguíneas CD1c^{+} recién aisladas como las DC sanguíneas BDCA-3^{+} recién aisladas exhiben las características morfológicas típicas de las DC CD11c^{+}CD4^{+}lin^{-} procedentes de sangre o amígdalas: es decir, células menos redondas con procesos celulares cortos y núcleos más hiperlobulados. Además de CD1c^{+} BDC, se pueden ver las células B CD1c^{+} con la morfología típica de linfocitos pequeños en reposo en los portaobjetos de la citocentrífuga de PBMC CD1c^{+} aisladas. CD1c^{+} BDC altamente puras se obtienen si, antes del enriquecimiento de las células CD1c^{+}, se depletan magnéticamente las células B CD19^{+} de PBMC.
Ejemplo 9 Fenotipo de superficie de las DC sanguíneas CD1c^{+} BDCA-2^{+} y BDCA-3^{+}
El fenotipo de DC sanguíneas BDCA-2^{+} y BDCA-3^{+} fue analizado por inmunofluorescencia de dos colores con mAb conjugado con FITC y PE. Para el análisis de DC sanguíneas CD1c^{+} , se efectuaron tinciones de tres colores utilizando CD19-Cy5 para la exclusión de células B. Los resultados del análisis fenotípico se muestran en la Tabla 2 y se pueden resumir como sigue: ninguno de los subconjuntos de DC sanguíneas expresan CD1a, CD8, CD15, CD16, CD19, CD20, CD23, CD25, CD27, CD34, CD61, CD69, CD7.1, CD77, CD80, CD83, glicoforina A (GPA), TCR\alpha\beta, AC133, IgD, IgM y el antígeno CMRF-56. Todos los subconjuntos de DC expresan CD43, CD44, CD54 y moléculas MHC de clase I a un nivel similar. Las DC BDCA-2^{+} difieren de los otros dos subconjuntos en que no expresan CD13, CD40, CD45RO, CD56, excepto CD45RA y pequeñas cantidades de CD10, y en que expresan niveles más bajos de CD18, CD38, CD58, CD98, CD116 y CLA, pero niveles más altos de CD4. Las DC sanguíneas CD1c^{+} difieren de los otros dos subconjuntos en que expresan CD2, niveles más altos de las moléculas MHC de clase II, pero niveles más bajos de CD62L, y en que expresan los receptores Fc CD32, CD64 y Fc_{\varepsilon}R1. Probablemente debido a la expresión del receptor Fc, las DC sanguíneas CD1c^{+} son también positivas para IgG, kappa y lambda. Además, algunas DC CD1c^{+} son positivas para CD14 y CD11b, donde el nivel de expresión se correlaciona inversamente con el nivel de la expresión de CD1c como de CD2. Las DC sanguíneas BDCA-3^{+} difieren de los dos subconjuntos en que expresan CD36 a un nivel más bajo y en que parecen expresar niveles bajos de CD5. Finalmente, aparte de CD11c y CD123, al menos un antígeno adicional, CD33, es útil para la discriminación de los tres subconjuntos: CD33 se expresa a niveles bajos en DC BDCA-2^{+}, a niveles intermedios en DC BDCA-3^{+} y a niveles altos en DC CD1c^{+}.
TABLA 2
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TABLA 2 (continuación)
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TABLA 2 (continuación)
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Ejemplo 10 Expresión de moléculas MHC de clase II, CD83 y co-estimuladoras en DC sanguíneas CD1c^{+}, BDCA-2^{+}, y BDCA-3^{+} después del cultivo
Las DC sanguíneas CD1c^{+} y DC sanguíneas BDCA-3^{+} recién aisladas se cultivaron durante 1 día en un medio sin ninguna citoquina suplementada y las DC sanguíneas BDCA-2^{+} recién aisladas se cultivaron durante 2 días en medio suplementado con IL-3 y mAb CD40 en fibroblastos transfectados de CD32. Después del periodo de cultivo, las células se analizaron por la expresión de CD1a, CD80, CD83, CD86 y HLA-DR. A efectos comparativos, se incluyeron también las llamadas DC-Mo "inmaduras", generadas por cultivo de monocitos durante 7 días en presencia de GM-CSF y IL-4, y las llamadas DC-Mo "maduras", generadas por cultivo de DC-Mo "inmaduras" durante 3 días en presencia de TNF-\alpha. Sallutsto y col. (1995) J. Exp. Med. 182:389-400; y Sallusto y col. (1998) J. Immunol. 28:2760-2769. Tal como muestra la Figura 10, al contrario de las DC-Mo "inmaduras" y DC-Mo "maduras", ninguno de los subconjuntos de DC sanguíneas expresa CD1a después del periodo de cultivo. Sin embargo, las moléculas estimuladoras CD80 y CD86, antígeno CD83 de activación de DC (Zhou y col. (1995); Zhou y col. (1992) J. Immunol. 149:735-742; y Zhou y col. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2588-2592), y moléculas HLA-DR se sobrerregulan bajo cultivo en todos los tres subconjuntos de DC sanguíneas a un nivel similar comparado a las DC-Mo maduras. Los resultados no fueron significativamente diferentes en otro experimento, en el cual los tres subconjuntos de DC sanguíneas fueron cultivados durante 2 días en un medio suplementado con IL-3, IL-4 y GM-CSF. Tal como se ha mostrado anteriormente para DC CD11c^{-}CD4^{+}lin^{-} procedentes de sangre y amígdalas, las DC sanguíneas BDCA-2^{+} mueren rápidamente cuando se cultivaron en medio sin IL-3.
Ejemplo 11 Capacidad endocítica de las DC sanguíneas CD1c^{+}, BDCA-2^{+}, y BDCA-3^{+} recién aisladas
La capacidad endocítica de las DC sanguíneas CD1c^{+}, BDCA-2^{+} y BDCA-3^{+} purificadas y, como control, de células T CD3^{+} se examinó cultivando las células a 37ºC en presencia de LY y analizando la captación de LY después de varios periodos de tiempo por citometría de flujo. Tal como muestra la Figura 11, a diferencia de las células T CD3^{+} purificadas, las DC sanguíneas CD1c^{+} purificadas, DC sanguíneas BDCA-3^{+}, y también hasta cierto punto DC sanguíneas BDCA-2^{+} poseen la capacidad de endocitosis a LY. Se obtuvieron resultados similares utilizando FITC-Dextrano. Las capacidades endocíticas de todas las poblaciones de DC son mucho más bajas si se comparan con DC-Mo.
La secuencia de aminoácidos de BDCA-4 fue obtenida purificando el antígeno con mAb ADS-17F6 (columna de afinidad de AD5-17F6) y analizando el antígeno purificado mediante espectrometría de masas MALDI TOF. El BDCA-4 es idéntico a neuropilina-1. He y col. (1997).
Ejemplo 12 La ligación de BDCA-2 con anticuerpo monoclonal anti-BDCA-2 (AC144) induce la movilización de Ca^{2+} intracelular, mientras que la ligación de BDCA-4 (neurofilina-1) con anti-BDCA-4 no induce inmovilización de Ca^{2+} Materiales y Métodos
La determinación de calcio citosólico en células U937 transfectadas o no transfectadas con BDCA-2^{+}, BDCA-4^{+}, BDC y BDCA-2. Las DC sanguíneas BDCA-2^{+}BDCA-4^{+} y células U937 transfectadas o no transfectadas con BDCA-2 se cargaron con Indo-1 AM (Sigma, St. Louis, MO) tal como ha sido descrito por Valitutti y col. (1993) Eur. J. Immunol. 23:790-795. Los mAb anti-BDCA-2 (AC144, IgG1) o anti-BDCA-4 (ADS-17F6, IgG1) fueron añadidos a células U937 transfectadas o no transfectadas de BDCA-2^{+}, BDCA-4^{+}, BDC y BDCA-2, respectivamente, seguidas o no por mAb IgG1 anti-ratón de rata (X56) como reticulador. Las células fueron analizadas en un citofluorímetro de flujo para detectar los flujos de Ca^{2+}. Solamente se incluyeron en el análisis células vivas (en base a los criterios de dispersión) y células marcadas con Indo-1 (en base a los espectros de emisión de 405 nm frente 525 nm).
La Figura 13 muestra que la movilización intracelular es inducida en las células U937 transfectadas con BDCA-2^{+} BDCA-4^{+} BDC (A, B) y BDCA-2 (D) purificadas inmunomagnéticamente, pero no en células U937 no transfectadas (E) por mAb anti-BDCA-2 solo (A) y o anti-BDCA-2 más mAb secundario reticulado (B, D, E).
La ligación de BDCA-4 en BDCA-2^{+}BDCA-4^{+} BDC purificadas inmunomagnéticamente con mAb anti-BDCA-4 y mAb secundario reticulado no induce movilización de Ca^{2+} citosólico. Queda demostrado por la relación 405nm/525nm dependiente de Ca^{2+} de la fluorescencia de Indo-1 (eje Y) frente al tiempo (eje X, un valor de 1024 corresponde a 204,80 segundos).
Tal como muestra la Figura 13, la ligación de BDCA-2 de superficie sobre BDC plasmacitoide (Figura 13A y B) y células U937 transfectadas con BDCA-2 (Figura 13D) con un mAb específico (AC144, IgG1) seguido (Figura 13B y D) o no seguido (Figura 13A) de un mAb secundario reticulado (IgG1 anti-ratón de rata, X56) provocaba una subida rápida y transitoria en la concentración de calcio citosólico. Por el contrario, la incubación de las DC plasmacitoides con mAb anti-BDCA-4 (AD5-17F6) seguido de un mAb secundario reticulado (IgG1 anti-ratón de rata, X56) (Figura 14C), o de células U937 no transfectadas con mAb anti-BDCA-2 (AC144, IgG1) seguido de un mAb secundario reticulado (IgG1 anti-ratón de rata, X56) (Figura 13E) no inducía una subida rápida y transitoria en la concentración de calcio citosólico.
Ejemplo 13 La producción de interferón tipo I por BDCA-2^{+}BDCA-4^{+}-BDCen respuesta a estimulación vírica (cepa del virus de la gripe PR8) se inhibe por desencadenamiento de BDCA-2 con mAb anti-BDCA-2
Las DC plasmacitoides CD4^{+}CD123^{bright}CD11c^{-} demostraron ser las principales productoras de interferón tipo I en respuesta a los virus, bacterias, y células tumorales implicados. Fitgerald-Bocarsly y col. (1993) Pharmacol Ther. 60:39-62; Siegal y col. (1999) Science 284:1835-1837; Cella y col. (1999) Nature Med. 5:919-923. Por esta razón, también han sido llamadas células productoras naturales de interferón tipo I (NIPC). Las DC plasmacitoides expresan BDCA-2 y BDCA-4. Tal como muestra la Figura 14, la ligación de BDCA-2 de superficie sobre DC plasmacitoides con un mAb específico seguido de un mAb secundario reticulado (IgG1 anti-ratón de rata, X56), inhibe la secreción del interferón tipo I por medio de las DC plasmacitoides BDCA-2^{+}BDCA-4^{+} purificadas inmunomagnéticamente procedentes de sangre o amígdalas en respuesta a la estimulación con la cepa del virus de la gripe PR8 (5 HAU/ml). El nivel de la producción de interferón de tipo I en cultivos con anti-BDCA-2, virus de la gripe y mAb reticulado (Figura 14, AC144+RamG1+FLU) es mucho más bajo que en cultivos de virus de la gripe solo (Figura 14, FLU), o con un mAb de isotipo control (mAb anticitoqueratina CK3-11D5, IgG1), virus de la gripe y mAb reticulado (Figura 14, CK3+RamG1+FLU).
De forma inversa, la ligación de BDCA-4 de superficie sobre DC plasmacitoides con un mAb específico seguido de un mAb secundario reticulado (IgG1 anti-ratón de rata, X56), no inhibe la secreción de interferón tipo I por las DC plasmacitoides BDCA-2^{+}BDCA-4^{+} purificadas inmunomagnéticamente procedentes de sangre o amígdalas en respuesta a la estimulación con la cepa de virus de la gripe PR8 (5 HAU/ml). El nivel de producción de interferón de tipo I en cultivos con anti-BDCA-4, virus de la gripo y mAb reticulado (Figura 14, 17F6+RamG1+FLU) es el mismo que en cultivos con un mAb de isotipo control (mAb anticitoqueratina CK3-11D5, IgG1), virus de la gripe y mAb reticulado (Figura 14, CK3+RamG1+FLU).
Materiales y Métodos
Las DC plasmacitoides que expresan BDCA-2 y BDCA-4 fueron aisladas de PBMC (Figura 14A) o células tonsilares (Figura 14B) por marcaje magnético directo con microesferas conjugadas a anti-BDCA-4(AD5-17F6) y enriquecimiento de las células marcadas por MACS. Las DC plasmacitoides aisladas que expresan BDCA-2 y BDCA-4 fueron cultivadas durante 24 horas en medio en presencia de: a) IL-3 solo (Figura 14, Control); b) IL-3, mAb anti-BDCA-2 (AC144, IgG1) y mAb IgG1 anti-ratón de rata(Figura 14, AC144+RamG1); c) IL-3, mAb anti-BDCA-2 (AC144, IgG1), mAb IgG1 anti-ratón de rata y cepa del virus de la gripe PR( (Figura 14, AC144+RamG1+FLU); d) IL-3 y cepa del virus de la gripe PR8 (Figura 14, FLU);; e) IL-3, mAb anticitoqueratina (CK3-11D5, IgG1), mAb IgG1 anti-ratón de rata, y cepa del virus de la gripe PR8 (Figura 14, CK3+RamG1+FLU); y f) IL-3, mAb anti-BDCA-4 (AD5-17F6), mAb IgG1 anti-ratón de rata, y cepa del virus de la gripe PR8 (Figura 14, 17F6+RamG1+FLU).
Se determinó el interferón tipo I secretado en los sobrenadantes de cultivo evaluando la inhibición de la proliferación de las células Daudi (Nederman y col. (1990) Biologicals 18:29-34) con referencia a una curva de IFN-\alpha estándar.
En cuanto a la inhibición de la producción de interferón tipo I por las DC plasmacitoides BDCA-2^{+}BDCA-4^{+}, niveles elevados de interferón tipo I circulante y del factor inductor de interferón tipo I (en cierto modo parecido a un complejo de anticuerpo anti-DNA y DNA) se encuentran en pacientes con SLE y se correlacionan con la actividad de la enfermedad., Además, los pacientes con trastornos no autoinmunes tratados con interferón tipo I desarrollan frecuentemente autoanticuerpos y ocasionalmente SLE. Varios artículos de Ronnblom y col. ((1999) Clin. Exp. Immunol. 115:196-202; (1999) J. Immunol. 163:6306-6313; y (2000) J. Immunol. 165:3519-3526) muestran que los factores inductores de interferón tipo I procedentes de pacientes inducen secreción de interferón tipo en las PBMC de donantes sanos y activan selectivamente las células naturales productoras de interferón tipo I (NIPC= DC plasmacitoides).
Los hallazgos aquí presentados de que la ligación de BDCA-2 suprime la producción de interferón tipo I inducida por estimulación vírica muestran que se puede aplicar la unión a BDCA-2 para tratar la enfermedad no sólo por ligación de BDCA-2 sino también por depleción de NIPC (=DC plasmacitoides BDCA-2+ BDCA-4+). La invención abarca así además la depleción de NIPC in vivo, in vitro y ex vivo. Tal depleción es adecuada para su uso en el tratamiento o profilaxis de enfermedades autoinmunes.
La Figura 14 muestra que la ligación de BDCA-2 pero no de BDCA-4 con un mAb específico seguido de un mAb secundario reticulado inhibe la secreción de interferón tipo I mediante las DC plasmacitoides BDCA-2^{+}BDCA-4^{+} procedentes de sangre y amígdalas en respuesta a la estimulación con la cepa del virus de la gripe PR8. Las DC plasmacitoides BDCA-2^{+}BDCA-4^{+} de sangre (A) o amígdalas (B) fueron cultivadas durante 24 horas en presencia de IL-3 solo (control); IL-3, mAb anti-BDCA-2 y mAb IgG1 anti-ratón de rata (AC144+RamG1); IL-3, mAb anti-BDCA-2, mAb IgG1 ant-ratón de rata, y cepa del virus de la gripe PR8 (AC144+RamG1+FLU); IL-3 y cepa del virus de la gripe PR8 (FLU); IL-3, mAb anti-citoqueratina, mAb IgG1 anti-ratón de rata, y cepa del virus de la gripe PR8 (CK3+RamG1+FLU); IL-3, mAb IgG1 anti-BDCA-4, mAb anti-ratón de rata, y cepa del virus de la gripe PR8 (17F6+RamG1+FLU). El interferón tipo I secretado (U/ml) en los sobrenadantes de cultivo fue determinado mediante un bioensayo con referencia a una curva de interferón tipo I estándar.
Ejemplo 14 BDCA-2 no sólo es capaz de producir endocitosis a un ligando, sino también de liberarlo en un compartimento de carga y procesamiento de antígenos, y presentarlo a las células T restrictivas de CD^{4+} clase II Materiales y Métodos
Las DC plasmacitoides que expresan BDCA-2 y BDCA-4 fueron aisladas de PBMC por marcaje magnético directo con microesferas conjugadas a anti-BDCA-4 (ADS-17F6) y enriquecimiento de las células marcadas por MACS. Las DC plasmacitoides que expresan BDCA-2 y BDCA-4 aisladas fueron cocultivadas con 4x10^{4} células/pocillo del clon de célula T B13 (Lanzavecchia y col. (1988) J. Exp. Med. 167:345-352) en microplatas con fondo plano de 96 pocillos en presencia de mAbs IgG1 (0,2 \mug/ml). Los mAbs utilizados en el ensayo fueron los siguientes: AC144 (anti-BDCA-2, IgG1), ZM3.8 (anti-ILT3, IgG1) y CK3-11D5 (anti-citoqueratina, IgG1). Después de 48 horas, los cultivos fueron pulsados con (^{3}H)timidina (1 \muCi/pocillo), y la radioactividad incorporada fue determinada después de 16 horas adicionales. Se efectuó el trazado de la captación de (^{3}H)timidina (cpm) frente al número de DC plasmacitoides aisladas que expresan BDCA-2 y BDCA-4 en los cultivos (Figura 15).
La Figura 15 muestra la presentación de mAb anti-BDCA-2 (AC144, IgG1) a un clon de células T específico para IgG1 de ratón mediante las DC plasmacitoides aisladas que expresan BDCA-2 y BDCA-4. Las DC plasmacitoides BDCA-2^{+}BDCA-4^{+} presentan el mAb anti-BDCA-2 (AC144, IgG1, \blacksquare) a las células T mucho más eficientemente que el mAb anti-IL-3 (ZM3.8, IgG1, \ding{115}) y el mAb anti-citoqueratina (CK3-11D5, IgG1, \bullet).
La incubación de las DC plasmacitoides BDCA-2^{+}BDCA-4^{+} marcadas con mAb anti-BDCA-2 (AC144, IgG1) a 37ºC da como resultado una internalización extremadamente rápida de los complejos mAb anti-BDCA-2/BDCA-2 sobre la superficie celular (ver Figura 8). Aquí se demuestra que el mAb anti-BDCA-2 (AC14, IgG1) tiene acceso a un compartimento de carga y procesamiento de antígenos, y los péptidos procedentes del anticuerpo son eficientemente presentados a un clon de células T restrictiva de CD4^{+} de clase II (B13) específico de un epítopo péptico de IgG1 de ratón. La presentación del mAb anti-BDCA-2 se comparó con la de un mAb IgG1 que se une a un receptor (ILT-3) conocido por ser capaz de dirigir su(s) ligando(s) en los compartimentos de procesamiento y de carga de péptidos, y a la de un mAb IgG1 que no se une a una molécula de superficie celular en las DC plasmacitoides BDCA-2^{+}BDCA-4^{+} (mAb anti-citoqueratina CK3-11D5, IgG1), pero pueden ser recogidos en la fase de fluido. Tal como se muestra en la Figura 15, las DC plasmacitoides BDCA-2^{+}BDCA-4^{+} presentaron mAb anti-BDCA-2 (AC144) a las células T mucho más eficientemente que el mAb anti-ILT-3 y el mAb anti-citoqueratina.
Ejemplo 15 En las células tonsilares, la expresión de BDCA-2 se restringe a las DC plasmacitoides asociadas a la zona de las células T CD123^{+}, mientras que BDCA-4 puede también expresarse a bajos niveles en unas pocas de las otras células
La Figura 16 muestra la expresión de BDCA-2 y BDCA-4 en DC CD123^{+} plasmacitoides amigdalinas. Se muestran las tinciones de dos colores de las células tonsilares con un mAb conjugado a FITC frente a BDCA-2 (AC144) y un mAb conjugado a PE frente a CD123 y BDCA-4 (AD5-17F6), respectivamente. Obsérvese que la expresión de BDCA-2 se restringe a DC plasmacitoide CD123^{bright}, mientras que BDCA-4 se expresa también a niveles bajos en otras pocas células.
Ejemplo 16 mAb BDCA-4 (AD5-17F6) reconoce la neuropilina-1
La neuropilina-1 es un receptor de la familia colapsina/semaforina que media la guía celular neuronal. La neuropilina-1 es expresada también por las células endoteliales y tumorales como un receptor específico de isoforma del factor de crecimiento endotelial vascular. Sin embargo, no se sabía antes que la neuropilina-1 se expresa sobre las DC plasmacitoides en sangre y amígdalas y que representa un marcador excelente para las DC plasmacitoides al menos en sangre no cultivada reciente.
Material y Métodos
La neuropilina-1 fue inmunoprecipitada de lisados celulares de células PAE no transfectadas (P) y células PEA transfectadas con neuropilina-1 (NP) (Soker y col. (1998) Cell 92:735-745) utilizando el mAb anti-BDCA-4 AD5-17F6 (anti-NRP-1 (ML)). Las proteínas precipitadas se analizaron por medio del análisis SPD-PAGE y Western blotting con el mAb específico de BDCA-4 AD5-17F6 (ML) o un mAb específico de neuropilina-1 procedente de Shay Soker, Children's Hospital, Boston, MA (S).
La Figura 17 muestra que la neuropilina-1 fue inmunoprecipitada de lisatos celulares de células PEA transfectadas con neuropilina-1 (NP) pero no células PAE no transfectadas (P) con el mAb anti-BDCA-4 AD5-17F6 (anti-NRP-1 (ML)). Las proteínas precipitadas se analizaron por medio de las pruebas SPD-PAGE y Western blotting con el mAb AD5-17F6 (ML) específico de BDCA-4 o un mAb específico de neuropilina-1 procedente de Shay Soker, Children's Hospital, Boston, MA (S).
Obsérvese que el mAb AD5-17F6 específico de BDCA-4 inmunoprecipita una banda específica de aproximadamente 130-140 kDa de las células PEA transfectadas con neuropilina-1 (NP), pero no de las células PAE no transfectadas (P). Se puede detectar la banda con el mAb específico de neuropilina-1 procedente Shay Soker (S) pero no con el mAb anti-BDCA-4 AD5-17F6 (ML). De este modo, nuestro mAb AD5-17F6 anti-BDCA-4 reconoce la forma nativa de la neuropilina-1 en los experimentos de inmunoprecipitación estándar, pero no logra detectar la forma desnaturalizada de la neuropilina-1 cuando se utiliza en los análisis por SDS-PAGE/Western blotting.
Es interesante el hecho que la neuropilina-1 es también expresada por las células endoteliales y tumorales como un receptor específico de isoforma del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Más interesante es que varios artículos (Gabrilovich y col. (1996) Nature Med. 2:1267; Nature Med. 2:1096-103; Gabrilovich y col. (1999) Clin. Cancer Res. 5:2963-70; Ohm y col. (1999) J. Immunol. 163:3260-8; Oyama y col. (1998) J. Immunol. 160:1224-32: Gabrilovich y col. (1998) Blood 92; 4150-66; Ishida y col. (1998) J. Immunol. 161:4842-51) han demostrado que el VEGF producido por un porcentaje importante de tumores disminuye la generación y función de las DC in vivo. No queda claro si estos efectos sobre las DCs son mediados por la neuropilina-1 (BDCA-4), en todo caso la invención abarca la modulación funcional mediada por neuropilina-1 de las DCs.
Ejemplo 17 La producción de interferón tipo I (IFN-\alpha) por BDCA-2^{+} BDCA-4^{+}- BDCpurificadas en respuesta a la estimulación con poli I:C se inhibe por desencadenamiento de BDCA-2 con mAb anti-BDCA-2
Las DC plasmacitoides CD4^{+}CD123^{bright}CD11c^{-} demostraron ser las principales productoras de interferón tipo I en respuesta a los virus, bacterias, y células tumorales implicados. Fitgerald-Bocarsly y col. (1993) Pharmacol Ther. 60:39-62; Siegal y col. (1999) Science 284:1835-1837; Cella y col. (1999) Nature Med. 5:919-923. Por esta razón, también han sido llamadas células naturales productoras de interferón tipo I (NIPC). Las DC plasmacitoides expresan BDCA-2 y BDCA-4. Tal como muestra la Figura 19, la ligación de BDCA-2 de superficie sobre DC plasmacitoides con un mAb específico seguido de un mAb secundario reticulado (IgG1 anti-ratón de cabra), inhibe la secreción de IFN-\alpha por medio de DC plasmacitoides BDCA-2^{+}BDCA-4^{+} purificadas inmunomagnéticamente procedentes de sangre o amígdalas en respuesta a la estimulación con poli I:C. El nivel de producción de IFN-\alpha en cultivos con BDCA-2, poli I:C y mAb de reticulación (Figura 18, AC144 + IgG anti-ratón de Cabra + Poli I:C) es más bajo como en los cultivos con IgG1 de ratón, poli I:C y mAb reticulado (Figura 18, IgG1 de Ratón + IgG anti-ratón de Cabra + Poli I:C).
Materiales y Métodos
Las DC plasmacitoides CD11^{-}CD123^{bright} fueron separadas de las células mononucleares de sangre periférica humana utilizando microesferas de BDCA-4. Se incubaron las DC plasmacitoides CD11^{-}CD123^{bright} (1x10^{6} células/ml) con 10 \mug/ml de mAb AC144 o mAb IgG1 de ratón (CF6B, anti-TPO) en RPMI, 10% de FCS, 10mM de HEPES, 50 \muM de 2-ME, 20 \mug/ml de gentamicina a 37ºC durante 30 minutos. Se añadieron 20 \mug/ml de IgG anti-ratón de cabra (Chemicon International) y las células se volvieron a incubar a 37ºC durante 30 minutos. Estas células se cultivaron con o sin 20 \mug/ml de poli I:C (Sigma) a 37ºC durante 24 horas. Los sobrenadantes de cultivo fueron cosechados y se determinaron las concentraciones de IFN-\alpha por ELISA (Endogen). La sensibilidad del ensayo es 3 pg/ml.
La Figura 18 muestra que la ligación de BDCA-2 pero no de BDCA-4 con un mAb específico seguido de un mAb secundario de reticulación inhibe la secreción de IFN-\alpha por las DC plasmacitoides BDCA-2^{+}BDCA-4^{+} procedentes de sangre y amígdalas en repuesta a la estimulación con poli I:C. Las DC plasmacitoides BDCA-2^{+}BDCA-4^{+} procedentes de sangre se cultivaron con 10 \mug/ml de mAb AC144 (2 y 4) o mAb IgG1 de ratón (CF6B, anti-TPO, 1 y 3) a 37ºC durante 30 minutos. Se añadieron 20 \mug/ml de IgG anti-ratón de cabra y las células se volvieron a incubar a 37ºC durante 30 minutos. Estas células se cultivaron con (3 y 4) o sin (1 y 2) 20 \mug de poli I:C a 37ºC durante 24 horas. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo y se determinaron las concentraciones de IFN-\alpha por ELISA.
Ejemplo 18 Análisis de la expresión mRNA de BDCA-2 por RT-PCR en varios tejidos y poblaciones de células sanguíneas purificadas Secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos
El cDNA que codifica BDCA-2 se obtuvo por clonación de expresión que clona en las células COS. La Figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos de BDCA-2 (la isoforma con todos los seis exones expresados). El BDCA-2 es una nueva proteína de membrana tipo II de lectina tipo C. Dichas lectinas se describen, por ejemplo, en Bates y col. (1999) J. Immunol. 163:1973-1983. La comparación de BDCA-2 con lectinas tipo C conocidas se indica en el Ejemplo 20.
La Figura 19 muestra un análisis de paneles de cDNA de múltiples tejidos humanos procedentes de Clonetech (banda 1: corazón; banda 2: cerebro; banda 3: placenta; banda 4: pulmón; banda 5: hígado; banda 6: músculo esquelético; banda 7: riñón; banda 8: páncreas; banda 9: bazo; banda 10: timo; banda 11: testículos; banda 12: ovario; banda 13: intestino delgado; banda 14: ganglio linfático; banda 15: médula espinal; banda 16: hígado fetal; banda 17: amígdala) y un análisis de cDNA preparado a partir de diferentes poblaciones de leucocitos en sangre (banda 18: células T; banda 19: células B; banda 20: células NK; banda 21: monocitos ; banda 22: DC CD11c^{bright}CD123^{low}; banda 23: BDC CD11c-CD123^{bright} plasmacitoide) para la presencia del cDNA de BDCA-2.
Todos los cDNAs se normalizaron al nivel de expresión de mRNA de varios genes diferentes de la casa (gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, fosfolipasa A2, \alpha-tubilina, y \beta-actina). La normalización garantiza una valoración precisa de la especificidad de los tejidos y abundancia relativa de los mRNAs diana. La misma cantidad de cDNA (aproximadamente 50pg) se utilizó para cada reacción de RT-PCR. Las reacciones de RT-PCR se efectuaron con cebadores específicos de BDCA-2 (de delante: 5'-TTGAAAGAACCACACCCCGAAAGT (SEC ID NO:) y de atrás 5'-TAGCTTTCTACAACGGTGGATGCC (SEC ID NO:)) y los cebadores para los cuatro genes de la casa (CLONTECH) mencionados anteriormente utilizando AdvanTaqPlusDNA Polimerase (CLONTECH).
Las condiciones del ciclo fueron las siguientes: 94ºC durante 30 segundos y 68ºC durante 2 minutos. Se emplearon 34 ciclos para BDCA-2 y 38 ciclos para la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH). Obsérvese que las señales mRNA de BDCA-2 son detectadas solamente en las DC plasmacitoides CD11c^{-}CD123^{bright}. Cuando se emplearon cuatro ciclos de PCR más para la amplificación del cDNA de BDCA-2 (38 ciclos en lugar de 34), se detectaron también señales débiles en páncreas, testículos, ovario, médula ósea y amígdala. Con el cDNA de testículos (38 ciclos de PCR), las señales de los transcritos más cortos (variantes de empalme) fueron más prominentes en comparación a las señales de las DC plasmacitoides CD11c^{-}CD123^{bright}, y las señales del transcrito de longitud completa fueron en realidad solo detectables con incluso más ciclos de PCR.
Ejemplo 19 Estructura exón/intrón de BDCA-2 y variantes de empalme de BDCA-2
Se obtuvo la información sobre las variantes de empalme de BDCA-2 por la amplificación RT-PCR del mRNA de DC plasmacitoides con cebadores complementarios a las secuencia de mRNA en frente del codon de inicio (cebador forward: 5'-TTGAAAGAACCACACCCCGAAAGT (SEC ID NO:)) y detrás del codon de parada (cebador reverse: 5'-TAGCMCTACAACGGTGGATGCC (SEC. ID NO:)), clonación de los fragmentos resultantes en plásmidos y secuenciación de insertos. Los resultados se muestran en la Figura 20, A efectos comparativos, las variantes de empalme de lectina 2 tipo C asociada a célula dendrítica de ratón (Dectina-2) se muestran en la Figura 21.
\newpage
La Figura 22 muestra una alineación de las secuencias de mRNA de BDCA-2 y Dectina-2 de ratón con las posiciones de los supuestos intrones indicados. La Tabla 3 muestra los parámetros de los exones.
TABLA 3
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Las posiciones de los intrones se basan en el Clon RP11-277J24 del cromosoma 12 de Homo sapiens, Working Draft Sequence, 21 piezas no ordenadas (GenBank Número de Acceso AC006517) y las reglas de empalme de los transcritos. La estructura intrón/exón de BDCA-2 es similar a la de Dectina-2.
Al menos son producidos cuatro variantes de empalme de BDCA-2. Estos son un mRNA que codifica una proteína con todos los seis exones; un mRNA que codifica una proteína que contiene los exones 1, 3, 4, 5, y 6; un mRNA que codifica una proteína que contiene los exones 1, 2, 4, 5 y 6 y un mRNA que codifica una proteína que contiene los exones 1, 2, 3, 5, y 6.
Ejemplo 20 Homología de BDCA-2 y dominios de las proteínas
En la Figura 23 se muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de BDCA-2 humano, DCIR humano (inmunorreceptor de células dendríticas), y Dectina-2 de ratón (lectina-2 tipo C asociada a células dendríticas).
El DCIR humano (GenBank Número de Acceso AJ133532) es la molécula con la homología más alta a BDCA-2 entre las moléculas humanas (ver Bates y col. (1999) J. Immunol. 163:1973) con aproximadamente un 51% de los aa siendo idénticos sobre una extensión de 191 aa.
La Dectina-2 de ratón (GenBank Número de Acceso AF240357) es muy probablemente el homólogo murino de BDCA-2 humano (ver Ariizumi y col. (2000) J. Biol. Chem. 16:11957; WO 98/28332; PCT/US97/23761; y Patente US 6,046,158) con aproximadamente un 51% de los aa siendo idénticos sobre una extensión de 211 aa.
BDCA-2 (213 aa), DCIR (237 aa) y Dectina-2 (209 aa) son todas glucoproteínas de membrana tipo II de la familia de lectinas (tipo C) dependientes de calcio. Cada una de las moléculas contiene un dominio putativo citoplásmico (BDCA-2: aa 1-21; DCIR: aa 1-44; Dectina-2: aa 1-17), un dominio transmembrana putativo (BDCA-2: aa 22-41; DCIR: 44-69; Dectina-2: 18-40), y un dominio extracelular putativo (BDCA-2: aa 42-213; DCIR: 70-237; Dectina-2: 40-209). Dentro del dominio putativo extracelular, cada una de las moléculas contiene un dominio de reconocimiento de hidrato de carbono único (CRD) al final del terminal COOH (BDCA-2: aa 83-206; DCIR: 106-230; Dectina-2: 79-202). La Figura 23 muestra la alineación de BDCA-2 humano, DCIR humano y Dectina-2 de ratón.
Los dominios/motivos putativos de las proteínas tal como se han encontrado por medio de las base de datos PROSTTE se muestran en la Tabla 4.
TABLA 4
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TABLA 4 (continuación)
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El BDCA-2 contiene tres lugares putativos de N-glucosilación (aa 110-113 NCSV; aa 137-140 NSSY; aa 164-167 NVTF), mientras que la Dectina-2 (aa 131-134 NESL) y DCIR (aa 185-188 NESS) contienen solamente un lugar putativo de N-glucosilación. Todos los lugares putativos de fosforilación de BDCA-2 y Dectina-2 están localizados en el dominio putativo extracelular. De este modo, es bastante improbable que se vuelvan fosforilados mediante las quinasas intracelulares. Al igual que muchas lectinas tipo C (p.ej., CD94, Ly-49, y NKG2) que son codificadas en el complejo natural de los genes asesinos, el DCIR contiene el motivo inhibidor basado en tirosina del inmunorreceptor de consenso (motivo ITIM (I/V) XYXX(L/V)) en el dominio citplásmico (aa 5-10 ITYAEV). Es interesante el hecho que este motivo ITIM no se encuentra en la cola citoplásmica relativamente corta de BDCA-2 y Dectina-2 (BDCA-2: 21 aa; Dectina-2: 17 aa).
Ejemplo 21 Análisis de la proteína BDCA-3
Las células HD-MY-Z que expresaban BDCA-3 fueron estimuladas durante 24 horas con 10 ng/ml de PMA (Sigma) y 0,5 mg/ml de lonomicina para sobrerregular la expresión de BDCA-3. Las células HD-MY-Z estimuladas por 3 x 10^{7} de PMA/lonomicina fueron biotiniladas en superficie por incubación durante 15 minutos a 4ºC con 1 mg/ml de Sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce) y lavadas dos veces. Las células fueron resuspendidas en 50 nM de Tris-HCl pH 8,0 suplementado con 10% de sacarosa e inhibidores de proteasa (Fluoruro de fenilmetilsulfonilo, Pepstatina A, Leupeptina y Aprotinina de Serva) y a 4ºC ultrasonificadas (5 x 4 segundos, 70% de potencia de salida). Las células sonificadas se centrifugaron a 900 x g a 4ºC durante 10 minutos para extrae los núcleos y células intactas. El sobrenadante se centrifugó a 30.000 x g a 4ºC durante 2 horas para obtener membranas celulares purificadas. Las membranas fueron lisadas por incubación en 50 mM de Tris-HCl pH 8,0, 150 nM de NaCl suplementado con inhibidores de proteasa y 1% de NP-40 durante 1 hora a 0ºC. Los fragmentos de membrana no solubilizada se extrajeron por centrifugación a 30.000 x g a 4ºC. Al sobrenadante se añadió MnCl_{2} y CaCl_{2} a una concentración final de 1mM cada uno. El lisado fue adsorbido en una columna ConA Sepharose (1 ml), y las proteínas unidas se eluyeron con 10 ml de tampón de elución (0,5 M D(+)Manosa, 20 nM Tris-HCl pH 7,4, 0,5 M NaCl, 1% NP-40) y se concentraron a un volumen de 1 ml empleando concentradores centrífugas Cetiprep-10 (Amicon).
Las proteínas se preaclararon por incubación con 150 \mul de microesferas conjugadas a mAb anti-NIP (Miltenyi Bistec) durante 30 minutos a 4ºC y separación en columna \muMACS. Para la inmunoprecipitación específica de BDCA-3, las proteínas se incubaron con 2 \mug del mAb AD5-14H12 (IgG1) específico de BDCA-3 conjugado a NIP o para el control de especifidad con 2 \mug del mAb SJ25-C1 (IgG1) específico de CD19 conjugado con NIP como reactivo primario durante 14 horas a 4ºC, y con microesferas conjugadas a mAb anti-NIP como reactivo secundario durante 3 horas a 4ºC. Las proteínas precipitadas se aislaron por separación en columna \muMACS. Las proteínas retenidas se eluyeron con 70 \mul de tampón SDS-PAGE que contenía DDT. Las proteínas precipitadas se analizaron mediante el análisis por SDS-PAGE (4-12%) y Western blotting con estreptavidina-peroxidasa.
Los resultados de la Figura 24 muestran que el mAb AD5-14H12 específico de BDCA-3 inmunoprecipita específicamente una proteína de superficie celular de aproximadamente 100 kD de las células HD-MY-Z. Así, el BDCA-3 tiene un peso molecular aparente de 100 kD.
Aunque la invención se ha descrito detalladamente a título de ilustración y ejemplo a efectos de claridad y comprensión, será evidente para los expertos en la materia que se pueden realizar ciertos cambios y modificaciones. Por lo tanto, la descripción y ejemplos no deberían ser interpretados como limitativos del ámbito de la invención, la cual queda definida por las reivindicaciones adjuntas.
<110> Schmitz, et al 
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Fragmentos de unión a antígeno específicos de células den-dríticas, composiciones y métodos de uso, antígenos reconocidos y células así obtenidas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 830003-2002.1 WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/IB00/01832
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 2000-11-15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/165,555
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999-11-15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1312
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1312)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de DNA de BDCA-2
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<400> 1
10
100 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 213
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> INCIERTA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(213)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de una de las isoformas de BDCA-2 con loa seis exones expresados.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
11
110 
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<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1227
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Mus musculus 
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (146)..(775)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante de Dectin-2 de ratón
\vskip1.000000\baselineskip
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<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> AF240357
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<309> 2000-05-02
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<313> (1)..(1227)
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<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
12
13 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 209
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<212> PRT
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<213> Mus musculus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
14 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 237
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> INCIERTA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(237)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de DCIR humano
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<300>
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<308> AJ133532
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<309> 1999-09-01
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<313> (1)..(237)
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<400> 5
15 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 5
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<212> PRT
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Unidad básica de un péptido de unión
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<400> 6
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\sa{Gly Gly Gly Gly Ser}
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<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador
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<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttgaaagaac cacaccccga aagt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tagctttcta caacggtgga tgcc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Cys Ser Val}
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\sa{Asn Ser Ser Tyr}
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<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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\sa{Asn Val Thr Phe}
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<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
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<212> PRT
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<213> Mus musculus 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Glu Ser Leu}
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<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Glu Ser Ser}
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Arg Leu Ser}
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Lys Thr Thr}
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<210>16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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<400> 16
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\sa{Thr Arg Glu Glu}
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<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ser Glu Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Thr Lys Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211>4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Thr Ser Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Glu Ala Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ile Cys Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Tyr Ala Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Thr Lys Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Thr Leu Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Trp Gln Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Glu Lys Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Gln Glu Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> UNSURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de fosforilación de la tirosina quinasa en BDCA-2 humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Leu Arg Glu Tyr Gln Gln Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Val Cys Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Val Cys Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> UNSURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de fosforilación de tirosina quinasa en dectin-2 de ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Arg Leu Tyr Glu Leu His Thr Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Arg Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> UNSURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de N-miristilación en dectin-2 de ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Val Cys Trp Thr Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> UNSURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de N-miristilación en dectin-2 de ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Thr Met Val Ser Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> UNSURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de N-miristilación en dectin-2 de ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Cys Cys Pro Asn His}
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> INCIERTO
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<222> (1).. (6)
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<223> Sitio en N-miristilación en DCIR humano
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
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\sa{Gly Ile Asn Thr Ala Ser}
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
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<220>
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<223> motivo ITIM consenso
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<220>
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<221> misc feature
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<222> (2)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> motivo consenso inhibidor basado en un inmunoreceptor de tirosina (motivo ITIM) (L/V)XYXX(L/V), aminoácido "X" de la posición 2, 3 y 5 puede ser cualquier aminoácido
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc feature
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<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> aminoácido "X" en la posición 1 puede ser cualquier aminoácido "I" o "V"
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc feature
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<222> (6)..(6)
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<213> Homo sapiens 
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<400> 30
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\sa{Ser Val Cys Glu}
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<210> 31
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Mus musculus 
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<220>
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<221> INCIERTO
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<222> (1)..(9)
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<223> Sitio de fosforilación de quinasa en dectin-2 de ratón
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<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Arg Leu Tyr Glu Leu His Thr Tyr}
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<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 32
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\sa{Gly Gly Arg Arg}
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<210> 33
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<211> 6
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<212> PRT
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<213> Mus musculus 
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<220>
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<221> INCIERTO
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<222> (1)..(6)
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<223> Sitio de N-miristilación en dectin-2 de ratón
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<400> 33
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\sa{Gly Val Cys Trp Thr Leu}
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<210> 34
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<211> 6
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<212> PRT
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<213> Mus musculus 
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<220>
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<221> INCIERTO
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<222> (1)..(6)
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<223> Sitio de N-miristilación en dectin-2 de ratón
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<400> 34
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\sa{Gly Thr Met Val Ser Glu}
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<210> 35
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<211> 6
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<212> PRT
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<213> Mus musculus 
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<220>
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<221> INCIERTO
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<222> (1).. (6)
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<223> Sitio de N-miristilación en dectin-2 de ratón
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<400> 35
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\sa{Gly Cys Cys Pro Asn His}
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<210> 36
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<211> 6
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> INCIERTO
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<222> (1)..(6)
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<223> Sitio de miristilación en DCIR humano
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<400> 36
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\sa{Gly Ile Asn Thr Ala Ser}
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<210> 37
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<211> 6
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<212> P RT
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<213> Desconocido
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<220>
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<223> Motivo consenso de ITIM
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<220>
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<221> misc feature
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<222> (2)..(5)
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<223> motivo consenso inhibidor basado en un inmunoreceptor de tirosina (motivo ITIM) (LIV)XYXX(L/V), aminoácido "X" de la posición 2, 3 y 5 puede ser cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<221> misc feature
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<222> (1)..(1)
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<223> aminoácido "X" en posición 1 puede ser cualquier aminoácido "I" o "V"
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<220>
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<221> misc feature
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<222> (6)..(6)
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<223> aminoácido "X" en posición 6 puede ser un aminoácido "L" o "V"
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<400> 37
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\sa{Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa}
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<210> 38
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<211> 6
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<221> INCIERTO
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<222> (1)..(6)
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<223> Motivo inhibidor basado en el inmunoreceptor de tirosina (ITIM motif) en DCIR
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<400> 38
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\sa{Ile Thr Tyr Ala Glu Val}

Claims (29)

1. Fragmento de unión a antígeno aislado que comprende un dominio de polipéptido que une específicamente una proteína BDCA-2 codificada por SEC ID NO:1, en donde dicha proteína BDCA-2 está codificada por los exones 1-6; exones 1 y 3-6; exones 1-2 y exones 4-6; o exones 1-3 y 5-6 de SEC ID NO: 1.
2. Fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 el cual es un anticuerpo monoclonal.
3. Fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 donde el anticuerpo es humano, murino, humanizado o un anticuerpo biespecífico.
4. Fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 el cual es un Fab, F(ab')_{2}, scFv, o un polipéptido de fusión, o está codificado por una biblioteca de exposición a fago.
5. Fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 el cual está conjugado a una fracción químicamente funcional.
6. Fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 5 donde la fracción químicamente funcional se selecciona del grupo que consiste en un radioisótopo, compuesto fluorescente, compuesto quimioluminiscente, compuesto bioluminiscente, enzima y un marcador paramagnético.
7. Fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 el cual está unido a una proteína BDCA-2.
8. Fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 7 el cual está unido a una célula dendrítica o a una célula mononuclear de sangre periférica que expresa una proteína BDCA-2.
9. Fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 8 donde la célula es una célula dendrítica.
10. Fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 9 donde la célula es una célula dendrítica plasmacitoide.
11. Fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 10 donde la célula dendrítica es BDCA-4^{+}.
12. Fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 11 donde la célula dendrítica es humana.
13. Fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 10 donde un anticuerpo anti-BDCA-4 también está unido a la célula dendrítica.
14. Composición que comprende el fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 ó 2 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
15. Hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal de la reivindicación 2.
16. Procedimiento para preparar una población de células enriquecidas de células BDCA-2^{+}, que comprende poner en contacto una mezcla de células humanas con un fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 y aislar las células a las cuales se une el fragmento de unión a antígeno.
17. Procedimiento para detectar la proteína BDCA-2 en una muestra biológica que comprende (a) poner en contacto la proteína BDCA-2 con el correspondiente fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 en condiciones que permitan la formación de un complejo entre la proteína BDCA-2 y el fragmento de unión a antígeno; y (b) detectar la formación del complejo.
18. Procedimiento de la reivindicación 17 donde la proteína BDCA-2 se exhibe en la superficie de una célula dendrítica.
19. Procedimiento de la reivindicación 18 donde la etapa de detectar la formación del complejo comprende la detección de una modulación funcional de la célula dendrítica, donde la modulación funcional es:
A.
inducción e infrarregulación de las respuestas de células T CD4^{+} y CD8^{+};
B.
polarización de la respuesta inmune hacia tolerancia e inmunidad;
C.
polarización de las respuestas de células T CD4^{+} hacia el desarrollo de células Th1, desarrollo de células Th2 o desarrollo de células T 1 CD4^{+} reguladoras de Th3/T;
D.
modulación de las respuestas de células B y/o las respuestas de las células NK.
20. Procedimiento de la reivindicación 19 donde la etapa de detectar la formación del complejo comprende la detección de la infrarregulación de la producción de interferón tipo I, infrarregulación de las respuestas inmunes de Th1, inducción de la movilización de Ca^{2+} intracelular, o polarización de una respuesta inmune a Th2.
21. Procedimiento para ligar el antígeno BDCA-2 en una célula dendrítica que comprende poner en contacto la célula con el fragmento de unión antígeno de la reivindicación 1 ó 2.
22. Procedimiento de la reivindicación 21 donde la ligación del antígeno BDCA-2 resulta en un cambio metabólico seleccionado de la infrarregulación de la producción de interferón tipo I, infrarregulación de las respuestas inmunes de Th1, inducción de la movilización de Ca^{2+} intracelular, o polarización de una respuesta inmune a Th2.
23. Procedimiento de cribado para agentes que interfieren con la ligación de BDCA-2, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto una proteína BDCA-2 y un fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 ó 2 en presencia de un agente de ensayo y determinar si el agente de ensayo reduce la unión del fragmento de unión a antígeno a la proteína.
24. Kit que comprende un fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 ó 2 y un componente seleccionado del grupo que consiste en: proteína BDCA-2, un tampón, y un marcador conjugado al, o que puede estar conjugado al, fragmento de unión a antígeno.
25. Proteína BDCA-2 aislada o recombinada codificada por SEC ID NO:1 o un fragmento polipéptido de la misma capaz de unir un anticuerpo anti-BDCA-2.
26. Proteína BDCA-2 de la reivindicación 25, donde dicha proteína BDCA-2 está codificada por los exones 1-6; exones 1 y 3-6; exones 1-2 y 4-6; o exones 1-3 y 5-6 de SEC ID NO:1.
27. Polinucleótido aislado o recombinante que codifica una proteína BDCA-2 de la reivindicación 25 ó 26.
28. Polinucleótido que codifica una proteína BDCA-2 o fragmento, seleccionado de:
(a)
un polinucleótido que comprende al menos 15 nucleótidos consecutivos de la secuencia mostrada en la Figura 12 (SEC ID NO:1) y codifica una proteína BDCA-2 o fragmento;
(b)
un polinucleótido de al menos 50 nucleótidos el cual hibridiza con el complementario del DNA de (a) y el cual codifica una proteína BDCA-2 o fragmento de la proteína; y
(c)
un polinucleótido con una secuencia que está degenerada como resultado del código genético de las secuencias de DNA definidas en (a) y (b) y el cual codifica un polipéptido BDCA-2 o fragmento.
29. Proteína BDCA-2 aislada o recombinante o un fragmento polipéptido de la misma capaz de unir un anticuerpo anti-BDCA-2, codificado por:
(a)
un polinucleótido que comprende al menos 15 nucleótidos consecutivos de la secuencia mostrada en la Figura 12 (SEC ID NO:1); o
(b)
un polinucleótido de al menos 50 nucleótidos el cual hibridiza con el complementario del DNA de (a); o
(c)
un polinucleótido con una secuencia que está degenerada como resultado del código genético de las secuencias de DNA definidas en (a) y (b).
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