DE60223058T2 - Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung von diabetes - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft im Allgemeinen die Zusammensetzung und die Methoden zur Behandlung von Diabetes und im Speziellen auf Präparate zur Erhöhung des Blutinsulinpegels.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Diabetes ist eine Krankheit, von der beinahe 16 Millionen Amerikaner betroffen sind. Die Diabetes vom Typ I, auch genannt Jugenddiabetes, ist charakterisiert durch eine absolute Insulinunterversorgung und der Abhängigkeit von exogenem Insulin, um weiterleben zu können. Ungefähr 800.000 bis 1,6 Millionen Menschen leiden unter Diabetes Typ I. Die Diabetes vom Typ II ist das Ergebnis einer Stoffwechselstörung, bei der das vom Körper produzierte Insulin nicht richtig verbraucht wird. Ungefähr 15 Millionen Menschen leiden unter Diabetes Typ II. Die gesamten (indirekten und direkten) Kosten übersteigen 98 Milliarden Dollar.
  • Derzeit beschränkt sich die langfristige Behandlung der Diabetes I hauptsächlich auf die subkutane Verabreichung von exogenem Insulin. Diese Behandlungsform bietet jedoch keine optimale Kontrolle über den Stoffwechsel, da die Therapie nicht in der Lage ist, den empfindlichen und sich minütlich ändernden Insulinausstoß, der normalerweise im Zusammenhang mit Malzeiten oder körperlicher Anstrengung usw. auftritt, nachzustellen. Trotz Einführung der Biotechnologie, die es gestattet, viele verschiedene Arten von Insulin zu produzieren, die sich hinsichtlich Wirkbeginn, Wirkhöhepunkt und Wirkdauer unterscheiden, ist es immer noch schwierig, den Glukosespiegel im Zeitraum eines Tages genau zu kontrollieren. Wenn Diabetiker Insulin spritzen, wird das periphere Gewebe einem höheren Insulinausstoß ausgesetzt, so dass es schwieriger wird, den Leberstoffwechsel bei diesen Patienten zu regulieren. Auch wenn durch den Einsatz multipler täglicher Injektionen (2–4) eine gute Stoffwechselkontrolle mit beinahe normaler Glykämie nachgewiesen werden konnte, verhindert jedoch die hohe Anzahl der Injektionen und die damit verbundenen Unannehmlichkeiten einen weitverbreiteten Einsatz dieser Anwendung.
  • Die angenehmste, bequemste, annehmbarste und einfachste Aufnahme wäre oral. Die gastrointestinale (GI) Mukosa bietet mehrere Vorteile bei der Verabreichung gegenüber anderen Schleimhäuten. Darunter die folgenden Vorteile: (1) Die orale Aufnahme ist bekannt, angenehm und für die meisten Menschen eine vertraute Einnahmeform; (2) das GI Epithel bietet eine große Oberfläche für die Aufnahme; und (3) das GI Epithel ist eng mit einer unerschöpflichen Blutzufuhr verbunden. Hormone wie Insulin werden subkutan verabreicht, weil sie die raue Umwelt im oberen gastrointestinalen Trakt nicht überwinden können. Im Gegensatz zu subkutanen Injektionen wird bei der oralen Einnahme von Insulin der Transport des physiologischen Insulins von der Bauchspeicheldrüse zum Pfortaderkreislauf nachempfunden, so wie es bei gesunden Nicht-Diabetikern beobachtet werden kann. Dennoch wird gemeinhin angenommen, dass die orale Insulineinnahme praktisch unmöglich sei. Auch unter besten experimentalen Bedingungen werden nur 0,5% des oral eingenommenen Insulins absorbiert Selbst wenn eine kleine Menge Insulin auf wundersame Weise den oberen gastrointestinalen Trakt überwinden sollte, ist das Hormon doch zu groß und hydrophil, was es ihm unmöglich macht, die intestinale Barriere hinter sich zu lassen.
  • Die PCT-Anmeldung Nr. WO 99/32136 behandelt chimäre Fusionsproteine, die immundominante Epitope sowohl aus Glutamat-Decarboxylase (GAD) als auch aus Insulin umfassen. In diesem Dokument wird beschrieben, wie Diabetes durch Einsatz dieses chimären Proteins verhindert oder behandelt werden kann und wie Diabetes Typ I diagnostiziert und prognostiziert werden kann.
  • US-Patent, Nummer 6,066,485 bezieht sich auf ein Serin/eine Phosphatase (FIN13) mit einer Kollagen-Homologie-Domäne, einer Säure-Box-Domäne, eine Serin/Threonin-Phosphatase-Domäne und eine funktionelle Domäne, wie sie für eine putative Kernlokalisierungssequenz charakteristisch ist. Daneben bezieht es sich auf Fusionsproteine, die FIN13 oder eine polypeptide Teildomäne davon mit einem anderen Protein verbinden, um eine Hybridfusion zu erschaffen, die über eine andere Zielspezifität, zum Beispiel beim Targeting der Kerntranslokation, verfügt.
  • Daneben beschreibt dieses Dokument die Konjugation von FIN13 mit Insulin: Insulin wird als "targeting Molekül" benutzt, um das Protein FIN13 auf Zellen mit Insulinrezeptor zu lokalisieren.
  • PCT-Anmeldung Nummer WO 99/01548 bezieht sich auf Vektoren zur Expression von heterologem Protein und beschreibt einen Vektor zur Expression von Proinsulin mit Hilfe einer Gram-negativen Bakterie, das expressierte Proinsulin-Protein enthält einen Histidinmarker, der hilfreich ist, um das Protein zu separieren, zu isolieren oder zu reinigen.
  • Ivanova et al. (1999), Molecular Reproduction and Development 54: 112–120, veröffentlichten eine Studie über rezeptoren-vermittelten Transport fremder DNA in Säugetierembryonen. Ein Konstrukt, das in den Experimenten beschrieben wird, ist ein (Polylysin-Insulin) DNA-Vektor. Der Insulinteil des Vektors ermöglicht die Internalisierung des Konstrukts.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung bringt diejenigen chimären Insulin-Peptide, die nützlich sind zur Erhöhung des Seruminsulinspiegels und zur Absenkung des Serumglukosespiegels, mit chimären Insulin-Peptiden in Verbindung. Daneben können mit der Erfindung die besagten Peptide zur Präparation von Pharmazeutika zur Behandlung von Diabetes, d. h. Typ I oder Typ II, eingesetzt werden.
  • Die Präparate der Erfindung basieren teilweise auf der Entdeckung, dass Diatos-Peptid-Vektoren (DPVs) den Transport von Molekülen ermöglichen, die normalerweise nicht über eine physiologische Barriere, insbesondere über die intestinale epitheliale Barriere, hinweg transportiert werden können. So können zum Beispiel Makromoleküle wie Insulin durch Anwendung der hier beschriebenen DPVs über die intestinale, epitheliale Barriere hinweg transportiert werden.
  • Unter verschiedenen Aspekten stellt die Erfindung ein chimäres Peptid zur Verfügung. Das chimäre Peptid kann durch eine biologische Membran wie etwa die Plasmamembran, die Mitochondrialmembran oder die Kernmembran translokieren. Alternativ translokiert das chimäre Peptid durch eine physiologische Barriere wie die gastrointestinale Barriere, die Blut-Hirn-Schranke, die Hautbarriere, die Atemwegs-Epithelschranke, die transmukosale Barriere, die intranasale Barriere und die okulare Barriere.
  • Ein weiterer Aspekt ist, dass die Erfindung ein chimäres Peptid mit einer ersten und einer zweiten Domäne zur Verfügung stellt. Die erste Domäne enthält eine Translokationssequenz, welche den aktiven Transport durch eine biologische Membrane ermöglicht. Die zweite Domäne enthält mindestens einen Abschnitt eines Insulin-Polypeptids, wobei der besagte Abschnitt des Insulin-Polypeptids die Funktion hat, den Blutglukosespiegel zu senken.
  • Die Translokationssequenz ist ein Teil eines Lipoproteins und wird aus SEQ ID NO: 30 oder SEQ ID NO: 35 selektiert.
  • Die Aminosäurensequenz der ersten Domäne ist weniger als 100 Aminosäuren lang; weniger als 50 Aminosäuren lang; weniger als 25 Aminosäuren lang. Vorzugsweise sind die Aminosäuresequenzen der ersten Domäne GKRKKKGKLGKKRDP (SEQ ID NO: 30, DPV7) oder SSRRARRSPRHLGSG (SEQ ID NO: 35, DPV10).
  • Das chimäre Peptid überwindet biologische und physiologische Barrieren.
  • Die Erfindung bietet auch Präparate aus chimärem Peptid und einem Träger. Die Zusammensetzung kann oral eingenommen werden.
  • Ein weiterer Aspekt ist, dass die Erfindung ein Set zur Verfügung stellt, welches die Zusammensetzung der Erfindung enthält.
  • Daneben stellt die Erfindung Methoden zur Verfügung, mit denen durch Kontakt in vitro bei nicht-embryonalen eukaryotischen Zellen der Glukosespiegel gesenkt und der Insulinspiegel angehoben werden kann.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist eine schematische Beschreibung der Präparation der Vektoren für die Expression rekombinanter Proteine, welche die Peptide der Erfindung enthalten.
  • 2 ist ein Liniendiagramm, das die Kinetik des Transports von D-[14C]-Mannitol und L-[3H]-Prolin zeigt.
  • 3 ist ein Liniendiagramm, das die Kinetik des Transports von D-[14C]-Mannitol und L-[3H]-Prolin zusammen mit 30 μg/ml DVP7-Insulin (A) oder DPV10-Insulin (B) zeigt.
  • 4 stellt in einem Balkendiagramm das mit den Zellen verbundene D-[14C]-Mannitol und L-[3H]-Prolin acht Stunden nach Inkubation im Zusammenhang mit der alleinigen Inkubation (Kontrolle) oder nach Zugabe von 30 μG/ml DVP7 oder DVP10 dar.
  • 5 stellt in einem Balkendiagramm die Pegel von Insulin und DPV-Insulin-Konjugaten im apikalen Medium dar.
  • 6 stellt in einem Balkendiagramm die Pegel von DPV-Insulin-Konjugaten in den Zelllysaten als Zeitfunktion dar.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung bietet Zusammenstellungen, die chimäre Insulin-Peptide enthalten, die nützlich sind zur Erhöhung des Seruminsulinspiegels und zur Absenkung des Serumglukosespiegels. Die chimären Peptide können eingesetzt werden, um die Bioverfügbarkeit des Insulins in einem Subjekt zu modulieren. Die chimären Peptide der Erfindung oder die Nukleinsäuren, welche diese chimären Peptide enkodieren, können zur Herstellung pharmazeutischer Präparate genutzt und zur Behandlung von Diabetes Typ I oder Typ II eingesetzt werden.
  • Des Weiteren stellt die Erfindung ein chimäres Peptid zur Verfügung, das eine erste Domäne mit einer Translokationssequenz enthält, die operabel mit einer zweiten Domäne verknüpft ist, welche mindestens ein Teil eines Insulin-Polypeptids enthält. Erste und zweite Domäne können in beliebiger Reihenfolge im Peptid auftreten, und das Peptid kann eine oder mehrere der beiden Domänen enthalten.
  • In diesem Text beinhaltet "chimäres Protein" oder "chimäres Peptid" wenigstens einen Teil eines Insulin-Polypeptids, das operabel mit einem nicht-insulinen Polypeptid verknüpft ist. Ein "Insulin-Polypeptid" bezeichnet ein Polypeptid, das eine Aminosäurensequenz hat, oder das wenigstens einem Teil eines Insulin-Polypeptids oder einer für ein Polypeptid enkodierenden Nukleinsäure entspricht, welches eine Aminosäuresequenz hat und wenigsten einem Teil eines Insulin-Polypeptides entspricht, während "nicht-insulines Polypeptid" sich auf ein Polypeptid bezieht, das über eine Aminosäuresequenz verfügt, die einem Protein entspricht, welches nicht essentiell homolog zu dem Insulin ist, z. B. ein Protein, das sich vom Insulin-Polypeptid oder Fragment unterscheidet und das aus dem selben oder einem anderen Organismus gewonnen wurde. Innerhalb eines insulinen chimären Peptids kann das Insulin-Polypeptid dem gesamten Insulin-Polypeptid oder einem Teil davon entsprechen.
  • Der Begriff "operabel verknüpft" soll anzeigen, dass die erste und zweite Domäne chemisch verknüpft sind (typischerweise über eine kovalente Bindung wie etwa eine Peptidbindung), und zwar auf solche Art, dass wenigstens eine Funktion, die mit dem Insulin-Polypeptid in Verbindung gebracht wird, ermöglicht wird. Der Begriff operabel verknüpft in Bezug auf eine Nukleinsäure, die ein chimäres Peptid enkodiert, bedeutet, dass eine Nukleinsäure, welche die erste Domäne enkodiert, und das Insulin-Polypeptid miteinander im Leserahmen fusioniert wurden. Die erste Domäne kann mit dem N-Terminus oder dem C-Terminus des Insulin-Polypeptids fusioniert werden.
  • "Translokationssequenz" bezeichnet jegliche Sequenz von Aminosäuren, die ein Peptid, in welchem sie vorhanden ist, in die gewünschte zellulare Destination steuert. So kann die Translokationssequenz die Penetration des Peptids durch eine biologische Membrane, z. B. eine Phospholipidmembran, eine Mitochondrialmembran oder eine Kernmembran, steuern oder ermöglichen. Die Translokationssequenz steuert zum Beispiel das Peptid von außerhalb der Zelle durch die Plasmamembran in das Cytoplasma oder an einen beliebigen Ort innerhalb der Zellen, z. B. Zellkern, Ribosom, Mitochondrie, ER, Lysosom order Peroxisom. Alternativ oder zusätzlich kann die Translokationssequenz ein Peptid durch die physiologische Barriere steuern, wie etwa die Blut-Gehirn-Schranke, die transmukosale Barriere, die hämatoencephalische, hämatoretinale, gastrointestinale und pulmonare Barriere.
  • Translokation, d. h. Durchdringung über eine biologische oder physiologische Schranke hinweg, kann durch verschiedene Prozesse festgestellt werden, zum Beispiel durch einen Zellpenetrationstest, der aus einem ersten Inkubationsschritt für das chimäre Peptid unter Zufügung von Kulturzellen besteht, gefolgt von einem Fixierschritt und einer Permeabilisierung der betreffenden Zellen und dem abschließenden Nachweis der vorhandenen chimären Peptide innerhalb der Zelle. Der Nachweisschritt kann mit einer anderen Inkubation in Anwesenheit von Antikörpern durchgeführt werden, die markiert und gegen das chimäre Peptid gesteuert werden, gefolgt vom Nachweis der immunologischen Reaktion zwischen der Sequenz und den markierten Antikörpern im Cytoplasma oder der unmittelbaren Umgebung des Zellkerns oder sogar innerhalb desselben. Der Nachweis kann auch geführt werden, indem eine Aminosäuresequenz in der Erfindung markiert wird und die Anwesenheit der Marker in den Kompartimenten der Zelle detektiert wird. In der oben erwähnten Patentanmeldung Nr. WO 97/02840 wurde ein Zellpenetrationstest beschrieben.
  • Die Translokation kann Energie benötigen, d. h. aktiven Transport. Alternativ dazu kann die Translokation keine Energie benötigen, d. h. passiver Transport.
  • Eine Translokationssequenz kann eine beliebige Länge haben. Zum Beispiel beträgt die Länge der Translokationssequenz weniger als 600 Aminosäuren, z. B. eine Länge von weniger oder gleich 500, 250, 150, 100, 50, 25 oder 10 Aminosäuren. Die Translokationssequenz ist zusammengestellt aus mindestens vier grundlegenden Aminosäuren.
  • Die Translokationssequenz wird gebildet aus einer bekannten Sequenz und wird zwischen SEQ ID NO: 30 oder SEQ ID NO: 35 selektiert.
  • Vorzugsweise ist die Translokation außerdem charakterisiert durch ihre Fähigkeit, mit Heparin, Chondroitinsulfat und ihren Derivaten reagieren zu können. Die Peptide, die sich an Glycosaminoglykan (GAG) oder allgemeiner an Aminoglykan oder insbesondere an Heparin, Heparinsulfate und Chondroitinsulfate binden, können natürlichen Ursprungs oder, wie die oben beschriebenen Peptide, künstlichen Ursprungs sein. Sie können in ihrer natürlichen Form oder in Form von Polymeren (Dimer, Trimer usw.) eingesetzt werden. "Heparin- oder Chondroitinsulfatderivate" oder "Aminoglykane wie Heparin oder Chrondroitinsulfat" werden hier so verstanden, dass sie jegliches Produkt oder Sub-Produkt bezeichnen wie in den Veröffentlichungen der Literaturliste definiert (Cardin & Weintraub, Arteriosclerosis 9: 21 (1989); Merton et al., Annu. Rev. Cell Biol. 8: 365 (1992); David, FASEB J. 7: 1023 (1993)).
  • Die translokierbaren Aminosäuresequenzen sind GKRKKKGKLGKKRDP (SEQ ID NO: 30) und SSRRARRSPRHLGSG (SEQ ID NO: 35). Im Allgemeinen ist die Aminosäurensequenz der ersten Domäne weniger als 100 Aminosäuren; weniger als 50 Aminosäuren; oder weniger als 25 Aminosäuren lang. Vorzugsweise ist die erste Domäne zwischen 6 und 25 Aminosäuren lang.
  • In diesem Dokument wird der Terminus "Insulin" so interpretiert, dass Insulinanaloga, natürlich gewonnenes Insulin oder rekombinant produziertes Insulin, das biologisch aktiv ist, davon umfasst werden. Mit biologisch aktiv ist gemeint, dass ein Molekül die Fähigkeit hat, die Krankheitssymptome von Diabetes zu unterdrücken oder zu verhindern, d. h. Absenkung von Serumglukose. Biologisch aktives Insulin beinhaltet Preproinsulin, Proinsulin, Insulin mit Alpha-Kette, Insulin mit Beta-Kette sowie reifes Insulin, z. B. bestehend aus Alpha- und Beta-Kette. Das Insulin kann von jedweden Spezies wie Menschen, Rindern, Schweinen, Pferden, Hunden oder Mäusen stammen.
  • Der Terminus soll die normalerweise für die Behandlung der Diabetes in substantiell gereinigter Form genutzten Polypeptide umfassen, aber auch die Anwendung des Begriffs in seiner kommerziell erhältlichen pharmazeutischen Form umfassen, welche zusätzliche Arzneistoffträger beinhaltet. Insulin zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung kann von zahlreichen kommerziellen Quellen, wie Novo Laboratories (Danbury, Conn.), Nordisk-USA (Rockville, Md.) und Eli Lilly and Co. (Indianapolis, Id.) bezogen werden.
  • Von Schweinen gewonnenes Insulin, humanes semi-synthetisches Insulin (Nordisk-USA) sowie geklontes rekombinantes Insulin (Eli Lilly) kann eingesetzt werden, um die Methoden der vorliegenden Erfindung auszuführen. Bevorzugt sollte rekombinant produziertes Insulin, vielleicht auch entwässert oder in Lösung, genutzt werden.
  • Der Terminus "Insulinanalogon" und ähnliche wird austauschbar in diesem Dokument genutzt, um jegliche der oben definierten Formen von "Insulin" zu umfassen, sofern eine oder mehrere Aminosäuren innerhalb der Polypeptidkette durch eine alternative Aminosäure ersetzt wurden bzw. sofern eine oder mehrere der Aminosäuren gelöscht wurden, oder sofern eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuren der Polypeptidkette oder der Aminosäuresequenz hinzugefügt wurden, und sofern es mindestens eine Funktion von natürlichem Insulin aufweist, zum Beispiel Senkung des Blutglukosespiegels. Im Allgemeinen beinhaltet der Terminus "Insulinanaloga" in der vorliegenden Erfindung die "Insulinanaloga Lispro", wie veröffentlicht in U.S. Pat. Nr. 5,547,929 , insgesamt durch Verweis hierin aufgenommen; Insulinanaloga, die LysPro Insulin und Humaloginsulin enthalten, sowie sämtliche anderen "Superinsulinanaloga", bei denen die Fähigkeit des Insulinanalogons zur Beeinflussung des Serumglukosespiegels im Vergleich zu konventionellem Insulin erheblich verbessert wurde, sowie hepatoselektive Insulinanaloga, die in der Leber aktiver sind als im Fettgewebe. Die bevorzugten Analoga sind monomerische Insulinanaloga, bei denen es sich um insulin-ähnliche Verbindungen handelt, die für die gleichen allgemeinen Zwecke wie Insulin genutzt werden, so wie Insulin Lispro, d. h. Verbindungen, die verabreicht werden, um den Blutglukosespiegel zu senken.
  • Mutanten von Novel Insulin A-Ketten sind bei dieser Erfindung auch verwendbar. Das Analogon des Humaninsulins mit A-Kette bewahrt die natürliche, intramolekulare Disulfidbindung zwischen den residenten CysA6 und CysA11, und zwei Serinen an Positionen 7 und 30 ersetzen die Cysteine, die in den beiden zwischen den Ketten liegenden Disulfidbrücken enthalten sind, welche beim natürlichen Insulin durch die B-Kette gebildet werden.
  • Das Insulin-Polypeptid und/oder die auf ein Insulin-Polypeptid enkodierte Nukleinsäure können mit Hilfe bekannter Insulinkodierungssequenzen konstruiert werden. Quellen für Insulin-Polypeptide und Nukleinsäuren, die für Insulin-Polypeptide kodieren, sind unter anderem GenBank mit Zugangsnummern 600165A; 550085A; AAH05255; AAA59179, welche insgesamt mittels Verweis hier aufgenommen werden.
  • Beispielhafte Insulinmoleküle könnten unter anderem folgende sein:
    GIVEQCCTSICSLYQLENYCNFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 52, Humaninsulin);
    GIVEQCCTSICSLYQLENYCNFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO: 53, Humaninsulin Lyspro); GIVEQCSTSICSLYQLENYSNFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 54, Human "Mini-Insulin");
    GIVEQCCASVCSLYQLENYCNFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA (SEQ ID NO: 55, Rinderinsulin); und GIVEQCCTSICSLYQLENYCNFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA (SEQ ID NO: 56, Schweineinsulin).
  • Falls gewünscht, können Aminosäuren zusätzlich zwischen der ersten Peptidhälfte, welche die Translokationssequenz umfasst, und der zweiten Polypeptidhälfte, welche das Insulin beinhaltet, eingefügt werden. Bei einigen Ausführungsformen beinhaltet die erste oder zweite Domäne eine Sequenz, die es ermöglicht, die Translokationssequenz mit Insulin zu verbinden.
  • In anderen Ausführungsformen umfasst ein chimäres Peptid mindestens zwei biologisch aktive Anteile eines Insulin-Polypeptids. In noch anderen Ausführungsformen umfasst ein chimäres Peptid mindestens drei biologisch aktive Anteile eines Insulin-Polypeptids.
  • Translokationssequenz und Insulinsequenz können auf jede bekannte zweckdienliche Art mit einer chemischen Kopplung verbunden werden. Viele chemische Kopplungsmethoden sind unspezifisch, d. h. sie weisen den Kopplungspunkt nicht einem bestimmten Ort in der Translokationssequenz oder im Insulin zu. Als Folge davon kann die Verwendung unspezifischer Verbindungsmittel die funktionalen Zentren angreifen oder aktive Zentren sterisch blockieren und dabei die konjugierten Proteine biologisch inaktiv machen.
  • Eine Art, die Kopplungsspezifizität zu steigern, besteht darin, die chemische Kopplung einer funktionalen Gruppe zuzuweisen, die nur ein oder wenige Male in einem oder beiden Polypeptiden, die miteinander verbunden werden sollen, gefunden werden kann. In vielen Proteinen tritt zum Beispiel Cystein, welches die einzige Proteinaminosäure ist, die eine Thiolgruppe beinhaltet, nur wenige Male auf. Auch wenn zum Beispiel ein Polypeptid keine Lysinreste enthält, wird ein für primäre Amine spezifischer Verbindungsreagens für den Aminoterminus dieses Polypeptids selektiv. Eine erfolgreiche Anwendung dieses Ansatzes zur Steigerung der Kopplungsspezifizität erfordert, dass die Polypeptide über einen geeignet dünnen und reaktiven Rest in denjenigen Gebieten des Moleküls verfügen, die ohne Verlust der biologischen Aktivität des Moleküls verändert werden können.
  • Cysteinrückstände können ersetzt werden, wenn sie in solchen Teilen der Polypeptidsequenz auftreten, wo ihr Einfluss auf eine Verbindungsreaktion möglicherweise die biologische Aktivität behindern würde. Wird ein Cysteinrückstand ersetzt, so ist es normalerweise wünschenswert, die resultierenden Veränderungen der Polypeptidfaltung zu minimieren. Änderungen an der Faltstruktur des Polypeptids können minimiert werden, wenn der Ersatzstoff dem Cystein chemisch und sterisch ähnlich ist. Aus diesem Grund wird Serin als Ersatzstoff für Cystein bevorzugt. Wie in den Beispielen weiter unten demonstriert, kann ein Cysteinrückstand in die Aminosäuresequenz eines Polypeptids eingesetzt werden, um eine Quervernetzung herzustellen. Wenn ein Cysteinrückstand eingesetzt wird, so geschieht dies vorzugsweise am oder in Nähe des Amino- oder Carboxy-Terminus'. Zur Modifikation derartiger Aminosäuresequenzen stehen konventionelle Methoden zur Verfügung, unabhängig davon, ob das betreffende Polypeptid mittels chemischer Synthese oder Expression einer rekombinanten DNA produziert wurde.
  • Die Kopplung der beiden Konstituenten kann durch Kopplungs- oder Konjugationsagenzien erreicht werden. Es können verschiedene intermolekulare Quervernetzungsreagenzien benutzt werden, siehe z. B. Means and Feeney, CHEMICAL MODIFICATION OF PROTEINS, Holden-Day, 1974, ff. 39–43. Unter diesen Reagenzien sind zum Beispiel J-Succinimidyl 3-(2-Pyridyldithio) Propionate (SPDP) oder N,N'-(1,3-Phenylen)Bismaleimid (die beide sehr spezifisch für Sulfhydrylgruppen sind und irreversible Verbindungen bilden); N,N'-Ethylen-bis(Iodoacetamid) oder andere solche Reagenzien, die 6 bis 11 Carbon-Methylen-Brücken haben (die spezifisch sind für Sulfhydrylgruppen); und 1,5-Difluoro-2,4-Dinitrobenzene (die irreversible Verbindungen zwischen Amino- und Tyrosingruppen herstellen). Andere Bindungsreagenzien, die nutzbringend eingesetzt werden können sind: p,p'-Difluoro-m,m'-Dinitrodiphenylsulfone (welche irreversible Bindungen mit Amino- und Phenolgruppen herstellen) Dimethyl Adipimidat (welches spezifisch für Aminogruppen ist), Phenol-1,4-Disulfonylchlorid (das hauptsächlich in Aminogruppen reagiert); Hexamethylendiisocyanat oder Diisothiocyanat oder Azophenyl-P-Diisocyanat (das hauptsächlich mit Aminogruppen reagiert); Glutaraldehyd (welches mit verschiedenen Seitenketten reagiert) und Disdiazobenzidin (welches hauptsächlich mit Tyrosin und Histidin reagiert).
  • Bindungsreagenzien können homobifunktional sien, d. h. sie haben zwei funktionale Gruppen, die der selben Reaktion ausgesetzt sind. Eine bevorzugte homobifunktionale Bindungsreagenz ist Bismaleimidohexan ("BMH"). BMH enthält zwei maleimide funktionale Gruppen, die spezifisch mit Sulfhydryd-haltigen Verbindungen unter milden Bedingungen reagieren (pH 6,5–7,7). Die beiden Maleimidgruppen werden durch eine Hydrocarbon-Kette verknüpft. Daher ist BMH geeignet für irreversible Bindungen von Polypeptiden, die Cysteinreste enthalten.
  • Bindungsreagenzien können auch heterobifunktional sein. Heterobifunktionale Bindungsagenzien haben zwei unterschiedliche funktionale Gruppen, zum Beispiel eine aminreaktive Gruppe und eine thiolreaktive Gruppe, die zwei Proteine quervernetzen, die freie Amine beziehungsweise Thiolen haben. Beispiele für heterobifunktionale Bindungsagenzien sind Succinimidyl 4-(Nmaleimidomethyl)Cyclohexan-1-Carboxylat ("SMCC"), M-Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimid Ester ("MBS") und Succinimid 4-(P-Maleimidophenyl)Butyrat ("SMPB") sowie eine ausgeweitete Kette analog zu MBS. Die Succinimidylgruppe dieser Quervernetzungen reagiert mit einem Primäramin, und das thiolreaktive Maleimid bildet eine kovalente Verbindung mit dem Thiol des Cysteinrückstands.
  • Bindungsreagenzien haben häufig eine niedrige Lösbarkeit in Wasser. Ein hydrophilische, funktionale Gruppe, wie eine Sulfonatgruppe, kann dem Bindungsreagens zugefügt werden, um die Wasserlöslichkeit zu verbessern. Sulfo-MBS und Sulfo-SMCC sind Beispiele für Bindungsreagenzien, deren Wasserlöslichkeit modifiziert wurde.
  • Viele Bindungsreagenzien bringen ein Konjugat hervor, das unter zellulären Konditionen essentiell nicht spaltbar ist. Jedoch beinhalten manche Bindungsreagenzien eine kovalente Bindung, wie ein Disulfid, das unter zellulären Konditionen spaltbar ist. Sehr bekannte spaltbare Binder sind zum Beispiel Trauts-Reagens, Dithiobis(Succinimidylpropionat) ("DSP") und N-Succinimidyl 3-(2-Pyridyldithio)Propionat ("SPDP"). Die Anwendung von spaltbaren Bindungsreagenzien ermöglicht es dem Insulin, sich nach Bereitstellung in der Zielzelle von der Translokationssequenz zu trennen. Auch die direkte Disulfid-Verbindung kann verwendet werden.
  • Zahlreiche Bindungsreagenzien einschließlich der oben genannten sind im Handel erhältlich. Detaillierte Anweisungen über deren Anwendung werden von den Anbietern zur Verfügung gestellt. Allgemeine Hinweise über die Quervernetzung von Proteinen und die Vorbereitung des Konjugats finden sich in: Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING, CRC Press (1991).
  • Chemische Quervernetzungen können den Einsatz von Abstandhaltern beinhalten. Abstandhalter bieten intramolekulare Flexibilität oder gleichen intramolekulare Distanzen zwischen konjugierten Rückständen aus und können somit helfen, die biologische Aktivität zu bewahren. Ein Abstandhalter kann die Form eines Polypeptidrestes haben, der Aminosäuren als Abstandhalter hat, z. B. Prolin. Alternativ kann ein Abstandhalter Teil der Vernetzungsreagenz sein, wie etwa in "langkettigem SPDP" (Pierce Chem. Co., Rockford, IL., cat. No. 21651 H).
  • Das chimäre Peptidprotein kann mit einem oder mehr zusätzlichen funktionalen Gruppen verbunden werden. Zum Beispiel kann das chimäre Peptid zusätzlich an ein GST-Protein gebunden werden, bei dem das chimäre Peptid mit dem C-Terminus der GST-Sequenzen (d. h. glutathione S-Transferase) verschmolzen wird. Derartige Fusionsproteine können die Reinigung chimärer Peptide ermöglichen.
  • Alternativ kann das chimäre Peptid als Fusionspeptid produziert werden, welches die Translokationssequenz und die Insulinsequenz enthält, die auf einfache Weise in bekannte, geeignete Wirtszellen exprimiert werden können. Fusionspeptide, wie hier beschrieben, können analog zu oder fertig anpassbar aus standardisierten, rekombinanten DNA-Techniken gebildet werden.
  • Die Erfindung bietet außerdem Methoden, um den Seruminsulinspiegel zu erhöhen oder um das Serum oder intrazelluläre Glukosespiegel zu senken. In einem bedürftigen Subjekt können Serumglukosespiegel gesenkt oder Insulinspiegel angehoben werden. Erhöhung von Serum oder intrazellularem Insulinspiegel oder Senkung von Serum oder intrazellularem Glukosespiegel durch Verabreichung einer Zusammenstellung, die ein chimäres Peptid der Erfindung enthält. Ein Subjekt wird dadurch identifiziert, dass entweder der Serumglukose- oder der Insulinspiegel mit bekannten Methoden gemessen wird. Ein Subjekt benötigt einen erhöhten Seruminsulinspiegel oder einen abgesenkten Glukosespiegel, wenn die Insulin- oder Glukosespiegel des Subjekts nicht innerhalb der normalen Werte liegen. Der normale Glukosespiegel ist 60–120 mg/dl. Der normale Insulinspiegel ist 7 mU/mL ± 3 mU. Wenn zum Beispiel das Subjekt einen Serumglukosespiegel von über 120 mg/dl aufweist, benötigt das Subjekt eine Absenkung des Serumglukosespiegels. Im Gegensatz dazu benötigt ein Subjekt, dessen Glukosespiegel zwischen 60–120 mg/dl beträgt, keine Absenkung des Serumglukosespiegels. Vorzugsweise liegt der Serumglukosespiegel des Subjekts nach Verabreichung mindestens zwischen 60–120 mg/dl. Ein Subjekt benötigt einen erhöhten Insulinspiegel, wenn zum Beispiel der Insulinspiegel weniger als 4 mU/mL beträgt. Vorzugsweise liegt der Insulinspiegel nach Verabreichung bei 7 mU/mL ± 3 mU.
  • Des Weiteren wird eine Methode beschrieben zur Behandlung und Vorbeugung von Diabetes durch Verabreichung der Zusammenstellung mit dem chimären Peptid dieser Erfindung in solchen Subjekten, bei denen eine Behandlung oder Vorbeugung gewünscht wird, und in so einer Dosierung, die ausreichend ist, um die Krankheit des Subjekts zu behandeln oder dieser vorzubeugen. Die Wirksamkeit der Behandlung wird im Zusammenhang mit jeglicher bekannten Methode zur Diagnose und Behandlung von Diabetes festgestellt. Diabetes kann beispielsweise diagnostiziert werden aufgrund von vermehrtem Harndrang, intensivem Durst und Hunger, Müdigkeitserscheinungen, trockener Haut und unerklärlichem Gewichtsverlust.
  • Das Subjekt kann z. B. jedes Säugetier sein, z. B. Menschen, Primaten, Mäuse, Ratten, Hunde, Katzen, Kühe, Pferde und Schweine.
  • Die chimären Peptide oder Nukleinsäuremoleküle, die diese chimären Peptide der Erfindung kodieren (hier auch bezeichnet als "Therapeutika" oder "Aktives Präparat") sowie Derivate, Fragmente, Analoga und Homologa davon, können in pharmazeutische Präparate eingebunden werden, die sich zur Verabreichung eignen. Solche Präparate umfassen typischerweise das Nukleinsäurenmolekül, Proteine oder Antikörper sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. "Pharmazeutisch akzeptabler Träger" bedeutet hier sämtliche Lösungsmittel, Dispersionsmittel, Überzüge, antibakteriellen und antifungalen Wirkstoffe, isotonischen und die Absorption verzögernden Agenzien sowie vergleichbare, die mit der pharmazeutischen Darreichungsform kompatibel sind. Geeignete Träger werden in der neusten Ausgabe von Remington's Pharmaceutical Sciences beschrieben, einem Standardwerk, dessen Inhalt hier mittels Verweis übernommen wird. Bevorzugte Beispiele solcher Träger oder Verdünnungsmittel umfassen unter anderem Wasser, Kochsalzlösung, Ringerlösung, Dextroselösung und 5% menschliches Serumalbumin. Liposome und nichtwässrige Vehikel wie Fettöle können auch genutzt werden. Die Verwendung solcher Mittel und Agenzien für pharmazeutisch aktive Substanzen ist dem Fachmann weitgehend bekannt. Außer für den Fall, dass konventionelle Mittel oder Agenzien inkompatibel mit den aktiven Präparaten sind, sollte deren Einsatz in den Präparaten genauer überprüft werden. Es können daneben auch zusätzliche aktive Verbindungen in die Präparate aufgenommen werden.
  • Die aktiven Agenzien, die hier offengelegt werden, können auch als Liposome formuliert werden. Liposome werden mittels dem Fachmann wohlbekannter Methoden präpariert, wie etwa beschrieben von Epstein et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); und U.S. Pat. Nummern 4,485,045 und 4,544,545 . Liposome mit verbesserter Zirkulationszeit wurden veröffentlich in U.S. Patent Nur. 5,013,556 .
  • Besonders nützliche Liposome können durch die Methode der Reverse Phase Evaporation mit einer Lipidkomposition generiert werden, welche Phosphatidylcholin, Cholesterol und PET-deriviertes Phosphatidlethanolamin (PEG-PE) beinhaltet. Lipsosomen werden mit Hilfe von Filtern, die eine definierte Porengröße aufweisen, extrudiert, um Liposomen mit dem gewünschten Durchmesser hervorzubringen.
  • Ein pharmazeutisches Präparat der Erfindung ist formuliert, um die Verträglichkeit mit dem beabsichtigten Darreichungsweg sicherzustellen. Beispielhafte Darreichungswege sind unter anderem parenteral, z. B. intravenös, intradermal, subkutan, oral (z. B. inhalieren), transdermal (d. h. topisch), transmukosal und rektal. Lösungen oder Suspensionen für die parenterale, intradermale oder subkutane Anwendung können die folgenden Komponenten enthalten: ein steriles Verdünnungsmittel wie Wasser für Injektionen, Kochsalzlösung, Fettöle, Polyethylenglykole, Glyzerine, Propylenglykol oder andere synthetische Lösungsmittel; antibakterielle Agenzien wie Benzylalkohol oder Methylparabene; Antioxidantien wie Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit, chelatbildende Agenzien wie Ethylendiamintetraacetat (EDTA); Puffer wie Azetate, Citrate oder Phosphate sowie Agenzien zur Einstellung der Tonizität wie Natriumchlorid oder Dextrose. Der pH-Wert kann mit Säuren oder Basen, wie etwa Salzsäure oder Natriumhydroxid justiert werden. Die parenterale Aufbereitung kann in Ampullen, Einwegspritzen oder Glas- oder Kunststoffphiolen mit Mehrfachdosierung abgefüllt werden.
  • Pharmazeutische Präparate die geeignet sind für die Verwendung als Injektion beinhalten sterile wässrige Lösungen (sofern wasserlöslich) oder Dispersionen mit sterilen Pulvern für die extemporane Zubereitung von sterilen, injizierbaren Lösungen oder Dispersionen. Bei intravenöser Verabreichung beinhalten geeignete Träger physiologische Kochsalzlösung, bakteriostatisches Wasser, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, N.J.) oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). In allen Fällen muss das Präparat steril und so flüssig sein, dass es einfach auf eine Spritze aufgezogen werden kann. Es muss unter Herstellungs- und Lagerbedingungen haltbar sein und gegen Kontaminationen durch Mikroorganismen wie Bakterien und Pilze geschützt werden. Der Träger kann ein Lösungs- oder Dispersionsmittel sein, das zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol (zum Beispiel Glycerol, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglykol und dergleichen) und geeignete Mischungen davon enthält. Die ausreichende Fluidität kann zum Beispiel bewahrt werden, indem Beschichtungen wie Lecithin genutzt werden, durch Beibehaltung der erforderlichen Partikelgröße im Falle von Dispersion und durch die Verwendung von Surfaktanten. Um die Kontamination mit Mikroorganismen zu verhindern, können verschiedene antibakterielle und antifungale Agenzien eingesetzt werden, wie zum Beispiel Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Ascorbinsäure, Thimerosal und dergleichen. In vielen Fallen ist es angebracht isotone Agenzien, zum Beispiel Zucker, Polyalkohole wie Manitol, Sorbitol, Natriumchlorid in dem Präparat einzusetzen. Eine verzögerte Absorption des injizierbaren Präparats kann erreicht werden durch Hinzufügen eines Agens, der die Absorption verzögert, zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine.
  • Zur Zubereitung von sterilen injizierbaren Lösungen wird die aktive Verbindung (z. B. ein Glykoprotein lbα Fusionsprotein) in der benötigten Menge einem geeigneten Lösungsmittel, das je nach Anwendung einen oder mehrere der oben genannten Zusatzstoffe enthalten kann, bei anschließender Filtersterilisation zugefügt. Zur Herstellung von Dispersionen wird die aktive Verbindung im Allgemeinen einem sterilen Vehikel zugefügt, das als Grundlage ein Dispersionsmittel sowie die benötigten oben genannten Bestandteile enthält. Bei sterilen Pulvern zur Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen gehören zur Herstellungsmethode Vakuumtrocknung und Gefriertrocknung, die ein Pulver hervorbringen, das den aktiven Bestandteil sowie zusätzlich den gewünschten Bestandteil aus einer zuvor steril gefilterten Lösung davon enthält.
  • Orale Präparate verfügen im Allgemeinen über ein inertes Verdünnungsmittel oder einen verzehrbaren Träger. Diese können in Gelatinekapseln eingeschlossen oder zu Tabletten gepresst werden. Zur Verabreichung bei der oralen Therapie kann die aktive Verbindung Arzneistoffträgern zugefügt und in Form von Tabletten, Pastillen oder Kapseln eingesetzt werden. Orale Präparate lassen sich auch herstellen, indem ein flüssiger Träger zur Benutzung als Mundwasser eingesetzt wird, wobei die Verbindung über den flüssigen Träger oral angewendet wird und dadurch gegurgelt und gespült oder geschluckt werden kann. Pharmazeutisch verträgliche Bindemittel und/oder weitere Zusatzstoffe können dem Präparat hinzugefügt werden. Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Pastillen und dergleichen können sämtliche der folgenden Bestandteile oder Verbindungen ähnlicher Art enthalten: einen Binder wie Mikrokristallinzellulose, Traganth oder Gelantine, Arzneiträgerstoffe wie Stärke oder Laktose, Verdünnungsmittel wie Alginsäure, Primogel oder Maisstärke; Lubrikanten wie Magnesiumstearat oder Sterotes, Gleitmittel wie kolloidales Silikondioxid; Süßstoffe wie Sucrose oder Sacharin; Aromastoffe wie Pfefferminz, Methylsalicylat oder Orangenaroma.
  • Zur Verabreichung durch Inhalieren, werden die Verbindungen in Form eines Aerosolsprays appliziert, das aus einem Druckbehälter mit geeignetem Treibmittel, z. B. einem Gas wie Kohlendioxid, oder aus einem Spender mit Vernebler kommt.
  • Eine systematische Verabreichung kann auch mit transmukosalen oder transdermalen Mitteln durchgeführt werden. Zur transmukosalen oder transdermalen Verabreichung werden in der Formel Durchdringungsmittel benutzt, die auf die zu durchdringende Schranke zugeschnitten sind. Derartige Mittel sind in Fachkreisen bekannt; dazu gehören zum Beispiel Detergens, Gallensalze, Fusidinsäurederivate bei transmukosaler Verabreichung. Transmukosale Verabreichung kann auch durch Einsatz von Nasensprays oder Suppositorien erreicht werden. Zur transdermalen Verabreichung werden die aktiven Verbindungen als Salben, Pasten, Gels oder Cremes formuliert, die in Fachkreisen allgemein bekannt sind.
  • Die Verbindungen können auch in Form von Suppositorien (z. B. mit konventionellen Grundstoffen für Suppositorien wie Kakaobutter und andere Glyceride) oder Spülungen für rektale Verabreichungsformen hergestellt werden.
  • In einer Ausführungsform werden die aktiven Verbindungen mit Trägern ausgestattet, welche die Verbindung gegen schnelles Ausscheiden aus dem Körper schützen, wie einer Formulierung zur kontrollierten Abgabe, einschließlich von Implantaten und Abgabesystemen in Mikrokapseln. Biologisch abbaubare, biokompatible Polymere wie Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglycolsäure, Collagen, Polyorthoestern und Polymilchsäure können eingesetzt werden. Die Methoden zur Herstellung solcher Formulierungen sind den besonders in der Materie versierten Fachkreisen bekannt. Die Materialien können von Alza Corporation und Nova Pharmaceuticals, Inc. bezogen werden. Liposomale Suspensionen (einschließlich solcher Liposome, die auf infizierte Zellen mit monoklonalen Antikörpern bis zu viralen Antigenen ausgerichtet sind) können ebenfalls als pharmazeutisch verträgliche Träger benutzt werden. Sie können nach den Methoden hergestellt werden, die den in der Materie versierten Fachkreisen bekannt sind, und wie sie zum Beispiel in U.S. Patent No. 4,522,811 beschrieben werden.
  • In manchen Ausführungsformen sind die oralen oder parenteralen Präparate zur einfacheren Verabreichung und gleichmäßigen Dosierung in Dosiereinheiten formuliert. Dosiereinheitform, wie hier benutzt, bezieht sich auf physikalisch getrennte Einheiten, die sich als Einzeldosierungen eignen und dem Subjekt in Behandlung verabreicht werden können; jede Einheit enthält eine vorbestimmte Menge an aktiver Verbindung, um den gewünschten therapeutischen Effekt im Verbund mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger zu erzielen. Die Spezifikation der Dosiereinheitformen der Erfindung werden vorgegeben und hängen unmittelbar ab von den besonderen Eigenschaften der aktiven Verbindung und den zu erreichenden Therapieeffekten sowie den Einschränkungen, denen die fachgerechte Herstellung solcher aktiver Verbindungen zur Behandlung von Individuen unterliegt.
  • Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können in Vektoren eingefügt werden und als Gentherapievektoren eingesetzt werden. Gentherapievektoren können einem Subjekt zum Beispiel mittels intravenöser Injektion oder lokal verabreicht werden (siehe z. B. U.S. Patent No. 5,328,470 ), oder mittels stereotaktischer Injektion (siehe z. B. Chef, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054–3057). Die pharmazeutische Präparation des Gentherapievektors kann den Gentherapievektor in einer verträglichen Verdünnung beinhalten oder eine Matrix zur verzögerten Freisetzung umfassen, in welcher das Vehikel zur Genabgabe eingebettet ist. Alternativ und wenn der vollständige Genabgabevektor aus intakten rekombinanten Zellen, z. B. retroviralen Vektoren, hergestellt werden kann, kann die pharmazeutische Präparation eine oder mehr Zellen enthalten, die das Genabgabesystem produzieren.
  • Falls gewünscht können Präparationen mit retardierter Freisetzung erstellt werden. Geeignete Beispiele für Präparationen mit retardierter Freisetzung beinhalten semipermeable Matrizen aus festen, hydrophoben Polymeren, die den Antikörper enthalten und deren Matrizen die Gestalt von ausgeformten Artikeln haben, z. B. Filmen oder Mikrokapseln. Beispiele für Matrizen mit retardierter Freisetzung beinhalten Polyester, Hydrogel (zum Beispiel Poly(2-Hydroxyethyl-Methacrylat) oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide ( U.S. Pat. No. 3,773,919 ), Kopolymere aus L-Glutaminsäure und einem γ Ethyl-L-Glutamat, nicht abbaubare Ethylen-Vynil-Acetate, abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Kopolymere wie LUPRON DEPOTTM (injizierbare Mikrosphären zusammengestellt aus Milchsäure-Glykolsäure-Kopolymer und Leuprolidacetat) und Poly-D-(–)-3-Hydroxybutansäure. Während Polymere wie Ehtylen-Vinyl-Acetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen über 100 Tage ermöglichen, werden bestimmte Hydrogele Proteine in kürzeren Zeitabschnitten freigesetzt.
  • Die orale Dosierung der erfindungsgemäßen chimären Peptide liegt zum Beispiel, wenn sie für die angezeigte Wirkung genutzt werden, zwischen 0,05 und 1,000 mg/Tag bei oraler Verabreichung, die vorzugsweise in Form von Tabletten durchgeführt wird, die jeweils 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100,0, 250,0 und 1.000,0 mg an aktiven Bestandteilen enthalten. Der wirksame Plasmaspiegel der Vektoren oder Transporter, die mit mindestens einer interessierenden Substanz beladen ist, liegt zwischen 0,002 mg und 50 mg pro Kilogramm Körpergewicht und Tag.
  • Die chimären Peptide oder Nukleinsäure, welche die erfindungsgemäßen chimären Peptide kodieren, können einmalig in Form einer einzelnen Tagesdosis oder über den Tag verteilt in zwei, drei oder vier Dosen verabreicht werden.
  • Die pharmazeutischen Präparate können in einem Behälter, einem Set, einer Packung oder einem Spender zusammen mit Hinweisen zur Einnahme enthalten sein.
  • Bei einer bestimmten Applikation bezieht sich diese Erfindung auf ein Diagnosemittel zur in vitro Nutzung, das mindestens ein chimäres Peptid und/oder eine Zelle gemäß der Erfindung enthält. Ein derartiges Diagnosemittel eignet sich auch zur Verwendung in vivo.
  • Gegenstand dieser Erfindung ist daher auch eine Diagnoseset, welches das Diagnosemittel enthält. Im Einzelnen enthält das Diagnoseset eine vorbestimmte Menge eines Präparats der Erfindung in einem oder mehreren Behältern.
  • In anderen Ausführungsformen, bietet die Erfindung eine Methode zur Translokation einer interessierenden Substanz über eine biologische Membran in eine nicht-embryonale, eukaryotische Zelle in vitro, eine Methode, welche die Zurverfügungstellung eines chimären Peptids der Erfindung und Kontaktieren einer Zellkultur in Anwesenheit des chimären Peptids umfasst. In einer Ausführungsform wird die Zellkultur unter Bedingungen, die den aktiven Metabolismus der eukaryotischen Zelle fördern, mit dem chimären Peptid in Kontakt gebracht.
  • Daneben stellt die Erfindung eine Methode zur Verfügung, mit der die intrazelluläre Konzentration erhöht oder die intrazelluläre Glukosekonzentration des Insulins innerhalb einer nicht-embryonalen eukaryotischen Zelle in vitro verringert werden kann, indem die Zelle mit dem erfindungsgemäßen chimären Peptid unter Bedingungen, die den aktiven Metabolismus der eukaryotischen Zelle fördern, in Kontakt gebracht wird.
  • In anderer Hinsicht stellt die Erfindung eine Methode zur Produktion eines erfindungsgemäßen Peptids zur Verfügung, das die Transfektion einer Produktionszelle mit einem Vektor umfasst, der ein Nukleinsäuremolekül enthält, das das Peptid kodiert, welches operabel mit einer Expressierungskontrollsequenz verknüpft ist, sowie die Produktionszelle unter Bedingungen, die die Herstellung von Peptiden erlauben, kultiviert und das Peptid isoliert.
  • Die Erfindung beinhaltet die Verwendung des chimären Peptids als Peptidvektor gemäß der obigen Definition. In diesem Dokument werden die Termini "chimäres Peptid", "Vektor" und "Peptidvektor" austauschbar verwendet. Diese Vektoren sind in der Lage innerhalb der Zellen Insulin zu transportieren, das mit ihnen kovalent oder nicht-kovalent kombiniert ist, was sie zu wirksamen Vektoren für einen intrazellulären Transfer von Insulin macht.
  • Um dieses Ziel zu erreichen, muss ein Vektor in der Lage sein, relativ große Mengen an Molekülen innerhalb der Zellen zu transportieren, ohne dabei vom menschlichen Immunsystem als fremdes Antigen identifiziert zu werden.
  • Es wurde herausgefunden, dass diese chimären Peptide sowohl in vivo als auch in vitro als Mittel genutzt werden können, um Insulin innerhalb von Zellen zu internalisieren.
  • Als Variation basiert der Vektor auf der Kopplung, einerseits, von Aminosäuresequenzen, die mit Aminoglykan reagieren, und andererseits, von neuen Peptiden, die von unterschiedlichen Teilen der menschlichen Anti-DNA-Antikörper stammen. "Kopplung" bedeutet jede Art der Interaktion, die es ermöglicht einen physikalische Verbund zwischen einem Insulin-Polypeptid und dem Diatos-Peptid-Vektor herzustellen. Es kann spaltbar oder nicht spaltbar sein gemäß des biologischen Mediums und/oder der interessierenden Substanz, die von den erfindungsgemäßen Peptiden transportiert wird, oder spaltbar durch physikalische Maßnahmen, die bei den Organismen, denen der an die aktive Substanz gekoppelte Vektor verabreicht wurde, appliziert werden. Die Expressierung des biologischen Effekts der Substanz kann es daher erforderlich machen, dass sie vom Vektor gelöst wird.
  • Die Kopplung von Aminosäuresequenzen, die mit Aminoglykan reagieren, und Peptiden, die aus verschiedenen Teilen der menschlichen Anti-DNA-Antikörper stammen, innerhalb ein und desselben Moleküls führt zur Präparation eines Peptidvektors, der besonders effektiv bei der Translokation und dem intrazellulären Transfer von Insulin ist, insbesondere, wenn die Aminosäuresequenz, die mit Aminoglykan reagiert, menschlichen Ursprungs ist.
  • Diese Kombination führt daneben zu einem Translokations- und Transfer-Vektor, der speziell auf die Anwendung bei Menschen angepasst wurde. Wie bereits angegeben ist es tatsächlich so, dass, obwohl die Peptidvektoren, die von Mäusen stammen und wie sie aus WO 97/02840 bekannt sind, von der Keimlinie kodiert werden und keine Mutationen tragen und daher denen, die in Menschen gefunden werden, im Hinblick auf Antigene ähnlich sein müssten, es möglich ist, dass die Injektion bei Menschen eine Immunreaktion herbeiführen würde. Der Peptidvektor, der gemäß der Erfindung aus DPV und aus Peptiden, die aus Anti-DNA-Antikörpern gewonnen werden, geformt wird, und die beide humanen Ursprungs sind, von der Keimlinie kodiert und ohne Mutationen, behebt dieses Problem.
  • Die allgemeinen Eigenschaften dieser aus menschlichen Anti-DNA-Antikörpern gewonnenen Peptide sind den Peptiden ähnlich, die von Mäusen stammen, wie beschreiben in Veröffentlichung WO 99/07414 , wobei sie aber zusätzliche Eigenschaften haben, die sie von den letzteren unterscheiden, nämlich:
    • 1) Die Fähigkeit Zellen zu durchdringen, sie müssen einen aktiven Zellmetabolismus haben (Kulturtemperatur zwischen 25°C und 39°C, vorzugsweise 37°C), während Peptide von Mäusen in weit geringerem Maße davon abhängig sind;
    • 2) Sie reagieren wesentlich schwächer mit DNA als Vektoren von Mäusen;
    • 3) Die Durchdringungskapazität wird nicht signifikant vom Molekül, welches sie in die Zelle transportieren, beeinflusst;
    • 4) Sie durchdringen Zellen humanen Ursprungs besser als Zellen anderen Ursprungs.
  • Die Erfindung stellt einen Diatos-Peptid-Vektor zur Verfügung, der aus einem Heparin-bindenden Peptid und einem oder mehreren Antikörper-Fragmenten zusammengesetzt ist, genauer aus einem oder mehreren Fragmenten, die aus den hypervariablen Regionen des Antikörpers kommen. Vorzugsweise wird der erfindungsgegenständliche Vektor dadurch charakterisiert, dass er ein Fragment einer schweren Kette eines Antikörpers enthält.
  • In der zuvor erwähnten Patentanmeldung WO 99/07414 wurden ausschließlich Fragmente eines monokionalen IgG eingesetzt, bei dem es sich um eine monomeres Immunoglobulin von kleiner Größe mit geringem Molekulargewicht handelt. Die Erfindung zeigt, dass es auch möglich ist, ein von einem IgM kommendes Fragment zu benutzen, bei dem es sich um ein pentameres Immunoglobulin mit sehr hohem Molekulargewicht handelt.
  • Wie weiter oben angeführt ist der Vektor der Erfindung besonders gut geeignet zum intrazellulären und intranuklearen Transport und Transfer von Insulin.
  • Im Gegensatz zu anderen Techniken der Internalisierung einer maßgeblichen Substanz in eine Zelle, sind die Techniken der vorliegenden Erfindung auf Energie angewiesen. Die Durchdringung der Peptide wird bei Inkubation der Zellen bei 4°C vollständig unterbunden. Teilweise unterbunden wird es auch durch Metabolismus-Inhibitoren, wie Natriumazid (Inhibitor von ATPase) und Genistein (Inhibitor von Tyrosinkinase und der Bindung zu ALP). Die Mechanismen zur Internalisierung der erfindungsgegenständlichen Peptide und damit auch die an die Peptide gekoppelten, interessierenden Substanzen sind daher energieabhängig. Die Vektorisierung, bei der die Peptide der Erfindung genutzt werden, wird daher über einen Bindungsort an der Zelloberfläche durchgeführt. Die erfindungsgegenständlichen Aminosäuresequenzen sind daher durch ihre Fähigkeit charakterisiert, an einem Bindungsort auf der Zellmembran befestigt werden zu können und die Zellmembran durchqueren zu können. Daher sind die Aminosäuresequenzen der Erfindung aufgrund ihrer Fähigkeit charakterisiert, die Zellmembran mittels eines aktiven Mechanismus' zu durchqueren und sich dann an das Cytoplasma oder den Zellkern anzudocken. Sie werden deswegen von den Peptidtransportern der vorhergehenden Art unterschieden, welche die Fähigkeit besaßen, die Zellmembran auf passive Weise zu durchqueren.
  • Es ist daher möglich, einen Vektor zu haben, dessen Verwendung beim Eintreten in die Zelle nicht durch die Größe der zu transportierenden Substanzen eingeschränkt wird. Tatsächlich sind die erfindungsgegenständlichen Vektoren in der Lage Arzneimittel zu transportieren, die von kleinen chemischen Molekülen (geringes Molekulargewicht) bis hin zu Proteinen oder plasmid-ähnlichen Nukleinsäuren (hohes Molekulargewicht) reichen. Die besondere Fähigkeit der erfindungsgegenständlichen Vektoren zur Durchdringung ermöglicht es, "Arzneimittel" auf so eine Weise in die Zelle zu befördern, die klar bevorzugt werden sollte, weil sie hilft, die Toxizität der Arznei zu reduzieren und damit zu einer möglichen Erhöhung des Wirksamkeitsindexes beiträgt.
  • Die Erfindung zielt somit darauf ab, einen Vektor wie den oben beschriebenen anzubieten, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er eine interessierende Substanz natürlich oder nicht natürlich enthält, die in eine Zelle und/oder die Zellkerne eingeführt werden kann.
  • Spezifischer ausgedrückt, ist der Gegenstand der Erfindung ein Vektor dessen Durchdringungsfähigkeit unabhängig ist von der Natur der interessierenden Substanz, die daran gekoppelt ist. Diese Eigenschaft, die verglichen mit Vektoren von Mäusen den menschlichen Vektoren eigen ist, ist von höchstem Interesse für die geplante Nutzung dieser Vektoren. Aber die Erfindung bezieht sich auch auf Vektoren, die an die interessierende Substanz, die daran gekoppelt ist, angepasst werden.
  • Die Interaktion muss jedoch fest genug sein, so dass der Vektor nicht vor oder während des Eindringens in die Zelle dissoziiert. Aus diesem Grund wird in der Erfindung eine kovalente Kopplung bevorzugt, auch wenn eine nicht-kovalente Kopplung möglich ist. Das Insulin-Polypeptid kann direkt an das Peptid gekoppelt werden, entweder an einem der Peptidenden oder an einer Seitenkette der Aminosäure. Das Insulin-Polypeptid kann indirekt über einen Verbindungsarm an das Peptid gekoppelt werden, entweder an einem der Enden der Peptide oder an einer Seitenkette der Aminosäuren.
  • Es konnte auch gezeigt werden, dass der erfindungsgegenständliche Vektor die Transfektion von Zellen in vitro erlaubt.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung, ist der Vektor mit wenigstens einem Molekül ("Ankermolekül" genannt), das über eine starke natürliche Affinität zu dem Insulin-Polypeptid verfügt, an das Insulin-Polypetid gekoppelt. Die natürliche Affinität des Ankermolekül zum Insulin-Polypeptid ermöglicht es dem Transporter, nicht kovalent mit dem Insulin-Polypetid zu interagieren und es somit auf dem intrazellulären Weg mit sich zu tragen.
  • Ein weiterer besonders interessanter Vorteil dieser Art von Transporter besteht darin, dass aufgrund der natürlichen Affinität des Ankermoleküls zum Insulin-Polypeptid, diese beiden Elemente auf vollkommen natürliche Art gekoppelt werden, ohne chemische oder biochemische Interaktion.
  • Dieser Typ von Transporter ist besonders interessant für den Fall, dass es sich als schwierig erweist, die interessierende Substanz aufgrund ihrer Größe oder ihrer Struktur direkt an die Aminosäuresequenz zu koppeln. Daneben kann sich dieser Typ von Transporter als besonders nützlich erweisen, wenn die interessierende Substanz nicht besonders stabil ist, und wenn eine chemische Kopplungs-Interaktion deren Aktivität vermindern oder verändern könnte.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, vorzugsweise Expressierung von Vektoren, die eine Nukleinsäure enthalten, die ein chimäres Peptid kodiert, oder Derivate, Fragmente, Analoga oder Homologa davon. In diesem Dokument bezieht sich der Terminus "Vektor" auf ein Nukleinsäuremolekül, das in der Lage ist eine andere Nukleinsäure, mit der es verbunden wurde, zu transportieren. Ein Vektortyp ist ein "Plasmid", welches sich auf einen linearen oder kreisförmigen zweisträngigen DNA-Ring bezieht, in den zusätzliche DNA-Segmente ligiert werden können. Ein anderer Vektortyp ist der Viralvektor, bei dem zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren sind in der Lage, sich autonom in einer Wirtszelle, in die sie eingefügt wurden, zu replizieren (z. B. bakterielle Vektoren, die einen bakteriellen Ursprung der Replikation haben, und episomale Vektoren von Säugetieren). Andere Vektoren (z. B. nicht episomale Vektoren von Säugetieren) können in das Genom einer Wirtszelle durch Einführung in die Wirtszelle integriert werden, wodurch sie zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert werden. Außerdem sind bestimmte Vektoren in der Lage die Expression von Genen, mit denen sie operativ verbunden sind, zu steuern. Solche Vektoren werden hier als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Im Allgemeinen liegen für den Einsatz in rekombinanten DNA-Techniken Expressionsvektoren häufig in Form von Plasmiden vor. In der vorliegenden Spezifikation können "Plasmid" und "Vektor" austauschbar benutzt werden, da das Plasmid die am meisten genutzte Form von Vektoren ist. Die Erfindung soll jedoch solch andere Formen von Expressionsvektoren enthalten, wie Viralvektoren (z. B. nicht replizierende Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren), die den gleichen Funktionen dienen. Zusätzlich sind einige virale Vektoren in der Lage, bestimmte Zelltypen entweder spezifisch oder unspezifisch zu targetieren.
  • Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung umfassen eine Nukleinsäure der Erfindung in einer der Expression der Nukleinsäure in der Wirtszelle dienlichen Form, was bedeutet, dass die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere Steuersequenzen beinhalten, die auf Grundlage der für die Expression genutzten Wirtszellen selektiert werden, die mit der Nukleinsäure, die expressiert werden soll, operabel verknüpft ist. Innerhalb eines rekombinanten Expressionsvektors bedeutet "operabel verknüpft", dass die interessierende Nukleotidsequenz mit der (den) Steuersequenz(en) derart verknüpft ist, dass die Expression der Nukleotidsequenz ermöglicht wird (z. B. bei einem in vitro Transkriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in diese Wirtszelle eingeführt wird). Der Terminus "Steuersequenz" beinhaltet Promoter, Enhancer und andere Elemente zur Expressionssteuerung (z. B. Plolyadenylisierungssignale). Derartige Steuersequenzen werden zum Beispiel erläutert in Goeddel; GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Steuersequenzen beinhalten jene, die die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Arten von Wirtszellen steuern, sowie jene, die die Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen steuern (z. B. gewebespezifische Steuersequenzen). Fachleute, die mit der Materie besonders vertraut sind, werden zu schätzen wissen, dass die Gestaltung des Expressionsvektors von Faktoren abhängt wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem Niveau der Expression des gewünschten Proteins usw. Die Expressionsvektoren der Erfindung können in die Wirtszellen eingeführt werden, um dabei Proteine und Peptide zu produzieren, einschließlich von Fusionsproteinen oder Peptiden, die von Nukleinsäuren wie in diesem Dokument beschrieben kodiert wurden (z. B. chimäre Peptide, Mutantenformen der chimären Peptide, Fusionsproteine usw.).
  • Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung können zur Expression der chimären Peptide in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen gestaltet werden. Das chimäre Peptid kann zum Beispiel in einer Bakterienzelle wie E. coli, Insektenzellen (unter Verwendung von baculovilaren Expressionsvektoren), Hefezellen oder Säugetierzellen expressiert werden, Geeignete Wirtszellen werden vertiefend diskutiert in: Goeddel; GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Alternativ kann der rekombinante Expressionsvektor in vitro transkribiert und übersetzt werden, zum Beispiel unter Verwendung von T7 Promoter-Steuersequenzen und T7 Polymerase.
  • Die Expression von Proteinen in Prokaryoten wird meistens in E. coli mit Vektoren durchgeführt, die konstitutive oder induzierende Promoter enthalten können, welche die Expression vom Fusions- oder Nicht-Fusions-Proteinen steuern. Fusionsvektoren fügen einem Protein, das darin kodiert ist, zahlreiche Aminosäuren hinzu, normalerweise dem Aminoterminus des rekombinanten Proteins. Derartige Fusionsvektoren dienen typischerweise drei Zwecken: (1) um die Expression des rekombinanten Proteins zu steigern; (2) um die Löslichkeit des rekombinanten Proteins zu steigern; und (3) um die Reinigung des rekombinanten Proteins zu unterstützen, indem es als Ligand in der Affinitätsreinigung agiert. Häufig wird in Fusion-Expressionsvektoren eine proteolytische Spaltungsstelle an der Verbindungsstelle von Fusionsgruppe und rekombinanten Protein eingeführt, um die Separation des rekombinanten Proteins von der Fusionsgruppe nach Reinigung des Fusionsproteins zu ermöglichen. Derartige Enzyme und ihre verwandten Erkennungssequenzen beinhalten Faktor XA, Thrombin und Enterokinase. Typische Fusion-Expressionsvektoren beinhalten pGEX ((Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson (1988) Gene 67: 31–40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) die Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose E-bindendes Protein oder Protein A jeweils mit dem rekombinanten Zielprotein fusionieren.
  • Beispiele für geeignete induzierende, nicht-fusionierende E. coli Expressionsvektoren beinhalten pTrc (Amrann et al., (1988) Gene 69: 301–315) und pET 11d (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60–89).
  • Eine Strategie zur Maximierung der rekombinanten Proteinexpression in E. coli besteht darin, das Protein in einer Wirtsbakterie zu expressieren, die über eine verminderte Kapazität zur proteolytischen Spaltung des rekombinanten Proteins verfügt. Siehe Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119–128. Eine weitere Strategie besteht darin, die Nukleinsäuresequenz der Nukleinsäure, die in einen Expressionsvektor eingefügt werden soll, so zu verändern, dass die individuellen Kodons für jede Aminosäure diejenigen sind, die bevorzugt in E. coli zum Einsatz kommen (Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111–2118). Eine derartige Veränderung der Nukleinsäuresequenzen der Erfindung kann mit standardisierten DNA-Synthesetechniken ausgeführt werden.
  • In einer anderen Ausführungsform ist der chimäre Peptid-Expressionsvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele für Vektoren zur Expression in Hefe S. cerevisiae beinhalten pYepSecl (Baldari, et al., (1987) EMBO J 6: 229–234), pMFa (Kurjan und Herskowitz, (1982) Cell 30: 933–943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54: 113–123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.), und picZ (InVitrogen Corp, San Diego, Calif.).
  • Alternativ kann das chimäre Peptid in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren expressiert werden. Baculovirus-Vektoren zur Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen (z. B. SF9-Zellen) beinhalten die pAc-Reihen (Smith et al. (1983) Mol Cell Biol 3: 2156–2165) und die pVL-Reihen (Lucklow und Summers (1989) Virology 170: 31–39).
  • In einer weiteren Ausführungsform wird eine Nukleinsäure der Erfindung in Säugetierzellen unter Verwendung eines Säugetier-Expressionsvektors expressiert. Beispiele für Säugetier-Expressionsvektoren beinhalten pCDM8 (Seed (1987) Nature 329: 840) und pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J 6: 187–195). Bei Nutzung in Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors häufig durch virale Regulationselement zur Verfügung gestellt. Zum Beispiel werden allgemein verwendete Promotoren aus Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus und Simian Virus 40 gewonnen. Weitere geeignete Expressionssysteme sowohl für prokaryotische als auch für eukaryotische Zellen finden sich in den Kapiteln 16 und 17 von Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
  • In einer anderen Ausführungsform ist der rekombinante Säugetier-Expressionsvektor in der Lage, die Expression der Nukleinsäure bevorzugt in einen bestimmen Zellentyp zu steuern (z. B. werden gewebespezifische Steuerelemente benutzt, um die Nukleinsäure zu exprimieren). Gewebespezifische Steuerelemente sind in Fachkreisen bekannt. Nicht limitierende Beispiele für geeignete gewebespezifische Promotoren beinhalten den Albumin-Promoter (leberspezifisch; Pinkert et al. (1987) Genes Dev 1: 268–277), lymphoid-spezifische Promotoren (Calame and Eaton (1988) Adv Immunol 43: 235–275), insbesondere Promotoren von T-Zellen-Rezeptoren (Winoto and Baltimore (1989) EMBO J 8: 729–733) und Immunoglobuline (Banerji et al. (1983) Cell 33: 729–740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33: 741–748), neuronen-spezifische Promotoren (z. B. Neurofilament-Promoter; Byrne and Ruddle (1989) PNAS 86: 5473–5477), pankreas-spezifische Promotoren (Edlund et al. (1985) Science 230: 912–916) und säugetierdrüsen-spezifische Promotoren (z. B. Milchserum-Promoter; U.S. Pat. No. 4,873,316 und Europäische Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 264,166 ). Entwicklungsregulierte Promotoren sind auch eingeschlossen, z. B. Maus-Hox-Promotoren (Kessel und Gruss (1990) Science 249: 374–379) und den α-Fetoprotein-Promoter (Campes and Tilghman (1989) Genes Dev 3: 537–546).
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Wirtszellen, in die ein rekombinanter Expressionsvektor der Erfindung eingeführt wurde. Die Termini "Wirtszelle" und "rekombinante Wirtszelle" werden in diesem Dokument austauschbar verwendet. Es wird davon ausgegangen, dass die Termini sich nicht ausschließlich auf die besondere Subjektzelle, sondern auch auf die Nachkommen oder potentiellen Nachkommen einer solchen Zelle beziehen. Weil bestimmte Modifikationen bei nachfolgenden Generationen aufgrund von Mutationen oder Umwelteinflüssen auftreten können, können solche Nachfahren tatsächlich nicht mit der Elternzelle identisch sein, werden aber trotzdem vom Umfang des hier benutzten Terminus erfasst. Zusätzlich können Wirtszellen einmalig moduliert werden, wobei sie das chimäre Peptid expressieren, und können die originalen Eigenschaften beibehalten oder verlieren.
  • Wirtszellen können prokaryotische oder eukaryotische Zellen sein. Chimäre Peptide können zum Beispiel in Bakterienzellen wie E. coli, Insektenzellen, Hefe- oder Säugetierzellen (wie etwa chinesische Hamster-Ovarien-Zellen (CHO) oder COS-Zellen) expressiert werden. Alternativ kann die Wirtszelle eine premature Säugetierzelle sein, d. h. eine pluripotente Stammzelle. Wirtszellen können auch aus anderem menschlichem Gewebe gewonnen werden. Andere geeignete Wirtszellen sind den besonders mit der Materie vertrauten Fachkreisen bekannt.
  • Vektor-DNA kann in prokaryotische oder eukaryotische Zellen mithilfe konventioneller Methoden der Transformation, Transduktion, Infektion oder Transfektion eingeführt werden. In diesem Dokument beziehen sich die Termini "Transformation", "Transduktion", "Infektion" und "Transfektion" auf eine Vielzahl von in der Fachwelt anerkannten Techniken zur Einführung fremder Nukleinsäuren (z. B. der DNA) in eine Wirtszelle, einschließlich Calciumphosphat oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation. Zusätzlich kann die Transfektion durch ein Transfektionsmittel vermittelt werden. "Transfektionsmittel" bezeichnet jegliche Verbindung, die die Einführung der DNA in die Wirtszelle vermittelt, z. B. Liposom. Geeignete Methoden zur Transformation und Transfektion von Wirtszellen können Sambrook, et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) und anderen Laborhandbüchern entnommen werden.
  • Die Transfektion kann "stabil" sein (d. h. Integration einer fremden DNA in das Wirtsgenom) oder "transient" sein (d. h. die DNA wird episomal in der Wirtszelle exprimiert).
  • Bei einer stabilen Transfektion von Säugetierzellen, ist bekannt, dass in Abhängigkeit von dem Expressionsvektor und den eingesetzten Transfektionstechniken, nur ein Bruchteil der Zellen die fremde DNA in ihr Genom integrieren, während der übrige Teil der DNA episomal bleibt. Um diese wesentlichen Bestandteile zu identifizieren und selektieren, wird im Allgemeinen ein Gen, das einen selektierbaren Marker kodiert (z. B. Antibiotikaresistenz), zusammen mit dem interessierenden Gen in die Wirtszelle eingeführt. Verschiedene selektierbare Marker umfassen solche, die Resistenzen gegen Arzneimittel übertragen wie G418, Hygromycin und Methotrexat. Nukleinsäure, die einen selektierbaren Marker kodiert, kann auf einem eigenen Vektor oder auf dem selben Vektor wie der kodierende in eine Wirtszelle eingeführt werden. Zellen, die stabil mit der eingeführten Nukleinsäure transfektiert sind, können durch Arzneimittel-Selektion identifiziert werden (z. B. überleben Zellen, die den selektierbaren Marker übernommen haben, während die anderen Zellen absterben). In einer anderen Ausführungsform werden die vom chimären Peptid modulierten oder die transfektierten Zellen durch die Induktion einer Expression eines endogenen Reporter-Gens identifiziert. In einer spezifischen Ausführungsform ist der Promoter der Insulin-Promoter, der die Expression eines grün fluoreszierenden Proteins (GFP) lenkt.
  • Andere Vorteile und Eigenschaften der Erfindung ergeben sich aus den Beispielen für Ausführungsformen, die in der Folge aufgeführt werden und sich auf die beigefügten Zeichnungen beziehen.
  • BEISPIELE
  • Die Erfindung wird anhand der folgenden nicht limitierenden Beispiele genauer veranschaulicht.
  • BEISPIEL 1: SYNTHESE VON CHIMÄREN PEPTIDEN UND DIATOSPEPTID-VEKTOREN (DVPs)
  • Chemische Synthese:
  • Die Peptidsynthese erfolgt mittels Techniken, die dem interessierten Fachmann bekannt sind (Altergen und Neosystem). Sie werden benutzt in fester Phase auf Fmoc-Harz. Die Abspaltung erfolgt mit Trifluoressigsäure (TFA), und die Peptide wurden gereinigt auf einer semi- präparativen HPLC-CR C5 Säule und mit einer 0,1% TFA Lösung und Acetonitril-Gradient (10%–70%) in der TFA. Die lyophilisierten Peptide wurden in NaCl 0,15 M aufgelöst.
  • Molekulare Konstruktion zur Präparation von Proteinen mit den erfindungsgemäßen Peptiden:
  • Die Techniken der Molekularbiologie ermöglichen es, Plasmide zu konstruieren, die, sobald sie in adäquate Zellen eingeführt wurden, die Synthese vektorisierter Makromoleküle erlauben.
  • Konstruktion von Vektoren zur Expression rekombinanter Proteine:
  • 1 zeigt die Präparation von Vektoren, mit denen die Expression der rekombinanten Proteine, die in der erfindungsgemäßen Peptidsequenz enthalten sind, möglich ist. Der prokaryotische Vektor pQE30 (Quiagen) erlaubt die Expression von Genen in Form von Fusionsproteinen (oder rekombinanten Proteinen) mit der Sequenz 6XHis. Dieser Vektor trägt den Ursprung der Replikation ColEt, den starken Promoter der Phage T5, die mittels IPTG induziert werden kann, das Gen zur β-Laktase, das dem Ampicillin Resistenz gibt, und einer multiplen Cloning Site bei 3' der Sequenz, die Markierung 6XHis kodierend, die Klonierung von komplementärer DNA, die gleichphasig mit der 6XHis-Sequenz ist.
  • Die komplementären Oligonukleotide von 63-mer:
    PAV1U: (SEQ ID NO: 49)
    5' gatccgtaaaacgaggactaaaactacgacacgtacgaccacgagtaacacgaatggacgtaa 3'
    PAV1L: (SEQ ID NO: 50)
    5' gatcttacgtccattcgtgttactcgtggtcgtacgtgtcgtagttttagtcctcgttttacg-3' sind hybridisiert. Das erhaltene DNA-Segment hat eine BamHI Site bei 5' und eine BglII Site bei 3.' Es kodiert für die Peptidsequenz PAV1: VKRGLKLRHVRPRVTRMDV (SEQ ID NO: 51). Dieses Fragment ist geklont bei der BamHI Site von Vektor pQE30. Die komplementäre DNA (DNAc) Codierung für das Zebra virale Protein (BZLF1) des Epstein-Barr-Virus' (EBV) oder das Zebra-Protein, das von seiner nuklearen Lokalisation-Site (nls) der 35 Aminosäuren gelöscht wurde, wurden durch PCR erhalten. Sie wurden kloniert bei der BamHi-Site des Vektors His-PAV1 oder pQE30. Das daraus resultierende Plasmid erlaubt die Expression rekombinanter Proteine His6-Zebra-PAV1, His6-ZebraΔnls-PAV1, His6-Zebra und His6-ZebraΔnls nach Transformation der E. coli Bakterie.
  • Induktion, Extraktion und Reinigung rekombinanter Proteine:
  • Die Produktion des rekombinanten Proteins wird bei 37°C induziert unter Hinzugabe von 1 mM IPTG (Isopropyl-β-DThiogalactopyranosid) zu den Bakterienkulturen in exponentieller Wachstumsphase in Luria Bertani Medium, ergänzt mit 40 μg/ml Ampicillin. 12 Stunden nach Zugabe von IPTG werden die Bakterien bei 5700 g für 15 Min. bei 4°C zentrifugiert. Der Bakterienrückstand wird in 5 Teile denaturierten Lysispuffer gegeben (20 mM Tris-HCl pH 7,8; 0,5 M NaCl; 10% Glycerol; 6 M Guanidin-HCl). Nach 20-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur und langsamer Vermischung, wird das Lysat durch 30-minütige Zentrifugierung bei 15000 g und 4°C geklärt. Der Überstand der das rekombinante Protein enthält wird bei –80°C gelagert.
  • Die 6XHis rekombinaten Proteine werden gereinigt durch Affinitätschromatographie auf einer "TALON"-Harz-Säule (CLONTECH), die mit denaturiertem Lysispuffer präkalibriert wurde. Nach 3 aufeinanderfolgenden Reinigungen des Harzes mit 10 Teilen denaturiertem Lysispuffer, der 10 mM Imidazol enthält, wird das an die Säule gebundene, rekombinante Protein renaturiert durch einen Gradienten von 6 bis 0 M Guanidin-HCl im Puffer 20 mM ris-HCl pH 7,8; 0,5 M NaCl; 10% glycerol; 0,5 mM PMSF. Das rekombinante Protein wird mit einem Gradienten von 20 mN bei 1 M Imidazol pH 8,0 eluiert. Die verschieden Eluate werden analysiert auf 12% SDSacrylamid denaturiertem Gel. Die Fraktionen, die das gereinigte Protein enthalten, werden gesammelt und für 2 Stunden bei 4°C gegen den Puffer 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl dialysiert. Das Protein wird konzentriert, aliquotiert, in flüssigem Nitrogen schockgefroren und bei –80°C gelagert.
  • Verwendete Peptide:
  • Nicht-funktionalisierte Peptide:
    • SEQ ID NO: 1. Mit Heparin reagierendes Peptid, das aus der Aminosäursequenz (3358–3372) des menschlichen Lipoproteins B, stammt, Cardin et al., Biochem. Biophys. Res. Com. 154: 741 (1988), auch als DPV1 bezeichnet.
    • SEQ ID NO: 2. Peptid, das mit dem Heparin-Dimer von SEQ ID NO: 1 reagiert, auch bezeichnet als (DPV1)2.
    • SEQ ID NO: 3. Peptid, das mit dem Heparin-Trimer von SEQ ID NO: 1 reagiert, auch bezeichnet als (DPV1)3.
    • SEQ ID NO: 4. Peptid, das dem hypervariablen Bereich CD3 des Anti-DNA monoklonalen Mäuseantikörpers F4.1 entspricht (Avrameas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 5601 (1998)).
    • SEQ ID NO: 5 Peptid, das SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 4 enthält.
    • SEQ ID NO: 6. Peptid, das einen Teil der CDR2- und CDR3-Regionen des monoklonalen Mäuseantikörpers F4.1 enthält (Avrameas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 5601 (1998)).
    • SEQ ID NO: 7. Peptid, das SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 6 enthält.
    • SEQ ID NO: 8. Peptid, das dem hypervariablen Bereich CD3 des Anti-DNA monoklonalen Antikörpers RTT79 entspricht (Stevenson et al., J. Autoimmunity 6: 809 (1993)).
    • SEQ ID NO: 9. Peptid, das SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 8 enthält.
    • SEQ ID NO: 10. Peptid, das mit Heparin reagiert und SEQ ID NO: 1 sowie die Sequenz des Peptids enthält, die dem hypervariablen Bereich CDR3 des menschlichen Anti-DNA monoklonalen Antikörpers NE-1 entspricht (Hirabayashi et al., Scand. J. Immunol. 37: 533 (1993)), auch bezeichnet als Nr. 1047.
    • SEQ ID NO: 11. Peptid, das SEQ ID NO: 1 sowie die Sequenz des Peptids enthält, die dem hypervariablen Bereich CDR3 des menschlichen Anti-DNA monoklonalen Antikörpers RT72 entspricht (Kalsi et al., Lupus 4: 375 (1995)).
    • SEQ ID NO: 12. Peptid, das die Sequenz des NLS (nukleares Lokalisations-Signal) der Zellen 3T3 und SEQ ID NO: 6 enthält.
    • SEQ ID NO: 13. Peptid, das SEQ ID NO: 1 enthält und die Sequenz von den CDR2 und CDR3 Regionen des Anti-DNA monoklonalen menschlichen Antikörpers, NE-1, enthält.
    • SEQ ID NO: 14. Peptid, das einen Teil der CDR3-Region des monoklonalen Mäuseantikörpers F4.1 und SEQ ID NO: 6 enthält.
    • SEQ ID NO: 15. Peptid, das zweimal die Sequenz des Peptides enthält, welches der hypervariablen CDR3-Region des Anti-DNA monoklonalen menschlichen Antikörpers NE-1 entspricht.
    • SEQ ID NO: 16. Peptide, die aus der Inklusion entstehen, an Position 13–19 von SEQ ID NO: 1 in SEQ ID NO: 15.
    • SEQ ID NO: 17. Mit Heparin reagierendes Peptid, das aus der Aminosäuresequenz des menschlichen Lipoproteins E stammt (Cardin et al., Biochem. Biophys. Res. Com. 154: 741 (1988)), auch als DPV4 bezeichnet.
    • SEQ ID NO: 18. Peptid, das mit Heparin reagiert, gewonnen aus der Aminosäuresequenz von Agrin (Campanelli et al., Development 122: 1663–1672 (1996)), Protein der extrazellulären Matrix, welches die Differenzierung der neuromuskulären Verbindung reguliert.
    • SEQ ID NO: 19. Dimer aus SEQ ID NO: 18. SEQ ID NO: 20. Mit Heparin reagierendes Peptid, das aus der Aminosäursequenz des Insulinwachstumsfaktor bindenden Proteins stammt, auch bezeichnet als DPV2 (Fowlkes et al., Endocrinol. 138: 2280–2285 (1997)).
    • SEQ ID NO: 21. Mit Heparin reagierendes Peptid, das aus der Aminosäursequenz des C-terminalen Teils der Kette A des Thrombozytenwachstumsfaktors stammt (Maher et al., Mol. Cell. Biol. 9: 2251–2253 (1989)), auch als DPV6 bezeichnet.
    • SEQ ID NO: 22. Peptid, das 12 Lysine (K) und SEQ ID NO: 6 enthält.
    • SEQ ID NO: 23. Peptid, das 12 Lysine (K) und SEQ ID NO: 5 enthält.
    • SEQ ID NO: 24. Peptide mit antimikrobieller Aktivität (Javadpour et al., J. Med. Chem. 39: 3107–3113 (1996)).
    • SEQ ID NO: 25. Mit Heparin reagierendes Peptid, das aus der Aminosäuresequenz des Insulinwachstumsfaktor bindenden Proteins stammt (Fowlkes et al., Endocrinol. 138: 2280–2285 (1997)).
    • SEQ ID NO: 26. Mit Heparin reagierendes Peptid und Dimer eines Peptids, das aus dem C-terminalen Teil der Sequenz der humanen Superoxid-Dismutase gewonnen wird (Inoue et al., FEBS 269: 89–92 (1990)), auch bezeichnet als (DPV3)2.
    • SEQ ID NO: 27. Mit Heparin reagierendes Peptid, das der Sequenz SEQ ID NO: 26 entspricht, in welcher die Aminosäuren in Konfiguration D sind.
    • SEQ ID NO: 28. Mit Heparin reagierendes Peptid, dessen Sequenz aus SEQ ID No: 26 gewonnen wird und das Motiv RGD enthält, welches selektiv die αv Integrine bindet (21).
    • SEQ ID NO: 29. Mit Heparin reagierendes Peptid, das aus den Peptiden von SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 17 zusammengestellt ist, auch bezeichnet als DPV1–DPV4.
    • SEQ ID NO: 30. Mit Heparin reagierendes Peptid, das aus dem C-terminalen Teil der Sequenz des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) stammt (Arkonac et al., J. Biol. Chem. 273: 4400–4405 (1998)), auch als DPV7 bezeichnet.
    • SEQ ID NO: 31. Mit Heparin reagierendes Peptid, das dem Peptid mit Sequenz SEQ ID NO: 12 entspricht, wobei die Aminosäuren in Vorne-Hinten-Position sind.
    • SEQ ID NO: 32. Mit Heparin reagierendes Peptid, das der Sequenz SEQ ID NO: 30 entspricht, in welcher die Aminosäuren in D-Konfiguration vorliegen.
    • SEQ ID NO: 33. Mit Heparin reagierendes Peptid, das einen Teil der Sequenz des sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktors enthält (aFGF) (Fromm et al., Arch. Biochem. Bioph. 343: 92 (1997)), auch bezeichnet als DPV8.
    • SEQ ID NO: 34. Mit Heparin reagierendes Peptid, das einen Tiel der Sequenz des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF) enthält, auch bezeichnet als DPV9 (Yayon et al., Cell 64: 841–848 (1991)).
    • SEQ ID NO: 35. Mit Heparin reagierendes Peptid, das dem C-terminalen Teil der intestinalen murinen Sequenz entspricht (Gongqiao et al., Glyconjug J. 13: 81–90 (1996)), auch bezeichnet als DPV10.
    • SEQ ID NO: 36: Mit Heparin reagierendes Peptid, das den Teil der C-terminalen Sequenz eines humanen γ-Interferons enthält (Lortat-Jacob & Grimaud, FEBS 280: 152–154 (1991)), auch bezeichnet als DPV11.
    • SEQ ID NO: 37: Mit Heparin reagierendes Peptid, das einen Teil der Sequenz der Untereinheit p40 des humanen Interleukins 12 enthält (Hasan et al., J. Immunol. 162: 1064–1070 (1999)), auch bezeichnet als DPV12.
    • SEQ ID NO: 38: Mit Heparin reagierendes Peptid, das einen Teil der Sequenz des Faktors 1α, gewonnen aus Bindegewebszellen, enthält (Amara et al., J. Biol. Chem. 272: 200–204 (1999)), auch bezeichnet als DPV 13.
    • SEQ ID NO: 39: Mit Heparin reagierendes Peptid, das einen Teil der Sequenz des "Heparinbindenden Proteins" enthält (CAP 37) (Pohl et al., FEBS 272: 200–204 (1990)), auch bezeichnet als DPV 15.
    • SEQ ID NO: 40: Mit Heparin reagierendes Peptid, das dem Peptid in Sequenz SEQ ID NO: 10 (1047) plus 13 N-terminalen Lysinen entspricht.
    • SEQ ID NO: 41: Mit Heparin reagierendes Peptid, das dem Peptid in Sequenz SEQ ID NO: 28 (DPV3)2) plus 13 N-terminalen Lysinen entspricht.
    • SEQ ID NO: 42: Mit Heparin reagierendes Peptid, das dem Peptid in Sequenz SEQ ID NO: 39 (DPV10) plus 13 N-terminalen Lysinen entspricht.
    • SEQ ID NO: 43: Peptid mit antimikrobieller Aktivität, das die Peptide in den Sequenzen SEQ ID NO: 10 (1047) und SEQ ID NO: 24 enthält.
    • SEQ ID NO: 44: Peptid mit antimikrobieller Aktivität, das die Peptide in den Sequenzen SEQ ID NO: 24 und SEQ ID NO: 30 (DPV7) enthält.
    • SEQ ID NO: 45: Peptid mit antimikrobieller Aktivität, das die Peptide in den Sequenzen SEQ ID NO: 24 und SEQ ID NO: 38 (DPV13) enthält.
    • SEQ ID NO: 46: Peptid, das die Peptide in Sequenz SEQ ID NO: 26 (DPV3)2 plus N-terminales Glycin-Phthalcyl enthält.
    • SEQ ID NO: 47: Peptid, das die Peptide in Sequenz SEQ ID NO: 21 (DPV6) plus ein N-terminales Salicylyl-Motiv enthält.
    • SEQ ID NO: 48: Peptid, das die Peptide in Sequenz SEQ ID NO: 21 (DPV6) plus ein C-terminales salicylisches Motiv enthält.
  • Peptide aus SEQ ID NOS: 1–29, 31–34 und 36–48 sind nur zu Anschauungszwecken aufgeführt.
  • Funktionalisierte Peptide:
  • Diese Peptide entsprechen SEQ ID NO: 1 bis 48 oben, tragen aber an der N-terminalen Seite entweder ein Cystein, das kovalente Kopplung an einige interessierende Substanzen ermöglicht, oder ein Biotin, das die non-kovalente Kombination von Peptiden mit Streptavidin ermöglicht, oder Avidin konjugiert mit Peroxidase.
  • BEISPIEL 2: INTEGRITÄT DES CACO-2 BARRIEREMODELLS
  • In einem synthetischen Serum-freien Medium (Basal Definiertes Medium, BDM) wurden Caco-2-Zellen mit einer Dichte von 160000 Zellen/cm2 auf einer mikroporösen Polyethylen-Terephtalat-Membran ausgesät, die zuvor mit bovinem Dermalkollagen beschichtet wurde. Das Kulturmedium wurde dreimal wöchentlich ausgetauscht, und die Zellen wurden 18 Tage lang bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO2 gehalten. Als Negativkontrolle zur Überprüfung der Integrität der Caco-2-Barriere wurde 106 dpm/ml D-[14C]-Mannitol benutzt. Als Positivkontrolle wurde L-[3H]-Prolin benutzt: aktiver Transport –106 dpm/ml, 10 μM als finale Konzentration. Andere Kontrollen beinhalteten D-[14C]-Mannitol/L-[3H]-Prolin + DPV7 30 μg/ml and D-[14C]-Mannitol/L-[3H]-Prolin + DPV10 30 μg/ml.
  • Trans-epitheliale Transportexperimente wurden ausgeführt. Der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) wurde gemessen, um die Integrität der Caco-2-Zellen-Monolayer zu prüfen. Die Monolayer der Zellen wurden über 8 Stunden bei 37°C in Hanks' balancierter Salzlösung präinkubiert (HBSS, 5 mM Glucose, ergänzt durch 10 mM Hepes). Nach 1, 2, 4 und 8 Stunden wurden 100 μl des Mediums aus dem unteren Kompartiment entnommen und durch frisches HBSS ersetzt. Nach Beendigung des Experiments (8 Stunden) wurden die Monolayer der Zellen dreimal mit PBS gewaschen und auf Grundlage von TEER gemessen. Dann wurden die Zellen gesammelt in 400 μl Tris-HCl 0,1 M pH 8,0, 0,5% Triton X100 und mittels Ultrasonikation gespalten. Die in 100 μl Zellhomogenat enthaltene Radioaktivität wurde gemessen. Die Menge an radioaktivem Material wurde mittels Flüssigkeitsszintillationsspektometrie analysiert, bei der ein Packard Tri-carb 1600CA Instrument (Packard Instrument Company, Meriden, CT, USA) genutzt wurde nach leichter Dispersion in 2 ml Aqualuma Cocktail (Lumac/3M BV, Schaesberg, Niederlande).
  • 2 zeigt den Transport von D-[14C]-Mannitol und L-[3H]proline. Die Ergebnisse zeigen an, dass der transepitheliale Transport von D-[14C]-Mannitol und L-[3H]-Prolin in den ersten vier Stunden proportional zur Dauer des Experiments ist. Der Transport von L-[3H]-Prolin (Positivkontrolle) war höher als der von D-[14C]-Mannitol (Negativkontrolle), wodurch angezeigt wird, dass das Caco-2 intestinale Barrieremodell benutzt werden kann, um den Transport von DPV-Insulin-Verbindungen zu bewerten. Zwischen 4 und 8 Stunden Inkubation verlangsamte sich der Transport von L- [ 3H ] -Prolin , und der Transport von D-[14C]-Mannitol nahm signifikant zu. Diese Beobachtung war das Ergebnis einer Veränderung der Monolayer der Zelle durch die lange Inkubation in HBSS. Die drastische Abnahme der TEER-Werte, die am Ende des Transportexperiments gemessen wurden (nach 8 Stunden Inkubation in HBSS) steht im Zusammenhang mit dieser Beobachtung (Tabelle 1).
  • Die Präsenz von 30 μg/ml DPV7 oder DPV10 hatte weder Auswirkung auf den Transport von D-[14C]-Mannitol noch L-[3H]-Prolin (3) noch auf die Mengen D-[14C]-Mannitol und L-[3H]-Prolin, die am Ende des Experiments mit den Zellen assoziiert wurden (4).
    TABELLE 1. TEER-Messungen
    Insertions-Nr. TEER vor Inkubation (Ω·cm2) TEER nach Inkubation (Ω·cm2)
    Control 1 2 3 540 495 512 143 173 124
    DPV7 1 2 3 506 828 545 117 145 129
    DPV10 1 2 3 500 458 501 153 201 201
  • BEISPIEL 3: INSULIN UND DPV-INSULIN KONJUGATE TRANSEPITHELIALER TRANSPORT
  • DPV-Insulin-Konjugate wurden synthetisiert. Kurz wurde das Insulin aktiviert durch einen um 10 Molar erhöhten heterobifunktionalen Quervernetzer, SMCC. Nach mehreren Reinigungsschritten, wurden DPV7 und DPV10 in 5-fach erhöhter Molarmenge hinzugefügt. Die Proben wurden erneut gereinigt, um ungekoppeltes Material zu entfernen, und die Konjugate wurden mittels SDS-Page elektrophoretischer Analyse geprüft. Insulin, DPV7- Insulin und DPV10-Insulin wurden in NaCl 0,15 M verdünnt, um eine Endkonzentration von 0,65 mg/ml zu erreichen. 30 μg eines jeden Moleküls wurden auf den Caco-2 Monolayern der Zellen inkubiert.
  • Trans-epitheliale Transportexperimente wurden ausgeführt. Der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) wurde gemessen, um die Integrität der Caco-2-Zellen-Monolayer zu prüfen. Die Monolayer der Zellen wurden über 30 Minuten bei 37°C in Hanks' balancierter Salzlösung präinkubiert (HBSS, 5 mM Glucose, ergänzt durch 10 mM Hepes). Die Insulinverbindungen wurden bei einer Konzentration von 60 μg/ml in 0,5 ml HBSS-Medium im oberen Kompartiment der Insertion zugefügt, gegenüber der apikalen Seite der Zelle. Das obere und untere Kompartiment enthielten jeweils 0,5 und 1,25 ml HBSS. Die Monolayer der Zellen wurden bei 37°C für 1, 4 oder 8 Stunden mit Insulinverbindungen inkubiert. Die Medien der oberen und unteren Kompartimente wurden entnommen. Die Monolayer der Zellen wurden dreimal mit PBS gereinigt und TEER wurde gemessen. Dann wurden die Zellen gesammelt in 400 μl Tris-HCl 0,1 M pH 8,0, 0,5% Triton X100. Für jede Bedingung wurden drei Insertionen benutzt (Triplikate).
  • Tabelle 2 zeigt die TEER-Werte, die vor und nach Inkubation mit den Verbindungen gemessen wurden. Die Ergebnisse zeigen an, dass DPV7-Insulin eine signifikante Abnahme des TEER-Werts nach 1 und 4 Stunden Inkubation induziert, woraus sich ergibt, dass das DPV7-Insulin zu diesen beiden Zeitpunkten Auswirkungen auf die Integrität der Caco-2 Monolayer hatte. Dieser Abfall der TEER-Werte und die Änderungen in der Zellmorphologie wurden bei Insulin und DPV10-Insulin nicht beobachtet. Auch zeigten die Ergebnisse eine signifikante Abnahme der TEER-Werte nach 8-stündiger Inkubation mit den drei Verbindungen. Dies stimmt überein mit den Ergebnissen aus Beispiel 1 und zeigt an, dass eine Inkubationszeit in HBSS von mehr als 4 Stunden die Caco-2 Zellbarriere verändert.
    TABELLE 2. TEER-Messungen
    Insertions-Nr. TEER vor Inkubation (Ω·cm2) TEER nach Inkubation (Ω·cm2)
    Insulin 1 h 1 2 3 458 592 445 478 561 425
    Insulin 4 h 1 2 3 510 451 606 305 324 325
    Insulin 8 h 1 2 3 442 451 498 151 145 151
    DPV7-Insulin 1 h 1 2 3 515 434 542 143 202 178
    DPV7-Insulin 4 h 1 2 3 639 548 600 129 112 116
    DPV7-Insulin 8 h 1 2 3 543 583 473 123 95 112
    DPV10-Insulin 1 h 1 2 3 553 656 599 537 660 573
    DPV10-Insulin 4 h 1 2 3 678 451 498 553 386 416
    DPV10-Insulin 8 h 1 2 3 650 613 605 194 190 186
  • BEISPIEL 4: DETEKTION UND QUANTIFIZIERUNG VON INSULINVERBINDUNGEN
  • Freie Insulinkonzentrationen wurden mit dem ELISA-Kit von Dako gemessen (ref. K6219). DPV-Insulinkonjugate konnten in einem selbst hergestellten Nachweisverfahren detektiert werden. DPV-Insulinkonjugate wurden absorbiert auf heparin-überzogenen Wells in 96-well Mikrotiter-Platten. Die Pegel des DPV-Insulinkonjugats wurden mit einem ELISA-abgeleiteten Nachweisverfahren unter Verwendung eines murinen Anti-Insulin monokionalen Antikörpers und einem Peroxidase-gekoppelten zweiten Antikörpers quantifiziert.
  • Die nach der Inkubation mit Caco-2 Zellen genommenen Proben wurden in BSA-überzogene Mikrotuben gegeben und bei –20°C gelagert, bis die Insulinpegel gemessen wurden. Freie Insulinpegel blieben während des ganzen Experiments in dem apikalen Medium stabil. Die apikale Konzentration des DPV-Insulinkonjugats nahm als Zeitfunktion ab. Nach 8 Stunden entsprachen die Pegel von DPV7-Insulin und DPV10-Insulin jeweils 25% und 35% der ursprünglichen Ladung (5). Nach 1 und nach 4 Stunden konnten ebenfalls signifikante Abnahmen der DPV-Insulinkonjugat-Pegel beobachtet werden (5). Zu diesen beiden Zeitpunkten, betrugen die Pegel der DPV-Insulinkonjugate 70% der ursprünglichen Ladung nach einer Stunde bei beiden Konjugaten, 54% und 64% der anfänglichen Ladung nach 4 Stunden, für DPV7-Insulin beziehungsweise DPV10-Insulin.
  • Eine kleine Menge an freiem Insulin wurde in dem basolateralen Medium detektiert (0,2% des geladenen Materials). Keine signifikanten Mengen an DPV-Insulinkonjugaten wurden in dem basolateralen Medium entdeckt, vermutlich weil das Nachweisverfahren zur Detektion von DPV-Insulinkonjugaten 1000fach weniger sensitiv ist als der Dako-Test zur Detektion von freiem Insulin. Zieht man diesen Unterschied der Sensitivität in Betracht, wäre es unwahrscheinlich gewesen, eine solch geringe Menge an DPV-Insulinkonjugat detektieren zu können.
  • Eine kleine Menge an freiem Insulin wurde in dem im Zelllysat (ungefähr 0,004% der ursprünglichen Ladung). Im Gegensatz dazu erreichte die Menge an DPV7-Insulin und DPV10-Insulin, die im Zelllysat nach einer Stunde Transport gefunden wurde, 1% beziehungsweise 4% der ursprünglichen Ladung (6). Diese Pegel blieben während des Experiments stabil, was darauf hindeutet, dass die Verbindungen nicht intrazellulär akkumulierten und die Caco-2 Zellen verlassen konnten.
  • Die Filter auf denen die Caco-2 Zellen gezüchtet wurden, wurden auch auf Vorkommen von Insulin und DPV-Insulin hin analysiert. Freie und DPV-Insulinkonjugate wurden auf den Filtern gefunden, wobei dieselben Quantifizierungsverfahren eingesetzt wurden, um einen direkten Vergleich der auf den Filtern verbliebenen Mengen an Verbindungen zu ermöglichen.
  • Die Resultate zeigen an, dass nur eine geringe Menge freien Insulins auf den Filtern verblieben ist. Im Gegensatz dazu, blieben die an DPV10 oder DPV7 gekoppelten Insulinkonjugate deutlich in den Zellkultureinsätzen gefangen.
  • BEISPIEL 5: IN VITRO QUANTIFIZIERUNG DER DPV-INSULINKONJUGATE
  • DPV-Insulinkonjugate wurden wie in Beispiel 2 beschrieben synthetisiert. Um die Messungen der Konjugatkonzentration zu validieren, wurden verschiedene Tests durchgeführt. Die Erkennung von DPV-Insulinkonjugaten wird durch den RIA Test verifiziert. Ein Standardkonzentrationskurve wird in vitro für jedes Konjugat etabliert, parallel zu freiem Insulin, so dass sichergestellt wird, dass die Konjugate vom Anti-Insulin-Antikörper erkannt werden, sowie um zu bestimmen, ob die Konjugate mit der korrekten Sensibilität bei Verwendung des RIA-Tests quantifiziert werden können.
  • BEISPIEL 6: IN VIVO QUANTIFIZIERUNG DER DPV-INSULINKONJUGATE
  • DPV Insulinkonjugate wurden wie in Beispiel 2 beschrieben synthetisiert. Die Aktivität von DPV-Insulinkonjugaten wurde in vivo nach subkutaner Injektion passender Mengen der Konjugate bei hyperglykämischen Ratten bewertet. Kontrollen wurden entweder mit freiem Insulin oder NaCl injiziert. Blutproben wurden zu vorbestimmten Zeitpunkten gesammelt und auf Insulin und Glukosekonzentrationen mit ELISA beziehungsweise mit der Glukose-Oxidase-Methode überprüft. Ein Ansteigen der Insulinkonzentration im Blut mit nachfolgender Abnahme der Blutglukosepegel zeigt an, dass die DPV-Insulinkonjugate biologisch aktiv sind.
  • BEISPIEL 7: IN VIVO EVALUATION DER DPV-INSULINKONJUGATE NACH ORALER VERABREICHUNG
  • Um festzustellen, ob die DPV-Insulinkonjugate die intestinale Barriere überwinden, werden die Verbindungen in das ileale Lumen von hyperglykämischen Ratten eingeführt. Kontrollen werden entweder mit freiem Insulin oder NaCl verabreicht, bevor der Übergang des Insulins in das Blut der behandelten Ratten evaluiert wird.
  • Die Glykämie der Tiere wird zumindest in den ersten drei Stunden nach Verabreichung alle 15 Minuten kontrolliert, in den folgenden 12 Stunden stündlich. Blutproben wurden zu vorbestimmten Zeitpunkten gesammelt und auf Glukosekonzentrationen mit der Glukose-Oxidase-Methode überprüft. Eine Abnahme der Blutglukosepegel zeigt an, dass das Insulin die intestinale Barriere passiert hat.
  • Bei den Tieren, in denen die in vivo Tests jedoch keine biologische Aktivität des Insulins anzeigten, war die in vitro Quantifizierung mittels RIA-Test möglich, Blut wird den Ratten zu einem Zeitpunkt nach der subkutanen Injektion entnommen und der Pegel des Insulinkonjugats wird mittels RIA in jeder Blutprobe bestimmt. Diese direkte Detektion des Insulins ermöglicht es zu bestimmen, ob das Konjugat die intestinale Barriere überwunden hat.
  • BEISPIEL 8: MORPHOLOGISCHE UND IMMUNOCYTOCHEMISCHE STUDIEN
  • Kleine intestinale, ileale Gewebe der hyperglykämischen Ratten, die mit den DPV-Insulinkonjugaten kontaktiert wurden, wurden gesammelt, um die Integrität der Tight Junctions zu verifizieren. Eine immunocytochemische Studie wird nach einem einzelnen Zeitpunkt (30 oder 60 Minuten) durchgeführt, um den transzellulären Transport des Insulins zu demonstrieren.
  • AUFLISTUNG DER SEQUENZEN
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Claims (19)

  1. Ein chimerisches Peptid, eine erste und eine zweite Domäne umfassend, wobei die erste Domäne eine Translokationssequenz umfasst, die den aktiven Transport durch eine biologische Membran oder eine physiologische Schranke erleichtert, und die zweite Domäne mindestens einen Abschnitt eines Insulin-Polypeptids umfasst, wobei die besagte Translokationssequenz aus SEQ ID NO: 30 oder SEQ ID NO: 35 ausgewählt ist, und wobei der besagte Abschnitt eines Insulin-Polypeptids der zweiten Domäne die Funktion hat, Blutglukoseniveaus zu senken.
  2. Das Peptid von Anspruch 1, wobei die physiologische Schranke die gastrointestinale Schranke oder die Blut-Hirn-Schranke ist.
  3. Das Peptid von Anspruch 1, wobei das Insulin-Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt ist, die Preproinsulin, Proinsulin, Insulin Alphakette, Insulin Betakette umfasst.
  4. Das Peptid von Anspruch 1, wobei der Abschnitt eines Insulin-Polypeptids aus der Gruppe ausgewählt ist, die SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 oder SEQ ID NO: 56 umfasst.
  5. Das Peptid von Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz der ersten Domäne weniger als 100 Aminosäuren lang ist.
  6. Das Peptid von Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz der ersten Domäne weniger als 50 Aminosäuren lang ist.
  7. Das Peptid von Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz der ersten Domäne weniger als 25 Aminosäuren lang ist.
  8. Eine Zusammensetzung, ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und ein pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel, Träger oder Hilfsstoff umfassend.
  9. Die Zusammensetzung nach Anspruch 8 in einer Zubereitung, die zur oralen oder transmukosalen Verabreichung geeignet ist.
  10. Ein Set, in einem oder in mehreren Behältern die Zusammensetzung von Anspruch 8 umfassend.
  11. Ein Set nach Anspruch 10, wobei der Behälter aus der Gruppe ausgewählt ist, die eine Ampulle, eine entsorgbare Spritze oder Dosisphiole umfasst.
  12. Eine isolierte Nukleinsäure, ein chimerisches Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 kodierend.
  13. Ein Vektor, die Nukleinsäure von Anspruch 12 umfassend.
  14. Eine Zelle, den Vektor von Anspruch 13 umfassend.
  15. Eine Zusammensetzung, die Nukleinsäure von Anspruch 12 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassend.
  16. Die Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Zubereitung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes.
  17. Eine Methode zur Zubereitung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Methode umfasst: – Kultivierung einer Zelle, eine Nukleinsäure nach Anspruch 12 umfassend, unter Bedingungen, die für die Expression des besagten Peptids sorgen, und – Gewinnung des exprimierten Peptids.
  18. Eine Methode zur Erhöhung der intrazellulären Insulinkonzentration in einer nichtembryonalen eukaryotischen Zelle in vitro, wobei die Methode umfasst: – Zurverfügungstellung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 7, und – Kontaktierung der Zelle mit dem Peptid unter Bedingungen, die den aktiven Stoffwechsel der eukaryotischen Zelle fördern.
  19. Methode zur Senkung der intrazellulären Glukosekonzentration in einer nichtembryonalen eukaryotischen Zelle in vitro, wobei die Methode umfasst: – Zurverfügungstellung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 7, und – Kontaktierung der Zelle mit dem Peptid unter Bedingungen, die den aktiven Stoffwechsel der eukaryotischen Zelle fördern
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