JP2008073041A - 組換え型ヒトα−フェトプロテインおよびその利用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定のアミノ酸配列またはその断片またはその断片のいずれかと実質的に同一な配列を含む、実質的に純粋で生物学的に活性な組換え型ヒトα-フェトプロテインと、その産生に昆虫細胞を用いる方法、哺乳類における自己反応性免疫細胞の増殖を阻害する方法、細胞培養方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、クローニングしたヒトα-フェトプロテインの発現および精製;自己免疫疾患の治療法;癌治療および診断法;ならびに細胞増殖および細胞培養に関する。
α-フェトプロテイン(AFP)は、通常、胎児血中にのみ有意な濃度で検出される血清蛋白である。成人血中では、α-フェトプロテイン濃度の増加は、肝再生および特定の癌に関連する。
一般的に、本発明は、図1のアミノ酸1〜389(配列番号:9)またはその断片;図1のアミノ酸198〜590(配列番号:10)またはその断片;図1のアミノ酸198〜389(配列番号:7)またはその断片;図1のアミノ酸390〜590(配列番号:8)またはその断片;および図1のアミノ酸266〜590(配列番号:11)またはその断片のいずれかと実質的に同一な配列を含む、実質的に純粋で生物学的に活性な組換え型ヒトα-フェトプロテインを特徴とする。
a) ヒトα-フェトプロテインまたはその断片もしくはアナログの発現を指向する発現調節因子に機能的に結合したヒトα-フェトプロテインまたはその断片もしくはアナログをコードする組換えDNA分子を含む形質転換した昆虫細胞(例えば、スポドプテラ・フルジペルダSpodoptera frugiperda)の提供;
b) 形質転換した細胞の培養;および
c) 生物学的に活性なヒトα-フェトプロテインまたはその断片もしくはアナログの回収。
宿主細胞の染色体にヒトAFPの全てまたは一部をコードするDNA断片を組み込むことも可能である。
関係するDNA部分を含むベクターは、細胞宿主のタイプによって異なる周知の方法によって宿主細胞に移すことができる(サムブルックら(Sambrook), 前記)。「形質転換細胞」という用語は、形質転換細胞の前駆体をも含むことを意味する。
組換え蛋白の高レベル発現に有用な原核細胞宿主には:様々な株の大腸菌、枯草菌(Bacillus subtilis)およびシュードモナス属(Psuedomonas)が含まれる。
本発明の方法は、それによって生物活性を有するヒトα-フェトプロテインを大量生産する手段を提供する。本発明の方法によって産生されたAFPは、天然に生じるヒトAFPと同じようには修飾されないという事実があるにもかかわらず、生物活性を有する。
組換えヒトα-フェトプロテインの発現
cDNAライブラリーの構築
4.5ヶ月で流産したヒト胎児の肝細胞(生体重〜3 g)から分離したポリ(A)+RNAから調製した、サイズ分画したcDNA(0.5〜3 kb)を用いて、cDNAライブラリーを構築した。(または、カリフォルニア州パロアルトのクローンテックラボラトリー社(Clontech Laboratories)から胎児cDNAライブラリーを購入することができる。)グアニジン・チオシアネート法によって全RNAを調製し(Chirgwinら、 Biochemistry 18: 5294, 1979)、オリゴ(dT)セルロースクロマトグラフィーによってmRNAを選択した(マサチューセッツ州ベドフォード、コラボレイティブリサーチ社(Collaborative Research))(Ausubelら編、分子生物学最新プロトコール、ウィリーインターサイエンス社、ニューヨーク、1989)。ライブラリアン(Librarian)II cDNA合成キット(カリフォルニア州サンディエゴ、インビトロジェン(Invitrogen)社)を用いてcDNAを合成し、1%アガロースゲルで分画した。0.5から3 kbの断片を抽出して、ベクターpTZ18-RB(インビトロジェン(Invitrogen)社)にライゲーションし、コンピテントセルの大腸菌DH1αF'(インビトロジェン(Invitrogen)社)を形質転換するために用いた。コロニー/プラークスクリーンフィルター(デラウエア州ウィルミントン、デュポン社)を用いてコロニーを採取し、移し換えた細菌のコロニーを、0.5 M NaOH、1.5 M NaClの溶液中で10分間インキュベートして、溶解、変性した。このフィルターを1.5 M NaCl、0.50 M トリス塩酸(pH 7.6)で5分間洗浄してから風乾した。次に、フィルターをクロロフォルムで5回洗浄し、細胞残渣を取り除くために0.3 M NaClに浸漬してから風乾した。減圧下で2時間、80℃で乾熱することによって、DNAをニトロセルロースに固定した。乾熱したフィルターを6×SSC(1×SSC=150 mM NaCl、15 mMクエン酸[pH 7.0])、1×デンハルツ(Denhart's)溶液(0.2 g/l ポリビニルピロリドン、0.2 g/l BSA、0.2 g/l フィコール400)0.05% ピロリン酸ナトリウム、0.5% SDS、100μg/mlの大腸菌DNAの中で、37℃で3時間プレハイブリダイズさせた。同じ溶液で、SDSを含まない、5'末端のリン酸化によって32P標識した2種類のオリゴヌクレオチド、1〜2×106cpm/mlを含む溶液中で、37℃で18〜24時間ハイブリダイゼーションを行なった(分子生物学最新プロトコール、前掲)。このライブラリーを検索するために用いたオリゴヌクレオチドの配列は、5'-TGTCTGCAGGATGGGGAAAAA-3'(配列番号:1)と5'-CATGAAATGACTCCAGTA-3'(配列番号:2)で、それぞれ、ヒトAFPのコード配列の772から792番目と、1405から1422番目に相当する。フィルターを、6×SSC、0.05% ピロリン酸ナトリウム中、37℃で30分間、2回洗浄し、同じ溶液中、48℃で30分間、1回洗浄した。陽性クローンを同定するために、デュポンクロネックス(Du Pont Cronex Lightning Plus)感光増強スクリーンの上で、乾燥フィルターをコダック(Kodak)XARフィルムに24〜48時間感光させた。陽性クローンを分離、増幅し、サザンブロット解析にかけた(分子生物学最新プロトコール、前掲)。簡単に述べると、精製DNAを、適当な制限酵素で加水分解し、その結果できた断片を1 % アガロースゲルで分離した。次に、このDNAをニトロセルロース膜に移した。ハイブリダイゼーション条件は、上記の2種類のプローブに加えて、ヒトAFPのコード領域の7から24番目を表す3番目の32P標識したオリゴヌクレオチド(5'-CATAGAAATGAATATGGA-3'(配列番号:3))を用いた以外は、上記の条件と同じであった。スクリーニングした3,000コロニーの中から5個の陽性クローンを同定した。以下に述べる構築には、1個のクローンpLHuAFPを用いた。
ヒトAFPのコード配列の前に翻訳開始コドンを含み、かつ翻訳終止コドンを含む構築物を、以下の5個のDNA断片を用いて作出した。
断片1:2種の脱リン酸化オリゴヌクレオチドをアニール化して、5'末端にEcoRI認識部位の粘着末端を有し、その後ろにATG開始コドン、ヒトAFP cDNAの60 bpまでの配列で、コード配列の60番目に位置するPstI部位を含む配列を有する二本鎖DNA分子を形成させた(この概要において、ヌクレオチドの一番目とは、成熟蛋白質の第一コドン(Thr)の一番目のヌクレオチドのことで、Morinagaら、前掲、の102番目のヌクレオチドに相当する)。この断片をpUC119(pUC19のNdeI部位に、M13の5465番目のHgiA I部位から5941番目のAhaIIまでの遺伝子間領域を挿入したpUC19)にライゲーションして、EcoRIとPstIで直鎖化した。こうしてできたDNAを大腸菌NM522(ニュージャージー州ピスカタウエイ、ファルマシア社)の中で増幅した。組換えプラスミドを制限酵素消化して、EcoRI-PstI挿入物を回収し、5%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動により分離して、ゲルから単離した。
断片2:pLHuAFPをPstIとNsiIで制限酵素消化して、97 bpのヒトAFPのcDNA断片(57番目から153番目)を得、上記のようにしてゲル精製した。このクローンには、ヒトAFPの全コード領域と、5'および3'の非翻訳配列とが含まれる。
断片3:pLHuAFPをNsiIとAlwNIで制限酵素消化して、224 bpのヒトAFPのcDNA断片(150番目から373番目)を得、上記のようにしてゲル精製した。
断片4:pLHuAFPをAlwNIとStyIで制限酵素消化して、1322 bpのヒトAFPのcDNA断片(371番目から1692番目)を得、上記のようにゲル精製した。
断片5:2種の脱リン酸化したオリゴヌクレオチドをアニール化して、ヒトAFP 配列のStyI部位の1693番目から、1773番目で、AFPのコード領域を終わらせるTAA終止コドンまでを含むヒトAFP配列で、その後ろにBamHI粘着部位を有する86 bpの二本鎖DNA分子を形成させた。これ以上の操作は加えずに、この合成DNAを用いた。
異なる3つの発現システムで、大腸菌の中でヒトAFPの高水準の合成がうまく行われた。TRPシステムは、直接発現を行わせる。RX1システムでは、trpEとベクター配列によってコードされる20アミノ酸を含む融合蛋白質が回収される。MALシステムは、malE遺伝子産物に融合されたAFP、すなわち42 kdのマルトース結合蛋白質を発現する。
簡単に説明すると、pHuAFPをEcoRIとBamHIで制限酵素消化してから、末端をクレノウポリメラーゼでフィリングした。次に、1186 bpのAFP断片をゲル精製した。pTrp4をClaIで制限酵素消化して、末端をクレノウポリメラーゼでフィリングし、直鎖状にしたベクターをゲル精製した。1186 bpのAFP断片とpTrp4のバックボーンを連結させて、以下の菌株のコンピテントな大腸菌を形質転換するのに用いた。すなわち、DH5α、BL21(F.W. Studier, ニューヨーク州アプトン、ブルックヘブン国立研究所(Brookhaven National Laboratory))、SG927(メリーランド州ロックビル、合衆国基準培養株保管所(American Type Culture Collection):寄託番号39627)、SG928(ATCC寄託番号39628)、およびSG935(ATCC寄託番号39623)。
3種類の発現ベクターの構築で用いられたAFPのコード領域の配列を決定したところ、全長AFPをコードしていることが分かった。
細菌の培養液を通気しながら30℃または37℃でインキュベートした。大腸菌を一晩培養したものを、必要とされる適当な抗生物質を添加した(テトラサイクリン塩酸は50μg/ml、アンピシリンナトリウムは100μg/ml)LB培地中で増殖させた。
組換えAFPの発現と作用を判定するために、解析的な研究を行なった。細胞沈殿物をSDS-溶解液(0.16 Mトリス塩酸[pH 6.8], 4% w/v SDS, 0.2 M DTT, 20% グリセロール, 0.02% ブロモフェノールブルー)に懸濁するか、5分間ボイルして、SDS-PAGEによる解析に用いるか、10 mM Na2HPO4, 30 mM NaCl, 0.25 % トウィーン(Tween)20, 10 mM EDTA, 10 mM EGTAを含む溶解バッファーに懸濁し、1 mg/mlのリゾチームとともに、4℃で30分間インキュベートしてから、50%出力、3×1分間のパルスモード(コネティカット州ダンベリー、ソニック・アンド・マテリアル社、VC300型超音波発生器)で超音波破砕を行なった。破砕物を、10,000 gで20分間遠心分離し、可溶性蛋白質を含む上清を静かに試験管へ注ぎ入れ、使用時まで-20℃で凍結しておいた。不溶性蛋白質を含む沈殿物は、SDS-溶解バッファーに懸濁し、5分間ボイルしてから、使用時まで-20℃で保存した。SDS-溶解バッファー中に解離された全蛋白質と、可溶性分画および沈殿物分画を、SDS-PAGEと、ウエスタンブロットで移した後の免疫学的検出法によって解析した。これらの実験では、クマシーブルー染色したゲルは、通常の手順としてビデオデンシトメータ(video densitometer)(バイオラド社、620型)でスキャンした。これによって、産生された組換えAFPの量を、全細胞内蛋白質に対する割合として評価することができた。
特に記載のない限り、すべての実験は4℃で行われた。培養液1リットルから採集した細胞を沈殿させて凍結したものを、25 mlの溶解バッファーA(50 mMトリス塩酸[pH 7.5], 20 %蔗糖、100μg/mlリゾチーム、10μg/ml PMSF)に再懸濁して10分間インキュベートした。EDTAを最終濃度35 mMになるように加えて、抽出物をさらに10分間そのままの状態に置いた。25 mlの溶解バッファーB(50 mMトリス塩酸[pH 7.5], 25 mM EDTA、0.2% トライトン(Triton)X-100)を加えてから、溶解物をさらに30分間インキュベートした。細胞溶解物を12,000 gで20分間遠心分離し、組換えAFPを含む沈澱を、50 mlの洗浄バッファー(50 mMトリス塩酸[pH 8.0], 10 mM EDTA、0.2%トライトン(Triton)X-100)で2回洗浄し、洗浄する度に上記の遠心分離を行った。この沈殿物を50 mlの変性バッファー(0.1 M K2HPO4 [pH 8.5], 6 M グアニジン塩酸、0.1 M 2-メルカプトエタノール)に溶解して、超音波破砕し、ニューテーター(Nutator)(クレイアダムス社)の上で4時間混合した。可溶化した抽出物を、50 mMトリス塩酸、100 mM NaCl、1 mM EDTAで50倍に希釈してから、組換えAFP蛋白質を復元させるために24時間おいた。希釈する前、AFPは微小な集塊になっていると考えられるため、この50倍希釈の段階は重要である。希釈と再濃縮を行なえば、AFPは集塊にならない。アミコン(Amicon)濾過ユニットを用いて、YM10メンブレン上で、この溶液を100倍に濃縮し、ミレックス(Millex)0.22μmのメンブレンフィルター(ミリポア社)に通して不純物を除去した。組換えAFPは、さらに、20 mMトリス塩酸[pH 8.0]で平衡化したモノQ(Mono Q)カラム(ファルマシア社)にかけ、結合した蛋白質を、0〜100%の1 M NaCl, 20 mMトリス塩酸(pH 8.0)の直線勾配を用いて室温下で精製した。画分を、SDS-PAGE、APAGE、および、ウエスタンブロッティングによって解析した。
ポリペプチド発現および精製に関するこれらの一般的技術は、また、有用なヒトα-フェトプロテイン断片またはアナログを産生させ、単離するためにも用いることができる(後述)。
ミニプロティーン(mini-Protean)電気泳動装置(バイオラド社)を用いて、ヘイムズら(Hamesら)(「蛋白質のゲル電気泳動:実用研究(Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach)」、ロンドン、IRL出版、1981)に従って、不連続バッファーシステムにおけるSDS-PAGEとアルカリPAGEとを行なった。SDS-PAGEまたはAPAGEを行なった後、トランスファー緩衝液(12.5 mMトリス塩酸、96 mMグリシン、20% メタノール[pH 8.2])に15分間浸すことによって、組換えヒトAFPの免疫学的検出を行なった。それぞれのゲルは、イモビロン(Immobilon)PVDF膜(ミリポア社)と重ねて、ミニプロティーン(mini-Protean)トランスファー装置(バイオラド社)の二つの電極の間に、ただし、ゲルが陰極側になるようにはさんだ。このシステムをトランスファー緩衝液に浸し、150 mAの電流を2時間通電した。イモビロンPVDF膜の非反応部分を20 mMトリス塩酸(pH 7.5)、500 mM NaCl、3 %ゼラチンで1時間ブロッキングした。 ウサギ抗-ヒトAFP抗血清と、アルカリフォスファターゼに結合したヤギ抗-ウサギIgG抗体(バイオラド社)を、それぞれ一次および二次抗体として用いた。5-ブロム-4-クロロ-3-インドリルリン酸とp-ニトロブルーテトラゾリウム(バイオラド社)を用いて、アルカリフォスファターゼ活性を検出した。
ヒトAFP ELISAキット(イリノイ州シカゴ、アボット研究所)を用いて、組換えヒトAFPを定量した。
銀染色ゲルを調べて、AFPの収量を評価した。Trp発現システムを利用する、AFPをコードするプラスミドを用いてSG935細胞を形質転換すると、AFPが大腸菌の全細胞内蛋白質の2から5%を占めることになる(1リットルの培養液当たり約3〜7 mg)。上述したように、最初の抽出物におけるAFPの大部分は不溶性である。上述の再可溶化処理によって、安定した半精製状態の単量体AFPを50〜60%(おおよその収量は50 mg/ 20 lの大腸菌)回収できるようになる。これをさらに精製すると、純粋な単量体AFPを25 mg回収できる。
配列が最適になるよう、統合的に特製された微穿孔HPLCを用いたポートン(Porton)蛋白質/ペプチドガス相マイクロシークエンサーを用いて、自動式エドマン分解を行なった。蛋白質の配列解析には、PC/ジーンソフトウエアパッケージ(インテリジェネティクス社)の中のプログラムから選択したプログラムの助けを借りた。
当業者に公知の標準的な方法を用いて(例えば、米国特許第4,745,051号)、HuAFP(またはその断片またはアナログ)を発現する組換えバキュロウイルスを構築する。一般的に、このプロセスには2つの段階が含まれる。発現されるべき遺伝子、例えば、rHuAFP、または、その断片またはアナログ(後述する)を、まず、プラスミド移行ベクターの中、バキュロウイルスDNAの非必須遺伝子座、例えば、ポリヘドリン遺伝子に由来するDNAに隣接するバキュロウイルスプロモーターの下流にクローニングする。次に、このプラスミドを、相同的組換えが起きるように、環状の野生型ゲノムDNAと一緒に昆虫細胞に導入する。この結果できた組換え体の後代を、例えば、非組換え親系統から切り離された組換えウイルスを精製するための連続プラーク解析法を用いてスクリーニングする。また、蛋白質を発現させるために充分な量のウイルスを得るためには、ウイルスを増幅することが一般的に必要である。当業者に周知の標準的な方法を用いて、組換えウイルスをプラーク精製して、DNA構造を確認する。
本発明は、rHuAFPの生物学的に活性のある断片を包含する。rHuAFPの生物学的に活性のある断片とは、以下の活性の一つ以上を有するものである。すなわち、(a)例えば、rHuAFPによって認識されるレセプター(例えば、MCF-7や骨髄細胞などの癌細胞の膜)を発現している細胞に結合するなど、標的細胞との特異的な相互作用を行わせる;(b)新生組織や自己反応性免疫細胞の増殖を停止、抑制または阻害する(例えば、細胞表面レセプターに結合して、抗増殖シグナルを伝える);骨髄細胞などの細胞増殖を刺激、上昇、展開するか、または、その他の方法で細胞増殖をもたらす(例えば、細胞表面レセプターに増殖または刺激シグナルを結合させる);または、免疫病理学的抗体反応を遮断、阻害または妨害する。rHuAFP断片またはアナログの、rHuAFPによって認識されるレセプターに結合する能力は、当業者に公知の標準的な結合解析法を用いて調べることができる。このような断片およびアナログの生物学的活性を、当業において既知の方法(例えば、本明細書において説明されている方法)によって調べる。
インビボまたはインビトロにおける免疫制御活性を解析するための標準的な解析法によって、rHuAFP(またはその断片もしくはアナログ)の免疫抑制特性を評価する。後に検討するように、本技術は、rHuAFP(またはその断片もしくはアナログ)の、自己免疫疾患、例えば、非肥満性糖尿病(NOD)マウスに対する免疫抑制特性をインビボで調べるための多くの動物システムを提供する。さらに、さまざまなインビトロシステムを利用して、例えば、このようなインビトロ解析法の一つには、自己混合リンパ球反応(AMLR)における、自己抗原によって誘発されるT細胞増殖の阻害を評価するものなどがあるが、これを利用して、rHuAFPの免疫抑制的側面を調べることもできる。
材料および方法
ゲル電気泳動、イムノブロッティングおよび精製
rHuAFPの精製および特徴決定を、常法によるドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)および非変性アルカリPAGEによって評価した。続いて、ゲルを、クーマシーブリリアントブルーを用いて染色するか、または電気泳動で分離したポリペプチドをイムノブロッティング分析のためのイモビロンPVDFメンブラン(Immobilon PVDF menbrane)(ミリポア(Millipore)、ミシソーガ(Mississauga)、オンタリオ州)に転写することによって分析した。組換えHuAFP−単特異性ウサギ抗天然HuAFPポリクローナル抗体複合体を、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギIgGによって同定し、免疫反応性を有するバンドを製品説明書に従い、BCI/NBT発色溶液(バイオラド・ラボラトリーズ(Bio-Rad Laboratories)、ミシソーガ、オンタリオ州)を用いて検出した。
カラムクロマトグラフィーは常法に従い行った。
ヒトアルファ−フェトプロテインの断片をコードするプラスミド構築物を、分子生物学の技術分野に属する者にとっては公知のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法により、ヒトアルファ−フェトプロテイン遺伝子に特異的な部分を増幅させるように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて調製した(例えば、PCR法(PCR Technology)、H. A. Erlich編、ストックトン・プレス(Stockton Press)、ニューヨーク、1989年;PCRプロトコル:方法および応用の手引き(PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications)、M. A. Innis、David H. Gelfand、John J. Sninsky、およびThomas J. White編、アカデミック・プレス社(Academic Press, Inc.)、ニューヨーク、1990年;およびAusubelら、前記、参照)。
ドメインI アミノ酸1(Thr)〜197(Ser)、(図1、配列番号:6)
ドメインII アミノ酸198(Ser)〜389(Ser)、(図1、配列番号:7)
ドメインIII アミノ酸390(Gln)〜590(Val)、(図1、配列番号:8)
ドメインI+II アミノ酸1(Thr)〜389(Ser)、(図1、配列番号:9)
ドメインII+III アミノ酸198(Ser)〜590(Val)、(図1、配列番号:10)
rHuAFP断片I アミノ酸266(Met)〜590(Val)、(図1、配列番号:11)
アミノ酸配列はヒトアルファ−フェトプロテイン(図1に示された1(Thy)〜590(Val);配列番号:5)について示された配列から推定した。ドメインI、ドメインII、ドメインIII、ドメインI+II、ドメインII+IIIおよびrHuAFP断片Iの断片は、標準的なPCR反応条件で、34μLのH2O、10μLの10×反応緩衝液、20μLの1mM dNTP、2μLのDNA鋳型(pI18中にクローニングしたHuAFP)、適当な5'オリゴヌクレオチドプライマーおよび3'オリゴヌクレオチドプライマー(10μLの10pモル/μL 5'プライマー、10μLの10pモル/μL 3'プライマー)、1μLのグリセロール、10μLのDMSO、および1μLのPfuポリメラーゼ(ストラタジーン(Stratagene)、ラホラ(LaJolla)、カリフォルニア州)を含む100μLの反応溶液中で合成した。PCR増幅に用いたプライマーは、
DomI25 (配列番号:14)
DomI3 (配列番号:15)
DomII5 (配列番号:16)
DomII3 (配列番号:17)
DomIII5 (配列番号:18)
DomIII3 (配列番号:19)
5'rHuAFP断片I (配列番号:20)
であった。したがってプライマー対、DomI25とDomI3、DomII5とDomII3、DomIII5とDomIII3、5'rHuAFP断片IとDomIII3、DomI25とDomII3、およびDomII5とDomIII3は、それぞれrHuAFPのドメインI、ドメインII、ドメインIII、rHuAFP断片I、ドメインI+II、およびドメインII+IIIのcDNA配列を単離するために用いた。アニール化、鎖伸長、および変性の温度はそれぞれ50℃、72℃、および94℃で、30サイクル行った。PCR産物は常法にしたがって精製した。ドメインIおよびドメインI+IIをコードする精製されたPCR産物は、KpnIおよびBamHIを用いて別個に消化し、KpnI/BamHI処理したpTrp4に別々にクローニングした。ドメインII、ドメインIII、ドメインII+IIIおよびrHuAFP断片Iをコードする精製されたPCR産物は、Bsp106IおよびBamHIを用いて別個に消化し、Bsp106I/BamHI処理したpTrp4に別々にクローニングした。それぞれのプラスミド構築物は続いて、コンピテント大腸菌細胞に形質転換した。この発現産物は翻訳開始シグナルのメチオニンによってコードされたアミノ酸配列で開始されると考えられるため、このようなシグナルは除去されるか、またはいずれにしても最終的な発現産物の生物活性に影響を与えることはないと考えられる。
ヒトの末梢血単核細胞(PBMC)の単離、非T細胞群への分画、およびAMLRは常法にしたがって行った。市販のIg−抗Igアフィニティカラム(バイオテック・ラボラトリーズ(Biotek Laboratories))に1.5×108個のPMBCを通過させることによって応答T細胞を単離し、続いて2×105個のその応答細胞を、1人のドナーから得られた137Cを照射(2500ラド)した2×105個の自己非T刺激細胞とともに培養した。用いた培地は、20mMのHEPES(ギブコ(Gibco))、5×10−5Mの2-メルカプトエタノール(BDH、モントリオール、ケベック州)、4mMのL-グルタミン(ギブコ)、100U/mlのペニシリン(ギブコ)および100μg/mlのストレプトマイシン硫酸を補充したRPMI-1640に、AMLRのための応答T細胞ドナーに対して自己の10%の新鮮なヒト血清が添加されているものであった。さまざまな濃度の精製したrHuAFP、ヒト血清アルブミン(HSA)、抗HuAFPモノクローナル抗体クローン#164(培養液中の最終濃度が125μg/ml)(レインコ・テクノロジーズ(Leinco Technologies)、セントルイス、ミズーリ州)を培養の開始時に添加した。AMLR培養物を4〜7日間、95%の空気と5%のCO2中で37℃にてインキュベートした。指示された間隔で、DNA合成について、1μCiの3H-チミジン(56〜80Ci/mmolの特異的活性、ICN)を用いて6時間パルスすることによって分析した。その培養物をマルチプルサンプル採集器(スカトロン(Skatron)、スターリン、バージニア州)を用いて採集し、3H-TdRの取り込みをパッカード2500TR液体シンチレーションカウンターで測定した。結果は、3回培養または4回培養の平均cpm±標準偏差で表した。
正常ドナーから得られるヘパリン処理した血液をPBSを用いて1:1で希釈し、フィコール−ハイパック(シグマ(Sigma)、セントルイス、ミズーリ州)で密度遠心分離することによって赤血球細胞よりヒト末梢血リンパ球(PBL)を分離した。それらをPBSを用いて少なくとも3回洗浄し、トリパンブルー排除法によって細胞の生存能力について明らかにした。ヒトPBL(2.5×105細胞)を常法にしたがって培養した。結果は、3回培養の平均cpmチミジン取り込み±SEMで表した。
発現および精製
大腸菌で発現したrHuAFP単離物の純度は、クーマシー染色したAPAGEとSDS-PAGE上に現れる単一のバンドとして証明され、それらは図1A〜1Bにそれぞれ示されている。大腸菌由来の可溶性モノマーrHuAFPは、Q-セファロースクロマトグラフィーを用いてrHuAFPを含むタンパク質画分を溶出することによって得られた。細菌培養液1リットルあたり約1mgの純粋なrHuAFPが、220〜230mMのNaClを用いるFPLCモノQ陰イオン交換を行うことによって単一の均質なピークとして回収され、それはSDS-PAGE上では約65kDで移動した(図1B参照)。組換えHuAFPはSDS-PAGEにおいて天然のHuAFPよりも低分子量を示すが、これは、原核生物の発現系にはタンパク質のグリコシル化に必要な酵素機構が存在しないためである。FPLCおよびHPLCで再クロマトグラフィーした純粋なrHuAFPの試料では、図1Cおよび1Dに示されているような単一のピークが得られ、これによってrHuAFP調製物の純度が確認された。さらにN-末端配列のデータは、rHuAFPのN-末端にあると予測されるアミノ酸配列に対応していた。
rHuAFPの免疫抑制活性は、ヒトの自己混合リンパ球反応(AMLR)を抑制する能力によって評価した。図8Aに示されているように、rHuAFPは、自己増殖性を測定した4〜7日間を通して、自己非T細胞によって刺激される自己反応性のリンパ球の増殖応答性を阻害した。図8Bに示されているように、T細胞自己増殖のピークで行った用量−反応実験から得られた結果は、培養の開始時にrHuAFPを添加することにより用量依存的にAMLRが抑制されることを示している。更に、併行して行った生存性の実験により、ヒトの自己反応性のT細胞に対するrHuAFPの阻害活性が非特異な細胞毒性効果によるものではないことが確かになった。
100μg/mlのrHuAFP断片I、並びに大腸菌由来rHuAFPおよびバキュロウイルス由来rHuAFP(下記に記載されている)の免疫抑制活性も、ヒト末梢血リンパ球反応(PBL)を抑制する能力で評価した。表IIに示されているように、大腸菌由来rHuAFPおよびバキュロウイルス由来rHuAFP、ならびに断片I(上述のようにして作製した)は、ConAで刺激したヒト末梢血リンパ球の増殖応答性を阻害することが明らかとなった。
上記に記載したように、自己免疫疾患は、自己抗原に対する寛容が消失し、免疫系の細胞、例えばT細胞またはB細胞(もしくは両方)が自己組織抗原に対して反応するようになることに特徴がある。自己免疫疾患は、いずれの臓器系に関わることもありうるが、ある種の臓器が他の臓器よりも影響を受けることが多い。自己免疫状態により影響を受ける組織の例には、多発性硬化症における脳および脊髄の白質、リウマチ様関節炎における関節の内層、およびインシュリン依存性糖尿病における膵臓のインシュリン分泌性β島細胞が含まれる。この他の形態の自己免疫疾患は、重症筋無力症において神経と筋との間の連結を損傷したり、または全身性エリテマトーデスにおいて腎臓や他の臓器を損傷したりする。他の自己免疫疾患の例には、アジソン病、クローン病、グレイブス病、乾癬、強皮症、および潰瘍性大腸炎が含まれるが、これらに限られるわけではない。
多発性硬化症(MS)は中枢神経系の白質の散在領域に発生する脱髄性疾患である。MSではミエリン塩基性タンパク質およびプロテオリピドタンパク質が、他の免疫系の成分の中でもTリンパ球が関与する自己免疫応答の主要な標的となる。神経細胞のミエリン鞘の喪失(脱髄)は、ついには昏睡または麻痺に陥る神経学的な症状を引き起こす。
リウマチ様関節炎(RA)は、複数の関節の滑膜が炎症を起こして軟骨および骨に損傷を生じさせるよく見られる慢性疾患である。RAはヒトリンパ球抗原(HLA)-DR4と関連しており、T細胞が関与する自己免疫性疾患であると考えられている。例えば「Sewellら、Lancet 341: 283, 1993」参照。RAは、滑液分泌細胞が、循環血流から関節の滑液分泌層に浸潤する種々の細胞性因子(およびそれらの可溶性生成物)と複雑な相互反応をすることにより起こる。一連の生物学的な事象が進行し、最終的には、関節のコラーゲンと軟骨基質を侵食しそして腐食する障害が引き起こされる。
重症筋無力症(MG)は、神経筋接合部のアセチルコリン受容体に対する自己抗体が存在する、神経筋伝達の障害である。抗体が接合部を攻撃すると、弛緩や麻痺が起こる。女性には男性よりも2倍の頻度で起こり、通常は30代で発症する。筋力低下がこの疾患の顕著な特徴である。臨床上の兆候は眼瞼下垂と複視などである。MGと甲状腺機能亢進症の間には関連がある。
糖尿病は、ブドウ糖代謝の異常である。インシュリン依存性糖尿病(IDDM)はI型糖尿病としても知られており、ランゲルハンス島にある膵臓β細胞がT細胞により破壊されていることに特徴のある自己免疫疾患である。この病気においては、他の病理学上の事象のなかでも、自己ペプチドの多様性に対する免疫応答が起こり、それが高血糖がもたらされる。IDDMの患者は、正常なブドウ糖の代謝を維持するために外来性のインシュリンに依存している。IDDMを発症する危険性のあるヒトは、インシュリン、島細胞、グルタミン酸カルボキシラーゼ、およびその他の自己タンパク質に対する自己抗体を異常に発現することから、高血糖が起こる前に同定することが可能である(例えば、Baekkeskovら、J. Clin. Invest. 79: 926, 1987;Deanら、Diabetologia 29: 339, 1986;Rossiniら、Annu. Rev. Immunol. 3: 289, 1985;Srikantaら、N. Engl. J. Med. 308: 322, 1983参照)。通常、自己抗体のパターンから、結果的に起こる疾患の進行度および/またはこの疾患を発症する危険性が予測される(例えば、Kellerら、Lancet 341:927, 1993、参照)。
全身性エリテマトーデス(SLE)は、重篤な全身性の自己免疫疾患である。この疾患の患者の約90%は若い女性である。女性に起こるこの顕著な優位性は、思春期前または更年期後では見られない。この病気は通常、若年層で始まり、その際には特徴的な皮膚の発疹が頬骨と前頭に現れる。脱毛が一般的に起こり、重篤な腎臓の損傷、関節炎、心臓周囲の体液の蓄積、そして肺の内層の炎症も同様によく起こる。患者のほぼ半数で脳の血管も炎症を起こし、それによって麻痺や痙攣が生じる。他の自己免疫性疾患と同様に、この疾患の活動度も変動性であり、健康状態の良好な長い落ち着いた期間が、突然に原因不明に新しい発作が開始することで終わってしまう。非常に多くの異なる自己抗体、例えばDNA、RNAおよびヒストンに対する自己抗体がSLEでは発現することがわかっている(例えば、Fundamental Immunology、前記、参照)。
上記で証明したように、組換えアルファ−フェトプロテイン、例えばrHuAFP(またはその断片もしくはアナログ)は自己免疫細胞の増殖の阻害において有効であり、したがってこれらに限定するわけではないが、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、糖尿病、全身性エリテマトーデス、および重症筋無力症を含む自己免疫疾患を抑制したり改善したりするために有用である。したがって、組換えヒトアルファ−フェトプロテイン(またはその断片もしくはアナログ)を、薬学的に有用な組成物を調製するために公知の方法にしたがって製剤化することができる。
細胞障害性の薬物
rHuAFPのハイブリッド細胞毒は、従来法を用いて、完全長のrHuAFPまたはその断片もしくはアナログを、いくつかの既知の毒性物質に結合させることによって調製される。このような毒素は腫瘍の成長を阻害する(下記に記載したように)ために有用である。有用な細胞毒は好ましくは、細胞内に存在している場合のみ有意に細胞障害性であり、かつ標的となるドメインが存在しない場合には問題となっている細胞から実質的に排除される。下記に説明したようにペプチド毒素はこれらの両方の条件を満足し、ハイブリッド分子に容易に組み入れられる。必要に応じて、混合型の細胞毒(即ち、二種またはそれ以上の毒素の全部または一部を含む細胞毒)を用いることもできる。数種の有用な毒素をより詳細に下記に説明する。
組換えrHuAFPまたはその断片もしくはアナログを検出可能な標識に結合させ、インビボ、インサイチュー、またはインビトロで新生組織を検出したり位置を明らかにするために有用な試薬を作製することができる。タンパク質にこのような標識を結合させる方法は、当技術分野においては公知である。例えば、検出可能な標識は化学的な結合によって結合させられるが、その標識がポリペプチドである場合には別法として、遺伝子操作によって結合させることもできる。
本発明の抗癌剤(例えば、rHuAFPまたはその断片もしくはアナログ、またはrHuAFPのハイブリッド細胞毒)は、新生組織、例えば乳ガンや前立腺ガンを抑制するのに有用である。当業者は、インビトロであってもインビボであっても、本発明の方法において有用な抗癌剤の効果を調べるために何種類の方法を用いてもよいことを理解できるであろう。例えば、被検化合物を投与した後で腫瘍の成長が減少することを、前立腺ガン(例えば、LNCaPアンドロゲン受容体陽性なヒト前立腺ガン細胞系からなる腫瘍異種移植片)を発症しているマウスまたはラットでモニターすることができる。実施例では、この培養で増殖中のヒト腫瘍細胞系(例えば、MCF-7(ATCC HTB22)、T-47D(ATCC HTB133)、MDA-MB-231(ATCC HTB26)、BT-20(ATCC HTB19)、NIH:OV-CAR-3(ATCC HT161)、LnCaP.FGC(ATCC CRL1740)、およびDu-145(ATCC HTB81)のような細胞系)をトリプシン作用によって単層から放出させ、単一細胞懸濁液に希釈してから、遠心分離を行ってペレットへと固体化し、それを続いて15μlのフィブリノーゲン(50mg/ml)と10μlのトロンビン(50ユニット/ml)に37℃で30分間さらす。次に腫瘍を含むフィブリン塊を直径が約1.5mmの断片に切る。続いてそれぞれの腫瘍断片を、常法にしたがってマウスの腎臓被膜下に埋め込む。必要に応じて、従来法にしたがって腫瘍を移植する直前に、マウスの体重1kgあたり60mgのシクロスポリンA(Sandimmune IV)を毎日皮下注射(s.c.)することによって免疫抑制してもよい。必要に応じて、マウスのエストロゲンとアンドロゲンの補充を、標準的な方法によって、例えばエストラジオールを含むシラスティックチューブを移植することによって、またはプロピオン酸テストステロンを注射することによって行う。通常、ホルモンの補充は、腫瘍を移植した日に開始する。一般的に、被検分子の投与は、腫瘍を移植する前、および/または腫瘍を移植した後に開始する。対照動物にはプラセボ、例えばヒト血清アルブミンまたは希釈液が、rHuAFPもしくは関連する分子について行ったのと同様に投与される。腫瘍成長に対する被検分子の効果は、常法にしたがってモニターする。例えば、腫瘍の成長を接眼マイクロメーターを装着した切開用の顕微鏡を用い、開腹術を行って腫瘍の大きさを毎週測定することによりモニターする。このような移植された腫瘍の成長を停止、減少または阻害することが実験により示された分子は、本発明において有用であると考えられる。
下記の実験例は、抗癌剤としてのrHuAFPの効果を示している。これら実施例は本発明を例示するために提供されたものであって、本発明を限定するものではない。
材料および方法
培養培地および腫瘍細胞
ダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)、RPMI1640、ウシ胎児血清、グルタミン、非必須アミノ酸、およびペニシリン−ストレプトマイシン混合物は、ギブコ(GIBCO)(BRL)から得た。ドナーのウシ血清は、ハイクローン(Hyclone)(ローガン(Logan)、ユタ州)から、またブタインシュリンはスクイブ社(Squibb, Inc.)(プリンストン、ニュージャージー州)から得た。
この検定法はエストロゲン含有培地中のMCF-7細胞はコンフルエント状態を越えて成長し、病巣に蓄積するが、エストロゲンが存在しない場合には細胞の増殖は細胞−細胞接触状態になった後で停止し、病巣が形成されないという知見に基づいている(例えば、GierthyらのBreast Cancer Res. Treat. 12:227, 1988参照)。1×107個のMCF-7乳ガン細胞を、24ウェルの組織培養プレートの16mmウェルに載せた。培養培地は、5%のドナーウシ血清(検出可能なエストロゲンが含まれないように予めスクリーニングしたもの)、L-グルタミン(2mM)、非必須アミノ酸(1×、ギブコ)、インシュリン(10ng/ml)、ペニシリン−ストレプトマイシン(1×、ギブコ)および最終濃度が1.8×10−9Mの濃度に希釈したエストラジオールを補充した、フェノールレッドを含まないDMEMである。培養物には、24時間目と、その後4日毎にrHuAFPおよびヒト血清アルブミンを含む培養培地2mlを、1ウェルあたり100μg/mlの最終タンパク質濃度となるように再度与えた。細胞は5日間でコンフルエント状態に達し、そして相当数の病巣がエストロゲンのみを含むウェルにおいて10日以内に出現した。細胞を緩衝化したホルマリンで固定化し、1%のロダミンBを用いて染色した。染色された病巣を、アルテック870マクロ−マイクロ自動コロニーカウンター(Artek 870 Macro-Micro Automated Colony Counter)を用いて定量した。データは、処理を行った群あたりの病巣の平均数で表わした。
MCF-7乳ガン細胞に対するrHuAFPの活性
図9に示された結果は、rHuAFPが、インビトロでMCF-7乳ガン細胞のエストロゲンにより刺激されたコンフルエント後増殖を阻害することを示している。ヒトアルブミンを用いるか、またはどのタンパク質も用いない対照の実験では、MCF-7病巣の形成に影響がなかった。これらのデータは、rHuAFPが癌細胞培養物の成長に対して直接的な阻害作用を有していることを示している。
上記で明らかにしたように、rHuAFPは、新生組織、例えば乳ガン細胞の阻害に有効である。したがって、本発明の化合物は、薬学的に有用な組成物を調製するために既知の方法にしたがって製剤化することができる。ヒトの患者の治療は、生理学的に許容される担体中に含まれる治療に有効な量のrHuAFPの抗癌剤を用いて行うことができる。適当な担体およびその製剤化は、例えば、E. W. Martinによる「レミントンの薬剤学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」に記載されている。投与されるべき抗癌剤の量は、投与方法、患者の年齢と体重、疾患のタイプ、および患者の疾患の進行度に応じて変化する。一般的な量は癌治療で用いられる他の薬物で利用する量の範囲内であろうが、ある例においては、化合物の特異性が大きいために必要とされる量は少ないであろう。例えば、rHuAFPは下記に説明するように、悪性腫瘍細胞の増殖を阻害する用量、即ち典型的には0.1ng/kg(体重)〜10g/kg(体重)の範囲内の用量で全身に投与される。
抗癌剤として使用する際、本発明の化合物を、例えば生理食塩水などの薬学的に許容される緩衝液中に製剤化して全身に投与することができる。好ましい投与経路には、例えば皮下注射、静脈注射、腹腔内注射、筋肉内注射、または皮内注射が挙げられ、それは患者において持続的に薬物のレベルを維持させる。他の好ましい投与経路において、本発明の化合物は、例えば徐々に崩壊するポリマー状や結晶状の形態の徐放性製剤を注入することによって患者に投与することができる。この種の持続的投与法は、まず、より一般的な経路(例えば上述した経路)によって薬物を供給した後で行うとよい。また、この化合物は、薬物の放出速度を正確に制御することが可能な注入ポンプを用いて投与してもよいし、またインシュリンの吸収を促進させるために用いられるのと同じ方式で鼻経路に化合物を投与してもよい。鼻の粘膜を経由して吸収させる別法として、この化合物を、粉末状や溶液状のエアロゾル沈積により肺に供給することもできる。
本発明の抗癌剤はまた、癌を治療するために局所投与することもできる。抗癌剤は通常、制限された組織領域、例えば腫瘍において作用することが望ましいため、薬物が腫瘍付近で局所的に高濃度となるような方法によって薬物を供給することが特に望ましい。
検出可能な標識に結合させた組換えHuAFP(またはその断片もしくはアナログ)は、新生組織(例えば、乳ガンや前立腺ガン)の存在の検出またはモニターまたは検定において診断のために利用することができる。
例えば、検出可能に標識されたrHuAFP(例えば、Tc-99m標識されたrHuAFP)を用いて新生組織の存在を確認するために、インビボでの実験をヒト患者に対して行うことができる。概略して述べると、検出可能に標識されたrHuAFPを静脈投与し、画像処理を、当業者に既知の方法、例えばシンチグラフィーを用いた放射性画像化法によってスキャナーを用いて行うことができる。
材料および方法
動物
CB-17 SCIDマウスの側方胸郭に移植されたMCF-7ヒト乳ガン細胞は、当技術分野において公知の方法にしたがってエストロゲン刺激することにより直径1cm(約5グラム)の大きさにまで成長した。
99mTc標識された組換えアルファ−フェトプロテインは、0.9%の塩化ナトリウム注射用溶液(バクスター・ヘルスケア・コーポレーション(Baxter Healthcare Corporation)、ディアフィールド(Deerfield)、イリノイ州)、0.5mlと混合したAFPアリコートより調製した。この溶液を、アルゴン気流下で保存した凍結乾燥状態の塩化第1スズ二水和物、クエン酸ナトリウム二水和物、およびデキストロース無水物を含むUltraTag RBC反応容器(マリンクロット・メディカル社(Mallinckrodt Medical Inc.)、セントルイス、ミズーリ州63134、ロット番号0683040)に添加する。この容器内の内容物を緩和な攪拌によって混合し、5分間室温にてインキュベートする。インキュベートを終えた時点で、0.8〜1.2Gbpのテクネチウム99mTcソジウム・ペルテクネテート注入液(Technetium 99mTc Sodium Pertechnetate Injection)(99mTcジェネレーター・マリンクロット・メディカル社(99mTc Generator Mallincrokt Medical, Inc)、セントルイス、ミズーリ州)を容量1〜2mlで添加する。その容器中の内容物を緩和な攪拌によって混合し、15分間インキュベートする。用量アリコートを調製後、0、3、および6時間経過した時点で検定した。0.9%のNaClを含むITLC-SG(ゲルマン・インストルメント社(Gelman Instrument Co.)、アン・アーバー(Ann Arbor)、ミシガン州)を用いて調製物について行った薄層クロマトグラフィーにより、95〜99%の99Tcが組換えアルファ−フェトプロテインに結合していることが示された。
実験動物をメダファン(Medafane)で鎮静化する。次に24ゲージで3/4インチのカテーテル(サーフロIVカテーテル(Surflo IV catheter)、テルモ・メディカル(Terumo Medical))を側方尾の静脈に固定する。つづいて、この動物に、体重1kgあたり20〜25mgのペントバルビタールを静脈内に徐々に注入することで麻酔をかける。麻酔は、必要であれば、5mgの追加のペントバルビタールを注入して維持する。
同位元素の生物分布データを、エルシント・ダイマックス(Elscint Dymax)409ガンマカメラを用いて収集する。このデータを続いてコンピュータ(シーマンズ・ガンマソニックス・マイクロデルタ(Siemans Gammasonics Microdelta))により分析する。3匹の動物を薄いポリエチレンパネル上に背側の横臥位で配設して画像化する。画像化の間の動きをなくすために、呼吸を制限しないように両手両足をテープ片で止めることによって動物をこれらのパネル上に必要に応じて制止させる。60分間で得られる動的画像を用いることで、標識されたタンパク質の生物分布を調べる。通常は12回の連続的な5分間の画像が低エネルギーの一般用途の視準で得られ、1.5ハードウェアが128×128ピクチャー要素を持つコンピュータマトリックスにズームする。実験動物は、典型的には、37MBqのTc-99m標識されたタンパク質を用いて注射される。
トレーサーの生物分布と動態
37MBq(約4〜6μgのTc-99m組換えヒトアルファ−フェトプロテイン)を尾の静脈に投与した後で、トレーサーの生物分布動態を注入後の1時間と24時間目に測定した。組織の取り込み動態は、100ROI(関心のある領域)ピクセル(%IA)あたりの注入された活性%で測定した。急速な腎クリアランスの起こる最初の1時間では肝臓にゆるやかに局在化し、他の組織にはほとんど明白な活性がなかった。1時目の腫瘍の取り込みは(平均±SEM:1.9±0.3%IA)であり、心臓に対する腫瘍(T/H)の領域比は0.84±0.23であった。24時間目までに、腫瘍の取り込みは(0.8±0.1%IA)となり、そしてT/Aおよびバックグラウンドに対する腫瘍(T/B上腕)の領域比は、それぞれ1.43±0.41および2.66±0.54であった。同じ動物で繰り返し行った、99mTc標識されたヒト血清アルブミン(非特異的なタンパク質対照として用いた)に対する、99mTc標識されたrHuAFPの比較実験では、T/B画像ROI活性割当が1時間目と24時間目でそれぞれ99mTc標識されたrHuAFPについては2.7と5.8であり、そして24時間では99mTc標識されたrHuAFPがTc-99mヒト血清アルブミンに比較して40%大きいことを示していた。これらの結果は、rHuAFPがTc-99mで標識できること、またこの標識された試薬が、低い非特異的な組織取り込み、血液からの急速な腎クリアランスを有していることを示している。ヒト乳ガンの外来移植片への局在化は最初は急速に起こり時間につれて増加するが、それは特異的な腫瘍取り込みによるものである。これらの結果は、Tc-99mで標識されたrHuAFPが乳ガン診断薬として有用なことを証明している。
上記に説明したように検出可能な標識に結合させたrHuAFP(またはその断片もしくはアナログ)は、新生組織(例えば、乳ガンや前立腺ガン)の存在を検出またはモニターまたは検定において診断のために利用することができる。したがって、例えば乳ガンや前立腺ガンなどの癌の典型的な症状が起きていたり、このような癌にかかりやすいことを示す病歴を有している患者は、本発明の方法を用いて試験するとよい。このような試験を行うことが適当な他の患者としては、乳ガンや前立腺ガンの家族歴のある人が含まれる。薬物の投与を受けていたり、癌の発生に影響のある毒素にさらされている患者も試験すべきである。
本発明にかかる検出可能に標識されたrHuAFP(またはその断片もしくはアナログ)を用いる診断方法は、癌が関与する臨床上の症状が現れる前、または現れた後で、癌の存在を検出すべく用いることができる。
本発明の方法は、臨床上の症状(例えば、明白な腫瘍塊)が現れる前か、現れると同時に新生組織を容易に診断できる。例えば、本発明の方法は、臨床状の症状が現れる前に乳ガンを診断する方法を提供する。さらに、本発明の方法により、医師は、乳ガンや前立腺ガンのような新生組織の的確な診断を行うことが可能となる。
本発明の診断用画像化法は、生理学的に許容される担体中に含まれる診断に有効な量のrHuAFPの診断薬を用いて行うことができる。適当な担体およびその製剤化は、例えば、E. W. Martinによる「レミントンの薬剤学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」に記載されている。投与されるべき診断薬の量は、投与方法、患者の年齢と体重、疾患のタイプ、疾患の程度、そしてその疾患にかかっている患者の体格に応じて変化する。しかしながら、一般的には、その量は、癌の診断に用いられる他の薬物で利用する量の範囲内であろうが、ある場合においては、化合物の特異性が大きいために必要な量はより低くなるであろう。例えば検出可能に標識されたrHuAFPは下記に説明するように、新生組織の画像化が可能となる用量、例えばシンチグラフィーを用いて放射性画像化を行うことが可能となる用量で静脈内に投与される。通常その用量は体重1kgあたり0.1〜10gの範囲内である。
本発明はさらに、細胞培養を行うためのrHuAFP(またはその断片もしくはアナログ)を含む培地を提供する。rHuAFPは血清の使用の代わりとなるかまたは補充するためのものであるため、本発明の培地には通常、血清(例えば、ウシ胎児血清、ウシ血清、ウマ血清、正常マウス血清、ヒト血清、ブタ血清、ウサギ血清など)の利用は必要でないが、当業者は必要に応じて血清を添加してもよいことを理解し認識することができる。培地の処方は通常、当業者にとって既知の方法により調製される。したがって、例えばRMPI-1630培地、CMRL培地、ダルベッコ修飾イーグル培地(D-MEM)、フィッシャー培地、イスコブ修飾ダルベッコ培地、マッコイ培地、最小必須培地、NCTC培地などの、いかなる標準的な培地を、所望の有効濃度でrHuAFP(またはその断片もしくはアナログ)とともに処方することもできる。必要に応じて、培地の補充剤、例えば塩溶液(例えば、ハンク平衡塩溶液またはイーグル平衡塩溶液)、抗生物質、核酸、アミノ酸、炭水化物、およびビタミンが、既知の方法により添加される。必要に応じて、成長因子、コロニー刺激因子、サイトカインなども標準的な方法にしたがって培地に添加することができる。例えば、本発明の培地は、rHuAFP(またはその断片もしくはアナログ)とともに、以下の物質のいずれかを単独でまたは組み合わせて含んでいてもよい:エリスロポエチン、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、インターロイキン(例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5など)、インシュリン成長因子(IGF)、トランスフェリン、アルブミン、および幹細胞成長因子(SCF)。本発明の培地は種々の真核細胞、例えば哺乳動物細胞、酵母細胞、両性類細胞、および昆虫細胞を培養するために有用である。この培地はいかなる組織や器官を培養するためにも用いることができる。またこのような培地は、さまざまな培養条件で、さまざまな生物学的応用に対して用いることもできる。このような培養条件の例には、バイオリアクター(例えば、連続式バイオリアクターまたはフォローファイバー式バイオリアクター)、細胞懸濁培養、半固体培養、液体培養、および長期細胞懸濁培養が含まれるが、これらに限定するわけではない。本発明の培地はまた、産業上の用途、例えばハイブリドーマ細胞、遺伝子操作した哺乳動物細胞、組織または器官を培養するためにも有用である。
rHuAFP(またはその断片もしくはアナログ)についての細胞成長促進作用は、インビトロおよびインビボで細胞増殖を分析するための標準的な検定法によって評価する。以下に説明するように、当技術分野においては、rHuAFP(またはその断片もしくはアナログ)の細胞成長の促進作用や刺激作用をインビボで試験するための動物系が提供されている。さらに、極めて多様なインビトロ系も、rHuAFP(またはその断片もしくはアナログ)の成長促進作用や成長刺激作用を試験するために利用可能である。
材料および方法
動物
成熟した雄と雌のCBA/Jマウスは、ジャクソン・ラボラトリー(Jackson Laboratory)(バー・ハーバー(Bar Harbor)、マイネ(Maine))より入手した。全てのマウスを、本発明者らの動物施設で飼育し、維持した。本実験で用いた動物は12〜20週齢であった。
骨髄細胞は、滅菌シリンジと25ゲージ針を用い、修飾ダルベッコ燐酸緩衝溶液(PBS)でCBA/Jマウスのけい骨(tibia)および大腿骨を流すことによって採集した。均質な単一細胞の懸濁液は、細胞混合物をパスツールピペットに繰り返し通過させることによって得られた。全ての細胞は250gで10分間、遠心分離することによって2回洗浄し、続いてトリパンブルー色素排除法によって生存能力について評価した。95%またはそれ以上の細胞生存能力がすべての実験で記録された。それから細胞を使用する前に所望の濃度に調節した。骨髄細胞(250,000)を96ウェルの丸底マイクロタイタープレート(フロー・ラボラトリーズ(Flow Laboratories)、ミシソーガ、オンタリオ州、カナダ)中で培養した。培養倍地は、無血清RPMIに4mMのL-グルタミン、20mMのヘルペス、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン(ギブコ・ラボラトリーズ(GIBCO Laboratories)、バーリントン(Burlington)、オンタリオ、カナダ)、5μg/mlのトランスフェリン、および5×10−5の2-メルカプトエタノール(イーストマン・ケミカル社(Eastman Chemicals Co.)、ロチェスター、ニューヨーク州)を添加したものであった。細胞は、rHuAFPの存在下または非存在下でそれぞれ400μg/mlの濃度で培養した。すべての培養物の全容量は0.2mlであった。培養物は、95%の加湿された空気と5%のCO2の雰囲気中、37℃で維持した。採集する前の6時間その培養物を1μCiのトリチウム化チミジン(NEN、特異的活性77.1Ci/mmol)でパルス処理した。続いて細胞をガラスファイバーマット(フロー・ラブズ(Flow Labs))上にマルチプルサンプル採集器(スカトロン、フロー・ラブズ)を用いて採集した。水に不溶性のトリチウム化チミジンの取り込みは、標準的なの液体シンチレーション法を用いてLKB 1215 ラックベータ(Rackbeta)IIで測定した。
無血清培地における骨髄増殖に対するrHuAFPの効果
培養したマウスの骨髄に対する精製したrHuAFPの効果は、無血清培地中で評価した。この実験では、CBA/Jマウスの骨髄から得られる2.5×105個の生細胞を72時間、無血清培地中において、最終濃度が400μg/mlのrHuAFPと最終濃度が5μg/mlのトランスフェリンの存在下または非存在下で培養した。図10に示したデータは、グリコシル化されていないrHuAFPの存在下で骨髄細胞が強い増殖反応、即ち刺激指標(SI)が35の増殖反応を受けることを示している。骨髄細胞をrHuAFPの非存在下で培養した場合には、このような増殖が見られなかった。
上記に示したように、rHuAFPは細胞増殖の促進において効果があり、したがって、例えば骨髄細胞の増殖などの細胞増殖の促進が関与する治療法で有用であり、また免疫抑制療法、放射線療法、もしくは化学療法、または免疫系を弱めることおよび骨髄の生成を抑制することがわかっていて骨髄毒性を引き起こす他の治療法の副作用を抑制するための治療法において有用である。したがってrHuAFP(またはその断片もしくはアナログ)は、造血系前駆細胞もしくは幹細胞の不足を治療したり、または関連する疾患を治療したりするために用いられる。また組換えHuAFP(またはその断片もしくはアナログ)は、癌を治療するための方法でも用いることができるし、また骨髄毒性、放射線または薬物への被爆、そして例えば、白血球減少症、細菌やウイルスの感染症、貧血、自己骨髄移植または非自己骨髄移植の後で起こる免疫細胞や造血細胞の欠乏などのB細胞またはT細胞が欠乏症に至る他の病的な状態を治療するための方法でも用いることができる。組換えHuAFP(またはその断片もしくはアナログ)はまた、インビトロまたはインビボで巨核細胞およびナチュラルキラー細胞の成長を刺激するためにも用いることが可能である。
組換えHuAFP(または断片もしくはアナログ)は、薬学的に有用な組成物を調製するために既知の方法にしたがって製剤化することができる。組換えヒトアルファ−フェトプロテイン、例えばrHuAFP(またはその断片もしくはアナログ)は好ましくは、骨髄毒性の症状を抑制したり改善したりするのに有効な量で患者に投与される。一般的には体重1kgあたり0.1ng〜10gの範囲の用量が適当である。例えば患者の治療は、生理的に許容される担体に含まれる治療に有効な量のrHuAFP(またはその断片もしくはアナログ)を用いて行うことができる。適当な担体およびその製剤化は、例えば、E. W. Martinによる「レミントンの薬剤学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」に記載されている。投与されるべきrHuAFPの量は、投与方法、患者の年齢と体重、疾患のタイプ、および疾患の素因を有するか疾患に罹っている患者のサイズに応じて変化する。好ましい投与経路には、経口投与、皮下注射、静脈注射、腹腔内注射、筋肉内注射、経皮注射または皮内注射が含まれ、それは患者において持続的に薬物のレベルを維持させる。他の好ましい投与経路においてrHuAFPは、徐放性の製剤、例えば徐々に崩壊するポリマー状や結晶状の形態の製剤を注入または埋め込みによって患者に投与することができる。この種の持続的投与法は、まず、より一般的な経路(例えば上述した経路)によって薬物を供給した後で行うとよい。またrHuAFPは、薬物の放出速度を正確に制御することが可能な、体外の注入ポンプまたは埋め込み可能な注入ポンプを用いて投与してもよいし、またインシュリンの吸収を促進させるために用いられるのと同じ方式で鼻経路にrHuAFPを投与してもよい。鼻の粘膜を経由して吸収させる別法としてrHuAFPは、粉末状や溶液状のエアロゾルの堆積によって肺に供給することもできる。
また本発明の方法は、非ヒト哺乳動物である例えば家庭用ペットや家畜を治療するためにも適用することができる。
他の態様において本発明は、後天性免疫不全症候群(AIDS)を予防したり治療したりするためにrHuAFP(またはその断片もしくはアナログ)を利用することを含む。AIDSに対するrHuAFPまたはその断片もしくはアナログの免疫抑制効果、即ちAIDSの自己免疫要素を抑制したり改善したりするといったその化合物の能力を評価するために、被検化合物を標準的な方法、例えば静脈投与または腹腔内投与により、上記に説明したように毎日適当量を適当な動物(例えば、患者)に投与する。一般的に投与は、AIDSが起こる前、および/またはAIDSが臨床的に出現する後に開始される。対照の動物には、プラセボ、例えばヒト血清アルブミンが、rHuAFPもしくは関連する分子について行ったのと同様に投与される。AIDSに対しての被検化合物の効果は、常法にしたがってモニターする。例えば、ヘルパーT細胞の破壊を阻害したり抑制したり改善したりする被検化合物の能力の分析がモニターされる。処置を行った動物と対照の動物との間の比較研究は、AIDSを抑制したり改善したりする被検分子の相対的な効果を調べるために用いられる。AIDSの症状を抑制したり改善したり(減少させたり抑制したり放散させたりその緩解を促進したり)できる分子は、本発明において有用であると考えられる。
Claims (110)
- 図1のアミノ酸1〜389(配列番号:9)と実質的に同一な配列またはその断片を含む、実質的に純粋な生物学的に活性な組換え型ヒトα-フェトプロテイン。
- ヒトα-フェトプロテインが原核細胞を用いて産生される、請求項1記載の純粋な組換え型ヒトα-フェトプロテイン。
- 図1のアミノ酸198〜590(配列番号:10)と実質的に同一な配列またはその断片を含む、実質的に純粋な生物学的に活性な組換え型ヒトα-フェトプロテイン。
- ヒトα-フェトプロテインが原核細胞を用いて産生される、請求項3記載の純粋な組換え型ヒトα-フェトプロテイン。
- 図1のアミノ酸198〜389(配列番号:7)と実質的に同一な配列またはその断片を含む、実質的に純粋な生物学的に活性な組換え型ヒトα-フェトプロテイン。
- ヒトα-フェトプロテインが原核細胞を用いて産生される、請求項5記載の純粋な組換え型ヒトα-フェトプロテイン。
- 図1のアミノ酸390〜590(配列番号:8)と実質的に同一な配列またはその断片を含む、実質的に純粋な生物学的に活性な組換え型ヒトα-フェトプロテイン。
- ヒトα-フェトプロテインが原核細胞を用いて産生される、請求項7記載の純粋な組換え型ヒトα-フェトプロテイン。
- 図1のアミノ酸267〜590(配列番号:11)と実質的に同一な配列またはその断片を含む実質的に純粋な生物学的に活性な組換え型ヒトα-フェトプロテイン。
- ヒトα-フェトプロテインが原核細胞を用いて産生される、請求項9記載の純粋な組換え型ヒトα-フェトプロテイン。
- 請求項1、3、5、7、および9記載の実質的に純粋なヒト組換え型α-フェトプロテインを含む治療用組成物。
- 以下を含む、生物学的に活性な組換え型ヒトα-フェトプロテインまたはその断片もしくはアナログを産生するために昆虫細胞を用いる方法。
a) 該ヒトα-フェトプロテインまたはその断片もしくはアナログの発現を指向する発現調節因子に機能的に結合した該ヒトα-フェトプロテインまたはその断片もしくはアナログをコードする組換え型DNA分子を含む形質転換した昆虫細胞の提供;
b) 該形質転換細胞の培養;および
c) 該生物学的に活性なヒトα-フェトプロテインまたはその断片もしくはアナログの回収。 - 昆虫細胞がスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)である、請求項12記載の方法。
- 請求項12記載の方法によって産生される、実質的に純粋なヒトα-フェトプロテインまたはその断片もしくはアナログ。
- 請求項14記載の実質的に純粋なヒトα-フェトプロテインまたはその断片もしくはアナログを含む治療用組成物。
- 組換え型ヒトα-フェトプロテインまたはその免疫細胞抗増殖性断片もしくはアナログの治療的有効量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類における自己反応性免疫細胞の増殖を阻害する方法。
- 免疫細胞がT細胞を含む、請求項16記載の方法。
- 免疫細胞がB細胞を含む、請求項16記載の方法。
- 哺乳類がヒト患者である、請求項16記載の方法。
- 組換え型α-フェトプロテインが原核細胞において産生され、グリコシル化されていない、請求項16記載の方法。
- 原核細胞が大腸菌である、請求項20記載の方法。
- 方法が組換え型ヒトα-フェトプロテインまたはその免疫細胞抗増殖性断片もしくはアナログの治療的有効量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類における自己免疫疾患の治療法。
- 自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項22記載の方法。
- 自己免疫疾患がリウマチ性関節炎である、請求項22記載の方法。
- 自己免疫疾患が重症筋無力症である、請求項22記載の方法。
- 自己免疫疾患がインスリン依存型真性糖尿病である、請求項22記載の方法。
- 自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスである、請求項22記載の方法。
- 組換え型α-フェトプロテインが原核細胞において産生され、グリコシル化されていない、請求項22記載の方法。
- 原核細胞が大腸菌である、請求項28記載の方法。
- 免疫抑制剤を単独で使用する場合の標準用量より少ない有効量で免疫抑制剤を哺乳類に投与することをさらに含む、請求項16記載の方法。
- 耐性化剤を哺乳類に投与することをさらに含む、請求項16記載の方法。
- 組換え型ヒトα-フェトプロテインが原核細胞において産生され、グリコシル化されていない、請求項30または請求項31記載の方法。
- 原核細胞が大腸菌である、請求項32記載の方法。
- 免疫抑制剤がシクロスポリンである、請求項30記載の方法。
- 免疫抑制剤がステロイド、アザチオプリン、FK-506、または15-デオキシスペルガリンである、請求項30記載の方法。
- 組換え型ヒトα-フェトプロテインまたはその抗新生組織断片もしくはアナログの治療的有効量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類において新生組織を阻害する方法。
- 哺乳類がヒト患者である、請求項36記載の方法。
- 新生組織が悪性腫瘍である、請求項36記載の方法。
- 悪性腫瘍が乳癌である、請求項38記載の方法。
- 悪性腫瘍が前立腺癌である、請求項38記載の方法。
- 組換え型ヒトα-フェトプロテインが原核細胞において産生され、グリコシル化されていない、請求項36記載の方法。
- 原核細胞が大腸菌である、請求項41記載の方法。
- 新生組織の細胞が組換え型ヒトα-フェトプロテインによって認識される受容体を発現する、請求項36記載の方法。
- 新生組織が癌である、請求項36記載の方法。
- 新生組織が腺癌である、請求項36記載の方法。
- 新生組織が肉腫である、請求項36記載の方法。
- 新生組織がエストロゲンに反応して増殖する、請求項36記載の方法。
- 投与により哺乳類における新生組織の細胞増殖が阻害される、請求項36記載の方法。
- 投与により哺乳類における新生組織の細胞が死滅する、請求項36記載の方法。
- 化学療法剤が単独で用いられる場合の標準用量より少ない有効量で化学療法剤を哺乳類に投与することをさらに含む、請求項36記載の方法。
- 組換え型ヒトα-フェトプロテインの治療的有効量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類を新生細胞発症から保護する方法。
- 組換え型ヒトα-フェトプロテインが原核細胞において産生され、グリコシル化されていない、請求項51記載の方法。
- 原核細胞が大腸菌である、請求項52記載の方法。
- 細胞障害剤と結合した組換え型ヒトα-フェトプロテインを含むハイブリッドサイトトキシン。
- 細胞障害剤が蛋白である、請求項54記載のハイブリッドサイトトキシン。
- 細胞障害剤が組換え型ヒトα-フェトプロテインと化学結合する、請求項54記載のハイブリッドサイトトキシン。
- サイトトキシンがペプチド結合によって組換え型ヒトα-フェトプロテインに結合し、ハイブリッドトキシンが遺伝子操作したハイブリッドDNA分子の発現によって産生される、請求項54記載のハイブリッドサイトトキシン。
- ヒト新生細胞に結合できる、検出可能に標識した組換え型ヒトα-フェトプロテインまたは検出可能に標識したその断片もしくはアナログ。
- 放射性核種によって標識した請求項58記載の分子。
- 放射性核種がテクネチウム-99mである、請求項59記載の分子。
- 組換え型ヒトα-フェトプロテインが原核細胞において産生され、グリコシル化されていない、請求項58記載の分子。
- 原核細胞が大腸菌である、請求項61記載の分子。
- 以下を含む、ヒト患者においてインビボで新生細胞含有領域を画像化する方法:
(a) 請求項58記載の検出可能に標識した分子を提供する;
(b) 該患者に該分子を投与する;
(c) 該標識分子を結合させ、該領域を含む該領域から非結合分子を除去させる;
(d) 該新生細胞含有領域の画像を得る。 - 領域が乳房である、請求項63記載の方法。
- 領域が前立腺である、請求項63記載の方法。
- 領域が骨髄である、請求項63記載の方法。
- 領域が肝臓である、請求項63記載の方法。
- 画像がシンチグラフィーを用いて得られる、請求項63記載の方法。
- 以下を含む、生物学的サンプルにおける新生組織の診断法:
(a) 生物学的サンプルを検出可能に標識した請求項58記載の分子と接触させ;および
(b) 基底レベル以上の標識が検出されることにより、患者が新生組織を有することが示される、該サンプルに結合した該標識の検出。 - 生物学的サンプルが接触段階の前に固定および切片にした細胞を含み、該サンプルに結合した標識が該細胞の細胞膜に相当する領域に結合する、請求項69記載の方法。
- 生物学的サンプルがヒト患者の乳房からのものである、請求項69記載の方法。
- 生物学的サンプルがヒト患者の前立腺からのものである、請求項69記載の方法。
- 以下を含む、インビボにおいて哺乳類の新生組織を検出する方法:
(a) 請求項58記載の検出可能に標識した分子の診断的有効量を投与し;および
(c) 標識が基底レベル以上の量であれば、哺乳類における該新生組織の存在を示す、該哺乳類の組織に結合した検出可能な標識の存在を検出する。 - 哺乳類が乳癌の疑いがあるヒト患者であり、組織が乳房組織である、請求項73記載の方法。
- 哺乳類が前立腺癌の疑いがあるヒト患者であり、組織が前立腺組織である、請求項73記載の方法。
- 検出可能な標識が放射性核種であり、検出段階が放射線造影によって達成される、請求項73記載の方法。
- 放射性核種がテクネチウム-99mであり、放射線造影がシンチグラフィーである、請求項76記載の方法。
- (a) 組換え型ヒトα-フェトプロテインまたはその断片もしくはアナログを含む第一試薬;および
(b) 検出可能な標識を含む第二試薬
を含むキット。 - 検出可能な標識が放射性核種である、請求項78記載のキット。
- 放射性核種がテクネチウム-99mである、請求項79記載のキット。
- 放射性核種がヨードまたはインジウムを含む、請求項79記載のキット。
- 検出可能な標識を組換え型ヒトα-フェトプロテインまたはその断片もしくはアナログに結合させるための第三試薬をさらに含む、請求項78記載のキット。
- 検出可能な標識が酵素、蛍光、または抗体を含む、請求項78記載のキット。
- 組換え型ヒトα-フェトプロテインまたはその断片もしくはアナログに結合した検出可能な標識を検出するための第四試薬をさらに含む、請求項78記載のキット。
- 組換え型ヒトα-フェトプロテインが原核細胞において産生され、グリコシル化されていない、請求項78記載のキット。
- 原核細胞が大腸菌である、請求項78記載のキット。
- 組換え型ヒトα-フェトプロテインまたはその細胞刺激断片もしくはアナログを含む、細胞培養培地。
- 組換え型ヒトα-フェトプロテインが原核細胞において産生され、グリコシル化されていない、請求項87記載の培地。
- 原核細胞が大腸菌である、請求項88記載の培地。
- (a) 請求項87記載の培養培地を提供し;(b) 細胞を提供し;および(c) 該細胞が増殖し維持される該培地中で該細胞を増殖させることを含む、細胞培養法。
- 細胞が哺乳類細胞である、請求項90記載の方法。
- 細胞が骨髄細胞である、請求項91記載の方法。
- 骨髄細胞がT細胞である、請求項92記載の方法。
- 骨髄細胞がナチュラルキラー細胞である、請求項92記載の方法。
- 骨髄細胞がリンパ球である、請求項92記載の方法。
- 細胞がハイブリドーマである、請求項91記載の方法。
- 方法がエクスビボ細胞培養を含む、請求項90記載の方法。
- 組換え型ヒトα-フェトプロテインまたはその骨髄毒性阻害アナログもしくは断片の治療的有効量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類において骨髄毒性を阻害する方法。
- 哺乳類がヒト患者である、請求項98記載の方法。
- 組換え型ヒトα-フェトプロテインが原核細胞で産生され、グリコシル化されていない、請求項99記載の方法。
- 原核細胞が大腸菌である、請求項100記載の方法。
- 組換え型α-フェトプロテインまたはその抗抑制性断片もしくはアナログの有効量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類において骨髄細胞増殖の抑制を阻害する方法。
- 組換え型ヒトα-フェトプロテインが原核細胞において産生され、グリコシル化されていない、請求項102記載の方法。
- 原核細胞が大腸菌である、請求項103記載の方法。
- 組換え型ヒトα-フェトプロテインまたはその細胞刺激断片もしくはアナログの有効量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類において骨髄細胞増殖を促進する方法。
- 組換え型ヒトα-フェトプロテインが原核細胞において産生され、グリコシル化されていない、請求項105記載の方法。
- 原核細胞が大腸菌である、請求項106記載の方法。
- 組換え型ヒトα-フェトプロテインまたはその抗拒絶断片もしくはアナログの有効量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類において骨髄細胞移植拒絶反応を予防する方法。
- 組換え型ヒトα-フェトプロテインが原核細胞において産生され、グリコシル化されていない、請求項108記載の方法。
- 原核細胞が大腸菌である、請求項109記載の方法。
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