CN1549826A - 治疗糖尿病的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明主要涉及促进胰岛素运输通过生物膜的嵌合肽和组合物，涉及制备该嵌合肽的方法，以及治疗糖尿病患者的方法。

Description

治疗糖尿病的组合物和方法
技术领域
本发明主要涉及治疗糖尿病的组合物和方法，且更具体地涉及增加血清胰岛素水平的组合物。
背景技术
糖尿病是一种折磨着将近1600万美国人的疾病。I型糖尿病或者少年型糖尿病的特点是胰岛素的绝对缺乏并依赖于外源性胰岛素来维持生命。有将近80万-160万人已经被诊断为I型糖尿病。II型糖尿病是一种体内不能有效地利用所产生的胰岛素而造成的代谢性疾病。将近1500万人有II型糖尿病。所有的花费(间接和直接)超过9800万美元。
目前I型糖尿病的长期治疗主要依赖于皮下注射外源性胰岛素。但是这种治疗不能提供最佳的代谢调控，因为该治疗不能模仿胰岛素分泌微妙的时时刻刻的调节，这种调节的发生通常与食物、运动等有关。随着生物工程技术的进步，生产了各种不同类型的胰岛素，然而尽管这些胰岛素有着不同的作用开始时间、峰时间和持续时间，仍很难在整天时间内有效地控制葡萄糖的水平。当糖尿病患者注射胰岛素时，周围的组织暴露于更高水平的胰岛素中，以致在这些对象中更难合适地调控肝脏代谢。尽管每日多次(2-4次)注射已经取得了较好的接近正常血糖的代谢控制，但是如此多次注射的不便限制了这种方案的广泛应用。
最方便的、轻松的、可接受的、及最容易的给药途径是口服给药。相对于其他粘膜，作为给药部位的胃肠道粘膜有着一些优点。这些优点包括如下：(1)口服给药途径对于绝大多数人是通用的、便利的和可接受的给药方式；(2)胃肠道上皮提供了可用于吸收的大量表面积；(3)胃肠道上皮与非常多的血管供应有着紧密的联系。激素，例如胰岛素必需经过皮下途径给药，因为它们不能通过上消化道的“严酷”环境。与皮下注射不同，口服给予胰岛素能模仿生理的胰岛素从胰腺到肝门静脉循环的运输，就象在健康的非糖尿病个体中所见的那样。然而，口服给予完整的胰岛素事实上被认为是不可能的。在最好的实验条件下，只有不超过0.5％的口服给予的胰岛素被吸收。即使少量的胰岛素能奇迹般地通过上消化道，但是由于激素分子是相当大的且为亲水性的，这使得它不能通过肠屏障。
发明内容
本发明涉及嵌合胰岛素肽，该嵌合胰岛素肽可以有效地增加血清胰岛素浓度和降低血清葡萄糖浓度。本发明也提供了一种治疗I型糖尿病或II型糖尿病患者的方法。
本发明的组合物部分是基于以下的发现：Diatos肽载体(DPV)可以帮助那些通常不能运输通过生理学屏障的分子运输通过生理学屏障，以及更特异的是肠上皮屏障。例如，利用所述的DPV可以将诸如胰岛素的大分子运输通过肠上皮屏障。
在本发明的各个方面提供了一种嵌合肽。该嵌合肽能穿透生物膜，比如细胞膜、线粒体膜或核膜。同样的，该嵌合肽可以通过生理学屏障，比如胃肠屏障、血脑屏障、皮肤屏障、气道上皮屏障、横粘膜屏障、鼻内屏障和眼屏障。
在一个方面，本发明提供了一种有着第一结构域和第二结构域的嵌合肽。第一结构域是转运序列，它促进主动运输通过生物膜，第二结构域至少是胰岛素多肽的一部分。
转运序列是脂蛋白的一部分。另外，转运序列至少有四个碱性氨基酸，例如赖氨酸或精氨酸。优选地，转运序列结合一种氨基聚糖(aminoglycan)，比如肝素或硫酸软骨素。
第一结构域是一种选自如下一组的氨基酸序列：a)(XBBBXXBX)n；b)(XBBXBX)n；c)(BBXmBBXo)n；d)(XBBXXBX)n；和e)(BXBB)n，其中B是一种碱性氨基酸；X是一种非碱性氨基酸；每个m独立地是从0到5的一个整数；每个n独立地是1到10之间的一个整数；每个o独立地是0到5之间的一个整数。在特定实施方式中，n可以是2或3，而X可以是疏水性氨基酸。
第一结构域的氨基酸序列的长度是少于100个氨基酸；少于50个氨基酸；少于25个氨基酸。优选地，第一结构域氨基酸序列是GKRKKKGKLGKKRDP(SEQ ID NO：30，DPV7)或SSRRARRSPRHLGSG(SEQ ID NO：35，DPV10)。
嵌合肽进一步可以包括一种抗体片段的氨基酸序列，比如a)人抗DNA抗体的CDR3区域；b)人抗DNA抗体的CDR2区域；c)鼠抗DNA抗体的CDR3区域；d)鼠抗DNA抗体的CDR2区域。
在其他方面，本发明提供了一种有着第一结构域、第二结构域以及第三结构域的嵌合肽。第一和第二结构域包括a)(XBBBXXBX)n；b)(XBBXBX)n；c)(BBXmBBXo)n；d)(XBBXXBX)n；e)(BXBB)n或f)(一种抗体片段)n的一种氨基酸序列，其中B是一种碱性氨基酸；X是一种非碱性氨基酸；每个m独立地是从0到5的一个整数；每个n独立地是1到10之间的一个整数；每个o是0到5之间的一个整数。第一结构域不同于第二结构域。第三结构域至少是胰岛素多肽的一部分。嵌合肽运输通过生物膜或生理学屏障。
仍在另一个方面，本发明提供了一种嵌合肽，其包括a)抗DNA抗体的CDR3区域的至少一部分；b)抗DNA抗体的CDR2区域的至少一部分；c)胰岛素多肽的至少一部分，其中该肽运输通过生物膜。
本发明也提供了嵌合肽和一种载体的组合物。该组合物适合于口服给药。
在另一个方面，本发明提供了一种包括本发明组合物的试剂盒。
本发明也提供了通过将本发明的组合物和细胞接触以降低细胞内葡萄糖水平或增加胰岛素水平的方法。或者，通过将本发明的组合物给予有此需要的对象可以降低对象血清中的葡萄糖水平和增加胰岛素水平。
除非另外的定义，在此使用的技术和科学术语有着和本发明所属领域人员通常所理解的同样意义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用和这里所描述的相似或相同的方法和材料，下面描述了合适的方法和材料。在此将所有的出版物、专利申请书、专利和其他这里所提及的参考物并入作为参考。对于有冲突的部分，将对照现有的说明书，包括定义。另外，材料、方法和实施例都仅仅是举例说明的，并不是特别限定的。
附图说明
图1显示了制备用于表达含有本发明的肽的重组蛋白的载体的示意图。
图2是表示D-[14C]-甘露醇和L-[3H]脯氨酸运输动力学的线性图。
图3是表示在有着30μg/ml DVP-胰岛素(A)或DPV10-胰岛素(B)时的D-[14C]-甘露醇和L-[3H]脯氨酸运输动力学的线性图。
图4是表示在没有(对照)或者有30μg/ml DVP或DPV10的情况下孵育8小时后与细胞相关的D-[14C]-甘露醇和L-[3H]脯氨酸的条形图。
图5是表示顶端培养基中胰岛素和DPV-胰岛素缀合物水平的条形图。
图6是显示细胞裂解物中DPV-胰岛素缀合物水平的时间函数的条形图。
具体实施方式
本发明提供了含有嵌合胰岛素肽的组合物，它能有效地提高血清胰岛素浓度和降低血清葡萄糖浓度。该嵌合肽可以被用于调节对象的胰岛素生物利用率。本发明的嵌合肽或编码这些嵌合肽的核酸能被加入到药物组合物中并将其施用于对象以治疗I型或II型糖尿病。
在本发明的各个方面提供了一种嵌合肽，包括含有转运序列的第一结构域，它被可操纵地连接于含有胰岛素多肽的至少一部分的第二结构域。所述的第一和第二结构域在该肽中可以是任何顺序的，且该肽所包括的每一种结构域可以是一或多个。
在此所指的“嵌合蛋白”或“嵌合肽”包括胰岛素多肽的至少一部分被可操纵地连接于非胰岛素多肽。“胰岛素多肽”指的是一种具有胰岛素多肽的氨基酸序列或相应于胰岛素多肽的氨基酸序列的至少一部分的多肽，或者指一种具有胰岛素多肽的氨基酸序列或相应于胰岛素多肽的氨基酸序列的至少一部分的多肽的编码核酸。反之，“非胰岛素多肽”指的是具有相应于与胰岛素基本上不具有同源性的蛋白的氨基酸序列的一种多肽，例如一种来源于相同或不同的有机体的、不同于胰岛素多肽或其片段的蛋白。在胰岛素嵌合肽中，该胰岛素多肽可以是完整胰岛素多肽或它的一部分。
术语“可操纵地连接”被特定地用于表示第一和第二结构域通过化学方法进行连接(最典型地是通过共价键，例如肽键)以使得其具有至少一种与胰岛素多肽相关的功能。当用于表示编码嵌合肽的核酸时，术语“可操纵地连接”意思是在读码框内(in-frame)第一结构域和胰岛素多肽彼此融合。该第一结构域可以被融合于胰岛素多肽的N末端或C末端。
“转运序列”指的是任何的氨基酸序列，它可以指导它所在的肽到细胞的指定目的位置。因此，转运序列可以指导或促进肽穿过生物膜，例如磷脂膜、线粒体膜或核膜。例如转运序列指导肽从细胞外侧通过细胞膜到细胞浆或到细胞内的指定位置，比如细胞核、核糖体、线粒体、内质网、溶酶体或过氧化物酶体。或者或另外的，转运序列可以指导肽通过生理学屏障例如血脑屏障、粘膜屏障或血大脑、血视网膜、胃肠道和肺屏障。
可以用各种方法来确定转运，也就是穿过生物膜或生理学屏障，例如通过细胞穿透实验，其步骤包括首先将嵌合肽在有培养的细胞的情况下进行孵育，接着是固定步骤和增加细胞的通透性，然后是验证在细胞内存在嵌合肽。可以将细胞和一种标记的并直接对抗于嵌合肽的抗体进行另一次孵育，之后通过在细胞浆或非常靠近细胞核的位置或甚至在细胞核内检测序列和标记抗体的免疫反应来进行该验证步骤。也可以通过标记本发明的氨基酸序列以及检测细胞成分中标记物的存在来进行验证。上述的细胞穿透实验被描述于专利申请No.WO 97/02840。
转运可以需要能量，也就是主动运输(active transport)。同样的，转运可以不需要能量，也就是被动运输(passive transport)。
转运序列可以是任何长度。例如转运序列的长度少于600个氨基酸，例如少于或等于500、250、150、100、50、25、或10个氨基酸。转运序列至少由四个碱性氨基酸组成。
转运序列来源于已知序列。例如，转运序列可以包括来自脂蛋白的序列，例如人脂蛋白B、人脂蛋白E；和免疫球蛋白分子的序列，例如CDR2或CDR3区域、集聚蛋白(agrine)、FGF、或PGF。
优选地，转运的进一步特点是它与肝素、硫酸软骨素及它们的衍生物反应的能力。肽结合一种葡糖氨基聚糖(GAG)或，更常见的是结合一种氨基聚糖，且具体地是肝素，肝素硫酸盐和硫酸软骨素同上述肽一样可以是天然来源的或人造的。可以使用它们的天然的或聚合物(二聚体、三聚体等)的形式。“肝素或硫酸软骨素衍生物”或“氨基聚糖样肝素或硫酸软骨素”被理解为指的是任何在所参考的出版物(Cardin &Weintraub，动脉硬化9：21(1989)；Merton等，Annu.Rev.Cell Biol.8：365(1992)；David，FASEB J.7：1023(1993))中所定义的产品或替代产品。
转运序列的实例包括包含有以下结构中的一种氨基酸序列的肽：a)(XBBBXXBX)n；b)(XBBXBX)n；c)(BBXmBBXo)n；d)(XBBXXBX)n；e)(BXBB)n，或f)(一种抗体片段)n，其中B是一种碱性氨基酸，X是一种非碱性氨基酸，优选的是疏水性氨基酸，例如丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸或酪氨酸；m独立地是0和5之间的一个整数；n独立地是1和10之间的一个整数，优选的是1和3之间；o独立地是0和5之间的一个整数。
抗体片段的意思为包括小于全长免疫球蛋白的多肽，例如重链、轻链、Fab、Fab2、Fv或Fc。例如抗体可以是人或鼠的。优选的抗体是抗DNA抗体。优选地，抗体片段包括抗体的完整或部分CDR2区域。同样的，抗体包括抗体的完整或部分CDR3区域。更特异的，抗体片段包括人抗DNA抗体的一个CDR3区域，例如RTT79，NE-1和RT72。
“完整或部分”可以被理解为抗体片段可以包括提及的完整CDR区域或仅仅其部分，条件是载体仍保留了穿透细胞的能力(功能同源物)。“部分CDR区域”被理解为去除了一或多个氨基酸的CDR区域。这也可以是删除了或用其他的氨基酸取代了一或多个内在残基的CDR区域，进行取代的优选的氨基酸是同一性质的氨基酸(例如碱性氨基酸)。
典型的转运序列包括SEQ ID NO：1-48。优选的转运氨基酸序列是GKRKKKGKLGKKPDP(SEQ ID NO：30)和SSRRARRSPRHLGSG(SEQ ID NO：35)。通常的，第一结构域的氨基酸序列的长度少于100个氨基酸；小于50个氨基酸；或少于25个氨基酸。优选地，第一结构域的长度在6个和25个氨基酸之间。
术语“胰岛素”在此应当被解释为包括胰岛素类似物、天然分泌的胰岛素、或重组生成的有生物学活性的胰岛素。生物学活性指的是具有能抑制或防止糖尿病的疾病症状的能力的分子，例如降低血糖。生物学活性胰岛素包括前胰岛素原、胰岛素原、胰岛素α链、胰岛素β链和成熟胰岛素，例如α和β链。胰岛素可以来源于任何物种，例如人、牛、猪、马、犬或鼠。
该术语旨在涵盖在糖尿病的治疗中通常使用的以基本上纯化的形式存在的多肽，但是该术语也涵盖了这些多肽的可商品化获得的药用形式，它包含有附加的赋形剂。本发明所使用的胰岛素可以来自于多个商业来源例如诺华实验室(Danbury，Conn.)，Nordisk-USA(Rockville，Md.)和EliLilly and Co.(Indianapolis，Id.)。在实践本发明方法时，可以使用猪源胰岛素、人半合成胰岛素(Nordisk-USA)和克隆重组胰岛素(Eli Lilly)。优选的胰岛素是重组合成的以及可以是脱水的或水溶液的。
术语“胰岛素类似物”及其类似的表述在此是可相互替换的并特定地包括任何形式的上述“胰岛素”，其中多肽链的一或多个氨基酸已经被替换氨基酸所取代和/或其中一或多个氨基酸已经被删除或其中一或多个附加氨基酸已经被添加于多肽链或氨基酸序列中，它们仍有着天然胰岛素的至少一种功能，例如降低血糖水平。通常，本发明的术语“胰岛素类似物”包括“赖脯胰岛素(insulin lispro)类似物”，如在美国专利No.5,547,929中所描述的，在此将其全文并入做为参考；胰岛素类似物包括LysPro胰岛素和Humalog胰岛素，以及其他的“超级胰岛素类似物”，其中比较于传统的胰岛素，这些胰岛素类似物影响血糖水平的能力被相当地强化，以及肝选择性(hepatoselective)胰岛素类似物在肝脏比在脂肪组织中更有活性。优选的类似物是单体胰岛素类似物，它们是用于和胰岛素相同目的的胰岛素样化合物，例如赖脯胰岛素，也就是给药后能降低血糖水平的化合物。
新的胰岛素A链突变物也可以用于本发明。人胰岛素A链类似物保留了残基CysA6和CysA11之间的天然分子内二硫键，并在7号位和30号位用丝氨酸取代了在天然胰岛素中与B链形成链间二硫键桥的半胱氨酸。
利用编码胰岛素的序列构建胰岛素多肽，和/或编码胰岛素的核酸在技术上是熟知的。胰岛素多肽和编码胰岛素多肽的核酸的来源包括基因库登记号600165A；550085A；AAH05255；AAA59179并在此将它们的全文并入做为参考。
典型的胰岛素分子包括，但不局限于：
GIVEQCCTSICSLYQLENYCNFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTP
KT(SEQ ID NO：52，人胰岛素)；
GIVEQCCTSICSLYQLENYCNFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYT
KPT(SEQ ID NO：53，人赖脯胰岛素)；
GIVEQCSTSICSLYQLENYSNFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTP
KT(SEQ ID NO：54，人“微胰岛素”)；
GIVEQCCASVCSLYQLENYCNFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYT
PKA(SEQ ID NO：55，牛胰岛素)；以及
GIVEQCCTSICSLYQLENYCNFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTP
KA(SEQ ID NO：56，猪胰岛素)。
如果需要，一或多个氨基酸可以被额外地插入到含有转运序列的第一肽部分和包括胰岛素的第二多肽部分的中间。在一些实施方案中，第一或第二结构域包括促进转运序列和胰岛素连接的序列。
在一个实施方案中，嵌合肽包括胰岛素多肽的至少一个生物学活性部分。在另一个实施方案中，嵌合肽包括胰岛素多肽的至少两个生物学活性部分。仍在另一个实施方案中，嵌合肽包括胰岛素多肽的至少三个生物学活性部分。
利用任何技术上已知的方法可以通过化学结合连接转运序列和胰岛素序列。许多已知的化学交联方法是非特异的，也就是说它们的结合点不指向于转运序列或胰岛素的任何特异位点。因此，使用非特异的交联试剂可能攻击功能性位点或空间性地阻断活性位点，引起缀合蛋白的生物学失活。
增加结合特异性的一个方法是直接地化学结合于功能性基团，在被交联的一个或两个多肽中只有一个或少数几个这些基团。例如，在许多蛋白中只有少数几个唯一含有巯基的蛋白氨基酸的半胱氨酸。又例如，如果多肽不含有赖氨酸残基，特异性针对于主胺的交联试剂将被结合于多肽的氨基末端。成功地利用这种增加结合特异性的方法就要求多肽在分子的某些部位有着合适的、稀少的和活性的残基，这些部位可以被改变且不丢失分子的生物学活性。
当半胱氨酸存在于部分多肽序列，且它们能参与于交联反应而不影响生物学功能，这些半胱氨酸残基可以被取代。当半胱氨酸残基被取代时，通常要求造成多肽折叠结构的改变达到最小。当取代物是与半胱氨酸化学和结构相似时，多肽折叠结构的改变可以达到最小。基于这些原因，丝氨酸是优选的半胱氨酸的取代物。如在下面的实施例中所描述的，半胱氨酸残基可以被引入多肽的氨基酸序列以用于交联。当半胱氨酸残基被引入时，优选的是引入于在或接近于氨基或羧基末端。无论感兴趣的多肽是通过化学合成或重组DNA表达所产生，都可以得到更改这些氨基酸序列的传统方法。
通过一种结合或缀合试剂可以实现两种成分的结合。这里有一些可以使用的分子间交联的试剂，见例如Means和Feeney，蛋白质的化学修饰，Holden-Day，1974，pp.39-43。这些试剂是例如，3-(2-联硫基吡啶)丙酸J-琥珀酰亚胺酯(J-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate，SPDP)或N，N′-(1，3-亚苯基)双马来酰亚胺(N，N′-(1，3-phenylene)bismaleimide)(两者都是高度特异于巯基并形成不可逆连接)；N，N′-亚乙基-双-(碘乙酰胺)(N，N′-ethylene-bis-(iodoacetamide))或其他有着6到11碳亚甲基桥的试剂(它们相对特异于巯基)；以及1，5-二氟-2，4-二硝基苯(1，5-difluoro-2，4-dinitrobenzene)(它与氨基和酪氨酸基团形成不可逆连接)。其他有用的交联试剂包括：p，p′-二氟-m，m′-二硝基二苯砜(p，p′-difluoro-m，m′-dinitrodiphenylsulfone)(它与氨基和苯酚基形成不可逆交联)；己二(亚胺酸)二甲酯(dimethyl adipimidate)(它特异于氨基)；苯酚-1，4-二磺酰氯(phenol-1，4-disulfonylchloride)(它主要和氨基反应)；1，6-己二异氰酸酯(hexamethylenediisocyanate)或二异硫氰酸酯(diisothiocyanate)，或苯偶氮基-p-二异氰酸酯(azophenyl-p-diisocyanate)(它主要和氨基反应)；戊二醛(它和一些不同的侧链反应)以及disdiazobenzidine(它主要和酪氨酸和组氨酸反应)。
交联试剂可以是同双功能的(homobifunctional)，就是说有着两个进行同一反应的功能基团。优选的同双功能交联试剂是二顺丁烯二酰亚胺己烷(＂BMH＂)。BMH含有两个顺丁烯二酰亚胺功能性基团，它在温和条件下(pH6.5-7.7)特异地与含巯基化合物反应。顺丁烯二酰亚胺基团间通过烃链连接。因此，BMH能用于含半胱氨酸残基多肽的不可逆交联。
交联试剂也可以是异双功能的(heterobifunctional)。异双功能交联试剂有着两个不同的基团，例如一个氨基反应基团和巯基反应基团，它将相应地交联两个有着自由氨基和巯基的蛋白。异双功能交联试剂的例证是4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(succinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(＂SMCC＂))，m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester(＂MBS＂))，以及4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(succinimide 4-(p-maleimidophenyl)butyrate(＂SMPB＂))，MBS的伸展链同类物。这些交联试剂的琥珀酰亚胺基基团和主胺基反应，而与巯基反应的顺丁烯二酰亚胺和半胱氨酸残基的巯基形成共价键。
交联试剂通常有着低水溶性。可以在交叉试剂中加入亲水基团，例如磺酸基以提高它们的水溶性。磺酸MBS和磺酸SMCC是交联试剂水溶性变更后的实例。
许多交联试剂形成的结合在细胞内条件下基本上是不可降解的。然而，一些交联试剂含有的共价键，例如二硫键，它在细胞条件下是可降解的。例如，Traut′s试剂、二硫双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(＂DSP＂)、以及N-琥珀酰亚胺基-3-(2-联硫基吡啶)丙酸酯(＂SPDP＂)是已知的可降解交联试剂。使用可降解交联试剂使得胰岛素在输送进靶细胞后可以和转运序列分离。直接的二硫键也可能是有用的。
许多交联试剂，包括上述的那些都是可商业化获得的。容易从供应商中得到它们的详细的使用说明。常用的蛋白质交联和缀合制备的参考文献是：Wong，蛋白质缀合和交联的化学，CRC出版社(1991)。
化学的交联可以包括使用隔离臂(spacer arm)。隔离臂提供了分子内的灵活性或调整分子内缀合部分之间的距离，并因此可以帮助保持生物学活性。隔离臂可以是含有隔离氨基酸如脯氨酸的多肽亚基的形式。同样的，隔离臂可以是交联试剂的一部分，例如在“长链SPDP”中(PierceChem.Co.，Rockford，IL.，cat.No.21651 H)。
嵌合肽可以连接有一或多个附加亚基，例如，嵌合肽可以再连接于GSU蛋白，其中嵌合肽融合于GST序列(就是谷胱苷肽S转移酶)的C末端。这些融合蛋白可以促进嵌合肽的纯化。
同样的，嵌合肽可以生产为融合肽，它包括转运序列和胰岛素序列，并能在已知的合适的宿主细胞中方便表达。可以按照类似于标准的重组DNA技术的方法或对其进行容易的修改而制备和使用如这里所描述的融合肽。
通常的，本发明的氨基酸序列(SEQ ID NO：1-48)包括大量的碱性氨基酸，例如是赖氨酸、精氨酸或组氨酸。“大量”应当被理解为至少等于3。
一个特别感兴趣的氨基酸序列是序列SEQ ID NO：1，特点是(1)在至少二聚体状态下，它具有所需的特性；以及(2)在单体或多聚体状态下，它就所述的特性赋予另一种与其结合的氨基酸序列或者在该序列已经具有该特性时进一步增强这些特性。相似的，设计的肽DPV3、(DPV3)2、DPV6、DPV7、DPV10和DPV13具有这种增加能力。
本发明也提供了增加血清胰岛素水平或降低血清或细胞内葡萄糖水平的方法。在这些有此需要的对象中降低血葡萄糖水平和增加胰岛素水平。通过给予一种包含本发明嵌合肽的组合物以增加血清或细胞内胰岛素水平或降低血清或细胞内葡萄糖水平。利用本领域已知的方法通过测定血糖或胰岛素水平来鉴定对象。如果对象的胰岛素或葡萄糖水平不在正常范围内，那么对象就需要增加血清胰岛素或降低葡萄糖水平。
正常的葡萄糖水平是60-120mg/dl。正常胰岛素水平是7mU/mL±3mU。例如如果对象的血糖水平高于120mg/dl，那么对象就需要降低血糖水平。相反的，对象的葡萄糖水平如果在60-120mg/dl之间，那么血糖水平就不需要降低。优选地，在给药后对象的血糖是至少在60-120mg/dl之间。如果例如血清胰岛素水平小于4mU/mL，那么对象需要增加胰岛素水平。优选地，给药后的胰岛素水平是7mU/mL±3mU。
另外，本发明提供了一种治疗或预防糖尿病的方法，它通过将含有一定量的本发明嵌合肽的组合物给予需要这些治疗或预防的对象以治疗或预防这些对象的疾病。利用任何已知的诊断或治疗糖尿病的方法来确定治疗的有效性。例如通过过多排尿、严重口渴和饥饿感、以及严重乏力、皮肤干燥或不能解释的体重下降来诊断糖尿病。
对象可以是例如任何哺乳动物，例如人、灵长类、鼠、大鼠、狗、猫、牛、马、猪。
本发明的嵌合肽、或编码这些嵌合肽的核酸分子(这里也称为“治疗物”或“活性化合物”)、它们的衍生物、片段、类似物和同源物能被结合于适合给药的药物组合物。这些组合物通常包括核酸分子、蛋白质、或抗体以及可药用载体。“可药用的载体”在此特定地包括任何溶剂、弥散介质、包衣、抗菌的和抗真菌的试剂、等渗的和延时吸收的试剂，以及适合于给药的类似物。在最新版的Remington′s药学中描述了合适的载体，这是本领域的标准参考书目，在此并入参考。这些载体或稀释剂的优选的例证包括，但不限定于，水、盐、finger′s溶液、右旋糖溶液、以及5％人血白蛋白。也可使用脂质体和非水性颗粒例如脂肪油。这些介质和试剂在药用的活性成分上的应用对于本领域是熟知的。任何传统的介质或试剂除了那些与活性化合物不相兼容的外，它们在组合物中的使用是必需的。辅助的活性化合物也可以结合于该组合物。
在此阐述的活性物质也可以表达为脂质体。利用本领域已知的方法制备脂质体，如在Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，77：4030(1980)；以及美国专利No：4,485,045和4,544,545中所描述的。美国专利No：5,013,556公开了具有延长的循环时间的脂质体。
特别适用的脂质体可通过反相蒸发方法以含有磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)生成。脂质体经挤压通过具有限定孔径大小的滤膜而产生具有所需直径的脂质体。
本发明的药用组合物被制备为适合于它所计划的给药途径。给药途径的例证包括肠外，例如静脉内、皮内、皮下、口(例如吸入)、经皮(即局部)、经粘膜以及直肠给药。用于肠外、皮内或皮下给药的溶液或悬浊液可以包括以下成分：无菌稀释剂例如注射用水、盐水、脂肪油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂例如苯甲醇或甲基对羟基苯甲酸酯类(methyl parabens)；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调整渗透压的试剂如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱调整pH值，例如盐酸或氢氧化钠。肠外制剂可以放置于安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量小瓶。
适合于注射使用的药用组合物包括无菌水溶液(水溶性的)或脂肪油以及用于临时制备无菌注射溶液或脂肪油的无菌粉末。对于静脉注射，合适的载体包括生理盐水、无菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸缓冲液(PBS)。对于所有的例证，组合物必须是无菌的以及应当是容易被注射器所应用的液体。它在生产和储存的条件下必须是稳定的，且在保存时必须防止微生物如细菌和真菌的污染。载体可以是溶液或含有弥散介质，例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液态聚乙二醇，以及类似物)和它们的适当的混合物。例如通过使用如卵磷脂的包被、通过保持分散体所需的颗粒大小以及通过使用表面活性物质可以保持一定的流动性。利用各种抗菌的和抗真菌的试剂可预防微生物活性，例如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、硫柳汞和类似物。在许多实施方案中，优选的在组合物中包括等渗试剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。在组合物中使用能延长吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和凝胶可以造成注射用组合物的延长吸收。
可以将合适溶液中所需剂量的活性成分(例如糖蛋白Ibα融合蛋白)和上述的一种成分或它们的混合物混合以制成无菌注射溶液，按需紧接着的是过滤灭菌。通常，通过将活性化合物结合于含有碱性弥散介质及所需的来自上述提及的其他成分的无菌载体以制成弥散介质。对于用于制备注射溶液的无菌粉末，制备的方法是真空干燥和冷冻干燥，这样就生成了活性成分加上任何附加的来自它的先前无菌滤过溶液的所需成分的粉末。
口服组合物通常包括一种惰性稀释剂或一种食用载体。它们可以被装入明胶胶囊或压缩成片剂。对于口服治疗给药，活性成分可以结合于赋形剂并以片剂、药片、或胶囊的形式食用。也可以食用液态载体制成用为含漱的口服组合物，其中可以口服、漱口或吞咽液态载体中的化合物。适合药用的结合试剂和/或佐剂材料可以做为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、药片等等可以含有以下成分，或相似性能的化合物：粘合剂例如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖；分解剂例如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；滑润剂例如硬脂酸镁或Sterotes；助滑剂(glidant)例如胶体二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或糖精；或调味剂例如薄荷、水杨酸甲酯或调味橙汁。
对于吸入给药，从压力罐或含有合适推进物例如一种气体如二氧化碳的分样器或喷雾器中以喷雾剂的形式给予化合物。
全身给药也可以通过经粘膜或经皮的方式。对于经粘膜或经皮给药，在组成上使用了适合于需穿透的屏障的穿透剂。这些穿透剂在本领域是熟知的，对于经粘膜给药例如包括去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。可以通过使用鼻喷剂或栓剂完成经粘膜给药。对于经皮给药，活性化合物被制成本领域常见的油膏、软膏、明胶或乳膏。
化合物也可以被制成直肠给药的栓剂(例如和传统的栓剂基质如可可脂和其他的甘油脂一起)或滞留灌肠剂。
在一个实施方案中，活性化合物可以制备于载体中，该载体经组织化合物在体内被快速地清除，例如控释方式，包括种植物和微胶囊输送系统。可以使用生物可降解的、生物相容性的多聚体，例如乙烯醋酸乙烯酯(ethylene vinly acetate)、聚酸酐(polyanhydride)、聚乙醇酸、胶原、聚原磷酯(polyorthoesters)、以及聚乳酸。制备这些化合物的方法对于本领域人员是显而易见的。也可以从Alza公司和Nova医药公司购得这些材料。脂质体悬浮液(包括含有对应于病毒抗原的单克隆抗体的靶向于被感染细胞的脂质体)也可以被作用为可药用的载体。根据本领域人员已知的方法制备这些脂质体，例如象在美国专利No.4,522,811所描述的那样
在一些实施方案中，口服或肠外组合物被制成剂量单位的形式以利于给药和剂量的一致性。在此的剂量单位指的是将对于治疗对象的合适的生理性不连续的剂量做为单位，每个单位含有预先计算好的能产生所需的治疗作用的活性化合物的量以及所需的药用载体。本发明的剂量单位形式的规格是决定于或直接依赖于活性化合物的独特性质和获得的特定的治疗作用、以及混合技术的固有的限制例如用于治疗个体的活性化合物。
本发明的核酸分子可以被插入于载体中并做为基因治疗载体。可以将基因治疗载体导入对象中，例如静脉内注射、局部注射(见，例如美国专利No.5,328,470)或通过立体定向注射(见例如Chen，等，1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3054-3057)。基因治疗载体的药用产品可以包括可药用稀释液中的基因治疗载体，或包括有着基因输送载体植入的慢释放基质。同样的，可以从重组细胞中完整地生成整个基因输送载体，例如逆转录病毒载体，药用生产可以包括一种或多种细胞以生产基因输送系统。
如果需要，可以制备恒定释放的产品。合适的恒定释放产品的例证包括含有抗体的固态疏水性多聚体的半透性基质，该基质是以定型样式的形式存在，例如胶片或微胶囊。恒定释放基质的例证包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚酸酐(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙二醇酸共聚物例如LUPRONDEPOTTM(乳酸-乙二醇酸共聚物和亮氨酸脯氨酸醋酸盐构成的注射用微粒)、乙基聚-D-(-)-3-羟丁酸。例如乙烯醋酸乙烯酯和乳酸-乙二醇酸的多聚体能释放分子超过100天，但是水凝胶释放蛋白的持续时间更短。
做为例子，当本发明的嵌合肽要达到它所表明的作用时，本发明嵌合肽在口服途径应用时的口服剂量为大约0.05和1000mg/天之间，优选的为含有0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100.0、250.0、500.0和1,000.0mg活性成分的片剂形式。携带有至少一种目标物质的载体或转运体(transporter)的有效血浆水平为每天每公斤体重0.002mg到50mg的范围内。
本发明的嵌合肽或编码嵌合肽的核酸可以以每天单次剂量的形式给药，或将每天的总剂量按每天两次、三次或四次的剂量给药。
药用组合物可以和用于给药的设备一起包含于一种密封罐、试剂盒、罐子、或分样器。
在一个特殊应用中，本发明涉及一种体外使用的诊断性试剂，包括或包含有至少一种嵌合肽和/或一种依照本发明的细胞。这些诊断试剂也可以在体内使用。
本发明的对象因此也是一种诊断试剂盒，它包括诊断试剂。更特异的，诊断试剂盒包括预先确定好剂量的本发明组合物，它们在一或多个容器中。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种将目标物质转运通过真核细胞生物膜的方法，该方法包括提供一种本发明的嵌合肽并将嵌合肽与细胞培养物接触。在一个实施方案中，在促进真核细胞的活性代谢的条件下将细胞培养物与嵌合肽接触。
本发明也提供了一种利用在促进真核细胞活性代谢的条件下将本发明的嵌合肽与细胞接触以增加真核细胞内胰岛素浓度或减少细胞内葡萄糖浓度的方法。
在另一个方面，本发明提供了一种制备本发明肽的方法，包括用含有编码肽并可操纵地连接于表达调控序列的核酸分子转染生产细胞，并在允许生产肽的条件下培养生产细胞，及分离肽。
本发明包括使用以上描述为肽载体的嵌合肽。这里所使用的术语“嵌合肽”、“载体”和“肽载体”是通用的。这些载体能将共价或非共价地结合于它们的胰岛素运输进细胞，因此它们是胰岛素细胞内转移的有效载体。
为了达到这个目标，载体能够将相当大量的分子运输进细胞以及它不被人免疫系统识别为外源抗原都是必要的。
已经发现这些嵌合肽可以在体内和体外被用作为提高细胞内胰岛素的试剂。
做为一种变更，载体一方面是结合于与氨基聚糖反应的氨基酸序列，另一方面是结合于来自人抗DNA抗体的可变部分的新肽。“结合”被认为意味着任何形式的相互作用，它允许胰岛素多肽和diatos肽载体之间的物理连接。根据生物学介质和/或本发明多肽运输的目标物质它可以是可降解的或不可降解的，或者它可以被已经给予了结合有活性物质的载体的有机体以物理的方式所降解。因此该物质的生物作用的表达需要它从载体中释放出来。
在同一分子内与氨基聚糖反应的氨基酸序列和来自人抗DNA抗体的可变部分的肽的结合制成了一种肽载体，它对于胰岛素的转运和细胞内转移特别有效，特别重要的是与氨基聚糖反应的氨基酸序列是人来源的。
这样的结合也使得转运和转移载体特别适合于在人的应用，如上所示，尽管来自WO 097/02840的已知的鼠源肽载体是通过原始株编码的以及不带有突变，因此在抗原方面它们应当是接近于人的，但是将它们注射到人体将诱发免疫反应是可能的。依照本发明来自DPV和来自源于抗DNA抗体的肽所形成的肽载体都是人源的，原始株编码的且不带有突变，因此可以预防这个问题。
这些源于人抗DNA抗体的肽的常见特征接近于在出版物WO99/07414中所描述的鼠源肽的特征，然而它们还具有不同于后者的另外的特性，就是：
1)穿透进细胞内的能力，这些细胞必须有着活性的细胞代谢培养温度在25℃和39℃之间，优选的为37℃，然而鼠源肽明显是很少有这种依赖性的；
2)它们和DNA的反应不及鼠源载体强烈；
3)它们的穿透能力不受正在运输进细胞的分子的显著影响；
4)它们能更好地穿透进入源细胞，比较于其他来源的细胞；
本发明提供了一种diatos肽载体，它由肝素结合肽和一种或多种抗体片段组成，抗体片段优选的为多反应性的，以及更特异的一种或多种片段来自抗体的高变异区域。优选地，本发明的目标载体的特征是它包含有抗体的重链片段。
在上面提及的专利申请WO 99/07414中，仅仅使用了单克隆的IgG片段，它是一种单体免疫球蛋白，它是小型的并有着低分子量。本发明表明也可以使用来自IgM的片段，它是有着非常大分子量的五聚体免疫球蛋白。
如上所述，本发明的载体特别适合于胰岛素的细胞内和核内运输和转移。
不象其他将目标物质转入细胞内的技术，本发明的技术依赖于能量。在4℃孵育细胞可以完全抑制肽的穿透。这种穿透也可以部分被细胞代谢的抑制物所抑制，例如叠氮化钠(ATPase抑制剂)和染料木黄酮(酪氨酸激酶抑制剂并结合于ATP)。因此本发明的肽和结合于肽的目标物质的内吞作用是依赖于能量的。因此利用本发明肽的运载是通过细胞表面的结合位点来进行的。因此本发明氨基酸序列的特点为它们结合于细胞膜的结合位点并通过细胞膜的能力。因此，本发明氨基酸序列的特点为它们能通过主动机制穿过细胞膜并定位于细胞浆和/或细胞核的能力。因此它们与在以往技术中能依靠被动方式穿过细胞膜的肽转运体是不同的。
因此可能存在一种载体：当它进入细胞时，它的应用不受被运输的物质的大小所限制。事实上，本发明的载体能运输药物的范围从小化学分子(低分子量)到蛋白或质粒型核酸(大分子量)。本发明载体的这种特殊的穿透能力使得它以一种优先的方式靶向于细胞中的“药物”成为可能，因此显著下降了药物的毒性并显著地增加了效率指数。
因此本发明涉及提供一种上述的载体，它的特点是它天然地或非天然地含有一种目标物质，以及它可以被转入进细胞和/或细胞核中。
更特异的，本发明的对象是一种载体，该载体的穿透能力是相当独立于结合于它的目标物质的特性。比较于鼠载体，这种特性适合于人载体，这特性也是这些载体的计划应用中最令人感兴趣的地方。但是本发明也涉及那些适合于结合于它的目标物质的载体。
然而，相互作用必须是足够坚硬的以致载体不会在穿透细胞之前或之中脱离。针对这个原因，本发明优选的结合是共价结合，尽管这也可以是非共价结合。胰岛素多肽可以直接结合于肽的其中一个末端或一个侧链或其中一个氨基酸。胰岛素多肽也可以通过连接臂间接地结合于肽的其中一个末端或其中一个氨基酸的侧链。
也已经显示本发明的载体允许体外转染细胞。
在本发明的一个实施方案中，载体通过至少一个分子(称为“锚定分子”)被结合于胰岛素多肽，该分子对胰岛素多肽有着强烈的天然亲和力。锚定分子对胰岛素多肽的这种天然亲和力允许转运体和胰岛素多肽的非共价相互作用，并因此能携带胰岛素多肽一起在细胞内的转移。
这种类型的转运体的另一个特别有意思的优点是：因为锚定分子和胰岛素多肽的天然亲和力，这两个成分是以完全天然的方式结合在一起，没有化学的或生物化学的相互作用。
这种转运体是特别适合于那目标物质因为它的大小和/或它的结构被证实是难以直接结合于氨基酸序列的情况。当目标物质不是非常稳定以及任何类型的结合于它的化学相互作用可以使之降解或改变它的功能时，这种类型的转运体也被证明是特别有效的。
本发明的另一个方面是关于载体，优选的为表达载体，包括一种编码嵌合肽、或它的衍生物、片段、类似物或同类物的核酸。这里所用的术语“载体”指的是能运输另一种它所结合的核酸的一种核酸分子。载体的一个类型是“质粒”，它指的是附加的DNA片段能连接于其内的线性的或环状的双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中附加的DNA片段可以被连接进病毒基因组中。某些载体可以在它们所转导入的宿主细胞中进行自主复制(例如，有着细菌来源复制子的细菌载体和游离体的哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离体的哺乳动物载体)在转导入宿主细胞后能整合于宿主细胞的基因组，因此它们可以和宿主基因组一起复制。
此外，某些载体能支配可操纵地连接于它们的基因的表达。这些基因在此被称为“表达载体”。通常的，在重组DAN技术中使用的表达载体经常是质粒的形式。在本说明中，因为质粒是最常使用的载体形式，“质粒”和“载体”可以被相互替代使用。然而，本发明也包括那些其他形式的表达载体，例如病毒载体(如缺乏复制子的逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们有着相同的功能。另外，这些病毒载体能特异地或非特异地靶向于特定的细胞类型。
本发明的重组的表达载体包括以在宿主细胞中合适于核酸表达的形式存在的本发明核酸，这意味着重组表达载体包括一或多个调控序列，调控序列的选择依靠所用于表达的宿主细胞，并且它被可操纵地连接于用于表达的核酸序列。在重组表达载体中，“可操纵地连接”特定地表示目标核酸按允许核酸序列表达的方式结合于调控序列(例如，在体外转录/翻译系统或当载体被转导入宿主细胞时，在宿主细胞内)。术语“调控序列”特定地包括启动子、增强子和其他表达调节成分(例如，聚腺苷信号)。例如在Goeddel；基因表达技术：酶学方法185，科学出版社，SanDiego，Calif.(1990)中描述了这些调控序列。调控序列包括那些在许多类型的宿主细胞中指导核酸序列组成表达的序列以及那些只在某些宿主细胞中指导核酸序列表达的序列(例如组织特异性调控序列)。本领域人员懂得该表达载体的涉及依赖于一些因素，比如被转化的宿主细胞的选择、所需蛋白的表达水平等。本发明的载体可以被转导入宿主细胞以生产蛋白或肽，包括如这里所描述的核酸所编码的融合蛋白或肽(例如嵌合肽、嵌合肽的突变形式、融合蛋白等)。
本发明的重组表达载体可以被设计为用于在原核或真核细胞中表达嵌合肽。例如，嵌合肽可以表达于例如大肠杆菌的细菌细胞、昆虫细胞(利用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞。在Goeddel；基因表达技术：酶学方法185，科学出版社，San Diego，Calif.(1990)中进一步讨论了合适的宿主细胞。同样的，重组表达载体可以在体外转录和翻译，例如利用T7启动子调控序列和T7聚合酶。
原核细胞中蛋白的表达最常见的是在大肠杆菌中进行，它利用含有指导融合或非融合蛋白表达的固有的或诱导的启动子的载体。融合载体将大量的氨基酸添加到它所编码的蛋白上，通常是在重组蛋白的氨基末端。这些融合载体通常有三个作用：(1)增加重组蛋白的表达；(2)增加了重组蛋白的水溶性；(3)做为亲和纯化的一种配基帮助重组蛋白的纯化。通常的在融合表达载体中，一个蛋白裂解切割位点被引入于融合亚基和重组蛋白的接合部使得重组蛋白能与融合亚基分离，最后纯化融合蛋白。这些酶以及它们的同源识别序列，包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。常见的融合表达载体包括相应地将谷胱苷肽S转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合于靶重组蛋白的pGEX(Pharmacia BiotechInc；Smith和Johnson(1988)Gene 67：31-40)，pMAL(New England Biolabs，Beverly，Mass.)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，N.J.)。
合适的诱导的非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amrann等，(1988)基因69：301-315)和pET1 ld(Studier等，基因表达技术：酶学方法185，科学出版社，San Diego，Calif.(1990)60-89)。
将大肠杆菌中重组蛋白表达最大化的一个策略是在蛋白裂解地降解重组蛋白的能力减弱的宿主细菌中表达蛋白。见Gottesman，基因表达技术：酶学方法185，科学出版社，San Diego，Calif.(1990)119-128。另一个策略是改变插入到表达载体的核酸的核酸序列以使得每个氨基酸的各个密码子都是那些在大肠杆菌中优先使用的密码子(Wada等，(1992)核酸研究.20：2111-2118)。可以利用标准的DNA合成技术进行本发明的核酸序列的变更。
在另一个实施方案中，嵌合肽表达载体是酵母表达载体。在酵母菌S.cerevisiae中表达的载体的实例包括pYepSecl(Baldari，等，(1987)EMBOJ 6：229-234)，pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)细胞30：933-943)，pJRY88(Schultz等，(1987)基因54：113-123)，pYES2(InvitrogenCorporation，SanDiego，Calif.)，以及picZ(InVitrogen Corp，San Diego，Calif.)。
同样的，利用杆状病毒表达载体可以在昆虫细胞中表达嵌合肽。适合于在培养的昆虫细胞(例如SF9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等(1983)分子细胞生物学3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)病毒学170：31-39)。
仍在另一个实施方案中，利用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达本发明的核酸。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed(1987)自然329：840)和pMT2PC(Kaufman等(1987)EMBO J 6：187-195)。当表达载体应用于哺乳动物时，表达载体的调控功能经常由病毒调节成分提供。例如，常用的启动子来自多瘤、腺病毒2、巨细胞病毒和猴病毒40。对原核和真核细胞两者都适合的其他表达系统见于Sambrook等，分子克隆：实验手册第二版，冷泉港实验室，冷泉港实验出版社，冷泉港，纽约，1989的第16和17章。
在另一个实施方案中，重组的哺乳动物表达载体能指导核酸优选地在一些特殊的细胞类型中的表达(例如，利用组织特异性调控成分表达核酸)。组织特异性调控成分在本领域是已知的。合适的组织特异性启动子的非限定的实例包括白蛋白启动子(肝脏特异的；Pinkert等，(1987)基因发育1：268-277)，淋巴组织特异性启动子(Calame和Eaton(1988)Adv Immunol 43：235-275)，T细胞受体的特异启动子(Winoto和Baltimore(1989)EMBOJ 8：729-733)以及免疫球蛋白特异启动子(Banerji等.(1983)细胞33：729-740；Queen和Baltimore(1983)Cell 33：741-748)，神经元特异性启动子(例如神经丝启动子；Byrne和Ruddle(1989)PNAS 86：5473-5477)，胰腺特异性启动子(Edlund等(1985)科学230：912-916)，以及乳腺特异性启动子(例如乳清启动子；美国专利No.4,873,316和欧洲申请公开文本No.264,166)。发育调节启动子也包括例如鼠hox启动子(Kessel和Gruss(1990)科学249：374-379)和thea-胎蛋白启动子(Campes和Tilghman(1989)基因发育3：537-546)。
本发明的另一个方面是关于已经导入本发明的重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在这里可以相互替代。要认识到这些术语不仅仅指的是特定的对象细胞也指的是这些细胞的后代或潜在的后代。因为某些修饰可以发生在随后的传代中，这归结于突变或环境的影响，事实上这些后代可能和母代不完全相同，但是仍然包括在这里所使用的术语的范围内。另外，一旦表达了嵌合肽，宿主细胞可能被修改，以及可能保持或丢失原有的特性。
宿主细胞可以是任何的原核或真核细胞。例如，嵌合肽可以在例如大肠杆菌的细菌细胞、昆虫细胞、酵母菌细胞或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)中表达。同样的，宿主细胞可以是不成熟的哺乳动物细胞，就是多能干细胞。宿主细胞也可以来源于其他人类组织。其他适合的宿主细胞对于本领域人员是已知的。
可以通过传统的转化、转导、感染或转染技术将载体DNA导入到原核或真核细胞中。这里所使用的术语“转化”、“转导”、“感染”和“转染”特定地指的是各种领域认可的将外源核酸(如DNA)导入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙协同沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂染或电穿孔。此外转染可以被转染试剂所介导。“转染试剂”指的是包括任何将DNA导入宿主细胞的化合物，例如脂质体。可以在Sambrook等，(分子克隆：实验手册第二版，冷泉港实验室，冷泉港实验出版社，冷泉港，纽约，1989)中发现转化或转染细胞的合适方法，以及其他实验指南。
转染可以是“稳定的”(就是将外源DNA整合于宿主基因组中)或“瞬时的”(就是DNA在宿主细胞中是游离表达的)。
已知哺乳动物细胞的稳定转染依赖于表达载体和使用的转染技术，仅仅一小部分细胞可以将外源DNA整合入它们的基因组，而剩余细胞中的DNA仍是游离体的。为了确定和选择这些整合的细胞，编码选择性标记的基因通常和目标基因一起导入到宿主细胞中。各种选择性标记包括那些有着抗药性的基因，例如抗G418，潮霉素和氨甲蝶呤。编码选择性标记的核酸可以在和编码目标基因的同一个载体上被导入到宿主细胞中，或可以在不同的载体上被导入到细胞中。利用药物选择(例如结合于选择性标记基因的细胞将存活，而其他细胞将死亡)可以确定稳定转染有导入核酸的细胞。
在本发明的另一个实施方案中，利用诱导内源性报告基因的表达确定了嵌合肽调节了的细胞或转染的细胞。在一个特殊的实施方案中，启动子是带有绿色荧光蛋白(GFP)表达的胰岛素启动子。
本发明的其他优点和特性将体现于下面实施方案的实施例中，并参照于附图。
实施例
在以下的非限定的实施例中进一步阐述本发明。
实施例1：嵌合肽和DIATOS肽载体(DPV)的合成化学合成：
利用本领域人员已知的技术(Altergen和Neosystem)进行肽的合成。在Fmoc树脂上固相应用这些技术。用三氟乙酸(TFA)进行裂解，及在半预备的HPLC-CRC5柱上进行肽的纯化，并用0.1％TFA溶液与TFA中的乙氰梯度(10-70％)稀释肽。将冻干的肽溶解在0.15M的氯化钠中。分子的构建允许制成含有本发明肽的蛋白：
分子生物学技术使得构建质粒成为可能，这种质粒一旦导入到一定量的细胞内就可以合成载体化的大分子。
用于表达重组蛋白的载体的构建：
图1显示了用于表达含有本发明的肽序列的重组蛋白的载体的制备。原核载体Pqe30(Qiagen)允许基因以融合蛋白(或重组蛋白)和6XHis序列的形式表达。该载体携带有ColEl复制子、噬菌体T5的强启动子(它可以被IPTG所诱导)、抗氨苄西林的P-乳糖酶基因以及在编码标记6XHis序列的3’端的多个克隆位点以允许同相克隆带有6XHis序列的互补DNA。
将63-mer的互补寡核苷酸：
PAV1U：(SEQ ID NO：49)
5′gatccgtaaaacgaggactaaaactacgacacgtacgaccacgagtaacacgaatggacgtaa3′
PAV1L：(SEQ ID NO：50)
5′gatcttacgtccattcgtgttactcgtggtcgtacgtgtegtagttttagtcctcgttttacg-3′杂交。获得的DNA片段在5’端有aBamHI位点以及在3’端有aBglII位点。它编码肽序列PAV1：VKRGLKLRHVRPRVTRMDV(SEQ ID NO：51)。将该片段克隆于载体pQE30的BamHI位点。利用PCR获得编码Epstein-Barr病毒(EBV)的Zebra病毒蛋白(BZLF1)或从Zebra病毒的核定位点(nls)删得的35个氨基酸大小的Zebra蛋白的互补DNA(DNAc)。将它们克隆于载体His-PAV1或pQE30的BamHI位点。组成的质粒在转化大肠杆菌后可以表达重组蛋白His6-Zebra-PAV1、His6-ZebraΔnls-PAV1、His6-Zebra和His6-ZebraΔnls。
重组蛋白的诱导、提取和纯化：
将1mM IPTG(异丙基-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(isopropyl--D-thiogalactopyranoside))在37℃加入到培养在有着40μg/ml氨苄西林的Luria Bertani培养基的指数生长的细菌中以诱导重组蛋白的生成。加入IPTG12小时后，将细菌在4℃，5700g下离心15分钟。将细菌残渣放入到5份体积的变性裂解缓冲液中(20mM Tris-HCl pH7.8；0.5M NaCl；10％甘油；6M盐酸胍)。缓慢混合并在环境温度下孵育20分钟后，将裂解液在4℃，15000g下离心30分钟以澄清裂解液。将含有重组蛋白的上清液储存在-80℃。
利用亲和层析在用变性裂解缓冲液预先校正的“TALON”树脂柱(CLONTECH)上纯化6XHis重组蛋白。在用10份体积的含有10mM亚胺唑的变性裂解缓冲液连续洗涤树脂三次以后，用6M到0M盐酸胍梯度的20mM Tris-HCl pH7.8；0.5M NaCl；10％甘油；0.5mM PMSF缓冲液对结合于柱的重组蛋白进行复性。用1M亚胺唑pH8.0的20mM梯度洗脱重组蛋白。将不同的洗脱液在12％SDS-丙烯酰胺变性凝胶上进行分析。收集含有纯化的蛋白的部分并用20mM HEPES pH7.5，150mM NaCl缓冲液在4℃透析2小时。将蛋白浓缩、分装、在液氮中快速冰冻并储存在-80℃。
使用的肽：
非功能化肽：
SEQ ID NO：1：与肝素相互作用来自人脂蛋白B的氨基酸序列(3358-3372)的肽，Cardin等，Biochem.Biophys.Res.Com.154：741(1988)，也称为DPV1。
SEQ ID NO：2：与肝素相互作用的SEQ ID NO：1的二聚体的肽，也称为(DPV1)2。
SEQ ID NO：3：与肝素相互作用的SEQ ID NO：1的三聚体的肽，也称为(DPV1)3。
SEQ ID NO：4：对应于抗DNA单克隆的鼠抗体F4.1的高变异CD3区的肽(Avrameas等，Proc.Natl.Acad.Sci.95：5601(1998))。
SEQ ID NO：5：含有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4的肽。
SEQ ID NO：6：含有部分单克隆鼠抗体F4.1的CDR2和CDR3区域的肽(Avrameas等，Proc.Natl.Acad.Sci.95：5601(1998))。
SEQ ID NO：7：含有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：6的肽。
SEQ ID NO：8.对应于人抗DNA单克隆抗体RTT79的高变异CD3区的肽(Stevenson等，J.Autoimmunity 6：809(1993))。
SEQ ID NO：9：含有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：8的肽。
SEQ ID NO：10：与肝素相互作用的及含有SEQ ID NO：1和对应于人抗DNA单克隆抗体NE-1的CDR3高变异区的肽序列的肽(Hirabayashi等，Scand.J.Immunol.37：533(1993))，也称为No.1047。
SEQ ID NO：11：含有SEQ ID NO：1和对应于人抗DNA单克隆抗体RT72的CDR3高变异区的肽序列的肽(Kalsi等，Lupus 4：375(1995))。
SEQ ID NO：12：含有细胞3T3的NLS(核定位信号)序列和SEQ IDNO：6的肽。
SEQ ID NO：13：含有SEQ ID NO：1和来自人抗DNA单克隆抗体NE-1的CFR2和CDR3区序列的肽。
SEQ ID NO：14：含有部分鼠单克隆抗体F4.1的CD3区和SEQ IDNO：6的肽。
SEQ ID NO：15：含有两份对应于人抗DNA单克隆抗体NE-1的CDR3高变异区的肽序列的肽。
SEQ ID NO：16：得自在SEQ ID NO：15的13-19位加入了SEQ IDNO：1的肽。
SEQ ID NO：17；与肝素相互作用的来自人脂蛋白E的氨基酸序列的肽(Cardin等，Biochem.Biosphys.Res.Com.154：741(1988))，也称为DPV4。
SEQ ID NO：18：与肝素相互作用的来自集聚蛋白的氨基酸序列的肽(Campanelli等，Development 122：1663-1672(1996))，调节神经肌肉接头分化的细胞外基质蛋白。
SEQ ID NO：19：SEQ ID NO：18的二聚体。
SEQ ID NO：20：与肝素相互作用的来自胰岛素生长因子结合蛋白的氨基酸序列的肽，也称为DPV2(Fowlkes等，Endocrinol.138：2280-2285(1997))。
SEQ ID NO：21：与肝素相互作用的来自血小板生长因子的A链的C末端部分的氨基酸序列的肽(Maher等，Mol.Cell.Biol.9：2251-2253(1989))，也称为DPV6。
SEQ ID NO：22：含有12个赖氨酸(K)和SEQ ID NO：6的肽。
SEQ ID NO：23：含有12个赖氨酸(K)和SEQ ID NO：5的肽。
SEQ ID NO：24：有着抗微生物作用的肽(Javadpour等，J.Med.Chem.39：3107-3113(1996))。
SEQ ID NO：25：与肝素相互作用的对应于胰岛素样生长因子结合蛋白序列的肽(Fowlkes等，Endocrinol.138：2280-2285(1997))。
SEQ ID NO：26：与肝素相互作用的来自于人超氧化物歧化酶序列的C末端部分的肽的二聚体的肽。(Inoue等，FEBS269：89-92(1990))，也称为(DPV3)2。
SEQ ID NO：27：与肝素相互作用的对应于SEQ ID NO：26序列的肽，其中氨基酸是D构型的。
SEQ ID NO：28：与肝素相互作用的肽，它的序列来自SEQ ID NO：26并含有选择性结合于av整合素(21)的RGD基素。
SEQ ID NO：29：与肝素相互作用并由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：17的肽组成的肽，也称为DPV1-DPV4。
SEQ ID NO：30：与肝素相互作用的来自于上皮生长因子(EDF)序列的C末端部分的肽。(Arkonac等，J.Biol.Chem.273：4400-4405(1998))，也称为DPV7。
SEQ ID NO：31：与肝素相互作用的对应于SEQ ID NO：12的肽，其中氨基酸是前后位的。
SEQ ID NO：32：与肝素相互作用的对应于SEQ ID NO：30的肽，其中氨基酸是D构型的。
SEQ ID NO：33：与肝素相互作用的含有部分酸性纤维母细胞生长因子(aFGF)序列的肽(Fromm等，Arch.Biochem.Bioph.343：92(1997))，也称为DPV8。
SEQ ID NO：34：与肝素相互作用的含有部分碱性纤维母细胞生长因子(aFGF)序列的肽，也称为DPV9(Yayon等，Cell 64：841-848(1991))。
SEQ ID NO：35：与肝素相互作用的对应于鼠肠序列C末端的肽(Gongqiao等，Glyconjug J.13：81-90(1996))，也称为DPV10。
SEQ ID NO：36：与肝素相互作用的含有部分人γ干扰素C末端的肽(Lortat-Jacob & Grimaud，FEBS 280：152-154(1991))，也称为DPV11。
SEQ ID NO：37：与肝素相互作用的含有部分人白介素12的p40亚基序列的肽(Hasan等，J.Immunol.162：1064-1070(1999))，也称为DPV12。
SEQ ID NO：38：与肝素相互作用的含有部分来自基质细胞的因子Iα序列的肽(Amara等，J.Biol.Chem.272：200-204(1999))，也称为DPV13。
SEQ ID NO：39：与肝素相互作用的含有部分“肝素结合蛋白”(CAP37)序列的肽(Pohl等，FEBS 272：200-204(1990))，也称为DPV15。
SEQ ID NO：40：与肝素相互作用的对应于添加有13个N末端赖氨酸的SEQ ID NO：10(1047)序列的肽的肽。
SEQ ID NO：41：与肝素相互作用的对应于添加有13个N末端赖氨酸的SEQ ID NO：28(DPV3)2)序列的肽的肽。
SEQ ID NO：42：与肝素相互作用的对应于添加有13个N末端赖氨酸的SEQ ID NO：39(DPV10)序列的肽的肽。
SEQ ID NO：43：含有序列SEQ ID NO：10(1047)和SEQ ID NO：24肽的具有抗菌作用的肽。
SEQ ID NO：44：含有序列SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：30(DPV7)肽的具有抗菌作用的肽。
SEQ ID NO：45：含有序列SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：38(DPV13)肽的具有抗菌作用的肽。
SEQ ID NO：46：含有在N末端添加有甘氨酸-phthalcyl的序列SEQID NO：26(DPV3)2的肽。
SEQ ID NO：47：含有在N末端添加有水杨酸基团的序列SEQ IDNO：21(DPV6)的肽。
SEQ ID NO：48：含有在C末端添加有水杨酸基团的序列SEQ IDNO：21(DPV6)的肽。
功能化肽：
这些肽对应于上述的SEQ ID NO：1到48，但是在它们的N末端携带有能共价结合于一些目标物质的半胱氨酸或能使得肽与过氧化物酶缀合的抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白发生非共价结合的生物素。
实施例2：CACO-2屏障模型的完整性
将Caco-2细胞按160,000细胞/cm2的密度种植在合成的无血清培养基(Basal Defined Medium，BDM)中的聚乙烯terephtalate微孔膜上，该膜事先用牛真皮胶原包被。每周更换培养基三次，将细胞在37℃，5％CO2大气压下培养18天。做为检测Caco-2屏障完整性的阴性对照是106dpm/ml D-[14C]-甘露醇。将L-[3H]-脯氨酸做为阳性对照：主动运输106dpm/ml，10μM做为终浓度。其他对照包括D-[14C]-甘露醇/L-[3H]-脯氨酸+DPV7 30μg/ml和D-[14C]-甘露醇L-[3H]-脯氨酸+DPV10 30μg/ml。
进行经上皮运输试验。测定经上皮电阻抗(TEER)以检测Caco-2细胞单层的完整性。将细胞单层在37℃用Hank平衡盐水(HBSS，5mM葡萄糖，加有10mM Hepes)预先孵育8小时。在1，2，4，8小时时，从下隔间收集100μl培养基并用纯HBSS取代。在试验结束时(8小时)，用PBS洗涤细胞单层三次并测定TEER。将细胞收集在400μl的Tris-HCl0.1M pH8.0，0.5％TritonX100中，超声破碎。测定100μl细胞匀浆的。利用Packard Tri-carb 1600CA装置(Packard Instrument company，Meriden，CT，USA)，在光弥散于2ml的Aqualuma coktail(Lumac/3M bv，Schaesberg，the Netherlands)后，通过液态闪烁分光光度计测定放射性物质的量。
图2显示了D-[14C]-甘露醇和L-[3H]-脯氨酸的运输。结果说明经上皮的D-[14C]-甘露醇和L-[3H]-脯氨酸的运输是与试验在头4个小时期间持续时间成成比例的。L-[3H]-脯氨酸(阳性对照)的运输要高于D-[14C]-甘露醇(阴性对照)，提示Caco-2肠屏障模型可以用于评价DPV-胰岛素化合物的运输。在孵育4到8个小时之间，L-[3H]-脯氨酸的运输减慢而D-[14C]-甘露醇运输显著增加。该结果的原因是细胞单层长时间和HBSS孵育后发生了改变。在运输实验结束时(和HBSS孵育8小时后)测定到的TEER的急剧下降与这些结果是相关的(图1)。
30μg/ml DPV7或DPV10的存在既没有影响D-[14C]-甘露醇或L-[3H]-脯氨酸的运输(图3)，也不影响试验结束时与细胞相关的D-[14C]-甘露醇和L-[3H]-脯氨酸的运输的量(图4)。
表1.TEER测定
        内置膜n°    孵育前TEER(Ω.cm2)   孵育后TEER(Ω.cm2)
对照    1            540                   143
        2            495                   173
        3            512                   124
DPV7    1            506                   117
        2            828                   145
        3            545                   129
DPV10   1            500                   153
        2            458                   201
        3            501                   201
实施例3：胰岛素和DPV-胰岛素缀合物的经上皮运输
合成DPV-胰岛素缀合物。简要的，用10克分子过量的异双功能交联试剂SMCC激活胰岛素。在几次洗涤步骤后，加入5倍克分子过量的DPV7或DPV10。再次洗涤标本以去除未结合材料，并用SDS-PAGE电泳分析检测缀合物。将胰岛素、DPV7-胰岛素和DPV10-胰岛素稀释于0.15M的氯化钠中使其终浓度为0.65mg/ml。将30μg每种分子与Caco-2细胞单层一起孵育。
进行经上皮运输试验。测定经上皮电阻抗(TEER)以检测Caco-2细胞单层的完整性。将细胞单层在37℃用Hank平衡盐水(HBSS，5mM葡萄糖，加有10mM Hepes)预先孵育30分钟。将0.5ml 60μg/ml胰岛素化合物的HBSS培养基加入到内置膜的上间隔，对着细胞的顶端。上间隔和下间隔相应地含有0.5ml和1.25ml HBSS。将细胞单层和胰岛素化合物在37℃一起孵育1、4、8小时。收集上和下间隔的培养基。用PBS洗涤细胞单层3次并测定TEER。
将细胞收集在400μl的Tris-HCl0.1M pH8.0，0.5％TritonX100中。对于每种条件都使用三个内置膜(三次重复试验)。
表2说明了在用化合物孵育前后测定的TEER值。结果显示在孵育1和4个小时后DPV7-胰岛素诱导了TEER的显著下降，说明DPV7-胰岛素在这两个时间点影响Caco-2细胞单层的完整性。这种TEER下降和细胞形态的改变却没有在胰岛素和DPV10-胰岛素中观察到。该结果也显示TEER值在用这三种化合物孵育8小时后的显著降低。
这个结果和实施例1的结果是一致的，说明在HBSS孵育超过4个小时将改变Caco-2细胞屏障。
表2.TEER测定
内置膜n° 孵育前TEER(Ω.cm2) 孵育后TEER(Ω.cm2)
  胰岛素1h     123     458592445     478561425
  胰岛素4h     123     510451606     305324325
  胰岛素8h     123     442451498     151145151
  DPV7-胰岛素1h     123     515434542     143202178
  DPV7-胰岛素4h     123     639548600     129112116
  DPV7-胰岛素8h     123     543583473     12395112
  DPV10-胰岛素1h     123     553656599     537660573
  DPV10-胰岛素4h     123     678451498     553386416
  DPV10-胰岛素8h     123     650613605     194190186
实施例4：胰岛素化合物的检测和定量
用Dako(参考K6219)的ELISA试剂盒测定游离胰岛素浓度。用自制的分析检测DPV-胰岛素缀合物。简要的，将DPV-胰岛素缀合物吸收在96孔板的有肝素包被的96微孔板的孔中。利用鼠抗胰岛素单克隆抗体和过氧化物酶结合的第二抗体通过ELISA来源的测定方法定量DPV-胰岛素缀合物的水平。
将与Caco-2细胞孵育后收集的标本转移到BSA包裹的微管中并储存在-20℃直至测定胰岛素水平。在整个试验期间，顶端培养基中的游离胰岛素水平保持稳定。相反的，DPV-胰岛素缀合物的顶端浓度按时间函数减少。在8小时，DPV7-胰岛素和DPV10-胰岛素的水平相应地为最初给定的25％和35％(图5)。在1和4小时也观察到了DPV-胰岛素缀合物的显著减少(图5)。在这两个时间点，两种DPV-胰岛素缀合物的水平在1小时是最初给定的70％，在4小时，DPV7-胰岛素和DPV10-胰岛素相应地是最初给定的54％和64％。
在基底侧的培养基中检测到了的游离胰岛素(0.2％最初加入的材料)。在基底侧的培养基中没有检测到明显量的DPV-胰岛素缀合物，这可能是因为用于检测DPV-胰岛素缀合物的检测方法的敏感度比检测游离胰岛素的Dako方法低1000倍。因为存在这种敏感度的差异，所以不可能检测到如此少量的DPV-胰岛素缀合物。
在细胞裂解液中发现了非常少量的游离胰岛素(几乎是最初加入物的0.004％)。相反的，运输1小时后在细胞裂解液中测定到的DPV7-胰岛素和DPV10-胰岛素的量相应地达到了最初给定量的1％和4％(图6)。这些水平在整个试验中都是稳定的，说明化合物没有在细胞内聚集，它们可以离开Caco-2细胞。
将Caco-2细胞所生长的滤膜也进行胰岛素和DPV-胰岛素缀合物存在的分析。利用相同的定量检测方法滤膜上的游离和DPV-胰岛素缀合物，将允许直接比较滤膜上的化合物的量。
结果显示只有少量的游离胰岛素留待在滤膜上。相反的，当与DPV7或DPV10结合后，胰岛素缀合物可以清楚地停留捕获于培养基内置膜上。
实施例5：体外定量DPV-胰岛素缀合物
如在实施例2中所描述的合成DPV-胰岛素缀合物。为了有效地完成缀合物浓度的测定，实施了多种测定方法。
利用能够RIA测试确认胰岛素-DPV缀合物的识别。在体外建立了每种缀合物的平行于游离胰岛素的标准浓度曲线，以证实缀合物可被抗胰岛素抗体所识别并确定应用RIA测试是否能以准确的灵敏性来定量缀合物。
实施例6：体内定量DPV-胰岛素缀合物
如在实施例2中所描述的合成DPV-胰岛素缀合物。将合适水平的缀合物经皮注射到高血糖的鼠后，体内测定DPV-胰岛素缀合物的活性。用游离胰岛素或生理盐水注射的鼠做为对照。在预先设定的时间点收集血样并相应地利用ELISA和葡萄糖氧化酶方法测定胰岛素和葡萄糖浓度。血胰岛素浓度的增加和随后血糖水平的下降提示DPV-胰岛素缀合物是生物学活性的。
实施例7：口服给药后DPV-胰岛素缀合物的体内评价
为了评价DPV-胰岛素缀合物对肠屏障的穿透，将化合物放置于高血糖鼠的空肠腔中。在评价治疗胰岛素穿透入鼠血之前，将游离胰岛素或生理盐水给予对照鼠。
在给药后的至少三个小时内每15分钟检测所有动物的血糖，然后在随后的12个小时内每小时检测。在预先设定的时间点收集血样并相应地利用ELISA和葡萄糖氧化酶方法测定胰岛素和葡萄糖浓度。血葡萄糖水平的下降提示胰岛素穿透了肠屏障。
对于那些体内试验提示胰岛素没有生物学活性的动物，利用RIA测试方法的体外定量是可能的，在皮下注射后的一个时间点收集所有鼠的血样以及在每个血样中用RIA测定胰岛素缀合物的水平。这种胰岛素的直接测定可以确定缀合物是否穿透肠屏障。
实施例8：形态学和免疫细胞化学的研究
收集和DPV-胰岛素缀合物接触的高血糖鼠的小肠空肠组织以确定紧密连接的完整性。在单个时间点(30或60分钟)后进行免疫细胞化学研究以说明胰岛素的经细胞运输。
               序列表
<110>迪亚特斯公司
<120>治疗糖尿病的组合物和方法
<130>20440-004PCT
<140>
<141>2002-08-30
<150>60/316,063
<151>2001-08-30
<160>56
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>7
<212>PRT
<213>智人
<400>1
Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu
  1               5
<210>2
<211>14
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu
  1               5                  10
<210>3
<211>21
<212>PRT
<213>智人
<400>3
Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Val Lys
  1               5                  10                  15
Arg Gly Leu Lys Leu
             20
<210>4
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠X褐家鼠
<400>4
Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala Met Asp Tyr
  1               5                  10
<210>5
<211>18
<212>PRT
<213>智人-小鼠-褐家鼠
<400>5
Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala Met
  1               5                  10                  15
Asp Tyr
<210>6
<211>20
<212>PRT
<213>智人-小鼠-褐家鼠
<400>6
Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Arg Gln Lys Tyr
  1               5                  10                  15
Asn Lys Arg Ala
             20
<210>7
<211>26
<212>PRT
<213>智人-小鼠-褐家鼠
<400>7
Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Lys Gly
  1               5              10                      15
Arg Phe Thr Arg Gln Tyr Asn Lys Arg Ala
             20                  25
<210>8
<211>17
<212>PRT
<213>智人
<400>8
Val Arg Arg Ser Gly Arg Val Val Val Pro Ala Ala Pro Arg Asn Arg
  1               5                  10                  15
Asp
<210>9
<211>24
<212>PRT
<213>智人
<400>9
Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Val Arg Arg Ser Gly Arg Val Val Val
  1               5                  10                      15
Pro Ala Ala Pro Arg Asn Arg Asp
             20
<210>10
<211>19
<212>PRT
<213>智人
<400>10
Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg
  1               5                  10                  15
Met Asp Val
<210>11
<211>19
<212>PRT
<213>智人
<400>11
Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Gly Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Pro
  1               5                  10                  15
Gly Lys Asn
<210>12
<211>27
<212>PRT
<213>小鼠X褐家鼠
<400>12
 Asn Val Lys Lys Pro Lys Leu Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Lys Gly
   1               5                  10                  15
 Arg Phe Thr Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala
              20                  25
<210>13
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<400>13
 Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
   1               5                  10                  15
 Leu Lys Ser Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg Met Asp Val
              20                  25                  30
<210>14
<211>28
<212>PRT
<213>小鼠X褐家鼠
<400>14
Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Lys
  1               5                  10                  15
Gly Arg Phe Thr Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala
             20                  25
<210>15
<211>24
<212>PRT
<213>智人
<400>15
Arg Gly Val Arg Pro Arg Val Thr Arg Met Asp Val Arg His Val Arg
  1               5                  10                  15
Pro Arg Val Thr Arg Met Asp Val
             20
<210>16
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<400>16
Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg Met Asp Val Val Lys Arg Gly
  1               5                  10                  15
Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg Met Asp Val
             20                  25                  30
<210>17
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>17
Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp
  1               5
<210>18
<211>4
<212>PRT
<213>智人
<400>18
 Lys Ser Arg Lys
   1
<210>19
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>19
Lys Ser Arg Lys Lys Ser Arg Lys
  1               5
<210>20
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>20
Arg Lys Gly Phe Tyr Lys Arg Lys Gln Cys Lys Pro
  1               5                  10
<210>21
<211>17
<212>PRT
<213>智人
<400>21
Gly Arg Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu Lys
  1               5                  10                  15
Pro
<210>22
<211>32
<212>PRT
<213>小鼠X褐家鼠
<400>22
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Thr Tyr Tyr Ser
  1               5                  10                  15
Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala
             20                  25                  30
<210>23
<211>30
<212>PRT
<213>小鼠X褐家鼠
<400>23
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Val Lys Arg Gly
  1               5              10                      15Leu Lys Leu Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala Met Asp Tyr
            20                  25                  30
<210>24
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：具有抗微生物活性的肽
<400>24
 Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys
   1               5                  10
<210>25
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>25
Arg Lys Gly Lys Phe Tyr Lys Arg Lys Gln Cys Lys Pro Ser Arg Gly
  1               5                  10                  15
Arg Lys
<210>26
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>26
Ser Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg
  1               5                  10                  15
Glu Ser
<210>27
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>变体
<222>(1)..(18)
<223>所有氨基酸均为D构型
<400>27
Ser Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg
  1               5                  10                  15
Glu Ser
<210>28
<211>16
<212>PRT
<213>智人
<400>28
Arg Lys Lys Arg Arg Arg Gly Asp Arg Lys Lys Arg Arg Arg Gly Asp
  1               5                  10                  15
<210>29
<211>15
<212>PRT
<213>智人
<400>29
Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp
  1               5                  10                  15
<210>30
<211>15
<212>PRT
<213>智人
<400>30
Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro
  1               5                  10                  15
<210>31
<211>16
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>变体
<222>(1)..(16)
<223>氨基酸处于前后位置
<400>31
 Pro Asp Arg Lys Lys Gly Leu Lys Gly Lys Lys Lys Arg Lys Lys Gly
   1               5                  10                  15
<210>32
<211>14
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>变体
<222>(1)..(14)
<223>所有氨基酸均为D构型
<400>32
Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Asp
  1               5                  10
<210>33
<211>13
<212>PRT
<213>智人
<400>33
Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg
  1               5                  10
<210>34
<211>15
<212>PRT
<213>智人
<400>34
Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Ser Ser Trp Tyr Tyr Ala Leu Lys Arg
  1               5                  10                  15
<210>35
<211>14
<212>PRT
<213>智人
<400>35
Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg His Leu Gly Ser Gly
  1               5                  10
<210>36
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>36
Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gly
  1               5                  10
<210>37
<211>13
<212>PRT
<213>智人
<400>37
Gln Gly Lys  Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe
  1                5                  10
<210>38
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>38
Lys His Leu Lys Lys His Leu Lys Lys His Leu Lys
  1               5                  10
<210>39
<211>17
<212>PRT
<213>智人
<400>39
Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Glu Arg Ser Gln Ser
  1               5                  10                  15
Arg
<210>40
<211>32
<212>PRT
<213>智人
<400>40
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Val Lys Arg
  1               5                  10                  15
Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg Met Asp Val
             20                  25                  30
<210>41
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<400>41
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Glu Arg
  1               5                  10                  15
Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser
             20                  25                  30
<210>42
<211>27
<212>PRT
<213>智人
<400>42
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Arg Arg
  1               5                  10                  15
Ala Arg Arg Ser Pro Arg His Leu Gly Ser Gly
             20                   25
<210>43
<211>21
<212>PRT
<213>智人
<400>43
Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu
  1               5                  10                  15
Ala Lys Leu Ala Lys
             20
<210>44
<211>29
<212>PRT
<213>智人
<400>44
Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Gly Lys
  1               5                  10                  15
Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro
             20                  25
<210>45
<211>26
<212>PRT
<213>智人
<400>45
Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys His
  1               5                  10                  15
Leu Lys Lys His Leu Lys Lys His Leu Lys
             20                  25
<210>46
<211>18
<212>PRT
<213>
<220>
<221>变体
<222>(1)...(1)
<223>N端位置的邻苯二甲酰甘氨酸残基(Xaa)
<400>46
Xaa Gly Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg
  1               5                  10                  15
Glu Ser
<210>47
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>变体
<222>(1)...(1)
<223>N端位置具有一个水杨酸基序(称为Xaa)
<400>47
Xaa Gly Arg Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu
  1               5                  10                  15
Lys Pro
<210>48
<211>19
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>变体
<222>(17)...(17)
<223>C端位置具有一个水杨酸基序(称为X)
<400>48
Gly Arg Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu Lys
  1               5                  10                  15
Xaa Pro Gly
<210>49
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：PAV1U PCR引物
<400>49
gatccgtaaa acgaggacta aaactacgac acgtacgacc acgagtaaca cgaatggacg  60
taa                                                                63
<210>50
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：PAV1L PCR引物
<400>50
gatcttacgt ccattcgtgt tactcgtggt cgtacgtgtc gtagttttag tcctcgtttt  60
acg                                                                63
<210>51
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：PAV1肽序列
<400>51
Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg
  1               5                  10                  15
Met Asp Val
<210>52
<211>51
<212>PRT
<213>智人
<400>52
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
  1               5                  10                  15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser
                 20                  25                  30
His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe
                 35                  40                  45
Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
                 50
<210>53
<211>51
<212>PRT
<213>智人
<400>53
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
  1               5                  10                  15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser
                 20                  25                  30
His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe
                 35                  40                  45
Phe Tyr Thr Lys Pro Thr
                 50
<210>54
<211>51
<212>PRT
<213>智人
<400>54
Gly Ile Val Glu Gln Cys Ser Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
  1               5                  10                  15
Leu Glu Asn Tyr Ser Asn Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser
                 20                  25                  30
His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe
                 35                  40                  45
Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
                 50
<210>55
<211>51
<212>PRT
<213>牛
<400>55
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Ala Ser Val Cys Ser Leu Tyr Gln
  1               5                  10                  15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser
                 20                  25                  30
His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe
                 35                  40                  45
Phe Tyr Thr Pro Lys Ala
                 50
<210>56
<211>51
<212>PRT
<213>猪
<400>56
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
  1               5                  10                  15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser
                 20                  25                  30
His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe
                 35                  40                  45
Phe Tyr Thr Pro Lys Ala
                 50

Claims (42)

1.一种包括第一结构域和第二结构域的嵌合肽，其中第一结构域包括一种促进主动运输通过生物膜的转运序列，而第二结构域包括胰岛素多肽的至少一部分。
2.权利要求1的肽，其中所述的转运序列结合一种氨基聚糖。
3.权利要求2的肽，其中所述的氨基聚糖是肝素或硫酸软骨素。
4.权利要求1的肽，其中所述的第一结构域包括一种氨基酸序列，所述的氨基酸序列选自：
a)(XBBBXXBX)n；
b)(XBBXBX)n；
c)(BBXmBBXo)n；
d)(XBBXXBX)n；或
e)(BXBB)n，
其中
B是一种碱性氨基酸；
X是一种非碱性氨基酸；
每个m独立地是从0到5的一个整数；
每个n独立地是1到10之间的一个整数；
每个o独立地是0到5之间的一个整数。
5.权利要求1的肽，其中所述的嵌合肽转运通过一种生理学屏障。
6.权利要求5的肽，其中所述的生理学屏障是胃肠道屏障或血脑屏障。
7.权利要求1的肽，其中所述的转运序列是脂蛋白的一部分。
8.权利要求1的肽，其中所述的转运序列包括至少四个碱性氨基酸。
9.权利要求4的肽，其中n为2。
10.权利要求4的肽，其中n为3。
11.权利要求4的肽，其中X是一种疏水性氨基酸。
12.权利要求4的肽，其中所述的第一结构域的氨基酸序列是XBBBXXBX。
13.权利要求4的肽，其中所述的第一结构域的氨基酸序列是XBBXBX。
14.权利要求4的肽，其中所述的第一结构域的氨基酸序列是BBXmBBXo。
15.权利要求4的肽，其中所述的第一结构域的氨基酸序列是XBBXXBX。
16.权利要求4的肽，其中所述的第一结构域的氨基酸序列是BXBB。
17.权利要求4的肽，其中所述的第一结构域的氨基酸序列包括SEQID NO：30或SEQ ID NO：35。
18.权利要求4的肽，其中所述的第一结构域的氨基酸序列的长度少于100个氨基酸。
19.权利要求4的肽，其中所述的第一结构域的氨基酸序列的长度少于50个氨基酸。
20.权利要求4的肽，其中所述的第一结构域的氨基酸序列的长度少于25个氨基酸。
21.权利要求4的肽，进一步包括一种第三结构域，所述的第三结构域选自：
a)人抗DNA抗体的CDR3区域；
b)人抗DNA抗体的CDR2区域；
c)鼠抗DNA抗体的CDR3区域；或
d)鼠抗DNA抗体的CDR2区域。
22.一种包括第一结构域、第二结构域以及第三结构域的肽，所述的第一结构域和第二结构域包括一种氨基酸序列，所述的氨基酸序列选自：
a)(XBBBXXBX)n；
b)(XBBXBX)n；
c)(BBXmBBXo)n；
d)(XBBXXBX)n；或
e)(BXBB)n，
f)一种抗体片段，
其中
B是一种碱性氨基酸；
X是一种非碱性氨基酸；
每个m独立地是从0到5的一个整数；
每个n独立地是1到10之间的一个整数；
每个o独立地是0到5之间的一个整数，
其中所述的第一结构域不同于所述的第二结构域，且其中所述的第三结构域包括胰岛素多肽的至少一部分，其中所述的嵌合肽转运通过生物膜。
23.权利要求22的肽，其中所述的肽进一步转运通过一种生理学屏障。
24.权利要求23的肽，其中所述的生理学屏障选自胃肠道屏障和血脑屏障。
25.一种包括第一结构域和第二结构域的嵌合肽，其中所述的第一结构域包括氨基酸序列SEQ ID NO：30，而所述的第二结构域包括胰岛素多肽的至少一部分。
26.一种包括第一结构域和第二结构域的嵌合肽，其中所述的第一结构域包括氨基酸序列SEQ ID NO：35，而所述的第二结构域包括胰岛素多肽的至少一部分。
27.一种嵌合肽，其包括：
a)抗DNA抗体的CDR2区域的至少一部分；
b)抗DNA抗体的CDR2区域的至少一部分；和
c)胰岛素多肽的至少一部分，
其中该肽转运通过一种生物膜。
28.权利要求27的肽，其中所述的肽进一步转运通过一种生理学屏障。
29.权利要求28的肽，其中所述的生理学屏障是胃肠道屏障或血脑屏障。
30.一种组合物，包括权利要求1、4、21、22或25-27中任一项的肽和一种药用可接受的稀释剂、载体或佐剂。
31.配制为适于口服给药的权利要求30的组合物。
32.一种试剂盒，包括置于一或多个容器中的权利要求30的组合物。
33.一种分离的核酸，其编码权利要求1、4、21、22或25-27中任一项的多肽。
34.一种含有权利要求33的核酸的载体。
35.一种含有权利要求34的载体的细胞。
36.一种包括权利要求33的核酸和一种载体的组合物。
37.一种治疗对象的糖尿病的方法，包括将权利要求30或36的组合物施用于该对象。
38.一种制备肽的方法，该方法包括：
(a)在用于表达本发明的肽的条件下培养含有权利要求33的核酸的细胞；以及
(b)收集表达的肽。
39.一种增加真核细胞内的胰岛素浓度的方法，该方法包括：
(a)提供权利要求1、4、21、22或25-27中任一项的肽；以及
(b)在促进真核细胞活性代谢的条件下将该细胞与所述的肽接触。
40.一种降低真核细胞内的葡萄糖浓度的方法，该方法包括：
(a)提供权利要求1、4、21、22或25-27中任一项的肽；以及
(b)在促进真核细胞活性代谢的条件下将该细胞与所述的肽接触。
41.一种增加对象的血清胰岛素浓度的方法，包括将权利要求1、4、21、22或25-27中任一项的肽施用于该对象。
42.一种降低对象的血清葡萄糖浓度的方法，包括将权利要求1、4、21、22或25-27中任一项的肽施用于该对象。
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