JP3319594B2 - 定常領域の代わりに受容体結合性リガンドを有するキメラ抗体 - Google Patents

定常領域の代わりに受容体結合性リガンドを有するキメラ抗体

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Description

【発明の詳細な説明】 この出願は、1990年３月20日に出願された米国特許出
願第496,409号の一部継続出願であり、その内容は参照
として本出願に組み込まれる。
本発明は、NIH−CA16858号の授与番号で、アメリカ合
衆国健康および人的資源局、国立健康協会から付与され
た支援の下に行われた。従って、アメリカ合衆国は本発
明に対して一定の権利を有する。
〔発明の背景〕
この出願の全体を通して、括弧で囲んだアラビア数字
によって種々の刊行物が引用される。これら刊行物の全
部の引用が、請求の範囲の直前の明細書末尾に挙げられ
ている。これら刊行物の開示は、ここに記載され権利請
求される発明の日において、本発明が属する技術の当業
者に知られた技術の状態をより完全に記述するために、
その全体が参照としてこの出願に組み込まれる。
癌治療における挑戦によって、正常細胞を無傷で残し
ながら、悪性細胞を選択的に殺す手段が見出だされてい
る。伝統的な化学療法は、活発に分割する細胞に対して
向けられているが、活発に増殖する正常な細胞、例えば
骨髄をも殺してしまう欠点を有している。他の挑戦は、
一般には殆どの分子が接近し得ない患者の領域（例えば
脳）に対して接近し得る抗体を製造することである。
抗体は、その顕著な特異性のために、悪性細胞を選択
的に同定および除去し得る「魔法の小銃弾」として、こ
れまで長らく関係者にアピールされてきた。
形質転換された細胞（トランスフェクトーマ）は、モ
ノクローナル抗体の改良へのアプローチを提供する。一
般的に、加工された抗体は、リンパ細胞への遺伝子の形
質転換に続いて発現され得る（１−５）。遺伝子的に加
工された抗体を発現させることの主な利点の一つは、抗
体を天然に存在するままで使用するように制限を受けな
いことである。特に、免疫グロブリン鎖を抗体鎖に結合
させて、多機能分子を作り出すことができる。
研究者が免疫療法剤としてモノクローナル抗体の使用
を企画するときに遭遇する問題の中に、正常細胞には触
れることなく、癌細胞に対して効果的にターゲッティン
グを行うことが含まれる。この問題を克服する試みにお
いて、我々は、成長因子（増殖因子）および抗癌特異性
の両者が一つの分子内に含まれ得、相乗的に機能し得る
ことを見出した。従って、成長因子受容体を具備した癌
細胞を効果的にターゲッティングする分子を製造するた
めに、我々は、抗体結合特異性に対して成長因子を組み
合わせた。成長因子受容体が脳−血液関門に存在するこ
とも報告されており、従ってここで説明する分子は、脳
内へのトランスサイトーシス（transcytosis）に関する
成長因子受容体を利用し得る（18,49,15）。通常、癌細
胞は成長因子受容体を発現し、これがその増大した増殖
脳を反映するから、成長因子は適切である。
現在のところでは、IL−２受容体に対する抗体が、Ｔ
細胞悪性疾患に対するターゲッティング療法に用いられ
ている（67,68）。或いは、特定の細胞をターゲッティ
ングする治療として、受容体リガンドが用いられてい
る。更に、細胞受容体のブロッキングによって、細胞の
増職能は阻害される。
ここに記載する分子には、抗体結合特異性に組み合わ
せられた、インスリン又はインスリン様成長因子タイプ
１及びタイプ２（IGF1及びIGF2）を有する遺伝子的に加
工された抗体が含まれる。インスリン並びにIGF1及びIG
F2は、形質膜上の特定の受容体に結合することによっ
て、細胞の代謝および増殖に影響する関連したポリペプ
チドである。IGF1はソマトメジンＣと同一物である。イ
ンスリンおよびIGF1の受容体は、同様の分子サイズおよ
び副構造を有する。
インスリンはIGF1受容体に結合し得るが、その結合は
IGF1の結合よりも弱い。近年、IGF1は、培養中の或る種
のヒト乳癌細胞の自己分泌成長因子であることが示され
た（35）。インスリン受容体およびIGF受容体の両者は
脳−血液関門に存在すると考えられ、これを横切るトラ
ンスサイトーシスに影響すると考えられる（1,16−19,4
8）。
加えて、ここに記載する分子には、抗体結合特異性に
組み合わされたトランスフェリンを有する遺伝子的に加
工された抗体が含まれる。トランスフェリン受容体は、
ヒト腫瘍に広範に分布している（20）。加えて、脳毛細
血管の血管内皮は、他の組織の内皮がこれを発現してい
ないのに対して、トランスフェリン受容体を発現してい
る（26）。トランスフェリン受容体に向けられた抗体
は、トランスフェリン受容体を架橋することによって腫
瘍細胞の成長を阻害する（54）。しかしながら、IgM抗
体のみが有効であり、これによってポリマーが重要であ
ることが示唆された。更に、IgG抗体はトランスフェリ
ン受容体の代謝回転を増大し（69）、これによって、リ
サイクルの間に受容体の分解を増大することが細胞成長
を阻害するための別のアプローチであることが示唆され
た。
トランスフェリン受容体は、主要血清鉄移送タンパク
（即ちトランスフェリン）に結合し、細胞内への鉄の取
り込みを媒介する。トランスフェリンが鉄の取り込みを
媒介する基本的なメカニズムが解明されている。鉄を付
加されたトランスフェリンが受容体に結合した後、受容
体−リガンド複合体が被覆ピットを介して取り込まれ、
細胞内小胞中に蓄積する（4,23,24）。この細胞内の膜
区画を酸性化することによって、トランスフェリンから
の鉄の解離が導かれ、次いでアポトランスフェリン−ト
ランスフェリン受容体複合体が細胞表面に再循環され
る。中性条件下において、アポトランスフェリンは迅速
に受容体から解離し、次いでエンドサイトーシスの次ぎ
のラウンドに用いられる（11,30,65,70）。
受容体のエンドサイトーシスおよび再循環は、迅速か
つ効率的に起こる。殆どの受容体は夫々のサイクルの間
に細胞表面に戻され、極く僅かがサイクルを外れてリソ
ゾーム中に流れ込み、分解される。鉄が細胞質中に移送
されるメカニズムは知られていない。抗体を細胞質に対
してターゲッティングするために、抗体は細胞内小胞中
での分解に抵抗しなければならない。
活性酵素部分またはｃ−myn抗原決定因子を表示する
ポリペプチドを、重鎖の定常領域に有するネズミ組換Fa
b様抗体の製造が報告されている（43）。これに対して
我々は、ネズミ抗ダンシル（Dns）結合特性およびヒトI
gG3由来の重鎖（Ｈ）定常領域（Ｃ）であるCH2ドメイン
に、インスリン様成長因子１（IGF1）を組み合わせた。
このキメラＨ鎖が、ダンシル特異性軽鎖（Ｌ）と共にミ
エローマ細胞中に形質転換されたとき、予想された分子
が産生され、組み立てられ、分泌された。得られたキメ
ラタンパクは、ハプテンDnsに結合した。又、これらは
成長因子受容体によって結合されたが、その効率は低
く、またα−アミノイソ酪酸および２−デオキシ−Ｄ−
グルコース（２−dGlc）の取り込み増大のような幾つか
のIGF1機能を示した（２）。
〔発明の概要〕 本発明は、異なったポリペプチドの夫々の二つの分子
を具備した、修飾されたキメラモノクローナル抗体を提
供する。短い方の二つのポリペプチドは抗体の軽鎖とし
て機能し、長い方の二つのポリペプチドは抗体の重鎖と
して機能する。更に、重鎖として機能するポリペプチド
は、第一の哺乳動物に特有の可変領域および第二の哺乳
動物に特有の定常領域を有する。軽鎖として機能する夫
々のポリペプチドは、哺乳動物に特有の可変領域および
哺乳動物に特有の定常領域を有しており、抗体の重鎖と
して機能する夫々のポリペプチドの定常領域の少なくと
も一部が受容体結合性リガンドで置き換えられている。
加えて、本発明は二つの異なったポリペプチドを具備
した免疫学的な反応性複合体を提供する。そのポリペプ
チドの短い方は軽鎖として機能し、長い方は重鎖として
機能する。重鎖として機能するポリペプチドは、第一の
哺乳動物に特有の可変領域および第二の哺乳動物に特有
の定常領域を有する。また、軽鎖として機能するポリペ
プチドは、哺乳動物に特有の可変領域および第二の哺乳
動物に特有の定常領域を有する。更に、受容体結合性リ
ガンドが、一つのポリペプチドの定常領域の少なくとも
一部を置き換えている。
本発明はまた、抗体の重鎖として機能することができ
るキメラポリペプチドを提供する。このキメラポリペプ
チドは、第一の哺乳動物に特有の可変領域および第二の
哺乳動物に特有の定常領域を具備している。更に、この
ポリペプチドの定常領域の少なくとも一部が、受容体結
合性リガンドで置き換えられている。加えて、本発明は
抗体の軽鎖として機能することができるキメラポリペプ
チドを提供する。このポリペプチドは、第一の哺乳動物
に特有の可変領域および第二の哺乳動物に特有の定常領
域を具備し、該ポリペプチドの定常領域の少なくとも一
部は受容体結合性リガンドで置き換えられている。
更に、本発明は追加的に、二つの異なったポリペプチ
ドの夫々の二つの分子を具備し、その短い方は抗体の軽
鎖として機能し、また長い方は抗体の重鎖として機能す
るような、修飾されたキメラモノクローナル抗体を提供
する。重鎖として機能する夫々のポリペプチドは、第一
の哺乳動物に特有の可変領域および第二の哺乳動物に特
有の定常領域を有する。更に、軽鎖として機能する夫々
のポリペプチドは、哺乳動物に特有の可変領域および哺
乳動物に特有の定常領域を有しており、受容体結合性リ
ガンドが、抗体の重鎖として機能する夫々のポリペプチ
ドの定常領域の末端に共有結合的に結合している。
更に、もう一つの免疫学的な反応性複合体が提供され
る。この複合体は、二つの異なったポリペプチドを具備
し、その短い方は軽鎖として機能し、長い方は重鎖とし
て機能する。また、その重鎖として機能するポリペプチ
ドは、第一の哺乳動物に特有の可変領域および第二の哺
乳動物に特有の定常領域を有し、その軽鎖として機能す
るポリペプチドは哺乳動物に特有の可変領域および第二
の哺乳動物に特有の定常領域を有しており、受容体結合
性リガンドが一つのポリペプチドの定常領域の末端に対
して共有結合的に結合している。本発明は又、第一の哺
乳動物に特有の可変領域および第二の哺乳動物に特有の
定常領域を具備しており、受容体結合性リガンドが該ポ
リペプチドの定常領域に対して共有結合的に結合されて
いる、抗体の重鎖として機能することができるキメラポ
リペプチドを提供する。
更に、本発明は、第一の哺乳動物に特有の可変領域お
よび第二の哺乳動物に特有の定常領域を具備し、受容体
結合性リガンドが該ポリペプチドの定常領域に対して共
有結合的に結合された、抗体の軽鎖として機能すること
ができるキメラポリペプチドを提供する。
最後に、本発明は、上記修飾されたキメラモノクロー
ナル抗体を使用する方法、並びにこれを製造する方法を
提供する。
〔図面の簡単な説明〕
図1: （Ａ）;IgG3−IGF1融合遺伝子を構築するための戦略。
ヒトIgG3におけるCH2ドメインのための遺伝子の４番目
の塩基（Ｃ）が、部位指向性変異誘発によってＧに変異
され、これによって独特のPvu II制限酵素部位が導入さ
れた。加えて、ラットIGF1・cDNA（イタリック文字）の
リーダー配列（リーダーSeq.又はLS）の最後の塩基
（Ｃ）をＴに変えることによって、独特のPvu II部位が
IGF1遺伝子中に導入された。Pvu IIで消化されたヒトIg
G3・cDNAおよびラットIGF1・cDNAをライゲートし、顕著
なアミノ酸置換を何等伴うことなく、IgG3−IGF1組込み
融合遺伝子を得た。
（Ｂ）；形質転換ベクター、遺伝子的に加工されたIgG3
−IGF1融合遺伝子および提案されたキメラ抗体の図式的
に表現している。マウス−ヒト・κＬ鎖遺伝子がSV184
ΔＨ−neoの中にクローン化された。このpSV184ΔＨ−n
eoはpACYC184から誘導されたもので、真核細胞中での選
別のためのシミアンウイルス40（SV40）初期領域プロモ
ータ（影線ボックス）と共に、pACY複製源、Escherichi
a coli中での選別を行なうためのクロラムフェニコール
耐性遺伝子（Cm）、およびneo遺伝子（付点ボックス）
を含んでいる。このマウス−ヒトIgG3−ラットIGF1H鎖
遺伝子が、pSV2ΔＨ−gpt遺伝子（縞ボックス）中にク
ローン化された。このキメラ遺伝子中のボックスはエキ
ソンを表す。太い黒の実線およびボックスはマウス起源
のDNAを表わし、細い実線およびオープンボックスはヒ
トDNA切片を表わす。Ｈ鎖遺伝子中の影を付したボック
スは、ラットIGF1・cDNAを表わす。制限酵素エンドヌク
レアーゼEcoR1（オープン三角形）、BamH I I（オープ
ン円）およびHind III（閉じた円）による開裂部位が示
されている。形質転換された両ベクターの発現によって
製造される該マウス−ヒトIgG3−ラットIGF1キメラタン
パクが、Ｂの底部に示されている。該キメラ分子の黒く
塗り潰した領域はハプテンDnsに特異的なマウスＶ領域
ドメインを表わし、オープン領域はヒトκＬ鎖およびIg
G3のＣ領域を表わし、斜線を付した領域はラットIGF1を
表わす。
図2: 形質転換細胞により分泌されたIgG3−IGF1キメラタン
パクのNaDodSO4/PAGE分析である。［35S］メチオニンで
生合成的にラベルされ、分泌されたIgG3−IGF1キメラタ
ンパクが、非還元性条件（Ａ）および還元性条件（Ｂ）
下で分析された。このラベルされたキメラタンパクは、
Dns−セファロース（ＡのDnsレーン）または抗ヒトIgG
・Fab抗血清／スタフィロコッカスタンパクA/IgGsorb
（ＡのFabレーン）の何れかで沈殿された。抗Fabは遊離
Ｌ鎖、並びにＨ鎖に共有結合したＬ鎖を沈殿させる。マ
ウスＶ領域−ヒトIgGのＣ領域からなる分泌されたIgG3
キメラ抗体は、IgG3−IGF1キメラタンパクと同じ基本的
構造を有し、対象として用いられる。非還元性条件
（Ａ）の下で、三つのバンドは加工されたキメラタンパ
クおよび未加工キメラタンパクの不均一なアセンブリー
を表わす：還元性条件の下では、加工されたキメラタン
パク（Ｐ）および未加工キメラタンパク（unP）が見ら
れる（Ｂ）。不均一なアセンブリーパターンの図はＣに
示されており、ここで斜線を付した領域はマウスＶ領域
を表わし、オープン領域はヒトＣ領域を表わし、縞領域
は成熟IGF1を表わし、黒く塗り潰した領域は未加工IGF1
のカルボオキシ末端を表わす。
図3:IgG3−IGF1融合タンパクの精製 A;精製されたIgG3−IGF1融合タンパクが、非還元性条件
下でのSDS−PAGEによって分画され、銀染色を用いて可
視化された。
B;精製されたIgG3−IGF1融合タンパクが、FPLC（スーパ
ロース−12カラム，流速:0.25ml/min.）を用いて分画さ
れた。IgG3−IGF1融合タンパクの溶出時間は42分であ
る。マウス−ヒトIgG3キメラ抗体（170KDa）の溶出時間
は40分であり、IgG1キメラ抗体（146KDa）の溶出時間は
54分である；これらについては矢印で示した。
図4: 125I−IGF1のIM−９に対する結合の拮抗的阻害を示
す。略３×106のIM−９細胞が、一定量の125I−IGF1と
共に15℃でインキュベートされ、ラベルされない拮抗剤
（組換IGF1、IgG3−IGF1キメラタンパク、およびIgG3キ
メラ抗体）の濃縮が示された。２時間のインキュベーシ
ョンの後、受容体に結合した放射活性が測定された。測
定値は、ラベルされたトレーサー125I−IGF1のみの使用
と比較した相対的な結合阻害として表わされる。夫々の
曲線に示された結果は、繰り返し行われた実験の平均で
ある。
図5: KB細胞内へのα−アミノイソ酪酸（AIB）（Ａ）及びd
Glc（Ｂ）の取り込みに対する、IGF1の刺激効果とIgG3
−IGF1の刺激効果との間の関係を示す。取り込みは、指
定された濃度のIGF1、IgG3−IGF1、及び対象としてのIg
G3の存在下で測定された。
図6: 核／形質膜画分（Nuc/Pm）、ミトコンドリア画分（Mi
t）、高密度ミクロソーム画分（H.Micro）、低密度ミク
ロソーム画分（L.Micro）、およびサイトゾル画分（Cyt
o）を得るために用いられた分画遠心分離プロトコール
を図式的に示す図である。
図7: 発現ベクター中にヒンジ−IL2を具備するpAG5018の図
である。
図8: TUZ（IL−２融合タンパク）対IL−２の相対的活性を
示す線図である。
図9: CD4−IGF1を挿入されたブルースクリプト（Bluescrip
t;KS）の図である。
図10: ヒトトランスフェリンを具備したpSV2 VDNS HUG3 HTF
の図である。
図11: IgG3−IGF1毛細血管消耗を示す線図である。
〔発明の詳細な開示〕
モノクローナル抗体を免疫療法剤として使用する試み
において、多くの問題に遭遇している。これら問題のな
かには、（１）正常細胞に触れることなく、癌細胞に対
して抗体を効率的にターゲッティングすることができな
いこと、および（２）身体の限定された部位（例えば
脳）へのアクセスが得られないことが含まれる。
従って、ここに提供されるモノクローナル抗体は、天
然に存在する抗体よりも、ターゲット領域（例えば脳）
へのより大きな接近可能性を与えるように加工される。
更に、主題のキメラモノクローナル抗体は、ターゲット
細胞に対して再現可能に結合する。
本発明は、二つの異なったポリペプチドの夫々の二つ
の分子を具備した、修飾されたキメラモノクローナル抗
体を提供する。短い方の二つのポリペプチドは抗体の軽
鎖として機能し、長い方の二つのポリペプチドは抗体の
重鎖として機能する。更に、重鎖として機能するポリペ
プチドは、第一の哺乳動物に特有の可変領域および第二
の哺乳動物に特有の定常領域を有する。軽鎖として機能
する夫々のポリペプチドは、哺乳動物に特有の可変領域
および哺乳動物に特有の定常領域を有しており、抗体の
重鎖として機能する夫々のポリペプチドの定常領域の少
なくとも一部が受容体結合性リガンドで置き換えられて
いる。
ここで用いられる「修飾されたキメラモノクローナル
抗体」の用語は、一般的に、（１）二つが重鎖で二つが
軽鎖である四つのポリペプチドであって、これらポリペ
プチドが異なった遺伝子的構成を有する核酸分子によっ
てコードされる四つのポリペプチドと、（２）重鎖の定
常領域における変更とを具備する加工されたタンパクを
意味する。
ここで用いる「修飾されたキメラモノクローナル抗体
の重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）」は、上記抗体を構成す
るポリペプチドの分子量の相違に関連する。
更に、ここで用いる「修飾されたキメラモノクローナ
ル抗体の可変領域（Ｖ）」は、分子のアミノ末端におけ
る軽鎖および重鎖の両方の配列である。
更にまた、ここで用いる「修飾されたキメラモノクロ
ーナル抗体の定常領域（Ｃ）」は、分子のカルボキシ末
端における軽鎖および重鎖の両方の配列である。従っ
て、免疫グロブリンの鎖はそのＶ成分およびＣ成分に分
割され得る。即ち、軽鎖はVLおよびCL（可変lightおよ
び定常light）の二つの部分に分割され、同様にして重
鎖はVHおよびCH（可変heavyおよび定常heavy）に分割さ
れ得る。
本発明の一つの態様において、第一の哺乳動物類はマ
ウスであり、第二の哺乳動物はヒトである。他の態様に
おいては、第一の哺乳動物はヒトであり、第二の哺乳動
物はマウスである。更に、ラット、モグラ、トガリネズ
ミ、サル、コウモリ、野ウサギ、ウサギ、イヌ、ネコ、
クジラ、イルカ、ゾウ、ウマ、ウシ、シカ又はこれらの
組み合わせのような哺乳動物に由来するポリペプチドを
具備したキメラモノクローナル抗体も又、本発明の範囲
内に含まれる。
更に、本発明の実施に従えば、軽鎖の可変領域および
定常領域は、両者共に第二の哺乳動物に特有のものであ
る。或いは、軽鎖の可変領域および定常領域の両者が、
第一の哺乳動物に特有のものである。更なる変形では、
軽鎖の可変領域は第一または第二の哺乳動物の何れか一
方に特有のものであり、軽鎖の定常領域は他方の哺乳動
物に特有のものであるキメラモノクローナル抗体が提供
される。
更に、本発明によれば、受容体結合性リガンドが成長
因子からなる修飾されたキメラモノクローナル抗体が提
供される。成長因子の例には、インスリン、インスリン
様成長因子、血小板由来成長因子、表皮成長因子、トラ
ンスフォーミング成長因子、神経成長因子および成長ホ
ルモンが含まれるが、これに限定されるものではない。
ここで用いる「インスリン」の用語は、（１）天然に
存在するヒトまたは動物起源のインスリン、或いは
（２）遺伝子組換えまたは他の方法によって製造された
ヒトまたは動物由来の生合成されたインスリンの何れか
を意味する。
同様に、ここで用いる「インスリン様成長因子」、
「血小板由来成長因子」、「表皮成長因子」、「トラン
スフォーミング成長因子」、「神経成長因子」および
「成長ホルモン」の用語は、天然に存在するもの又は合
成されたものの何れかを意味する。
更に、インスリン様成長因子の例には、インスリン成
長因子１およびインスリン成長因子２が含まれるが、こ
れに限定されるものではない。
本発明の実施において、成長ホルモンには成長ホルモ
ン放出因子が含まれるが、これに限定されるものではな
い。更に、ここで用いる「成長因子」の例には、ヒト、
鳥類、ウマ属、ブタ、ヒツジ、ウシ及び魚類の成長ホル
モンが含まれる。
加えて、トランスフォーミング成長因子の例には、ト
ランスフォーミング成長因子−α、並びにトランスフォ
ーミング成長因子−β、即ちトランスフォーミング成長
因子−β１、トランスフォーミング成長因子−β２およ
びトランスフォーミング成長因子−β３が含まれるが、
これに限定されるものではない。
加えて、本発明の実施に従えば、重鎖ポリペプチドの
定常領域の少なくとも一部を置き換える受容体結合性リ
ガンドは、腫瘍壊死因子を具備する。
或いは、本発明の別の態様においては、受容体結合性
リガンドはトランスフェリンを具備する。更に、本発明
の他の態様において、受容体結合性リガンドはリンホカ
インを具備する。適切なリンホカインの例は、マクロフ
ァージ阻止因子、白血球遊走阻害因子、マクロファージ
活性化因子、マクロファージ細胞傷害性因子、インター
ロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン
３、インターロイキン４、インターロイキン５、インタ
ーロイキン６、リンホトキシン、単球由来リンパ球活性
化因子、およびヘルパ−Ｔ細胞置換因子からなる群から
選択される。
ここで用いる「リンホカイン」の用語は、（１）ヒト
もしくは動物起源の天然に存在するリンホカイン、或い
は（２）遺伝子組換え又は他の方法によって製造された
ヒトもしくは動物由来の生合成的リンホカインの何れか
を意味する。
更にまた、本発明の実施において、前記抗体は、IgG,
IgA,IgD,IgEもしくはIgM抗体またはその何れかの組合わ
せから選択されるが、これに限定されるものではない。
また、本発明に従う実施において、先に述べたキメラ
モノクローナル抗体の可変領域は、折り畳まれた形の免
疫グロブリン様リガンド結合性領域を具備する。免疫グ
ロブリン様リガンド結合性領域の例には、Ｔ細胞受容
体、主要組織適合性遺伝子複合体抗原、CD4およびCD8由
来のドメインが含まれるが、これに限定されるものでは
ない。
本発明に従う実施において、可変領域はＴ細胞受容体
のドメインを具備する。或いは、他の態様において、該
可変領域はMHC抗原、例えばHLA抗原またはＨ−２抗原の
ドメインを具備する。更なる態様において、可変領域は
表面糖タンパクCD4のを具備する。更にもう一つの態様
において、該可変領域は表面糖タンパクCD8のドメイン
を具備する。
CD4分子は、クラスII主要組織適合性遺伝子複合体（M
HC）分子を有するターゲットと相互作用する細胞表面糖
タンパクである（73）。CD4は、CD4+Tリンパ球とそのタ
ーゲットとの間の適切な相互作用を媒介する認識分子と
して作用する。加えて、CD4はAIDSウイルスのための細
胞表面受容体である。従って、CD4ドメインを具備した
重鎖の可変領域を有する主題のキメラモノクローナル抗
体は、Ｔリンパ球の機能を媒介し、AIDSを緩和する治療
薬および診断薬として重要である。
加えて、CD8はＴリンパ球のサブポピュレーション、
即ちCD8+Tリンパ球に見られる細胞表面糖タンパクであ
る。従って、CD8を具備するモノクローナル抗体は、CD8
に対して向けられる分子と特異的に結合することによっ
て、Ｔ細胞機能を阻害する。この点において、特に重鎖
の可変領域がCD8ドメインを具備するような本発明の態
様では、主題のキメラモノクローナル抗体はＴリンパ球
機能の媒介において重要である。
Ｔ細胞受容体は、Ｔ細胞に見られる特殊な膜結合細胞
表面タンパクであり、抗体に類似している。更に、Ｔ細
胞受容体は、それによってＴ細胞を抗原と相互作用さ
せ、Ｔ細胞に細胞性免疫応答を起こさせるメカニズムで
ある。この点において、Ｔ細胞受容体のドメインを具備
する主題のキメラモノクローナル抗体は、該抗原のため
の天然に存在するＴ細胞受容体と競合し、従って、Ｔ細
胞を細胞性免疫の媒介から防御する。本発明のこの態様
は、自己免疫疾患、例えば紅斑性狼瘡、AIDSの治療に有
用である。
ここで用いる「主要組織適合性抗原」は移植抗原、即
ち、クラスH2タンパクのようなマウス起源のもの、また
はHLAタンパクのようなヒト起源のものを意味する。移
植抗原は、構造的に抗体分子に類似している。
更に、MHC抗原のドメインを具備した主題のキメラモ
ノクローナル抗体は、移植抗原、即ちHLAまたはH2抗原
との結合詰抗に関与して、個体間での臓器移植の迅速な
拒絶を防止することにより、個体間での臓器移植の迅速
な拒絶を防止する上で重要である。
加えて、本発明は短い方が軽鎖として機能し、長い方
が重鎖として機能する二つの異なったポリペプチドを具
備した免疫学的な反応性複合体を提供する。重鎖として
機能するポリペプチドは第一の哺乳動物に特有の可変領
域および第二の哺乳動物に特有の定常領域を有し、また
軽鎖として機能するポリペプチドは、哺乳動物に特有の
可変領域および第二の哺乳動物に特有の定常領域を有す
る。更に、受容体結合性リガンドが、一つのポリペプチ
ドの定常領域の少なくとも一部を置き換えている。
ここで用いる「免疫学的な反応性複合体」は、生合成
的複合体であり、遺伝子組換えまたは他の方法によって
製造される。
更に、免疫学的な反応性複合体は、ヒトである第一の
哺乳動物およびマウスである第二の哺乳動物を具備す
る。或いは、第一の哺乳動物がマウスであり、第二の哺
乳動物がヒトである。更に、ラット、モグラ、トガリネ
ズミ、サル、コウモリ、ナマケモノ、野ウサギ、ウサ
ギ、イヌ、ネコ、クジラ、イルカ、ゾウ、ウマ、ウシ、
シカ又はこれらの組み合わせのような哺乳動物に由来す
るポリペプチドを具備した免疫学的な反応性複合体もま
た、本発明の範囲内に含まれる。
更に、本発明の一つの態様において、免疫学的な反応
性錯体の軽鎖の可変領域および定常領域は、両者共に第
二の哺乳動物に特有のものである。或いは、軽鎖の可変
領域および定常領域の両者が、第一の哺乳動物に特有の
ものである。他の変形においては、軽鎖の可変領域が第
一もしくは第二の哺乳動物の何れか一方に特有のもので
あり、軽鎖の定常領域は他方の哺乳動物に特有のもので
あることが提供される。例えば、軽鎖の可変領域が第一
の哺乳動物に特有のものであれば、軽鎖の定常領域は第
二の哺乳動物に特有のものである。
本発明は、軽鎖として機能するポリペプチドの定常領
域の少なくとも一部を受容体結合性リガンドが置き換え
た、免疫学的な反応性複合体を提供する。或いは、受容
体結合性リガンドは、重鎖として機能するポリペプチド
の定常領域の少なくとも一部を置き換えている。
又、本発明に従えば、免疫学的な反応性複合体の受容
体結合性リガンドは成長因子である。成長因子の適切な
例には、インスリン、インスリン様成長因子（インスリ
ン成長因子１またはインスリン成長因子２）、血小板誘
導成長因子、表皮成長因子、トランスフォーミング成長
因子（トランスフォーミング成長因子−α、トランスフ
ォーミング成長因子−β１、トランスフォーミング成長
因子−β２またはトランスフォーミング成長因子−β３
のようなもの）、神経成長因子および成長ホルモン（成
長ホルモン放出因子のような）、腫瘍壊死因子、トラン
スフェリン、及びリンホカイン（マクロファージ阻止因
子、白血球遊走阻止因子、マクロファージ活性化因子、
マクロファージ細胞障害性因子、インターロイキン１、
インターロイキン２、インターロイキン３、インターロ
イキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、
インターロイキン７、リンホトキシン、単球誘導リンパ
球活性化因子、およびヘルパ−Ｔ細胞置換因子のよう
な）が含まれるが、これに限定されるものではない。
加えて、本発明の実施に従うと、免疫学的な反応性複
合体のポリペプチドの可変領域は、Ｔ細胞受容体のドメ
インを具備する。或いは、該ポリペプチドの可変領域
は、MHC抗原（HLA抗原またはＨ−２抗原のような）のド
メインを具備する。更なる変形において、該ポリペプチ
ドの可変領域は表面糖タンパクCD4またはCD8のドメイン
を具備する。
加えて、本発明は抗体の重鎖として機能することがで
きるキメラポリペプチドを提供する。このキメラポリペ
プチドは、第一の哺乳動物に特有の可変領域および第二
の哺乳動物に特有の定常領域を具備しており、このポリ
ペプチドの定常領域の少なくとも一部が、受容体結合性
リガンドで置き換えられている。或いは、この受容体結
合性リガンドは該ポリペプチドの定常領域の少なくとも
一部に結合される。
本発明は抗体の軽鎖として機能することができるキメ
ラポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、第一
の哺乳動物に特有の可変領域および第二の哺乳動物に特
有の定常領域を具備し、該ポリペプチドの定常領域の少
なくとも一部は受容体結合性リガンドで置き換えられて
いる。或いは、この受容体結合性リガンドは、該ポリペ
プチドの定常領域の少なくとも一部に結合される。
ここで用いられる「キメラポリペプチド」は、生合成
的ポリペプチドであり、遺伝子組換えまたは他の方法に
よって製造される。
本発明の実施に従えば、第一の哺乳動物はヒトであ
り、第二の哺乳動物はマウスである。或いは、第一の哺
乳動物はマウスであり、第二の哺乳動物はヒトである。
更にまた、ラット、モグラ、トガリネズミ、サル、コウ
モリ、ナマケモノ、野ウサギ、ウサギ、イヌ、ネコ、ク
ジラ、イルカ、ゾウ、ウマ、ウシ、シカ又はこれらの組
み合わせのような哺乳動物に由来するポリペプチドを具
備したキメラポリペプチドも本発明の範囲内に含まれ
る。
更に、本発明は上記キメラポリペプチドをコードする
核酸分子を提供する。更に、本発明はキメラポリペプチ
ドを製造するための発現ベクターであって、該キメラポ
リペプチドをコイードする核酸と、適切なホスト内で前
記ポリペプチドの発現を可能とするように該ベクター内
に位置付けられた適切な調節要素とを具備した発現ベク
ターを提供する。
「適切な調節要素」に遺伝子の発現を制御する遺伝子
要素、例えば複製起源、プロモータ、およびエンハンサ
ーのような発現制御配列が包含されることは、既に当業
者にはに明らかである。
更に、本発明は、薬剤または検出ラベルのような成分
が結合された既述の修飾されたヒトキメラモノクローナ
ル抗体を提供する。ここで、該結合は分子の可変領域で
行われる。
更に、適切な前記薬剤の例には、細胞傷害剤、例えば
メソトレキセート、デカルバジン、毒素（リシン、ジフ
テリア毒素、シュードモナス・エンドトキシンＡ、アブ
リン、スポリン（supporin）、及びゲルノインのよう
な）、抗感染剤、防腐剤、及び代謝拮抗剤が含まれる
が、これらに限定されるものではない。
ここで用いられる「リシン」及び「アブリン」は、広
範な天然の供給源、例えば種子から単離され、或いは遺
伝子組換え又は他の方法によって合成されたリシン及び
アブリンを意味する。
適切な代謝拮抗剤の例には、５−ヨード−２′−デオ
キシウリジン（IUdR）が含まれる。ここで用いる「代謝
拮抗剤」は、DNAの複製を妨害するどのような化学薬剤
をも包含する。
更に、適切な検出ラベルの例には、酵素、ビオチン、
蛍光団、発色団、重金属、常磁性アイソトープ又は放射
性アイソトープが含まれるが、これらに限定されるもの
ではない。出願人は、適切な検出ラベルとして、当該技
術において知られた複合体の検出を補助する何れのラベ
ルをも使用できると想定している。
当業者には、主題のキメラモノクローナル抗体を酵
素、例えば西洋ワサビパーオキシダーゼに結合する一つ
の方法が、パーヨーデート法（periodate method）によ
るものであることが明らかである（74）。或いは、Baye
r et al.の方法によって、主題のキメラモノクローナル
抗体にビオチンを結合することが当業者には明らかであ
ろう（75）。
薬剤成分については、該薬剤が主題のキメラモノクロ
ナル抗体の可変領域に結合され得ることが当業者には明
らかである。
更に、本発明は、薬剤または検出ラベルのような成分
が有効量の該薬剤を放出するのに充分な量で結合される
上記キメラモノクローナル抗体、免疫学的複合体または
ポリペプチドと、薬剤的に許容可能な担体とを含有する
薬剤組成物を提供する。
ここで用いられる「薬剤的に許容可能な担体」の用語
には、標準的な薬剤担体の何れもが包含される。このよ
うな担体は当該技術において周知であり、リン酸緩衝生
理食塩水溶液、水、油／水エマルジョンのようなエマル
ジョン、及び種々のタイプの湿潤剤のような標準的薬剤
担体の何れもが含まれ得るが、何れにしてもこれらに限
定することを意図してはいない。他の担体には、滅菌溶
液、錠剤、被覆錠剤及びカプセルもまた包含され得る。
典型的には、このような担体な澱粉、ミルク、糖、あ
る種の粘度、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、マ
グネシウム若しくはカルシウムのステアリン酸塩、タル
ク、植物性の脂肪または油、ガム、グリコール類、また
は他の公知の賦形財のような賦形財を含有する。また、
このような担体は香料、着色剤または他の成分をも含有
し得る。このような担体を含有する組成物は、周知の従
来方法によって製剤される。
この方法において、該組成物の投与は特に限定される
ものではなく、例えば静脈内、筋肉内、皮下および経口
投与を含む周知の方法の何れによっても行ない得る。
加えて、本発明は上記修飾されたキメラモノクローナ
ル抗体の製造方法を提供する。この方法は、次の（ａ）
〜（ｃ）を具備する：（ａ）適切な非抗体産生ホスト細
胞に対して、（ｉ）抗体の重鎖として機能することがで
き、また第一の哺乳動物に特有の可変領域および第二の
哺乳動物に特有の定常領域を有し、重鎖ポリペプチドの
定常領域の少なくとも一部を受容体結合性リガンドが置
き換えているポリペプチドをコードする発現プラスミ
ド、および（ii）抗体の軽鎖として機能することがで
き、且つ哺乳動物に特有の可変領域および哺乳動物に特
有の定常領域を有するポリペプチドをコードする発現プ
ラスミドの二つの発現プラスミドを同時形質転換するこ
と；（ｂ）この同時形質転換されたホスト細胞を、該ホ
スト細胞内において、前記プラスミドによってコードさ
れるポリペプチドの発現およびキメラモノクローナル抗
体の形成が行なわれ、該ホスト細胞によって該抗体の培
地への排出が行なわれるように処理すること；（ｃ）そ
の結果排出されたキメラモノクローナル抗体を培地から
回収すること。
更に、本発明は、上記の修飾されたキメラモノクロー
ナル抗体を製造する別の方法を提供する。この方法は、
次の（ａ）〜（ｃ）を具備する：（ａ）適切な非抗体産
生ホスト細胞に対して、（ｉ）抗体の重鎖として機能す
ることができ、また第一の哺乳動物に特有の可変領域お
よび第二の哺乳動物に特有の定常領域を有し、重鎖ポリ
ペプチドの定常領域の少なくとも一部を受容体結合性リ
ガンドが置き換えているポリペプチド、および（ii）抗
体の軽鎖として機能することができ、且つ哺乳動物に特
有の可変領域および哺乳動物に特有の定常領域の両方を
有するポリペプチドの二つのポリペプチドをコードする
一つの発現ベクターを同時形質転換すること；（ｂ）こ
の同時形質転換されたホスト細胞を、該ホスト細胞内に
おいて、前記プラスミドによってコードされるポリペプ
チドの発現およびキメラモノクローナル抗体の形成が行
なわれ、該ホスト細胞によって該抗体の培地への排出が
行なわれるように処理すること；（ｃ）その結果排出さ
れたキメラモノクローナル抗体を培地から回収するこ
と。
モノクローナル抗体を製造するための一つの方法に
は、ホスト細胞内で適合的に複製し且つ増幅する、分離
された軽鎖および重鎖の免疫グロブリン遺伝子形質転換
ベクターを構築することが含まれる（45）。これは、夫
々のプラスミドは分離して扱われ得るがホスト細胞内で
一緒に維持され、プロトプラスト融合またはエレクトロ
ポレーション法を用いた両形質転換ベクターの哺乳動物
細胞内への遺伝子導入を容易にすることを意味する。夫
々のプロトプラスト融合の結果、次いで同じ哺乳動物細
胞へ両ベクターが導入される。
ここで用いる「同時形質転換」の用語は、重鎖遺伝子
および軽鎖遺伝子の両者が、一つまたは二つの発現ベク
ターによって、適切な非抗体産生ホスト細胞内に実質的
に同時に挿入されることを意味する。適切な非抗体産生
ホスト細胞には、真核細胞であろうと原核細胞であろう
と、該ホスト細胞内において、プラスミドによってコー
ドされるポリペプチドの発現およびキメラモノクローナ
ル抗体の形成を行なうことができ、また該ホスト細胞に
よる該抗体の培地中への排出を行なうことができる如何
なる細胞も包含されることが当業者には明らかである。
出願人は、ここでのベクターには、本発明の修飾され
たキメラモノクローナル抗体の製造に適した当該技術に
おいて公知の何れのベクターも含まれることが、当業者
には明らかであることを指摘しておく。更に、ここで用
いるベクターは、プラスミド、ウイルス（ファージを含
む）および集積可能なDNAフラグメント、即ち、組換に
よってホストゲノム中に集積可能なフラグメントを包含
する。本発明の一つの例において、該ベクターはバクテ
リア細胞内にクローン化され、同時形質転換に際してホ
スト細胞のゲノム中に集積されるプラスミドであり得
る。
上記方法の一つの態様において、適切な非抗体産生ホ
スト細胞はヒト細胞、即ちミエローマ細胞である。或い
は、他の態様において、適切な非抗体産生ホスト細胞は
ネズミ細胞である。更に、好ましいホスト細胞はヒトま
たはネズミ細胞であるが、原理的には、脊椎動物培養細
胞または無脊椎動物培養細胞からの何れであっても、高
度真核細胞の何れも有効に用い得る。
ここで用いる「その結果得られた排出されたキメラモ
ノクローナル抗体を培地から回収すること」は、例えば
免疫沈殿、溶媒分画、古典的高圧液体カラムクロマトグ
ラフィー（即ち、正常もしくは逆層の、サイズ排除、イ
オン交換、分配および吸着クロマトグラフィー）のよう
な、タンパクを分離および単離する手段として当業者に
一般的に知られ且つ受け入れられている何れの手段をも
意味する。
本発明は薬剤を、表面に成長因子のための受容体を有
する細胞、例えば脳細胞、脂肪細胞、血液細胞、表皮細
胞、筋細胞、神経細胞、または白血球に配薬する方法を
提供する。
ここで用いる「脂肪細胞」は、脂肪の製造および貯蔵
を担当する細胞を意味する。更に、表皮細胞は身体の内
表面および外表面を裏打ちする細胞である。
ここに記載されるキメラモノクローナル抗体、免疫学
的な反応性複合体およびキメラポリペプチドは、BBBを
横切って輸送されるように受容体に結合する。循環系に
導入された小さい外来分子は迅速に、身体の細胞外液全
体に分布する：しかし、これらは一般に脳の組織、即ち
脳−血液関門（BBB）を貫通することができない。BBB
は、脳毛細血管と脳組織との間の機能的バリアであり、
或る物質は血液から脳へ迅速に侵入させるが、他の物質
は遅延して侵入させるか又は全く侵入させない。更に、
BBBは所定の分子、特に約200ドルトンより大きい水可溶
性の帯電した分子の血液と中枢神経系の間の輸送を有効
に制限する。BBBは、仮睡体茎周囲の小領域、視索前凹
部および第４脳室の床下のポストリームエリア（area p
ostreme）を除いて、中枢神経系の全ての解剖学的領域
に亘って機能することが見出されている。このバリアの
基礎は、脳内の毛細血管の内皮細胞中に具体化されてい
るように思える。
BBBは固定したバリアではない。これは、機械的損
傷、脳塞栓症、高炭酸ガス症、低酸素症、広範なストレ
ス、照射電気痙攣ショック、爆発的な減圧、および種々
の毒性物質に加えて、脳の代謝的要求によって影響され
得る。これら全ての条件がこのバリアの透過性を変化さ
せ、引き続いて細胞外液の組成を変化させる。
種々の物質が受動拡散、或いはより頻繁には担体に媒
介された輸送もしくは能動輸送によって、はBBBを横切
って輸送される。しかしながら移動は制限され、毛細血
管壁を横切る水の移動でさえも制限される。従って、本
発明の抗体、免疫学的な反応性複合体およびキメラポリ
ペップチドは、BBBを横切る輸送を容易にすることがで
きる受容体に結合する、受容体結合性リガンドを具備す
る。
薬剤を細胞に配薬する上記方法の実施において、細胞
は脳細胞であり、成長因子、即ちインスリン様成長因子
１インスリン様成長因子２、インスリン、トランスフェ
リンは、受容体と結合すると、前記抗体、免疫学的な反
応性複合体、またはキメラポリペプチドの脳−血液関門
を横切った輸送をもたらす。
更に、上記方法において、脳細胞は異常で且つ進行し
た痴呆を伴っており、キメラ抗体、免疫学的反応性複合
体またはキメラポリペプチドは、該細胞をこの進行性痴
呆を停止させるために有効な量の抗体、免疫学的反応性
複合体またはキメラポリペプチドに接触させる。
ここで用いる「進行性痴呆」は、知的な機能、論理、
力および記憶が徐々に劣化すること又は喪失することと
して定義される。或いは、脳細胞は異常で大脳皮質萎縮
を伴ない、前記キメラ抗体、免疫学的反応性複合体また
はキメラポリペプチドとの接触は、該細胞を、この大脳
皮質萎縮を停止させるために有効な量の抗体、免疫学的
反応性複合体またはキメラポリペプチドに接触させるこ
とを具備する。
ここで用いる「大脳皮質萎縮」は、典型的にはアルツ
ハイマー病に特有の症状である。
他の態様において、脳細胞は悪性で且つ神経肉腫を伴
っており、前記キメラ抗体、免疫学的反応性複合体また
はキメラポリペプチドとの接触は、該細胞を、この神経
肉腫を停止させるために有効な量の抗体、免疫学的反応
性複合体またはキメラポリペプチドに接触させることを
具備する。
更に、別の態様において、脳細胞は悪性で癌を伴って
おり、前記キメラ抗体、免疫学的反応性複合体またはキ
メラポリペプチドとの接触は、該細胞を、この癌を停止
させるために有効な量の抗体、免疫学的反応性複合体ま
たはキメラポリペプチドに接触させることを具備する。
或いは、もう一つの態様において、脳細胞は悪性で癌
肉腫を伴っており、前記キメラ抗体、免疫学的反応性複
合体またはキメラポリペプチドとの接触は、該細胞を、
この癌肉腫を停止させるために有効な量の抗体、免疫学
的反応性複合体またはキメラポリペプチドに接触させる
ことを具備する。
更に、本発明の実施に従えば、脳細胞は悪性で肉腫を
伴っており、前記キメラ抗体、免疫学的反応性複合体ま
たはキメラポリペプチドとの接触は、該細胞を、この肉
腫を停止させるために有効な量の抗体、免疫学的反応性
複合体またはキメラポリペプチドに接触させることを具
備する。
更に、脳細胞は悪性で且つ癌性小脳変性を伴ってお
り、前記キメラ抗体、免疫学的反応性複合体またはキメ
ラポリペプチドとの接触は、該細胞を、この癌性小脳変
性を停止させるために有効な量の抗体、免疫学的反応性
複合体またはキメラポリペプチドに接触させることを具
備する。
加えて、薬剤を細胞に配薬する上記方法の実施におい
て、細胞は血液細胞、筋細胞、神経細胞、骨細胞及び表
皮細胞からなる群から選択されるが、これに限定される
ものではない。更に、上記方法に従えば、細胞は悪性で
且つメラノーマを伴っており、前記キメラ抗体、免疫学
的反応性複合体またはキメラポリペプチドとの接触は、
該細胞を、このメラノーマを停止させるために有効な量
の抗体、免疫学的反応性複合体またはキメラポリペプチ
ドに接触させることを具備する。
或いは、上記方法に従えば、細胞は悪性で且つ乳癌を
伴っており、前記キメラ抗体、免疫学的反応性複合体ま
たはキメラポリペプチドとの接触は、該細胞を、この乳
癌を停止させるために有効な量の抗体、免疫学的反応性
複合体またはキメラポリペプチドに接触させることを具
備する。更に、細胞は悪性で且つリンパ腫を伴ってお
り、前記キメラ抗体、免疫学的反応性複合体またはキメ
ラポリペプチドとの接触は、該細胞を、このリンパ腫を
停止させるために有効な量の抗体、免疫学的反応性複合
体またはキメラポリペプチドに接触させることを具備す
る。また、上記方法に従えば、細胞は悪性で且つ癌を伴
っており、前記キメラ抗体、免疫学的反応性複合体また
はキメラポリペプチドとの接触は、該細胞を、この癌を
停止させるために有効な量の抗体、免疫学的反応性複合
体またはキメラポリペプチドに接触させることを具備す
る。加えて、上記方法に従えば、細胞は悪性で且つ肉腫
を伴っており、前記キメラ抗体、免疫学的反応性複合体
またはキメラポリペプチドとの接触は、該細胞を、この
肉腫を停止させるために有効な量の抗体、免疫学的反応
性複合体またはキメラポリペプチドに接触させることを
具備する。
本発明は更に、その表面に成長因子のための受容体を
有する細胞を検出する方法を提供する。この方法は、該
細胞を、検出可能な成分が結合されている本発明のキメ
ラモノクローナル抗体、免疫学的反応性複合体またはキ
メラポリペプチドと接触させることを具備している。こ
こで該抗体、免疫学的反応性複合体またはキメラポリペ
プチドの受容体結合性リガンドは、前記抗体、免疫学的
反応性複合体またはキメラポリペプチドが該細胞に結合
し、これにより該細胞が検出されるように、受容体に結
合する成長因子を具備する。
成長因子のための受容体を表面に有する細胞を検出す
る上記方法の一つの態様において、該細胞は脳細胞であ
り、また成長因子の受容体への結合によって生じるの
は、抗体、免疫学的反応性複合体またはキメラポリペプ
チドの脳−血管関門を横切る輸送である。適切な成長因
子の例は、インスリン様成長因子１、インスリン様成長
因子２、インスリン及びトランスフェリンからなる群か
ら選択される。
更に、本発明の実施に従えば、脳細胞は異常で且つ銀
親和性プラークを伴っており、前記キメラ抗体、免疫学
的反応性複合体またはキメラポリペプチドとの接触は、
該細胞を、このプラークを検出するために有効な量の抗
体、免疫学的反応性複合体またはキメラポリペプチドに
接触させることを具備する。
或いは、脳細胞は異常で且つ脳腫瘍を伴っており、前
記キメラ抗体、免疫学的反応性複合体またはキメラポリ
ペプチドとの接触は、該細胞を、この腫瘍を検出するた
めに有効な量の抗体、免疫学的反応性複合体またはキメ
ラポリペプチドに接触させることを具備する。
この検出は、前記検出可能な成分の特性（たとえ周知
でないにしても）に依存する方法を用いて達成されるこ
とが、当業者には明らかであろう。例えば、検出可能な
成分が放射活能を有していれば、液体シンチレーション
カウンタが用いられる。或いは、放射活性ラベルは、未
反応の検出可能な抗体を分離した後、放射能崩壊を検出
するオートラジオグラフィー又は他の方法によって検出
される。更に、該成分が酵素、例えば標準的な検定にお
ける西洋ワサビパーオキシダーゼであるときは、スペク
トロフォトメータが用いられる。更に、該成分が蛍光物
質であるときはフルオロメータ、例えば蛍光活性化細胞
分類（fluorescence activated cell sorting）が用い
られる。
加えて、本発明は二つの異なったポリペプチドの夫々
の二つの分子を具備し、その短い方は抗体の軽鎖として
機能し、長い抗体の重鎖として機能する、修飾されたキ
メラモノクローナル抗体を提供する。重鎖として機能す
る夫々のポリペプチドは、第一の哺乳動物に特有の可変
領域および第二の哺乳動物に特有の定常領域を有する。
更に、軽鎖として機能する夫々のポリペプチドは、哺乳
動物に特有の可変領域および哺乳動物に特有の定常領域
を有しており、抗体の重鎖として機能する夫々のポリペ
プチドの定常領域の端部に、受容体結合性リガンドが共
有結合的に結合している。
更に、もう一つの免疫学的反応性複合体が提供され
る。この複合体は二つの異なったポリペプチドを具備
し、その短い方は軽鎖として機能し、長い方は重鎖とし
て機能する。重鎖として機能するポリペプチドは、第一
の哺乳動物に特有の可変領域および第二の哺乳動物に特
有の定常領域を有し、また軽鎖として機能するポリペプ
チドは、哺乳動物に特有の可変領域および第二の哺乳動
物に特有の定常領域を有する。ここで、一つのポリペプ
チドの定常領域の端部には受容体結合性リガンドが共有
結合的に結合している。
本発明はまた、抗体の軽鎖として機能することができ
るキメラポリペプチドを提供する。このキメラポリペプ
チドは、第一の哺乳動物に特有の可変領域および第二の
哺乳動物に特有の定常領域を具備しており、この一つの
ポリペプチドの定常領域の端部には、受容体結合性リガ
ンドが共有結合的に結合している。
更にまた、抗体の重鎖として機能することができるキ
メラポリペプチドも本発明の範囲内に含まれる。このポ
リペプチドは、第一の哺乳動物に特有の可変領域および
第二の哺乳動物に特有の定常領域を具備し、該ポリペプ
チドの定常領域に受容体結合性リガンドが共有結合的に
結合している。
上記抗体、免疫学的反応性複合体またはキメラポリペ
プチドのBBBの通過を必要とする能内の異常細胞および
感染の治療に加えて、主題のキメラモノクローナル抗
体、免疫学的反応性複合体またはキメラポリペプチド
は、身体の他の全ての部位における異常細胞または感染
細胞の治療にも重要である。例えば、共有結合的に結合
した代謝詰抗剤を有し又は有しない主題のキメラモノク
ローナル抗体は、白血病、リンパ腫、カルチノーマ、腺
腫およびミエローマのように、それが身体の何れの部分
に存在するものであっても、全ての形の癌の治療に有用
である。
この発明は、以下に記載する実験の詳細を記載したセ
クションにおいて例示される。このセクションは本発明
の理解を助けるために提示されるものであり、如何なる
意味においても、後記の請求の範囲に提示される発明を
限定することを意図するものではなく、またそのように
解釈されてはならない。
〔実験の詳細〕
材料および方法 細胞ライン： 表面にIGF1受容体を発現しているヒトリンパ芽球のIM
−９（51）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クションから入手し、これを10％ウシ胎児血清を含むRP
MI1640培地（Hyclone,Logan,UT）内で維持した。表面に
成長因子受容体を発現するヒト表皮癌のKB（37）および
ミエローマ細胞、即ちP3X63Ag8.653細胞を、10％ウシ血
清（Hyclone）を含有するイスコバールの改変ダルベッ
コ培地（IMDM,GIBCO,Grand Island,NY）中で培養した。
得られたモノクローナル抗体の特徴付け 頸動脈注射技術：ジャーナル・オブ・クリニカル・イン
ベスティゲーション74;745−752,1984に基づく 35S−テスト化合物および3HOH（自由に拡散し得る内
部標準）を、成体ラット（２−３ラット、雄、スプラー
グ−ドーリー系;200−300グラム）及びウサギの一般頸
動脈に注射する。注射の15分後に、ラット（またはウサ
ギ）を断頭する。二重アイソトープ液体モデルシステム
の前に、1.5mlのSoluen−350中で、注射溶液および注射
と同じ側にある半球のサンプルを２倍に可溶化する。同
様のプロトコールをウサギに用いる。
大脳脊髄液（CSF）の採取：エンドクリノロジー133
（６）:2299−2301,1983に基づく システルナ・マグナからCSFのサンプルを採取する。
数匹の動物（ラット及びウサギ）を麻酔し、テーブルの
表面から略15cm上に持ち上げられたイヤーバー（ear ba
rs）を有するコプフの定位脳手術装置（Kopf stereotax
ic apparatus）の中に置く。動物の頭が最大限に腹部に
屈曲（ventroflexed）するように、切り込みバーを最低
部位におく。PE−10管に接続された30ゲージの針を電極
キャリア上に水平に載置し、該針を首の中央線に向け
る。該針を後部首筋から6.3ないし6.8cm（動物の大きさ
及びストレインに応じて）下げることによって、システ
ルナ・マグナの背から腹部側への位置（dorsal ventral
location）を決定する。前記管の先端に付設された1.0
mlのシリンジを介して僅かに吸引しながら、皮膚の切り
込みを通して、また背首筋肉を通して針を進める。針が
環椎後頭骨膜を貫通し、システルナ・マグナに接近した
とき、CSFの流出が始まる。シリンジを取り外し、重力
排出によってサンプルをマイクロッピペット中に採取す
る。30分の間に、50〜200μｌのサンプルを採取する。C
SFサンプリング手順を完了した時点で、尾部毛細血管叢
から1.0mlの血液サンプルを採取する。この手順に続い
て、動物を致死させる。脳−血液関門のトランスサイト
ーシス及び組換分子の最終位置の決定に関する実験にお
いては、数匹の動物のみが必要とされる（４−６）。
血清半減期の決定 尾静脈を通して、35S−ラベルされたキメラ抗体を静
脈注射する。ヘパリン化された50〜100μｌのキャピラ
リーピペットで、後部眼窩洞から周期的にマウスを出血
させる。この手順の後、マウスを致死させ、35S−ラベ
ルされたキメラ抗体の存在を検定する。
表皮細胞の単離 麻酔された１月齢のスプラーグ・ドーリー系ラット
（２−３匹）またはウサギ（１匹）を断頭した後、採取
した大脳皮質を切り刻み、ホモジェナイズして内皮細胞
を単離する。
最終的な局在化の決定 頸動脈注射技術のセクションで説明したように、精製
されたキメラ融合タンパクを対象、即ちラットまたはウ
サギの一般頸動脈中に注射する。対象を断頭する。該キ
メラ融合タンパクの存在について、脳および器官組織検
体の試験を行なう。
麻酔 痛み／不快感を和らげるために、ケタミン（45mg/k
g）及びキシラジン（88mg/kg）をウサギに投与する。ケ
タミン（87mg/kg）及びキシラジン（13mg/kg）をラット
に投与する。心泊および呼吸速度、並びに神経反射およ
び粘膜の色をチェックし、麻酔の成功を確認する。
上首尾の安楽死 安楽死させるために、ラットには二酸化炭素を用い、
ウサギにはナトリウムペントバルビタール（100mg/kg）
を用いる。マウスはエーテル麻酔の後に、大脳脱臼によ
って致死させる。安楽死が成功したことを確認するため
に、心泊をモニターする。
例 １ 改良された機能特性を有する抗体分子を創製するため
に、抗体の定常領域を成長因子で置き換えた。マウス／
ヒト・キメラIgG3抗ダンシル抗体由来のVH、CH1、ヒン
ジ、及びCH2の最初のアミノ酸を、ラットインスリン様
成長因子１（IGF1）をコードするcDNAに対して、該IGF1
のリーダー配列の３′に直接結合した。このキメラ重鎖
は、抗ダンシル特異性キメラκ軽鎖と共に、免疫グロブ
リン非産生ミエローマP3X63Ag8.653中に導入された。こ
の免疫グロブリン／非免疫グロブリンIgG3−IGF1キメラ
タンパクが効率的に産生され、排出された（30μg/106
細胞/24時間まで）。このIgG3−IGF1キメラタンパク
は、親和性の減少にもかかわらず、ダンシル抗原に対す
る特異性を保持し、ヒトリンパ芽球IM−９のIGF1受容体
に結合する。このキメラタンパクは、ヒト表皮カルチノ
ーマKB細胞において、ヒトIGF1と同じ幾つかの生物学的
効果を誘導したが、特異的活性は減少した。
親和性及び生物学的活性の減少は、次の三つの原因に
よるものであろう。即ち、（１）未加工のIGF1成分が存
在すること、（２）IGF1の大きさ（7KDa）に比較して、
IgG3−IGF1キメラタンパクの寸法が大きいこと（160KD
a）、並びに（３）ラットIGF1における三つのアミノ酸
の置換は、ヒトIGF1に比較して、ヒトIGF1受容体に対す
る親和性の減少を導くであろうことである。該キメラタ
ンパクは、モル当たりでは未加工のIGF2より効果は小さ
いが、それでも適当な結合特異性を示し、IGF1に伴う生
物学的効果を誘導する能力を示す；従って、成長因子受
容体に対してターゲッティングされる免疫療法剤分子の
新しいファミリーを例示する。
IgG3−IGF1キメラタンパクの構築及び特徴付け 部位指向性の変異誘発によって、マウス／ヒトIgG3重
鎖遺伝子（72）のCH2ドメインの５′位およびラットIGF
1・cDNAのリーダー配列の３′位に、独特の制限酵素部
位（Pvu II）導入された。IGF1及びIgG3は、Pvu II部位
を用いて結合された。このキメラIgG3−IGF1重鎖遺伝子
およびキメラκ軽鎖遺伝子は、プロトプラスト融合（4
5,58）によって、P3X63Ag8.653中に同時に形質転換され
た。次いで、形質転換された細胞は1.0mg/mlのG418（GI
BCO）を用いて選択され、酵素結合免疫吸着検定（ELIS
A）により、該キメラタンパクを産生するトランスフェ
クトーマがスクリーニングされた（58）。35S−メチオ
ニン（アメルシャム社、アーリントンハイツ、イリノイ
州）で生合成的にラベルされたIgG3−IGF1キメラタンパ
クは、２−メルカプトエタノール（コダック社、ロチェ
スター、ニューヨーク）を含み又は含まないドデシル硫
酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS
−PAGE）によって分析された。このIgG3−IGF1キメラタ
ンパクは、先に説明したアフィニティークロマトグラフ
ィー（40）によって精製された。IgG3−IGF1キメラタン
パクの純度は、銀染色ゲル（41）および高速液体クロマ
トグラフィー（FPLC、ファルマシア社、ピスカッタウエ
イ、ニュージャージー州）によって測定された。
受容体結合試験： IM−９細胞は、120mM NaCl,5mM KCl,1.2mM MgSO4,15m
Mグルコース及び１％BASを含有する100mM HEPES緩衝
液、pH7.5（HEPES−BSA緩衝液）で２回洗浄され、HEPES
−BSA緩衝液に再懸濁され、室温で１時間インキュベー
トされた（36）。細胞をカウントし、４−６×107細胞/
mlの濃度で再懸濁した。この細胞懸濁液の50μｌ部分
（２−３×106細胞）を取り出し、アムジェン社（Thous
and Oaks,CA）から購入した50μｌのヒトIGF1、IgG3−I
GF1、IgG3または緩衝液、および１μｌの125I−IGF1
（アメルシャム社;2mlのリン酸緩衝生理食塩水中に、2.
5μCiの125I−IGF1を含有する）を含有する100μｌの緩
衝液と共に、回転しながら室温で２時間インキュベート
した。全てのサンプルを２倍にした。細胞は、ミクロ遠
心分離機中で10秒間遠心分離することによりペレット化
された。100μｌの上清（合計200μｌ）を未結合（Ｓ）
のカウントのために保存し、ペレット（Ｐ）を0.5mlの
氷冷したPBSで洗浄してγカウンタ（ベックマン社、ガ
ンマ5500、フレルトン、CA）中でカウントした。結合し
た方のカウントは、合計カウント（2S＋Ｐ）で除するこ
とにより正規化した。パーセント阻止を次の式に従って
計算した。
［１−P/（2S＋Ｐ）/C］×100％ ここで、Ｃは詰抗剤の不存在下での結合カウントであ
る。
α−［１−14C］−アミノイソ酪酸（AIB）および２−デ
オキシ−Ｄ−［１−14C］グルコース（２−DG）の取り
込みの測定： KB細胞（５×105細胞/ml）が、24ウエルのプレート
（FALCON社、リンパーンパーク、ニュジャジー州）内で
コンフルーエント（集密）になるまで増殖され、IMDMで
３回洗浄された。血清を含み又は含まないIMDMと共に37
℃で一晩インキュベートした後、細胞をHEPES−BSA緩衝
液で洗浄し、同じ緩衝液100μｌを添加した。グルコー
スを含有しないHEPES−BSA緩衝液が、２−DG取り込みの
ために用いられた。種々の濃度の試験サンプル（IGF1、
IgG3−IGF1またはIgG3）の100μｌを夫々のウエルに添
加し、37℃で６時間インキュベートした。インキュベー
トした後、24μＭの14C−AIB（デュポン社、ボストン、
MA）または15μＭの14C−DG（アメルシャム社）を夫々
のウエルに添加した（２）。37℃で15分間インキュベエ
ートした後、プレートを氷冷PBSで迅速に洗浄し、300μ
ｌの1N−NaOHで溶解した。アリコートを14Cについてカ
ウントし、BCAプロトコール（Pierce Chemical Co.,Roc
kford,IL）によって測定された合計タンパク量に対して
正規化した。
結果 ヒトIgG3及びラットインスリン様因子１（IGF1）間のハ
イブリッド遺伝子の構築 得られる分子が抗体および成長因子受容体の両者に結
合する能力を保持するように、成長因子に結合する抗体
結合部位を製造するために実験が企画された。初めの構
築のために、ラットのインスリン様成長因子１（IGF1）
が成長因子として選択された。IGF1前駆体（130アミノ
酸タンパク）から、そのリーダーペプチド及びそのカル
ボキシ末端の両方のタンパク分解プロセッシングを通し
て、成熟IGF1（70アミノ酸タンパク）が形成される。リ
ーダーペプチドが開裂される部位のアミノ酸は、Ig分子
に結合するために便利な部位である。好ましくは、該Ig
分子は62アミノ酸の延出したヒンジ領域を有するヒトIg
G3である。更に、IGF1はヒトIgG3のヒンジ領域に対して
離間して配置され、抗原および受容体の同時結合を容易
にするスペースが設けられる。
融合遺伝子の構築を容易にするために、ラットIGF1・
cDNAのリーダー配列の５′末端での部位指向性変異によ
って、独特の制限部位（Pvu II）が作られた（図1A）。
これらの変異はシーケンシングによって確認された。CH
1、ヒンジおよびCH2エキソンの４塩基対を含むヒトIgG3
遺伝子が、リーダー配列の２塩基対、エキソン２、エキ
ソン３及びエキソン５を含むIGF1遺伝子に連結された。
キメラ定常領域遺伝子は、ヒトIgG3/IGF1キメラ定常領
域遺伝子を、形質転換ベクターpSV2Δgpt中にクローン
化されたマウス抗ダンシル（DNS）可変領域遺伝子に連
結して構築された（図1B）。ダンシルに特異的なマウス
／ヒトκ軽鎖はpSV184ΔHneoの中に含まれる。
IgG3−IGF1融合遺伝子の構築のための戦略は次の通り
である（図1A）。ヒトIgG3におけるＣH２ドメインの第
４番目の塩基（Ｃ）が部位指向性変異によってＧに変異
され、独特のPvu II制限酵素部位の導入がもたらされ
た。加えて、ラットIGF1・cDNAのリーダー配列（LS）の
最後の塩基（Ｃ）をＴ（チミジン）に変えることによっ
て、IGF1に独特のPvu II部位が導入された。Pvu IIで消
化されたヒトIgG3及びラットIGF1・cDNAがライゲートさ
れ、顕著なアミノ酸置換を何等伴うことなく、組み込ま
れたIgG3−IGF1融合遺伝子が得られた。
図1Bは、形質転換ベクター、遺伝子的に加工されたIg
G3−IGF1融合遺伝子および提案されるキメラ抗体を図式
的に表わしている。マウス−ヒトκ軽鎖遺伝子は、pSV1
84ΔHneo中にクローン化された。該pSV184ΔHneoはpACY
C184から誘導されたもので、真核細胞中での選別のため
のSV40初期プロモータ領域（影ボックス）と共に、pACY
C複製起源、E.coli内での選別のためのクロラムフェニ
コール耐性遺伝子（CM′）及びneo遺伝子（付点ボック
ス）を含んでいる。マウス−ヒトIgG3/ラットIGF1重鎖
遺伝子が、pSV2ΔHgpt遺伝子（付点ボックス）中にクロ
ーン化された。当該キメラ遺伝子中のボックスはエキソ
ンを表わす。黒で塗り潰した太い実線およびボックス
は、マウス起源のDNAを表わし、細い実線およびオープ
ンボックスはヒトDNA切片を表わす。重鎖遺伝子中の影
を付したボックスは、ラットIGF1・cDNAを表わす。制限
酵素であるエンドヌクレアーゼ（オープン三角形）、Ba
mH I（オープン円）およびHind III（閉じた円）による
開裂部位が示されている。形質転換された両ベクターの
発現によって製造される該マウス−ヒトIgG3/ラットIGF
1キメラタンパクが、パネルＢの底部に示されている。
該キメラ分子の黒く塗り潰した領域はハプテン・ダンシ
ルに特異的なマウス可変領域ドメインを表わし、オープ
ン領域はヒトκおよびIgG3のＣ領域を表わし、影を付し
た領域はラットIGF1を表わす。
キメラIgG3−IgF1遺伝子のトランスフェクション これら重鎖および軽鎖ベクターをE.coliHB101中へ形
質転換し、両方のベクターを含有するバクテリアを使用
してプロトプラスト融合により非生産性ミエローマ細胞
系（P3X63 Ag8.653）を移入した。あるいは、トランス
フェクションを電気穿孔法または標準的なリン酸カルシ
ウムプレシピテーション法により行なうことができる。
好適なトランスフェクタント細胞（トランスフェクト
ーマ）をG418を用いて選択し、好適なトランスフェクト
ーマを抗ヒトκ鎖抗体を用いた酵素結合免疫吸着アッセ
イ（エリザ）法により抗体蛋白の存在について試験し
た。完全な抗体分子を分泌する77の好適なトランスフェ
クトーマを同定し、皿なる特性決定のために回収した。
所望のトランスフェクトーマの頻度は、1.54×106宿
主ミエローマ細胞であった。これらトランスフェクトー
マは、0.5〜30μｇのキメラ分子106細胞/24時間を分泌
した。免疫グロブリン／非免疫グロブリンキメラ分子の
生産レベルは、野生型キメラ抗体のそれと異ならない。
IgG3−IGF1キメラ蛋白の特性決定 分泌されたIgG3−IGF1キメラ蛋白を35S−メチオニン
で生合成的に標識し、この標識蛋白を、ダンシル−BSA
（ダンシル;5−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホ
ニルクロリド）結合セファロースビーズまたはウサギ抗
ヒトIgGFab抗血清およびIgGSorbを用いたイムノプレシ
ピテーションにより精製した。融合蛋白のダンシル−BS
Aとの反応性は、それらがそれらの抗原と反応する能力
を保持していることを立証した。SDS−PAGE分析（図2A
および2B）は、安定なトランスフェクトーマが新規分子
を生産することを立証した。予想したように、これらキ
メラ分子のサイズは、正常IgG3抗体のそれよりも小さ
い。しかしながら、分泌されたキメラ重鎖は、宿主細胞
がIGF1を成熟IGF1へ部分的に加工するので、サイズが均
質であった。IgG3−IGF1重鎖のカルボキシ末端での不完
全な蛋白分解プロセッシングは、２つの別個の重鎖であ
る加工および未加工の重鎖をもたらす（図2B）。
キメラ分子が集合して新規H2L2抗体分子を生成すると
き、２つの未加工重鎖の集合は、最も高い分子量のキメ
ラ分子をもたらし（図2Aの頂部バンド）、２つの加工重
鎖の集合は、最も低い分子量のキメラ分子をもたらす
（図2Aの底部バンド）。加工および未加工重鎖の集合
は、中間の大きさのキメラ分子をもたらす（図2Aの中間
部バンド）。IgG3−IGF1キメラ蛋白は抗IGF1抗血清によ
り認識され、融合蛋白中のIGF1が天然の形態を取ること
が立証された。
図2Aおよび2Bは、トランスフェクトーマにより分泌さ
れたIgG3−IGF1キメラ蛋白のSDS−PAGE分析を示す。35S
−メチオニンで生合成的に標識した分泌されたIgG3−IG
F1キメラ蛋白を還元性（パネルＡ）および非還元性（パ
ネルＢ）条件下で分析した。標識キメラ蛋白をダンシル
−セファロース（DNS−セファロース：パネルＡの左）
または抗ヒトIgGFab抗血清/StaphA/IgGSorb（パネルＡ
中のHUG/Fab−IgG−Sorb）のいずれかを用いて沈澱させ
た。IgG3−IGF1キメラ蛋白の基本構造である、分泌され
たIgG3キメラ抗体を多少として用いた。非還元性条件
（パネルＡ）の下で、３つのバンドは加工および未加工
キメラ蛋白の均質な集合を示し、還元性条件下で、加工
および未加工キメラ蛋白が見られる（パネルＢ）。
AH−セファロース4Bに結合された２−ジメチルアミノ
ナフタレン−５−スルホニルクロリド（MW269;ダンシル
異性体）を有するアフィニティーカラムを用いてIgG3−
IGF1キメラ蛋白を培養上澄から精製した。結合蛋白をＮ
−５−カルボキシペンチル−２−ジメチルアミノナフタ
レン−５−スルホンアミド（MW364;ダンシル異性体）で
溶出させ、遊離ハプタンを徹底的な透析により除去し
た。濃縮され精製した蛋白は、予想したように、４量体
であり、サイズが均質であった。銀染色ゲル中に他の蛋
白は観察されなかった（図3A）。精製キメラ蛋白をセフ
ァロース−12クロマトグラフィーにより分画したとき、
IgG1キメラ抗体（マウス可変部−ヒトIgG1定常部;M.W.1
46KDa）およびIgG3キメラ抗体（マウス可変部−ヒトIgG
3定常部;M.W.170KDa）の間の広幅ピーク中に均質キメラ
蛋白が溶出した。（IgG3−IGF1）2t2キメラ蛋白のおお
よその分子量は160KDaである。
図3Aは、非還元性条件下でSDS−PAGEにより分画さ
れ、銀染色を用いて可視化された精製IgG3−IGF1融合蛋
白を示す。図3Bは、FPLC（セフェロース−12カラム、流
速:0.25ml/分）を用いて分画された精製IgG3−IGF1キメ
ラ蛋白のクロマトグラムである。IgG3−IGF1キメラ蛋白
の溶出時間は42分である。矢印で示したように、マウス
−ヒトIgG3キメラ抗体（170KDa）の溶出時間は40分であ
り、IgG1キメラ蛋白（146KDa）のそれは45分である。
IgG3−IGF1キメラ蛋白のIGF1レセプターへの結合 融合蛋白の臨界的な属性は、それがIGF1レセプターへ
結合する能力を保持しているかどうかである。これを調
べるために、未標識組換え体ヒトIGF1、野生型キメラIg
G3およびIgG3−IGF1キメラ蛋白を用いて、125I−IGF1の
ヒトリンパ芽球IM−９細胞への結合を阻害した（20）。
IGF1およびIgG3−IGF1の両者は、ドース量に依存して、
125I−IGF1の結合を阻害した（図４）。125I−IGF1結合
50％阻害は2.25×10-9Mの組換え体IGF1濃度および3.15
×10-7MのIgG3−IGF1キメラ蛋白濃度で生じた。それ
故、IgG3−IGF1キメラ蛋白は、125I−IGF1結合を阻害す
る上で、組換え体ヒトIGF1の0.7％有効である。しかし
ながら、野生型キメラIgG3は、2.7×10-6Mもの高い濃度
においてさえ、何等125I−IGF1結合の阻害を示さなかっ
た。従って、キメラ蛋白による競合は、IGF1部分の存在
の結果であった。
図４は、125I−IGF1のIM−９リンパ球への結合の競合
阻害を示すグラフである。約３×10-6IM−９細胞を一定
量の125I−IGF1および指摘した量の未標識競合物（組換
え体IGF1、IgG3−IGF1キメラ蛋白およびIgG3キメラ抗
体）とともに15℃でインキュベートした。２時間のイン
キュベーション後、レセプター結合照射性の量を決定し
た。値は、標識トレーサー125I−IGF1のみを用いた場合
と比較した結合の相対阻害として表現されている。各曲
線についての結果は、２回の実験の平均である。
IgG3−IGF1キメラ蛋白を、ヒト脳内皮細胞の２つの異
なる一次培養、すなわち１つは初期継代（13）、１つ
はより後の継代（22）、への結合性について試験し
た。これら細胞系の両者との匹敵するレベルの結合が観
察された（データ示さず）。IgG3−IGF1キメラ蛋白は、
これら両者の細胞系へ特異的に結合したが、対照蛋白で
あるキメラIgG3は、これら細胞へ結合しない。
ヘキソースおよびアミノ酸取込みのIgG3−IGF1キメラ蛋
白刺激 ヒトエピエデルモイド癌腫KB細胞において、液相エン
ドサイトーシスおよびエキソサイトーシスは、成長ホル
モン（インスリン、インスリン様成長因子１および表皮
成長因子）によって刺激される。これら細胞は、7.5×1
04/細胞のタイプＩ IGFレセプターを有する（13）。そ
れ故、IgG3−IGF1の２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２
−DG）およびα−アミノイソ酪酸（AIB）取込み（11）
を刺激する能力を調べ、IGF1およびIgG3と比較した。Ｋ
細胞における２−DGおよびAIB取込みのIgG3−IGF1キメ
ラ蛋白刺激の投与量−応答関係を図５に示す。半最高有
効濃度に基づき、IGF1とIgG3−IGF1の相対効力は、AIB
取込みについては200:1であり、２−DG取込みについて
は25〜100:1であった。IgG3単独は、KB細胞による２−D
GおよびAIB取込みに影響を与えなかった。従って、キメ
ラ蛋白は、予期された生物学的効果を発揮するが、ヒト
IGF1標準よりも効力が低い。
図５は、IGF1とIgG3−IGF1との間の関係大微κＢ細胞
におけるそれらのAIBおよび２−DG取込みに及ぼす刺激
効果を示す。AIB（パネルＡ）および２−DG（パネル
Ｂ）取込みは、種々の濃度のIGF1、IgG3−IGF1、および
対照としてのIgG3の存在下で決定した。
論考 研究者が単一クローン抗体を免疫療法剤として使用す
ることを試みるときに、多くの問題に遭遇する。これら
問題の中に、正常細胞には触れず、かつ生体内の制限さ
れた部位例えば脳、リンパ、肝臓、腎臓、肺、副腎、皮
膚、および膵臓に対するアクセスを得ながら、抗体を効
率的に腫瘍細胞に指向させることがある。すなわち、本
キメラ単一クローン抗体は、これら問題を克服するため
に構築されたものである。キメラ蛋白はダンシル特異性
キメラ軽鎖とともに共移入させ、効率的に生成され、宿
主非生産性マウスミエローマ中でIgG3−IGF1キメラ蛋白
を（30μg/106細胞/24時間まで）分泌した。すなわち、
これら組換え体分子の高レベル発現は可能である。
この実施例において、抗体の定常部を成長因子例えば
インスリン、IGF1、IGF2およびトランスフェリンと置き
換えた。キメラマウス／ヒトIgG3抗ダンシル抗体由来の
VH、CH1、ヒンジおよびCH2の最初のアミノ酸を、ラット
インスリン様成長因子１（IGF1）をコードするcDNAに、
IGF1のリーダー配列の3'に直接結合させた。キメラ重鎖
を、抗ダンシル特異性キメラκ軽鎖とともに、免疫グロ
ブリン非生産性ミエローマP3X63Ag8.653中へ導入した。
免疫グロブリン／非免疫グロブリンIgG3−IGF1キメラ蛋
白が効率的に生成し、分泌された（30μg/106細胞/24時
間まで）。IgG3−IGF1キメラ蛋白は、抗原ダンシルに対
するその特異性を保持し、減少した親和性を有するにも
拘らず、ヒトリンパ芽球IM−９のIGF1レセプターへ結合
する。キメラ蛋白は、ヒトエピデルモイド癌腫KB細胞に
おいてヒトIGF1と同じバイオ的効果のいくつか（向上し
たグルコースおよびアミノ酸取込み）を示したが、特異
的活性が減少していた。
減少した親和性およびバイオ活性は、（１）未加工IG
F1部位の存在、（２）IGF1（7KDa）と比べて大きなサイ
ズのIgG3−IGF1キメラ蛋白（160KDa）および（３）ヒト
IGF1レセプターに対する低下した親和性に至り得るころ
の、ヒトIGF1に比べラットIGF1中の３つのアミノ酸置換
から由来し得る。キメラ蛋白は、そのままのIGF2よりも
モルベースで効果的でないが、それらは適切な結合特異
性およびIGF1に付随するバイオ的効果を発揮する能力を
示し、成長因子レセプターへ指向する新しい科の免疫療
法分子を立証している。
この新規IgG3−IGF1キメラ蛋白は、抗原ダンシルに対
する特異性、減少した親和性をもってIGF1屁結合する能
力、およびレセプター結合のバイオ的効果のいくつかを
発揮する能力を保持している。減少した、レセプターに
対する親和性およびバイオ活性は、（１）IgG3−IGF1の
均質集団の結果となる未加工IGF1部位の存在、（２）IG
F1への減少したアクセス可能性および減少した結合親和
性にいたる、IGF1（7KDa）と比べて大きなサイズのIgG3
−IGF1キメラ蛋白（160KDa）および（３）ヒトIGF1レセ
プターに対するより低い親和性に至り得るころの、ヒト
IGF1に比べラットIGF1中の３つのアミノ酸置換から由来
し得る。
減少したレセプターに対する親和性およびバイオ活性
が未加工IGF1部位の存在から結果するかどうかを決定す
るに当り、停止コドンが成熟蛋白の末端に導入された第
２世代の蛋白を作る。また、大きさが減少したサイズの
Fab−IGF1キメラを創製することは、減少し対レセプタ
ー親和性およびバイオ活性が、IGF1（7KDa）に比べてIg
G3−IGF1キメラ蛋白の大きなサイズ（160KDa）に由来す
るかどうかの決定を容易にする。さらに、ヒトIGF1に比
べてラット中の３のアミノ酸の部位特異的突然変異誘発
による改変は、減少した親和性が３つのアミノ酸置換か
らのものであるかどうかの決定を容易にする。
IGF1の柔軟性およびアクセス可能性は、またキメラ蛋
白において重要な役割をなす。IGF1部位をヒトIgG3の拡
大ヒンジのカルボキシ末端近くに配置した。IgG3は最も
柔軟なヒトIgGである（61）。従って、この柔軟性は、I
GF1レセプターおよび抗体を同時に結合する能力を最適
化する。しかしながら、ヒンジの直カルボキシ末端のIG
F1の位置は、IGF1分子を互いに接触させ、それらの結合
を妨害した。これら分子は、IGF1をCN2中のβ−ストラ
ンド上ヒンジに対してより先端に配置することによって
改良された（９）。CN2領域は、通常、互いに接触しな
いので、このことは、２つのIGF1部位を互いにある距離
をもって配置することとなり、それによりそれらの結合
効率を向上させる。
正常脳中のBBBは、ある種の分子特に水溶性で荷電さ
れ、数百ダルトンよりも大きな分子の、血液と中枢神経
系との間の輸送を効率的に制限する（56）。IgG3−IGF1
キメラ蛋白は、IGF1レセプターおよびヒト脳内皮細胞に
特異的に結合する（図11）。図11は、線グラフであり、
Ｘ軸は注入後の時間単位の時間であり、Ｙ軸はIgG3−IG
F1キメラ構成物の％注入量である。図11は、ラット動物
モデルに注入後IgG3−IGF1構成物が、キャピラリーペレ
ットと比較して、脳実質細胞中に見いだされ、存続して
いたことを示している。従って、このキメラ構成物は、
BBBを横切った。
実施例 ２ A.方法 キメラ融合遺伝子の構築 結合特異性、レセプター担持細胞を目指す成長因子お
よび免疫エフェクター機能を１分子中に有する抗体分
子、および二機能性結合特異性を有する抗体分子は、悪
性細胞に対するターゲティング療法に向けられた多機能
性キメラ抗体の科に属する。
多機能性キメラ抗体の科を作るための好適なプロトコ
ールは、 a.高い結合親和性という利点を有するダンシル（DNS）
特異性ハイブリドーマから可変部を有する抗体を作る。
あるいは、抗腫瘍特異性を有する抗デキストラン可変
（Ｖ）部もしくは領域を使用する。
b.DNS−セファリンを真核細胞の細胞膜へ導入して細胞
表面マーカーをシミュレートする（８）。
c.それぞれ高親和性Fcレセプターを結合し、補体を活性
化するヒトIgG1およびIgG3の定常部を用いる。
d.重鎖のFc部の少なくとも一部の代替としてIGF1、IGF
2、インスリンおよびトランスフェリンを用いる（実施
例１参照）。
e.IGF1およびインスリンを抗DNSもしくは抗腫瘍キメラI
gG3中に置換させて、 ＶDNS/抗腫瘍特異性−CN1−ヒンジ−IGF ＶDNS/抗腫瘍特異性−CN1−ヒンジ−インスリン を生産する。
好ましくは、免疫グロブリンシーケンスのためにIgG3
を使用する。その拡大されたヒンジ部が当該分子により
大きな柔軟性をもたらし、成長因子のそのレセプターへ
の結合を容易にするからである。
ヒトエフェクター機能を漸増させ得る分子は、 ＶDNS/抗腫瘍特異性−CN1−ヒンジ−CN2−リガンド ＶDNS/抗腫瘍特異性−CN1−ヒンジ−CN2CN3−リガンド である。
CN2は、高親和性FcレセプターのためのおよびClqのた
めの結合部位を含んでいる。
遺伝子トランスフェクション オイおよびモリソン（45）によって開発された変性ト
ランスフェクションベクターを使用した。再構成キメラ
Ig/レセプターリガンド遺伝子をpSVgptの誘導体である
トランスフェクションベクター（pSV2ΔHgpt）に挿入す
る。pSV2ΔHgptは、pBR322複製起点を含み、E.coli中で
の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子および真核細胞
中での選択のためのgpt遺伝子を有する。
マウス／ヒト軽鎖キメラ遺伝子をpACYC184プラスミド
の誘導体である軽鎖ベクター（pSV184ΔHneo）であって
pACYC複製起点、E.coli中での選択のためのクロラムフ
ェニコール耐性遺伝子および真核細胞中での選択のため
のneo遺伝子を含有するものへクローン化させる。
これらプラスミドをE.coli中へ形質転換させる。クロ
ラムフェニコールおよびアンピシリンを有する所望のバ
クテリアを選択し、選択したバクテリアを、プロトプラ
スト融合（39、58）により、非生産性ミエローマ細胞と
融合させる。あるいは、電気穿孔法またはリン酸カルシ
ウム沈降法を用いてDNAをミエローマ細胞に導入する（3
9、58）。選択可能な薬マーカーを用いて安定なトラン
スフェクトーマを単離する。抗原ダンシル、抗イディオ
タイプ抗体、ヒトκ鎖または抗リガンド抗体のいずれか
を用いたエリザにより安定なトランスフェクトーマの培
養上澄をスクリーニングしてキメラ抗体を高レベルで分
泌するクローンを同定する。
トランスフェクトーマの分析 キメラ遺伝子の発現は、mRNAが安定であり翻訳され、
かつ蛋白生成物が細胞を通して適切に処理され、細胞質
もしくは媒質中で劣化されることなく分泌されるよう
に、効率的な転写、適切なRNA処理および核からの取り
だしを必要とする。
移入された遺伝子の発現を調べるために、移入された
遺伝子の種々の領域に特異的なプローブ（マウスVNプロ
ーブ、ヒトIgG3CN1プローブ、およびリガンドプロー
ブ）を用いたノーザンブロットで、安定なトランスフェ
クトーマからの全RNAを分析する。
さらに、細胞質性の分泌されたキメラ蛋白を分析する
ために、選択されたトランスフェクトーマを35S−メチ
オニンで標識し、その後、標識された蛋白を、ダンシル
結合ビーズ、抗イディオタイプ抗体結合ビーズ、または
抗リガンド抗体結合ビーズを用いたイムノプレシピテー
ションにより精製する。
これら沈降蛋白を、還元性および非還元性条件下でSD
S−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分析す
る。培養上澄または腫瘍担持マウスのいずれかからの多
量の蛋白を単離する。トランスフェクトーマが腫瘍化性
のままであるかどうかを決定する。
キメラ融合細胞の特性決定 a.Fcレセプター結合の決定。ハプテン−酵素結合アッセ
イにおいて抗ダンシルキメラ融合分子を用いる（40）。
簡単に述べると、これは次のことを含む：抗体がFcレセ
プターへ結合するに充分な時間保持した後、種々の濃度
で、キメラ融合分子を、高親和性Fcレセプターを担持す
るヒト単球様細胞系U937とともにインキュベートする。
細胞を洗浄する。細胞を、Ｂ−ガラクトシダーゼと結合
したダンシルとともにインキュベートする。抗原−抗体
反応を平衡に達せさせ、蔗糖パッドを通して細胞を遠心
することにより未結合抗原を除去する。細胞を基質ｏ−
ニトロフェニルガラクトシドとともにインキュベートし
た後、分光光度的に結合IgG−β−Ga1の量を決定し、42
0nmでの吸光度を測定する。スカッチャード分析を用い
て、Fcレセプターについての抗体の見かけの結合および
細胞当りのレセプター数を決定する。ダンシルに結合特
異性のないキメラ蛋白をヨウ素標識し、直接結合を決定
するか、組換え体蛋白が結合を阻止する能力をアッセイ
する。
b.補体（C'）活性化。抗ダンシルキメラに対する抗体と
して、BSAに結合したダンシル、または異なる特異性の
キメラに対する適切な抗原を用いて補体活性化をオイら
（44）に従ってアッセイする。力価を測定したモルモッ
ト補体、固定量のキメラ融合分子（Ab）および連続的に
希釈したダンシル−BSAをＵ底マイクロタイターウェル
中で混合する。混合物をインキュベートする。インキュ
ベート後、溶血素感作51Cr放射性標識赤血球を混合物に
加え、インキュベーションを続け、未溶解赤血球をペレ
ット化する。上澄を集め、放射性をシンチレーションカ
ウンター中でカウントする。補体消費は、 ［１−（Ag＋Ab＋Ｃ′）のcpm/（Ab＋Ｃ′）のcpm］×100 として計算される。
c.Clq結合アッセイ。柔軟なマイクロタイタープレート
をダンシル−BSAでコートし、ついで、抗ダンシルキメ
ラ融合分子の飽和量とともにインキュベートする。異な
る特異性を有する抗体に対して、適切な抗原を用いてマ
イクロタイタープレートをコートする。プレートを洗浄
し、いくつかの希釈125I−標識ヒトClqをしてAg−Ab補
体を結合させる。洗浄後、ウェルをプレートから切り出
し、ガンマカウンター中でカウントする（62）。
d.プロテアーゼに対する感受性。キメラ融合分子を種々
のプロテアーゼ例えばパパイン、プロナーゼ、トリプシ
ンまたはペプシンで消化する。消化を種々の時間（４時
間から24時間まで）起こさせる。SDS−PAGEを用いてプ
ロテアーゼ処理キメラ融合分子の消化度を分析し、染色
されたゲルを分光光度計で操作することにより、酵素標
識により放出された色の量を決定する。
e.キメラ融合分子の血清半寿命の決定。免疫グロブリン
／非免疫グロブリンキメラ融合分子がインビボ条件下で
如何に挙動するかを理解するために、免疫グロブリン／
非免疫グロブリン分子とキメラマウス−ヒト免疫グロブ
リン分子との半寿命を比較して、半寿命を決定する際の
定常部の役割を決定する（62）。
精製した放射性キメラ分子をマウスの尾の血管を通し
て血管内注射し、ヘパリン化キャピラリーピペット中に
周期的にマウスを放血させる。35S−メチオニンを用い
て、標識化手法が蛋白の構造を変化させそれによりその
代謝に悪影響を及ぼさないように、蛋白を生合成的に標
識する。血液を厚め、イムノプレシピテーションの前後
で放射生を決定する。各キメラ分子の血清半寿命を計算
する。
特異生抗原担持細胞に対するキメラ融合分子の生物学的
機能の比較 分子がいずれかの生物学的効果、例えば、標的細胞の
抗体依存性細胞媒介細胞障害（ADCC）（57）を発揮する
かどうかを決定するために、標的細胞すなわち、3T3−L
1、IM−９およびＫ−562を、DNS−セファリンを用い
て、DNSハプテンと結合させる（８）。標的細胞を51Cr
クロメートで標識する。健康なドナーからヒト末梢血単
核細胞を得、フィコール−ハイペーク上で遠心すること
によりヒト末梢血単核細胞を準備する。細胞を、自己血
清でコートした組織培養皿に加え、８％CO2−空気の加
湿雰囲気中37℃で90分間インキュベートする。非付着細
胞すなわちリンパ球をプールし、付着細胞すなわち単球
を収穫する。リンパ球および単球懸濁液を、いくつかの
エフェクター：標的細胞比で、DNSと結合／未結合の標
的細胞に加える。懸濁液を遠心する。600×ｇで３分間
の遠心後、バッフィーコートを除去し、これを８％CO2
−空気の加湿雰囲気中37℃で４時間インキュベートす
る。600×ｇで10分間の遠心後、各試料から上澄のアリ
コートを除去し、カウントする。パーセンテージ特異性
51Cr放出を パーセント放出＝100×［（テスト放出）−（自発放出）］ ／［（全放射性）・［（自発放出）］ として計算する。
これら実験は、ADCCに対して細胞にターゲットする上
での多機能性分子の有効性およびより効果的なキメラ蛋
白のための必要な変性を指摘している。
キメラ融合分子の配位子受容体への結合 IGF1インシュリンおよびトランスフェリン受容体は生
体内（64）および生体外（16）の双方で脳血管にて特定
できたので、分離した脳マイクロベッセルをこれら配位
子（16、17、18、49）の結合およびインターナリゼイシ
ョンについてテストするためのモデルシステムとして用
いた。しかし、これらの配位子は非脳細胞についても生
じている。特に培養したヒト芽球細胞株IM−９は多くの
IGF1受容体（52）を示した。脂肪細胞株3T3−LIは多く
のインシュリン受容体（50、53、54）を示し、ヒト慢性
骨髄性白血病細胞株Ｋ−562は多くのトランスフェリン
受容体（63、66）を示した。
15℃で、受容体へのキメラ融合分子の初期結合研究
（16）を培養細胞株（IM−９、3T3−LIおよびK562）お
よび精製放射性キメラ分子でおこなった。受容体に結合
した配位子の少量のみを15℃でインターナリゼイション
をおこなった。非特異的結合を決定するため、非ラベル
配位子の高濃度（100μg/ml）を添加した以外は同様に
反応をおこなった。定期的に少量を取出し、ペレットの
放射性を判定し、ローリ（Lowry）（34）の方法で各ペ
レット中のたんぱく質の量を測定した。競争的置換実験
を精製キメラ分子および非ラベル配位子の適当な希釈で
おこなった。10％TCA中での沈殿により配位子の退化を
モニターした。これらの全ての実験から、キメラ融合分
子の配位子部分のその受容体への特異的結合を分析し
た。
内皮細胞トランスサイトーシスを研究するため、脳内
皮細胞の分離を必要とするとき、最初にマイクロベッセ
ルを作り、ついで内皮細胞を分離する。機械的均質化
（６、48）を用いて、マウス、ラットまたはラビットか
ら脳マイクロベッセルを分離した。これらの標本を必ず
しもトリパンブルーを除外するものではない。これらの
標本は代謝的に活性であり、生体外（３、60）でグルコ
ース、ラクテート、脂肪酸代謝について研究した。内皮
細胞（７、21、29）を培養するため、脳膜および表面血
管からの皮質組織を洗浄し、脳からの皮質組織を小さな
立方体に刻み、これを、0.5％ディスパーゼを含む媒体
中で37℃で３時間培養し、1,000gで１分間、遠心分離す
ることにより内皮細胞を集めた。13％デキストランを含
む媒体中でペレットを懸濁させた。この懸濁液を5,800g
で10分間、遠心分離することによりマイクロベッセルを
他の脳組織から分離した。基底膜およびほとんどの血管
周囲細胞を除去するため、マイクロベッセルをさらに媒
体中でコラーゲナーゼ／デスパーゼで９〜12時間処理し
た。マイクロベッセルを1,000gで20分間ペレット化し、
マイクロベッセルを媒体中で懸濁させ、これを使用まで
液体窒素中に保持させた。マイクロベッセル懸濁物の一
部を250μｍナイロンメッシュで濾過し非消化物質を除
去した。適当な媒体を加えた後、これら細胞の上層を除
去し、残る細胞をペレット化した。このペレットを再び
懸濁させ、30μｍナイロンメッシュで再び濾過した。つ
いで内皮細胞を30μｍナイロンメッシュ内に保持させ
た。この内皮細胞をPBS40ml、Ca1.0mMおよび５％BSAを
収容したプラスチックチューブに集めた。このサンプル
を静置させた。上層の10mlを除去し、残る懸濁物を先進
分離した。この内皮細胞を含むペレットをゼラチン被覆
組織培養プレートとした。これらの一次培養細胞を形態
学的およびファクターVIII抗原に対する陽性反応により
識別した。
結合錯体の処理 37℃で受容体に結合したほとんどの配位子をインター
ナリゼイションさせる。４℃できわめて僅かなインター
ナリゼイションが行われた。精製キメラ融合分子のイン
ターナリゼイション（飲食作用）を、酸洗浄法（18、2
7、46、49）により評価した。培養細胞を精製放射性キ
メラ融合分子の微量を用い37℃で接種し、少量を取出
し、直ちにペレットをカウントし、これをpH3氷冷バル
ビタール緩衝液中にて再懸濁させた。このペレットを酸
洗し、ついで再度カウントし、たんぱく質の量を測定し
た。この酸洗は、結合しているがインターナリゼイショ
ンされていないたんぱく質を除去した。SDS−PAGEによ
り結合され、インターナリゼイションされた双方のたん
ぱく質を分析し、退化が生じているか否かを判定した。
精製キメラ融合分子のインターナリゼイション（飲食
作用）を判定するため、37℃でのインターナリゼイショ
ンの後、これら細胞を非ラベル配位子の存在下で再び培
養し、表面結合キメラ融合分子をインターナリゼイショ
ン化し、またはその受容体から変位させた。これら細胞
の洗浄を繰り返し、非ラベル配位子を含む新鮮な分析緩
衝液に再懸濁させ、再結合を防止し、37℃で培養した。
定期的に少量を取出し、ペレット中のたんぱく質の量を
測定した。SDS−PAGEによりイクターナル化したたんぱ
く質を分析したんぱく質が無傷であるか否かを判定し
た。
マウス、ラットおよびラビットについてのトランスサ
イトーシスを研究するため、（17）ですでに述べた実験
方式を用いた。精製した放射性（35S−メチオニン）キ
メラ分子を頸動脈を介して注射し、15秒後（脳を介して
の単一通過に十分な時間）（17）にこれら動物を断頭し
た。直ちに同側の半球を除去し、針、ホモジナイズし、
溶解し、同時に35Sおよび3Hについて計測した。これら
の結果から脳取込み指数（BUI）を計算した。
麻酔動物のクモ膜下腔または大槽からCSFを取り出
し、同じ動物から心臓破裂により血液を得た。脳キメラ
分子レベルをFrank等の方法（17）により判定した。CSF
および血液におけるキメラ融合分子レベルを、ダンシル
ハプテンまたは抗イディオタイプ抗体を用い、放射免疫
分析により判定した。血清、脳、CSFにおけるBUIおよび
キメラ融合分子のレベルは生体において血液−脳バリア
を介してキメラ分子が通過するか否かの指標となるもの
である。
分離したサブセル（subcellular）目標細胞株のキメラ
融合たんぱく分布分子の判定 キメラ融合分子のサブセル目標部位を知るため、幾つ
かのサブセル区分を分析した。35Sおよび125Iラベルキ
メラ融合分子のインターナリゼイションによりDNSで結
合された3T3−LI、IM−９およびＫ−562細胞に転換した
のち、音波処理によりサンプルを作った。差動遠心分離
をおこない核／血漿膜（Nuc/Pm）区分；ミトコンドリア
（Mit）区分、高密度ミクロゾーム（H.Micro）区分、低
密度ミクロゾーム（L.Micro）区分および細胞質（Cyt
o）区分を得た（10、59）（図６）。
各区分をTCA沈殿により計測した。さらにSDS−PAGEに
よりキメラ融合分子を分析し、細胞内目標部位の位置を
決定し、退化が生じているか否かを判定した。中に存在
する酵素を判定することにより各区分の純度を分析し
た。血漿膜マーカーとして５′ヌクレオチダーゼおよび
アデニレートシクラーゼを用い、高密度ミクロゾームに
おいては小胞体マーカーとしてロテノン不感性NADH−シ
トクロームｃリダクターゼおよびグルコース−６−ホス
ファターゼを用い、低密度ミクロゾームにおいてはゴル
ギ（Golgi）装置マーカーとしてガラクトシルトランス
ファラーゼを用い、ミトコンドリアマーカーとしてシト
レートシンサーゼを用いた。
細胞区分に対する他のアプローチとしては免疫組織化
学分析および電子顕微鏡がある。これによりキメラ融合
分子のサブセルの極在化を特定する。
実施例３ CD4の最初の２つの領域を結合してIGF1とする（図
９）。溶融たんぱくを合成し、分泌させた。
CD4の突然変異生成 CD4 cDNAに適当な場所をつくり、CD4の２つの領域、
NH2末端領域、細胞外領域を結さつさせ提案通りの構造
にした。
５′CD4 Bal I位置を翻訳開始位置の上流につくった。
３′CD4 Sca I位置をグルタミン114についての遺伝暗号の後の
１つの塩基につくった。
結果的に得られたCD4区分はリーダーペプチドの23の
アミノ酸と、成熟たんぱくの114のアミノ酸を含む。こ
の区分の３′末端で塩基対を１つ付加することにより成
熟IGF1についての２つの５′と結びつきCD4のグルタミ
ン114とIGF1のグリシン１との間のトレオニンを符号化
させる。IGF1のＣ末端プロペプチドの最初の遺伝暗号は
停止遺伝暗号で置換されている。
CD4−IGF1の構築 ３′Sca I位置を生じさせるCD4のｐブルースクリプト
における突然変異生成に続いて、ポリリンカー中におい
てIGF1をこのSca I位置とBamH I位置との間のこのプラ
スミドに挿入し、CD4のすべての下流領域を除去した
（図９）。このIGF1挿入は、ゲノム遺伝子に存在してい
ないアデニンのひもを介して成熟たんぱくの第１の遺伝
子暗号の前に２つの塩基対からのコード領域を含み、Ig
G3の３′非翻訳（UT）領域の600bpに結合されている。
この３′領域はそれに含まれるポリＡ信号のために含め
たものである。この領域が実際にポリＡ信号を含むか否
かについて疑問が生じる。IGF1の３′UT領域内に連鎖、
AATGAAAおよびAAGTAAAのようなポリＡ信号がある。これ
らの連鎖はポリＡ信号として機能しているように思え
る。すなわち、そのcDNAは約40塩基下流でメッセイジが
ポリアデニル化されていることを示している。さらにIg
G3−IGF1キメラ構造がこれらの信号のみを含み、正常に
現れているように思える。
最終構造は23のアミノ酸プロペプチド、CD4の最初の1
14の残渣、トレオニン、成熟IGF1の70残渣全体を符号化
している。
上記の構造はIgG3プロモータの直ぐ下流のベクトルPA
G4235内に挿入されている。このプラスミドはさらに重
質鎖強化剤およびpSV2−gptセレクタブルマーカーを含
む（図10）。
実施例４ １つの抗体が作られ、ここにおいてトランスフェリン
がヒンジ領域の直ぐ後のマウス／ヒトIgG3キメラ抗ダン
シル重質鎖に結合している（図10）。この溶融たんぱく
は軽質鎖を用いて組立てられ、H2L2分子として分泌され
る。
実施例５ ヒトIL−２がIL−２特異オリゴマーを用いてPCR法に
より複製された。複製されたIL−２を本明細書に記載の
方法（図７）を用いて、ヒンジ領域の直ぐ後のマウス／
ヒトIgGキメラ抗ダンシル重質鎖に結合させた。この溶
融重質鎖は軽質鎖を用いて組立てられ、H2L2分子として
分泌される。図８はIL−２溶融たんぱく（TU2）が活性
を有することを示している。このたんぱくを合成してい
るマウスの骨髄腫細胞株トランスフェクタントからの培
養上澄液は、IL−２依存Ｔ細胞株の成育を証明してい
る。非トランスフェクション骨髄腫細胞株またはキメラ
Ig欠乏IL−２でトランスフェクトされた骨髄腫細胞株か
らの培養上澄液はこの成長を証明できなかった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/46 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (72)発明者 モーリソン、シェリー・エル アメリカ合衆国、カリフォルニア州 90048、ロサンゼルス、デンスロウ・ア ビニュー 258 (72)発明者 シン、セウング ― ウォン アメリカ合衆国、カリフォルニア州 91304、カノガ・パーク、トパンガ・キ ャニオン 7700 (56)参考文献 特開 昭61−181380（ＪＰ，Ａ) 国際公開89／5816（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/02 C07K 16/18 C07K 16/46 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (28)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】二つの異なるポリペプチドをそれぞれ二分
    子ずつ具備する、修飾されたキメラモノクローナル抗体
    であって、 前記ポリペプチドの短い方は抗体の軽鎖として機能し、
    また長い方は抗体の重鎖として機能し、 重鎖として機能するポリペプチドは、それぞれ第一の哺
    乳動物に特有の可変領域および第二の哺乳動物に特有の
    定常領域を有し、また軽鎖として機能するポリペプチド
    は、それぞれ哺乳動物に特有の可変領域および哺乳動物
    に特有の定常領域を有しており、 抗体の重鎖として機能する各ポリペプチドの定常領域の
    少なくとも一部が、受容体結合性リガンドで置き換えら
    れている修飾されたキメラモノクローナル抗体。
  2. 【請求項２】請求項１に記載の修飾されたキメラモノク
    ローナル抗体であって、軽鎖の可変領域および定常領域
    の両者が、（１）前記第二の哺乳動物に特有のもの、ま
    たは（２）前記第一の哺乳動物に特有のものであるキメ
    ラモノクローナル抗体。
  3. 【請求項３】請求項１に記載の修飾されたキメラモノク
    ローナル抗体であって、軽鎖の可変領域は前記第一また
    は第二の哺乳動物の何れか一方に特有のものであり、軽
    鎖の定常領域は他方の哺乳動物に特有のものであるキメ
    ラモノクローナル抗体。
  4. 【請求項４】請求項１に記載の修飾されたキメラモノク
    ローナル抗体であって、（１）前記第一の哺乳動物がマ
    ウスであり、且つ前記第二の哺乳動物がヒトであるか、
    または（２）前記第一の哺乳動物がヒトであり、且つ前
    記第二の哺乳動物がマウスであるキメラモノクローナル
    抗体。
  5. 【請求項５】請求項１に記載のキメラモノクローナル抗
    体であって、前記受容体結合性リガンドが増殖因子、イ
    ンスリン、インスリン様増殖因子、インスリン様増殖因
    子１、インスリン様増殖因子２、血小板由来増殖因子、
    表皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、トラン
    スフォーミング増殖因子α、トランスフォーミング増殖
    因子β、トランスフォーミング増殖因子β１、トランス
    フォーミング増殖因子β２、トランスフォーミング増殖
    因子β３、神経増殖因子、成長ホルモン、又は増殖因子
    ホルモン放出因子を具備するキメラモノクローナル抗
    体。
  6. 【請求項６】請求項１に記載の修飾されたキメラモノク
    ローナル抗体であって、前記受容体結合性リガンドが腫
    瘍壊死因子、トランスフェリン、またはリンホカインを
    具備するキメラモノクローナル抗体。
  7. 【請求項７】請求項１に記載の修飾されたキメラモノク
    ローナル抗体であって、前記リンホカインが、マクロフ
    ァージ阻害因子、白血球遊走阻害因子、マクロファージ
    活性化因子、マクロファージ細胞傷害性因子、インター
    ロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン
    ３、インターロイキン４、インターロイキン５、インタ
    ーロイキン６、インターロイキン７、リンホトキシン、
    単球由来リンパ球活性化因子、およびヘルパ−Ｔ細胞置
    換因子からなる群から選択されるキメラモノクローナル
    抗体。
  8. 【請求項８】請求項１に記載のキメラモノクローナル抗
    体であって、前記抗体がIgG抗体、IgA抗体、IgD抗体、I
    gE抗体、またはIgM抗体であるキメラモノクローナル抗
    体。
  9. 【請求項９】請求項１に記載のキメラモノクローナル抗
    体であって、前記ポリペプチドの前記可変領域がＴ細胞
    受容体のドメイン、MHC抗原、HLA抗原、Ｈ−２抗原のド
    メイン、表面糖タンパクCD4のドメイン、または表面糖
    タンパクCD8のドメインを具備するキメラモノクローナ
    ル抗体。
  10. 【請求項１０】二つの異なるポリペプチドを具備した免
    疫学的反応性複合体であって、前記ポリペプチドの短い
    方が軽鎖として機能し、長い方が重鎖として機能し、重
    鎖として機能するポリペプチドは、第一の哺乳動物に特
    有の可変領域および第二の哺乳動物に特有の定常領域を
    有し、また軽鎖として機能するポリペプチドは、哺乳動
    物に特有の可変領域および第二の哺乳動物に特有の定常
    領域を有し、前記ポリペプチドの一方の定常領域の少な
    くとも一部が受容体結合性リガンドで置き換えられてい
    る免疫学的反応性複合体。
  11. 【請求項１１】請求項10に記載の免疫学的反応性複合体
    であって、（１）前記第一の哺乳動物がマウスであり、
    且つ前記第二の哺乳動物がヒトであるか、または（２）
    前記第一の哺乳動物がヒトであり、且つ前記第二の哺乳
    動物がマウスである免疫学的反応性複合体。
  12. 【請求項１２】請求項10に記載の免疫学的反応性複合体
    であって、（１）軽鎖の可変領域および定常領域の両者
    が、前記第二の哺乳動物に特有のものであるか、（２）
    軽鎖の可変領域および定常領域の両者が、前記第一の哺
    乳動物に特有のものであるが、または（３）軽鎖の可変
    領域は前記第一または第二の哺乳動物の何れか一方に特
    有のものであり、軽鎖の定常領域は他方の哺乳動物に特
    有のものである免疫学的反応性複合体。
  13. 【請求項１３】請求項10に記載の免疫学的反応性複合体
    であって、（１）軽鎖として機能するポリペプチドの定
    常領域の少なくとも一部、または（２）重鎖として機能
    するポリペプチドの定常領域の少なくとも一部が、前記
    受容体結合性リガンドによって置き換えられている免疫
    学的反応性複合体。
  14. 【請求項１４】請求項10に記載の免疫学的反応性複合体
    であって、前記受容体結合性リガンドが増殖因子、イン
    スリン、インスリン様増殖因子、インスリン増殖因子
    １、インスリン増殖因子２、血小板由来増殖因子、表皮
    増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、トランスフ
    ォーミング増殖因子α、トランスフォーミング増殖因子
    β、トランスフォーミング増殖因子β１、トランスフォ
    ーミング増殖因子β２、トランスフォーミング増殖因子
    β３、神経増殖因子、成長ホルモン、成長ホルモン放出
    因子、腫瘍壊死因子、トランスフェリンまたはリンホカ
    インを具備する免疫学的反応性複合体。
  15. 【請求項１５】請求項14に記載の免疫学的反応性複合体
    であって、前記リンホカインが、マクロファージ阻害因
    子、白血球遊走阻害因子、マクロファージ活性化因子、
    マクロファージ細胞傷害性因子、インターロイキン１、
    インターロイキン２、インターロイキン３、インターロ
    イキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、
    インターロイキン７、リンホトキシン、単球由来リンパ
    球活性化因子、およびヘルパ−Ｔ細胞置換因子からなる
    群から選択される免疫学的反応性複合体。
  16. 【請求項１６】請求項10に記載の免疫学的反応性複合体
    であって、前記ポリペプチドの可変領域がＴ細胞受容体
    のドメイン、MHC抗原、HLA抗原、Ｈ−２抗原のドメイ
    ン、表面糖タンパクCD4のドメイン、または表面糖タン
    パクCD8のドメインを具備する免疫学的反応性複合体。
  17. 【請求項１７】修飾されたキメラモノクローナル抗体を
    製造する方法であって、 （ａ）適切な非抗体産生ホスト細胞に対して二つの発現
    プラスミド、（ｉ）一方のプラスミドは抗体の重鎖とし
    て機能することができ、第一の哺乳動物に特有の可変領
    域および第二の哺乳動物に特有の定常領域を有し、且つ
    重鎖ポリペプチドの前記定常領域の少なくとも一部が受
    容体結合性リガンドで置き換えられているポリペプチド
    をコードする発現プラスミド、および（ii）他方のプラ
    スミドは抗体の軽鎖として機能することができ、且つ哺
    乳動物に特有の可変領域および哺乳動物に特有の定常領
    域を有するポリペプチドをコードする発現プラスミドを
    同時形質転換することと、 （ｂ）この同時形質転換されたホスト細胞を、該ホスト
    細胞内において、前記プラスミドによってコードされる
    ポリペプチドの発現およびキメラモノクローナル抗体の
    形成が行なわれ、該ホスト細胞によって該抗体の培地へ
    の排出が行なわれるように処理することと、 （ｃ）その結果排出されたキメラモノクローナル抗体を
    培地から回収することとを具備した方法。
  18. 【請求項１８】修飾されたキメラモノクローナル抗体を
    製造する方法であって、 （ａ）適切な非抗体産生ホスト細胞に対して、（ｉ）抗
    体の重鎖として機能することができ、第一の哺乳動物に
    特有の可変領域および第二の哺乳動物に特有の定常領域
    を有し、且つ重鎖ポリペプチドの前記定常領域の少なく
    とも一部が受容体結合性リガンドで置き換えられている
    ポリペプチド、および（ii）抗体の軽鎖として機能する
    ことができ、且つ哺乳動物に特有の可変領域と哺乳動物
    に特有の定常領域の両者を有するポリペプチドをコード
    する一つの発現ベクターを同時形質転換することと、 （ｂ）この同時形質転換されたホスト細胞を、該ホスト
    細胞内において、前記プラスミドによってコードされる
    ポリペプチドの発現およびキメラモノクローナル抗体の
    形成が行なわれ、該ホスト細胞によって該抗体の培地へ
    の排出が行なわれるように処理することと、 （ｃ）その結果排出されたキメラモノクローナル抗体を
    培地から回収することとを具備した方法。
  19. 【請求項１９】請求項17又は18の何れかに記載の方法で
    あって、前記適切な非抗体産生ホスト細胞がヒト細胞、
    ネズミ細胞、またはミエローマ細胞である方法。
  20. 【請求項２０】抗体の受容体結合性リガンドが受容体に
    結合する増殖因子を具備する、請求項１のキメラモノク
    ローナル抗体を、表面に増殖因子の受容体を有する細胞
    に薬剤を配薬するために有効な薬剤組成物を製造するた
    めに使用する方法。
  21. 【請求項２１】前記細胞が脳細胞であり、前記増殖因子
    は前記受容体との結合に際して、脳血液関門を横切った
    前記抗体の輸送をもたらす請求項20に記載の使用する方
    法。
  22. 【請求項２２】前記細胞が血液細胞、筋細胞、神経細
    胞、骨細胞、または表皮細胞である請求項20に記載の使
    用する方法。
  23. 【請求項２３】前記増殖因子が、インスリン様増殖因子
    １、インスリン様増殖因子２、インスリン及びトランス
    フェリンからなる群から選択される請求項20に記載の使
    用する方法。
  24. 【請求項２４】前記脳細胞は異常で且つ進行性痴呆を伴
    う請求項21に記載の使用する方法。
  25. 【請求項２５】前記脳細胞は異常で且つ大脳皮質萎縮、
    神経肉腫、リンパ腫、癌肉腫、肉腫又は癌性小脳変性を
    伴なう請求項21に記載の使用する方法。
  26. 【請求項２６】前記細胞は悪性で且つメラノーマ、乳
    癌、リンパ腫、癌腫、肉腫を伴なう請求項22に記載の使
    用する方法。
  27. 【請求項２７】二つの異なるポリペプチドをそれぞれ二
    分子具備した修飾されたキメラモノクローナル抗体であ
    って、 前記ポリペプチドの短い方は抗体の軽鎖として機能し、
    また長い方は抗体の重鎖として機能し、 重鎖として機能するポリペプチドは、それぞれ第一の哺
    乳動物に特有の可変領域と第二の哺乳動物に特有の定常
    領域を有し、且つ軽鎖として機能するポリペプチドは、
    それぞれ哺乳動物に特有の可変領域と哺乳動物に特有の
    定常領域を有しており、 抗体の重鎖として機能する各ポリペプチドの定常領域の
    端部に、受容体結合性リガンドが共有結合的に結合して
    いる修飾されたキメラモノクローナル抗体。
  28. 【請求項２８】二つの異なるポリペプチドを具備した免
    疫反応性複合体であって、 前記ポリペプチドの短い方は軽鎖として機能し、また長
    い方は重鎖として機能し、 重鎖として機能するポリペプチドは、第一の哺乳動物に
    特有の可変領域と第二の哺乳動物に特有の定常領域を有
    し、且つ軽鎖として機能するポリペプチドは、哺乳動物
    に特有の可変領域と第二の哺乳動物に特有の定常領域を
    有しており、 前記ポリペプチドのうちの一方の定常領域の端部に、受
    容体結合性リガンドが共有結合的に結合している免疫学
    的反応性複合体。
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