CN1179106A - 重组人甲胎蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

总体上披露了抑制哺乳动物自身反应免疫细胞增殖的方法,包括向哺乳动物给药治疗有效量的重组人甲胎蛋白或其免疫细胞抗增殖的片段或类似物;抑制哺乳动物肿瘤的方法,包括向哺乳动物给药治疗有效量的重组人甲胎蛋白或其抗肿瘤片段或类似物;以及细胞培养方法,包括采用含有重组人甲胎蛋白或其片段或类似物的培养基。

Description

重组人甲胎蛋白 及其用途
本发明涉及克隆人甲胎蛋白的表达和纯化；用于治疗自身免疫病的方法；癌症治疗及诊断方法；以及细胞生长和细胞培养。
甲胎蛋白(AFP)是一种血清蛋白，一般仅在胎血中有较高含量。成体血液中较高的甲胎蛋白含量与肝的再生和某些癌有关。
概括地说，本发明的特征是大体上纯的有生物活性的重组人甲胎蛋白，它包括一段序列，该序列大体上相同于图1(序列9)的氨基酸1-389或其片段；图1(序列10)的氨基酸198-590或其片段；图1(序列7)的氨基酸198-389或其片段；图1(序列8)的氨基酸390-590；图1(序列11)的氨基酸266-590或其片段。
在另一个相关方面，本发明的特征是一种用昆虫细胞生产具有生物学活性的重组人甲胎蛋白或其片段或其类似物的方法，该方法包括
a)提供一种转化的昆虫细胞(例如，草地食夜蛾(Spodoptera frugiperda))，其含有一个编码人甲胎蛋白或其片段或其类似物的重组DNA分子，该分子与一个表达控制因子可操作地连接，由该控制因子指导人甲胎蛋白或其片段或类似物的表达；
b)培养转化的细胞；和
c)回收有生物学活性的人甲胎蛋白或其片段或类似物。
在有关方面，本发明的特征还在于用本文披露的任何方法生产的大体上纯的人甲胎蛋白或其片段或其类似物，和含有用本文披露的任何表达系统生产的大体上纯的人甲胎蛋白(或其片段或类似物)的治疗组合物。
另一方面，本发明的特征是一种抑制哺乳动物(如，人类患者)自身反应免疫细胞增殖的方法，包括给哺乳动物给药治疗有效量重组人甲胎蛋白或其免疫细胞抗增殖片段或类似物。这种方法是基于本人的发现：在原核生物(如大肠杆菌)中生产的非糖基化重组人甲胎蛋白可用于抑制源于哺乳动物的自身反应免疫细胞。这种免疫细胞优选包括T细胞或B细胞；而用于这种方法的重组人甲胎蛋白(或其免疫细胞抗增殖片段或类似物)优选是在原核细胞(如大肠杆菌)中生产的，而且是非糖基化的。
再一方面，本发明的特征是一种治疗哺乳动物(如人类患者)的自身免疫病的方法，包括向哺乳动物给药治疗有效剂量的重组人甲胎蛋白或其免疫细胞抗增殖片段或其类似物。所述自身免疫病是多发性硬化、类风湿性关节炎、重症肌无力、胰岛素依赖性糖尿病、或系统性红斑狼疮。在其它的优选实施方案中，所述自身免疫病是获得性免疫缺陷综合症或涉及移植器官、组织或细胞的排斥。用于所述方法的重组人甲胎蛋白优选是在原核细胞(如大肠杆菌)中生产的，而且是非糖基化的。在其它优选实施方案中，所述方法还包括向哺乳动物给药有效剂量的免疫抑制剂，这一剂量低于仅使用这种免疫抑制剂的标准剂量。所述免疫抑制剂优选是环孢菌素、类固醇、硫唑嘌呤、FK-506或15-脱氧精胍菌素。在另一种优选实施方案中，所述方法包括给哺乳动物给药一种耐受剂(to1erizing agent)。用于所述方法的重组人甲胎蛋白优选是在原核细胞(如大肠杆菌)中产生的，而且是非糖基化的。
根据本发明，给药重组人甲胎蛋白(“rHuAFP”)(或其片段或类似物)，可能是一种有效的预防、治疗或改善哺乳动物的自身免疫病的方法。为了说明这一点，发明人已证实在原核表达系统中产生的重组HuAFP能有效抑制T细胞效应于自身抗原的增殖，尽管实际情况是这种rHuAFP是以不同于天然存在的HuAFP的方式修饰的。到目前为止，天然HuAFP的应用一直受到其不可获得性的局限，天然HuAFP是通过繁琐的纯化过程从有限的脐带及脐带血清来源中获取的。由于现在可以用重组DNA技术大量制备有生物学活性的rHuAFP，所以，目前用rHuAFP治疗自身免疫病是可行的。rHuAFP的应用尤其有利，因为还未知有与人甲胎蛋白相关的有害副作用，而且据认为可以安全地给药较大剂量。
在另一方面，本发明的特征是用于预防、治疗和诊断肿瘤，特别是癌症的组合物和方法。本发明的这一方面是基于发明人的如下发现：在原核生物(如大肠杆菌)中产生的非糖基化重组人甲胎蛋白可用于治疗和诊断患有肿瘤的哺乳动物，特别是患恶性肿瘤，如乳腺癌或前列腺癌，以及由恶性细胞增生所致的其它癌的哺乳动物，所述细胞能表达被重组人甲胎蛋白识别的受体。
一方面，本发明的特征是抑制哺乳动物(如人类患者)肿瘤的方法，包括向哺乳动物给药治疗有效剂量的重组人甲胎蛋白或其抗肿瘤片段或类似物。所述肿瘤优选是恶性肿瘤(如乳腺瘤和前列腺瘤)；而所述重组人甲胎蛋白是在原核细胞(如大肠杆菌)中产生的，而且是非糖基化的。在优选实施方案中，所述肿瘤细胞能表达一种由重组人甲胎蛋白识别的受体。所述肿瘤通常是诸如腺癌或肉瘤的癌。在优选实施方案中，肿瘤效应于诸如雌激素或雄激素的激素增生。给药重组人甲胎蛋白优选能抑制哺乳动物肿瘤细胞的增生或杀死这些肿瘤细胞。该方法还包括向哺乳动物给药化疗剂。
另一方面，本发明的特征是一种预防哺乳动物发生肿瘤的方法，包括向哺乳动物给药一种治疗有效剂量的重组人甲胎蛋白。重组人甲胎蛋白优选是在原核细胞(如大肠杆菌)中产生的，而且是非糖基化的。
又一方面，本发明的特征是一种杂合的细胞毒素，包括和一种细胞毒性剂连接的重组人甲胎蛋白(或其片段或类似物)。这种细胞毒性剂的例子包括，但不限于白喉毒素、假单胞杆菌属(Pseudomonas)外毒素A；蓖麻毒蛋白及其它植物毒素，如相思豆毒蛋白、modeccin、Volkensin、桷寄生毒素；霍乱毒素(由霍乱弧菌(Vibrio cholerae)产生)；所谓志贺样毒素(由大肠杆菌及其它肠杆菌产生)；沙门氏菌属(Salmonella)不耐热的肠毒素；和大肠杆菌不耐热的热毒素。在其它优选实施方案中，所述细胞素性剂是非蛋白类的。这种非蛋白类细胞毒性剂的例子包括，但不限于抗癌剂，如阿霉素，以及α-发射放射性核素，如砹，和β-发射核素，如钇。所述杂合细胞毒素的细胞毒性剂是通过肽键和重组人甲胎蛋白连接，而且该杂合毒素是通过表达遗传工程的杂合DNA分子产生的。在其它优选实施方案中，所述杂合细胞毒素的细胞毒性剂是蛋白；这种细胞毒性剂是和重组人甲胎蛋白化学缀合的。
在其它方面，本发明的特征是一种能够与人体肿瘤细胞结合的可检测地标记的重组人甲胎蛋白或其可检测地标记的片段或类似物。所述分子优选是用放射核素标记过的，如锝-99m、I-125、I-131或铟。其它可检测的标记包括，但不限于酶，荧光团，或其它能发出可检测到的信号(如放射性、荧光、颜色)成分或化合物，或在该标记暴露给其底物后发出一种可检测到的信号，或者所述可检测到的信号可以是一种能由一种抗体识别的表位(例如，甲胎蛋白表位或通过工程手段特意引入重组甲胎蛋白的表位，如HA或myc表位)。所述分子优选能针对恶性肿瘤(如乳腺瘤、前列腺瘤或癌)，该恶性肿瘤能表达一种可由重组人甲胎蛋白(或其片段或类似物)识别的受体。通常，这种重组甲胎蛋白是在原核细胞(如大肠杆菌)中产生的，而且是非糖基化的。
可检测地标记的重组人甲胎蛋白(或其片段或类似物)可用于对人类患者的具肿瘤细胞的部位进行体内显像。一般，该方法包括：(a)提供一种可检测地标记的重组人甲胎蛋白分子(或其片段或类似物)；(b)向患者给药这种分子；(c)让所述标记分子和所述部位结合，并将未结合的分子从所述部位清除；和(d)获得具肿瘤细胞的部位的图像。所述部位优选是乳腺或前列腺。在其它优选实施方案中，所述部位包括但不限于：肝组织、肺组织、脾组织、胰腺组织、脑组织、淋巴组织或骨髓。所述图像优选是利用动态γ闪烁照像法得到的。
可检测地标记的重组人甲胎蛋白(或其片段或类似物)也可用于诊断哺乳动物(如人类患者)内的肿瘤的方法。这种方法包括：(a)让生物样品和可检测地标记的重组人甲胎蛋白接触；和(b)检测和样品结合的标记，当检测到的标记高于背景含量时，表明患者有肿瘤。该方法优选在所述接触步骤之前包括含有固定的和切片的细胞的生物样品，而与样品结合的标记是结合在相当于细胞的细胞膜部分。在优选实施方案中，生物样品来自人类患者的乳腺或前列腺。
可检测地标记的重组人甲胎蛋白(或其片段或类似物)也可用于体内检测哺乳动物活体内肿瘤的方法。这种方法包括：(a)给药诊断有效剂量的可检测地标记的重组人甲胎蛋白；和(b)检测与哺乳动物组织结合的可检测标记的存在，标记量高于背景含量处表明在该哺乳动物体内存在肿瘤。
在优选实施方案中，该方法涉及被怀疑患有乳腺癌的患者，而所述组织是乳腺组织。在其它优选实施方案中，该方法涉及被怀疑患有前列腺癌的患者，而所述组织是前列腺组织。可检测地标记的重组人甲胎蛋白优选是和放射核素(如锝-90)连接，而检测步骤是通过放射成像(如动态γ闪烁照相法)完成的。
另一方面，本发明的特征是用于在体内、原位或体外检测肿瘤或任何表达可由重组人甲胎蛋白(或其片段或类似物)识别的受体的细胞的试剂盒。一般，该试剂盒含有一种可由肿瘤识别的重组人甲胎蛋白，而且这种蛋白可以是可被检测地标记过的。如果所述重组人甲胎蛋白是未标记的，则所述试剂盒中最好含有具有可检测标记(如放射性核素，如锝90、I-125，I-131或铟)的第二种试剂。当所述可检测标记是酶时，所述试剂盒还包括一种用于这种酶的底物。该试剂盒还包括一种用于将可检测标记和重组甲胎蛋白连接的试剂。在另一种实施方案中，所述用于检测肿瘤或任何有害的能表达一种可由重组人甲胎蛋白(或其片段或类似物)识别的受体的细胞的试剂盒，包括一种含有可以特异结合重组人甲胎蛋白的试剂和一种含有可由抗人甲胎蛋白抗体特异结合的可检测地标记的重组人甲胎蛋白的试剂。所述试剂盒的重组人甲胎蛋白优选是在原核细胞(大肠杆菌)中生产的，而且是非糖基化的。
将重组人甲胎蛋白用于治疗和诊断癌症具有很多优点。例如，可将rHuAFP直接给药于肿瘤位点。重组HuAFP也可以是化学定义和合成的，以及用重组DNA技术大量制备的，例如，用本文所披露的方法。另外，与常规的癌症化疗和放疗不同，重组人甲胎蛋白引起的副作用很小，这些副作用如恶心、呕吐和神经毒性。因此，可以安全地给药较大剂量的rHuAFP。
本发明的诊断方法是有利的，因为该方法可以快速便捷地诊断出肿瘤。例如，将rHuAFP用作诊断剂(例如，通过闪烁照相法进行放射显像)特别有利于癌症的实时成像，以便进行癌(如，乳腺癌)手术前或内部的操作定位和分期，在手术后的检查中也是有利的。这种诊断方法的应用可以对肿瘤的存在、位置或缺乏进行非侵害性的测定，这有利于监控患者的疾病。
在另一方面，本发明的特征是一种含有重组人甲胎蛋白或其细胞刺激性片段或类似物的的细胞培养基。本发明的这一方面是基于发明人的以下发现：在原核生物(如大肠杆菌)中产生的非糖基化重组人甲胎蛋白是一种细胞增殖剂，例如，在体外促进骨髓生长。这种重组人甲胎蛋白优选是在原核细胞(大肠杆菌)中产生的，而且是非糖基化的。
因此，本发明这一方面的特征是一种细胞培养方法，该方法包括(a)提供一种含有重组人甲胎蛋白的细胞培养基；(b)提供一种细胞；(c)在所述培养基中培养所述细胞，使细胞增殖和维持。所述细胞优选是哺乳动物细胞。这种哺乳动物细胞的例子包括骨髓细胞(例如，T细胞、天然杀伤细胞、淋巴细胞)、杂交瘤、或遗传工程细胞系。其它细胞的例子包括造血细胞，如干细胞、母细胞、祖细胞(例如，诸如成爆发集落形成单位和集落形成单位的红细胞祖细胞)、成髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、嗜伊红性粒细胞、嗜碱性细胞、组织肥大细胞、巨核细胞[例如，参见“医疗实践的最好的Taylor′s生理学基础”(Best and Taylor′sPhysiological Basis of Medical Pratice)，John B.West著，Willians & Wilkins，Baltimore]。在其它优选实施方案中，该方法涉及来自体内的细胞培养。
在另一方面，本发明的特征是抑制哺乳动物(如人类患者)的骨髓中毒性的方法，包括向动物给药一种治疗有效剂量的重组人甲胎蛋白或其骨髓毒性抑制类似物或片段。所述重组人甲胎蛋白优选是在原核细胞(大肠杆菌)中产生的，而且是非糖基化的。
在另一方面，本发明的特征是一种抑制哺乳动物骨髓细胞增殖抑制的方法，该方法包括向哺乳动物给药有效剂量的重组甲胎蛋白或其抗抑制片段或类似物。重组人甲胎蛋白优选是在原核细胞(如，大肠杆菌)中产生的，而且是非糖基化的。
在另一方面，本发明的特征是一种促进哺乳动物骨髓细胞增殖的方法，包括向哺乳动物给药有效剂量的重组人甲胎蛋白或其细胞刺激片段或类似物。重组人甲胎蛋白优选是在原核细胞(如大肠杆菌)中产生的，而且是非糖基化的。
再一方面，本发明的特征是一种预防哺乳动物骨髓细胞移植排斥的方法，包括向哺乳动物给药有效剂量的重组人甲胎蛋白或其抗排斥片段或类似物。重组人甲胎蛋白优选是在原核细胞(如大肠杆菌)中产生的，而且是非糖基化的。按照本发明的方法，给药rHuAFP(或其片段或类似物)可能是促进和加强体外、来自体内或体内细胞生长的有效方法。另外，给药本发明的化合物可能还是预防、治疗或改善哺乳动物的骨髓毒血症的有效方法。
将rHuAFP(或其片段或类似物用作组织培养基的主要成分是有利的，因为其优点是感染病原体的可能性几乎没有)。
“人甲胎蛋白”是指一种大体上与由Morinaga等描述的[“美国国家科学院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)80：4604(1983)]人甲胎蛋白基因编码的蛋白的氨基酸序列的多肽。在原核细胞中产生人甲胎蛋白的方法披露于美国专利5,384,250中，而且与本文所披露的方法一致。
“表达控制因子”是指一个核苷酸序列，它包括关于控制蛋白编码序列表达并与该序列可操作地连接的因子的识别序列。因此，表达控制因子通常包括控制转录和翻译的序列，例如，启动子、核糖体结合位置、阻遏物结合位点和激活物结合位点。
“大体上相同的氨基酸序列”是指一种多肽，且它与天然存在的人甲胎蛋白的氨基酸序列的同源性至少为80％，典型地至少约为85％、更典型地至少约为90％，经常至少约为95％，更加经常的是至少约为97％。比较序列的长度通常至少约为16个氨基酸，通常至少约为20个氨基酸，更通常的是至少约为25个氨基酸，典型地至少约为30个氨基酸，优选多于35个氨基酸。
多肽的同源性一般是用序列分序软件(例如，威斯康星大学生物技术中心的序列分析软件包，1710，University Avenue，Madison，WI53705)测定的。蛋白分析软件通过评价与各种置换、缺失、置换和其它修饰的同源程度对相似序列进行配对。保守置换一般包括以下各组范围内的置换：甘氨酸，丙氨基；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。
在本文中，“大体上纯的”是指一种已与其天然相伴的成分分离的蛋白或多肽的蛋白。一般，当一种样品中至少60-75％的总蛋白都是感兴趣的蛋白时，这种感兴趣的蛋白是大体上纯的。小的变型或化学修饰一般具有相同的多肽序列。大体上纯的蛋白一般在样品中含有超过约85-90％的这种蛋白，而且优选纯度在99％以上一般，纯度是在层析柱上、聚丙烯酰胺凝胶上测定的，或通过HPLC分析测定。
当把一种蛋白与在天然状态下和其相伴生的杂质分离时，这种蛋白就是大体上无天然伴生成分的蛋白。因此，化学合成的蛋白或在不同于天然产生这种蛋白的细胞的细胞系统中产生的蛋白将是大体上没有其天然伴生成分的。因此，这一术语可用于描述在大肠杆菌或其它原核生物中合成的源于真核生物的多肽和核酸。
本发明提供了大体上纯的人甲胎蛋白。可以部分地根据人甲胎蛋白的结构和功能特性设计出各种从生物材料中分离人甲胎蛋白(AFP)的方法。另外，可以将抗AFP抗体固定在固体基质上，以得到一种用于纯化人AFP的高度专一的亲和性。
除了大体上全长的多肽外，本发明还提供了人甲胎蛋白的有生物活性的重组片段或类似物。例如，有配体结合或免疫抑制活性的片段。
编码人甲胎蛋白或其理想片段的天然或合成DNA片段将被结合到DNA结构上，该DNA结构可以导入细胞培养物中并在其中表达。为导入这种宿主而制备的DNA结构通常包括一个可被宿主细胞利用的复制起点，一个编码人甲胎蛋白的所需部分的DNA片段，可操作地和该甲胎蛋白编码片段连接的转录和翻译起始调节序列，以及可操作地和甲胎蛋白编码片段连接的转录和翻译终止调节序列。该转录调节序列通常包括一个可由宿主识别的异源启动子。合适启动子的选择取决于宿主，但在合适条件下可以使用诸如trp、tac和噬菌体启动子、tRNA启动子和糖酵解酶启动子(Sambrook等著，“分子克隆：实验指南”(Molecular Cloning：Laboratory Manual)，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，NY 1989)。在某些场合可能希望包括关于能够在宿主细胞中调节转录的因子的适当定位的识别序列(例如，大肠杆菌的lac阻遏物)。可以使用包括复制系统与转录和翻译调节序列以及常用于插入编码待表达基因的DNA片段的市售表达载体。
上述各种启动子、转录和翻译序列一般是指“表达控制因子”。
也可以将一个编码全部或部分人AFP的DNA片段整合到宿主细胞染色体中。
可以用众所周知的方法将含有感兴趣的DNA片段的载体转入宿主细胞中，这些方法因细胞宿主的类型而异(Sambrook等，同上)。“转化的细胞”这一说法的含义也包括转化细胞的子代。
可用于高水平表达重组蛋白的原核宿主包括：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)和假单胞属的各种菌株。
本发明的方法提供了一种产生大量具有生物活性的人甲胎蛋白的手段。用本发明方法生产的AFP具有生物活性，尽管事实上这种AFP未被以与天然存在的人AFP相同的方式修饰。
“免疫细胞抗增殖”这一说法是指能够抑制不需要的免疫细胞(例如，使用本文所披露的分析方法测得的自身反应T细胞)的生长。
“肿瘤”是指任何无生理功能的细胞的有害生长。一般，肿瘤细胞是从其正常的细胞分裂控制中释出的，即这样的一种细胞，其生长不是由细胞环境中普通的生化和物理影响调节的。在多数情况下，肿瘤细胞的增殖会形成细胞的克隆，这种克隆是良性的或恶性的。肿瘤的例子包括，但不限于转化的和无限增殖化细胞、肿瘤、和癌，如乳腺细胞癌和前列腺癌。
“治疗有效量”这一说法是指能够抑制肿瘤增殖或能够抑制自身反应免疫细胞增殖或刺激细胞(如骨髓细胞)增殖的非糖基化重组人甲胎蛋白或其抗肿瘤片段或类似物的剂量。
“诊断有效量”这一说法是指可以在哺乳动物(如人类患者)的靶部位中可以检测到的经可检测地标记的重组人甲胎蛋白或其经可检测地标记的片段或类似物的剂量。
“细胞刺激”这一说法是指增加细胞增殖、增加细胞分裂、促进细胞分化和/或发育、或延长细胞寿命。
“骨髓毒性抑制”是指抑制骨髓剥离。
从以下对本发明优选实施方案的说明和权利要求书可以了解本发明的其它特征和优点。
先说明附图。
附图
图1是编码人甲胎蛋白的cDVA的核苷酸序列(序列4)和推断氨基酸序列(序列5)。
图2是rHuAFP片段I(序列11)的10％SDS-PAGE分析(泳道A，分子量标记；泳道B，天然人甲胎蛋白(AFP)；泳道C，未纯化的rHuAFP；泳道D，rHuAFP片段I；和泳道E，rHuAFP(图1的氨基酸1-590，序列5))。
图3是表示由大肠杆菌产生的rHuAFP和结构域片段对人“自体混合淋巴细胞反应(AMLR)的抑制作用的直方图。
图4表示用聚丙烯酰胺凝胶电泳和柱层析制备的由杆状病毒和大肠杆菌产生的rHuAFP的纯度和生化特征的一系列示图。图4A是10％非变性碱性聚丙烯酰胺凝胶，示rHuAFP的纯度。小鼠羊水蛋白(运铁蛋白、AFP和白蛋白)如泳道1所示，天然HuAFP(泳道2)，由杆状病毒产生的rHuAFP(泳道3)，和大肠杆菌产生的rHuAFP(泳道4)。图4B是10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶，示用杆状病毒和大肠杆菌表达系统生产的rHuAFP的纯度。分子量标记示于泳道1中，天然HuAFP、由杆状病毒和大肠杆菌产生的rHuAFP分别示于泳道2、3和4中。图4C是在Mono Q阴离子交换柱上洗脱的天然HuAFP、由杆状病毒和大肠杆菌产生的rHuAFP的一系列FPLC层析谱。重叠的层析谱表示天然HuAFP(层析谱1)、由杆状病毒和大肠杆菌产生的rHuAFP(分别为层析谱2和3)。图4D是通过让50μg天然HuAFP和rHuAFP从反向Delta Pak C18柱(Waters)中通过，并用在0.1％“三氟乙酸”(TFA)中配制的0-100％乙腈梯度洗脱而获得的一系列HPLC层析谱。重叠的层析谱表示天然HuAFP(层析谱1)和由杆状病毒与大肠杆菌产生的rHuAFP(分别为层析谱2和3)。
图5是一直方图，其表示由用杆状病毒和大肠杆菌表达系统产生的rHuAFP产生的抗天然HuAFP抗体阻止AMLR的免疫抑制。由用杆状病毒和大肠杆菌表达系统产生的rHuAFP产生的免疫抑制是显著的(P＞0.002)，而由单克隆抗天然HuAFP(aAFP)抗体产生的、由rHuAFP介导的AMLR的免疫抑制也是显著的(P＜0.03)。AMLR培养是在有或没有蛋白的条件下建立的，其含有2×105个效应T细胞，2.5×105个辐射过的自身非T细胞，在144小时时收获，并根据掺入自身反应T细胞中的3H-胸苷是测定其自身增殖。rHuAFP的自身增殖抑制作用是这样进行的：以1/8(125μg/ml)的稀释倍数将鼠抗人AFP单克隆抗体加入AMLR培养物中，AMLR能被100mg/ml由杆状病毒产生的rHuAFP(影线条)和100μg/ml由大肠杆菌产生的rHuAFP(空白条)抑制。对照培养物由有1/8倍抗人AFP(aAFP)单克隆抗体存在的AMLR组成。
图6是一系列直方图(图6A和6B)，表示用人AMLR(图6A)和“外周血淋巴细胞”(PBL)(图6B)进行试验时由rHuAFP介导的免疫抑制效果。图6A表示通过对250,000个T细胞和等量自身辐射(autologous irradiated)的非T淋巴细胞进行其培养制备的自体混合淋巴细胞反应(AMLR)结果。源于大肠杆菌和杆状病毒表达的系统的重组HuAFP制剂和白蛋白在培养开始时均以100μg/ml的浓度加入。在144小时时通过3H-胸苷掺入量测定增殖效应。图6B表示用1μg/ml伴刀豆凝集素A(ConA)刺激的PBLs(2×105)的结果，将其在仅补充有2mg/ml白蛋白的RPMI培养基中培养48小时。以100μg/ml的浓度加入白蛋白和源于大肠杆菌和杆状病毒的rHuAFP，开始培养。根据DNA合成过程中3H-胸苷的掺入量测定增殖效果。测得SEM低于平均值的5％。
图7是pVT-PlacZ的质粒图。
图8是系列图，表示rHuAFP对T细胞活化的动力学的抑制效果(图8A)，和rHuAFP对自身增殖的T细胞的剂量-效应关系。图8A是表示在没有rHuAFP()和有100μg/ml()rHuAFP存在的条件下将细胞培养4天以上时间的增殖效应的图。(°)表示单独培养的效应细胞群的背景增殖。在上述时间内，由重组HuAFP-介导的对AMLR的抑制作用是显著的(P＜0.01)。图8B是表示在144小时时用量为6-100μg/ml()的rHuAFP对自身增殖的T细胞的抑制作用。()表示在无蛋白的条件下反应的对照效应。用量在12.5-100μg/ml范围内的rHuAFP对自身反应T细胞的抑制作用是显著的(P＜0.005)。
图9是表示rHuAFP对雌激素刺激的MCF-7乳腺癌细胞铺满后生长的影响的直方图。
图10是表示在有或没有400μg/ml rHuAFP和5μg/ml运铁蛋白的存在条件下鼠骨髓在无血清RPMI培养基中的增殖。重组人甲胎蛋白的表达CDNA文库的构建
用由自4.5月龄人类流产胎儿的肝细胞(～3g湿重)中分离的poly(A)+RNA制备的大小分级cDNA(0.5-3kg)构建cDNA文库。(另外，可以从Clontech Laboratory，Inc.获得胎儿cDNA文库，Palo Alto，CA.)。用硫氰酸胍法(Chirgwin等，“生物化学”(Biochemistry)18：5294，1979)制备总RNA，并通过oligo(dT)-纤维素层析(Collaborative Research，Bedford，MA)[“现代分子生物学方案”(Current Protocols in Molecular Biology)，Ausubel等，著，WileyInterscience，New York 1989]筛选mRNA。利用Librarian IIcDNA合成试剂盒(Invitrogen，San Diego，(A)合成cDNA并在1％琼脂糖凝胶上进行分级分离。提取0.5-3kb的片段，并将其和载体pTZ18-RB(Invitrogen)连接，然后用其转化感受态大肠杆菌DHl αF(Invitrogen))。用Colony/Plaque Screen滤膜(DuPont，Wilmington，DE)进行菌落起模(colony lifts)，在含有0.5M NaOH、1.5M NaCl的溶液中培养10分钟对转移的细菌菌落进行裂解和变性。在含有1.5M NaCl、0.50M Tris-HCl(pH7.6)的溶液中洗涤滤膜5分钟，然后风干。然后在氯仿中将滤膜洗涤5次，在0.3M NaCl中浸泡以除去细胞屑，然后风干。通过在80°下在真空条件下焙烤2小时将DNA固定在硝酸纤维素膜上。将焙烤过的滤膜放在含有6×SSC(1×SSC＝150mM NaCl、15mM柠檬酸钠[pH7.0])、1×Denhardt′s溶液(0.2g/l聚乙烯吡咯烷酮、0.2g/l“牛血清白蛋白”(BSA)、0.2g/lFicoll 400)、0.05％焦磷酸钠、0.5％SDS、和100μg/ml大肠杆菌DNA的溶液中，在37℃下预杂交3小时。在37℃下在同一溶液中杂交18-24小时，杂交溶液中无SDS，含有1-2×106cpm/ml通过5′-端磷酸化“[现代分子生物学方案”(Current Protocols in MolecularBiology)，同上]用32P标记的两种寡核苷酸。用于检测所述文库的寡核苷酸的序列为：5′-TGTCTGCAGGATGGGGAAAAA-3′(序列1)和5′-CATGAAATGACTCCAGTA-3′(序列2)，分别相应于人AFP编码序列的772-792位和1405-1422位。在37℃下用6×SSC、0.05％焦磷酸钠将滤膜洗两次，30分钟，然后在48℃下在同一溶液中洗一次，30分钟。在有Du Pont Cronex Lightning Plus增感屏存在的条件下用干燥的滤膜对KodakXAR胶片进行曝光24-48小时，以鉴定阳性克隆。分离、扩增阳性克隆，并进行Southern印迹分析[“现代分子生物学方案”(Current Protocols inMolecuar Biology)，同上]。简单地讲，用合适的限制酶水解纯化的DNA，并在1％琼脂糖凝胶上分离所得到的片段。然后将DNA转移到硝酸纤维素膜上。杂交条件如上所述，所不同的是，除上述两种探针外，还使用第三种32P标记的寡核苷酸(5′-CATAGAAATGAATATGGA-3′(序列3)，表示人AFP编码片段的7-24位)。在所筛选的3,000个菌落中鉴定出5个阳性克隆。其中的一个克隆pLHuAFP被用于以下所述的构建。构建全长人AFP cDNA
用以下5个DNA片段制备一种含有翻译起始密码子、其后为人AFP编码序列和翻译终止密码子的结构。
片段1：将两种非磷酸化寡核苷酸退火，以形成一种双链DNA分子，其组成为：一个5′-端粘性EcoRI识别位点，随后是一个ATG起始密码子，和人AFP cDNA的前60个碱基对(bp)。而且包括位于该编码序列的第60位上的PstI限制位点(在这种方案中，核苷酸1是成熟蛋白的第一个密码子(Thr)的第一个核苷酸，相当于Morinaga等的核苷酸102，同上)。将该片段同用EcoRI和PstI线性化的pUC119(具有M13的从5465位的HgiAI至5941位的AhaII的基因间区的pUC19，该基因间区被插在pUC19的NdeI位点)连接。所得到的DNA在大肠杆菌NM522(Pharmacia，Piscataway，NJ)中扩增。以如下方法回收EcoRI-PstI插入片段：酶促消化重组质粒，然后在5％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，再自凝胶中提取。
片段2：通过用PstI和NsiI消化pLHuAFP和上述凝胶纯化获得一个97bp的人AFPcDNA片段(57-153)。该克隆含有人AFP的完整的编码片段及5′和3′非翻译序列。
片段3：通过用NsiI和AlwNl消化pLHuAFP和上述纯化获得一个224bp的人AFP cDNA片段(150-373位)。
片段4：通过用AlwNI和StyI消化pLHuAFP和上述纯化获得一个1322bp的人AFP cDNA片段(371-1692位)。
片段5：将两个非磷酸化的寡核苷酸退火，形成86bp的双链DNA，其含有从StyI位点的1693位至1773位终止AFP编码片段的TAA终止密码子的人AFP序列，其后面为一个粘性BamHI位点。无需任何进一步的操作即可使用这种合成的DNA。
用EcoRI和BamHI彻底水解pBlue Script(StrataGene，La Jolla，CA)，并将其加入含有上述5种纯化片段的连接混合物中。对照连接混合物中仅含有线性化的pBluescript。将上述两种连接混合物的一部分用于转化感受态大肠杆菌DH52(GIBCO/BRL，Grand Island，NY)。从几种转化体中分离重组质粒，通过深入的限制性酶分析和DNA测序进行筛选。筛选出一种重组质粒并命名为pHuAFP。随后将其用来将人AFP基因插入几种表达载体中。pHuAFP包括一个独特的EcoRI-BamHI片段，该片段不仅包括5′-末端的ATG起始密码子和3′-末端的TAA终止密码子，而且还含有人AFP的完整的编码序列。AFP表达载体
在3种不同的表达系统中成功实现了在大肠杆菌里的高水平合成人AFP。TRP系统能进行直接表达。R×1系统能产生一种融合蛋白，其含有20个由trpE和载体序列编码的氨基酸。MAL系统表达与malE基因产物-一种42kd的芽糖结合蛋白融合的AFP。
TRP表达系统：将pHuAFP的1186bp EcoRI-BamHI AFP编码片段克隆到表达载体pTrP4(Olsen等，“生物技术杂志”(J.Biotechnol.)g：179，1989)上，克隆位于trp启动子和一个修饰过的核糖体结合位点的下游。
简单地讲，用EcoRI和BamHI消化pHuAFP，并用Klenow聚合酶将末端补平。然后对1186bp的AFP片段进行凝胶纯化。用ClaI消化pTrp4，用Klenow聚合酶将其末端补平，并对线性化的载体进行凝胶纯化。连接1186bp的AFP片段和pTrp4主链，并将其用于转化感受态大肠杆菌，即以下菌株：DH5α，BL21(F.W.Studier，Brookhaverc National Laboratory，Upton，NY)、SG927(美国模式培养物保藏所，Rockville，MD：保藏号39627)、SG928(ATCC，保藏号39628)和SG935(ATCC，保藏号39623)。
R×1表达系统：将人AFP cDNA克隆到表达载体pR×1[Rimm等，“基因”(Gene)，75：323，1989]上接近trp启动子的位置，其位于TrpE翻译框中。通过用EcoRI和BamHI消化将人AFP cDNA从pHuAFP上切除，并克隆到经适当处理的pR×I(BioRad Laboratories，Hercules，CA)上。然后用最终得到的被称为pR×1/HuAFP的质粒结构转化上述大肠杆菌菌株和CAG456(D.W.Cleveland，Johns Hepkins University，Baltimore，MD)。
MAL表达系统：将AFP cDNA插入表达载体pMAL(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)中，将其置于tac启动子的控制之下，并位于MalE翻译框中。简单地讲，用BamHI水解pHuAFP，并用Klenow聚合酶将末端补平。通过EcoRI消化将人AFP cDNA质粒DNA的其余部分释出，然后进行凝胶纯化。将纯化的法段连接到适当消化过的pMAL-C上。将正确取向的重组质粒-其名称为pMAL/HuAFP用于转化大肠杆菌DH52、TBI(New EnglandBiolabs)和SG935。
对用于构建上述3种表达系统中的AFP编码片段进行测序，发现其编码完整长度的AFP。在大肠杆菌中表达AFP
在30℃或37℃、通气条件下对细菌培养物进行培养。使过夜的大肠杆菌培养物在补充了适当的所需抗生素(四环素-HCl 50μg/ml，氨苄青霉素-Na 100μg/ml)和LB培养基中生长。
TRP和R×1表达系统：在色氨酸饥饿条件下诱导trp启动子。诱导是在按如下方法制备的MgCA培养基中执行：将1g酪蛋白氨基酸(DifcoLaboratory，Detroit，MI)，6g Na2HPO4，3g KH2PO4，0.5g NaCl，1g NH4Cl加入1升Milli-Q水(Millipore公司，Bedford，MA)中，将pH调至7.4，并对该溶液进行高压灭菌。使冷却的培养基中含有2mM MgSO4、0.1mM CaCl2、和0.2％葡萄糖。将在补充了抗生素的MgCA中培养过夜的培养物稀释100倍，然后在30℃下使细胞生长至A550为0.4，离心收获，并在-20℃下以沉淀形式保存。
MAL表达系统：用义务诱导物异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导tac启动子。用补充了抗生素的LB培养基将过夜培养物稀释100倍，并使细胞在37℃下生长至A550为0.4。然后将IPTG加至终浓度为0.3mM，并将细菌再培养2小时。通过离心收获细胞，并于-20℃下保存沉淀。检测AFP在大肠杆菌中的表达
进行分析研究以测定重组AFP的表达和行为。或者将细胞沉淀悬浮于SDS-裂解溶液(0.16M Tris-HCl[pH6.8])、4％W/VSDS、0.2m二硫苏糖醇(DTT)、20％甘油、0.02溴酚蓝)中，煮沸5分钟，并用于SDS-PAGE分析；或者将细胞沉淀悬浮于由10mM Na2HPO4、30mM NaCl，0.25％Tween20、10mM EDTA、10mM乙二醇双(乙-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)组成的裂解缓冲液中，在4℃下与1mg/ml溶菌酶一起培养30分钟，然后以50％的功率用脉冲方式进行声处理3×1分钟(“声能学及器材”(Sonics andMaterials)，Danbury，CT：model VC300 Sonifier)。在10,000g下将裂解液离心20分钟，将含有可溶性蛋白的上清液倾入另一支试管中，并在-20℃下冰冻待用。将含有不溶性蛋白的沉淀重新悬浮于SDS-裂解缓冲液中，煮沸5分钟，并在-20℃下保存等用。对释放在SDS-裂解缓冲液中的总蛋白以及可溶性和沉淀级分进行SDS-PAGE分析和Western吸印转移后的免疫检测。在以上研究中，用图像测密计(BioRad，Mode1620)对考马斯蓝染色的凝胶进行常规扫描。由此可以对所产生的重组AFP量进行定量测定，以占细胞总蛋白的百分比形式表示。在TRP系统中表达的AFP的纯化
除非另有说明，所有操作均在4℃下进行。将每份自1升培养物获得冰冻细胞沉淀重新悬浮于25ml裂解缓冲液A[50mM Tris-HCl[pH7.5]]、20％蔗糖、100μg/ml“苯甲基磺酰氟”(PMSF)]中，并温育10分钟。加入EDTA至终浓度为35mM，并将提取物再放置10分钟。加入25ml(裂解缓冲液B(50mM Tris-HCl[pH7.5])，2.5mM EDTA，0.2％TritonX-100)后将裂解缓冲液再温育30分钟。于12,000g离心细胞裂解液20分钟，并用50ml洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl[pH8.0]、10mM EDTA、0.2％TritonX-100)将含有重组AFP的沉淀洗涤2次，每次洗涤后都进行上述离心。将沉淀溶解在50ml变性缓冲液(0.1M K2HPO4[pH8.5])、6M盐酸胍、0.1M2-巯基乙醇)中，声处理，然后在一台Nutator(Clay Adams)上混合4小时。用含有50mMTris-HCl、100mM NaCl、1mMEDTA的溶液将溶解的提取物稀释50倍，并使重组AFP蛋白复性24小时。这一50倍稀释步骤是很重要的，因为在稀释之前AFP似乎有微聚积。经过稀释和再浓缩后，AFP不再聚积。用Amicon过滤装置在YM10膜上将上述溶液浓缩100倍，并通过Millex 0.22μm膜滤器(Millipore)澄清。在室温下用在20mM Tris-HCl(pH8.0)中平衡的Mono Q柱(Pharmacia)上进一步纯化AFP，用线性梯度0-100％1M NaCl，20mMTris-HCl(pH8.0)洗脱结合的蛋白。通过SDS-PAGE、碱性PAGE(APAGE)和Westem印迹分析洗脱级分。
上述多肽表达和纯化的一般方法也可用于产生和分离有用的人甲胎蛋白或类似物(如下文所述)。聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western免疫检测方法
按照Hames等的方法(“蛋白质凝胶电泳：一种实用方法”(GelElectrophoresis of Proteins：A Practical Approach)，IRL Press，London，1981)，使用mini-Protean电泳装置(BioRad)在不连续的缓冲系统中进行SDS-PAGE和碱性PAGE。在SDS-PAGE或APAGE之后通过将凝胶浸泡在转移缓冲液(12.5mMTris-HCl，96mM甘氨酸、20％甲醇[pH8.2])中15分钟，对重组人AFP进行免疫检测。然后在每块凝胶上覆盖一张Immobilon聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)，并将其夹在mini-Protean转移装置(BioRad)的两个电极载网之间，使凝胶接近阴极。将该系统浸入转移缓冲液中，施加150mA的电流，作用2小时。在含有20mMTris-HCl(pH7.5)、500mM NaCl、3％明胶的溶液中封闭Immobilon PVDF膜上未反应的位点1小时。分别将同碱性磷酸酶(BioRad)缀合的兔抗人AFP抗血清和羊抗兔抗体用作一级和二级抗体。用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐和P-氮蓝四唑(BioRad)检测碱性磷酸酶活性。AFP表达的定量
用人AFP“酶联免疫吸附测定”(ELISA)试剂盒(Abbort Laboratories，Chicago，IL)，对重组人AFP进行定量。
通过扫描银染凝胶测定AFP产量。当用采用了“色氨酸”(Trp)表达系统的编码AFP的质粒转化SG935细胞时，AFP占大肠杆菌细胞总蛋白的2-5％(每升培养物中约含3-7mg AFP)。如上所述，初级提取物中的大部分AFP是不可溶的。上述再溶解过程可以回收50-60％稳定、半纯化、单体形式的AFP(每201大肠杆菌大约可得50mg)。可对上述产物进行进一步纯化，以得到25mg的纯化单体AFP。N-末端分析
用一台Porton蛋白/肽气相微量测序仪进行自动Edman降解，用一台定做的一体化的微孔HPLC优化序列。用PC/Gene软件包(Intelligenetics)里的选择程序辅助蛋白质序列分析。用一种杆状病毒表达系统进行HuAFP的克隆、表达和纯化
按照本领域公知的标准方法(例如，参见美国专利No.4,745,051)构建表达HuAFP(或其片段或类似物)的重组杆状病毒。这种方法一般包括两个步骤。首先将待表达的基因，例如rHuAFP或其片段或类似物(见下文)克隆到一个质粒转移载体上，使其位于杆状病毒启动子的下游，杆状病毒启动子的侧翼为源于非必须位点的杆状病毒DNA，例如多角体蛋白基因。然后将该质粒随环状野生型基因组DNA一起导入昆虫细胞，使发生同源重组。随后筛选重组的子代，例如，用顺序噬斑分析从非重组型亲代菌株中纯化重组病毒。为了获得足够的用于蛋白表达的病毒，通常必须进行病毒扩增。对重组病毒进行噬斑纯化，并用本领域熟知的标准方法证实其DNA结构。
用EcoRI/BamHI从质粒PIl8中分离rHuAFP的cDNA片段，并利用下文所述的Geneclean进行纯化。HuAFP cDNA在杆状病毒中的克隆和表达是用质粒pVT-PlacZ进行的。将人AFP cDNA克隆到质粒pVT-PlacZ(图7)上，位于其3′-端为昆虫产生的蜂毒肽信号肽序列的读框中。对杆状病毒载体pVT-PlacZ的修饰是通过用寡核苷酸5′-GATCTAGAATTCGGATCCGGT-3′(序列21)及其互补片段替代其多克隆位点，包括沿5′和3′方向的EcoRI和BamHI限制位点，所述修饰还包括减少位于蜂毒肽信号肽裂解位点和在EcoRI内切核酸酶序列上插入AFP cDNA位点之间的非AFP编码核苷酸的数目。然后将所述插入片段连接到修饰过的pVT-PlacZ载体的EcoRI和BamHI DNA序列上。
按照标准方法制备含有rHuAFP编码序列的重组杆状病毒。通过用pVT-PlacZ转移载体和野生型杆状病毒进行共转染，并接着进行两轮噬斑纯化制备含有HuAFP编码序列的纯化重组杆状病毒。将Sf9昆虫细胞以1×106细胞/ml的密度接种在盛于500ml体积的转动烧瓶中的无血清Grace培养基中，用重组杆状病毒进行感染，感染复数为5。通过在200×g下离心收获含有所分泌的rHuAFP的上清液，并除去细胞。通过用YM30 Amicon膜超滤将含有rHuAFP的培养基浓缩10-20倍，用PBS透析过夜，然后加注到ConA凝集素柱(Pharmacia)上。用0.4M的甲基α-D吡喃甘露糖苷洗脱结合的rHuAFP，并通过在用20mM磷酸缓冲液，pH8.0配制的1M NaCl的0-100％线性梯度期间从MonoQ柱上洗脱来纯化。用本领域公知的方法鉴定重组HuAFP。
本发明人发现，由杆状病毒所产生的rHuAFP约占由Sf9昆虫细胞分泌到无血清培养基中的总蛋白量的20％。通过非还原性碱性PAGE发现，这种AFP也是单体。大部分由杆状病毒产生的HuAFP结合于固定化ConA上。这样一来，可以有效除去90％以上的混杂蛋白，这些蛋白不能结合在凝集素粒上。用270-310mM NaCl从MonoQ珠上洗脱蛋白，对由杆状病毒产生的rAFP制剂进行最终的纯化，得到一种单一的肽，其表现分子量约为68KD。我们从每升生长培养物中至少可获得1mg纯化蛋白。
由杆状病毒产生的rHuAFP的分子量类似于天然人体分子的分子量(图4B)。上述发现，以及杆状病毒产生的rHuAFP的结合到ConA柱上和所观察到的由大肠杆菌产生的rHuAFP不结合到ConA柱上表明，由杆状病毒产生的rHuAFP是糖基化的。不过，预计由杆状病毒产生的rHuAFP(BrAFP)的糖基化程度低于天然分子的糖基化程度，因为已有文献记载被重组杆状病毒感染的Sf9细胞缺乏进行复杂的糖基化的能力，而这种糖基化却常见于高等真换生物产生的蛋白。在APAGE和SDS-PAGE(图4A和4B)上的单一带，以及分别示于图4C和4D中的FPLC和HPLC层析谱上的单一峰证实了所分离的由杆状病毒产生的rHuAFP的纯度。N-末端测序进一步证实了纯化rHuAFP的身份。所述rHuAFP的N-末端序列为：Asp-Leu-Gly-Phe-Met-Thr-Leu-His-Arg-Asn(序列22)。对来自由重组杆状病毒感染的Sf9细胞的无血清上清液进行Western印迹分析，检测到一条单一的和非特异性抗-HuAFP Ab的免疫反应带，而在未感染的或由野生型病毒感染的Sf9细胞中缺乏这条带。
用本领域已知方法进行实验，以测定由HuAFP所产生的杆状病毒的生物学活性。例如，100μg/ml由杆状病毒产生的HuAFP的免疫抑制活性是根据其抑制上述人AMLR的能力测定的。如图5和6A所示，由杆状病毒产生的rHuAFP能在144小时时抑制由自身非T细胞刺激所产生的自身反应淋巴细胞的增殖效应。而加入等量的人血清白蛋白不能减弱淋巴细胞增殖效应。
为了证实rHuAFP是决定抑制自身增殖的T细胞的底物，用市售鼠抗人AFP单克隆抗体(MAb)阻止由rHuAFP介导的AMLR的抑制作用。如图5所示，抗HuAFP能彻底阻止由100μg/ml大肠杆菌和杆状病毒产生的rHuAFP对增殖的自身反应T细胞的抑制作用。而加入100μg/ml HSA不能减弱AMLR效应，而在反应培养物中仅有MAb存在无任何作用。
另外，我们试验了在仅补充2mg/ml纯化人白蛋白(ICN，Mississanga，ON)的RPMI组织培养基中rHuAFP抑制由丝裂原诱导的外周血淋巴细胞(PBL)增殖的生物学活性。如表II(下文)和图6B所示，100μg/ml rHuAFP能抑制ConA刺激的PBLs，而相同浓度的白蛋白不起作用。
根据标准方法，用如本文所披露的任何方法能由上述杆状病毒表达系统产生其它rHuAFP[例如，rHuAFP(氨基酸1(THr)-590(Val)；序列5)；结构域I(氨基酸1(THr)-197(Ser)；序列6)；结构域II(氨基酸198(Ser)-389(Ser)；序列7)；结构域III(氨基酸390(Gln)-590(Val)；序列8)；结构域I+II(氨基酸1(THr)-389(Ser)；序列9)；结构域II+[II，(氨基酸198(Ser)-590(Val)；序列11)]。
在一个实施例中，载体pVT-PlacZ/HuAFP(氨基酸1-590)是通过将编码HuAFP的cDNA插入pVT-P10中而构建成的，pVT-P10是构建pVT-PLacZ的中间载体[Richardson等，(1992)“用杆状病毒表达系统设计分泌的糖蛋白”(Engineering Glycoproteins for Secretion using the baculovirusexpression System)。见“杆状病毒和产生重组蛋白的方法”(Baculovirus andRecombinant Protein Production Processes)，J.M.Viak，E-J.Schlaeger和A.R.Bernard，Editiones Roche著，Basel，Switzerland，PP.67-73]。用BamHI消化pVT-P10载体，接着再与绿豆核酸酶(New England Biolabs，Mississ-auga，Ont.)一起温育。然后在平端BamHI位点下游用EcoRI对该载体做进一步水解，以利于HuAFP cDNA的直接克隆。编码氨基酸1-590的rHuAFPcDNA是通过PCR扩增获得的，扩增时采用了以下寡核苷酸引物：(5′-AAAAAACTCGAGATACACTGCATAGAAATGAA-3′；序列23)，其含有一个Xhol位点(5′-AAAAAAGAATTCTTAAACTCCCAAAGCAGCACG-3′；序列24)并含有一个EcoRI位点，而且作为模板DNA的质粒p118含有HuAFP的编码片段。所述PCR反应按标准方法进行，例如，在含有34μLH2O，10μL10×反应缓冲液，20μLdNTP，2μl DNA模板，10μL 10pmol/μL5′引物，10μL 10pmol/μL3′引物，1μL甘油，10μL二甲基亚砜(DMSO)和1μLPfu聚合酶的反应混合物中进行。退火、延伸和变性温度也是按照标准条件，例如分别在50℃、72℃和94℃下进行，用Gene Amp PCR系统9600(PerKing Elmer Cetus)进行30次循环。用Genaclean试剂盒(Bio II Inc.，LaJolla，CA)纯化来自PCR反应的DNA。rHuAFP片段先用Xhol消化，接着再用绿豆核酸酶处理。接着用EcoRI消化HuAFP cDNA，以利于将其直接克隆到pVT-P10上。
将PCR产生的rHuAFP cDNA连接到平端5′BamHI位点和3′EcoRI位点上。通过用限制性酶BamHI消化从载体pJVNheI[Vialard等，(1990)“用新的具有α-半乳糖苷酶基因的杆状病毒载体合成麻疹病毒的膜融和血凝素蛋白”(Synthesis of the membrane fusion and hemagglutinin proteins of Measles(Virus，using a novel baculovirus vector containing the β-galactosidase gene)，“病毒学杂志”(J.Virology)64：37-50]中分离的在其3′末端含有源于SV40的聚腺苷酸位点的β-半乳糖苷基团，再将其插入相容的BgIII，产生最终的结构：pVT-PLacZ/HuAFP(含有氨基酸1-590)。然后将该结构用于表达rHuAFP(1-590)。片段和类似物
本发明包括有生物学活性的rHuAFP片段。具有生物学活性的rHuAFP的片段具有下列活性中的至少一种：(a)指导与一种靶细胞的特异性相互作用，例如，与表达一种可由rHuAFP识别的受体的细胞结合(例如，诸如MCF-7的癌细胞或骨髓细胞膜)；(b)终止、减弱或抑制肿瘤或自身反应免疫细胞的生长(例如，与细胞表面受体结合并产生一种抗增殖信号)；刺激、提高、扩展或以其它方式影响诸如骨髓细胞的细胞增殖(例如，在细胞表面受体上结合一个增殖或刺激信号)；或阻止或抑制或防止免疫病理学抗体反应。可以用本领域公知的任何标准结合试验测定rHuAFP片段或类似物结合可由rHuAFP识别的受体的能力。用本领域公知方法(如在本文中披露的方法)测定这种片段和类似物的生物学活性。
一般，rHuAFP片段是用上述多肽表达和纯化技术产生的。例如，可以通过用结合在合适表达载体上的编码HuAFP的cDNA片段的一部分(如上述cDNA)转化合适的宿主细菌细胞来产生合适的rHuAFP片段。另外，可以用标准的PCR技术产生上述片段并克隆到表达载体(同上)上。也可以用化学合成法产生片段(例如，用披露于“固相肽合成”(Solid Phase Peptide Syn-thesis)，第二版，1984中的方法，The Pierce Chemical Co.，Rockford，I1)。因此，一旦rHuAFP片段被表达，可以用各种本领域公知的层析和/或免疫方法进行分离。在进行亲合层析之前，可以用标准方法裂解含有rHuAFP的细胞并进行分级分离。用本领域技术人员已知的方法检测候选rHuAFP片段表现出甲胎蛋白生物活性的能力(例如，用本文所披露的方法)。
如上文所述，rHuAFP片段也可以融合蛋白形式表达，以与麦芽糖结合蛋白融合形式在大肠杆菌中产生。采用麦芽糖结合蛋白融合和纯化系统(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)，可将克隆的人cDNA序列插在编码麦芽糖结合蛋白(malE)基因的下游，并位于该基因的读框中，然后就可以超量表达malE融合蛋白。当所述人cDNA序列上缺乏常见的限制位点时，可以用PCR方法在该cDNA片段的5′和3′末端引入适应载体的限制位点，以便于将cDNA片段插入该载体中。在融合蛋白表达之后，可以通过亲合层析进行纯化。例如，可以利用融合蛋白的麦芽糖结合蛋白部分与固定在柱上的直链淀粉结合的能力纯化该融合蛋白。
为了方便蛋白纯化，质粒pMalE在cDNA插入该载体的位点的上游含有一个Xa因子裂解位点。因此，随后可以用Xa因子裂解上述纯化的融合蛋白，将麦芽糖结合蛋白同人重组cDNA基因产物分离。可以对该裂解产物进行进一步层析，以使从麦芽糖结合蛋白中纯化rHuAFP。另外，可以融合蛋白形式表达rHuAFP片段，所生产的融合蛋白含有聚组氨酸片段。然后，可以通过聚组氨到片段与一种亲和柱的结合来分离这种甲胎蛋白融合蛋白，所述亲和柱具有能以高亲和力结合聚组氨酸片段的镍部分。可以通过改变亲和柱里的pH洗脱该融合蛋白。通过用特殊蛋白酶裂解该融合蛋白，可以将rHuAFP从存在于所得到的融合蛋白的聚组氨酸序列上释放下来。
可以用免疫学方法测定重组HuAFP片段表达产物(例如，由上述任何原核系统所产生)，如重组细胞提取物的Western印迹、免疫沉淀分析，或免疫荧光(例如，用Ausubel等所披露的方法，“现代分子生物学方案”(CurrentProtocols In Molecular Biology)，Greene Publishing Associates and WileyInterscience(Jhon Wiley & Sons)，New York，1994)。
如果需要，可以用众所周知的方法(见Coligan等著，“现代免疫学方案”(Current Protocols in Immunology)1992，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)将纯化的基因产物或其片段用于制备抗人重组甲胎蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体。为了制备单克隆抗体，可以用重组蛋白免疫接种小鼠，分离能分泌抗体的B细胞，并用非分泌性骨髓瘤细胞融合供体进行无限增殖化。然后筛选用于产生重组人甲胎蛋白(或其片段或类似物)特异性抗体的杂交瘤，并进行克隆，以获得能产生单克隆抗体的均匀细胞群。
如在本文中所用到的，“片段”一词在用于表示rHuAFP多肽时，优选其至少有20个连续的氨基酸，优选至少有50个连续的氨基酸，更优选有至少约100个连续的氨基酸，最优选至少有约200-400或更多连续的氨基酸。可以用本领域技术人员所知的方法制备rHuAFP片段，例如，通过蛋白分解裂解或重组肽的表达来制备，或由普通蛋白加工(例如，从新生多肽上除去与生物学活性无关的氨基酸)来制备。
感兴趣的重组HuAFP片段包括，但不限于结构域I(氨基酸1(Thr)-197(Ser)，参见图1，序列6)；结构域II(氨基酸198(Ser)-389(Ser)，参见图1，序列7)，结构域III(氨基酸390(Gln)-590(Val)，参见图1，序列)；结构域I+II(氨基酸1(Thr)-389(Ser)；参见图1，序列9)；结构域II+III(氨基酸198(Ser)-590(Val)，参见图1，序列10)，和rHuAFP片段I(氨基酸266(Met)-590(Val)，参见图1，序列11)。用实验方法测定片段的活性，采用常规技术和分析方法，例如，本文所披露的方法。
本发明还包括完整长度rHuAFP或其片段的类似物。类似物可以因氨基酸序列差异或不影响其序列的修饰(例如，翻译后修饰)或同时因为以上两种原因而不同于rHuAFP。本发明的类似物与rHuAFP全部或部分氨基酸序列的同源性一般至少为80％，更优选85％，最优选90％或甚至99％。修饰(通常不改变其一级序列)包括多肽的体内成体外化学衍生化，例如，乙酰化或羧基化；这种修饰可以在多肽合成或加工期间进行，或在用单独的修饰酶进行处理之后。类似物也可以因一级序列的改变而不同于天然存在的rHuAFP，例如，用一种氨基酸取代另一种有类似特性氨基酸(例如，用缬氨酸取代甘氨酸，用精氨酸取代赖氨酸等)或进行不丧失该多肽的生物学活性的一个或几个非保守氨基酸的置换、缺失或插入。其中包括天然的和诱导的遗传变体[例如通过辐射或乙磺酸甲酯处理进行随机诱变或用Sambrook等所披露的方法(“分子克隆：实验指南”(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，2nd ed.Cold Spring Harbor Press，1989，或Ausubel等，同上)]进行位点特异性诱变，还包括环化肽分子和含有L-氨基酸以外残基的类似物，例如，D-氨基酸或非天然存在的或合成氨基酸，例如，β或γ氨基酸，或带有非天然侧链的L-氨基酸(例如，参见Noren等，“科学”(Science)244：182，1989)。例如，Ellman等披露了(见“科学”(Science)255；197，1992)将非天然氨基酸掺入蛋白质的蛋白主链的位点特异性掺入方法。还包括化学合成的多肽或具有修饰肽键(例如，在美国专利4,897,445和美国专利5,059,653中所披露的非肽键)或修饰侧链的肽，以获得本文所述的理想药物特性。采用常规方法，例如本文所披露的方法鉴定有用的突变体和类似物。将重组HuAFP作为免疫抑制剂
用任何标准方法分析体内或体外免疫调节活性，以测定rHuAFP(或其片段或类似物)的免疫抑制作用。如下文所述，本领域提供了若干用于体内检验rHuAFP(或其片段或类似物)对自身免疫病，例如，非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的免疫抑制特征的动物系统。另外，还有多种可用于检验rHuAFP的免疫抑制特征的体外系统，例如，一种这样的体外分析方法可以测定在自体混合淋巴细胞反应(AMLR)中对自身抗原诱导的T细胞增殖的抑制作用。
以下的实施例证实，非糖基化的rHuAFP和rHuAFP片段能抑制T细胞效应于自身抗原的自动增殖。这些实施例的用意在于说明，而不是限制本发明。
实施例材料和方法
凝胶电泳、免疫印迹和纯化
用标准方法通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和非变性碱性PAGE(APAGE)测定rHuAFP的纯度和特征。随后对凝胶进行以下分析：或通过考马斯亮蓝染色，或通过电泳将分离的多肽转移到Immobilon膜(Millipore，Mississauga，ON)上进行免疫印迹分析。用碱性磷酸酶缀合的羊抗兔IgG鉴定重组HuAFP非特异性兔抗天然HuAFP多克隆抗体复合体，并按照生产商的说明书，用BCIP/NBT显色溶液(BioRad Laboratories Mississange，ON)检测免疫反应带。
按标准方法进行柱层析。
rHuAFP片段的聚合酶链式反应(PCR)
用分子生物学技术领域技术人员公知的PCR技术制备编码人甲胎蛋白片段的质粒结构，使用被设计用于扩增人甲胎蛋白的基因特定部分的寡核苷酸引物[例如，参见“PCR技术”(PCR Technology)，H.A.Erlich，著，StochtonPress，New York，1989；“PCR方案：方法和应用指南”(PCR Protocols：AGuide to Methods and Applications)，M.A，Innis，David H.Gelfand，JohnJ.Sninsky，和Thomas J.White著，Academic Press，Inc.，New York，1990，和Ausubel等，同上]。
制备以下6种rHuAFP片段，测定其生物学活性(例如，用本文所披露的方法)：
结构域I         氨基酸1(Thr)-197(Ser)，(图1，序列6)
结构域II        氨基酸198(Ser)-389(Ser)，(图1，序列7)
结构域III       氨基酸390(Gln)-590(Val)，(图1，序列8)
结构域I+II      氨基酸1(THr)-389(Ser)，(图1，序列9)
结构域II+III    氨基酸198(Ser)-590(Val)，(图1，序列10)
rHuAFP片段I     氨基酸266(Met)-590(Val)，(图1，序列11)
氨基酸序列是根据所示人甲胎蛋白(1(Thr)-590(Val)；图1中序列5)的序列推定的。被命名为结构域I、结构域II、结构域III、结构域I+II、结构域II+III和rHuAFP片段I的rHuAFP的片段是用标准的PCR反应条件合成的，在100μL反应混合物中含有34μL H2O、10μL 10×反应缓冲液、20μL 1mMdNTP、2μL DNA模板(克隆在pI18上的HuAFP)、适量的5′和3′寡核苷酸引物(10μL 10pmol/μ L5′引物，10μL 10pmol/μL3′引物)、1μL甘油、10μL二甲基亚砜(DMSO)和1μL Pfu聚合酶(Stratagene，LaJolla，CA)。用于PCR扩增的引物为：
结构域I25       5’-AAAAAAGGTACCACACTGCATAGAAATGAA-3’   (序列：14)
结构域I3        5’-AAAAAAGGATCCTTAGCTTTCTCTTAATTCTIT-3’ (序列：15)
结构域II5       5’-AAAAAAATCGATATGAGCTTGTTAAATCAACAT-3’ (序列：16)
结构域II3       5’-AAAAAAGGATCCTTAGCTCTCCTGGATGTATIT-3’(序列：16)
结构域III5      5’-AAAAAAATCGATATGCAAGCATTGGCAAAGCGA-3’(序列：16)
结构域III3      5-AAAAAAGGATCCTTAAACTCCCAAAGCAGCACG-3’  (序列：17)
5’rHuAFP片段I  5’-AAAAAAATCGATATGTCCTACATATGTICTCAA-3’(序列：18)
因此，可将引物对DomI25和DomI3、DomII5和DomII3、DomIII5和DomIII3、5′rHuAFP片段I和DomIII3、DomI25和DomII3、以及DomII5和DomIII3分别用于提取rHuAFP的结构域I、结构域II、结构域III、rHuAFP片段I、结构域I+II、以及结构域II+III的cDNA序列。退火、延伸和变性温度分别为50℃、72℃和94℃，进行30次循环。用标准方法纯化PCR产物。纯化编码结构域I和结构域I+II的PCR产物单独用KpnI和BamHI消化，并分别克隆到KpnI/BamHI处理过的pTrp4上。编码结构域II、结构域III、结构域II+III和rHuAFP片段I的纯化PCR产物分别用Bsp106I和BamHI消化，并分别克隆到Bsp106I/BamHI处理过的pTrp4上。随后将每种质粒结构转入感受态大肠杆菌细胞里。由于表达产物始于由翻译起始信号蛋氨酸编码的氨基酸序列，预计该信号将被除去，或在任何情况下都不会影响最终表达产物的生物活性。
自体混合淋巴细胞反应(AMLR)
提取人外周血单核细胞(PBMC)，用标准方法将其分级分离成非T细胞群和AMLR。通过让1.5×108PMBC从市售Ig-抗-Ig亲和柱(BiotekLaboratories)上通过来分离效应T细胞，随后将2×105效应细胞与来自单一供体的自身137Cs-辐射的(2500拉德)非T刺激细胞一起培养。所用的培养基为补充了20mM HEPES(Gibco)、5×10-5M2-巯基乙醇(BDH、Montreal，QC)、4mML-谷氨酰胺(Gibco)、100μ/ml青霉素(Gibco)和100μg/ml硫酸链酶素的RPMI-1640，在用于AMLR时再加入10％效应T细胞供体的自体新鲜人血清。在开始培养时加入各种浓度的纯化rHuAFP、人血清白蛋白(HSA)、抗HuAFP单克隆抗体Clone#164(在培养物中的终浓度为125μg/ml)(Leinco Tcchnologies St.Louis，MO)。将AMLR培养物在37℃下于95空气和5％CO2中培养4-7天。以指明的间隔，通过用1μCi3H-胸苷(比活性为56-80Ci/mmole，ICN)进行6小时脉冲，测定DNA合成。在一个多样品收集器(Skatron，Sterling，VA)上收集培养物，并在一台Packard 2500 TR液体闪烁计数器上测定3H-TdR的掺入。所给出的结果为平均cpm±3个或4个重复培养的平均值的标准误差。
外周血淋巴细胞(PBL)测定
以1∶1的比例用PBS稀释肝素化来自正常人体的血液，通过在Ficoll-Hypaque(Sigma，St.louis，MO)上进行密度离心从红血细胞中分离人外周血淋巴细胞(PBL)。至少用PBS将其洗3次，并通过台盼蓝排斥法鉴定细胞活性。用标准方法培养人PBL(2.5×105细胞)。以平均Cpm胸苷掺入量±3次重复培养的SEM来表示结果。
             结果
表达和纯化
分解在图1A-1B中所示出的考马斯壳蓝染色的APAGE和SDS-PAGE的单一带证实了所分离的在大肠杆菌中表达的rHuAFP的纯度。源于大肠杆菌的可溶性单体rHuAFP是通用Q-Sepharose层析洗脱含HuAFP的蛋白级分而得到的。通过FPLC Mono-Q阴离子交换，用220-230mM NaCl从每升细菌培养物中回故到约1mg纯rHuAFP，其为单一的均匀峰，其在SDS-PAGE的迁移量约为65KD(1B)，在SDS-PAGE上，重组HuAFP的分子量比天然HuAFP的低，因为原核表达系统缺乏蛋白糖基化所需的酶促机制。在FPLC和HPLC上对纯的rHuAFP样品进行再层析，得到图1C和1D所示的单一峰，证实了该rHuAFP的纯度。另外，N-末端测序资料与预期的rHuAFP的N-末端氨基酸序列一致。
另外，按上述方法培养含有编码rHuAFP的表达质粒的大肠杆菌。图2(泳道D)中示纯化rHuAFP片段1的特征。N-末端氨基酸序列分析表明，rHuAFP片段I具有的氨基酸序列为：Ser267-Tyr-Ile-Cys-Ser-Gln-Gln-Asp-Thr275(序列13)，该序列与预期的rHuAFP片段I的N-末端氨基酸序列(参见图1，序列11)一致，其中，开头的蛋氨酸在细胞内部切除。
自体混合淋巴细胞反应(AMLR)的抑制
根据其抑制人自体混合淋巴细胞反应(AMLR)的能力测定rHuAFP的免疫抑制活性。如图8A所示，通过在4-7天时间内测定自身增殖，测定rHuAFP对由自身非T细胞刺激的自身反应淋巴细胞增殖效应的抑制。如图8B所示，由在T细胞自身增殖峰处进行的剂量效应研究所得到的结果证实，在培养开始时加入rHuAFP可以与剂量有关的方式抑制AMLR。另外，平行活性研究证实，rHuAFP对人自身反应T细胞的抑制活性不是由于非特异性细胞毒性作用。
为了进一步证实rHuAFP是决定自身增殖T细胞的抑制作用的抑制剂，用市售鼠抗人AFP单克隆抗体(MAb)阻止rHuAFP介导的AMLR的抑制作用。如图5所示，抗HuAFP MAb可以完全阻止100μg/ml对增殖的自身反应T细胞的抑制作用。加入100μg/ml HSA不会破坏AMLR效应，在反应培养物中仅有MAb也没有任何作用。
在原核表达系统中产生的重组多肽在从细胞中提取时有被宿主细胞脂多糖(LPS)污染的危险。业已证实，少量的LPS可以拮抗细胞因子的生物活性，从而破坏巨噬细胞的免疫反应。因此，内毒素对各种rHuAFP制剂的影响是这样测定的：用从Detoxi-gel(pierce)上通过而除尽了内毒素的重组蛋白和未处理过的rHuAFP进行AMLR实验。以上实验表明，两种制剂具有相同水平的免疫抑制活性。
如图8A和8B所示，这一研究的结果还表明，rHuAFP能以与糖基化rHuAFP相同的效力抑制自身反应T细胞的增殖，在体外反应中对自身增殖的T细胞产生抑制作用，当rHuAFP的浓度在5μg/ml-100μg/ml范围内时有很明显的抑制作用。另外，如表1和图3所示，在144小时时rHuAFP片段I能抑制由自身非T细胞刺激的自身反应淋巴细胞的增殖效应。而且，如图3所示，结构域I和III也能抑制AMLR。
表1
反应方案 胸苷掺入量(CPM)
T细胞 7118±964
AMLR 83103±6480
AMLR+rHuAFP片段I(100μg/ml) 29692±2963
外周血淋巴细胞反应(PBL)的抑制
还检验了100μg/ml rHuAFP片段I、和由大肠杆菌和杆状病毒产生的rHuAFP(如下文所述)的免疫抑制活性，来检验抑制人外周血淋巴细胞反应(PBL)的能力。如表II所示，由大肠杆菌和杆状病毒产生的rHuAFP和片段I(按上述方法生产)被证实能抑制ConA刺激的人外周血淋巴细胞的增殖效应。
表II
3H-胸苷掺入量(CPM±SE)
无蛋白 102,353±5,566 91,502±4,333 99,700±4,464
100μg/ml人白蛋白 89,860±5,800 82,924±11,085 94,123±1,633
100μg/ml大肠杆菌rHuAFP  33,641±3,893 - -
100μg/ml杆状病毒rHuAFP - 31,331±6,303 -
100μg/ml片段I - - 39,019±161
自身免疫病
如上文所述，自身免疫病的特点是丧失对自身抗原的耐受性，导致诸如T或B细胞(或两者)的免疫系统细胞与自身的组织抗原反应。自身免疫病涉及所有器官系统，不过某些器官比另一些器官更易受影响。受自身受免症状影响的组织的例子有：多发性硬化患者脑和脊髓的白质；类风湿关节炎患者关节的衬里；和胰岛素依赖型糖尿病患者的胰腺上的分泌胰岛素的β岛细胞。其它形式的自身免疫病能破坏重症肌无力患者的神经与肌肉之间的连接或破坏系统性红斑狼疮患者的肾脏及其它器官。其它自身免疫病的例子包括，但不限于Addison′s病、节段性回肠炎、Grrave′s病、牛皮癣、硬皮病、和溃疡性结肠炎。
本领域提供了多种用于试验治疗与自身免疫病有关的人体疾病的转基因和非转基因的实验动物系统[例如，参见Panl，W.E.，“基础免疫学”Fundamental Immunology)，2nd ed，Raven Press，New York，1989；和Kandel等，“神经科学方法”(Principles of Neural Science)，3rd ed.，Appleton和Lange，Novwalk，CT，1991；以及“当今免疫学方案”(Current Protocols In Immunology)，Coligan，J.E.，Kruisbeek，A.M.，Margulies，D.H.Sherach E.M.，和Strober著，Green Publishing Associates(John Wiley&Sons)。New York 1992]。上述实验结果证实了非糖基化rHuAFP的免疫抑制活性，有理由认为服用这种在原核系统中产生的rHuAFP(或其片段或类似物)可以治疗其它自身免疫病。因此，本发明提供了将rHuAFP(或其片段或类似物)用于治疗(即预防，或抑制，或改善，或促进缓解)一切自身免疫病的用途。
以下是可用于测定重组人甲胎蛋白或其免疫细胞抗增殖片段或类似物在治疗自身免疫病方面的效力的动物系统的例子。这些例子是用于说明本发明的，而不是要限定本发明。
多发性硬化
多发性硬化(MS)是一种涉及中枢神经系统的白质的分散部分的脱髓鞘病。在MS中，髓鞘碱性蛋白和蛋白脂质蛋白是其它免疫系统成分中涉及T淋巴细胞的自身免疫反应的主要目标。神经细胞髓鞘的丧失(脱髓鞘)，会导致神经病学症状，并最终导致昏迷或瘫痪。
实验自身免疫脑脊髓炎(EAE)是本领域用于检验和测定治疗MS的治疗剂的效果的主要模型。EAE是通过对中枢神经系统免疫而在实验动物中诱发的炎性自身免疫脱髓鞘病。当给动物(如小鼠、大鼠、肠鼠、兔、猴等)注射诸如弗氏完全佐剂加髓鞘碱性蛋白或蛋白脂质蛋白之类的左剂时，可诱发EAE，其在病理学上类似MS[例如，参见Alvord等，“实验自身免疫脑脊髓炎-一种有用的用于多发性硬化的模型”(Experimental Allergie Enceph-alomyelitis-A Useful Model for Multiple Sclerosis)，Liss，New York，1984；Swanberg，“酶学方法”(Meth.Enzymol.)162：413，1988；和McCarron等)“免疫学杂志”J.Immunol.)，147：3296，199l]。
为了检验rHuAFP或其片段或类似物，在合适的实验动物上诱发EAE，例如，用本领域已知方法在小鼠或兔上诱发EAE。为了评价某种化合物对EAE的免疫抑制效果，即其预防或改善EAE的能力，用诸如静脉内或肠膜内注射的标准方法以适当剂量每天给药所述化合物。一般，给药是在诱发EAE之前和/或出现EAE临床症状之后开始。对照对物接受诸如人血清白蛋白之类的安慰剂，以类似于给药rHuAFP或相关分子的方式给药安慰剂。根据任何标准方法检测试验分子对EAE的影响。例如，每天监测EAE诱发动物的重量减少和肌肉瘫痪。如果需要，对脑和脊髓组织进行组织学检测[例如，用任何标准组织化学或免疫组织化学方法，例如参见Ausubel等，“现代分子生物学方案”(Current Protocols In Molecular Biology)，Greene PublishingAssociates(John Wiley&Son)，New York，1994；Bancroft和Stevens，“组织化学技术的理论和实践”(Theory and Practice of Histochemical Techniques)，Churchill Livingstone，1982]，并对组织样品进行显微镜检查，寻找EAE的证据，例如血管周细胞渗液的证据。处理过的动物和对照动物之间的对比研究用于确定试验分子在预防或改善EAE方面的相对效力。能预防或改善(减轻，或抑制，或缓解，或减弱)EAE的症状的分子被视为可用于本发明。
类风湿关节炎
类风湿关节炎(RA)是一种慢性病，这种病会使多种关节的滑膜发炎，造成对软骨和骨的损伤。RA与人淋巴抗原(HLA)-DR4相关，并被视为一种涉及T细胞的自身免疫病，例如，参见Sewell等，“柳叶刀”(Lancet)341：283，1993。RA是因滑膜细胞与各种细胞因子(及其可溶性产物)的相互作用所致，所述细胞因子是从循环系统渗入关节的滑膜衬里。所发生的一系列生物学事件最终导致侵入和侵蚀关节的胶原和软骨基质的损害作用。
若干AR动物模型，例如MRL-lpr/lpr小鼠在本领域中是众所周知的，这些模型能产生类似人类疾病的关节炎症状(例如，参见“基础免疫学”(Fundamental Immunology)同上)。另外可以用标准方法在合适的动物上诱发自身免疫胶原关节炎(ACA)和佐剂关节炎(AA)(adjuvant arthritis)。
为了测定rHuAFP或其片段或类似物对RA的免疫抑制，即该化合物预防或改善RA的能力，用标准方法给MRL-lpr/lpr小鼠服用试验分子，所述方法如静脉内或腹膜内注射，以合适的剂量每日给药。一般，给药是在RA发作之前和/或出现RA临床症状之后开始。对照动物接受安慰剂，例如，人血清白蛋白，以与给药rHuAFP或相关分子类似的方法给药安慰剂。用标准方法监测试验分子对RA的影响。例如，通过每日监测对滑膜关节的细胞成分的分析结果。如果需要，可以对滑膜关节进行组织学检测(例如，采用任何标准的组织化学或免疫组织化学方法，例如，参见Ausubel等，同上；Bancroft和Stevens，同上)，并对组织样品进行显微镜检验，以寻找RA的证据，例如，关节中胶原和软骨基质侵蚀的证据。处理过的动物与对照动物之间的比较研究被用于测定试验分子在预防或改善RA方面的相对效力。能预防或改善(减轻，或抑制，或缓解，或促进减弱)RA症状的试验分子被视为可用于本发明。
重症肌无力
重症肌无力(MG)是一种神经肌肉传递疾病，这种病会产生抗神经肌肉接头的乙酰胆碱受体的自身抗体。抗体侵害所述接头，导致虚弱和瘫痪。女性的发病率为男性的2倍，通常在30岁左右发病。这种病的主要特点为肌无力。临床症状包括眼睑下垂和双视象。MG与甲状腺机能亢进相关。
业已研究了包括兔、猴、Lewis大鼠和小鼠自交品系在内的多种动物的实验自身免疫MG(EAMG)，EAMG的症状类似于人类疾病的基本特征。[例如参见：“神经科学方法”(Principles of Neutral Science)，同上]。与佐剂一起注射一次乙酰胆碱受体，例如，从鳗(Torpedo californica)的电器管中纯化的受体，在8-12天内会引起急性无力症状，然后在30天左右后出现慢性无力症状。对鳗受体的反应是T细胞决定型的。C57BL/6品系(H-2B)是Torpedo受体的高效应体，而且高度易感EAMG。
为了检验RhuAFP或其片段或类似物，用本领域公知的方法在诸如C57BL/6品系(H-2B)小鼠的合适实验动物上诱发EAMG。为了检验某种化合物对EAMG的免疫抑制效果，即预防或改善EAMG的能力，用标准方法给药该化合物，例如，以静脉内或腹膜内注射的形式以适当剂量每日给药。一般，给药是在诱发EAMG之前和/或出现EAMG临床症状之后开始。对照动物接受安慰剂，如人血清白蛋白，以与给药rHuAFP或相关分子类似的方式给药安慰剂。用标准方法监测试验分子对EAMG的作用。例如，可以对EAMG诱发的动物的肌电图分析中进行神经刺激分析(例如，用Pachner等披露的方法，“神经病学纪事”(Ann.Neurol.)11：48，1982)。如果需要，可以对组织样品进行组织学检验(例如，用任何标准的组织化学或免疫组织化学方法，例如，参见Ausubel等，同上；Bancroft和Stevens，同上)，并对组织样品进行显微镜查检，以发现EAMG的证据，例如，单核细胞渗入和/或自身抗体定位于神经肌肉接头的乙酰胆碱受体的证据。处理过的动物和对照动物之间的对比研究被用于测定试验分子在预防或改善EAMG方面的相对效力。能预防或改善(减轻，或抑制，或缓解，或促进减弱)EAMG症状的分子被视为可用于本发明。
胰岛素依赖性糖尿病
糖尿病是一种葡萄糖代谢疾病。胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)又被称作I型糖尿病，它是一种自身免疫病，其特征是由T细胞介导的朗氏岛上的胰腺β细胞的破坏，伴随着由多种自身肽引起的免疫反应，导致高血糖及其它病理学症状。IDDM患者依靠外源胰岛素维持正常的葡萄糖代谢。可以在高血糖发作之前根据抗胰岛素、岛细胞、谷氨酸羧化酶及其它自身蛋白的异常出现确定有发生IDDM危险的人体(例如，参见，Baekkeskov等，“临床研究杂志”(J.Clin.lnvest.)79：926，1987；Dean等，“糖尿病学”(Diabetologia)29：339，1986；Rossini等，“免疫学年评”(Annu.Rev.Immunol.)3：289，1985；Srikanta等，“新英格兰医学杂志”(N.Engl.J.Med.)308：322，1983)。一般自身抗体的类型可以预示最终的疾病发展和/或发病的危险(例如，参见Keller等，“柳叶刀”(Lancet)341：927，1993)。
能自发发生类似于人体疾病的动物模型的例子包括Bio-Breeding(BB)大鼠和非肥胖糖尿病(NOD)小鼠。糖尿病也可以用链脲霉素(streptozotocin)通过实验方法诱发。
BB大鼠能自发发生类似于IDDM的疾病，伴有胰岛炎(单核细胞渗入胰岛)和抗自身细胞和胰岛素(例如，参见Baekkeskov等，“临床研究杂志”(J.Clin.Invest.)79：926，1987；Rossini等，同上；Nakhooda等)“糖尿病”(Diabetes)26：100，1977，Dean等，“临床实验免疫学”(Clin.Exp.Immunol.)69：308，1 987)。
NOD小鼠通常在5-8周龄时发生胰岛炎，在7月龄时有70％的雌性、40％的雄性变得患糖尿病。将糖尿病小鼠的T细胞转移到初生非糖尿病NOD小鼠体内在2-3周内可诱发糖尿病(例如，参见Bendelac等，“实验医学杂志”(J.Exp.Med.)166：823，1987)。NOD小鼠在发生糖尿病后通常在1-2月内死亡，除非接受胰岛素治疗。
通过多次小剂量注射链脲霉素可以以化学方法诱发糖尿病，链脲霉素对胰腺β细胞有毒性，它可以导致严重的胰岛炎和糖尿病(例如，参见Kikutani等，“免疫学进展”(Adv.Immunol.)51：285，1992)。
因此，本领域提供了多种模拟人IDDM的动物模型，可将这些动物模型用于检验和试验用于预防或改善糖尿病的方法，这些方法涉及rHuAFP(或其片段或类似物)。
为了测定rHuAFP或其片段或类似物对糖尿病小鼠的发病的免疫抑制效果，即该化合物治疗或预防胰岛炎和糖尿病的能力，用诸如静脉内或腹膜内注射的标准方法以适当剂量每天给合适的试验动物给药适当的试验化合物。一般，给药是在胰岛炎和糖尿病发作之前和/或在出现糖尿病临床症状之后进行。对照动物接受安慰剂，如人血清蛋白，以与给药rHuAFP或相关分子类似的方式给药安慰剂。用标准方法监测试验分子对胰岛炎和糖尿病的影响。例如，每日监测体重下降、酮体形成和血糖浓度。如果需要，可以对胰岛细胞进行组织学检查(例如，用任何标准的组织化学或免疫化学方法，例如，参见Ausubel等，同上；Bancroft和Stevens，同上)，并对组织样品进行显微镜检，以寻找胰岛炎和β细胞损害的证据。处理过的动物和对照动物之间的对比研究可用于测定试验分子在预防或改善糖尿病症状方面的相对效果。能预防或改善(减轻，或抑制，或缓解，或促进减弱)糖尿病，，如IDDM症状的分子被视为可用于本发明。
系统性红斑狼疮
系统性红斑狼疮(SLE)是一种严重的系统性自身免疫病。这种病的患者约有90％为年轻女性。这种显著的女性优势在青春期之前和绝经之后并不存在。这种病通常始于成年初期，发病时在患者的颧骨和前额出现特有的皮疹。脱发是常见的，还会出现严重的肾脏损害、关节炎、在心脏周围积液、和肺部衬里的发炎。有接近半数的患者的脑血管也会发炎，导致瘫痪和惊厥。这种病的作用与其它自身免疫病一样，会产生波动：长时期的健康良好的静态期可能突然终止并莫名其妙的重新发病。已知在SLE中有大量不同的自身抗体，例如，抗DNA、RNA和组蛋白的自身抗体(例如，参见“基础免疫学”(Fundamental Immunolgy)，同上)。
若干种人类SLE的动物模型在本领域中是公知的，例如，自交小鼠品系，包括NIB小鼠及其F1杂种、MRL小鼠和BXSB小鼠(例如，参见Bielschowsky等，“Otago大学药学院院刊”(Proc.Univ.Otago Med.Sch.)37：9，1959；Braverman等，“皮肤学研究杂志”(J.Invest.Derm.)50：483，1968；Howie等，“免疫学进展”(Adv.Immunol.)9：215，1968；“自身免疫病的遗传控制控制”(Genetic Contral of Autoimmune Diease)，Rose，M.Bigazzi，P.E.，和Warner，N.L著，Elsevier，Amsterdam，1979；和“现代免疫学方案”(Current Protocols In Immunology)，同上)。例如，NZB×NZW F1小鼠是一种极好的人类SLE模型，雌性小鼠会产生大量抗双链和抗单链DNA自身抗体，其它抗核抗体和患肾病；通常在约8个月时出现死亡(例如，参见Theofilopoulos等，“免疫学进展”Adv.Immunol.)37：269，1985)。
为了测定rHuAFP或其片段或类似物对SLE的免疫抑制作用，即化合物rHuAFP预防或改善SLE的能力，用诸如静脉内注射或腹膜内注射的标准方法以适当剂量每天给合适的诸如NZB×NZW F1小鼠的动物给药试验化合物。一般，给药是在SLE发作之前和/或出现SLE临床症状之后开始。对照动物接受安慰剂，例如，人血清蛋白，以与给药rHuAFP或相关分子类似的方式给药安慰剂。用标准方法监测所述试验化合物对SLE的影响。例如，可以监测对诸如抗DNA抗体的自身抗体的分析。如果需要，可以对肾组织进行组织学检查(例如，用任何标准组织化学或免疫组织化学方法，例如，参见Ausubel等，同上；Bancroft和Stevens，同上)，并对组织样品进行显微镜检，以寻找SLE的证据，例如，狼疮肾炎的证据。处理过的动物和对照动物之间的比较研究可用于测定试验化合物在预防或改善SLE方面的相对效果。能预防或改善(减弱，或抑制，或缓解，或促进减轻)SLE症状的分子被视为可用于本发明。
治疗给药
如上所述，重组甲胎蛋白，如rHuAFP(或其片段或类似物)能有效抑制自身免疫细胞的增殖，因此，可被用于预防或改善自身免疫病，包括，但不限于多发性硬化、类风湿关节炎、糖尿病、系统性红斑狼疮和重症肌无力。因此，可以用已知方法配制重组人甲胎蛋白(或其片段或类似物)，以制备可以药用的组合物。
优选以能有效预防或改善自身免疫病症状的量给该病的患者给药重组甲胎蛋白，如rHuAFP(或其片段或类似物)。一般，以0.1ng/kg体重-10g/kg体重的剂量为宜。如果需要，可以每天给药的方式进行。因为没有已知和重组人甲胎蛋白有关的有害副作用，因此，据认为可以安全地以较高剂量给药。例如，可以用包含于生理上可以接受的载体中的治疗有效量的rHuAFP(或其片段或类似物)治疗人类患者。合适的载体及其配方由E.WMartin披露于Remington＇s药学(Pharmaceutical Sciences)中。rHuAFP的给药量因给药方式、患者的年龄和体重、患病类型和易感病或正在患病的患者的体型不同而不同。例如，优选的给药方式包括皮下、静脉内、肌内或真皮内注射，这些方法可以持续维持患者体内的药物水平。在其它优选给药方式中，可以通过注射或植入缓释制剂的方式给患者给药rHuAFP，例如，所述rHuAFP为缓慢解离的聚合或结晶形式；在这类持续给药之前，可以用更常的方式(如上述方式)进行最初的给药。另外，可以用灌输泵(例如，外置的或可植入的灌输泵)给药rHuAFP，以便能够精确控制药物释放速度，或以类似于用于促进胰岛素吸入的方式将rHuAFP植入鼻道。作为经鼻粘膜吸收的一种替代方式，可将rHuAFP以粉状物的气溶胶沉淀或溶液形式输入肺部。
另外，本发明的方法还可以采用组合治疗形式，其中，rHuAFP与诸如普通或特殊耐受剂的治疗剂同时或依次服用，例如，所述治疗剂为抗独特型剂(如单克隆抗体)或治疗疫苗或口服剂(如胰岛素、胶原或髓鞘碱性蛋白)或细胞因子(如I1-15)或干扰素(α-干扰素)或免疫抑制剂。优选以有效剂量给药免疫抑制剂，该剂量低于单独使用该免疫抑制剂时的剂量。优选的免疫抑制剂为环孢菌素、FK-506、类固醇、硫唑嘌呤、或15-脱氧精胍菌素。
治疗一般始台于诊断或怀疑患上自身免疫病时，并且一般每天重复治疗。在发病之前给药rHuAFP可以防止或预防自身免疫病的发生(或发展或恶化)。如果需要，可以用监测或诊断患者自身免疫病的方法对治疗或预防方案的效果进行检验。将重组人AFP用于治疗或诊断癌症
细胞毒性剂
通过用常规技术将全长rHuAFP或其片段或类似物同任何数量的已知毒性剂缀合制备rHuAFP的杂合细胞毒素。这些毒素可用于抑制肿瘤的发生(如下文所述)。有用的细胞毒素优选是仅在存在于细胞内时才有明显的细胞毒性，而且基本上被排除在缺乏靶结构域的特定细胞之外。如上所述，肽毒素满足以上标准并且能方便的结合到杂合分子上。如果需要也可以使用混合的细胞毒素(即由两种或两种以上的毒素的全部或部分组成的细胞毒素)。下面将对几种有用的毒素作更详细地说明。
用于本发明方法的毒素分子优选是诸如肽毒素的毒素，这种毒素只有在出现于细胞内时才有明显的细胞毒性。当然，在这种情况下，所述毒素分子必需能够进入带有靶受体的细胞。这种能力取决于分子的性质和细胞受体的性质。例如，可使自然地摄取配体的细胞受体似乎能够为包括有毒素的分子提供进入带有所述受体的细胞的手段。如下文所述，可用于本发明方法的肽毒素是通过产生一种编码一种杂合蛋白的分子而同rHuAFP(或其片段或类似物)结合域融合。
很多肽毒素具有通用的真核受体结合域；在这种情况下，必须对所述毒素进行修饰以防止带有非受体细胞中毒。任何所述修饰都必需以能保留该分子的细胞毒性功能的形式进行[参见“美国卫生和人类服务部，美国流水号401.412”(U.S.Department of Health and Human Service，U.S. SerialNo.401.41 2)]。潜在的有用毒素包括，但不限于：霍乱毒素、蓖麻毒蛋白、O-志贺样毒素(SLT-I、 SLT-II、 SLTIIv)、LT毒素、C3毒素、志贺毒素、百日咳毒素、破伤风毒素、假单孢杆菌属外毒素、皂草素、modeccin和gelanin。
如果需要，可用于本发明的某些分子的细胞毒性部分可以由混合毒素分子提供。混合毒素分子是源于两种不同多肽毒素的分子。一般，如上所述，除了决定通用的真核细胞结合的结构域外，多肽毒素还有一个酶促活性结构域和一个转运结构域。该结合结构域和转运结构域分别为细胞识别和毒素进入所必需。一旦毒素分子进入细胞，由所述酶促活性结构域决定细胞毒性活性。
已知具有转运结构域的天然蛋白包括白喉毒素、假单孢杆菌属外毒素A及其它可能的肽毒素。对白喉毒素和假单孢杆菌属外毒素A的转运结构域的特征已有充分说明[例如，参见Hoch等，“美国国家科学院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82：1692，1985；Colombatti等，“生物化学杂志”(J.Biol.Chem.)261；3030，1986；和Deleers等，“欧洲生物化学学会联合会通讯”(FEBS Lett.)160：82，1983]，并且，可以用Hwang等(“细胞”(Cell)48：129，1987)和Gray等(“美国国家科学院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81：2645，1984)所采用的方法测定这种结构域在其它分子上的存在和位置。
例如，一种有用的rHuAFP/混合毒素杂合分子是通过将大肠杆菌志贺样毒素的酶促活性A亚基(例如，参见Calderwood等，“美国国家科学院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)84：4364，1987)同白喉毒素的转运结构域(氨基酸残基202-460)和rHuAFP融合而形成的。这种有3部分的杂合体的rHuAFP部分使该分子能够特异结合带有可由rHuAFP识别的受体的细胞，而白喉毒素转运部分的作用是将志贺样毒素的酶促活性A亚基插入靶细胞内。志贺样毒素的酶促活性部分与白喉毒素一样作用于细胞的蛋白合成机构，以阻止蛋白合成，从而杀死该细胞。
本发明杂合细胞毒素的官能部分通过非共价键或共价键或同时由二者连接在一起。非共价的相互作用可以是离子型、疏水型或亲水型的，这种相互作用涉及亮氨酸-拉链相互作用或抗体-蛋白G相互作用(例如，参见Denick等，“自然”(Nature)359：752，1992)。共价连接的一个例子是二硫键。
杂合细胞毒素是通过用化学方法将rHuAFP(或片段或类似物)和任何数量的已知毒性部分，如上文所述毒性成分缀合而制成的。该反应是用本领域技术人员公知的标准技术进行的。将一种蛋白和一种蛋白毒素(例如，包括细菌毒素，如白喉毒素或假单孢杆菌属外毒素A，或植物毒素，如蓖麻毒蛋白)缀合的常用方法是通过一个二硫键的交联作用实现的(例如，参见Chang等，“生物化学杂志”(J.Biol.Chem.)252：1515，1977)或通过异基双功能分子实现(例如，参见Cawley等，“细胞”(Cell)，22：563，1980)。此可参见Stevens等，美国专利No.4,894,227。
另外，所述杂合细胞毒素是通过用本领域普通技术人员了解的技术[例如，参见Murphy，美国专利No4,675,382，和Chadhary等，“美国国家科学院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)844538,1 987]表达用工程方法产生的编码rHuAFP(或其片段或类似物)和毒素(或其毒性部分)的杂合DNA而制成的。例如，用本领域公知方法(例如，参见Murphy，同上，和Huston等，“酶学方法”(Meth.Enzymol.)203：46，1991)制备rHuAFP和细胞毒性剂的重组融合蛋白。如果杂合细胞毒素是通过表达一个融合基因而产生的话，由一个肽键在细胞毒性剂和靶配体之间起连接作用。可用于将一种蛋白或多肽和一种蛋白毒素缀合的方法采用了聚合物、单甲氧基聚乙二醇(mPEG)[如Maiti等所述，“国际癌症杂志副刊”(Int.J.Cancer Suppl.)3：17，1988]。
如果需要，在合成杂合细胞毒素后用标准方法对其进行亲和纯化，采用抗该分子的靶部分的抗体，例如，抗人甲胎蛋白的抗体。类似地，也可以通过标准的免疫技术用抗细胞毒性剂的抗体纯化杂合细胞毒素分子。然后将所得到的杂合细胞毒素配制成用作抗诸如癌细胞的有害细胞的制剂，采用药学领域的标准方法进行制备。
可以用本领域公知的分析方法，如在本文中所披露的方法筛选本发明分子降低带有靶受体的细胞的生活力的能力。
因为本发明的杂合细胞毒素是带有可由rHuAFP识别的受体的细胞的有效毒性剂，所以，可将rHuAFP用于治疗涉及有害的甲胎蛋白受体阳性细胞，如癌细胞的疾病。
诊断剂
可将重组rHuAFP或其片段或类似物与可检测的标记结合，制成可用于体内、原位或体外检测和定位肿瘤的制剂。用于将这种标记连接在蛋白上的方法为本领域所熟知。例如，可以用化学方法连接可检测的标记，但当标记是多肽时，也可以用遗传工程技术连接。
可检测的标记一般选自本领域已知的多种此类标记，但通常放射性同位素、荧光团、酶(例如，辣根过氧化物酶)、或其它能发射可检测的信号的部分或化合物(如放射性、荧光、颜色)或在该标记接触其底物后能发射可检测的信号的部分或化合物。各种可检测的标记/底物对(例如，辣根过氧化物酶/二氨基联苯胺、亲和素/链毒亲和素、荧光素酶/荧光素、β-半乳糖苷酶/X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-D吡喃半乳糖苷)及为这种检测目的而标记蛋白的方法在本领域中是公知的。可以用如下方法测定这种制剂的用途：例如，将诸如MCF-7的肿瘤细胞系植入诸如小鼠的宿主，并通过采用闪烁照像法的放射显象技术检测本发明的制剂是否已可检测地标记了由植入的细胞所产生的肿瘤。还可将这种制剂用于检测是否存在任何有害的带有甲胎蛋白受体的细胞，例如，采用Western印迹分析或用已知方法对组织样品进行组织化学染色。
重组HuAFP作为抗癌剂
本发明的抗癌剂(如rHuAFP或其片段或类似物；或rHuAFP的杂合细胞毒素)可用于抑制肿瘤，如乳腺癌或前列腺癌。本领域技术人员可以理解，任何用于体外和体内测定抗癌剂的效果的方法均可用于本发明。例如，在给药试验化合物之后监测长有前列腺癌(例如，LNCaP雄激素受体阳性人类前列腺癌细胞系的肿瘤异种移植)的小鼠或大小鼠的肿瘤生长的减少。在一个实施例中，通过胰蛋白酶消化将生长于培养物中的人类肿瘤细胞系[例如，诸如MCF-7(ATCCHTB 22)、T-47D(ATCC HTB 133)、MDA-MB-231(ATCC HTB 26)、BT-20(ATCC HTB 19)、NIH：OV-CAR-3(ATCCHTB 161)、Ln Cap.FGC(ATCC CRL 1740)和Du-145(ATCC HTB 81)从单层细胞中释出，稀释成单细胞悬浮液，并通过离心固化成沉淀，然后，在37℃下用15μl血纤蛋白原(50mg/ml)和10μl凝血酶(50单位/ml)处理30分钟。然后将含有肿瘤的血纤蛋白块切成直径约为1.5mm的小块。然后用标准方法将各肿瘤块植入小鼠的肾囊下面。如果需要，可以在即将植入肿瘤之前开始用常规方法每日皮下注射(S.C.)60mg/kg环孢菌素A(Sandimmune IV)对小鼠进行免疫抑制。如果需要，用标准方法对小鼠进行雌激素和雄激素补充，例如植入含有雌二醇的硅化橡胶管或注射丙酸睾酮。通常，激素补充始于肿瘤移植的当天。一般，试验分子的使用是在肿瘤移植之前和/或肿瘤移植之后开始。对照动物接受安慰剂，如人血清蛋白或稀释剂，以与给药rHuAFP或相关分子类似的方式给药安慰剂。用任何标准方法监测试验分子对肿瘤生长的影响。例如，通过剖腹术每周测定肿瘤大小的方式监测肿瘤的生长，采用装配有目镜测微尺的解剖显微镜。通过实验证明能够阻止或减弱或抑制这种移植的肿瘤生长的分子被认为可用于本发明。
可以用任何标准方法在体外测定试验化合物对带有可由rHuAFP识别的受体的细胞的毒性。例如，将培养的癌细胞系，如MCF-7雌激素受体-阳性人类乳腺癌细胞系维持在盛于塑料组织培养瓶(Costar)中的Dulbecco的改进Eagle培养基(DMEM)中，DMEM中含有青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)、5％胎牛血清、胰岛素(1 0ng/ml)、L-谷氨酰胺(2mM)和非必须氨基酸(1％)。以1×105/孔的浓度接种到96孔V形底的板上(Linbro-FlowLaboratoris，Mclean，VA)的完全培养基中。以各种浓度(10-12M-10-6M)加入推定的毒素，并在37℃下在5％CO2气体中将培养物培养18小时。培养之后，于170xg离心所述的板5分钟，除去培养基，并代之以100μl无亮氨酸的培养基(MEM，Gibco)，该培养基含有8μCi/ml(3H-亮氨酸；NewEngland Nuclear，Bostoa，MA)。在37℃下再培养90分钟，然后以170xg离心所述板5分钟，除去培养基，并用细胞收集器(Skatron，Sterling，VA)将细胞收集在玻璃纤维滤膜上。洗涤滤膜、干燥、并用标准方法计数。将仅用培养基培养的细胞作为对照。与未处理的对照细胞相比，对作为毒性指示的能减弱或阻止或抑制细胞生长的试验化合物进行测定，并被视为可用于本发明。
测定一种试验化合物是否能产生抗肿瘤(乳腺癌或前列腺癌)发生的保护作用的方法一般涉及使用一种已知能产生肿瘤的动物(例如，在美国专利No.4,736,866中所披露的转基因小鼠)。按标准方法用试验化合物处理合适的动物，并将检测到的与未处理的对照动物相比肿瘤发病的发病率的降低作为保护作用的指示。
如下文所述，本发明人已发现在原核表达系统中产生的非糖基化rHuAFP能有效治疗癌症。例如，业已发现rHuAFP是体外生长的乳腺癌的有效的抑制剂。
下面披露的实验例证实了rHuAFP作为抗癌剂的效力。这些实验例是用于说明本发明的，而不是要对本发明进行限定。
实施例材料和方法
培养基和肿瘤细胞
从GIBCO(BRL)购买Dulbecco＇s改进的Eagle′s培养基(DMEM)、RPMI1640、胎牛血清、谷氨酰胺、非必需氨基酸和青霉素-链毒素混合物。供体牛血清购自Hyclone，Logan，UT，而猪胰岛素购自Squibb，Inc.，Princeton，NJ。
MCF-7雌激素-受体-阳性人类乳腺癌细胞系由Institute ofExperimental Biology and Medicine，Buenos Aires，Argentina Alberto C.Baldi博士提供。母培养物维持于塑料组织培养烧瓶(Costar)中所盛的DMEM中，该DMEM含有青霉素(100u/ml)、链霉素(100μg/ml)、5％胎牛血清、胰岛素(10ng/ml)、L-谷氨酰胺(2mM)和非必需氨基酸(1％)。
雌激素刺激的MCF-7细胞在培养中的铺满后生长。
该试验基于以下发现：MCF-7细胞在含雌激素的培养基中生长经过铺满期，并聚积成集中点；但是，在缺乏雌激素的条件下，当培养物中形成细胞-细胞接触后细胞增殖终止，不能形成集中点(例如，参见Gierthy等，“乳腺癌的研究治疗”(Breast Cancer Res.Treat.)12：227，1988)。将1×107 MCF-7乳腺癌细胞接种到24-孔组织培养板的16mm孔中。培养基是无酚红的DMEM，其中补充了5％供体牛血清(预先筛选可检测雌激素的缺乏)、L-谷氨酰胺(2mM)、非必需氨基酸(1×，GIBCO)、胰岛素(10ng/ml)、青霉素-链霉素(1×，GIBCO)和终浓度稀释至1.8×10-9M的雌二醇。在24小时时向培养物中补充培养基，随后每4天补充一次，每次补充2ml含有rHuAFP和人血清白蛋白的培养基，使每孔的最终蛋白浓度为100μg/ml。细胞在5天内达到铺满，在10天内在仅含雌激素的孔内出现大量的集中点。用缓冲的福尔马林固定细胞并用1％罗丹明B染色。用一台Artek 870 Macro-MicroAutomated Colomy Counter对染色的集中点进行定量。所给出的数据为每个处理组的平均集中点的数目。结果
rHuAFP抗MCF-7乳腺癌细胞活性
图9所示结果表明，rHuAFP能抑制雌激素刺激的MCF-7乳腺癌细胞在体外的铺满后生长。采用人白蛋白或无蛋白的对照实验对MCF-7集中点的形成无影响。以上资料表明，rHuAFP对癌细胞培养物的生长有直接抑制作用。治疗给药
如上所述，rHuAFP能有效抑制肿瘤，例如，乳腺细胞癌。因此，可以用已知方法将本发明的化合物配制成可以药用的组合物。可以用包含于生理学上可以接受的载体中的治疗有效量的rHuAFP抗癌剂治疗人类患者。合适的载体及其配方由E.W.Martin披露于Remington′s“药学”(PharmaceuticalSciences)中。抗癌剂的给药量因给药方式、患者的年龄和体重、以及疾病的类型而不同。一般，其用量在用于治疗癌症的其它制剂的用量范围内，不过，在某些场合需要较低的用量，因为该化合物的特异性较高。例如，如下文所述，以能抑制恶性细胞增殖的剂量系统给药rHuAFP，剂量范围通常为0.1ng-10g/kg体重。
另外，本发明的方法也可以采用组合治疗，其中rHuAFP与化疗剂同时给药或依次给药。一般，用标准方法给药化疗剂，或者，以低于单用化疗剂的剂量使用化疗剂。化疗剂的例子包括，但不限于氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、六羟甲基三聚氰氨、硫化三磷、白消安、亚硝脲氮芥、罗氮芥、赛氮芥、链脲菌素、氮烯咪胺、氨甲蝶呤、氟尿嘧啶、阿糖胞苷、巯基嘌呤、硫代鸟嘌呤、戊抑制素、长春花碱、长春新碱、鬼臼乙叉苷、鬼臼毒素、放线菌素D、道诺霉素、阿霉素、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、顺铂、米托蒽醌、羟脲、盐酸甲基苄肼、邻氯苯对氯苯二氯乙烷、氨基苯乙哌啶酮、强的松、羟基孕酮、己烯雌酚、它莫西芬、氟硝丁酰胺、或促性腺激素释放激素类似物。
治疗一般自诊断出肿瘤或怀疑有肿瘤时开始，通常是每天重复用药。每天给药rHuAFP也能防止肿瘤的发生。如果需要，用监测或诊断患者是否患癌症的方法对治疗或保护方案的效果进行评价。
另外，本发明的化合物也可用于治疗哺乳动物，以杀死任何与病理学症状有关的、有害的、带有甲胎蛋白受体的细胞。本发明方法也可用于治疗非人类哺乳动物，例如，家畜或牲畜。如下文所述，本发明抗癌剂可以系统给药或局部给药。
系统给药
本发明的化合物在被用作抗癌剂时可以系统给药，例如，配制成药学上可以接受的缓冲液，如生理盐水。举例来说，给药的优选方法包括皮下、静脉内、腹膜内、肌内或真皮内注射，以这种方法连续维持患者体内的药物水平。在其它优选给药方法中，可以通过注射一种缓释制剂，例如，以缓慢解离的聚合或结晶形式将所述化合物输入患者体内；在这种持续给药方式之前，可以用更常见的方法(例如，如上文所述的方法)开始给药。另外，可以用灌输泵给药所述化合物，以便精确控制药物释放速度，或以类似于用于促进胰岛素吸收的方式将所述化合物放入鼻道。作为经鼻粘膜吸收的一种替代方式，可以用粉状物的气溶胶沉淀或溶液形式将本发明的化合物输入肺部。
局部给药
本发明的抗癌剂也可以局部给药，以治疗癌症。由于所希望的治疗剂的作用通常取决于涉及的组织的大小，例如，肿瘤的大小，因此以能导致肿瘤附近有很高的局部浓度的方式输送药物是特别理想的。将重组HuAFP作为诊断剂
在检测、监测或分析肿瘤(例如，乳腺癌或前列腺癌)存在时可将与检测标记连接的重组HuAFP(或其片段或类似物)用于诊断目的。
例如，可以用可检测地标记的rHuAFP(Tc-99m-标记的rHuAFP)对人类患者进行体内研究，以确定肿瘤的存在。一般，静脉内给药可检测地标记的rHuAFP，并通过本领域技术人员已知的方法用扫描仪进行显像，例如，用闪烁照像法进行放射性显像。
在另一种实施方案中，可以用和一种检测标记连接的rHuAFP(或其片段或类似物)检测诸如活组织、体液的组织样品中肿瘤或任何带有可由rHuAFP识别的受体的细胞的存在。在经过以上测定后，应当检验取自患者的组织样品、活组织或体液样品、特别是淋巴、血、血清、或尿液中这种细胞的存在。因此，可由rHuAFP识别的受体的亚细胞定位或存在用分级分离的细胞通过任何标准生化或组织化学方法(例如，参见Ausubel等，同上；Bancroft和Stevens，“组织学技术的理论和实践”(Theory and Practice of HistologicalTechniques)，Churdill Livingstone，1982)进行原位或体外测定。用于分析的合适对照样品包括自不具有带有甲胎蛋白的细胞的个体内采集的组织样品或体液(负对照)，或含有已知的、预定数量甲胎蛋白受体的样品(正对照)。
诊断试验可以用任何标准方法在溶液中或用固体(不可溶性)支持体(例如，聚苯乙烯、硝酸纤维素或珠粒)或在为组织学检查而制备的组织样品中进行。例如，为了确定从其身上采集试验样品的患者是否具有带有可由rHuAFP识别的受体的细胞，将试验样品中可检测地标记的rHuAFP结合水平与其在负对照样品和/或正对照样品中的结合水平进行比较。当在试验样品中的结合水平高于在负对照样品中的结合水平时，或至少等于在正对照样品中的结合水平时，表明该患者具有携带甲胎蛋白受体的细胞。
用于按本发明方法进行诊断分析的材料，可以以带有使用说明的试剂盒形式提供。一般，该试剂盒的部分地由rHuAFP(或其片段或类似物)组成。这种试剂盒还可以包括另一种试剂，例如，被用于标记rHuAFP(或其片段或类似物)的检测标记。例如，上述试剂盒可用于体外检测人体组织样品中肿瘤的存在，或用于体内检测目的。
下面所述的实验范例证实了rHuAFP诊断肿瘤的效果。
实施例材料和方法
动物
用本领域已知方法，在雌激素刺激条件下使植入CB-17 SCID小鼠侧胸部的MCF-7人类乳腺癌细胞生长至直径为1cm大小(约5克)。
锝标记
由与0.5m10.9％NaCl注射液(Baxter Healthcare Corporation，Deerfield，IL)混合的AFP试样制备99m Tc标记的重组甲胎蛋白。将上述溶液加入UltraTagRBC Reaction Vial(Mallinckrodt Medical Inc.，St.Louis，Mo63134 LotNo.0683040)中，其中含有在氩气下保存的冻干形式的氯化亚锡二水合物、柠檬酸钠二水合物、和无水葡萄糖。通过轻微回荡，混合上述小瓶中的内含物，并在室温下温育5分钟。在温育结束时加入体积为1-2ml的0.8-1.2GbqTechnetium 99mTc Sodium Pertechnetate Injection(99mTc Generator MallincroletMedical，Inc.St.Louis，MO)。通过轻微回荡，混合上述小瓶中的内容物，并温育15分钟。在制备后0、3和6小时分析剂型试样。用ITLC-SG(GelmanInstrument Co.，Ann Arbor，MI)以0.9％NaCl对制剂进行薄层层析，表明有95-99％的99Tc被结合在重组甲胎蛋白上。
显像
用Medafane镇静实验动物。然后将一个24径计、3/4英寸的导管(SurfloIV导管，Terumo Medical)固定在侧向尾脉冲。然后通过静脉内缓慢输入20-25mg/kg体重戊巴比妥对上述动物作进一步麻醉。视需要通过另外注射5mg戊巴比妥保持麻醉，以便约束其行动。
用一台Elscint Dymax409γ照像机收集同位素的生物分布数据。随后用计算机(Siemans Gammasonics Microdelta)分析这些数据。对动物进行3次显像，动物以背躺着的姿势放置在聚乙烯薄板上。为了避免在显像期间动物活动，必要时可对动物进行约束，用胶带将其肢体缚在上述板上，以便不会限制其呼吸。将所获得的60分钟的动态图像用于测定标记蛋白的生物分布。通常，以低能量一般目的的校准获得12幅顺序的5分钟图像，并将1.5硬件放大成具有128×128像素的计算机矩阵。研究用动物通常注射37MBq的Tc-99m标记的蛋白。结果
示踪剂生物分布和动力学
在从尾脉中给药37MBq(约4-6μg Tc-99m重组人甲胎蛋白)之后，在注射后的头1个小时和第24小时测定示踪剂生物分布的动力学。以注射的活性/100感兴趣的部位(ROI，Region of Interested)象素的60％形式(％IA)测定组织吸收动力学。在第一小时内，能迅速从肾脏消除，中度定位于肝脏，而在其它器官中很少有明显活性。在第一小时时，肿瘤吸收为(平均±SEM：1.9±0.3％IA)，而肿瘤与心脏(T/H)部位比值为0.84±0.23。到24小时时，肿瘤吸收为(0.8+/-0.1％IA)而T/A和肿瘤与背景(T/B上胸)部分之比分别为1.43±0.41和2.66±0.54。对在相同的动物上重复进行的99mTc-标记的rHuAFP和99mTc-标记的人血清白蛋白(用作非特异蛋白对照)的对比研究表明，对于99mTc标记的rHuAFP来说，在1小时和24小时时的T/B图像ROI活性比分别为2.7和5.8，而且，在24小时时99mTc标记的rHuAFP的活性比Tc-99m人血清白蛋白高40％。以上结果表明，rHuAFP可以用Tc-99m标记，而且，这种标记的制剂具有低的非特异性组织吸收力并能由肾脏迅速从血液中清除。在人类乳腺癌异种移植体中的定位起初很快，并随时间推移而加快，这是由于特异的肿瘤吸收。这些结果表明，用Tc-99m标记的rHuAFP可用作乳腺癌的诊断剂。诊断用途
如上所述，与可检测的标记连接的rHuAFP(或其片段或类似物)可用于诊断目的，用于肿瘤(如乳腺细胞癌)的检测、监测或分析。因此，出现典型的癌症症状，如乳腺癌或前列腺癌症状的患者，或具有表明易患这种癌症的医学病史的患者可以用本发明方法进行检验。适合这种测试的其他患者包括那些具有乳腺癌或前列腺癌家族史的患者。还应当检验正接受药物的患者或被涉及癌症诱发的毒素作用过的患者。
本发明的采用了可检测地标记过的rHuAFP(或其片段或类似物)的诊断方法可用于在出现与癌症相关的临床症状之前或之后检测癌症的存在。
本发明的方法有利于在出现临床症状(如可触知的肿块)之前和同时诊断肿瘤。例如，本发明的主题方法可用于在出现临床症状之前诊断乳腺癌。另外，本发明的方法可使医师准确诊断出诸如乳腺癌或前列腺癌的肿瘤。
本发明的诊断显像方法可以用含于生理上可以接受的载体中的诊断有效量的rHuAFP诊断剂进行。例如，合适的载体及其配方由E.W.Martin披露于“Remington′s药学”(Remingyon′s Pharmaceutical Sciences)。欲给药的诊断剂的量取决于以下因素：给药方式、患者的年龄和体重、疾病的类型、疾病的蔓延程度、以及患这种病的患者的体型。不过，一般用量在其它用于诊断癌症的制剂的用量范围内，尽管在某些场合需要较低的用量，这是因为其具有较高的化合物特异性。例如，以静脉内注射方式给上述患者给药可检测地标记的rHuAFP，以使肿瘤能够显像的剂量给药，例如，用闪烁照查法进行放射性显像。通常，剂量在0.1ng-10g/kg体重范围内。
在本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均以相等的份量被收作本文的参考资料，如同每份出版物或专利申请被具体地或单独地指明为可收作本发明的参考。本发明的细胞培养基
本发明还提供了用于细胞培养的含rHuAFP(或其片段或类似物)的培养基。虽然本发明培养基一般不需要使使用血清(例如，胎牛血清、牛血清、马血清、正常小鼠血清、人血清、猪血清、兔血清等)，因为欲将所述rHuAFP用于取代或补充血清的用途，但本领域技术人员应当理解，如果需要，可以加入血清。配养基成份一般是用本领域公知方法制备的。因此，任何标准培养基，如RMPI-1630培养基、CMRL培养基、Dulbecco′s改进的Eagle培养基(D-MEM)、Fischer′s培养基、Iscove′s改进的Dulbecco′s培养基、Mccoy′s培养基、极限必需培养基、NCTC培养基等可以以需要的有效浓度用rHuAFP(或其片段或类似物)配制。如果需要，用已知方法加入培养基补充成分，例如，盐溶液(如Hank′s平衡盐溶液或Earle′s平衡盐溶液)、抗生素、核酸、氨基酸、糖类和维生素。如果需要，还可以有标准方法向培养基中加入生长因子、集落刺激因子、细胞因子等。例如，本发明培养基可以单独或以组合形式含有下列任何物质和rHuAFP(或其片段或类似物)：红细胞生成素、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白介素(如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5等)，胰岛素生长因子(IGF)、运铁蛋白、白蛋白、和干细胞生长因子(SCF)。本发明的培养基可用于培养多种真核细胞，如哺乳动物细胞、酵母细胞、两栖类细胞和昆虫细胞。本发明的培养基还可以用于培养任何组织或器官。所述培养基还可用于多种培养条件，并用于多种生物学目的。所述培养条件的例子包括，但不限于生物反应器(如连续的或中空纤维生物反应器)、细胞悬浮培养物、半固体培养物、和长期细胞悬浮培养物。本发明的培养基还可用于工业用途，例如，培养杂交瘤细胞、遗传工程哺乳动物细胞、组织或器官。将重组人甲胎蛋白作为细胞增殖剂
用任何用于体外和体内分析细胞增殖的试验方法测定rHuAFP(或其片段或类似物)的细胞生长促进作用。如下文所述，本领域有用于体内试验rHuAFP(或其片段或类似物)的细胞生长促进或增进特征的动物系统。另外，还有多种可用于试验rHuAFP(或其片段或类似物)的生长促进或生长增进特征的体外系统。
可以用本领域已知的标准方法鉴定任何效应于rHuAFP(或其片段或类似物)而增殖的细胞。例如，可以这样监测细胞(如骨髓细胞)增殖：在含有试验化合物的液体培养基中培养细胞，将试验化合物单独或以与其它生长因子组合形式人为加入无血清或血清基培养基。另外，可以在稀琼脂或甲基纤维素的半固体基质里培养所述骨髓细胞，而将试验化合物单独或以与其它生长因子组合形式人为加入到无血清或血清减少了的培养基中。在所述半固体基质中，分离的前体细胞的子代效应于rHuAFP或其片段或类似物增殖，以可鉴别的集落保持在一起。例如，一个骨髓细胞可以形成由多个骨髓细胞组成的克隆，所述细胞如NK细胞。这种系统提供了一种分析一种细胞是否单独效应于rHuAFP(或其片段或类似物)或效应于rHuAFP与其它生长因子的组合的便捷方法。
如果需要，按照标准方法鉴定并分离扩增的细胞亚群。例如，可以用荧光激活细胞分选仪(FACS)分析细胞。该方法一般包括用与荧光染料结合的抗体标记细胞，并在一台FACS上将标记细胞和未标记细胞分离，所述FACS如FACScan(Becton Dickson)。因此，通过分析细胞表面抗原的存在，实际上可以对任何细胞进行鉴定和分离(例如，参见Shah等，“免疫学杂志”(J.Immunol.)140：1861，1988)。当得到一个细胞群时，对其进行生化分析，或将其作为另一次细胞培养的原始群体，以便可以在培养条件确定的条件下对细胞的作用进行测定。
在一个实施例中，用如下方法检验rHuAFP(或其片段或类似物)对人骨髓细胞生长的作用。一般，人体骨髓样品是在获得许可后用标准方法获得。例如，骨髓是从健康供体的髂嵴中获得的，并在室温下将骨髓细胞稀释在磷酸缓冲的盐溶液里。然后洗涤细胞并使其在合适的生长培养基中生长。例如，可以通过将骨髓细胞接种在20-30ml含有50U/ml青霉素、50U/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺的McCoy′s培养基中建立培养。在有或没有单独存在的或与诸如运铁蛋白或GM-CSF的其它生长因子组合的条件下培养所述培养物。随后在37℃下，在含有5％CO2、5％O2和90％N2的潮湿空气中将培养物培养，持续所需要的时间。用标准方法进行细胞增殖试验。例如，通过用1-2μCi的3HTdR脉冲细胞对在有和没有试验化合物的条件下培养的复制样品进行分析。在经过一定的培养时间后，将培养物收获到玻璃纤维滤膜上并通过液体闪烁测定掺入的3H。对处理过的细胞和对照细胞，如在有rHuAFP的条件下培养的细胞和在无rHuAFP的条件下培养的细胞进行对比研究，将其用于测定试验分子在刺激细胞增殖方面的相对效力。能刺激细胞增殖的分子被视为可用于本发明。
为了测定rHuAFP(或其片段或类似物)的增殖作用，例如，试验化合物的体内血细胞生成作用，用诸如静脉内注射或腹膜内注射的标准方法，以合适剂量每天给亚致死辐射小鼠(或用诸如环孢菌素或FK-506的免疫抑制剂，或用诸如5-氟尿嘧啶或环磷酰胺的化疗剂，或用本领域已知的任何其它贫化骨髓的方法处理过的小鼠)和正常小鼠给药试验分子。一般，给处理过的小鼠给药试验化合物是在用诸如亚致死辐射、免疫治疗或化疗法处理动物之前和/或之后开始。对照动物接受诸如人血清白蛋白或稀释剂的安慰剂，以与给药rHuAFP或相关分子类似的方法给药安慰剂。用标准技术监测试验分子对血细胞生成的作用。例如，分析处理动物和对照动物的外周血和脾内的白血球数。对诸如淋巴细胞谱系或骨髓谱系或任何其它类型细胞的骨髓进行定性和定量分析，也可以用常规方法进行测定和分析。比较处理过的动物和对照动物的数据，并将其用于测定试验分子在促进细胞增殖方面的相对效力，例如，促进骨髓细胞产生、成熟B淋巴细胞、胸腺细胞或外周T淋巴细胞产生。能刺激细胞增殖的试验分子被视为可用于本发明。
以下实施例证实了非糖基化rHuAFP在体外刺激骨髓生长的能力。该实施例是用了说明本发明的，而不是要限定本发明的范围。
实施例材料和方法
动物
由Jackson实验室(Bar Harbor，Maine)获得成年雄性和雌性CBA/J小鼠。所有小鼠均在我们的动物饲养装置中饲养和维持。用于该研究的动物为12-20周龄。
培养物
用改进的Dulbecco′s磷酸缓冲的盐溶液(PBS)冲洗CBA/J小鼠的胫骨和股骨，并用消毒的注射器和25-规格(gauge)针头收集骨髓细胞。通过让细胞混合物反复从巴斯德移液管中通过获得均匀的单细胞悬浮液。所有细胞通过在250xg下在PBS中离心10分钟洗涤2次，然后通过台盼蓝染料排除法测其生活力。在所有实验中均记录到95％或更高的细胞活力。然后在使用之前将细胞调至理想浓度。在96孔圆底微量滴定板(FloW Laboratories，Mississauga，Ontario，Canada)中培养骨髓细胞(250,000)。培养基为无血清RPMI加4mML-谷氨酰胺、20mMHepes、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素(GIBCOLaboratories，Burlington，Ontario，Canada)、5μg/ml运铁蛋白和5×10-5乙-巯基乙醇(Eastman Chemicals Co.，Rochester N.Y.)。分别在没有rHuAFP或有浓度为400μg/ml的rHuAFP的条件下培养细胞。所有培养物的总体积为0.2ml。细胞在37℃下在温度为95％、含5％CO2的空气中进行。收获之前6小时，用1μCi氚化胸苷(NEN，比活性77.1Ci/mmol)对培养物进行脉冲。然后用多样品收集器(Skatron，FloW Labs)将细胞收集在玻璃纤维垫(Flow Labs)上。用一台LKB 1215 RackbetaII、通过标准液体闪烁技术测定不溶于水的氚化胸苷的掺入量。结果
rHuAFP在无血清培养基中对骨髓增殖的作用
在无血清培养基中测定纯化rHuAFP对培养的鼠骨髓的影响。在该实施方案中，在没有或有终浓度为400μg/ml以及终浓度为5μg/ml的运铁蛋白的无血清RPMI中将获自CBA/J小鼠的2.5×105活细胞培养72小时。图10中所示数据表明，在有非糖基化rHuAFP的条件下，骨髓细胞能进行显著的增殖反应；刺激指数(SI)为35。在没有rHuAFP的条件下培养骨髓细胞未观察到这种增殖作用。治疗
如上所述，rHuAFP能有效促进细胞增殖，因此，可用于涉及促进细胞增殖，如骨髓细胞增殖的治疗，并可用于预防免疫抑制疗法、放疗或化疗、或其它已知会抑制免疫系统并抑制骨髓产生导致骨髓毒性的疗法的副作用的治疗。因此，rHuAFP(或其片段或类似物)被用于治疗成红细胞祖细胞或干细胞缺陷或相关疾病。重组HuAFP(或其片段或类似物)也可用于治疗癌症及其它导致骨髓毒性的其它病理学症状，治疗受到辐射或药物作用，例如包括白细胞减少、细菌和病毒感染、贫血、B细胞或T细胞缺陷，包括自身或非自身骨髓移植的免疫细胞或成红细胞缺陷。重组HuAFP(或其片段或类似物)也可用于体外或体内刺激巨核细胞和天然杀伤细胞的发育。
本发明的培养基、组合物和方法也可用于治疗通过骨髓移植(BMT)进行治疗的癌症，该方法包括自患者体内取出骨髓，在来自体内的培养物中维持这些细胞，同时对患者进行放疗或化疗，并在治疗结束后将这些细胞重新植入患者体内，以恢复患者的骨髓。因此，rHuAFP可用于BMT，作为在来自体内的细胞培养基中重建骨髓的手段，并用于在体内促进骨髓细胞的增殖。重组HuAFP(或其片段或类似物)也可用于其它细胞疗法，例如细胞扩增和/或基因疗法，需要来自体内的细胞培养物的疗法。重组HuAFP(或其片段或类似物)也可用于预防自身或同种骨髓移植的排斥作用。
治疗给药
可用已知方法将重组HuAFP(或其片段或类似物)配制成可以药用的组合物。重组人甲胎蛋白，如rHuAFP(或其片段或类似物)优选以能有效预防或改善髓毒性的症状的剂量向患者给药。一般0.1ng/kg-10g/kg体重的剂量是足够的。例如，可以用治疗有效量的、包含于生理上可以接受的载体中的rHuAFP(或其片段或类似物)治疗人类患者。例如，合适的载体及其配方由E.W.Martin披露于Remingtor′s药学(Remington＇s Pharmaceutical Sciences)中。rHuAFP的用量取决于以下因素；给药方式、患者的年龄和体重、疾病的类型、倾向于患或正患该病的患者的体型。例如，给药的优选方法包括经口给药，皮下、静脉内、腹膜内、肌内、经皮或真皮内注射，由此持续保持患者体内的药物水平。在其它优选给药方法中，可以通过注射或植入诸如缓慢解离的聚合成结晶形式的缓释制剂的方法给患者给药rHuAFP；在这种持续给药之前，可以用更常见的方法(如上所述)开始用药。另外，可以用外置的或可植入的灌输泵给药rHuAFP，以便精确地控制药物的释放速度，或以类似于用于促进胰岛素吸收的方式将rHuAFP放入鼻道。作为经鼻粘膜吸收的一种替代形式，可以粉状物的气溶胶沉淀或溶液形式将rHuAFP输入肺部。
本发明的治疗方法和组合物还包括与其它人类生长因子一起给药。用于这种目的的细胞因子或血细胞生成素的例子包括，但不限于诸如白介素(IL-1)、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、肿瘤坏死因子(TNF)、运铁蛋白和红细胞生成素的因子。诸如B细胞生长因子、B细胞分化因子或嗜伊红粒细胞分化因子的生长因子也可以用于与rHuAFP(或其片段或类似物)一起给药。可以对上述剂量进行调整，以补偿治疗组合物中的上述其它成分。可以用常规方法监测受治患者的进展。
一般，治疗始于诊断出或怀疑有骨髓毒性时，并且有规律地重复进行或每天重复进行，以改善或预防症状的发展或恶化。在发病之前给药rHuAFP也可以防止或预防骨髓毒性的发展。如果需要，可以用监测或诊断患者骨髓毒性的方法测定治疗或预防的效果。
本发明方法也可用于治疗非人类哺乳动物，例如，家畜或牲畜。
其它实施方案
在其它实施方案中，本发明包括将rHuAFP(或其片段或类似物)用于预防或治疗获得性免疫缺损综合症(AIDS)。为了测定rHuAFP或其片段或类似物对AIDS的免疫抑制作用，即该化合物预防或改善AIDS的自身免疫作用的能力，用诸如静脉内或腹膜内注射的标准方法以上述合适剂量每日给合适动物(如人类患者)给药试验化合物。一般，给药是在AIDS发作之前和/或出现AIDS临床症状之后开始。对照动物接受安慰剂，如人血清白蛋白，以与给药rHuAFP或相关分子类似的方式给药安慰剂。用标准方法监测试验化合物对AIDS的影响。例如，可以监测对试验化合物抑制、预防或改善辅助T细胞的破坏作用的分析。对处理过的动物和对照动物的对比研究可用于确定试验化合物在预防或改善AIDS方面的相对效力。能预防或改善(减弱，或抑制，或缓解，或促进减轻)AIDS症状的分子被视为可用于本发明。
本发明还包括将治疗有效量的rHuAFP(或其片段或类似物)用于抑制哺乳动物的器官(如心脏、肝脏、肺、胰腺和肾脏)、组织(如皮肤、骨髓、硬脑膜、骨、植入的胶原、植入的生物反应器)或细胞(如β胰岛细胞、干细胞、血细胞生成细胞、淋巴细胞、神经内分泌细胞或肾上腺细胞)移植的排斥作用。所述移植器官、组织或细胞可以源于任何来源，例如，这种生物材料可以是同种型的、同表型的、自身的、合成的、人工的或遗传工程的。例如，当患者是同种异体移植，如来自另一物种的心脏或肾脏的受体时可以采用该方法。
在一种实施方案中，rHuAFP对临床移植的免疫抑制作用，即rHuAFP预防或改善移植排斥作用(例如，超急性排斥、急性排斥和慢性排斥)的能力是用诸如静脉内注射或腹膜内注射的标准方法以合适剂量每天给NIH小型猪给药rHuAFP的方式进行测定。一般，rHuAFP的给药是在移植，如肾脏移植之前和/或移植过程之后开始。对照动物接受安慰剂，如人血清白蛋白，以给药rHuAFP的类似方法给药。用标准方法监测rHuAFP对移植排斥的影响。排斥过程的一种表现形式是移植器官的功能受到损伤，例如，可以监测尿液排出量的分析。如果需要，可以对肾组织进行组织学检验(例如，用任何标准的组织化学或免疫组织化学方法，例如，参见Ausubel等，同上；Bancroft和Stevens，同上)，并对通过活检获得的组织样品进行显微镜检，以寻找移植排斥的证据，如慢性间质纤维化、血管血栓形成或异常淋巴浸润的出现。对处理过的动物和对照动物的比较研究可用于测定rHuAFP在预防或改善抑制排斥方面的相对效力。能预防或改善(减弱，或抑制，或缓解，或促进减轻)移植排斥症状的重组HuAFP(或其片段或类似物)被视为可用于本发明。
在本发明说明书中提及的所有出版物、生产商的说明、专利、及专利申请被以同样的份量收作本发明的参考资料，如同每份出版物或专利申请被特意和分别指明收作本文的参考一样。
                            序列表(1)一般资料：
(i)申请人：Murgita，Robert A
(ii)发明名称：克隆人甲胎蛋白的表达和纯化
(iii)序列数目：20
(iv)通讯地址：
    (A)收件人：Fish和Richardson P.C.
    (B)街道：225 Franklin Street，Suite 3100
    (C)城市：Boston
    (D)洲：MA
    (E)国家：USA
    (F)由编：02110-2804
(V)计算机可读形式：
    (A)媒介类型：软盘
    (B)计算机：IBM PC兼容
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：Patent In Re1ease#1.0，#1.30版
(vi)当前申请资料
    (A)申请号：PCT/US96/---
    (B)申请日：1996年1月24日
    (C)分类：
(vii)在先申请资料：
    (A)申请号：08/377,317
    (B)申请日：1995年1月24日
    (C)分类：
    (A)申请号：08/377,311
    (B)申请日：1995年1月24日
    (C)分类：
    (A)申请号：08/377,309
    (B)申请日：1995年1月24日
    (C)分类：
    (A)申请号：08/377,316
    (B)申请日：1995年1月24日
    (C)分类：
    (A)申请号：08/505,012
    (B)申请日：1995年7月21日
    (C)分类：
(viii)律师/代理人资料：
    (A)姓名：Clark，Paul T.
    (B)注册号：30,162
    (C)资料/文件号：06727/003001
(ix)通讯资料：
    (A)电话：(617)542-5070
    (B)传真：(617)542-8906
    (C)电传：200154(2)序列l资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：21个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：序列1
TGTCTGCAGG ATGGGGAAAA A(2)序列2资料
(i)序列特征：
    (A)长度：18个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：序列2
CATGAAATGA  CTCCAGTA(2)序列3资料
(i)序列特征：
    (A)长度：18个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：序列3
CATAGAAATG  AATATGGA(2)序列4资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：2022个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：未涉及
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白
(xi)序列描述：序列4ATATTGTGCT TCCACCACTG CCAATAACAA AATAACTAGC AACCATGAAG TGGGTGGAAT        60CAATTTTTTT AATTTTCCTA CTAAATTTTA CTGAATCCAG AACACTGCAT AGAAATGAAT       120ATGGAATAGC TTCCATATTG GATTCTTACC AATGTACTGC AGAGATAAGT TTAGCTGACC       180TGGCTACCAT ATTTTTTGCC CAGTTTGTTC AAGAAGCCAC TTACAAGGAA GTAAGCAAAA       240TGGTGAAAGA TGCATTGACT GCAATTGAGA AACCCACTGG AGATGAACAG TCTTCAGGGT       300GTTTAGAAAA CCAGCTACCT GCCTTTCTGG AAGAACTTTG CCATGAGAAA GAAATTTTGG       360AGAAGTACGG ACATTCAGAC TGCTGCAGCC AAAGTGAAGA GGGAAGACAT AACTGTTTTC       420TTGCACACAA AAAGCCCACT GCAGCATGGA TCCCACTTTT CCAAGTTCCA GAACCTGTCA       480CAAGCTGTGA AGCATATGAA GAAGACAGGG AGACATTCAT GAACAAATTC ATTTATGAGA       540TAGCAAGAAG GCATCCCTTC CTGTATGCAC CTACAATTCT TCTTTCGGCT GCTGGGTATG      600AGAAAATAAT TCCATCTTGC TGCAAAGCTG AAAATGCAGT TGAATGCTTC CAAACAAAGG      660CAGCAACAGT TACAAAAGAA TTAAGAGAAA GCAGCTTGTT AAATCAACAT GCATGTCCAG      720TAATGAAAAA TTTTGGGACC CGAACTTTCC AAGCCATAAC TGTTACTAAA CTGAGTCAGA      780AGTTTACCAA AGTTAATTTT ACTGAAATCC AGAAACTAGT CCTGGATGTG GCCCATGTAC      840ATGAGCACTG TTGCAGAGCA GATGTGCTGG ATTGTCTGCA GGATGGGGAA AAAATCATGT      900CCTACATATG TTCTCAACAA GACACTCTGT CAAACAAAAT AACAGAATGC TGCAAACTGA      960CCACGCTGGA ACGTGGTCAA TGTATAATTC ATGCAGAAAA TGATGAAAAA CCTGAAGGTC     1020TATCTCCAAA TCTAAACAGG TTTTTAGGAG ATAGAGATTT TAACCAATTT TCTTCAGGGG     1080AAAAAAATAT CTTCTTGGCA AGTTTTGTTC ATGAATATTC AAGAAGACAT CCTCAGCTTG     1140CTGTCTCAGT AATTCTAAGA GTTGCTAAAG GATACCAGGA GTTATTGGAG AAGTGTTTCC     1200AGACTGAAAAA CCCTCTTGAA TGCCAAGATA AAGGAGAAGA AGAATTACAG AAATACATCC    1260AGGAGAGCCA AGCATTGGCA AAGCGAAGCT GCGGCCTCTT CCAGAAACTA GGAGAATATT     1320ACTTACAAAA TGAGTTTCTC GTTGCTTACA CAAAGAAAGC CCCCCAGCTG ACCTCGTCGG     1380AGCTGATGGC CATCACCAGA AAAATGGCAG CCACAGCAGC CACTTGTTGC CAACTCAGTG     1440AGGACAAACT ATTGGCCTGT GGCGAGGGAG CGGCTGACAT TATTATCGGA CACTTATGTA     1500TCAGACATGA AATGACTCCA GTAAACCCTG GTGTTGGCCA GTGCTGCACT TCTTCATATG     1560CCAACAGGAG GCCATGCTTC AGCAGCTTGG TGGTGGATGA AACATATGTC CCTCCTGCAT     1620TCTCTGATGA CAAGTTCATT TTCCATAAGG ATCTGTGCCA AGCTCAGGGT GTAGCGCTGC     1680AAAGGATGAA GCAAGAGTTT CTCATTAACC TTGTGAAGCA AAAGCCACAA ATAACAGAGG     1740AACAACTTGA GGCTCTCATT GCAGATTTCT CAGGCCTGTT GGAGAAATGC TGCCAAGGCC     1800AGGAACAGGA AGTCTGCTTT GCTGAAGAGG GACAAAAACT GATTTCAAAA ACTGGTGCTG     1860CTTTGGGAGT TTAAATTACT TCAGGGGAAG AGAAGACAAA ACGAGTCTTT CATTCGGTGT     1920GAACTTTTCT CTTTAATTTT AACTGATTTA ACACTTTTTG TGAATTAATG ATAAAGACTT     1980TTATGTGAGA TTTCCTTATC ACAGAAATAA AATATCTCCA AA                        2022(2)序列5资料
(i)序列特征：
    (A)长度：590个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：未涉及
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白
(xi)序列描述：序列5Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu Asp Ser Tyr1               5                   10                  15Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr Ile Phe Phe
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    35                  40                  45Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp Glu Gln Ser
50                  55                  60Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu Glu Leu Cys65                  70                  75                  80His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp Cys Cys Ser
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    195                 200                 205Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val Thr Lys Leu
210                 215                 220Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln Lys Leu Val225                 230                 235                 240Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Ala Asp Val Leu
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        260                 265                 270Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys Leu Thr Thr
    275                 280                 285Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp Glu Lys Pro
290                 295                 300Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp Arg Asp Phe305                 310                 315                 320Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala Ser Phe Val
            325                 330                 335His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser Val Ile Leu
        340                 345                 350Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys Phe Gln Thr
    355                 360                 365Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lys
370                 375                 380Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys Gly Leu Phe385                 390                 395                 400Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Glu Phe Leu Val Ala Tyr
            405                 410                 415Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser Ser Glu Leu Met Ala Ile Thr
        420                 425                 430Arg Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu Ser Glu Asp
    435                 440                 445Lys Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ile Ile Gly His
450                 455                 460Leu Cys Ile Arg His Glu Met Thr Pro Val Asn Pro Gly Val Gly Gln465                 470                 475                 480Cys Cys Thr Ser Ser Tyr Ala Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ser Leu
            485             490                 495Val Va1 Asp Glu Thr Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser Asp Asp Lys Phe
        500             505                 510Ile Phe His Lys Asp Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala Leu Gln Arg
    515                 520                 525Met Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys Pro Gln Ile
530                 535                 540Thr Glu Glu Gln Leu Glu Ala Leu Ile Ala Asp Phe Ser Gly Leu Leu545                 550                 555                 560Glu Lys Cys Cys Gln Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys Phe Ala Glu Glu
            565                 570                 575Gly Gln Lys Leu Ile Ser Lys Thr Gly Ala Ala Leu Gly Val
        580                 585                 590(2)序列6资料：
(i)序列特征：
     (A)长度：197个氨基酸
     (B)类型：氨基酸
     (C)链型：未涉及
     (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu Asp Ser Tyr1               5                   10                  15Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr Ile Phe Phe
        20                  25                  30Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser Lys Met Val
    35                  40                  45Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp Glu Gln Ser
50                  55                  60Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu Glu Leu Cys65                  70                  75                  80His Glu Lys Glu Ile Leu glu Lys Tyr Gly His Ser Asp Cys Cys Ser
            85                  90                  95Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His Lys Lys Pro
        100                 105                 110Thr Ala Ala Trp Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro Val Thr Ser
    115                 120                 125Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn Lys Phe Ile
130                 135                 140Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro Thr Ile Leu145                 150                 155                 160Leu Ser Ala Ala Gly Tyr Glu Lys Ile Ile Pro Ser Cys Cys Lys Ala
            165             170                     175Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr Val Thr Lys
        180                 185                 190Glu Leu Arg Glu Ser
    195(2)序列7资料：
(i)序列特征：
     (A)长度：192个氨基酸
     (B)类型：氨基酸
     (C)链型：未涉及
     (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白
(xi)序列描述：序列7Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys Pro Val Met Lys Asn Phe Gly Thr1               5                   10                  15Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val Thr Lys Leu Ser Gln Lys Phe Thr
        20                  25                  30Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln Lys Keu Val Leu Asp Val Ala His
    35                  40                  45Val His Glu His Cys Cys Arg Ala Asp Val Leu Asp Cys Leu Gln Asp
50                  55                  60Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile Cys Ser Gln Gln Asp Thr Leu Ser65                  70                  75                  80Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys Leu Thr Thr Leu Glu Arg Gly Gln
            85                  90                  95Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp Glu Lys Pro Glu Gly Leu Ser Pro
        100                 105                 110Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp Arg Asp Phe Asn Gln Phe Ser Ser
    115                 120                 125Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala Ser Phe Val His Glu Tyr Ser Arg
130                 135                 140Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser Val Ile Leu Arg Val Ala Lys Gly145                 150                 155                 160Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys Phe Gln Thr Glu Asn Pro Leu Glu
            165                 170                 175Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lys Tyr Ile Gln Glu Ser
        180                 185                 190(2)序列8资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：201个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：未涉及
(D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白
(xi)序列描述：序列8Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys Gly Leu Phe Gln Lys Leu Gly Glu1               5                   10                  15Tyr Tyr Leu Gln Asn Glu Phe Leu Val Ala Tyr Thr Lys Lys Ala Pro
        20                  25              30Gln Leu Thr Ser Ser Glu Leu Met Ala Ile Thr Arg Lys Met Ala Ala
    35                  40                  45Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu Ser Glu Asp Lys Leu Leu Ala Cys
50                  55                  60Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ils Ile Gly His Leu Cys Ile Arg His65                  70                  75                  80Glu Met Thr Pro Val Asn Pro Gly Val Gly Gln Cys Cys Thr Ser Ser
            85                  90                  95Tyr Ala Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ser Leu Val Val Asp Glu Thr
        100                 105                 110Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser Asp Asp Lys Phe Ile Phe His Lys Asp
    115                 120                 125Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala Leu Gln Arg Met Lys Gln Glu Phe
130                 135                 140Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys Pro Gln Ile Thr Glu Glu Gln Leu145                 150                 155                        160Glu Ala Leu Ile Ala Asp Phe Ser Gly Leu Leu Glu Lys Cys Cys Gln
            165                 170             175Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys Phe Ala Glu Glu Gly Gln Lys Leu Ile
            180             185                 190Ser Lys Thr Gly Ala Ala Leu Gly Val
    195                 200(2)序列9资料：
(i)序列特征：
     (A)长度：389个氨基酸
     (B)类型：氨基酸
     (C)链型：未涉及
     (D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：蛋白(xi)序列描述：序列9Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu Asp Ser Tyr1               5                   10                  15Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr Ile Phe Phe
        20                  25                  30Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser Lys Met Val
    35                  40                  45Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp Glu Gln Ser
50                  55                  60Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu Glu Leu Cys65                  70                  75                  80His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly Hls Ser Asp Cys Cys Ser
            85                  90                  95Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His Lys Lys Pro
        100                 105                 110Thr Ala Ala Trp Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro Val Thr Ser
    115                 120                 125Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn Lys Pne Ile
130                 135                 140Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro Thr Ile Leu145             150                     155                        160Leu Ser Ala Ala Gly Tyr Glu Lys Ile Ile Pro Ser Cys Cys Lys Ala
            165                 170                 175Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr Val Thr Lys
        180                 185                 190Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys Pro Val Met
    195             200                     205Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val Thr Lys Leu
210                 215                 220Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln Lys Leu Val225                 230                 235                 240Leu Asp Val Ala His Val His Glu Hie Cys Cys Arg Ala Asp Val Leu
            245                 250                 255Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile Cys Ser Gln
        260                 265                 270Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys Leu Thr Thr
    275                 280                 285Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp Glu Lys Pro
290                 295                 300Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp Arg Asp Phe305                 310                 315                 320Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala Ser Phe Val
            325                 330                 335His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser Val Ile Leu
        340                 345                 350Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys Phe Gln Thr
    355                 360                 365Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lys
370                 375             380Tyr Ile Gln Glu Ser385(2)序列10资料：
(i)序列特征：
     (A)长度：393个氨基酸
     (B)类型：氨基酸
     (C)链型：未涉及
     (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白
(xi)序列描述：序列10Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys Pro Val Met Lys Asn Phe Gly Thr1               5                   10                  15Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val Thr Lys Leu Ser Gln Lys Phe Thr
        20                  25                  30Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln Lys Leu Val Leu Asp Val Ala His
    35          40                          45Val His Glu His Cys Cys Arg Ala Asp Val Leu Asp Cys Leu Gln Asp
50                  55                  60Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile Cys Ser Gln Gln Aap Thr Leu Ser65                  70                  75                  80Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys Leu Thr Thr Leu Glu Arg Gly Gln
            85                  90                  95Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp Glu Lys Pro Glu Gly Leu Ser Pro
        100                 105                 110Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp Arg Asp Phe Asn Gln Phe Ser Ser
    115                 120                 125Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala Ser Phe Val His Glu Tyr Ser Arg
130                 135                 140Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser Val Ile Leu Arg Val Ala Lys Gly145                 150                 155                 160Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys Phe Gln Thr Glu Asn Pro Leu Glu
            165                 170                 175Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lys Tyr Ile Gln Glu Ser
        180                 185                 190Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys Gly Leu Phe Gln Lys Leu Gly Glu
    195                 200                 205Tyr Tyr Leu Gln Asn Glu Phe Leu Val Ala Tyr Thr Lys Lys Ala Pro
210                 215                 220Gln Leu Thr Ser Ser Glu Leu Met Ala Ile Thr Arg Lys Met Ala Ala225                 230                 235                 240Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu Ser Glu Asp Lys Leu Leu Ala Cys
            245                 250                 255Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ile Ile Gly His Leu Cys Ile Arg His
        260                 265                 270Glu Met Thr Pro Va1 Asn Pro Gly Val Gly Gln Cys Cys Thr Ser Ser
    275                 280                 285Tyr Ala Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ser Leu Val Val Asp Glu Thr
290                 295                 300Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser Asp Asp Lys Phe Ile Phe His Lys Asp305                 310                 315                 320Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala Leu Gln Arg Mer Lys Gln Glu Phe
            325                 330                 335Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys Pro Gln Ile Thr Glu Glu Gln Leu
        340                 345                 350Glu Ala Leu Ile Ala Asp Phe Ser Gly Leu Leu Glu Lys Cys Cys Gln
    355                 360                 365Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys Phe Ala Glu Glu Gly Gln Lys Leu Ile
370                 375                 380Ser Lys Thr Gly Ala Ala Leu Gly Val385                 390(2)序列11资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：325个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：未涉及
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白
(xi)序列描述：序列11Met Ser Tyr Ile Cys Ser Gln Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lye Ile Thr1               5                   10                  15Glu Cys Cys Lys Leu Thr Thr Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His
        20                  25                  30Ala Glu Asn Asp Glu Lys Pro Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg
    35                  40                  45Phe Leu Gly Asp Arg Asp Phe Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn
50                  55                  60Ile Phe Leu Ala Ser Phe Val His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln65                  70                  75                  80Leu Ala Val Ser Val Ile Leu Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu
            85                  90                  95Leu Glu Lys Cys Phe Gln Thr Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys
        100                 105                 110Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lys Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala
    115                 120                 125Lys Arg Ser Cys Gly Leu Phe Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln
130                 135                 140Asn Glu Phe Leu Val Ala Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser145                 150                 155                 160Ser Glu Leu Met Ala Ile Thr Arg Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr
            165                 170                 175Cys Cys Gln Leu Ser Glu Asp Lys Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala
        180                 185                 190Ala Asp Ile Ile Ile Gly His Leu Cys Ile Arg His Glu Met Thr Pro
    195                 200                 205Val Asn Pro Gly Val Gly Gln Cys Cys Thr Ser Ser Tyr Ala Asn Arg
210                 215                 220Arg Pro Cys PPhe Ger Ser Leu Val Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Pro225                  230                 235                 240Ala Phe Ger Asp Asp Lys Phe Ile Phe His Lys Asp Leu Cys Gln Ala
            245                 250                 255Gln Gly Val Ala Leu Gln Arg Met Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn Leu
        260                 265                 270Val Lys Gln Lys Pro Gln Ile Thr Glu Glu Gln Leu Glu Ala Leu Ile
    275                 280                 285Ala Asp Phe Ser Gly Leu Leu Glu Lys Cys Cys Gln Gly Gln Glu Gln
290                 295                 300Glu Val Cys Phe Ala Glu Glu Gly Gln Lys Leu Ile Ser Lys Th Gly305                 310                 315                320Ala Ala Leu Gly Val
            325(2)序列12资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：324个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：未涉及
    (D)拓朴结构：蛋白
(ii)分子类型：蛋白
(xi)序列描述：序列12Ser Tyr Ile Cys Ser Gln Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu1               5                   10                  15Cys Cys Lys Leu Thr Thr Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala
        20                  25                  30Glu Asn Asp Glu Lys Pro Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe
    35                  40                  45Leu Gly Asp Arg Asp Phe Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn Ile
50                  55                  60Phe Leu Ala Ser Phe Val His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln Leu65                  70                  75                  80Ala Val Ser Va1 Ile Leu Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu
            85                  90                  95Glu Lys Cys Phe Gln Thr Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly
        100                 105                 110Glu Glu Glu Leu Gln Lys Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys
    115                 120                 125Arg Ser Cys Gly Leu Phe Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn
130                 135                 140Glu Phe Leu Val Ala Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser Ser145                 150                 155                 160Glu Leu Met Ala Ile Thr Arg Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr Cys
            165                 170                 175Cys Gln Leu Ser Glu Asp Lys Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala Ala
        180                 185                 190Asp Ile Ile Ile Gly His Leu Cys Ile Arg His Glu Met Thr Pro Val
    195                 200                 205Asn Pro Gly ValGly Gln Cys Cys Thr Ser Ser Tyr Ala Asn Arg Arg
210                215                 220Pro Cys Phe Ser Ser Leu Val Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Pro Ala225                 230                 235                 240Phe Ser Asp Asp Lys Phe Ile Phe His Lys Asp Leu Cys Gln Ala Gln
            245                 250                 255Gly Val Ala Leu Gln Arg Met Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn Leu Val
        260                 265                 270Lys Gln Lys Pro Gln Ile Thr Glu Glu Gln Leu Glu Ala Leu Ile Ala
    275                 280                 285Asp Phe Ser Gly Leu Leu Glu Lys Cys Cys Gln Gly Gln Glu Gln Glu
290                 295                 300Val Cys Phe Ala Glu Glu Gly Gln Lys Leu Ile Ser Lys Thr Gly Ala305                 310                 315                 320Ala Leu Gly Val(2)序列13资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：9个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：未涉及
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白
(xi)序列描述：序列13Ser Tyr Ile Cys Ser Gln Gln Asp Thr1               5(2)序列14资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：30个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：序列14
AAAAAAGGTA CCACACTGCA TAGAAATGAA(2)序列15资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：33个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：序列15
AAAAAAGGAT CCTTAGCTTT CTCTTAATTC TTT(2)序列16资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：33个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：序列16
AAAAAATCG ATATGAGCTT GTTAAATCAA CAT(2)序列17资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：33个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：序列17
AAAAAAGGAT CCTTAGCTCT CCTGGATGTA TTT(2)序列18资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：33个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：序列18
AAAAAAATCG ATATGCAAGC ATTGGCAAAG CGA(2)序列19资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：33个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：序列19
AAAAAAGGAT CCTTAAACTC CCAAAGCAGC ACG(2)序列20资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：33个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：序列20
AAAAAAATCG ATATGTCCTA CATATGTTCT CAA(2)序列21资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：21个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：序列21
GATCTAGAAT TCGGATCCGG T(2)序列22资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：10个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：未涉及
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白
(xi)序列描述：序列22
Asp Leu Glu Phe Met Thr Leu His Arg Asn
1               5                   10(2)序列23资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：32个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：序列23
AAAAAACTCG AGATACACTG CATAGAAATG AA(2)序列24资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：33个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：序列24
AAAAAAGAAT TCTTAAACTC CCAAAGCAGC ACG

Claims (110)

1.大体上纯的有生物活性的重组人甲胎蛋白，其含有一段大体上相同于图1的氨基酸1-389(序列9)或其片段的序列。
2.如权利要求1的纯的重组人甲胎蛋白，其中，所述人甲胎蛋白是用一种原核细胞生产的。
3.大体上纯的有生物活性的重组人甲胎蛋白，其含有一段大体上相同于图1的氨基酸198-590(序列10)或其片段的序列。
4.如权利要求3的纯的重组人甲胎蛋白，其中，所述甲胎蛋白是用一种原核细胞生产的。
5.大体上纯的有生物活性的重组人甲胎蛋白，其含有一段大体上相同于图1的氨基酸198-389(序列7)或其片段的序列。
6.如权利要求5的纯的重组人甲胎蛋白，其中，所述人甲胎蛋白是用一种原核细胞生产的。
7.大体上纯的有生物活性的重组人甲胎蛋白，其含有一段大体上相同于图1的氨基酸390-590(序列8)或其片段的序列。
8.大体上纯的重组人甲胎蛋白，其中，所述人甲胎蛋白是用一种原核细胞生产的。
9.大体上纯的有生物活性的重组人甲胎蛋白，其含有一段大体上相同于图1的氨基酸267-590(序列11)或其片段的序列。
10.如权利要求9的纯的重组人甲胎蛋白，其中，所述人甲胎蛋白是用一种原核细胞生产的。
11.一种治疗组合物，其含有权利要求1、3、5、7和9的大体上纯的人重组甲胎蛋白。
12.一种用昆虫细胞生产有生物活性的重组人甲胎蛋白或其片段或类似物的方法，包括：
(a)提供一种转化了的昆虫细胞，其含有一个编码所述人甲胎蛋白或其片段或类似物的重组DNA分子，该DNA分子可操作地和一个表达控制因子连接，由该控制因子指导所述人甲胎蛋白或其片段或类似物的表达；
(b)培养所述转化细胞；和
(c)回收所述有生物学活性的人甲胎蛋白或其片段或类似物。
13.如权利要求12的方法，其中，所述昆虫细胞是草地食夜蛾(Spodoptera frugiperda)。
14.用权利要求12的方法生产的大体上纯的人甲胎蛋白或其片段或类似物。
15.一种治疗组合物，其含有权利要求14的大体上纯的人甲胎蛋白或其片段或类似物。
16.一种抑制哺乳动物自身反应免疫细胞增殖的方法，该方法包括向所述哺乳动物给药治疗有效量的重组人甲胎蛋白或其免疫细胞抗增殖片段或类似物。
17.如权利要求16的方法，其中，所述免疫细胞包括T细胞。
18.如权利要求16的方法，其中，所述免疫细胞包括B细胞。
19.如权利要求16的方法，其中，所述哺乳动物是人类患者。
20.如权利要求16的方法，其中，所述重组甲胎蛋白是在一种原核细胞中生产的，而且是非糖基化的。
21.如权利要求20的方法，其中，所述原核细胞是大肠杆菌。
22.一种治疗哺乳动物自身免疫病的方法，该方法包括向所述哺乳动物给药治疗有效量的重组人甲胎蛋白或其免疫细胞抗增殖片段或类似物。
23.如权利要求22的方法，其中，所述自身免疫病是多发性硬化。
24.如权利要求22的方法，其中，所述自身免疫病是类风湿关节炎。
25.如权利要求22的方法，其中，所述自身免疫病是重症肌无力。
26.如权利要求22的方法，其中，所述自身免疫病是胰岛素依赖性糖尿病。
27.如权利要求22的方法，其中，所述自身免疫病是系统性红斑狼疮。
28.如权利要求22的方法，其中，所述重组甲胎蛋白是在一种原核细胞中生产的，而且是非糖基化的。
29.如权利要求28的方法，其中，所述原核细胞是大肠杆菌。
30.如权利要求16的方法，其中还包括向所述哺乳动物给药一种有效剂量的免疫抑制剂，该剂量低于单独使用所述免疫抑制剂的标准剂量。
31.如权利要求16的方法.其中还包括向所述动物给药一种耐受剂。
32.如权利要求30或31的方法，其中所述重组人甲胎蛋白是在原核细胞中生产的，而且是非糖基化的。
33.如权利要求32的方法，其中，所述原核细胞是大肠杆菌。
34.如权利要求30的方法，其中，所述免疫抑制剂是环孢菌素。
35.如权利要求30的方法，其中，所述免疫抑制剂是类固醇、硫唑嘌呤，FK-506或15-脱氧精胍菌素。
36.一种抑制哺乳动物肿瘤的方法，该方法包括向所述哺乳动物给药治疗有效量的重组人甲胎蛋白或其抗肿瘤片段或类似物。
37.如权利要求36的方法，其中，所述哺乳动物是人类患者。
38.如权利要求36的方法，其中，所述肿瘤是恶性肿瘤。
39.如权利要求38的方法，其中，所述恶性肿瘤是乳腺癌。
40.如权利要求38的方法，其中所述恶性肿瘤是前列腺癌。
41.如权利要求36的方法，其中，所述重组人甲胎蛋白是在原核细胞中生产的，而且是非糖基化的。
42.如权利要求41的方法，其中，所述原核细胞是大肠杆菌。
43.如权利要求36的方法，其中，所述肿瘤细胞能表达一种可由所述重组人甲胎蛋白识别的受体。
44.如权利要求36的方法，其中，所述肿瘤是癌。
45.如权利要求36的方法，其中，所述肿瘤是腺癌。
46.如权利要求36的方法，其中所述肿瘤是肉瘤。
47.如权利要求36的方法，其中，所述肿瘤增殖效应于雌激素。
48.如权利要求36的方法，其中，所述的给药能抑制所述哺乳动物的所述肿瘤的细胞增殖。
49.如权利要求36的方法，其中，所述的给药能杀死所述哺乳动物的所述肿瘤的细胞。
50.如权利要求36的方法，其还包括向所述哺乳动物给药一种有效量的化疗剂，该剂量低于单独使用所述疗剂时的标准剂量。
51.一种预防哺乳动物产生肿瘤的方法，其包括向所述哺乳动物给药治疗有效量的重组人甲胎蛋白。
52.如权利要求51的方法，其中，所述重组人甲胎蛋白是在一种原核细胞中产生的，而且是非糖基化的。
53.如权利要求52的方法，其中，所述原核细胞是大肠杆菌。
54.一种杂合细胞毒素，其含有与一种细胞毒性剂连接的重组人甲胎蛋白。
55.如权利要求54的杂合细胞毒素，其中，所述细胞毒性剂是一种蛋白。
56.如权利要求54的杂合细胞毒素，其中，所述细胞毒性剂通过化学方法和所述重组人甲胎蛋白缀合。
57.如权利要求54的杂合细胞毒素，其中，所述细胞毒素是通过一个肽键与所述重组人甲胎蛋白连接，所述杂合毒素是通过表达遗传工程的杂合DNA分子而产生的。
58.一种可检测地标记的重组人甲胎蛋白或其可检测地标记的片段或类似物，其能够与人类肿瘤细胞结合。
59.如权利要求58的分子，其被用一种放射性核素标记。
60.如权利要求59的分子，其中，所述放射性核素是锝-99m。
61.如权利要求58的分子，其中，所述重组人甲胎蛋白是在原核细胞中生产的，而且是非糖基化的。
62.如权利要求61的分子，其中，所述原核细胞是大肠杆菌。
63.一种在活体内对人类患者的具肿瘤细胞的部位进行显像的方法，该方法包括：
(a)提供一种权利要求58的可检测地标记的分子；
(b)向所述患者给药该分子；
(c)让所述标记分子和含有所述细胞的部位结合，并将未结合的分子从所述的具肿瘤细胞的部位清除；和
(d)获得所述含肿瘤细胞部位的图像。
64.如权利要求63的方法，其中，所述部位是乳腺。
65.如权利要求63的方法，其中，所述部位是前列腺。
66.如权利要求63的方法，其中，所述部位是骨髓。
67.如权利要求63的方法，其中，所述部位是肝脏。
68.如权利要求63的方法，其中，所述图像是用闪烁照像法获得的。
69.一种诊断生物样品中的肿瘤的方法，该方法包括：
(a)将所述生物样品与权利要求58的可检测地标记了的分子结合；和
(b)检测所述与该样品结合的标记，其中，当标记检测高于背景水平时表明患者患有肿瘤。
70.如权利要求69的方法，其中，所述生物样品含有在所述接触步骤之前被固定和切片的细胞，而且所述和该样品结合的标记与相当于该细胞的细胞膜的部位结合。
71.如权利要求69的方法，其中，所述生物样品获自人类患者的乳腺。
72.如权利要求69的方法，其中，所述生物样品获自人类患者的前列腺。
73.一种体内检测哺乳动物的肿瘤的方法，包括：
(a)给药一种诊断有效量的权利要求58的可检测地标记的分子；和
(c)检测与所述哺乳动物组织结合的所述可检测标记的存在，其中，当标记的量是高于背景水平时表明在所述哺乳动物体内存在肿瘤。
74.如权利要求73的方法，其中，所述哺乳动物是被怀疑患有乳腺癌的人类患者，而所述组织是乳腺组织。
75.如权利要求73的方法，其中，所述哺乳动物是被怀疑患有前列腺癌的人类患者，而所述组织是前列腺组织。
76.如权利要求73的方法，其中，所述可检测标记是放射性核素，而所述检测步骤是通过放射性显像实现的。
77.如权利要求76的方法，其中，所述放射性核素是锝-99m，而所述放射性显像是闪烁照像法。
78.一种试剂盒，其具有
(a)含有重组人甲胎蛋白或其片段或类似物的第一试剂；和
(b)含有一种可检测标记的第二试剂。
79.如权利要求78的试剂盒，其中，所述可检测标记是放射性核素。
80.如权利要求79的试剂盒，其中，所述放射性核素是锝-99m。
81.如权利要求79的试剂盒，其中，所述放射性核素包括碘或铟。
82.如权利要求78的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括用于连接所述可检测标记和所述重组人甲胎蛋白或其片段或类似物的第三试剂。
83.如权利要求78的试剂盒，其中，所述可检测标记包括酶、荧光团或抗体。
84.如权利要求78的试剂盒，其还包括用于检测所述和重组甲胎蛋白或其片段或类似物连结的可检测的标记。
85.如权利要求78的试剂盒，其中，所述重组人甲胎蛋白是在原核细胞中生产的，而且是非糖基化的。
86.如权利要求78的试剂盒，其中，所述原核细胞是大肠杆菌。
87.一种细胞培养基，含有重组人甲胎蛋白或其片段或类似物。
88.如权利要求87的培养基，其中，所述重组人甲胎蛋白是在原核细胞中生产的而且是非糖基化的。
89.如权利要求88的培养基，其中，所述原核细胞是大肠杆菌。
90.一种细胞培养方法，该方法包括(a)提供权利要求87的培养基；(b)提供一种细胞；和(c)在所述培养基中生长所述细胞，其中，所述细胞增殖并被维持。
91.如权利要求90的方法，其中，所述细胞是哺乳动物细胞。
92.如权利要求91的方法，其中，所述细胞是骨髓细胞。
93.如权利要求92的方法，其中，所述骨髓细胞是T细胞。
94.如权利要求92的方法，其中，所述骨髓细胞是天然杀伤细胞。
95.如权利要求92的方法，其中，所述骨髓细胞是淋巴细胞。
96.如权利要求91的方法，其中，所述细胞是杂交瘤。
97.如权利要求90的方法，其中，所述方法包括来自体内的细胞培养。
98.一种抑制哺乳动物的骨髓毒性的方法，包括向所述哺乳动物给药治疗有效量的重组人甲胎蛋白或其骨髓毒性抑制类似物或片段。
99.如权利要求98的方法，其中，所述哺乳动物是人类患者。
100.如权利要求99的方法，其中，所述重组人甲胎蛋白是在原核细胞中生产的，而且是非糖基化的。
101.如权利要求100的方法，其中，所述原核细胞是大肠杆菌。
102.一种抑制哺乳动物骨髓细胞增殖的抑制作用的方法，该方法包括向所述哺乳动物给药有效量的重组甲胎蛋白或其抗抑制片段或类似物。
103.如权利要求102的方法，其中，所述重组人甲胎蛋白是在一种原核细胞中生产的，而且是非糖基化的。
104.如权利要求103的方法，其中，所述原核细胞是大肠杆菌。
105.一种促进哺乳动物骨髓增殖的方法，该方法包括向所述哺乳动物给药有效量的重组人甲胎蛋白或其细胞刺激片段或类似物。
106.如权利要求105的方法，其中，所述重组人甲胎蛋白是在原核细胞生产的，而且是非糖基化的。
107.如权利要求106的方法，其中，所述原核细胞是大肠杆菌。
108.一种抑制哺乳动物骨髓细胞移植排斥的方法，该方法包括向所述动物给药有效量的重组人甲胎蛋白或其抗排斥片段或类似物。
109.如权利要求108的方法，其中，所述重组人甲胎蛋白是在原核细胞中生产的，而且是非糖基化的。
110.如权利要求109的方法，其中，所述原核细胞是大肠杆菌。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105732795A (zh) * 2016-03-21 2016-07-06 海南医学院 一种获得人类甲胎蛋白的方法
CN112898399A (zh) * 2019-12-03 2021-06-04 香雪生命科学技术（广东）有限公司 源自于afp抗原的短肽
CN113416729A (zh) * 2021-05-18 2021-09-21 遵义医科大学附属医院 一种肝脏靶向调控甲胎蛋白基因的shRNA和cDNA及其应用

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5965528A (en) 1991-09-27 1999-10-12 Mcgill University Recombinant human alph-fetoprotein as an immunosuppressive agent
US6288034B1 (en) 1995-01-24 2001-09-11 Martinex R & D Inc. Recombinant human alpha-fetoprotein as an immunosuppressive agent
US7098306B2 (en) 1997-02-13 2006-08-29 The Regents Of The University Of California Method and compositions for treating hepatocellular cancer
CN1739791A (zh) * 1997-02-13 2006-03-01 加利福尼亚大学董事会 肝细胞癌的预防及治疗
JP2002534077A (ja) * 1999-01-06 2002-10-15 アトランティック バイオファーマシューティカルズ インコーポレイティッド トランスジェニック動物における分泌型ヒトアルファ−フェト蛋白質の発現
US7208576B2 (en) 1999-01-06 2007-04-24 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Non-glycosylated human alpha-fetoprotein, methods of production, and uses thereof
US7022892B1 (en) 1999-07-12 2006-04-04 Universite Libre De Bruxelles Non-human genetically modified mammal lacking the alpha-fetoprotein
WO2001003501A2 (en) * 1999-07-12 2001-01-18 Universite Libre De Bruxelles Non-human genetically modified mammal lacking the alpha-fetoprotein
EP1253930A4 (en) * 2000-02-10 2003-05-21 Univ California METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING HEPATOCELLULAR CANCER
FI118263B (fi) * 2002-10-09 2007-09-14 Timo Kalevi Korpela Kaspaasiaktiivisuutta säätelevät peptidit
US7074561B2 (en) * 2002-10-22 2006-07-11 Biomerieux, Inc. Isothermal amplification based assay for the detection and quantitation of alpha-fetoprotein mRNA
US20060111289A1 (en) * 2004-09-09 2006-05-25 Serometrix, Llc, Compositions and methods of using Alpha-fetoprotein growth inhibitory peptides
US8932829B2 (en) 2005-07-07 2015-01-13 Elena Dudich Recombinant alpha-fetoprotein and compositions thereof
GB0617564D0 (en) * 2006-09-06 2006-10-18 Ucl Business Plc Peptides and methods
EP2111230A4 (en) * 2006-12-19 2010-11-17 Merrimack Pharmaceuticals Inc COMMON ADMINISTRATION OF ALPHA-FETOPROTEIN AND AN IMMUNOMODULATING AGENT TO TREAT MULTIPLE SCLEROSE
WO2008113970A2 (en) * 2007-03-16 2008-09-25 Ucl Business Plc Peptides

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5486602A (en) * 1977-10-27 1979-07-10 Hoffmann La Roche Production of purified alpha 1 phetoprotein
JPH025866A (ja) * 1988-06-27 1990-01-10 Kansai Shin Gijutsu Kenkyusho:Kk ヒトアルファフェトプロテインドメインｉ遺伝子、対応プラスミド組換体、対応形質転換体、該ドメインｉの製造法及び製造された該ドメインｉ
IT1226551B (it) * 1988-07-29 1991-01-24 Sclavo Spa Peptide sintetico immunologicamente attivo capace di indurre la produzione di anticorpi con elevata specificita' verso l'alfa- fetoproteina e loro impiego in campo diagnostico
EP0356399A3 (en) * 1988-08-26 1991-03-20 Sandoz Ag Substituted 4-azatricyclo (22.3.1.04.9) octacos-18-ene derivatives, their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US5342625A (en) * 1988-09-16 1994-08-30 Sandoz Ltd. Pharmaceutical compositions comprising cyclosporins
US5206153A (en) * 1990-06-27 1993-04-27 Snow Brand Milk Products Co., Ltd. Method of producing human α-fetoprotein and product produced thereby
AU2649592A (en) * 1991-09-25 1993-04-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Complexes of anthracycline antibiotics with polyunsaturated fatty acids in lipid emulsions
CA2120131A1 (en) * 1991-09-27 1994-05-11 Robert A. Murgita Expression and purification of cloned human alpha-fetoprotein
WO1996010199A1 (de) * 1994-09-26 1996-04-04 Siemens Aktiengesellschaft Koppelanordnung zum optischen aneinanderkoppeln eines oeic-bausteins und optischer fasern

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105732795A (zh) * 2016-03-21 2016-07-06 海南医学院 一种获得人类甲胎蛋白的方法
CN112898399A (zh) * 2019-12-03 2021-06-04 香雪生命科学技术（广东）有限公司 源自于afp抗原的短肽
CN113416729A (zh) * 2021-05-18 2021-09-21 遵义医科大学附属医院 一种肝脏靶向调控甲胎蛋白基因的shRNA和cDNA及其应用

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Publication number Publication date
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