PL193670B1 - Sposób przygotowania bydlęcego CD14 z serwatki siary bydlęcej, sposób bezpośredniej aktywacji komórek B in vitro, sposób bezpośredniej indukcji wzrostu i różnicowania komórek B in vitro do komórek wydzielających immunoglobulinę na wysokim poziomie, sposób przygotowania czystego białka lub ko-i/lub posttranslacyjnie zmodyfikowanej postaci białka, zastosowanie polipeptydu, sposób wytwarzania mieszanki dla niemowląt, sposób wytwarzania szczepionki oraz zestaw do przygotowania szczepienia - Google Patents

Abstract

1. Sposób przygotowania bydlecego CD14 z serwatki siary bydlecej, polegajacy na izolowaniu bialka z ser- watki, znamienny tym, ze uzyskuje sie siare z wydzielin gruczolu mlecznego krów, klaruje sie ja, odwirowujac stale skladniki i ze sklarowanej serwatki wysala sie bialka, które poddaje sie dalszemu oczyszczaniu i frakcjonowaniu stosujac anionowa chromatografie jonowymienna, molekularne saczenie na kolumnie i chromatografie na kolum- nie z hydroksyapatytu, po czym poddaje sie analizie sekwencyjnej wyizolowany polipeptyd o sekwencji amino- kwasów okreslanej jako SEQ ID NO: 4. 4. Sposób przygotowania czystego bialka lub ko- i/lub posttranslacyjnie zmodyfikowanej postaci bialka, znamienny tym, ze (i) hoduje sie prokariotycznego lub eukariotycznego gospodarza zawierajacego heterologiczna czasteczke kwasu nukleinowego, która koduje bialko majace sekwencje aminokwasów okreslona jako SEQ ID NO: 4 i która jest zdolna do ekspresji wymienionego bialka lub ko- i/lub posttranslacyjnie modyfikowanej postaci wymienionego bialka w warunkach hodowli, (ii) doprowadza sie do ekspresji bialka lub ko- i/lub posttranslacyjnie modyfikowanej postaci bialka, i (iii) odzyskuje sie bialko wytworzone w prowadzonej hodowli. 5. Zastosowanie polipeptydu majacego sekwencje aminokwasów okreslona jako SEQ ID NO: 4 do wytwarza- nia leku do aktywacji komórek B u ssaka potrzebujacego takiej aktywacji. 7. Sposób wytwarzania szczepionki zawierajacej antygen inny niz CD14, znamienny tym, ze do skladników szczepionki wprowadza sie polipeptyd majacy sekwencje aminokwasów okreslona jako SEQ ID NO: 4. 10. Zestaw do przygotowania szczepienia, znamienny tym, ze obejmuje uprzednio ustalona ilosc antygenu innego niz CD14 i uprzednio ustalona ilosc polipeptydu majacego sekwencje aminokwasów okreslona jako SEQ ID NO: 4. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób przygotowania bydlęcego CD14 z serwatki siary bydlęcej, sposób bezpośredniej aktywacji komórek B in vitro, sposób bezpośredniej indukcji wzrostu i różnicowania komórek B in vitro do komórek wydzielających immunoglobulinę na wysokim poziomie, sposób przygotowania czystego białka lub ko- i/lub posttranslacyjnie zmodyfikowanej postaci białka, zastosowanie polipeptydu, sposób wytwarzania mieszanki dla niemowląt, sposób wytwarzania szczepionki oraz zestaw do przygotowania szczepienia.

Rozwiązania stanowiące przedmiot wynalazku łączą w sobie zagadnienia należące do immunologii, biochemii, biologii molekularnej i komórkowej i dotyczą białka lub białek, modyfikowanych w trakcie lub po translacji, zwanych białkami LAIT, które aktywują komórki B.

Limfocyty B pochodzące ze szpiku kości, popularnie nazywane komórkami B, są rodzajem białych krwinek obecnych w limfie, krwi oraz wtórnych narządach limfatycznych układu odpornościowego. Komórki B są prekursorami komórek wydzielających przeciwciała, komórek plazmatycznych i jako takie są kluczowe dla indukcji humoralnych odpowiedzi odpornościowych.

Indukcja większości humoralnych odpowiedzi odpornościowych u dorosłego obejmuje pewną ilość interakcji komórkowych między limfocytami T pochodzącymi z grasicy, popularnie nazywanymi komórkami T, komórkami prezentującymi antygen (APC) i komórkami B (J. Exp. Med. 147: 1159, 1978; PNAS 77: 1612, 1982; PNAS 799: 1989, 1882; Immunol. Rev. 95: 914, 1987).

Jak obecnie się rozumie, zależna od komórek T aktywacja komórek B obejmuje aktywację komórek T po rozpoznaniu przez nie antygenu, prezentowanego przez APC w połączeniu z białkami kodowanymi przez kompleks głównych antygenów zgodności tkankowej (MHC), które są wyrażane na powierzchni komórki APC. Ta specyficzna w stosunku do antygenu i ograniczona przez MHC interakcja komórka T-APC daje w wyniku wzajemną aktywację dwóch typów komórek, i zmianę fizjologii komórek T tak, że staje się wyraźna „funkcja pomocnicza”.

Komórki pomocnicze T mogą aktywować specyficzne w stosunku do antygenu komórki B. Specyficzność antygenowa interakcji komórka T - komórka B jest utrzymywana jako konsekwencja ostatecznej zdolności komórki B do funkcjonowania jako APC. Tak więc w czasie spoczynku spoczynkowe komórki B nie są skutecznymi APC (PNAS 79: 1989, 1982), reagują one specyficznie z antygenem poprzez powiązaną z membraną immunoglobulinę, której specyficzność jest odbiciem specyficzności immunoglobuliny, którą wydzieli ich komórka potomna (J. Exp. Med. 140: 904, 1974).

Internalizacja antygenu przez specyficzną komórkę B, w której pośredniczy antygen, która może obejmować prezentację przez jeszcze jeden rodzaj APC, follikularną komórkę dendrytową, powoduje inicjację obróbki antygenu przez komórkę B, regulację w górę MHC klasy II i ekspresji B7 i prezentację peptydów pochodzących z antygenu w kontekście MHC (J. Exp. Med. 178: 2055, 1993). Komórka B aktywowana na tej drodze jest celem dla aktywowanej komórki pomocniczej T.

Funkcja pomocnicza komórek T obejmuje sygnały dostarczane przez zarówno kontakt komórka T - komórka B i interakcję pochodzących z komórek T rozpuszczalnych mediatorów określanych jako cytokiny, ze swymi odpowiednimi ligandami wyrażanymi na błonie plazmatycznej komórek B. Kontakt komórka T - komórka B jest też ograniczony przez MHC, podobnie do interakcji komórka T-APC (Eur. J. Immunol. 12: 62, 1982; Eur. J. Immunol. 12: 634, 1982). Jednak specyficzne interakcje cząsteczek, które pośredniczą w ograniczanej przez MHC interakcji między dwiema liniami limfocytów, w szczególności receptora komórek T dla antygenu (TcR) i kompleksu MHC/antygen wyrażanego przez komórki B nie przesądzają indukcji wzrostu komórek B i różnicowania (Eur. J. Immunol. 18: 375, 1988).

W istotnej interakcji molekularnej, której odbiciem jest wymaganie dla kontaktu komórka T - komórka B, pośredniczy CD40 wyrażany na błonie plazmatycznej komórki B i jej odpowiedni ligand gp39 (lub CD40L) wyrażany na błonie plazmatycznej komórki T (PNAS 89: 6650, 1992; Nature 357: 80, 1992). Zgodna z tym paradygmatem jest obserwacja, że ekspresja błonowa tego drugiego wzrasta po interakcji komórka T-APC jak i po interakcji komórka T - komórka B (PNAS 89: 6550, 1992). Dalej, interakcja komórek B z antygenem, w której pośredniczy immunoglobulina błonowa daje zwiększoną ekspresję w błonie CD40 (Sem. in Immunol. 6: 303, 1994). Ta interakcja między CD40 i CD40L przesądza o indukcji wzrostu komórek B, różnicowania komórek B w komórki wydzielające immunoglobulinę, i zmianę izotypu immunoglobulin (J. Exp. Med. 178: 1567, 1993).

Zgodna z tym modelem jest obserwacja, że rozpuszczalny CD40L, lub monoklonalne przeciwciało (mAb) specyficzne dla CD40 może indukować wzrost komórek B i różnicowanie do sekrecji immunoglobulin (Sem. in Immunol. 6: 267, 1994; PNAS 83: 4494, 1986; J. Immunol. 140: 1425, 1988).

PL 193 670 B1

Oprócz absolutnego wymagania kontaktu komórek T - komórek B pewna ilość cytokin pochodzących z komórek T, IL-2, IL-4 i IL-5 jest kluczowa dla wzrostu i różnicowania komórek B. Wrażliwość komórek B na te cytokiny jest w znacznym stopniu ograniczona przez uprzedni kontakt z komórką T. Tak więc po kontakcie z komórką T komórki B zwiększają ekspresję receptorów błonowych specyficznych dla cytokin (PNAS 80: 6628, 1983; J. Immunol. 145: 2025, 1990; J. Immunol. 146: 1118, 1991). Wykazano, że IL-2 i IL-5 wspierają wzrost zaktywowanych komórek B (PNAS 77: 1512, 1980; Immunol. Rev. 52: 115, 1980). Co więcej pokazano, że IL-4 i anty-immunoglobulina działają synergistycznie we wspieraniu wzrostu komórek B (J. Exp. Med. 155: 914, 1982).

Godnymi uwagi wyjątkami w tym kontekście są odpowiedzi spoczynkowych komórek B na IL-4 i IL-5. IL-4 indukuje transkrypcję de novo i translację białek MHC klasy II (J. Exp. Med. 155: 914, 1882; PNAS 81: 6149, 1984; J. Exp. Med. 160: 679, 1984) i IL-5 jest zdolne do wspierania różnicowania spoczynkowych komórek B w komórki wydzielające immunoglobuliny na wysokim poziomie pod nieobecność wzrostu komórek (Eur. J. Immunol. 22: 2323, 1992).

Stwierdzono tłumienie indukowanej aktywacji komórki B podczas zmniejszania mCD14 monocytów (The Journal of Immunology, Vol. 153 no 3, 1994, str. 972-978). Brak jest jednak danych mogących świadczyć o tym, że zaobserwowana supresja syntezy Ig przez monocyty niosące na sobie mCD14 wynika wyłącznie z obecności CD14, a zatem brak jest jakichkolwiek dowodów albo sugestii odnośnie tego, że CD14 może powodować domniemany współstymulujący efekt sam z siebie oraz, że można skutecznie zastąpić monocyty niosące mCD14 przez CD14 (jakiegokolwiek rodzaju), a w szczególności przez sCD14.

Zostały ujawnione zastosowania przeciwciał anty-CD14 Ab dla progresji indukcji/sekrecji IL-10 (WO-A-96/32418), ale ujawnienie to nie dotyczy bezpośredniej interakcji lub oddziaływania CD14 na komórki B.

Niezależnie od wiedzy na temat sCD14 i doświadczeń przeznaczonych do wyjaśnienia roli CD14 w aktywacji komórki B, nie stwierdzono możliwości stosowania sCD14 lub roli dla sCD14 w komórce. Wyczerpująca dyskusja na temat wyników badań B podczas zmniejszania mCD14 monocytów prowadzi do konkluzji (The Journal of Immunology, Vol. 153 no 3, 1994, str. 972-978), że „interakcja pomiędzy błonowymi mCD14 monocytów i naturalnymi ligandami (CD14L) może przyczyniać się do współstymulującego(cych) sygnału(łów) krytycznego(ych) dla indukowania i/lub bardziej prawdopodobne do wzmocnienia syntezy Ig”.

W każdym razie sygnały pochodzące z molekularnej interakcji wśród cząsteczek błonowych na komórkach T i komórkach B i z cytokin pochodzących od komórek T oddziałujących z ich odpowiednimi receptorami na komórkach B są częścią złożonego układu sygnalizującego. Każdy sygnał prowadzi komórkę B do innego stadium aktywacji czyniąc ją podatną na dalsze sygnały progresji. Te sygnały wzajemnie się uzupełniają raczej niż mają indywidualnie zdolność do sterowania całym procesem wzrostu i różnicowania komórek B (Immunol. Rev. 95: 177, 1987).

W 1988 r. wykryto unikalną aktywność w siarze owcy (J. Immunol. 140: 1336, 1998). Częściowo oczyszczono białko bogate w prolinę (Proline Rich Protein (PRP) stosując klasyczne techniki oczyszczania białek. Wykazano, że ten materiał stymuluje indukcję spoczynkowych komórek B w cyklu komórkowym i wspiera ich różnicowanie w komórki wydzielające immunoglobulinę na wysokim poziomie. Było to pierwsze doniesienie, że białko pochodzące od ssaków bierze udział w tych zjawiskach.

Następnie przygotowano przeciwciało specyficzne dla PRP z owcy. Gdy preparaty PRP przepuszczono przez kolumnę powinowactwa przygotowaną z zastosowaniem przeciwciała, cały PRP był zatrzymywany przez kolumnę, jak stwierdzono za pomocą badania techniką Western płynu, który przeszedł przez kolumnę. Jednak całą aktywność stymulującą komórek B znaleziono w przepływie. Tak więc opublikowana charakterystyka bioaktywności komórki tropicznej B, obecnej w siarze owcy, nie mogła być przypisana PRP (informacja nie publikowana).

Zgodnie z wynalazkiem sposób przygotowania bydlęcego CD14 z serwatki siary bydlęcej, polega na izolowaniu białka z serwatki i charakteryzuje się tym, że uzyskuje się siarę z wydzielin gruczołu mlecznego krów, klaruje się ją odwirowując stałe składniki i ze sklarowanej serwatki wysala się białka, które poddaje się dalszemu oczyszczaniu i frakcjonowaniu stosując anionową chromatografię jonowymienną, molekularne sączenie na kolumnie i chromatografię na kolumnie z hydroksyapatytu, po czym poddaje się analizie sekwencyjnej wyizolowany polipeptyd o sekwencji aminokwasów określanej jako SEQ ID NO: 4.

Sposób bezpośredniej aktywacji komórek B in vitro, według wynalazku, charakteryzuje się tym, że stosuje się rozpuszczalny polipeptyd mający sekwencję aminokwasów określaną jako SEQ ID NO:4.

PL 193 670 B1

Sposób bezpośredniej indukcji wzrostu i różnicowania komórek B in vitro do komórek wydzielających immunoglobulinę na wysokim poziomie, według wynalazku, charakteryzuje się tym, że do komórek wprowadza się rozpuszczalny polipeptyd mający sekwencję aminokwasów określoną jako SEQ

ID NO: 4.

Sposób przygotowania czystego białka lub ko- i/lub posttranslacyjnie zmodyfikowanej postaci białka według wynalazku charakteryzuje się tym, że (i) hoduje się prokariotycznego lub eukariotycznego gospodarza zawierającego heterologiczną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje białko mające sekwencję aminokwasów określoną jako SEQ ID NO: 4 i która jest zdolna do ekspresji wymienionego białka lub ko- i/lub posttranslacyjnie modyfikowanej postaci wymienionego białka w warunkach hodowli, (ii) doprowadza się do ekspresji białka lub ko- i/lub posttranslacyjnie modyfikowanej postaci białka i (iii) odzyskuje się białko wytworzone w prowadzonej hodowli.

Zgodnie z wynalazkiem polipeptyd mający sekwencję aminokwasów określoną jako SEQ ID NO: 4 jest stosowany do wytwarzania leku do aktywacji komórek B u ssaka potrzebującego takiej aktywacji.

Zgodnie z wynalazkiem sposób wytwarzania mieszanki dla niemowląt, charakteryzuje się tym, że do składników mieszanki wprowadza się polipeptyd mający sekwencję aminokwasów określoną jako SEQ ID NO: 4.

Zgodnie z wynalazkiem sposób wytwarzania szczepionki zawierającej antygen inny niż CD14, charakteryzuje się tym, że do składników szczepionki wprowadza się polipeptyd mający sekwencję aminokwasów określoną jako SEQ ID NO: 4, przy czym korzystnie dokonuje się koniugacji wprowadzonego antygenu i polipeptydu w składzie szczepionki albo korzystnie składniki szczepionki miesza się z antygenem i polipeptydem.

Zestaw do przygotowania szczepienia według wynalazku charakteryzuje się tym, że obejmuje uprzednio ustaloną ilość antygenu innego niż CD14 i uprzednio ustaloną ilość polipeptydu mającego sekwencję aminokwasów określoną jako SEQ ID NO: 4.

Bydlęce białko CD14 białko jest zdolne do aktywacji komórek B pochodzących od ssaków. Zasadniczo czyste białko LAIT wolne od innych białek lub ko- i/lub posttranslacyjnie modyfikowana postać białka mogą być wytworzone za pomocą oczyszczania biochemicznego, lub za pomocą sposobów rekombinacyjnych w gospodarzu prokariotycznym lub eukariotycznym, w którym jest on związany w stanie natywnym. Oczyszczone z siary bydlęcej białko LAIT lub jego ko- i/lub posttranslacyjnie modyfikowana postać posiada pożądaną aktywność biologiczną.

Wyizolowane białko bydlęce ma homologię z ludzkim CD14 i mysim CD14, a zatem jest określane jako bydlęce CD14. Cząsteczka kwasu nukleinowego, obejmująca sekwencję nukleotydów kodującą białko LAIT, może być cDNA lub DNA genomowym.

Aktywacja komórek B, a w szczególności aktywacja komórek B u ssaka potrzebującego takiej aktywacji następuje przez podanie CD14, zrekombinowanej postaci jego białka lub jego funkcjonalnej pochodnej, np. w postaci leku.

W szczególnym przypadku ssakiem-pacjentem jest człowiek, w tym również niemowlę. Korzystnym sposobem podania niemowlęciu CD14 jest nakarmienie go mieszanką z zawartością CD14.

Innym sposobem podawania CD14 jest włączenie CD14 jako części szczepionki. Pacjentowi potrzebującemu szczepienia jest podawany CD14 i antygen, przy czym korzystny sposób podania obejmuje podanie pojedynczego preparatu zawierającego zarówno CD14 jak i antygen.

CD14 może być podawany pacjentowi mającemu niedobór odporności komórek T, przykładowo pacjentowi cierpiącemu na szczególne zaburzenie komórek T, w którym gp39 (CD40L) jest wyrażany za słabo lub całkowicie nieobecny na powierzchni komórek T pacjenta.

W innym przypadku, gdy komórki B pacjenta są hiperaktywne w wyniku wyższych niż normalne poziomów CD14 w surowicy, pacjentowi cierpiącemu na te zaburzenia mogą być podawane przeciwciała uzyskane przeciwko CD14. W korzystnej postaci mogą być podawane przeciwciała przeciw CD14 pacjentowi cierpiącemu na reumatoidalne zapalenie stawów, w którym komórki B wydzielają czynnik reumatoidalny w wyniku aktywacji przez CD14 z surowicy.

Populacje komórek B aktywowane przez hodowanie komórek B z suboptymalnymi mitogennymi stężeniami CD14 wraz z antygenem, na który miały być skierowane przeciwciała są wysoce wzbogacone w zaktywowane, specyficzne w stosunku do antygenu komórki B i mogą być zatem stosowane do wytwarzania hybrydom wydzielających mAb o pożądanej specyficzności.

Określenie „CD14”, stosowane w dalszym tekście, obejmuje mysie, bydlęce lub ludzkie CD14. CD14 może być pochodzenia naturalnego lub pochodzić z rekombinacji DNA.

PL 193 670 B1

Definicje stosowanych dalej terminów „Pochodna funkcjonalna” zachowuje przynajmniej część funkcji CD14, taką jak wiązanie specyficznego przeciwciała lub wiązanie do jego odpowiedniego receptora na komórkach, które posiadają wymieniony receptor, co pozwala na jego użyteczność zgodnie z niniejszym wynalazkiem. Stosowane określenie „funkcjonalna pochodna obejmuje „fragment lub „wariant CD14, które to terminy są określone poniżej.

„Fragment” CD14 dotyczy dowolnego podzbioru polipeptydów, to znaczy krótszego peptydu. Określenie „fragment” jest tu stosowane aby wskazać polipeptyd, który pochodzi z CD14, mający naturalnie występującą sekwencją białka zawierającą delecję jednego lub więcej aminokwasów w jednym lub więcej miejsc C-końca, N-końca lub w obrębie sekwencji. Takie fragmenty powinny zatrzymywać jedną lub więcej aktywności biologicznych lub funkcji, które są charakterystyczne dla nienaruszonego polipeptydu CD14 lub ko- i/lub posttranslacyjnie modyfikowanych postaci CD14.

„Wariant” CD14 dotyczy polipeptydu mającego pierwszorzędową sekwencję podobną do sekwencji natywnego CD14 lub jego fragmentu taki, że natywna aktywność jest przynajmniej częściowo zatrzymana. Warianty peptydu mogą być przygotowane za pomocą sposobów syntetycznych lub przez mutacje cDNA kodującego wymieniony polipeptyd, która zachowuje biologiczną aktywność wymienionego polipeptydu w tym delecję, insercje lub konserwatywne podstawienia aminokwasów w polipeptydzie.

Określenie „przeciwciało” jak jest tu stosowane jest białkiem immunoglobulinowym, które ma zdolność do wiązania odrębnego epitopu w niekonserwowanym obszarze wymienionego białka w ten sposób umożliwiając przeciwciału rozróżnienie jednego białka od drugiego. Określenie epitop jest stosowane, aby odnieść się do tej części dowolnej cząsteczki zdolnej do bycia wiązaną przez przeciwciało. Określenie „przeciwciało” obejmuje przeciwciała poliklonalne, przeciwciała monoklonalne (mAb) lub przeciwciała chimeryczne.

Przeciwciała poliklonalne są heterogennymi populacjami cząsteczek przeciwciał pochodzących z surowic zwierząt immunizowanych antygenem.

Monoklonalne przeciwciała są homogenną populacją przeciwciał zdolnych do wiązania odrębnego epitopu na antygenie. MAbs mogą być uzyskane za pomocą metod znanych specjalistom. Takie przeciwciała mogą być dowolnej klasy immunoglobulin obejmujące IgG, IgM, IgE, IgA i IgD, i dowolnej ich podklasy. Określenie „przeciwciało” ma też obejmować zarówno nienaruszone komórki jak i ich fragmenty, takie jak na przykład Fab i F(ab')2, które są zdolne do wiązania antygenu. Fab i F(ab')2, wobec brak fragmentu Fc nienaruszonego przeciwciała, są łatwiej usuwane z krążenia i mogą mieć mniej niespecyficznego wiązania tkanek niż nienaruszone przeciwciało (Wahl i wsp., J. Nucl. Med. 24: 316-325, 1983).

Chimeryczne przeciwciała to cząsteczki, których różne porcje pochodzą z różnych gatunków zwierząt, tak jak takie, które mają zmienny obszar pochodzący z mysiej mAb i stały obszar pochodzący z ludzkiej immunoglobuliny.

„Antygen” to cząsteczka lub część cząsteczki zdolna do bycia wiązaną przez przeciwciało, która jest dodatkowo zdolna do indukowania zwierzęcia do produkcji przeciwciała zdolnego do wiązania do epitopu tego antygenu. Antygen może mieć jeden lub więcej niż jeden epitop. Gdy twierdzi się, że przeciwciało jest „specyficzne” w stosunku do polipeptydu, jego fragmentu lub wariantu znaczy to, że antygen będzie reagował w sposób wysoce selekcyjny ze swoim odpowiednim przeciwciałem a nie z dużą ilością innych przeciwciał, które mogą być wywołane przez inne antygeny.

Krótki opis figur

Figury 1A-1C przedstawiają oczyszczanie natywnego białka bydlęcego LAIT (nBo-LAlT). Figura 1A przedstawia profil elucji z anionowej kolumny jonowymiennej (FPLC-Mono-O, Pharmacia), którą załadowano 50 mg osadu 62% (obj/obj) (NH4)2SO4. Związane białka wyeluowano gradientem 50-400 mM NaCI w 10 mM bis-tris propanie, i jednoczesnym gradiencie pH od 7,5 do 9,5. Tabela 1A wykazuje bioaktywność frakcji z aktywnością szczytową, frakcji #57. Izolowano komórki B śledziony myszy o wysokiej gęstości pławnej jak opisano uprzednio (J. Immunol. 131: 581, 1983) i hodowano przy 5 x 10⁴ komórek w 0,2 ml pożywki wolnej od surowicy w skupieniu 96 studzienek w płytce do hodowli tkankowych o płaskim dnie (Costar). Każdą frakcję dodawano do końcowego stężenia 10% (obj/obj) w obecności lub nieobecności 0,25 μg/ml LPS. Po 40 godzinach kulturom podawano puls 1 μφ ³H-TdR, zbierano na sączki filtracyjne po 6 godzinach i oceniano pobieranie tymidyny za pomocą spektroskopii scyntylacyjnej. Liczby przedstawiają cpm x 10^-3.

PL 193 670 B1

Figura 1B przedstawia profil kolumny do sączenia molekularnego, na którą naładowano 20 mg Frakcji #57 (Figura 1A). Kolumnę równoważono w buforze 20 mM tris-HCI, pH 8,0 zawierającym 0,45 M NaCI. Tabela 1B wskazuje bioaktywność frakcji szczytowej, frakcji #38, ocenianej jak opisano przy Figurze 1A. Figura 1C przedstawia profil elucji kolumny z hydroksyapatytu (HPLC-hydroksyapatyt, Pharmacia), którą załadowano 1 mg frakcji #38 (Figura 1B). Związane białka eluowano gradientem buforu 1-500 mM K2HPO4 pH 6,8 zawierającym 1 mM NaCI. Tabela 1C wykazuje bioaktywność frakcji szczytowej, frakcji #25, ocenionej, jak opisano dla Fig. 1A. Wstawka w figurze przedstawia barwiony srebrem żel SDS-PAGE około 5 μg białka z frakcji #25. Lewa ścieżka: frakcja #25; prawa ścieżka: markery masy cząsteczkowej, od góry: 97, 66, 45, 31, 21 i 14kDa, odpowiednio.

Figura 2 przedstawia znaną sekwencją ludzkiego CD14 (SEQ ID NO: 5) i uszeregowanych fragmentów nBo-LAIT. Fragmenty Bo-LAlT generowano z nBo-LAIT z siary oczyszczonego na kolumnie powinowactwa (Figura 3). Fragmenty odpowiadające resztom 235-264 i 344-355 ludzkiego CD14 były odpowiednio głównym i pobocznym peptydem, o około 18 kDa wielkości każdy, wygenerowanymi za pomocą cięcia CnBr, i rozdzielonymi na kolumnie HPLC fazy odwróconej (kolumna CB, Pharmacia). Fragment odpowiadający resztom 53-67 ludzkiego CD14 jest częściową sekwencją fragmentu 24kDa powstałego w wyniku cięcia CnBr, i rozdzielonego za pomocą SDS-PAGE i przenoszonego za pomocą elektrotransferu na błonę PVDF. Fragmenty odpowiadające resztom 19-36 i 151-165 ludzkiego CD14 generowano za pomocą cięcia trypsyną i rozdzielano za pomocą HPLC fazy odwróconej (kolumna C8, Pharmacia). Długość zachodzących na siebie sekwencji z przewidywaną sekwencją CD14 jest podkreślona w każdym z fragmentów. Kreski wskazują te same aminokwasy, a te aminokwasy, które różnią się od sekwencji ludzkiej są pokazane.

Figura 3 przedstawia SDS-PAGE i barwienie srebrem oczyszczonych za pomocą powinowactwa białek LAIT z siary wołu i człowieka. Ścieżka 1: markery masy cząsteczkowej, jak podano na Figurze 1C; ścieżka 2: 62,5% (obj/obj) (NH4)2SO4 osad serwatki z siary bydlęcej; ścieżka 3: eluat przy pH 2,5 z kolumny powinowactwa z Sepharose #842; ścieżka 4 eluat przy pH 2,5 z (PNAS 767: 6764, 1980) kolumny powinowactwa z Sepharose z CD14 specyficznym mAb 63D3 załadowanej materiałem przedstawionym w ścieżce 5; ścieżka 5: ludzka serwatka z siary frakcjonowana na Sefakrylu S100 HR. Każda ze ścieżek 1-5 zawiera 5 μg białka. Tabela 2 przedstawia wyniki uzyskane gdy hodowano 5 x 10⁴ mysich komórek B śledziony w pożywce wolnej od surowicy w obecności wskazanych bodźców przez 40 godzin, podawano puls 1 μφ ³H-TdR, zbierano po 6 godzinach na krążki filtracyjne i ocenianopobieranie tymidyny za pomocą spektroskopii scyntylacyjnej w płynie. Liczby przedstawiającpm x 10^-3. Szczegóły biooznaczenia są takie jak przedstawiono na Fig. 1A. Kontrola cpm x 10^-3; bez bodźca, 0,3; 50 μg/ml LPS, 75,0; 0,25 μg/ml LPS (LPSf), 0,8; i 1 μg/ml mlgM specyficznego mAb b-7-6 (Eur. J. Immunol. 14: 753, 1984), 0.7.

Figury 4A i 4B przedstawiają wrażliwość na temperaturę i powodowaną przez przeciwciała inhibicję aktywności nBo-LAIT. Figura 4 przedstawia pobieranie tymidyny przez 5 x 10⁴ komórek B śledziony wysokiej gęstości pławnej z myszy hodowanych jak podano dla Figury 1A w obecności wskazanych stężeń oczyszczonych z pomocą powinowactwa nBo-LAIT poddanego działaniu temperatury w 95°C przez 10 minut (•) i nBo-LAIT, które nie było poddane obróbce cieplnej (o). Kulturom poddawano puls ³H-TdR po 40 godzinach, zbierano po 6 godzinachoceniano pobieranie tymidyny za pomocą spektroskopii scyntylacyjnej w płynie. Wstawka przedstawia odpowiedzi w kulturach zawierających wskazane stężenia LPS, poddanego (lub nie poddanego) działaniu temperatury jak dla nBo-LAIT. Figura 4B przedstawia pobieranie tymidyny w kulturach, które ustalono jak opisano dla Fig. 4A w obecności albo 0,25 μg/ml oczyszczonego za pomocą powinowactwa nBo-LAIT, albo 50 μg/ml LPS. Każdy z tych bodźców był hodowany w obecności wskazanego stężenia albo poliklonalnego IgG królika anty-Bo-LAlT #842 albo normalnego IgG królika. Procent hamowania pobierania tymidyny, w którym pośredniczy #842 IgG przy stymulacji powodowanej przez ribo-LAlT i LPS jest wskazana w nawiasach. Poziomy inhibicji, w których pośredniczy normalny IgG królika jest w zakresie od 9-20%, i 12-31% dla odpowiednio stymulacji nBo-LAlT i LPS. CPM bezpośrednio indukowany przez lg#842 był w zakresie od 454±53 do 764±69 przy 4 i 50 μg/ml, odpowiednio, i dla normalnego IgG królika od 297±34 do 420±31 przy 0,4 i 50 μg/ml, odpowiednio. Niestymulowane kontrole dały 195±29 cpm dla obu zestawów eksperymentów.

Figura 5A przedstawia mapę restrykcyjną fragmentu EcoRI-Xhol 7,1 kb zawierającego bydlęcy gen CD14. Skróty dla miejsc restrykcyjnych to: X, Xhol; P, Pstl; O, Ncol; B, BamHI; N, Notl; D, BssHI; T, BstEII; M, Smal; S, Sacll; C, Hpal; R, EcRV; A, SPhl; Bglll; H, Hindlll; E, EcoRI. Figura 5B jest schematycznym szkicem bydlęcego locus CD14. Obszar zaciemniony przedstawia region kodujący

PL 193 670 B1 genu, otwarta ramka to sekwencja intronu. Zakreskowany obszar przed kodonem start ATG jest obszarem 5' nie ulegającym translacji, a zakreskowany obszar za kodonem stop TAA jest obszarem 3' nie ulegającym translacji. Figura 5C jest schematycznym wykresem przedstawiającym wybraną strategię sekwencjonowania. Strzałki przedstawiają kierunek sekwencjonowania. Numer fragmentu jest przedstawiony z prawej (szczegóły w tekście).

Figura 6 przedstawia porównanie sekwencji kwasów nukleinowych bydlęcych (SEQ ID NO: 1), ludzkich (SEQ ID NO: 2) i mysich (SEQ ID NO: 3) regionów kodujących CD14. Pierwsza pozycja zasady odpowiada pierwszemu nukleotydowi kodonu ATG, ostatni nukleotyd odpowiada trzeciemu nukleotydowi kodonu stop TAA. Uszeregowania dokonano stosując oprogramowanie DNA STAR-Megalign, stosując metodą Clustal z ważoną tabelą reszt. Ludzka sekwencja cDNA (numer dostępu P08571), i mysia sekwencja cDNA (numer dostępu P08571) stosowane w tym uszeregowaniu pochodzą z Swiss Protein Database.

Figura 7 przedstawia porównanie sekwencji aminokwasów białka bydlęcego (SEQ ID NO: 4), ludzkiego (SEQ ID NO: 5) i myszy (SEQ ID NO: 6). Sekwencje aminokwasów wydedukowano z odpowiednich sekwencji cDNA przedstawionych na Fig. 6. Zastosowano oprogramowanie DNA-Star Megalign, aby wygenerować to uszeregowanie stosując metodę opisaną przez J. Hein (Methods in Enzymology 183: 626, 1990) w połączeniu z tabelą wagi reszt PAM 250.

Figura 8 przedstawia primery stosowane do amplifikacji obszaru kodującego bydlęcego CD14 cDNA. Figura 8A przedstawia primery lewy (SEQ ID NO: 7) i prawy (SEQ ID NO: 8) stosowane do układu ekspresyjnego bakulowirusów. Figura 8B przedstawia primery lewy (SEQ ID NO: 9) i prawy (SEQ ID NO: 10) stosowane do układu ekspresyjnego ssaków.

Figura 9 przedstawia elektrotransfer natywnego i zrekombinowanego bydlęcego CD14. Wykorzystano analizę typu Western, aby ocenić i porównać wielkości białka nBo-LAlT ze zrekombinowanymi białkami CD14. 250 ng białek CD14 poddano elektroforezie na 12,5% żelu poliakrylamid/SDS i przenoszono elektroforetycznie na membranę PVDF (Millipore) przy 180 mA przez 30 minut. Membranę blokowano przez 1 godzinę w 5% mleku odtłuszczonym w TBST (20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM

NaCI, 0,025% Tween 20) a następnie inkubowano przez 1 godzinę z króliczym anty-Bo-LAlT #842 Ab w stężeniach 2,5 μg/ml w TBST uzupełnionym 5% mlekiem odtłuszczonym. Filtr płukano trzy razy po 10 minut w TBST. Do wykrywania przeciwciała zastosowano IgG przeciwkrólicze z kozła sprzęgniętego z peroksydazą z chrzanu. Membranę następnie płukano trzy razy (10 minut/płukanie) TBST. Użyto zestaw do ECL (Amersham) do wizualizacji białek. Ścieżka 1: markery masy cząsteczkowej; ścieżka 2: białko nBo-LAlT oczyszczone na nBo-LAlT Sepharose 842; ścieżka 3: rBo-Sf9 - oczyszczone za pomocą powinowactwa na rBo-Sf9-12-CA5, Sf9 pochodzące z komórek owada zrekombinowane bydlęce CD14; ścieżka 4: L rBo-C127-842 -zrekombinowany bydlęcy CD14 oczyszczony z mysiej linii pochodzącej z guza piersi C127.

Figura 10 przedstawia porównawczo promującą wzrost aktywność nBo-LAlT i LPS. Spoczynkowe komórki B ze śledziony myszy, o wysokiej gęstości, przygotowywano, hodowano i zbierano jak opisano dla Figury 1A. Wskazane stężenia oczyszczonego za pomocą powinowactwa nBo-LAlT (oczyszczono za pomocą powinowactwa jak opisano dla Fig. 1) lub LPS, pochodzącego z S. typhosa (Difco), dodawano przy inicjacji kultury.

Figura 11 przedstawia aktywność stymulującą wzrost nBo-LAlT i LPS. Spoczynkowe komórki B ze śledziony myszy, o wysokiej gęstości, przygotowywano, hodowano i zbierano jak opisano dla Figury 1A. Inicjowano kultury w powtórzeniach stosując 10 μg/ml LPS [S. typhosa (Difco)] lub 500 ng/ml oczyszczonego za pomocą powinowactwa nBo-LAlT oraz zbierano we wskazanych czasach. Oceniano kumulatywną produkcję IgM przez oznaczenie ilości IgM obecnego w supernatancie stosując handlowo dostępny zestaw do ELISA.

Figura 12 przedstawia porównawczo promującą wzrost aktywność białek nBo-i rBo-LAlT i LPS. Spoczynkowe komórki B ze śledziony myszy, o wysokiej gęstości, przygotowywano, hodowano i zbierano jak opisano dla Figury 1A. Wskazane stężenia nBo-LAlT (oczyszczonego jak opisano dla Fig. 1A), rBo-LAlT pochodzącego albo z komórek owadów, albo komórek ssaków, i LPS [S. typhosa (Difco)] dodawano przy inicjacji kultury. Zrekombinowany Bo-LAlT pochodzący z hodowli komórek owadzich oczyszczono za pomocą powinowactwa z supernatantów hodowli komórek Sf9 transfekowanych cDNA Bo-LAIT. Wektor ekspresyjny zawierał 3' 27-mer kodujący nonapeptyd pochodzący z hemaglutyniny wirusa grypy (znacznik HA). Oczyszczanie za pomocą powinowactwa zrekombinowanego Bo-LAlT pochodzącego od ssaczego układuekspresyjnego C127 uzyskano tak jak dla nBo-LAlT stosując Sepharosę skoniugowaną z IgG wyizolowanym z poliklonalnej antysurowicy pochodzącej z królika 842.

PL 193 670 B1

Figura 13 przedstawia analizą porównawczą aktywności stymulującej wzrost nBo-LAlT na oczyszczone populacje pierwotnych komórek B oraz T. Spoczynkowe komórki B ze śledziony myszy, o wysokiej gęstości pławnej, przygotowano jak opisano dla Fig. 1A. Pierwotne komórki T izolowano z węzłów chłonnych tych samych zwierząt, z których izolowano komórki B ze śledziony. Specyficznie, przepuszczano zawiesiny węzłów chłonnych przez kolumny anty-lg (Biotex Labora) według instrukcji producenta, i jak opisano uprzednio (Eur. J. Immunol. 24: 967, 1984). Populacje komórek T były >95%

CD3⁺ i <0,5% mlg⁺ jak oceniano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i analizy FACS. Lewa część pokazuje odpowiedź proliferacyjną tej samej liczby komórek B lub T na albo 50 μg/ml LPS

[S. typhosa (Difco)] albo 1 μg/ml Concanavalin A (Sigma). Stosowano warunki bez surowicy, i wszyst₃ kie bodźce dodawano przy rozpoczynaniu hodowli. Po 40 godzinach kulturom podawano 1 μθ H-TdR, zbierano na filtry po 6 godzinach i oceniano pobieranie tymidyny za pomocą spektroskopii scyntylacyjnej. Wskazane liczby przedstawiają średnie cpm kultur w dwóch powtórzeniach.

Figura 14 przedstawia niezależność od płodowej surowicy cielącej wzrostu mysich komórek B wywołany przez nBo-LAIT. Przygotowano spoczynkowe komórki B o wysokiej gęstości pławnej ze śledziony myszy i hodowano je oraz zebrano jak opisano dla Figury 1A. Wolną od surowicy pożywkę hodowlaną uzupełniano wskazanymi stężeniami inaktywowanych termicznie (55°C przez 1 godzinę) płodowej surowicy cielęcej (Gibco BRL) i albo żadnego bodźca (), 0,5 μg/ml oczyszczonego na kolumnie powinowactwa nBo-LAlT (o) lub 50 μg/ml LPS [S. typhosa (Difco)] (·). Po 40 godzinach, kulturom podawano puls 1 μφ ³H-TdR zbierano na filtry po 6 godzinach i oceniano pobieranie tymidyny za pomocą spektroskopii scyntylacyjnej. Wskazane liczby przedstawiają średnie cpm kultur w dwóch powtórzeniach.

Figura 15 przedstawia analizą typu Northern dla CD14 zawartych w: (1) niefrakcjonowanych splenocytach, (2) spoczynkowych komórkach B o wysokiej gęstości pławnej ze śledziony myszy przygotowanych jak opisano dla Fig. 1A i (3) sortowanych FACS komórkach B mig⁺ pochodzących z tej wymienionej populacji spoczynkowej o wysokiej gęstości pławnej. Do sortowania FACS komórki o wysokiej gęstości pławnej inkubowano z mAb skoniugowanym z FITC 187.1 specyficznym dla mysiej IgK (Hybridoma 1:5, 1981). Podana jest część komórek mig+ dla każdej z trzech populacji. Całkowity RNA izolowany z 10⁷ komórek każdej z tych trzech populacji stosując metodę z Trizolem (Gibco BRL life Technologies) według instrukcji producenta rozdzielono na 1,2% żelu formaldehydowym. RNA przenoszono na błonę nylonową (GeneScreen) stosując system transferu w próżni (Pharmacia). Łączenie RNA z filtrem, prehybrydyzację i hybrydyzację przeprowadzono według zaleceń producenta membran. Specyficzną dla CD14 myszy sondą był fragment pochodzący z fragmentu genomowego CD14 wytworzony za pomocą PCR stosując primer lewy

5' CTA GAA TTC TCT CCC GCC CCA CCA GAG CCC TGC G 3' (SEQ ID NO: 11) i primerprawy

5'- GAA TTC TTA AAC AAA GAG GCG ATC TCC TAG G-3' (SEQ ID NO: 12).

Zamplifikowany fragment rozdzielano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, wycinano oraz oczyszczano. Użyto sondę cDNA L32 (Nucl. Acid. Res. 16: 10751, 1988) specyficzną w stosunku do konstytutywnie wyrażanego mRNA białka dużej podjednostki rybosomu do normalizacji ładowania RNA. Sondy (100 ng każda) znakowano stosując zestaw do znakowania oligonukleotydami (Pharmacia) do aktywności specyficznej 0,2-1 x 10⁹ cpm^g DNA. Błonę następnie płukano w 0,2 x SSC, 1% SDS w 65°C przez 2 godziny oraz eksponowano na kliszę rentgenowską (Kodak, BiomaxMS) przez 1 do 5 dni.

Figura 16 przedstawia odpowiedź spoczynkowych komórek B, o wysokiej gęstości pławnej, ze śledziony myszy, które były lub nie były dalej oczyszczane pod kątem komórek mlg⁺ jak opisano dla Fig. 15 do 50 μg/ml LPS [S. typhosa (Difco)] i 0,5 μg/ml oczyszczanego nBo-LAIT. Kultury inicjowano, podawano puls trytowanej tymidyny, zbierano i oceniano pobieranie tymidyny jak opisano dla Figury 1A. Wskazane liczby przedstawiają średnie cpm kultur w dwóch powtórzeniach.

Figura 17 przedstawia niezależność od CD40 aktywacji komórek B związanej ze zrekombinowanym Bo-LAIT. Izolowano spoczynkowe komórki B, o wysokiej gęstości pławnej, ze śledziony myszy albo z konwencjonalnych myszy C57BL/6 albo z myszy bez CD40 wygenerowanych przez programowaną dysrupcję locus CD40 (Immunity 1: 167, 1994). Komórki (1,5 x 10⁵) hodowano w obecności 10 μg/ml LPS lub przy wskazanych stężeniach rBo-LAlT pochodzącego z owadziego systemu ekspresji. Kulturom podawano puls i zbierano jak opisano dla Fig. 1A. Wskazane liczby przedstawiają średnie cpm kultur w dwóch powtórzeniach.

Figura 18 przedstawia porównawcze barwienie srebrem (z lewej) oraz immunotransfer (z prawej) analizy natywnego CD14 pochodzącego z człowieka (nHu), krowy (nBo) i myszy (nMo). nHu izolowano z moczu pacjentów z zespołem nerczycowym, jak uprzednio opisano (Eur. J. Immunol. 24: 1779, 1984),

PL 193 670 B1 nBo oczyszczano za pomocą powinowactwa z siary bydlęcej jak opisano dla Fig. 3. nBo izolowano z supernatantu hybrydomy mysiej OKT3 (PNAS USA 77: 4914, 1980) za pomocą chromatografii powinowactwa stosując unieruchomione na Sepharose 4B mAb 3C10 specyficzne w stosunku CD14 (J.

Exp. Med. 15: 126, 1983). Dla barwienia srebrem, 1 μg każdej z próbek rozdzielono na 10% SDSPAGE przy 200 V przez 45 minut. Białko uwidoczniono za pomocą barwienia srebrem (Biorad) według instrukcji producenta. Do immunotransferu, 250 ng każdej z próbek rozdzielano na 10% SDS-PAGE przy 180 mA przez 45 minut, przeniesiono elektroforetycznie na błonę PVDF (Millipore) w 180 mA przez 30 minut. Błonęblokowano przez 1 godzinęw 5% odtłuszczonym mleku w TBST (20 mM TrisHCI, pH 7,5, 150 mM NaCI, 0,025% Tween 20) a następnie prowadzono inkubację przez 1 godzinę z mAB 3C10 (J. Exp. Med. 15: 126, 1983) w stężeniu 10 μg/ml w TBST uzupełnionym 5% odtłuszczonym mlekiem. Błonę płukano trzy razy przez 10 minut/płukanie w TBST. Do wykrycia przeciwciała mysiego zastosowano anty-mysi IgG z kozy skoniugowany z peroksydazą z chrzanu (BioRad). Błonę następnie płukano trzy razy (10 minut/płukanie) TBST. Do wizualizacji białek zastosowano zestaw ECL (Amersham).

Figura 19 przedstawia porównawczą analizę natywnego CD14 pochodzącego z człowieka (nHu), krowy (nBo) i myszy (nMo) w stymulacji wzrostu mysich komórek B. Te trzy białka oczyszczono tak jak opisano dla Fig. 18. Oceniano odpowiedź spoczynkowych komórek B o wysokiej gęstości pławnej ze śledziony myszy, przygotowanych jak opisano dla Fig. 1A na wskazane stężenia trzech białek. Kulturom podawano puls 1 μφ ³H-TdR po 40 godzinach i zbierano po 46 godzinach. Przedstawione liczby to wskaźnik stymulacji uzyskany przez podzielenie średniego cpm kultur w dwóch powtórzeniach stymulowanych przez wskazane stężenia nHu, nBo i nMo przez średni cpm hodowli nie zawierających bodźców.

Figury 20 A i B przedstawiają stymulującą wzrost aktywność nBo-LAIT na ludzkie komórki B izolowane odpowiednio z krwi pępowinowej oraz migdałków. Figura 20A przedstawia pobieranie tymidyny przez komórki B krwi pępowinowej wyizolowane za pomocą pozytywnej selekcji. Zawiesiny leukocytów krwi pępowinowej barwiono znakowanym fluoresceiną mAb specyficznym dla markera komórek B CD72. CD72 dodatnie leukocyty krwi pępowinowej następnie izolowano w sorterze aktywowanym fluorescencją (FACStar Plus, Becton Dickinson) dając czystości >98%. Komórki B (1,5 x 10⁵) hodowano jak opisano dla Fig. 1A, bez żadnego czynnika stymulującego lub z 2 μg/ml nBo-LAIT. Komórki B także hodowano w studzienkach, które wstępnie powlekano przez 9 godzin kombinacją dwóch mAb, jeden z nich był specyficzny dla ludzkiej IgK [LO-HK3, („Rat Hybridomas and Rat Monoclonal Antibodies” red. H. Bazin, CRC Press, Boca Raton, FL, USA)] i jeden specyficzny dla ludzkiej ^λ, [LO-HL2, („Rat Hybridomas and Rat Monoclonal Antibodies”red. H. Bazin, CRC Press, Boca Raton, FL, USA)], każdy w stężeniu do powlekania 1,5 μg/ml, bez dodatkowego bodźca lub w obecności 2 μg/ml nBoLAIT. Kulturom podawano po 60 godzinach puls 1 μφ ³H-TdR, zbierano na krążki filtrów po 12 godzinach i oceniano pobieranie tymidyny za pomocą spektroskopii scyntylacyjnej. Figura 20B przedstawia wyniki uzyskane dla komórek B migdałków uzyskanych za pomocą negatywnej selekcji. Specyficznie, zawiesiny leukocytów znakowano biotynylowanym mAb specyficznym dla CD3ε (Becton Dickinson), a następnie dodatek awidyny skoniugowanej z „mikropaciorkami”zawierającymi żelazo (Becton Dickinson). Oznakowaną populację przepuszczono przez MACS (Becton Dickinson) i zbierano wyciek. Populacja zawierała <1% komórek T oraz >97% komórek B jak oceniono za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego z mAb specyficznymi w stosunku do linii. Komórki B migdałków, tak jak komórki B krwi pępowinowej, hodowano w obecności i nieobecności związanych z płytkami mAb specyficznych dla ludzkich IgK i λ, ale w tym przypadku ściany były wstępnie pokrywane stosując stężenie 0,5 μg/ml każdego mAbs. Kulturom podawano pulsy, zbierano oraz oceniono pobieranie tymidyny jak opisano dla Fig. 20A.

Figura 21 przedstawia stężenie CD14 w mleku w czasie po porodzie. Mleko zbierano z dwóch dawców (A.D. i S.B.) we wskazanych czasach po porodzie. Przygotowywano klarowaną serwatkę ioceniano stężenie zawartości CD14 stosując zestaw ELISA specyficzny w stosunku do CD14 (IBL, Hamburg) według instrukcji producenta.

Opis korzystnych postaci

Eksperymenty przedstawione poniżej wykazują oczyszczanie natywnego białka bydlęcego LAIT (nBo-LAlT) określane także tutaj jako CD14, z serwatki siary. Pokazana jest sekwencja aminokwasów oczyszczonego nBo-LAlT i wykazana jest homologia z ludzkim CD14. Pokazana jest metoda oczyszczania ludzkiego CD14. Przedstawiona jest metoda oczyszczania mysiego CD14 z supernatantu hybrydomy.

PL 193 670 B1

Opisano oznaczenia stymulacji komórek B in vitro dla oczyszczonego Bo-LAlT z siary, ludzkiego CD14 z siary, ludzkiego CD14 pochodzącego z moczu, i mysiego CD14 pochodzącego z supernatantu hybrydomy. Pokazano, że spoczynkowe komórki B o wysokiej gęstości pławnej ze śledziony myszy wchodzą do cyklu komórkowego i przechodzą przez niego w odpowiedzi na białko LAIT z trzech gatunków i różnicują się do komórek wydzielających immunoglobulinę na wysokim poziomie w odpowiedzi na bydlęce białko LAIT. Te zdarzenia aktywacyjne zachodzą w określonej pożywce wolnej od surowicy, i wykazano także, że obecność płodowej surowicy cielęcej w pożywce do hodowli nie wpływa na aktywację komórek B, w której pośredniczy białko LAIT. Przedstawiono doświadczenia wykazujące, że bydlęcy CD14 indukuje wzrost komórek B, w których nie zachodzi ekspresja CD40.

Opisana jest izolacja, klonowanie i sekwencjonowanie zarówno genomowego DNA jak i cDNA kodującego bydlęcy CD14. Porównania sekwencji z mysim i ludzkim CD14 znanymi z literatury, pokazują stosunek między sekwencjami Bo-LAlT i uprzednio znanymi CD14. Przedstawiono aktywności wzrostu i różnicowania komórek B związanych ze zrekombinowanym bydlęcym CD14.

Opisano metody ekspresji zrekombinowanego bydlęcego CD14 zarówno w komórkach owadów i ssaków. Specyficznie zastosowano wektor ekspresyjny bakulowirusa, aby uzyskać ekspresję zrekombinowanych białek w komórkach owadów. Porównanie właściwości wzrostu oraz różnicowania komórek B w obecności natywnego Bo-LAlT (nBo-LAIT) i zrekombinowanego Bo-CD14 (rBo-LAlT) pochodzącego z systemu ekspresyjnego wykazało, że drugi z nich był funkcjonalny, i miał aktywność specyficzną około 50% nBo-LAIT.

Linia raka sutka myszy, C127 była użyta jako biorca cDNA kodującego CD14 pochodzącego z wołu. cDNA sklonowano do wektora ekspresyjnego bydlęcego wirusa brodawczaka. Ustalono stabilne transfektanty C127 i wyizolowano białko zrekombinowane CD14 z supernatantów stycznych kultur C127 za pomocą chromatografii powinowactwa. Analiza typu Western komórek owadzich i białek zrekombinowanych LAIT wykazały, że różne ko- i/lub posttranslacyjne modyfikacje powstawały w dwóch systemach ekspresji. Specyficzna aktywność zrekombinowanego bydlęcego CD14 pochodzącego z komórek ssaków była taka sama jak materiału zrekombinowanego pochodzącego z komórek owadów.

Przedstawiono porównanie aktywności promującej wzrost komórek B podtrzymywanej przez natywne Bo-LAlT oraz zrekombinowane bydlęce CD14 pochodzące z komórek owadów i ssaków. Co więcej, podano stymulującą wzrost aktywności natywnego Bo-LAlT na ludzkie komórki B wyizolowane z migdałków lub krwi pępowinowej. Wyniki wykazują, że tak jak dla komórek B myszy, ludzkie komórki B izolowane albo z noworodka lub dorosłego, są podatne na wzrost wywoływany przez Bo-LAIT.

Pokazano, że stężenie CD14 obecnego w siarze ludzkiej i w mleku matki do 78 dni po porodzie jest 3-20 razy wyższe niż obserwowane z surowicy zdrowych dawców.

METODY

Oczyszczanie bydlęcego białka LAIT

Uzyskano ponad pięć litrów siary z pierwszych wydzielin gruczołu mlecznego krów tuż po porodzie.

(i) Klarowaną serwatkę z siary przygotowywano przez wirowanie siary najpierw przy 4420 g przez 30 minut, aby usunąć komórki i fragmenty komórek. Supernatant tego wirowania następnie wirowano przy 250000 przez dwie godziny. Pływające lipidy i osadzona kazeina były odrzucane, i klarowaną serwatkę z siary poddawano dalszemu frakcjonowaniu.

Każda frakcja pochodząca z każdej techniki frakcjonowania była oceniana pod kątem promowania wzrostu komórek B in vitro. Tak więc, każdą frakcję oznaczano w szerokim zakresie stężeń pod kątem jego zdolności do stymulowania wzrostu spoczynkowych komórek B o wysokiej gęstości pławnej ze śledziony, jak opisano uprzednio (J. Immunol. 131: 581, 1983). Określona pożywka wolna od surowicy była użyta do wszystkich analiz [IMDM (Gibco), uzupełniona 5 x 10⁵ 2-e-merkaptoetanol, 5 μg/ml transferryna nasycona żelazem (Boehringer, Lewes, GB), 0,5 mg/ml wolnej od lipidów BSA (Boehringer), 100 U/ml penicyliny (Gibco), 100 μg/ml streptomycyny (Gibco) i niezbędne aminokwasy]. Frakcje pochodzące ze schematu izolacji opisane poniżej testowano bezpośrednio jak i w kombinacji z submitogennym stężeniem LPS (0,25 μg/ml). Jak będzie opisane, w miarę oczyszczania białko LAIT wykazało właściwości mitogenne.

(ii) Wysalanie białek zawartych w preparatach serwatki siary przeprowadzono stosując kolejne strącanie (NH4)2SO4. Stosowano kolejne zwiększające się stężenia soli 42%, 50%, 62%, 65% (obj/obj) siarczanu amonu (AS). Tak więc, stężenie AS w supernatancie materiału strącanego przy 42% zwiększano do 50%, odzyskiwano materiał strącony przy 50%, i stężenie AS w pozostałym supernatancie zwiększano do 62%, itd. Każdy osad strącony AS rozpuszczano w 10 mM Tris-HCI, pH 8,0 zawierającym 0,15 M NaCI i 1 mM AEBSF (TNAEBSF). Te frakcje odsolono, zaś bufor zmieniono na TNAEBSF

PL 193 670 B1 stosując kolumny 10DG, i oznaczano w nich bioaktywność. Większość aktywności promującej aktywność komórek B wyizolowano z osadu 62% AS według powyższego schematu (nie przedstawiono).

(iii) Aktywność następnie wzbogacono i ostatecznie oczyszczono stosując kolejno trzy techniki oczyszczania białek. 50 miligramów frakcji wzbogaconej za pomocą 62% AS nałożono na anionową kolumnę wymienną i materiał rozdzielono stosując gradient soli 50 mM do 400 mM NaCI w 10 mM Bis-tris propanie, z równoczesnym gradientem pH od 7,5 do 9,5. Figura 1A przedstawia profil elucji z tej kolumny, a Tabela 1A pokazuje frakcje zawierające szczytową aktywność, frakcję #57. Dwadzieścia miligramów #57 następnie nakładano na kolumnę do sączenia molekularnego zrównoważoną w 20 mM Tris-HCI pH 8,0 zawierającym 0,45 M NaCI. Profile elucji tego frakcjonowania przedstawiono na Figurze 1B, a aktywność frakcji szczytowej #35 w Tabeli 1B.

Tabela 1A

	CPM x 10-3
Brak bodźca	0,8
LPS 50 pg/ml	152,5
LPS 0,25 pg/ml	3,9
Frakcja 57 + LPS 0,25 μg/ml	108,7

Tabela 1B

	CPM x 10-3
Brak bodźca	0,4
LPS 50 pg/ml	102,1
LPS 0,25 pg/ml	1,3
Frakcja 36 + LPS 0,25 μg/ml	76,0

Tabela 1C

	CPM x 10-3
Brak bodźca	0,7
LPS 50 pg/ml	135,2
LPS 0,25 pg/ml	3,5
Frakcja 25 + LPS 0,25 μg/ml	112,0

Następnie naniesiono jeden miligram frakcji #38 na kolumną z hydroksyapatytem w 1 mM NaCI i wyeluowano stosując gradient buforu fosforanowego pH 6,8 od 1 do 500 mM. Profil elucji przedstawiono na Figurze 1C, a związaną z nim aktywność przedstawiono w Tabeli 1C.

Wstawka na Figurze 1C przedstawia analizą SDS-PAGE frakcji ze szczytową aktywnością, a następnie barwienie srebrem, i przedstawia pojedynczy główny prążek z względną masą cząsteczkową 46-50 kD.

Analiza sekwencji bydlęcego białka LAIT

Oczyszczone białko nBo-LAlT poddano analizie sekwencyjnej. N-koniec okazał się być zablokowany. Materiał poddano hydrolizie za pomocą albo bromocyjanu albo trypsyny. Powstało pięć fragmentów, które oczyszczono stosując HPLC fazy odwróconej, lub SDS-PAGE, a następnie elektrotransfer na błonę PVDF przed sekwencjonowaniem.

Jak przedstawiono na Figurze 2, wszystkie pięć fragmentów można było uszeregować ze znaczącą homologią z ludzkim CD14.

PL 193 670 B1

Oczyszczanie białka LAIT z siary bydlęcej i ludzkiej za pomocą powinowactwa nBo-LAlT wyizolowany za pomocą klasycznych technik frakcjonowania białka użyto do przygotowania poliklonalnego przeciwciała z królika (#842). Frakcję IgG tego antyserum oczyszczono na

Sepharose-Białko A, a następnie skoniugowano z Sepharose 4B.

Homologia sekwencji nBo-LAlT i ludzkiego CD14 (HuCD14) wskazywała, że Bo-LAlT może być bydlęcym homologiem CD14. Badano to dalej przez wytworzenie kolumny powinowactwa stosując dostępne monoklonalne przeciwciało (mAb) specyficzne w stosunku do HuCD14. To przeciwciało, 63D3 (PNAS 77: 6764, 1980) oczyszczono z odpowiedniego supernatantu hybrydomy na kolumnie powinowactwa złożonej z mAb 187,1 [kappa ze szczura anty-mysz (Hybridoma 1:5, 1981)] skoniugowanej z Sepharose 4B i oczyszczony mAb następnie koniugowano z Sepharose 4B.

Klarowaną serwatkę z siary następnie kolejno wysalano stosując siarczan amonu jak opisano powyżej. Ludzką serwatkę z siary frakcjonowano na kolumnie Sephacryl S100 HR. Frakcję zawierającą szczyt aktywności promującej wzrost komórek B następnie oczyszczano techniką powinowactwa stosując albo kolumnę z 842-Sepharose dla materiału bydlęcego, lub kolumnę z 63D3-Sepharose dla materiału ludzkiego.

Analiza SDS-PAGE oczyszczonego za pomocą techniki powinowactwa Bo-LAlT i oczyszczonego za pomocą techniki powinowactwa ludzkiego CD14 z siary przedstawiono na Figurze 3, a związaną aktywność promującą wzrost komórek B przedstawiono w Tabeli 2. Jak pokazano, wyizolowano główny prążek z obu preparatów siary, materiał bydlęcy p46-50 (Figura 3, ścieżka 3) i cząsteczkę ludzką p50-52 (Figura 3, ścieżka 4).

Tabel a 2

	Eluat bydlęcy #842 pH 2,5	Eluat ludzki 6303 pH 2,5
100 ng/ml	20,00*	0,3
10 ng/ml	1,49	0,3
• + LPSj	16,50	21,1
• +b-7-6	5,17	8,5

* Cyfry przedstawiają cpm x 10^-3 po 40 godzinach hodowli.

Biaktywność przedstawiona w Tabeli 2 wykazuje, że Bo-LAlT oczyszczany za pomocą powinowactwa w stężeniu 100 ng/ml stymuluje wzrost spoczynkowych mysich komórek B. Po dodaniu wstężeniu 10 ng/ml, materiał ten nie był już mitogenny, ale kostymulacja została uzyskana po dodaniu albo submitogennej ilości LPS albo mAb specyficznego w stosunku do mysiego IgM, b-7-6 (Eur. J. Immunol. 14: 753, 1984). Ludzki materiał oczyszczony za pomocą powinowactwa nie był sam z siebie mitogenny w badanych stężeniach, ale przy 10 ng/ml wzrost komórek B był stymulowany równie wydajnie przez dodatkowe czynniki jak przy materiale bydlęcym.

Bioaktywność nBo-LAlT jest wrażliwa na ciepło. Jak przedstawiono na Fig. 4A, traktowanie oczyszczonego za pomocą powinowactwa Bo-LAlT w 95°C przez 10 minut niszczy aktywność stymulującą wzrost komórek B. Podobne traktowanie LPS nie miało żadnego wpływu na jego aktywność (wstawka w Figurze 4A). Co więcej, poliklonalne anty-Bo-LAlT, #842, skutecznie blokowało stymulującą wzrost komórek B aktywność nBo-LAlT, nie wpływając na aktywność LPS. Patrz Figura 4B oraz wstawka.

Molekularne klonowanie genomowego bydlęcego CD14

Bydlęcą genomową bibliotekę lambda EMBL3 SP6/T7 (Clontech) przeszukano za pomocą fragmentu 1,5 kb ludzkiego CD14 cDNA (otrzymany od R. Ulevitch, Scripps Institute). Uzyskano piętnaście dodatnich sygnałów, oraz wybrano klon „B2 o najsilniejszym sygnale do dalszej analizy i klonowania bydlęcego CD14.

Wyizolowany i oczyszczony fagowy DNA z klonu B2 miał wstawkę o wielkości około 15 kb. Oczyszczony DNA strawiono, i powstały fragment 7,1 kb EcoRI-Xhol zawierający sekwencję homologiczną do ludzkiego CD14 subklonowano do pBluescriptSK⁺ (Stratagene). Mapowanie restrykcyjne z zastosowaniem szerokiego zakresu enzymów, a następnie hybrydyzacja z sondą ludzkiego CD14 DNA pozwoliły na lokalizację bydlęcego genu CD14 w obrębie sklonowanego fragmentu (Figura 5A). Wykonano dalsze mapowanie restrykcyjne w celu subklonowania czterech krótszych fragmentów (I-IV)

PL 193 670 B1 do pBluescriptSK⁺, a następnie poddano sekwencjonowaniu około 5 kb odpowiadające całemu genowi bydlęcemu CD14 (Figura 5C). Fragment l (EcoRI-BamHI, 3,2 kb); II (Pstl-Pstl, 1,35 kb), III (Pstl-Pstl,

0,3 kb) i IV (Pstl-Xhol, 0,95 kb) zastosowano do konstrukcji zagnieżdżonych zachodzących na siebie jednokierunkowych delecji. Te fragmenty dostarczyły ciągłej sekwencji bydlęcego locus CD14. Figura

5B przedstawia organizacjębydlęcego fragmentu genomowego CD14.

Molekularne klonowanie bydlęcego cDNA CD14

Poli(A⁺) RNA izolowano z limfocytów obwodowej krwi bydlęcej oraz użyto Gigapack II Packaging Extract (Stratagene) do pakowania DNA zrekombinowanych fagów lambda. Przygotowano bibliotekę cDNA stosując wektor Excell EcoRI/CIP z „Time Saver cDNA Synthesis Kit”(Pharmacia).

Bibliotekę przeszukano sondą pochodzącą z kodującego ulegającego translacji obszaru bydlęcego genomowego fragmentu CD14 za pomocą PCR (szczegóły są podane poniżej w części opisującej przygotowania zrekombinowanego wektora ekspresyjnego bakulowirusa z fragmentem bydlęcego CD14). Sondę znakowano za pomocą ³²P metodą syntezy drugiej nici ze zdegenerowanymi heksanukleotydami jako starterami (Oligolabelling Kit, Pharmacia Biotech). Procedury przeszukiwania przeprowadzono w warunkach ostrych (0,1 x SSC, 1% SDS, 65°C przez 3 godziny). Jeden z uzyskanych klonów (ExCell/BoCD14-1) zawierał wstawkę 1,4 kb, który subklonowano do pBluescriptSK⁺ izsekwencjonowano stosując subklony pBS/BoCD14 zawierającego kolejne zachodzące na siebie jednokierunkowe delecje (Nested Deletion Kit, Pharmacia).

Ten bydlęcy klon CD14 cDNA składa się z 1327 bp. Po kodonie inicjacyjnym ATG następuje otwarta ramka odczytu 1116 nt i kodon stop TAA przy nukleotydzie 1202. Otwarta ramka odczytu jest oskrzydlona przez 82 bp 5' sekwencji nie ulegających translacji i 122 bp 3' sekwencji nie ulegającej translacji. Sygnał poliadenylacji 5'-ATTAAAA-3' jest umieszczony 105 bp w stronę 3' kodonu terminacyjnego.

Uszeregowanie sekwencji genomowych i cDNA CD14 wykazuje, że są kolinearne od początku 5' cDNA do pierwszego i jedynego intronu (88 bp), który jest spotykany zaraz po kodonie inicjacyjnym ATG. Reszta sekwencji kodującej jest nieprzerwana. Tak więc organizacja egzonintron uprzednio opisana dla ludzkiego i mysiego CD14 jest dokładnie zachowywana w bydlęcym CD14. Porównanie poddanej translacji sekwencji nukleotydów bydlęcego cDNA CD14 z ludzkimi i mysimi CD14 cDNA wykazało 74,2% i 62,6% identyczności nukleotydów, odpowiednio, w obszarach kodujących (Figura6).

Pierwszorzędową budowę białka bydlęcego CD14 wydedukowano z sekwencji cDNA i składa się ono z 374 aminokwasów. Po pierwszej metioninie następuje 15 aminokwasów hydrofobowych i/lub obojętnych, typowych dla eukariotycznych peptydów sygnałowych. Uszeregowanie sekwencji aminokwasów bydlęcego CD14 z ludzkim i mysim CD14 wykazuje odpowiednio 73,1% i 62,3% (Figura 7). Są trzy potencjalne miejsca N-glikozylacji (Asn-X-Thr/Ser), które są wszystkie konserwowane w ludzkim i mysim CD14. Cowięcej, bydlęcy CD14 zawiera 10 motywów powtórzonych bogatych w leucynę (LXXLXL), wspólnych dla zarówno ludzkiego jak i mysiego CD14 (J. Immunol 145: 331,1990).

Ekspresja zrekombinowanego bydlęcego CD14 wkomórkach owadów

Przy przygotowaniu fragmentów DNA dla produkcji zrekombinowanych białek CD14, wygenerowano fragmenty pełnej długości obszarów CD14 ulegających translacji za pomocą PCR. Specyficzne zestawy primerów PCR opracowano na podstawie informacji osekwencji uzyskanej z bydlęcego cDNA CD14. Primer PCR dla 5' końca zawierał: dwa miejsca rozpoznawane przez Nhel; sekwencję Kozak; kodon inicjacyjny ATG; i pierwsze 17-21 nukleotydów obszaru ulegającego translacji. Primer do PCR dla 3' końca zawierał: dwie sekwencje rozpoznawane przez Nhel; i ostatnie 21-24 nukleotydów z ulegającej translacji sekwencji do (oraz wyłączając) kodon stop TAA (Figura 8A).

Bydlęcy obszar ulegający translacji zamplifikowano stosując genomowy fragment 7.1 kb EcoRIXhol CD14 (patrz powyżej) jako matrycę. PCR przeprowadzono stosując polimerazę DNA Pwo (Boehringer). Amplifikację przeprowadzono dodając 5 ng matrycowego DNA, 10 mM Tris-HCI pH 8,85, 25mM KCI, 5 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 250 mM każdego dNTP, 250 nM każdego primera, i 5 jednostek polimerazy DNA Pwo w końcowej objętości 100 pi. Próbki amplifikowano przez 30 cykli w temperaturze hybrydyzacji 70°C stosując DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer).

Zamplifikowane fragmenty strawiono Nhel i indywidualnie subklonowano poniżej promotora polihedryny w wektorze bakulowirusowym do transferu pETL-HA (C. Richardson, OCI/Amgen). Wektor ten pochodzi od pETL (Methods in Molecular Biology 39: 161, 1995) i zawiera 3' 30 bp fragment DNA Nhel-BamHI kodujący nonapeptyd pochodzący z hemaglutyniny grypy (HA), a po nim kodon stop TAG (5'-TAC CAA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCT TAG-3') (SEQ ID NO: 13). Zrekombinowane wektory do transferu indywidualnie kotransfekowano z dzikim bakulowirusem polihedrozy jądrowej Autographa

PL 193 670 B1 californica (AcMNPV, Linear Transfection Module, lnvitrogen) do komórek Sf9 (Methods in Molecular

Biology 39: 161, 1995). Wybrano klony zrekombinowanych bakulowirusów i oczyszczono je zgodnie z ustalonymi protokołami (Methods in Molecular Biology 39: 161, 1995). Komórki Sf9 zakażano zrekombinowanym bakulowirusem z wielokrotnością 5-10:1.

Przeprowadzono analizę zależności od czasu w celu ustalenia optymalnego okresu czasu wymaganego by zakażone komórki Sf9 wydzielały zrekombinowane białka CD14. Analiza techniką immunotransferu pożywek hodowlanych pobranych w różnych punktach czasowych za pomocą monoklonalnego przeciwciała anty-HA 12CA5 (Cell 57: 787, 1984) wykazała, że ekspresja zrekombinowanych białek CD14 osiągała maksymalny poziom po 96 godzinach. Ten okres wybrano w dalszych eksperymentach do produkcji zrekombinowanych białek do biooznaczeń (patrz poniżej). Analiza metodą Western bydlęcego zrekombinowanego CD14 pochodzącego z Sf9 jest przedstawiona na Fig. 9.

Ekspresja zrekombinowanego bydlęcego CD14 w komórkach ssaczych

Zastosowaliśmy zmodyfikowaną wersję wektora pBPV (Episomal Mammalian Expression Vector, Pharmacia) dla stabilnej ekspresji zrekombinowanego bydlęcego CD14 w komórkach ssaka. Aby umożliwić bezpośrednią selekcję stransformowanych komórek zmodyfikowano pBPV włączając gen oporności na neomycynę, który wprowadzono 3,4 kb powyżej kasety ekspresyjnej. W tym celu, subklonowano fragment 1,95 kb Hindlll-Xbal z pBCMGSNeo (Eur. J. Immunol. 18: 98, 1988) do pCRII (lnvitrogen). Zrekombinowany konstrukt, pCRII-neo oczyszczono, a sklonowany fragment zamplifikowano za pomocą PCR. Primery do PCR zaprojektowano tak, by miejsca rozpoznawane dla Sall były włączone zarówno na 5' i na 3' końcach. Sekwencje primerów były komplementarne do regionu polilinkera wektora pCRII, flankując miejsca klonowania Hindlll (Primer A) i Xbal (Primer B).

Primer A: 5'-GCA GTC GAC ACT ATA GAA TAC TCA AGC-3' (SEQ ID NO: 14)

Primer B: 5'-TTC GTC GAC ATT GGG CCC TCT AGA-3' (SEQ ID NO: 15)

Pierwszy produkt strawiono Sall, oczyszczono na żelu i subklonowano w miejscu do klonowania Sall pBPV w tej samej orientacji transkrypcyjnej jak zawartej kasety ekspresyjnej. Wygenerowano preparaty plazmidowe zmodyfikowanego wektora ekspresyjnego pBPVneo-13 (Plasmid Maxi Kit, Quiagen).

Fragment DNA kodujący ulegający translacji obszar bydlęcego CD14 przygotowano poprzez amplifikacją PCR genu w wektorze pETL-HA. 5' koniec primera PCR stosowanego w reakcji amplifikacji zawierał: miejsce rozpoznawane przez Xhol, następnie miejsce rozpoznawane przez Nhel (obecne w wektorze pETL-HA); sekwencję Kozak; kodon inicjacyjny ATG i pierwsze 11 do 13 nukleotydów regionu ulegającego translacji. Rdzeniowy primer do PCR dla 3' końca zawierał sekwencję kodującą HA, która była przedłużona, jak dla sekwencji 5', przez włączenie miejsca rozpoznawanego przez Xhol. Primery przedstawiono na Figurze 8B.

PCR przeprowadzono stosując polimerazę DNA Pwo (Boehringer Mannheim). Amplifikację przeprowadzono dodając 5 ng matrycowego DNA, 10 mM Tris-HCI pH 8,85, 25 mM KCI, 5 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 250 mM każdego dNTP, 250 nM każdego primera, i 5 jednostek polimerazy DNA Pwo w końcowej objętości 100 pl. Próbki amplifikowano przez 30 cykli w temperaturze hybrydyzacji 70°C stosując DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer).

Fragmenty zamplifikowane trawiono Xhol i oczyszczono w żelu. Te fragmenty następnie subklonowano do pBPVneo-13 poniżej promotora mysiej metalotioneiny l. Przed subklonowaniem, pBPVneo poddano działaniu odpowiedniego enzymu restrykcyjnego i defosforylowano stosując fosfatazę z jelita cielęcego. Zrekombinowane plazmidy przygotowano stosując zestaw Plasmid Maxi Kit (Quiagen).

Zrekombinowany plazmid (pBPVneo13-BoCD14) transfekowano do mysiej linii raka sutka C127 (PNAS 78: 2727, 1981) stosując 20 pg DNA/10⁷ komórek. Transfer DNA osiągano za pomocą elektroporacji przy 960 pF/280V stosując Gene pulser (Bio-Rad Laboratories). Stabilne transformanty selekcjonowano w obecności 1 mg/ml G418 (Life Technologies).

Transfektanty wyrażające wysoki poziom błonowego CD14 (nietransfekowane C127 są negatywne dlaCD14) wzbogacano przez barwienie immunofluorescencyjne a następnie sortowanie komórek aktywowane przez fluorescencją stosując FACStar Plus Becton Dickinson. Poziom ekspresji na błonie egzogennego białka dobrze korelował z ilością wydzielanego CD14 ocalonego w supernatantach po 48godzinach stycznych kultur transfekowanych komórek C127. W odróżnieniu od oczyszczania zrekombinowanego materiału wygenerowanego w komórkach owadów, okazało się niemożliwe oczyszczenie materiału pochodzącego z C127 przy zastosowaniu kolumny powinowactwa 12CA5Sepharose. Mogło to wynikać ze strat znacznika C-końcowego HA na zrekombinowanych białkach pochodzących z komórek C127. Dlatego też zrekombinowany CD14, pochodzący z C127, oczyszczano

PL 193 670 B1 za pomocą powinowactwa na Sepharose 842. Analiza immunotransferów zrekombinowanego bydlęcego CD14, pochodzącego z komórek C127, jest przedstawiona na Figurze 9.

Porównanie aktywności promujących wzrost i różnicowanie nBo-LAIT i LPS

Wyniki przedstawione na Figurze 10 pokazują, że natywny Bo-LAIT wspiera wzrost spoczynkowych komórek B śledziony myszy o wysokiej gęstości pławnej z wydajnościami około 200 razy wyższymi niżLPS. Tak więc, nBo-LAlT przy stężeniu 50 ng/ml powoduje indukcję syntezy DNA porównywalną z obecnością 10 μg/ml LPS.

Zdolność nBo-LAlT do indukowania wzrostu komórek B idzie w parze z jego zdolnością do indukowania różnicowania spoczynkowych komórek B śledziony myszy, o wysokiej gęstości pławnej, do wydzielania immunoglobuliny. Jak przedstawiono na Figurze 11, łączna ilość IgM indukowana przez 500 ng/ml nBo-LAlT jest porównywalna z indukowaną przez 10 μg/ml LPS. Oceniano ilość wydzielanej IgM w czasie 24-godzinnego okresu hodowli. 500 ng/ml nBo-LAlT indukowało 956±10 ng/ml; 754±8,7 ng/ml i 25±1,4 ng/ml w czasie 24-godzinnych okresów hodowli 48-72 godzin; 72-86 godzin i 86-120 godzin, odpowiednio. Odpowiadające wartości pochodzące od hodowli stymulowanych 10 μg/ml LPS były 1442±71 ng/ml; 874±32 ng/ml i 183±3 ng, odpowiednio. Tak więc, nBo-LAlT ma zdolność do indukcji spoczynkowych komórek B śledziony myszy, o wysokiej gęstości pławnej, do wydzielania immunoglobulin z prędkością porównywalną z obserwowanymi gdy komórki B są stymulowane przez najsilniejszy obecnie znany bodziec. Co więcej, ma zdolność do robienia tego w stężeniach wynoszących 1-10% stężeń LPS.

Oceniano także zdolność nBo-LAlT do indukowania zmiany izotypu spoczynkowych mysich komórek B. Oceniano supernatanty otrzymane z powyższych kultur także pod kątem obecności izotypów IgG. Stwierdzono, że 500 ng/ml nBo-LAlT o 10 ng/ml LPS indukowało kumulatywne poziomy (ng/ml w dniu 5) lub lgG1: 7,0±0,1 i 5,6±0,6; Ig2a: 358±3 i 406±8; lgG2b: 8±1 i 11±2; lgG3: 75±5 i75±0,5; i lgA: 6,5±1,5 i 5,0±0,3, odpowiednio. Tak więc, nBo-LAlT ma zdolność indukowania pewnej ilości zmiany izotypu w spoczynkowych komórkach B myszy pod nieobecność komórek T.

Porównanie aktywności promujących wzrost białek nBo - rBo-LAlT

Zrekombinowane postacie bydlęcego CD14, zarówno pochodzące z komórek owadów i komórek ssaków, mają zdolność do indukowania wzrostu spoczynkowych komórek B śledziony myszy, owysokiej gęstości pławnej. Jak przedstawiono na Figurze 12, rBoCD14 pochodzący z komórek owadów i oczyszczony techniką powinowactwa na 12CA5 Sepharose indukuje znaczną syntezę DNA w stężeniach 0,2-3 μg/ml. Porównywalną aktywność dawał materiał zrekombinowany pochodzący z ssaczego układu ekspresyjnego i obie postacie zrekombinowane podtrzymują wzrost komórek B przy stężeniach ng/ml, porównywalne z aktywnością obserwowaną dla nBo-LAlT pochodzącego z siary.

Zapewnienie, że w bioaktywności, w której pośredniczy nBo-LAlT oczyszczony z siary bydlęcej za pomocą klasycznych technik frakcjonowania lub oczyszczania za pomocą chromatografii powinowactwa rzeczywiście pośredniczy obserwowane białko pochodzi z oceny bioaktywności, którą powoduje zrekombinowany bydlęcy CD14. Jak zilustrowano na Figurze 9, pozorne masy cząsteczkowe obu zrekombinowanych form nie są identyczne z nBo-LAIT. Przyczyna obserwowanych różnic w pozornych masach cząsteczkowych nie jest jasna, ale może wynikać albo z odrębnych, albo posttranslacyjnych modyfikacji odrębnych wielkości białek rdzeniowych, lub z obu tych wielkości. Rozpuszczalny CD14, pochodzący z monocytów, został udokumentowany i może być generowany przez jeden z trzech obecnie zrozumiałych mechanizmów, z których każdy by dawał białka o odrębnych masach cząsteczkowych. Może być wydzielane jako cząsteczka o pełnej długości (Eur. J. Immunol. 23: 2144, 1993; Eur. J. Immunol. 25: 604, 1995); wyrażana na błonie postać związana z GPI może być przecięta przez fosfolipazy (J. Immunol. 141: 547, 1988; EMBO J. 13: 1741, 1994), zaś wyrażana na błonie postać związana z GPI może być przecięta przez proteazy serynowo/treoninowe, przypuszczalnie wyrażane w zewnętrznej błonie plazmatycznej samego monocytu, i aktywowane w dotychczas niescharakteryzowany sposób (J. Immunol. 147: 1567, 1991). Pozostaje do ustalenia czy odrębne pozorne masy cząsteczkowe rBo-LAlT i pochodzącego z siary nBo-LAlT wynikają z odrębnych mechanizmów koi/lub posttranslacyjnych zrekombinowanych materiałów wynikających z ich odpowiednich układów ekspresyjnych, czy odrębnych wielkości białek rdzenia, czy z obu.

Aktywność promująca wzrost nBo-LAlT jest specyficzna w stosunku do komórek B

Po zbadaniu bioaktywności nBo-LAlT na komórki B myszy zbadano efekty na fizjologię komórek T myszy. Fakt, że wyizolowane oczyszczone komórki B reagują na nBo-LAlT nie wyklucza możliwości, że Bo-LAIT może też aktywować komórki T.

PL 193 670 B1

Wyizolowano komórki T z węzłów chłonnych za pomocą selekcji negatywnej na kolumnach anty-lg (Biotex Labora) jak opisano uprzednio (Eur. J. Immunol. 24: 967, 1994). Powstała populacja przechodząca przez kolumnęzawierała >95% komórek CD3⁺ i >0,5% komórek mlg⁺ według oceny za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i analizy FACS. Spoczynkowe komórki B śledziony myszy, o wysokiej gęstości pławnej, izolowano z tych samych myszy, i oceniano reakcję na nBo-LAlT zarówno komórek T węzłów chłonnych jak i komórek śledziony. Czystość tych preparatów oceniano funkcjonalnie przez analizę ich odpowiedzi na mitogeny specyficzne w stosunku do komórek B LPS, i specyficzny w stosunku do komórek T, konkawalinę A (ConA). Jak zilustrowano w prawej części Figury 13, komórki B, ale nie komórki T, odpowiadały na ConA. Jak zilustrowano w lewej części, komórki T nie reagowałyna nBo-LAlT w badanym zakresie stężeń podczas gdy komórki B reagowały na nBo-LAlT w stężeniach 10 ng/ml i wyższych.

Wzrost komórek B indukowany przez białko LAIT i bydlęca surowica płodowa

Niedawno wykazano, że monocyty odpowiadają na rozpuszczalny CD14 (sCD14) izolowane z moczu pacjentów z zespołem nerczycowym przez produkcję sprzyjających zapaleniu cytokin (Eur. J. Immunol. 24: 17780, 1994) w nieobecności pochodzącego z surowicy białka wiążącego (LBP). Przeciwnie, zdolność niskich stężeń LPS do stymulacji produkcji tych samych cytokin przez monocyty wyrażające CD14 zależy od surowicy (J. Exp. Med. 176: 719, 1992). Zależność od surowicy jest znoszona przy wysokich stężeniach LPS. Tak więc produkcja cytokin przez monocyty indukowana przez 10 ng/ml LPS ściśle zależy od LPB surowicy, ale indukowana przez 50 μg/ml nie.

Aby ustalić, czy obecność LBP z surowicy płodowej bydlęcej będzie wpływać na zdolność niskich stężeń nBo-LAlT do indukowania wzrostu komórek mysich B o wysokiej gęstości pławnej, badano odpowiedź wywoływaną przez 500 ng/ml nBo-LAlT w szerokim zakresie stężeń FBS w porównaniu z indukowanym przez 50 μg/ml LPS. Jak przedstawiono na Figurze 14, na odpowiedź komórek B na oba te bodźce nie wpływa obecność do 9% FBS w pożywce hodowlanej.

Wzrost komórek B indukowany przez białko LAIT i nCD14

Zróżnicowana wrażliwość komórek B i monocytów na aktywację, w której pośredniczy LPS mogła być skorelowana z ekspresją błonowego CD14 (mCD14) przez te drugie. Wykazano bezpośrednio, że wrażliwość aktywacji, w której pośredniczy LPS może być dramatycznie zwiększona przez obecność mCD14 na odpowiadających komórkach. Specyficznie, wykazano, że wrażliwość mCD14 ujemnej linii komórkowej pre-B na LPS jest zwiększana około 1000 razy po wymuszonej ekspresji egzogennego mCD14 połączonego z GPI (J. Exp. Med. 175: 1697, 1982). Pozostaje sporne czy pierwotne komórki B wyrażają mCD14. Wysoka aktywność specyficzna Bo-LAlT względem LPS w aktywacji komórek B jest zgodna z tym, że jego sposób aktywacji jest niezależny od ekspresji CD14.

Aby ocenić bezpośrednio udział ekspresji mCD14 w aktywacji komórek B, w której bierze udział Bo-LAlT oceniano obecność CD14 specyficznego mRNA w populacji komórek B myszy, o wysokiej gęstości pławnej, stosowanej do badania odpowiedzi. Izolowano całkowity RNA z 10⁷komórekz każdej z trzech populacji pochodzących ze śledziony: niefrakcjonowane splenocyty; zubożone w komórki T, frakcjonowane na Percollu komórki o wysokiej gęstości pławnej, stosowane rutynowo w oznaczeniach wzrostu z udziałem białka LAIT; i komórki wyrażające Ig na błonie wyizolowane z komórek o wysokiej gęstości pławnej zubożonych w komórki T przez znakowanie immunofluorescencyjne FITC połączone z mAb szczura specyficznym w stosunku do mysiego IgK (187.1 (Hybridoma 1: 5, 1981)) i następnie oczyszczanie za pomocą sortowania Becton Dickinson FACStarPlus. Jak przedstawiono na Figurze 15, te trzy populacje zawierały 59,2%, 83,5% i 99,8% komórek mlg⁺. Wyizolowany RNA z tych populacji rozdzielono na 1,2% żelu formaldehydowym, oraz przeniesiono na błonę nylonową (GeneScreen), łączono krzyżowo, prehybrydyzowano i hybrydyzowano kolejno z dwiema sondami.

Mysia sonda CD14 pochodziła z genomowego DNA za pomocą PCR. Specyficznie przeprowadzono amplifikację przez dodanie polimerazy DNA Pwo (Boehringer Mannheim) do 0,4 μg genomowego DNA Balb/c z primerem lewym: 5'-CTA GAA TTC TCT CCC GCC CCA CCA GAG CCC TGC G-3' (SEQ ID NO: 11) i primerem prawym: 5'-CTA GAA TTC TTA AAC AAA GAG GCG ATC TCC TAG G-3' (SEQ ID NO: 12). Próbki amplifikowano przez 30 cykli w urządzeniu DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer) stosując temperaturę hybrydyzacji 55°C. Zamplifikowany fragment rozdzielano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, wycinano z żelu i oczyszczano. Sonda L32 (Nucl. Acids Res. 16: 10751, 1988) została zastosowana do normalizacji ładowania RNA. Każdą sondę(100 ng) znakowano stosując zestaw do znakowania losowymi oligonukleotydami (Pharmacia) do aktywności specyficznej 0,2-1 x 10⁹ cpm^g DNA. Błony hybrydyzowano z sondą i płukano w 0,2 x SSC, 1% SDS w 65°C przez 2 godziny i poddano autoradiografii.

PL 193 670 B1

Jak przedstawiono na Figurze 15, RNA pochodzący zarówno z niefrakcjonowanych splenocytów i splenocytów o wysokiej gęstości pławnej zawierał mRNA specyficzny w stosunku do CD14, podczas gdy komórki B oczyszczane na FACS go nie zawierały. Sygnał CD14 w zubożonych w komórki T splenocytach o wysokiej gęstości pławnej, odtąd określanych jako spoczynkowe komórki B, prawdopodobnie pochodzi od zanieczyszczających monocytów, jako że te populacje są 86-90% mlg⁺, ale >98% MHC klasy II⁺ jak oceniono za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i analizy FACS. Jest więc możliwe, że wzrost komórek B, w którym pośredniczy Bo-LAlT w tej populacji jest pośredni, oraz bierze w nim udział aktywacja zanieczyszczających monocytów.

Porównano odpowiedź zubożonych w komórki T splenocytów czyszczonych na Percollu i komórek mlg⁺ czyszczonych za pomocą FACS pochodzących z tej populacji na nBo-LAlT i wzrost indukowany przez LPS. Jak przedstawiono na Figurze 16, obie populacje reagują znacząco na oba bodźce. 10 razy wyższa stymulacja uzyskana z 99,8% czystą populacją komórek B jest wynikiem zmniejszonego niestymulowanego tła uzyskanego w tych hodowlach (Figura 16).

Wzrost komórek B indukowany przez białko LAIT i CD40

Jak opisano powyżej, stwierdzono, że mAbs specyficzne w stosunku do CD40, które ulega ekspresji na błonie komórek B, indukują wzrost mysich komórek B (Sem. in Immunol 6: 267, 1994; PNAS 83: 4494,1986; J. Immunol. 140: 1425,1988).

Aby stwierdzić, czy istnieje jakiś stosunek między aktywacją komórek indukowaną przez antyCD40 i białko LAIT zbadano zdolność rBo-LAIT do stymulowania wzrostu komórek śledziony myszy B o wysokiej gęstości pławnej izolowanych albo z konwencjonalnych myszy C57BL/6, albo myszy C57BL/6, w których zniszczono ekspresję CD40 przez kierowaną dysrupcję genu (Immunity 1: 167, 1994). Jak przedstawiono na Figurze 17, nie stwierdzono różnic w odpowiedzi tych komórek B w badanym zakresie stężeń rBo-LAIT.

Te wyniki wykazują, że CD40 jako taki nie musi brać udziału w sygnalizacji, ale nie można wykluczyć możliwości, że systemy generacji drugiego posłańca stosowane przez CD40 i domniemany receptor błonowy dla białka LAIT są wspólne.

Analiza porównawcza natywnego ludzkiego, bydlęcego i mysiego CD14

Po zaobserwowaniu aktywności nBo-LAlT i rBo-LAIT na mysie komórki B zbadano aktywności mysiego CD14 (Mo) i ludzkiego CD14 (Hu) wyizolowanego z płynów innych niż siara. Wykazano, że Hu-CD14 jest obecny w moczu pacjentów z zespołem nerkowym (Eur. J. Immunol. 24: 1779, 1994). Hu-CD14 wyizolowano stosując zmodyfikowany protokół. Mocz wytrącano przez dodanie nasyconego (NH4)2SO4 do końcowego stężenia 45% (obj/obj) i strącony materiał usuwano przez wirowanie przy 14000 g przez 30 minut. Następnie zwiększono stężenie (NH4)2SO4 w supernatancie do 75% (obj/obj). Osad osadzono przez 14000 g przez 30 minut i solubilizowano w buforze TN pH 8,0 zawierającym 10 mM Tris, 150 mM NaCI i koktail inhibitorów proteazy „Complete” (Boehringer Mannheim). Nierozpuszczalny materiał usuwano przez wirowanie przy 13000 g przez 15 minut. Supernatant tego wirowania odsalano na kolumnach G10 (Bio-Rad) równoważonych buforem TN pH 8,0. Ten materiał następnie przepuszczano przez Sepharose 4B, do której skoniugowano specyficzny dla ludzkiego CD14 mAb 3C10 (J. Exp. Med. 15: 126, 1983). Związany materiał eluowano w 100 mM octanie, 150 mM NaCI, pH 2,8 i natychmiast zobojętniano przez dodanie jednej dziesiątej objętości 1 M Tris, pH 8,0. Eluat zatężano w wirówce próżniowej, i oznaczano kolorymetrycznie stężenie białka.

Mysi CD14 izolowano z supernatantu mysiej hybrydomy OKT3 (PNAS USA 77: 4914, 1980). Podczas badania przesiewowego populacji komórek pod kątem ekspresji mRNA specyficznego dla CD14, stwierdzono, że każda badana hybrydoma zawierała mRNA. Jeśli fuzja była wynikiem zlania partnerów mysich, produkowany CD14 też ma pochodzenie mysie. Hybrydoma OKT3 spełnia te kryteria. Aby ocenić, czy OKT3 produkuje białko CD14 w wystarczających ilościach, tak aby pozwolić na izolację, materiał zawarty w 1 litrze supernatantu z kultury OKT3 oczyszczono za pomocą powinowactwa na 3C10 Sepharose jak opisano powyżej dla CD14 pochodzącego z ludzkiego moczu. Specyficzność 3C10 zmapowano do reszt 7-10 ludzkiego CD14 (J. Biol. Chem. 270: 361, 1985). Te reszty są w wysokim stopniu konserwowane w bydlęcym i mysim CD14.

Lewa część Figury 18 przedstawia porównawczą analizę barwienia srebrem 1 μg każdego oczyszczonego za pomocą powinowactwa ludzkiego CD14 z moczu (nHu), bydlęcego CD14 z siary (nBo) i pochodzącego z OKT3 mysiego CD14 (nMo). Prawa część Figury 18 ilustruje porównawczą analizę immunotransferu po 250 ng każdego z tych samych trzech gatunków, sondowanych mAb 3C10. Jak przedstawiono, czystość trzech preparatów była porównywalna, jak i ich reaktywność z mAb3C10.

PL 193 670 B1

Pozorne rozbieżności między masami cząsteczkowymi CD14 trzech gatunków i różnicami w liczbie aminokwasów kodowanych przez ich odpowiednie cDNA mogły być wynikiem modyfikacji koi/lub posttranslacyjnych. W tym kontekście, jest ewidentne, że mysie, ludzkie oraz bydlęce CD14 zawierają odpowiednio pięć, cztery i trzy potencjalne miejsca N-glikozylacji.

Oceniono zdolność tych trzech preparatów CD14 do stymulacji wzrostu mysich komórek B. Jak przedstawiono na Figurze 19, CD14 izolowany z trzech gatunków miał porównywalną aktywność specyficzną oraz był aktywny w zakresie stężeń ng/ml. Wyniki wykazują także, że izogeniczny materiał jest czynny, a w szczególności mysi CD14 potrafi stymulować mysie komórki B. Wyniki też wykazują, że CD14 z siary nie jest wyjątkowy w swej zdolności do stymulacji komórek B, i w ten sposób nie jest prawdopodobne by była to specyficzna postać cząsteczki, która jest generowana w wyspecjalizowanych warunkach laktacji.

Aktywność stymulująca wzrost nBo-LAlT na ludzkie komórki B pępowiny

Po obserwacji szeregu bioaktywności nBo-LAlT na mysie komórki B, przebadano ich wpływ na fizjologię ludzkich komórek B. Zastosowano dwa źródła komórek B. Ponieważ jedną możliwą rolą białka LAIT jest udział w stymulowaniu rozwoju układu odpornościowego noworodka, sprawdzono jego zdolność do stymulowania wzrostu komórek B pochodzących z noworodka, a w szczególności z krwi pępowinowej.

Krew pępowinową rozcieńczano 1:1 w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i nałożono na Percoll (Pharmacia) p = 1,077. Gradient wirowano jak opisano przy Figurze 1A. Zebrano interfazę p=1,077/1,000 i płukano dwukrotnie w PBS uzupełnionym 5% płodową surowicą cielącą (FBS). Powstały preparat leukocytów następnie barwiono skoniugowanym z fluoresceiną mAb specyficzną dla markera błonowego CD72. Następnie za pomocą selekcji pozytywnej z użyciem FACS selekcjonowano leukocyty z krwi pępowinowej CD72 dodatnie, co dało czystości >98%. Te pozytywnie wyselekcjonowane komórki B następnie hodowano w określonej pożywce bez surowicy, jak dla mysich komórek B. Jedyną różnicą między testami wzrostu dla komórek B myszy i człowieka było podawanie komórkom ludzkim pulsu tymidyny po 60 godzinach przez 12 godzin, a nie tak jak u myszy po 40 godzinach przez 6 godzin.

Jak przedstawiono na Figurze 20A, nBo-LAlT oddziałuje z mAB specyficznymi dla IgK i ^λ, w swej zdolności do indukowania wzrostu komórek B noworodka. Podczas gdy zarówno unieruchomione (związane z płytką) mAb przeciwko łańcuchowi lekkiemu i 2 μg/ml nBo-LAlT indukują odrębnie wzrost w pobieraniu tymidyny powyżej tła, kombinacja obu daje jeszcze dodatkowy 5-krotny wzrost.

Wyniki te wskazują, że może być możliwe, że białko LAIT spożywane przez karmionego piersią noworodka działa jako zastępca komórek T w stymulacji komórek B, które spotkały antygen, aby rosły i różnicowały się do komórek wydzielających Ig, pod nieobecność w pełni rozwiniętego przedziału komórek T (J. Exp. Med. 169: 2149, 1989; Science 245: 749,1989; Intl. Immunol. 2: 859; Intl. Immunol. 2: 869,1990).

CD14 w ludzkiej siarze i normalnej surowicy

W celu ustalenia stężenia CD14 obecnego w siarze i normalnej surowicy, pobrano próbki siary od dwóch dawców i próbki surowicy od pięciu zdrowych dawców, i oznaczono w nich obecność CD14 stosując specyficzny test ELISA (IBL-Hamburg). Jak przedstawiono w Tabeli 3, surowica z tej grupy zdrowych osobników zawierała stężenia CD14 w zakresie od 1,7-3,2 μg/ml i była niezależna od płci. Te wartości dobrze odpowiadają wartościom, o których donoszą Grunwald i wsp. (J. Immunol. Method. 155: 255,1992).

Tab ela 3

Dawca	Płeć	pg/iril*
A.M.	F	2,8
N.J.	F	2,7
M.J.	M	1,7
E.K.	M	2,9
A.D.	M	3,2

* 2,6-3,4 pg/iril według producenta zestawu do ELISA (IBL, Hamburg)

PL 193 670 B1

Jak przedstawiono na Figurze 21, zawartość CD14 w siarze, określona 22 godziny po porodzie (A.D.) i we wczesnym mleku matki w cztery dni po porodzie (S.B.) była około 20 razy wyższa niż w normalnej surowicy. Od jednego dawcy (S.B.) uzyskano wiele próbek do 78 dni po porodzie i podczas gdy stężenia CD14 spadły znacznie w porównaniu z obserwowanymi w dniu 4, pozostały około 3-5 razy wyższe niż obserwowane w normalnej surowicy, w czasie oznaczanego okresu (Figura 21).

Nie ma dotychczas żadnych danych o stężeniu CD14 w surowicy kobiet karmiących. Tak więc, pozostaje do ustalenia czy wysokie stężenia CD14 obserwowane w siarze i mleku matki są ograniczone do tych płynów, czy też stanowią odbicie uogólnionego wzrostu w stężeniu CD14 we wszystkich płynach ustrojowych kobiet w czasie laktacji.

Być może przejściowa ekspozycja układu odpornościowego noworodka na aktywność CD14 z siary promującą wzrost i różnicowanie komórek odgrywa rolę w rozwoju układu odpornościowego noworodka. Fizjologiczna istotność obecności tej aktywności w siarze jest zgodna z obserwacją, że, tak jak opisano powyżej, funkcja komórek T u noworodka jest upośledzona, być może ze względu na obecność wysokich stężeń TGFei i TGFe2 w siarze i wczesnym mleku matki (J. Cell. Biol. 105: 1039, 1987; Cell 49: 437, 1987; EMBO J. 6: 1633, 1987). Jak pokazano w Tabeli 2, submitogenne stężenia CD14 w połączeniu z submitogennymi stężeniami mAb specyficznego dla błonowej immunoglobuliny, wspierają aktywność komórek B. CD14 może działać jako zastępca komórek T w rozwijającym się układzie odpornościowym noworodka. Jako taki, noworodek może skorzystać z zastosowania CD14 jako dodatku do mieszanek dla niemowląt ze względu na jego efekt stymulujący układ odpornościowy, nieobecny w syntetycznych formułach.

Aktywność promująca nBo-LAlT w stosunku do komórek B ludzkich migdałków

Oceniano bioaktywność nBo-LAlT w stosunku do komórek B izolowanych z dorosłych, samego i w połączeniu z immobilizowanymi (związanymi z płytką) mAb przeciwko łańcuchowi lekkiemu, w stymulacji komórek B izolowanych z ludzkich migdałków.

Komórki B z migdałków przygotowano za pomocą selekcji negatywnej. Leukocyty z migdałków przygotowano jak dla leukocytów krwi pępowinowej. Powstałą populację znakowano biotynylowanym mAb specyficznym w stosunku do CD3ε (Becton Dickenson), a następnie znakowano z „mikropaciorkami” (Becton Dickenson) znakowanymi żelazem. Po jednym płukaniu znakowaną populację przepuszczano przez MACS (Becton Dickenson) i zebrano wyciek. Populacja zawierała <1% komórek T oraz >97% komórek B, jak oceniono za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego stosując mAb specyficzne w stosunku do linii. Komórki B poddano dalszemu frakcjonowaniu na nieciągłych gradientach gęstości Percoll, identycznych do stosowanych do izolacji mysich komórek B, o wysokiej gęstości pławnej. W opisanych oznaczeniach użyto komórki B lokalizujące się na interfazie ρ = 1,085/1,079. Te negatywnie wyselekcjonowane spoczynkowe komórki B frakcjonowane pod względem gęstości hodowano jak opisano poniżej, podawano im puls i zbierano, jak w przypadku komórek z pępowiny.

Jak przedstawiono na Figurze 20B, i w przeciwieństwie do wyników uzyskanych dla komórek B izolowanych z noworodków, nBo-LAlT, samo obecne w stężeniach tak niskich jak 300 ng/ml, stymulowało znaczny wzrost spoczynkowych komórek B migdałków. Co więcej, odpowiedź przy pewnych stężeniach nBo-LAlT była znacznie zwiększona, gdy była oznaczana z unieruchomionymi mAb przeciw łańcuchowi lekkiemu (Figura 20B).

Dojrzałe ludzkie komórki B są podatne na stymulujące wzrost aktywności nBo-LAlT, które są amplifikowane w połączeniu z równoczesną ligacją receptora antygenu komórek B. Te wyniki charakteryzują potencjalne zastosowanie białka LAIT w nośnikach szczepionek, w celu zwiększenia ich działania jako adiuwantu, lub być może przez zmniejszenie zapotrzebowania na adiuwanty.

Ograniczeniem techniki szczepienia jest immunogenność danego preparatu antygenu. Uważa się, że pewne adiuwanty działają przez rekrutację i aktywację specyficznych w stosunku do antygenu komórek T. CD14, jako zastępca komórek T dla specyficznych w stosunku do antygenu reakcji komórek B, może dostarczyć poprawionego sposobu aktywacji komórek B specyficznych w stosunku do antygenu tak, że nie tylko rozrosną się i zróżnicują w komórki wydzielające przeciwciała ale, po aktywacji, będą działały jako skuteczne APC dla rekrutacji komórek T. To by wzmogło zarówno namnażanie specyficznej odpowiedzi i zmianę izotypu, w której pośredniczą komórki T.

Znane są niedobory odporności komórek T. Scharakteryzowano stany niedoboru odporności związane z dysfunkcją komórek T ze wzglądu na brak ekspresji gp39 (CD40L) (który mapuje się w chromosomie X): (i) sprzężony z X zespół hiper IgM (HIM); (ii) pospolity zmienny niedobór odporności (CVI); oraz (iii) agammaglobulinemia sprzężona z chromosomem X (XLA). W niektórych z tych stanów (HIM), wykazano, że komórki T izolowane z pacjentów są niezdolne do aktywacji komórek B

PL 193 670 B1 (Science 259: 990, 1993) i ten fenotyp koreluje z brakiem funkcjonalnego gp39 (CD40L). W tych warunkach, CD14 albo skierowany do indukcji specyficznych odpowiedzi hormonalnych, albo podany jako poliklonalny aktywator komórek B mógłby działać, aby indukować/utrzymywać poziomy izogenicznej

Ig zgodne z ochroną przed codziennym bombardowaniem przez potencjalne patogeny ze środowiska.

Obecność CD14 w siarze jest zgodna z jego rolą w stymulacji komórek B wśród ssących mleko matki noworodków. Skuteczność CD14 we wspomaganiu rozwoju układu odpornościowego noworodka może być oceniona na modelu zwierzęcym.

Samice z niedoborem CD14, wytworzone w wyniku programowanej dysrupcji locus CD14, będą krzyżowane albo z heterozygotycznymi, albo z zubożonymi w CD14 samcami. To pozwoli na ocenę efektu braku CD14 w siarze na rozwój komórek B u noworodków mysich, u których zachodzi, lub nie zachodzi, ekspresja CD14. Specyficznie, porównywana będzie ontogeneza komórek B i akumulacja w surowicy IgM oraz IgG, jak i zdolność tych myszek do specyficznych odpowiedzi odpornościowych.

Co więcej, można ocenić rolę, którą odgrywa CD14 z surowicy (sCD14) w utrzymaniu krążących poziomów „naturalnej” IgM. Poziomy krążących IgG oraz IgM są pod odrębną kontrolą. IgG w surowicy jest w zasadzie nieobecna u myszy hodowanych w środowisku wolnym od antygenu, podczas gdy poziomy IgM są niezmienione. Aby określić potencjalną rolę sCD14 w regulacji poziomów IgM w krwi, myszy mające oraz pozbawione CD14, pochodzące z powyższych krzyżówek, będą hodowane gnobiotycznie.

Deregulowana ekspresja sCD14 jest skojarzona z patologią specyficznych stanów chorobowych. Poziom sCD14 w surowicy pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów (RA) jest podwyższony (Clin. Exp. Immunol. 91(2):207, 1993). Doniesiono także, że istnieje wzrost w ilości aktywowanych monocytów CD14⁺ w maziówce pacjentów z RA (Br. J. Rheumatol. 29(2): 84, 1990; J. Rheumatol. 22(4): 600, 1995). Natomiast pozostaje do ustalenia, czy poziom sCD14 jest podwyższony w płynie maziówki u pacjentów z RD, monocyty CD14⁺ poaktywacji wyrażają proteazy związane z błonami, które mogą rozszczepiać błonowy CD14, co daje produkcję sCD14 (Eur. J. Immunol. 25: 604, 1995). Zgodnie ze zdolnością sCD14 do aktywacji komórek ludzkich, tu opisaną, płyn maziówkowy pacjentów zawiera wysoką częstość zaktywowanych komórek B, z których przynajmniej niektóre mogą produkować czynnik reumatoidalny (Clin. Immono. Immunopathol. 31(2): 272, 1984; Clin. Exp. Immunol. 55(1): 91, 1984). Tak więc, wynika paradygmat obejmujący zwiększoną produkcję sCD14 u pacjentów, i jego możliwy udział w aktywacji komórek B, z której wynika produkcja czynnika reumatoidalnego. Klirans sCD14, w którym pośredniczą przeciwciała, może więc powodować poprawę objawów wynikających z deregulacji aktywacji komórek B oraz produkcji czynnika reumatoidalnego u pacjentów RA. Co więcej, klirans, w którym biorą udział przeciwciała sCD14, by poprawiał zapalenie wspierane przez indukcję przez sCD14 cytokin sprzyjających zapaleniu przez monocyty (Eur. J. Immunol. 24: 1779,1994).

Rutynowa produkcja ludzkich monoklonalnych przeciwciał (mAb) była trudna z szeregu przyczyn, z których bynajmniej nie najmniejszą jest niezdolność do wzbogacania w zaktywowane komórki B o pożądanej specyficzności antygenowej. Zdolność sCD14 do indukcji wzrostu i różnicowania ludzkich komórek B in vitropozwala na jego możliwe zastosowanie w produkcji mAb specyficznych w stosunku do antygenu. Pokazujemy tu, że sCD14 w wysokich stężeniach (0,5-1 pg/ml) aktywuje ludzkie komórki B w sposób poliklonalny. Jednak pokazujemy także, że suboptymalne mitogenne stężenia sCD14 działają synergistycznie z mAb specyficznym w stosunku do receptora komórek B dla antygenu (BcR). Tak więc, suboptymalne stężenia sCD14 preferencyjnie aktywują te komórki B, które otrzymują komplementarny sygnał przez BcR. mAb specyficzny w stosunku do BcR działa w tych warunkach jako zastępca antygenu. Jeśli nałoży się specyficzność na dostarczanie sygnału BcR, powstające odpowiedzi komórek B będą także specyficzne. Tak więc, gdy anty-BcR jest zastąpiony przez specyficzny antygen, synergistyczny bodziec dostarczany przez równoczesną obecność scD14 byłby także nakierowany wyłącznie na antygenospecyficzne komórki B. Tak więc, wynikająca produkcja przeciwciał byłaby antygenospecyficzna. Populacje komórek B zaktywowane w ten sposób byłyby wysoce wzbogacone w zaktywowane, specyficzne w stosunku do antygenu komórki B, orazby w ten sposób ułatwiały produkcjęludzkich hybrydom wydzielających mAb o pożądanej specyficzności.

Skuteczność CD14 jako adiuwantu w technologii szczepień można ocenić za pomocą modelu zwierzęcego. Bo- i Hu- CD14 będą modyfikowane za pomocą haptenu TNP. Haptenowany materiał zostanie oceniony pod kątem zdolności do indukcji poliklonalnej aktywacji komórek B in vitro, aby zapewnić, że haptenowanie nie zmieniło bioaktywności CD14. Koniugaty będą wstrzykiwane podskórnie lub domięśniowo, i w surowicy będzie oznaczana zawartość specyficznego przeciwciała w czasie. Stosując inną serię myszy, będzie się zbierać drenujące węzły chłonne, oraz będą w nich liczone komórki

PL 193 670 B1 wydzielające przeciwciało. Dodatkowo, niektórzy biorcy będą immunizowani mieszaninami zmiennych ilości CD14, i albo białka albo antygenu komórkowego. Określi się miano przeciwciał w surowicy, jak i komórki całkowite wydzielające Ig i wydzielające przeciwciała specyficzne w stosunku do antygenu.

Toksyczność CD14 może być określona w ostrych badaniach dożylnych u myszy, szczurów i małp. Badania ostrego podrażnienia podskórnego u szczurów mogą być przeprowadzone, jak i badania długoterminowe, obejmujące liczne wstrzyknięcia podskórne i dożylne u tych trzech gatunków. Będzie dokonana zgrubna ocena patologiczna oraz histopatologiczna jak i chemia surowicy i analiza hematologiczna. Można ocenić potencjał genotoksyczny w komórkach ssaka in vitro, i w oznaczeniu mikronukleusa myszy. Potencjał teratogenny można oceniać u ciężarnych myszy, szczurów i małp.

Przy podawaniu CD14 pacjentowi, który jest człowiekiem, można stosować standardową praktykę farmaceutyczną. Jako dodatek do mieszanek dla niemowląt mógłby być dodawany do mieszanki w czasie jej produkcji w fabryce. Mógłby też być przygotowywany jako tabletka lub kapsułka, lub proszek do mieszania tuż przed podaniem. W przypadku przygotowania szczepionki, mógłby być włączony jako część szczepionki poza tym przygotowywanej technikami standardowymi. Podanie mogłoby być w dowolny dogodny sposób, na przykład dożylny, podskórny, domięśniowy, doprzedsionkowy, doczaszkowy, wewnątrztorebkowy, dordzeniowy, dozbiornikowy, dootrzewnowy, lub doustny.

Formuła dojelitowa może być w postaci płynnych roztworów lub zawiesin.

Sposoby znane w dziedzinie do przygotowywania formuł można znaleźć na przykład w „Remington's Pharmaceutical Science”. Formuły do podania dojelitowego mogą, na przykład, zawierać jako zaróbkę glikol polietylenowy, oleje roślinne, wodorowane naftaleny itp.

Stężenie CD14 do podania będzie zależało od, na przykład, dawki, która ma być podana i drogi podania.

W sensie wariantów naturalnej sekwencji aminokwasów CD14, mogłyby być robione przynajmniej konserwatywne substytucje. Konserwatywne substytucje są opisane w literaturze patentowej, jak na przykład w opisie patentowym USA Nr 5,2264,558. Oczekuje się więc, na przykład, że wymiana między niepolarnymi obojętnymi alifatycznymi aminokwasami glicyną, alaniną, proliną, waliną i izoleucyną byłaby możliwa. Także mogłyby być możliwe substytucje między polarnymi alifatycznymi obojętnymi aminokwasami seryną, treoniną, metioniną, asparaginą oraz glutaminą.

Mogłyby być dokonane podstawienia wśród naładowanych aminokwasów, kwasu asparaginowego i kwasu glutaminowego, jak i substytucje wśród naładowanych zasadowych aminokwasów lizyny i argininy. Substytucje wśród aromatycznych aminokwasów w tym fenyloalaniny, histydyny, tryptofanu i tyrozyny też by były możliwe. Te rodzaje podstawień i wymian są dobrze znane specjalistom. Inne podstawienia mogą być też możliwe. Oczywiście, należy się spodziewać, że im większy procent homologii wariantu białka do naturalnie występującego białka, tym większe utrzymanie aktywności metabolicznej.

Claims (10)

1. Sposób przygotowania bydlęcego CD14 z serwatki siary bydlęcej, polegający na izolowaniu białka z serwatki, znamienny tym, że uzyskuje się siarę z wydzielin gruczołu mlecznego krów, klaruje się ją, odwirowując stałe składniki i ze sklarowanej serwatki wysala się białka, które poddaje się dalszemu oczyszczaniu i frakcjonowaniu stosując anionową chromatografię jonowymienną, molekularne sączenie na kolumnie i chromatografię na kolumnie z hydroksyapatytu, po czym poddaje się analizie sekwencyjnej wyizolowany polipeptyd o sekwencji aminokwasów określanej jako SEQ ID NO: 4.

2. Sposób bezpośredniej aktywacji komórek B in vitro, znamienny tym, że stosuje się rozpuszczalny polipeptyd mający sekwencję aminokwasów określaną jako SEQ ID NO: 4.

3. Sposób bezpośredniej indukcji wzrostu i różnicowania komórek B in vitro do komórek wydzielających immunoglobulinę na wysokim poziomie, znamienny tym, że do komórek wprowadza się rozpuszczalny polipeptyd mający sekwencję aminokwasów określoną jako SEQ ID NO: 4.

4. Sposób przygotowania czystego białka lub ko- i/lub posttranslacyjnie zmodyfikowanej postaci białka, znamienny tym, że (i) hoduje się prokariotycznego lub eukariotycznego gospodarza zawierającego heterologiczną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje białko mające sekwencję aminokwasów określoną jako SEQ ID NO: 4 i która jest zdolna do ekspresji wymienionego białka lub ko- i/lub posttranslacyjnie modyfikowanej postaci wymienionego białka w warunkach hodowli,

PL 193 670 B1 (ii) doprowadza się do ekspresji białka lub ko- i/lub posttranslacyjnie modyfikowanej postaci białka, i (iii) odzyskuje się białko wytworzone w prowadzonej hodowli.

5. Zastosowanie polipeptydu mającego sekwencję aminokwasów określoną jako SEQ ID NO:4 do wytwarzania leku do aktywacji komórek B u ssaka potrzebującego takiej aktywacji.

6. Sposób wytwarzania mieszanki dla niemowląt, znamienny tym, że do składników mieszanki wprowadza się polipeptyd mający sekwencję aminokwasów określoną jako SEQ ID NO: 4.

7. Sposób wytwarzania szczepionki zawierającej antygen inny niż CD14, znamienny tym, że do składników szczepionki wprowadza się polipeptyd mający sekwencję aminokwasów określoną jako SEQ ID NO: 4.

8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że dokonuje się koniugacji wprowadzonego antygenu i polipeptydu w składzie szczepionki.

9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że składniki szczepionki miesza się z antygenem i polipeptydem.

10. Zestaw do przygotowania szczepienia, znamienny tym, że obejmuje uprzednio ustaloną ilość antygenu innego niż CD14 i uprzednio ustaloną ilość polipeptydu mającego sekwencję aminokwasów określoną jako SEQ ID NO: 4.