DE69813204T2

DE69813204T2 - Materialen und verfahren im zusammenhang mit der inhibierung der wechselwirkung der p53 und mdm2

Info

Publication number: DE69813204T2
Application number: DE69813204T
Authority: DE
Inventors: Philip David LANE
Original assignee: University of Dundee
Current assignee: University of Dundee
Priority date: 1997-04-22
Filing date: 1998-04-20
Publication date: 2004-02-05
Anticipated expiration: 2018-04-21
Also published as: WO1998047525A1; EP0977580B1; AU731431B2; EP0977580A1; CA2287344A1; GB9708092D0; AU7064498A; ATE236651T1; DE69813204D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegenden Erfindung betrifft Materialien und Verfahren zur Inhibierung der Wechselwirkung von p53 und mdm2 und spezieller die Zerstörung der Bindung von p53 und mdm2 oder das Inhibieren der Produktion von mdm2 in Zellpopulationen, die mdm2 nicht überexprimieren, um das mdm2-Targeting von p53 für den Abbau zu inhibieren.
Hintergrund der Erfindung
Das Tumorsuppressorprotein p53 wird bei genotoxischem Insult von Zellen aktiviert und agiert als Transkriptionsfaktor zur Induktion von Zellzyklus-Stillstand oder Apoptose in Zellen nach DNA-Schädigung. Frühere Berichte haben vorgeschlagen, dass die Zeltproliferation von einem genau abgestimmten Gleichgewicht zwischen der Expression des Onkogens mdm2 und dem Tumorsuppressor p53 abhängen könnte (Chen et al. 1994; Finlay, 1993; Otto und Deppert, 1993). Dies beruht auf einer autoregulatorischen Rückkoppelungsschleife für die p53-Aktivität, bei der mdm2 involviert ist, da mdm2 durch Bindung von p53 an einen internen Promotor innerhalb des mdm2-Gens transkriptionell aktiviert wird. (Juven et al., 1993; Wu et al., 1993). Es bindet dann den N-Terminus von p53 und verhindert dadurch die Wechselwirkung von p53 mit der Transkriptionsmaschinerie (Momand et al., 1992; Oliner et al., 1993).
Die eindrucksvollste Bestätigung für die Wichtigkeit dieser autoregulatorischen Schleife für das Überleben der Zellen stammt von Experimenten mit transgenen Mäusen. Mdm2 -/- -Mäuse überleben nur in Abwesenheit von p53 (Jones et al., 1995; Montes de Oca Luna et al., 1995). Dies spricht dafür, dass der p53-Aktivitätsspiegel in der Frühentwicklung stark kontrolliert sein muss und dass mdm2 an diesem Kontrollweg beteiligt ist.
Die cDNA-Sequenz von Human-mdm2 ist in WO 93/20238 dargelegt, die offenbart, dass überschüssige mdm2-Spiegel in einigen Tumorzellen, wie z. B. bestimmten Sarkom-Typen vorhanden sind: Diese Anmeldung offenbart, dass die Überexpression von mdm2 die normale Rückkoppelungsschleife zwischen mdm2 und p53 stört, was mdm2-überexprimierenden Zellen ermöglicht, durch Bindung von p53 der p53-regulierten Wachstumskontrolle zu entgehen. WO 93/20238 schlägt daher vor, dass Moleküle, die die Bindung von p53 an mdm2 inhibieren, als Therapeutika für Konditionen, bei denen mdm2 überexprimiert wird, verwendet werden könnten, indem diese Sequestrierung von p53 verringert und dadurch die normale p53-Kontrolle wiederhergestellt wird. WO 93/20238 kartiert die p53-Domänen, die für die mdm2-Bindung an die Aminosäurereste 13–41 notwendig sind, sowie zusätzliche Reste entweder an der carboxy- oder aminoterminalen Seite dieses Peptids.
WO 96/02642 beschreibt Experimente zur Verfeinerung des Peptid-Motivs von p53, das für die Bindung an mdm2 verantwortlich ist und zeigt, dass das Motiv weniger ausgedehnt ist, als in WO 93/20238 offenbart wurde. WO 96/02642 offenbart, dass ein FxxLW-Motiv zwischen den Aminosäureresten 18–23 von p53 (worin x eine beliebige Aminosäure sein kann) ausreicht, um mdm2 zu binden. Diese Motiv kann verwendet werden, um auf therapeutische Verbindungen zu screenen, die zur Zerstörung der Wechselwirkung fähig sind, so dass die transkriptionelle Aktivität von p53 in mdm2 überexprimierenden Zellen wiederhergestellt werden kann.
Mittels Phagen-Display ist ein Satz von Peptiden gefunden worden, die als höchst potente Inhibitoren in p53-mdm2-Bindungstests wirken, was darauf basiert, dass sie Mutationen im obigen mdm2-Bindungsmotiv enthalten (Böttger et al., 1996).
Ein signifikanter Nachteil bei der Verfolgung von Therapien auf Basis dieses Modells der Rolle von mdm2 ist jedoch, dass die Überexpression von mdm2 nur in einer kleinen Gruppe von Sarkomen auftritt, was die therapeutischen Anwendungen von Verbindungen, die zur Zerstörung der Bindung von p53 und mdm2 fähig sind, einschränkt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegenden Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass mdm2 an p53 in Zellen bindet, in denen mdm2 nicht überexprimiert wird, d. h. in Zellen, in denen mdm2 in normalen oder niedrigen Spiegeln exprimiert wird, und dass in diesen Zellen diese Wechselwirkung auf den Abbau von p53 abzielt. Diese Entdeckung bedeutet, dass das Inhibieren der mdm2-Produktion und/oder das Inhibieren der Bindung von mdm2 an p53 die Erhöhung der p53-Spiegel durch Herabsetzung der p53-Clearance durch mdm2 ermöglicht und zur Aktivierung der p53-Funktion verwendet werden kann.
Diese Ergebnisse gingen aus Experimenten hervor, bei denen höchst potente Peptid-Inhibitoren der Wechselwirkung zwischen mdm2 und p53 verwendet wurden, die als Peptid-Aptamere an der Oberfläche von bakteriellem Thioredoxin exprimiert wurden. Herkömmliche Peptide können wegen ihrer niedrigen Aufnahme und Empfindlichkeit gegen Abbau ein sehr niedriges Potential aufweisen, ihre Funktion in vivo zu erfüllen. Demgemäß basieren die hierin beschriebenen Experimente auf der Konstruktion von Peptid-Aptameren, die die Peptidsequenz inhibitorischer Peptide an der Aktivstellenschleife von Escherichia coli-Thioredoxin präsentieren (LaVallie et al., 1993). Diese Aptamere werden in vitro in mdm2-Bindungstests charakterisiert.
Die Mikroinjektion von für diese Aptamere kodierenden Plasmiden in Zellen, die p53- reaktionsfähige Reporterelemente enthalten, bewirkt eine markante Aktivierung des β-Galactosidase-Reportergens. Zellen mit normalen mdm2-Spiegeln reagieren sogar noch drastischer als Tumorzellen, die hohe mdm2-Spiegel akkumuliert haben.
Das potenteste Aptamer, TIP 12/1, zeigte eine ähnliche Bindungsaffinität für mdm2 wie bakterielles Volllängen-wt-p53. Dies machte es zu einem potenten Inhibitor, der in Säugetierzellen exprimiert werden könnte.
Demgemäß stellt die vorliegenden Erfindung in einem ersten Aspekt die Verwendung eines Mittels mit der Eigenschaft, die Bindung von p53 und mdm2 zu zerstören oder die Produktion von mdm2 in einer Population von Zellen zu inhibieren, für die Herstellung eines Medikaments zur p53-Aktivierung bereit, worin die Zellpopulation mdm2 nicht überexprimiert. Folglich befasst sich die Erfindung mit der Inhibierung des biologischen Stoffwechselwegs, durch den mdm2 auf den Abbau von p53 in normalen Zellen abzielt.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegenden Erfindung ein Verfahren der p53-Aktivierung bereit, das die Exposition einer Zellpopulation mit einem Mittel umfasst, das die Eigenschaft aufweist, die Bindung von p53 und mdm2 zu zerstören oder die Produktion von mdm2 zu inhibieren, so dass p53 in Zellen aktiviert wird, wobei die Zellen mdm2 nicht überexprimieren.
Die p53-Moleküle, die durch das obige Verfahren aktiviert werden können, umfassen wt p53 und mutierte p53-Moleküle, die die Eigenschaft der Bindung an mdm2, z. B. durch eine oder mehrere der in WO 93/20238 oder WO 96/02642 beschriebenen Wechselwirkungsdomänen beibehalten.
Eine Vielzahl von Mitteln kann verwendet werden, um die Bindung von p53 und mdm2 zu zerstören oder die Produktion von mdm2 in einer Zellpopulation zu inhibieren. Beispiele der ersteren Art von Mitteln umfassen Verbindungen, die p53-Peptidfragmente mit einer mdm2-Bindungsdomäne enthalten, oder andere Verbindungen mit der Eigenschaft, an eine oder mehrere mdm2-Regionen zu binden, die an der p53-Bindung beteiligt sind, wie z. B. Antikörper, die zur Blockierung einer p53-Bindunsstelle von mdm2 fähig sind. Alternativ dazu können Verbindungen, die mit mdm2 um die p53-Bindung konkurrieren, jedoch nicht eine biologische Aktivität von p53, z. B. für die DNA-spezifische Bindung inhibieren, verwendet werden, um die mdm2-Bindung von p53 zu inhibieren. Beispiele dieser Verbindungen umfassen Antikörper, die zur Blockierung einer mdm2-Bindungsstelle von p53 fähig sind.
Beispiele des letzteren Ansatzes zur Einschränkung der mdm2-Produktion umfassen die Verwendung von Antisense-Techniken, um die mdm2-Produktion zu inhibieren, oder die Verwendung anderer Substanzen, welche die Down-Regulation der mdm2-Produktion bewirken. Diese sind unten ausführlich erläutert.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegenden Erfindung eine Zelllinie bereit, die mdm2 nicht überexprimiert, wobei die Zelllinie mit einem Reporterkonstrukt transfiziert ist, das Nucleinsäure umfasst, die für ein Reporter-Polypeptid unter der Kontrolle von Promotorelementen kodiert, die zur Reaktion auf für spezifische DNA-Bindung aktiviertes p53 fähig sind, um die Expression des Reporter-Polypeptids zu steuern. Folglich kann diese Zelllinie verwendet werden, um Substanzen auf die Eigenschaft hin zu testen, die Bindung von p53 und mdm2 zu zerstören oder die Produktion von mdm2 zu inhibieren.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegenden Erfindung ein Screeningverfahren auf Substanzen bereit, die zur Zerstörung de Bindung von p53 und mdm2 oder zur Inhibierung der mdm2-Produktion in einer Zellpopulation fähig sind, die mdm2 nicht überexprimieren, wobei die Zellen mit einem Reporterkonstrukt transfiziert sind, das Nucleinsäure umfasst, die für ein Reporter-Polypeptid unter der Kontrolle von Promotorelementen kodiert, die auf den für die spezifische DNA-Bindung aktivierten p53-Spiegel reagieren, um die Expression des Reporter-Polypeptids zu steuern, wobei das Verfahren das Exponieren der Zellen mit den Kandidatsubstanzen und die Detektion der Gegenwart des Reporter-Polypeptids umfasst.
Zweckdienlicherweise kann dies, wo die Substanz ein Peptid ist, durch Transfizieren der Zellen mit einem Expressionsvektor erzielt werden, der eine Nucleinsäure umfasst, die für die Substanz kodiert, so dass die Substanz in mit dem Vektor transfizierten Zellen exprimiert wird. Wie unten beschrieben kann das Kandidatpeptid als Fusion mit einem Polypeptid, wie z. B. Thioredoxin exprimiert werden, um z. B. das Kandidatenpeptid in einer bestimmten Konformation zu präsentieren.
Kurzbeschreibung der Figuren
Die vorliegenden Erfindung wird nun beispielhaft unter Bezugnahme auf die begleitenden Figuren beschrieben. Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung sind für Fachkundige offensichtlich sein.
1: Schematische Darstellung der Aptamere TIP und TIP 12/1, welche die zwischen G³³ und P³⁴ von E. coli-Thioredoxin insertierte Peptidsequenzen zeigt. Abweichungen von der p53-wt-Sequenz in TIP 12/1 sind fett gedruckt, wobei die nicht austauschbaren Aminosäuren unterstrichen sind. Die 3D-Struktur für Thioredoxin wurde von der Protein Data Bank (PDB), Brookhaven National Laboratory, erhalten und unter Anwendung des Public-Domain-Programms RasMol dargestellt.
2: Immunpräzipitation aus Zell-Lysaten von U2-OS-, MCF-7- und OSA-Zellen unter Verwendung von Anti-p53 Pab 421 (Spuren 2, 5 und 7). Anti-mdm2-Mab 4B2 (Spuren 3, 6 und 8) oder kein Antikörper für die Kontrollen (Spuren 1 und 4). Präzipitierte Proteine wurden durch SDS-PAGE getrennt und Western-Blotting unterworfen. In (a) wurden Western-Blots mit einem Gemisch von monoklonalen Anti-mdm2-Antikörpern (3G5, 4B2 und SMP14) gefärbt. In (b) wurden sie mit Anti-p53-Kaninchen-Antiserum CM1 (1/ 1000) gefärbt. Die Position von mdm2 im Vergleich zur Schwer- (HC) und Leichtkette (LC) von Maus-Immunglobulinen sind an der linken Seite des Blots markiert, ebenso die Position von p53. In Spuren 1–8 an beiden Blots wurden Aliquoten derselben Proben analysiert.
3: Lösliche β-Galactosidase-Tests von Zell-Lysaten, die mit für RGCΔlacz und TIP 12/1 (schwarze Balken) oder Trx (weiße Balken) kodierender DNA transfiziert waren. Die höchste Aktivität wurde in mit TIP 12/1 transfizierten MCF-7-Zellen gemessen und wurde als 100% eingesetzt.
4: Western-Blot von SAOS-2-Zell-Lysaten 48 Stunden nach Transfektion von Kontrollplasmid (Spur 1), wt p53 alleine (Spur 2) oder gemeinsam mit mdm2 (Spur 3) und F¹⁹→A-Mutante p53 alleine (Spur 4) und in Kombination mit mdm2 (Spur 5).
Ausführliche Beschreibung
In der vorliegenden Erfindung bezieht sich „Aktivieren von p53" auf die Eigenschaft des Aktivierens von p53 für DNA-spezifische Bindung und Transkription.
In der vorliegenden Erfindung umfassen „Zellen, die mdm2 nicht überexprimieren" alle Zellen, in denen mdm2 in niedrigen oder normalen Spiegeln vorliegt. Diese umfasst nicht Zellen, in denen mdm2 überexprimiert wird, wie z. B. die in WO 93/20238 offenbarten Sarkom-Zellen. Es ist durch immunologische Messung der mdm2-Konzentration unter Anwendung fachbekannter Verfahren möglich zu ermitteln, ob Zellen mdm2 überexprimieren.
Peptide
Eine Klasse von Agenzien, die verwendet werden kann, um die Bindung von p53 und mdm2 zu zerstören, sind Peptide auf Basis der Sequenzmotive von p53, die mit mdm2 wechselwirken. Diese Peptide können auf diejenigen p53-Regionen basieren, die mit mdm2 wechselwirken, die in WO 93/20238 und WO 96/02642 offenbart sind. Solche Peptide neigen dazu, kleine Moleküle zu sein, vorzugsweise mit einer Länge von weniger als 25 Aminosäuren, bevorzugter weniger als 20 Aminosäuren, bevorzugter weniger als 15 Aminosäuren und bevorzugter weniger als 10 Aminosäuren. Die vorliegenden Erfindung sieht ferner Peptide vor, die Sequenzvarianten oder Derivate einer p53-Sequenz der Wildform sind.
Varianten-Peptide weisen eine Aminosäuresequenz auf, die sich von der wt-p53-Sequenz unterscheidet, z. B. im in WO 96/02642 beschriebenen Motiv zwischen Amino säuren 13–41, und zwar durch eines oder mehreren von Addition, Substitution, Deletion und Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren, die jedoch die Aktivität der Bindung an mdm2 beibehalten. Solche Varianten umfassen vorzugsweise das Motiv FxxxW, wobei x eine beliebige Aminosäure sein kann, und weisen typischerweise eine Aminosäuresequenzidentität von zumindest ungefähr 70%, bevorzugter zumindest ungefähr 80%, bevorzugter zumindest ungefähr 90% oder bevorzugter zumindest ungefähr 95% mit dem entsprechenden Teil von Human-p53 auf. Beispiele von zur Zerstörung der Wechselwirkung von p53 und mdm2 fähigen Peptiden sind die in Böttger et al., 1996, und in den untenstehenden Beispielen offenbarten Thioredoxin-Insert-Peptide (TIP_S), siehe insbesondere Peptid TIP 12/1.
Der Fachkundige kann die hierin beschriebenen und andere im Fach bekannte Techniken anwenden, um große Mengen der Peptide oder Varianten davon für die Verwendung als Pharmazeutika oder bei der Entwicklung von Medikamenten herzustellen. Die Peptide können durch Expression aus kodierender Nucleinsäure hergestellt und mit im Fach bekannten Techniken gereinigt werden.
Die Peptide können ferner völlig oder teilweise durch chemische Synthese erzeugt werden. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können nach gut etablierten, standardmäßigen Flüssig- oder vorzugsweise Festphasen-Peptidsyntheseverfahren leicht hergestellt werden, wobei allgemeine Beschreibungen davon allgemein verfügbar sind (siehe zum Beispiel J. M. Stewart und J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Aufl., Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984), M. Bodanzsky und A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984); und Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc., Foster City, California), oder sie können in Lösung hergestellt werden, und zwar durch das Flüssigphasen-Verfahren oder durch jede Kombination von Festphasen-, Flüssigphasen- und Lösungsmittel-Chemie, z. B. indem zunächst das betreffende Peptid-Teil vervollständigt und dann, falls gewünscht und angebracht, nach Entfernung aller vorhandener Schutzgruppen, der Rest X durch Reaktion der entsprechenden Carbon- oder Sulfonsäure oder eines reaktiven Derivats davon eingeführt wird.
Die Erfindung umfasst auch Derivate der obigen Peptide und umfasst das an einen Kopplungspartner, z. B. ein Effektor-Molekül, einen Marken, ein Medikament, ein Toxin und/oder ein Transportmolekül, wie z. B. das in WO 91/19981 beschriebene Penetratin-Peptid, gebundene Peptid. Die Techniken zur Kopplung der Peptide der Erfindung sowohl an Peptidyl-, als auch an Nicht-Peptidyl-Kopplungspartner sind im Fach bekannt.
Zusätzlich ist es möglich, das Peptid, die Peptidvariante oder das Derivat (wenn es Peptidyl ist) unter Verwendung eines Expressionsvektors zu exprimieren, der eine Nucleinsäure umfasst, die für das Peptid, die Variante oder das Derivat kodiert und sich unter der Kontrolle von Kontrollsequenzen befindet, um deren Expression zu detektieren.
Wo es sich bei der Substanz oder einem Teil davon um Peptidyl handelt, ist ein zweckdienlicher Weg für ihre Produktion die Expression der dafür kodierenden Nucleinsäure in einem geeigneten Expressionssystem. Die Anwendung von Expressionssystemen hat heute einen hohen Grad an Ausgereiftheit erreicht.
Folglich sieht die vorliegenden Erfindung auch ein Verfahren der Herstellung der hierin offenbarten Substanzen vor, wobei das Verfahren die Expression aus Nucleinsäure umfasst, die für die Substanz kodiert. Dies kann in geeigneter Weise durch Züchtung einer Wirtszelle in Kultur erzielt werden, die einen Vektor enthält, der Nucleinsäure unter der Kontrolle von Sequenzen umfasst, um ihre Expression unter geeigneten Bedingungen zu steuern, die die Expression des Peptids bewirken oder erlauben. Peptide können auch in In-vitro-Systemen, wie z. B. Retikulozyten-Lysaten exprimiert werden.
Systeme für die Klonierung und Expression eines Peptids in einer Vielzahl von verschiedenen Wirtszellen sind bekannt. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien, eukaryotische Zellen, wie z. B. Säugetierzellen und Hefe, und Bakulovirus-Systeme. Säugetier- Zeltlinien, die auf dem Gebiet der Erfindung für die Expression eines heterologen Peptids verfügbar sind, umfassen Chinahamster-Eierstockzellen, HeLa-Zellen, Babyhamster-Nierenzellen, COS-Zellen und viele andere. Ein gebräuchlicher, bevorzugter Wirt ist E. coli.
Geeignete Vektoren können gewählt oder konstruiert werden, die geeignete Regulationssequenzen, einschließlich Promotorsequenzen, Terminatorfragmente, Polyadenylierungssequenzen, Enhancersequenzen, Markergene und andere jeweils anwendbare Sequenzen enthalten. Vektoren können je nach Eignung Plasmide, Viren, z. B. Phagen oder Phagemide, sein. Für weitere Einzelheiten siehe beispielsweise "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Aufl., Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Zahlreiche bekannte Techniken und Protokolle für die Nucleinsäure-Manipulation, beispielsweise bei der Herstellung von Nucleinsäurekonstrukten, Mutagenese, Sequenzierung, Einführung von DNA in Zellen und Genexpression, und bei der Analyse von Proteinen sind in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (Hrsg.), John Wiley & Sons (1992), ausführlich beschrieben.
Noch ein weiterer Aspekt stellt ein Verfahren bereit, das die Einführung der Nucleinsäure in eine Wirtszelle umfasst. Die Einführung, die allgemein ohne Einschränkung als „Transformation" bezeichnet werden kann (insbesondere für die In-vitro-Einführung), kann jegliche verfügbare Technik anwenden. Für eukaryotische Zellen können geeignete Techniken Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran, Elektroporation, Liposomvermittelte Transfektion und Transduktion unter Verwendung von Retrovirus oder eines anderen Virus, z. B. Vakziniavirus, oder Bakulovirus für Insekten umfassen. Für Bakterienzellen können geeignete Techniken Calciumchlorid-Transformation, Elektroporation und Transfektion mit Bakteriophagen umfassen. Als Alternative könnte die direkte Injektion der Nucleinsäure eingesetzt werden.
Marker-Gene, wie z. B. Antibiotikaresistenz- oder -empfindlichkeits-Gene können bei der Identifizierung von Klonen verwendet werden, die Nucleinsäure von Interesse enthalten, wie im Fach bekannt ist.
Der Einführung kann das Bewirken oder Ermöglichen der Expression aus der Nucleinsäure folgen, z. B. durch Kultivieren von Wirtszellen (die die eigentlich transformierten Zellen umfassen können, jedoch werden die Zellen wahrscheinlicher Nachkommen der transformierten Zellen sein) unter Bedingungen für die Expression des Gens, so dass das kodierte Peptid produziert wird. Wenn dass Peptid an ein geeignetes Signalleitpeptid gekoppelt exprimiert wird, kann es aus der Zelle in das Kulturmedium sekretiert werden. Nach der Produktion durch Expression kann ein Polypeptid aus der Wirtszelle und/oder dem Kulturmedium isoliert und/oder gereinigt und wie gewünscht verwendet werden, z. B. bei der Formulierung einer Zusammensetzung, die eine oder mehrere zusätzliche Komponenten enthalten kann, wie z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Exzipienten, Vehikel oder Träger umfasst (siehe z. B. unten).
Antikörper
Das zur Zerstörung der Bindung von p53 und mdm2 verwendete Mittel kann ein Antikörper sein, der in dazu fähig ist, eine p53-Bindungsstelle von mdm2 spezifisch zu blockieren, das sind Antikörper, die mdm2-Antagonisten sind. Die Herstellung von Antikörpern ist im Fach bekannt und wird unten ausführlich beschrieben. Ein Beispiel eines solchen Antikörpers ist der von Blaydes et al. (1997) beschriebene 3G5-Antikörper.
Die vorliegenden Erfindung umfasst ferner Antikörper, die mit mdm2 um die p53-Bindung konkurrieren, die jedoch eine biologische Aktivität von p53 nicht inhibieren, z. B. die DNA-spezifische Bindung von p53 nicht antagonisieren.
Es ist möglich, monoklonale Antikörper mit den obigen Bindungsspezifitäten unter Anwendung von Verfahren, die im Fach gut etabliert sind, herzustellen. Monoklonale Antikörper können den Techniken der rekombinanten DNA-Technologie unterworfen werden, um andere Antikörper oder chimäre Moleküle herzustellen, die die Spezifität des ursprünglichen Antikörpers beibehalten. Solche Techniken könne die Einführung von DNA umfassen, die für die variable Immunglobulin-Region oder die komplementaritätsbestimmenden Regionen ("complementary determining regions"; CDRs) eines Antikörpers kodieren, in die Konstantregionen oder Konstantregionen plus Gerüstregionen eines anderen Immunglobulins. Siehe beispielsweise EP-A-184.187, GB-A-2.188.638 oder EP-A-239.400. Ein Hybridom, das einen monoklonalen Antikörper produziert, kann genetischer Manipulation oder anderen Änderungen unterworfen werden, die die Bindungsspezifität von produzierten Antikörpern verändern können oder auch nicht verändern.
Bevorzugte Antikörper gemäß der Erfindung sind in dem Sinne isoliert, als das sie frei von Kontaminanten sind, wie z. B. zur Bindung an andere Polypeptide fähigen Antikörpern, und/oder frei von Serumskomponenten sind. Monoklonale Antikörper werden für manche Zwecke bevorzugt, obgleich auch polyklonale Antikörper im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung enthalten sind.
Antikörper können unter Anwendung von Techniken erhalten werden, die im Fach maßgeblich sind. Verfahren der Produktion von Antikörpern umfassen das Immunisieren eines Säugetiers (z. B. Maus, Ratte, Kaninchen, Pferd, Ziege, Schaf oder Affe) mit dem Protein oder einem Fragment davon. Antikörper können aus immunisierten Tieren unter Anwendung jeglicher einer Reihe von fachbekannten Techniken erhalten und vorzugsweise mittels Bindung des Antigens an Antigen von Interesse erhalten werden. Beispielsweise können Western-Blotting-Techniken oder Immunpräzipitation angewendet werden (Armitage et al., Nature 357, 80–82 (1992)). Die Isolierung von Antikörpern und/ oder Antikörper-produzierenden Zellen aus einem Tier kann mit der Tötung des Tieres einhergehen.
Als Alternative oder Ergänzung zur Immunisierung eines Säugetiers mit einem Peptid kann ein für ein Protein spezifischer Antikörper aus einer rekombinant hergestellten Bibliothek von exprimierten variablen Immunglobulindomänen erhalten werden, z. B. unter Verwendung des Lambda-Bakteriophagen oder filamentösen Phagen, die funktionstüchtige Immunglobulin-Bindungsdomänen on ihren Oberflächen präsentieren; für Beispiele siehe WO 92/01047. Die Bibliothek kann nativ, d. h. aus Sequenzen konstruiert sein, die aus einem Organismus erhalten werden, der mit keinem der Proteine (oder Fragmente) immunisiert worden ist, oder kann eine sein, die unter Verwendung von Sequenzen konstruiert ist, die aus einem Organismus erhalten werden, der dem Antigen von Interesse exponiert worden ist.
Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung können auf zahlreiche Weisen modifiziert werden. In der Tat sollte der Begriff „Antikörper" dahingehend ausgelegt werden, dass er jede bindende Substanz umfasst, die eine Bindungsdomäne mit der erforderlichen Spezifität aufweist. Folglich umfasst die Erfindung Antikörperfragmente, Derivate, funktionelle Äquivalente und Homologe von Antikörpern, einschließlich synthetische Moleküle und Moleküle, deren Gestalt jene eines Antikörpers nachahmt, was ihre Bindung an Antigen oder Epitop ermöglicht.
Beispiele von Antikörperfragmenten, die zur Bindung eines Antigens oder anderen Bindungspartners fähig sind, sind das Fab-Fragment, das aus den VL-, VH-, C1 und CH1-Domänen besteht; das Fd-Fragment, das aus den VH- und CH1-Domänen besteht; das Fv-Fragment, das aus den VL- und VH-Domänen eines einzelnen Arms eines Antikörpers besteht; das dAb-Fragment, das aus einer VH-Domäne besteht; isolierte CDR-Regionen und F(ab')2-Fragmente, ein zweiwertiges Fragment, das zwei durch eine Disulfidbrücke an der Hinge-Region verbundene Fab-Fragmente umfasst. Einzelketten-Fv-Fragmente sind ebenfalls umfasst.
Ebenfalls in der vorliegenden Erfindung umfasst sind humanisierte Antikörper, bei denen CDRs von einer nicht-humanen Quelle auf humane Gerüstregionen aufgepfropft sind, typischerweise mit der Änderung einiger der Gerüstaminosäurereste, um Antikörper bereitzustellen, die weniger immunogen als die nicht-humanen Stamm-Antikörper sind.
Ein Hybridom, das einen monoklonalen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung produziert, kann genetischer Mutation oder anderen Veränderungen unterworfen werden. Es wird weiters von den Fachkundigen wohlverstanden, dass ein monoklonalen Antikörper den Techniken rekombinanter DNA-Technologie unterworfen werden kann, um andere Antikörper oder chimäre Moleküle herzustellen, die die Spezifität des ursprünglichen Antikörpers beibehalten. Solche Techniken können die Einführung von DNA, die für die variable Immunglobulin-Region oder die komplemenataritätsbestimmenden Regionen (CDRs) kodiert, eines Antikörpers auf die Konstantregionen plus Gerüstregionen eines anderen Antikörpers umfassen. Siehe beispielsweise EP-A-184.187, GB-A-2.188.638 oder EP-A-239.400. Die Klonierung und Expression chimären Antikörper wird in EP-A-120.694 und EP-A-125.023 beschrieben.
Hybridome, die zur Produktion von Antikörpern mit gewünschten Bindungseigenschaften fähig sind, liegen im Schutzumfang der Erfindung, wie auch eukaryotische oder prokaryotische Wirtszellen, die für Antikörper (einschließlich Antikörperfragmente) kodierende Nucleinsäure enthalten und zu deren Expression fähig sind. Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Herstellung der Antikörper bereit, einschließlich der Züchtung einer Zelle, die zur Produktion des Antikörpers unter Bedingungen fähig ist, bei denen der Antikörper produziert und vorzugsweise sekretiert wird.
Die Reaktivitäten von Antikörpern an einer Probe können auf jegliche Weise bestimmt werden. Markierung mit einzelnen Reportermolekülen ist eine der Möglichkeiten. Die Reportermoleküle können direkt oder indirekt detektierbare und vorzugsweise messbare Signale erzeugen. Die Bindung von Reportermolekülen kann direkt oder indirekt, kovalent, z. B. über eine Peptidbindung, oder nicht-kovalent sein. Die Bindung über eine Peptidbindung kann als Resultat der rekombinanten Expression einer Genfusion erfolgen, die für Antikörper und Reportermolekül kodiert.
Regulation der mdm2-Produktion in Zellen
Die vorliegende Erfindung umfasst Verfahren zur Regulation der mdm2-Produktion in Zellen, die mdm2 nicht überexprimieren. Ein Beispiel dieses Ansatzes ist die Anwendung von Antisense-Techniken, um die Produktion von mdm2 zu inhibieren.
Die Antisense-Oligonucleotide können auf der in WO 93/20238 dargelegten Humanmdm2-Sequenz beruhen und dazu verwendet werden, um die Synthese von mdm2 in Zellen, in denen mdm2 in normalen oder niedrigen Spiegeln exprimiert wird, zu inhibieren oder zu blockieren. Antisense-Oligonucleotide können so konstruiert sein, dass sie an die komplementäre Nucleinsäure-, pre-mRNA- oder reife mRNA-Sequenz hybridisieren, wobei sie die Produktion von Polypeptid stört, die von einer gegebenen DNA-Sequenz kodiert wird, so dass dessen Expression vermindert oder völlig verhindert wird. Zusätzlich zu der für mdm2 kodierenden Sequenz können Antisense-Techniken für das Targeting der Kontrollsequenzen des mdm2-Gens verwendet werden, z. B. in der 5'-flankierenden Sequenz der für mdm2 kodierenden Sequenz, wobei die Antisense-Oligonucleotide die mdm2-Kontrollsequenzen stören können. Die Konstruktion von Antisense-Sequenzen und ihre Verwendung wird in Peyman und Ulman, Chemical Reviews 90, 543–584 (1990), Crooke, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32, 329-376 (1992) und Zamecnik und Stephenson, P. N. A. S. 75, 280–284 (1974) beschrieben.
Die oben erwähnte Zelllinie kann verwendet werden, um auf Substanzen zu screenen, die die Eigenschaft des Modulierens der mdm2-Produktion aufweisen, z. B. das Herabsetzen der in den Zellen exprimierten mdm2-Menge, um das Targeting von p53 für den Abbau zu vermindern. Dies wird weiter unten diskutiert.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die Agenzien der Erfindung können zu pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden, z. B. als Medikamente für die p53-Aktivierung in Zellen, die mdm2 nicht überexprimieren. Diese Zusammensetzungen können zusätzlich zu einer der obigen Substanzen einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, Träger, Puffer, Stabilisator oder andere dem Fachkundigen bekannte Materialien umfassen. Solche Materialien sollten nicht-toxisch sein und sollten die Wirksamkeit des Wirkstoffs nicht stören. Der exakte Charakter des Trägers oder anderen Materials kann vom Verabreichungsweg, z. B. oraler, intravenöser, kutaner oder subkutaner, nasaler, intramuskulärer, intraperitonealer Weg, abhängen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen für die orale Verabreichung können in Tabletten-, Kapseln-, Pulver- oder Flüssigform vorliegen. Eine Tablette kann einen festen Träger, wie z. B. Gelatine oder ein Adjuvans umfassen. Flüssige pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen im Allgemeinen einen flüssigen Träger, wie z. B. Wasser, Petroleum, tierische oder pflanzliche Öle, Mineralöl oder synthetisches Öl. Physiologische Kochsalzlösung, Dextrose- oder eine andere Saccharidlösung oder Glykole, wie z. B. Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol können umfasst sein.
Für die intravenöse, kutane oder subkutane Injektion, oder für die Injektion an einer Krankheitsstelle wird sich der Wirkstoff in Form einer parenteral annehmbaren wässrigen Lösung befinden, die pyrogenfrei ist und einen geeignete Werte von pH, Isotonie und Stabilität aufweist. Der Fachkundige ist sehr wohl in der Lage, geeignete Lösungen unter Verwendung von zum Beispiel isotonischen Vehikeln, wie z. B. Natriumchlorid-lnjektion, Ringer-Injektion, taktierte Ringer-Injektion, herzustellen. Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Puffer, Antioxidantien und/oder andere Zusatzstoffe können wie erforder1ich zugesetzt werden.
Ob es sich um einen Antikörper, ein Polypeptid, Peptid, Nucleinsäuremolekül, kleines Molekül oder eine andere pharmazeutisch zweckdienliche Verbindung gemäß der vorliegende Erfindung handelt, die einem Individuum zu verabreichen ist, erfolgt die Verabreichung vorzugsweise in einer „prophylaktisch wirksamen Menge" oder „therapeutisch wirksamen Menge" (je nachdem, obgleich Prophylaxe als Therapie angesehen werden könnte), wobei diese ausreicht, um für das Individuum von Vorteil zu sein. Die tatsächlich verabreichte Menge, und Rate und Zeitverlauf der Verabreichung hängt für gewöhnlich vom Charakter und der Schwere dessen ab, was behandelt wird. Die Verschreibung der Behandlung, z. B. Entscheidungen über die Dosierung usw., liegt im Verantwortungsbereich praktischer Ärzte oder anderen Medizinern, und berücksichtigt typischerweise die zu behandelnde Störung, den Zustand des einzelnen Patienten, die Zufuhrstelle, das Verabreichungsverfahren und andere, den praktischen Ärzten bekannte Faktoren. Beispiele der oben erwähnten Techniken und Protokolle finden sich in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., A. Osol (Hrsg.) (1980).
Alternativ dazu können Targeting-Techniken verwendet werden, um das aktive Agens spezifischer bestimmten Zelltypen zuzuführen, indem Targeting-Systeme, wie z. B. antikörper- oder zeltspezifische Liganden verwendet werden. Das Targeting kann aus einer Reihe von Gründen wünschenswert sein; beispielsweise wenn das Agens unannehmbar toxisch ist oder wenn es anderenfalls zu hohe Dosen erfordern würde oder wenn es anderenfalls nicht fähig wäre, die Target-Zellen zu erreichen.
Statt diese Agenzien direkt zu verabreichen, könnten sie in den Target-Zellen durch Expression aus einem z. B. in einem Virus-Vektor in die Zellen eingeführten Gen produziert werden (eine Variante der VDEPT-Technik – siehe unten). Der Vektor könnte auf die speziell zu behandelnden Zellen abgezielt werden oder er könnte regulatorische Elemente enthalten, die von den Target-Zellen mehr oder weniger selektiv geschalten werden könnten.
Alternativ dazu könnte das Agens in einer Vorläufer-Form verabreicht werden, um durch ein aktivierendes Agens, das in den zu behandelnden Zellen produziert wird oder auf diese abzielt, in die aktive Form umgewandelt zu werden. Diese Art des Ansatzes ist manchmal als ADEPT oder VDEPT bekannt; der erstere umfasst das Targeting des aktivierenden Agens auf die Zellen durch Konjugation mit einem zeltspezifischen Antikörper, während der letztere das Produzieren des aktivierenden Agens, z. B. eines Enzyms, in einem Vektor durch Expression aus kodierender DNA in einem Virus-Vektor umfasst (siehe z. B. EP-A-415.731 und WO 90/07936).
Eine Zusammensetzung kann für sich alleine oder in Kombination mit anderen Behandlungen entweder gleichzeitig oder hintereinander in Abhängigkeit von der zu behandelnden Kondition, wie z. B. Krebs, Virusinfektion oder jeder anderen Kondition verabreicht werden, in denen p53 oder mdm2 nicht funktionstüchtig sind.
Screening-Verfahren für Medikamente
Die oben beschriebene Zelllinie, die mdm2 nicht überexprimiert und mit einem Reporterkonstrukt transfiziert ist, der die für ein Reportermolekül kodierende Nucleinsäure umfasst, die unter der Kontrolle von Promotorelementen steht, die auf den Spiegel des für DNA-spezifische Bindung aktivierten p53 reagiert, kann verwendet werden, um Kandidaten-Substanzen auf die biologische Eigenschaft der Zerstörung der Wechselwirkung von p53 und mdm2 oder der Inhibierung der mdm2-Produktion hin zu screenen. Wenn folglich eine Kandidaten-Sequenz diese Eigenschaft aufweist, wird sie bewirken, dass p53 in den Zellen für die spezifische DNA-Bindung verfügbar wird und die Expression der für den Reporter kodierenden Nucleinsäure verursacht. Beispiele geeigneter Zelltypen umfassen Human-Fibroblasten Keratinozyten und Tumorzelllinien, die p53 der Wildform exprimieren. Beispiele von Reportern umfassen β-Galactosidase, Luciferase, Chloramphenicol-Acetyl-Transferase und grün fluoreszierendes Protein.
Die Identifizierung von Substanzen mit einer de oben erwähnten biologischen Eigenschaften können wie unten erörtert bei der rationalen Konstruktion von Therapeutika verwendet werden.
Es ist bekannt, dass die zur Identifizierung eines neuen Medikaments führende pharmazeutische Forschung das Screening sehr großer Zahlen von Kandidaten-Substanzen umfassen kann, und zwar sowohl bevor und sogar nachdem eine Leitverbindung gefunden worden ist, Dies ist einer der Faktoren, der die pharmazeutische Forschung sehr kostenintensiv und zeitaufwendig macht. Mittel zur Unterstützung des Screening-Prozesses, wie z. B. die obigen Zelllinien, können eine beträchtliche wirtschaftliche Bedeutung und Nützlichkeit aufweisen.
Im Screening-Prozess stellt die Technologie der kombinatorischen Bibliothek einen effizienten Weg der Testung einer potentiell unermesslich großen Zahl verschiedener Substanzen auf die Eigenschaft der p53-Aktivierung in Zellen, die mdm2 nicht überexprimieren, bereit.
Kandidaten-Substanzen können auch auf die Fähigkeit hin gescreent werden, mit mdm2, z. B. in einem Hefe-Zweihybrid-System (welches erfordert, dass sowohl das Polypeptid, als auch die Testsubtanz in Hefe aus kodierender Nucleinsäure exprimiert werden kann) in Wechselwirkung zu treten. Dies kann als grober Screen vor dem Testen einer Substanz auf die Eigenschaft der Bewirkung der p53-Aktivierung verwendet werden.
Nach Identifizierung einer Substanz, welche die Polypeptid-Aktivität moduliert oder bewirkt, kann die Substanz weiter untersucht werden. Darüber hinaus kann sie gefertigt und/oder bei der Herstellung, d. h. Fertigung oder Formulierung einer Zusammensetzung, wie z. B. eines Medikaments oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden. Diese können an Individuen verabreicht werden.
Folglich erstreckt sich die vorliegende Erfindung in verschiedenen Aspekten nicht nur auf eine unter Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls als Modulator der Polypeptidaktivität identifizierte Substanz gemäß dem, was hierin offenbart ist, sondern auch auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, ein Medikament oder eine andere Zusammensetzung, die eine solche Substanz umfasst, ein Verfahren, das die Verabreichung einer solchen Zusammensetzung an einen Patienten, z. B. für die Behandlung (die präventive Behandlung umfassen kann) von Krebs oder andere hyperproliferative Störungen umfasst, und die Verwendung einer solchen Substanz bei der Fertigung einer Zusammensetzung zur Verabreichung, und ein Verfahren der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die das Mischen einer solchen Substanz mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, Vehikel oder Träger und gegebenenfalls anderen Inhaltsstoffen umfasst.
Eine unter Verwendung eines Modulators der Polypeptidfunktion identifizierte Substanz kann peptid- oder nicht peptidartig sein. Nicht peptidartige „kleine Moleküle" werden häufig für viele pharmazeutische In-vivo-Verwendungen bevorzugt. Demgemäß kann ein Mimetikum der Substanz (insbesondere, wenn sie ein Peptid ist) für die pharmazeutische Verwendung konstruiert werden.
Die Konstruktion von Mimetika einer pharmazeutisch aktiven Verbindung ist ein bekannter Ansatz für die Entwicklung von Pharmazeutika auf Basis einer „Leit"-Verbindung. Die kann wünschenswert sein, wenn die aktive Verbindung schwierig oder mit hohen Kosten zu synthetisieren ist oder wenn es für ein bestimmtes Verabreichungsverfahren ungeeignet ist, z. B. sind Peptide ungeeignete Wirkstoffe für orale Zusammensetzungen, das sie zu raschen Abbau durch Proteasen im Verdauungskanal neigen. Konstruktion, Synthese und Testung von Mimetika wird allgemein angewendet, um das Zufalls-Screening einer großen Anzahl von Molekülen auf eine Target-Eigenschaft zu vermeiden.
Es gibt mehrere Schritte, die üblicherweise bei der Konstruktion eines Mimetikums aus einer Verbindung mit einer gegebenen Target-Eigenschaft durchgeführt werden. Erstens werden die speziellen Teile der Verbindung ermittelt, die für die Festlegung der Target-Eigenschaft entscheidend sind. Im Falle eines Peptids kann dies durch systematische Variation der Aminosäurereste im Peptid, z. B. durch Substituieren jedes Rests der Reihe nach ermittelt werden. Alanin-Scans des Peptids werden für gewöhnlich verwendet, um solche Peptid-Motive zu verfeinern. Diese Teile oder Reste, die die aktive Region der Verbindung ausmachen, sind als ihre „Pharmakophore" bekannt.
Sobald das Pharmakophor gefunden worden ist, wird dessen Struktur gemäß seiner physikalischen Eigenschaften, z. B. Stereochemie, Bindung, Größe und/oder Ladung unter Verwendung von Daten aus einer Reihe von Quellen, z. B. spektroskopischen Techniken, Röntgenstrahlenstreuungsdaten und NMR modelliert. Rechnerische Analyse, Ähnlichkeitskartierung (welche die Ladung und/oder das Volumen eines Pharmakophors und nicht die Bindung zwischen Atomen modelliert) und andere Techniken können in diesem Modellierungsprozess verwendet werden.
In einer Variante dieses Ansatzes werden die dreidimensionale Struktur des Liganden und seines Bindungspartners modelliert. Dies kann besonders nützlich sein, wo der Ligand und/oder Bindungspartner bei Bindung die Konformation ändert, wobei das Modell ermöglicht, dies bei der Konstruktion des Mimetikums zu berücksichtigen.
Es wird dann ein Templat-Molekül gewählt, an das chemische Gruppen aufgepfropft werden können, die das Pharmakophor nachahmen. Das Templat-Molekül und die darauf aufgepfropften chemischen Gruppen können zweckdienlich gewählt werden, so dass das Mimetikum leicht zu synthetisieren ist, mit hoher Wahrscheinlichkeit pharmakologisch annehmbar ist und in vivo nicht abgebaut wird, während die biologische Aktivität der Leitverbindung beibehalten wird. Alternativ dazu kann, wo das Mimetikum auf Peptid basiert, eine höhere Stabilität durch Zyklisieren des Peptids erzielt werden, wobei dessen Starrheit erhöh wird. Das/die mit diesem Ansatz gefundenen Mimetikum oder die Mimetika kann/können dann gescreent werden, um festzustellen, ob sie die Target-Eigenschaft aufweisen oder in welchem Ausmaß sie dieses inhibieren. Es kann dann eine weitere Optimierung oder Modifizierung durchgeführt werden, um zu einem oder mehreren Mimetika für In-vivo- oder klinisches Testen zu gelangen.
Experimentelle Verfahren
Klonierung und Expression von Peptid-Aptameren
pTrx(Invitrogen) wurde mit Rsrll gespalten. Die folgenden Oligomere wurden phosphoryliert, anneliert und dann in den gespaltenen Vektor kloniert:
Die erhaltenen Peptid-Inserts sind in 1 dargestellt.
E. coli 1724-Zellen wurden mit den erhaltenen Plasmiden transformiert. Sie wurden in RM-Medium bei 30°C über Nacht gezüchtet, dann in frisches Induktionsmedium inokuliert und auf eine OD von 0,5 gezüchtet. Die Kulturen wurden auf 37°C übertragen, mit L-Tryptophan in einer Endkonzentration von 100 μg/ml induziert und für drei bis vier Stunden gezüchtet. Lösliche Extrakte wurden durch Resuspendieren der Pellets in eiskaltem 20 mM Tris/HCl, pH 8, 2, 5 mM EDTA mit Proteaseinhibitoren (1 mM PMSF, 1 mM Benzamidin, Leupeptin, Approtinin und Pepstatin mit je 10 μg/ml) und dreimaliges Schockgefrieren, Auftauen und Ultraschallbehandeln, gefolgt von Zentrifugation für 20 Minuten bei 10.000 g erhalten. Hitzeschock-Lysate wurden durch Resuspendieren der Pellets auf eine OD von 100 und anschließendes Behandeln bei 80°C für 10 Minuten, gefolgt von Zentrifugation bei 10.000 g für 20 Minuten erhalten.
Die Reinigung der löslichen Extrakte wurde durchgeführt, indem klare lösliche Lysate auf eine Q 50-lonentauschersäule (BioRad) aufgegeben und mit einem linearen Gradienten von 0,05 M-1 M KCl in 50 mM Tris/HCl, pH 7, 8, 0,1% Triton X-100, 10% Glycerin und 50 mM KCl eluiert wurden. Aktive Fraktionen wurden mit Anti-Thioredoxin-Antikörper (Invitrogen) an Dot-Blots identifiziert, unter Verwendung von Cetriprep 3-Filtern (Amicon) konzentriert und auf eine G100-Säule (Pharmacia) aufgegeben, die mit 30 mM HEPES, pH 8, 0, 500 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 10% Glycerin voräquilibriert war. Aktive Fraktionen nach Elution wurden vereinigt, konzentriert und gegen PBS dialysiert.
Für die Klonierung von TIP 12/1, TIP wt und Trx in pcDNA3 zur Expression in Säugetierzellen wurde die für Thioredoxin kodierende Region vollständig mit den Peptidinsertionen aus pTrx, pTrx 12/1 und pTrx wt unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert:
Die gebildeten PCR-Produkte wurden mit BamHl und EcoRl gespalten und in mit Bam-Hl, EcoRl geschnittenes pcDNA3 ligiert. Die TIP 12/1-Sequenz in pcDNA3 wurde durch Sequenzierung verifiziert.
ELISA-Tests
ELISAs wurden wie früher beschrieben (Böttger et al., 1996) durchgeführt. Kurz gesagt wurden Platten mit 1 μg/ml p53 oder Verdünnungen von p53 über Nacht bei 4°C beschichtet. Sie wurden geblockt und es wurde ein vorinkubiertes Gemisch von GST-hdm2 (1,3 μg/ml) und synthetischen Peptiden (Inhibitions-ELISA) oder hdm2 alleine (di rekter Bindungs-ELISA) für 1 Stunde zugesetzt. Die Bindung wurde mit monoklonalem Anti-mdm2-Antikörper SMP 14 (Picksley et al., 1994) und HRP-konjugiertem Anti-Maus- lgG nachgewiesen.
Zellkultur und Mikroinjektion
Alle Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) gezüchtet, das mit 10% FCS ergänzt war, für T2-Zellen wurde 1 mg/ml G418 zugesetzt.
Für die Mikroinjektion wurden die Zellen auf Gewebekulturplatten geimpft und auf 60-70% Konfluenz gezüchtet. Die Mikroinjektion wurde unter Verwendung eines Eppendorf-Mikroinjektionssystems (Mikroinjektor 5242, Mikromanipulator 51–70) durchgeführt, das an einem Axiovert 35 M mit beheizter Plattform montiert war. Antikörperinjektionen waren intranuklear oder zytoplasmatisch. Plasmidinjektionen waren intranuklear. Gereinigte monoklonale Maus-Antikörper 3G5 und 4B2 wurden in PBS in einer Konzentration von ca. 1,3 mg/ml injiziert. Für TIP 12/1, TIP und Trx kodierende Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des Quiagen-Reinigungssystems oder durch Phenol /Chloroform-Präzipitation gereinigt und in einer Konzentration von 0,25 mg/ml in Wasser injiziert. Im Anschluss an die Mikroinjektion wurde den Zellkulturen frisches Medium zugesetzt und sie wurden für 24 Stunden inkubiert.
Detektion der β-Galactosidase-Aktivität
Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit 2% Formaldehyd/0,2% Glutaraldehyd in PBS für 5 Minuten auf Eis fixiert. Die Zellen wurden wiederum mit PBS gewaschen und mit 0,25 mg/ml X-Gal im Reaktionsgemisch (5 mM Kaliumferricyanid, 5 mM Kaliumferrocyanid, 2 mM Magnesiumchlorid in PBS) überschichtet. Die Zellen wurden bei 37°C für 16 Stunden inkubiert. Es wurde blau gefärbte Zellen beobachtet.
Immunfluoreszenz
VRn.6-Zellen wurden mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 10 Minuten fixiert und mit 1% NP40 in PBS gewaschen und permeabilisiert. Die Primärantikörper Kaninchen-Antiβ-Galactosidase oder monoklonaler Anti-Thioredoxin-Antikörper (Anti-Thio^TM-Antikörper, Invitrogen) wurden 1/500 angewendet, Texas-Rot-konjugierte Ziege-Anti-Maus-lg- oder FlTC-konjugierte Ziege-Anti-Kaninchen-Ig-F(ab)₂-Fragmente (Jackson) wurden 1/500 als Sekundärantikörper angewendet. Die Inkubationen wurden für 1 Stunde oder 45 Minuten bei RT durchgeführt. Waschschritte wurden in PBS durchgeführt.
T22-Zellen wurden mit eiskaltem Aceton/Methanol (1/2) für 8 Minuten bei 4°C fixiert. Primärantikörper, Protein A-gereinigtes CM5 mit 2 μg/ml oder Anti-Thio^TM 1/500 wurden für 1 Stunde bei RT zugesetzt, nach PBS-Waschschritten wurde FlTC-konjugiertes Anti-Maus-lg bei 1/80 oder Texas-Rot-Anti-Kaninchen-lg bei 1/400 für 30 Minuten bei RT zugesetzt.
Vorübergehende Transfektionen für die Reporter-Induktion
Zellen wurden zu 1,5 × 10⁶ Zellen je Napf in 6-Napf-Platten geimpft. Sie wurden auf eine Dichte von 80% Konfluenz gezüchtet und unter Verwendung verschiedener lipophiler Reagenzien (Lipofectin und Lipofectamin, Promega, DOSPER und DOTAP, Boehringer) transfiziert. 2,5 μg TIP-kodierende Plasmid-DNA und 1 μg RGCΔFosLacZ-DNA und 5–10 μg lipophiles Reagens gemäß den Anleitungen des Herstellers wurden in serumfreiem Medium gemischt und auf die Zellen angewendet. 2–4 Stunden nach der Transfektion wurde vollständiges Medium zugesetzt. 48 Stunden nach der Transfektion wurde β-Glactosidase-Aktivität mit CPRG (Boehringer) als Substrat gemessen. Die Zellen wurden in PBS geschabt und zentrifugiert. Die Pellets aus jedem Napf wurden in 50 μl Reporter-Lyse-Puffer (Promega) gelöst und auf Eis für 15 Minuten inkubiert. Lösliche Lysate wurden mit CPRG in 100 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, inkubiert. Die OD bei 595 nm wurde 1–24 Stunden später gemessen. Um die Transfektionseffizienzen in jedem Ex periment zu messen, wurden Zellen in einem gesonderten Napf mit 2,5 μg pG3-DNA transfiziert, die für Leuchtkäfer-Luciferase kodiert. Die Luciferase-Aktivität wurde mit dem Promega-Luciferase-Testsystem gemessen. Dieselben Lysate dienten als Kontrolle für endogene β-Galactosidase-Aktivität.
Immunpräzipitationen
Zellen wurden auf > 90% Konfluenz auf 14 cm-Platten gezüchtet. Sie wurden in PBS abgeschabt und in 50 mM Tris/HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5% NP 40. und Proteaseinhibitoren (Boehringer Complete^TM) lysiert. Zu 100 μl Lysat wurden 1 μg PAb 421 in 400 μl DMEM/10% FCS oder 400 μl MAb 4B2-Überstand zugesetzt und die Lysate über Nacht bei 4°C inkubiert. Protein G-Sepharose-Perlen wurden zugesetzt und die Inkubation für 2 Stunden durchgeführt. Die Perlen wurden 5 Mal mit PBS, 0,2% Tween gewaschen und dann in SDS-Probenpuffer aufgekocht. Die Proteine wurden an PAGE-Gelen aufgetrennt, Western-Blotting unterzogen und mit polyklonalem Kaninchen-Anti-p53-Antikörpern CM5 und CM1, gefolgt von HRP-Anti-Kaninchen-lgG oder einem Gemisch aus monoklonalen Anti-mdm2-Antikörpern 3G5, SMP14 und 4B2, gefolgt von HRP-Anti-Maus-lgG (DAKO) gefärbt. HRP-Aktivität wurde mittels ECL (Amersham) nachgewiesen.
Vorübergehende Transfektionen zum Nachweis von p53-Spiegeln in An- und Abwesenheit von mdm2 SAOS 2-Zellen wurden 24 Stunden vor der Transfektion auf 80% Konfluenz in 10 cm-Platten geimpft. Calciumphosphat-vermittelte Transfektionen wurden wie früher beschrieben durchgeführt (Lin und Green, 1989).5 μg p53 wt und für Mutante kodierendes Plasmid (pcDNA3) oder Kontrollvektor und 5 μg für mdm2 kodierendes Plasmid (X2, Haupt et al., 1996) wurden je 10 cm-Platte cotransfiziert. 48 Stunden nach der Transfektion wurden Zelllysate mittels 12%-iger SDS-PAGE fraktioniert und auf Nitrocellulosemembranen übertragen. Blots wurden mit Kaninchen-Anti-p53-Antiserum CM5 (1/8000) und HRP-konjugiertem Anti-Kaninchen-lg gefärbt. Peroxidase-Aktivität wurde mittels ECL nachgewiesen.
Ortsgerichtete Mutagenese
Die Konstruktion von F¹⁹→A wurde durch ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung des Transformer^TM-Sets für ortsgerichtete Mutagenese(Clonetech) erzielt. Die Sequenz des Selektionsprimers war: 5'–3' GACTCTGGGGATCGATATGACCGACC, die Sequenz des mutagenen Primers war: 5'–3' GAGCCAGGAGACAGCCTCAGGCTTATG. Die Sequenz der p53-Mutante F¹⁹→A wurde durch Sequenzierung bestätigt.
Ergebnisse
Peptid-Inserts in Thioredoxin erzeugen potente Inhibitoren der p53-mdm2-Wechselwirkung
1 zeigt eine schematische Darstellung der drei Aptamere, welche die Erfinder durch Insertieren zusätzlicher Peptidsequenzen in die Aktivstelle von E. coli-Thioredoxin konstruierten. TIP 12/1/Thioredoxin-Insert-Protein) enthält die Sequenz, welche die Erfinder früher durch Phagen-Display als den potentesten Inhibitor der mdm2-p53-Wechselwirkung in In-vitro-Tests identifizierten (Böttger et al., 1996). TIP wt enthält die Sequenz, die der p53-Wildform-Sequenz p¹³ bis N²⁹ entspricht. Als Kontrollen exprimierten die Erfinder Thioredoxin, dem eine Peptid-Insertion fehlte (TRX), in Bakterien.
Alle diese Proteine konnten leicht in E. coli exprimiert werden. Sie konnten aus löslichen Bakterien-Lysaten durch Hitzeschock auf fast 80% Homogenität ohne Verlust mdm2-Bindungsaktivität gereinigt werden. Die Erfinder reinigten ferner die TIP_S nahezu homogen aus löslichen, nicht dem Hitzeschock unterzogenen Bakterien-Lysaten durch lonenaustauschchromatographie und Gelfiltration. Die mit auf beide Arten gereinigten TIPS erhaltenen Ergebnisse waren identisch.
Die Erfinder testeten die Aptamere auf ihre Funktion, die p53-mdm2-Wechselwirkung in ELISA-Tests zu inhibieren. Die Bindung von GST-mdm2 (1–188) an p53-beschichteten ELISA-Platten wurde durch ansteigende Mengen von bakteriell exprimierten TIPs inhibiert. Tabelle 1 zeigt IC₅₀-Werte, die in diesem Test im Vergleich zu den IC50-Werten für die entsprechenden Peptide und bakteriell exprimiertem Volllängen-p53 (Midgley et al., 1992) erhalten wurden. Die folgenden Schlussfolgerungen können gezogen werden.

1. TIP 12/1 inhibiert die Wechselwirkung zwischen p53 und mdm2 in diesem Test mit derselben Stärke wie Volllängen-p53. Dies sollte es zu einem geeigneten zu testenden Agens in zellulären Systemen hinsichtlich der Wirkungen auf die Wechselwirkung zwischen p53 und mdm2 in vivo machen.
2. TIP wt inhibiert die Wechselwirkung um das 20fache weniger als TIP 12/1. Dies muss der 50fach schwächeren, vom wt-Peptid erzielten Inhibierung bei Vergleich mit Peptid 12/1 in Peptid-Konkurrenz-Tests (Böttger et al., 1997) zugeschrieben werden.
3. Trx zeigt im Test der Erfinder keine Inhibierung, was es zu einer geeigneten Negativkontrolle für In-vivo-Experimente macht.

In diesen In-vitro-Tests zeigt TIP 12/1 ein ausreichend starkes Inhibierungspotential, um mit endogenen wt-p53-Spiegeln in Tumorzellen um die Bindung an mdm2 zu konkurrieren. Es stellt daher ein Mittel bereit, das innerhalb von Säugetierzellen funktionsfähig sein sollte.
Expression von Peptid-Aptameren in Säugetierzellen aktiviert die p53-abhängige Transkription.
Die Erfinder fuhren daher fort und klonierten TIP 12/1, TIP wt und Trx in pcDNA3 (Promega), einem Vektor, wo diese Proteine unter der Kontrolle des starken CMV-Promotors in Säugetierzellen exprimiert würden.
Zuerst wollten die Erfinder herausfinden, ob ein stabil exprimierter p53-responsiver β-Galactosidase-Reporter durch Mikroinjektion der für TIP_S kodierenden Plasmide angeschaltet werden kann. Eine kürzlich etablierte, transformierte, mit pRGCΔ fos-lac Z stabil transfizierte Ratten-Schilddrüsenepithel-Zeltlinie (Blaydes et al., 1997), VRn.6-Zellen, schien ein geeignetes Modell bereitzustellen. Es konnte bereits gezeigt werden, dass diese Zellen auf der Proteinebene wt p53 exprimieren und auch mdm2 überexprimieren. Der β-Galactosidase-Reporter reagiert stark auf UV-Induktion von p53 in VRn.6-Zellen. Die Mikroinjektion des monoklonalen Antikörpers 3G5 in die Kerne dieser Zellen konnte auch den p53-Reporter anschalten (Blaydes et al., 1997). Die Erfinder haben früher gezeigt, dass 3G5 das mdm2 genau innerhalb der p53-Bindungstasche bindet und die p53-mdm2-Assoziation blockiert (Böttger et al., 1997). Wenn die Wirkung der 3G5-Injektion auf die Induktion der p53-abhängigen Transkription auf die Unterbrechung der p53-mdm2-Wechselwirkung beruhte, sollten die inhibierenden Aptamere der Erfinder eine ähnliche Wirkung ausüben.
In diesen Experimenten stellten die Erfinder die starke Induktion von β-Galactosidase-Aktivität nach Mikroinjektion von 3G5 in die Kerne von VRn.6-Zellen fest. Um sicher zu sein, dass die Zellen, die mit β-Galactosidase-Aktivität reagierten, die injizierten waren, führten die Erfinder Doppel-Immunfluoreszenz-Untersuchungen durch. Die Erfinder färbten Zellen nach Injektionen mit Anti-β-Galactosidase-Antiserum und mit Anti-Maus-Immunglobulin. Dies zeigte, dass die das Reporterenzym exprimierenden Zellen (linke Tafel, blau) auch für den injizierten Antikörper positiv waren (rechte Tafel, grün). Die Injektion des für TIP 12/1 kodierenden Plasmids in die Kerne von VRn.6-Zellen hatte ebenfalls eine starke Wirkung auf die Induktion des Reporterenzyms. Es trat keine Induktion nach Mikroinjektion des für Thioredoxin kodierenden Kontroll-Plasmids auf, obwohl es eindeutig exprimiert wird.
Die bemerkenswerte Stärke dieser Reaktion bewegten die Erfinder dazu, zu testen, ob dies auf die relativ hohen p53- und mdm2-Spiegel beruhte, die in der VRn.6.-Linie vorhanden sind. Um dies zu bewerkstelligen, wurden die Mikroinjektionsexperimente in T22-Zellen durchgeführt, einer von Maus-Prostata hergeleiteten, ebenfalls mit demselben Reporterplasmid stabil transfizierten Zelllinie. Diese Zellen enthalten normalerweise sehr niedrige Spiegel von p53 und mdm2. Bei Behandlung mit DNA-schädigenden Mitteln akkumuliert das p53-Protein und die Zellen zeigen eine beachtliche p53-abhängige β-Galactosidase-Induktion (Hupp et al., 1995; Lu und Lane, 1993). Bei Mikroinjektion von für 3G5 und TIP_S kodierenden Plasmiden in T22-Zellen, detektierten die Erfinder wiederum eine immense Induktion von β-Galactosidase mit 3G5, jedoch keine Induktion mit 4B2, einem Anti-mdm2-Antikörper, der auf ein Epitop außerhalb des p53-Bindungstasche am mdm2 abzielt. Eine beachtliche Reporterinduktion wurde vom stärksten Aptamer der Erfinder, TIP 12/1, bewirkt. Niedrigere β-Galactosidase-Aktivitätsspiegel werden mit TIP und keine Aktivität mit dem Kontroll-Thioredoxin beobachtet. Dies spiegelt exakt die Fähigkeit der drei Aptamere wider, die mdm2-p53-Wechselwirkung in vitro zu inhibieren. Die Färbung der injizierten Zellen mit Anti-Thioredoxin-Antikörper bestätigte, dass die Unterschiede der Reporterenzymaktivität nicht auf der differenziellen Expression der TIP-Proteine beruhten.
Die starke Induktion des Reporterenzyms in T22-Zellen, die mdm2 nicht überexprimieren, führte die Erfinder zu der Annahme, dass die Aktivierung von p53 durch Freisetzung aus mdm2-Komplexen ein sehr starker Stimulus für die p53-Aktivierung sein muss, ähnlich zur Induktion von p53 durch UV und viel stärker als die früher beobachtete Wirkung allosterischer Aktivierung von latentem p53 in T22-Zellen durch PAb 421 (Hupp et al., 1995).
Die Erfinder strebten die Analyse weiterer Zelllinien an, die vorzugsweise nicht von einem stabil integrierten Reporterplasmid abhängen. Die Erfinder transfizierten daher Zellen vorübergehend, die wt p53 mit p53-responsiven Reporterplasmiden (RGCΔFos-LacZ) und TIP 12/1 oder Trx-Kontrolle enthielten. Die Erfinder wählten OSA-Zellen, eine humane Osteosarkom-Zelllinie (Florenes et al., 1994), als Beispiel für eine Zelllinie mit stark erhöhten mdm2-Speigeln aufgrund von Gen-Amplifikation. Die Erfinder verwendeten auch U2-OS-Zellen, eine weitere Osteosakrom-Zelllinie, die keine Gen- Amplifikation für mdm2, jedoch erhöhte Spiegel von mdm2-mRNA aufweist (Florenes et al., 1994), und MCF-7-Zellen, eine Brustkrebs-Zelllinie mit heterogen exprimierten niedrigen wt p53-Spiegeln und keiner berichteten mdm2-Erhöhung. Zuerst versuchten die Erfinder, die in diesen Zellen exprimierten Proteinspiegel und den Grad der Komplexbildung mit mdm2 mittels Immunpräzipitationen zu analysieren. Die Erfinder präzipitierten aus Zell-Lysaten mit dem monoklonalen Anti-mdm2-Antikörper 4B2 und dem monoklonalen Anti-p53-Antiköper 421. 2 zeigt die Ergebnisse.
In OSA-Zellen copräzipitiert 4B2 p53 in ähnlichen Mengen wie PAb 421 (2b, Spur 7 für PAb 421 und Spur 8 für 4B2). 4B2 präzipitiert mdm2 (2a, Spur 7), was auf einen mdm2-Überschuss hinweist, der nicht an p53 bindet, während das gesamte p53 mit mdm2 komplexiert ist. In U2-OS- und MCF-7-Zellen präzipitieren weder 4B2, noch Pab 421 leicht detektierbare Mengen von mdm2 (2a, Spuren 2 und 5 für PAb 421, Spuren 3 und 6 für 4B2, Spuren 1 und 4 stellen Kontrollen für Präzipitationen ohne Antikörper dar). Nach Überbelichtung von ECL-Film für 60 Minuten erscheint in U2-OS-Präzipitaten eine sehr schwache Bande bei der Größe von mdm2 (nicht gezeigt). In MCF-7-Zellen präzipitiert PAb 421 p53 (2b, Spur 5), jedoch wird keine Copräzipitation von p53 durch den Anti-mdm2-Antikörper 4B2 beobachtet (2b, Spur 6, das Signal ist dasselbe wie in der Kontrollpräzipitation, Spur 4). In U2-OS-Zellen präzipitiert Pab 421 p53 (2b, Spur 3) und 4B2 präzipitiert einen hohen Prozentsatz von p53 (2b, Spur 3), was auf einen hohen Grad an hdm2-p53-Komplexbildung hinweist.
Die Erfinder cotransfizierten daraufhin das (RGCΔFosLacZ-) Reporterplasmid und für TIP 12/1 oder Trx kodierende DNA in Zellen aller drei Zeltlinien, um die Reporterenzym-Induktionsspiegel direkt zu vergleichen. Verschiedene lipophile Transfektionsmittel wurden verwendet und die Transfektionseffizienz an gesonderten Platten durch Transfizieren von pG3, einem für Leuchtkäfer-Luciferase unter Kontrolle eines konstitutiven Promotors kodierenden Plasmid, und Messen der Luciferase-Aktivität beobachtet. Dies ermöglichte es den Erfindern, die Möglichkeit auszuschließen, dass die Unterschiede der p53-abhängigen transkriptionellen Aktivierung des Reporters mit der Transfektionseffi zienz zusammenhängen (Daten nicht gezeigt). 3 zeigt einen Mittelwert von vier Experimenten der Induktion von β-Galactosidase-Aktivität durch TIP 12/1 verglichen mit Trx in jeder Zeltlinie.
Überraschenderweise wird die höchste Induktion des p53-Reporters durch TIP 12/1 in MCF-7-Zellen und in U2-OS-Zellen erzielt, wo der mdm2-Spiegel unter der Nachweisgrenze liegt. Eine ca. 100-mal niedrigere Reporterenzym-Induktionswirkung von TIP 12/1 wird in OSA-Zellen beobachtet. 3 zeigt ferner, das die Transfektion von Kontrollplasmid alleine eine schwache Reaktion von p53-abhängiger Transkriptionsaktivität in MCF-7- und U2-OS-Zellen induziert. Dieser Effekt ist früher berichtet worden (Renzing und Lane, 1993). Sie fehlt jedoch in OSA-Zellen fast völlig.
Dies bestätigt die Auffassung, dass die p53-abhängige Transkriptionsaktivierung in Zellen, die mdm2 durch Gen-Amplifikation überexprimieren, reprimiert ist. Dies kann durch Inhibierung der Wechselwirkung zwischen mdm2 und p53 überwunden werden. Wesentlich bemerkenswerter ist jedoch die Beobachtung, dass in Zellen mit undetektierbaren mdm2-Spiegeln spezifische Inhibitoren der p53-mdm2-Wechselwirkung die p53-abhängige Transkriptionsaktivierung in einem Ausmaß induzieren können, die mit der Induktion durch UV vergleichbar ist.
Zerstörung der p53-mdm2-Wechselwirkung bewirkt die Akkumulierung von p53
Die drastische Induktion der p53-Antwort durch UV und andere genotoxische Mittel ist von der Akkumulierung hoher p53-Proteinspiegel begleitet, was zumindest teilweise auf seiner erhöhten Halbwertszeit in behandelten Zellen beruht. Es ist jedoch nicht bewiesen, dass dies der einzige Mechanismus ist, durch den die p53-Antwort aktiviert wird, und es sind auch andere Mechanismen, wie z. B. die allosterische Aktivierung der DNA-Bindungsfunktion vorgeschlagen worden, die eine Rolle spielen könnten (Hupp et al., 1995). Die sehr starke Induktion der p53-Antwort durch das für TIP 12/1 kodierende Plasmid und MAb 3G5-Injektionen führten die Erfinder zu der Frage, ob diese Induktion unabhängig von der Akkumulation des p53-Proteins erfolgte. Um diese Hypothese zu testen, wurden die Mabs 3G5 und 4B2 und die für TIP 12/1 und Trx kodierenden Plasmide in T22-Tellen injiziert und die p53-Speigel mittels Immunfluoreszenz analysiert. Die Erfinder stellten fest, dass p53 in hohem Ausmaß in jenen Zellen akkumuliert, die mit dem die Wechselwirkung zerstörenden 3G5-Antikörper injiziert waren, nicht jedoch in jenen, die mit dem Kontroll-Anti-mdm2-Antikörper injiziert waren. Auf ähnliche Weise akkumulieren Zellen, die mit dem TIP 12/1-Expressionsplasmid injiziert wurden, hohe p53-Spiegel, wogegen jene, die mit Kontrollplasmid injiziert wurden, dies nicht tun. Diese bemerkenswerten Ergebnisse beweisen, dass die Zerstörung der p53-mdm2-Wechselwirkung die genotoxische Reaktion nicht nur durch Aktivieren der p53-abhängigen Transkription, sondern auch dadurch widerspiegelt, dass das p53-Protein akkumuliert. Die Schlussfolgerung aus diesen Ergebnissen war, dass mdm2 in normalen Zellen auf den p53-Abbau abzielt. Als die Erfinder p53 der Wildform in p53-negative SAOS-2-Zellen transfizierten, stellten die Erfinder fest, dass die Cotransfektion eines mdm2-Expressionsplasmids den akkumulierten p53-Spiegel stark herabsetzte (4, Spuren 2 und 3), was die Vorstellung untermauert, dass mdm2 auf den p53-Abbau abzielen kann. Um diese Hypothese weiter zu testen, konstruierten die Erfinder eine Punktmutante F¹⁹→A in Maus-p53, bei der einer der Schlüssel-Kontaktreste der in der Kristallstruktur und in der Phagen-Display-Analyse der Erfinder identifizierten p53-mdm2-Schnittstelle mutiert war (Böttger et al., 1997; Kussie et al., 1996). Die Erfinder konnten bestätigen, dass diese Mutante zur Bindung an mdm2 zu unfähig, jedoch transkriptionell aktiv war (Daten nicht gezeigt). Wenn dieses mutierte p53 in SAOS-2-Zellen transfiziert wurde, war dessen Akkumulierung im Gegensatz zum p53 der Wildform nicht von der Cotransfektion des mdm2-Expressionsplasmids beeinflusst (4, Spuren 4 und 5).
Diskussion Peptid-Aptamere zur Zerstörung von Protein-Protein-Wechselwirkungen
Die obigen Ergebnisse zeigen, dass Peptid-Aptamere in Zell-Tests fähig sind, die Bindung von p53 an mdm2 zu blockieren. Um diese zu bewerkstelligen, wurden zur festen Bindung an mdm2 fähige Peptidsequenzen, die aus Phagen-Peptid-Bibliotheken identifiziert worden waren, an der Aktivstellen-Schleife von Thioredoxin präsentiert. Die Aptamer-Proteine (TIPS) konnten leicht in E. coli exprimiert und leicht aus löslichen Lysaten gereinigt werden. In In-vitro-Tests zeigten die in die Aktivstellen-Schleife von Thioredoxin insertierten Peptide dieselbe außerordentlich verstärkte Bindung im Vergleich zur p53-Peptidsequenz der Wildform, welche die Erfinder in ihrer früheren Analyse der freien Peptide beobachtet hatten, was den erfolgreichen Transfer der optimierten Sequenz aus dem Phagen-Display zum Insert-Protein beweist. Entscheidend ist, dass das Inhibierungspotential des TIP 12/1-Proteins mit 15 kDa dasselbe wie das des tetrameren wt p53 und viel größer als jenes war, das durch die simple Transplantation der p53-Sequenz der Wildform in das Thioredoxin erzielt wurde. Wenn sie in Säugetierzellen exprimiert wurden, waren TIP 12/1 und TIP wt in der Lage, die p53-abhängige Transkriptionsaktivierung eines Reportergens zu induzieren. Die Intensität der von TIP 12/1 im Vergleich zu TIP wt ausgeübten Wirkung in Mikroinjektionsexperimenten war proportional zu ihren In-vitro-Inhibierungspotentialen. Mit diesen mdm2-bindenden Aptameren haben die Erfinder daher mächtige Werkzeuge entwickelt, um die biologischen Auswirkungen der Zerstörung der Wechselwirkung zwischen mdm2 und p53 in Tumorzellen zu untersuchen. Dieser exakte Ansatz der Aptamer-Selektion und Konstruktion beschreibt einen Weg, der von der Identifizierung von Peptiden, die zur Zerstörung einer sehr spezifischen Protein-Protein-Wechselwirkung fähig sind, durch Ansätze der kombinatorischen Bibliothek zur Verifizierung der erwarteten biologischen Wirkung in vivo führt. Dieses Konzept in Kombination mit der Verwendung von Peptid-Aptamer-Bibliotheken, die beispielsweise in Hefe-Zweihybrid-Systemen exprimiert und gescreent werden (Colas et al., 1996), sollte ein bedeutendes Potential für die Untersuchung von Netzwerken von Pro tein-Protein-Wechselwirkungen in eukaryotischen Zellen auf der biochemischen sowie funktionellen Ebene aufweisen. es ermöglicht den Erfindern zweifellos, einige Schlussfolgerungen über die Signifikanz der Inhibierung der Wechselwirkung zwischen mdm2 und p53 in Tumorzellen zu ziehen.
Aktivierung von p53 durch Blockieren der Bindung an mdm2
Es ist angenommen worden, dass die Zerstörung der Wechselwirkung zwischen den beiden Proteinen möglicherweise transkriptionell aktives p53 in Tumorzellen freisetzt, die mdm2 aufgrund von Gen-Amplifikation überexprimieren. Obgleich die Experimente der Erfinder mit OSA-Zellen darauf hinweisen, dass dies tatsächlich der Fall ist, scheinen diese Zellen nicht die empfänglichsten zu sein. Im Gegensatz dazu reagieren MCF-7-Zellen und U2-OS-Zellen sowie T22-Zellen, wovon alle kaum detektierbare mdm2-Spiegel aufweisen, mit einer immensen Transkriptionsaktivierung von p53 nach Anwendung von mdm2-Inhibitoren.
Es scheint so zu sein, dass die Wechselwirkung von p53 mit mdm2 die primäre Hemmnis für die p53-Aktivität in allen analysierten Tumorzellen ist. Der Vergleich der Reaktion in verschiedenen Zeltlinien legt dar, dass die Freisetzung von transkriptionell aktivem p53 reziprok zum mdm2-Gehalt der Zellen ist. Es könnte erwartet werden, dass Inhibitoren höherer Affinität oder spezifisches Targeting der TIP-Aptamere der Erfinder auf den Kern, die mdm2-Repression von p53 in einem viel höheren Ausmaß in Zellen mit amplifizierten mdm2-Spiegeln, wie z. B. OSA-Zellen, überwindet.
Dieses Ergebnis beweist ferner, dass Inhibitoren der p53-mdm2-Wechselwirkung nicht die Fähigkeit von p53 stören, mit dem Transkriptionsapparat in Wechselwirkung zu treten. Es ist befürchtet worden, das die starke Ähnlichkeit zwischen der Target-Stelle für mdm2 und für den Transkriptionskomplex am N-Terminus von p53 bedeuten könnte, dass jeglicher Inhibitor der mdm2-Bindung auch den Transkriptionsapparat an der Bindung an p53 hindert.
Mdm2 reguliert p53-Spiegel
Die Erfinder zeigen weiters, dass die Inhibierung der Wechselwirkung von p53 mit mdm2 ein Ansteigen der p53-Proteinspiegel bewirkt. Dies impliziert nachdrücklich, dass die Bindung von mdm2 an p53 eine Voraussetzung für p53-Abbau oder Destabilisierung ist. Dieser Schluss wird stark durch die Entdeckung untermauert, dass die F¹⁹→A-Mutation mdm2-abhängige Verminderungen der p53-Spiegel in Transfektionsuntersuchungen blockiert. Marston et al. stellten fest, dass eine In-Frame-Deletion der konservierten Box 1 eine p53-Mutante hervorbrachte, die sehr stabil war, jedoch die Transkriptionsaktivität beibehielt (Marston et al., 1994), wenn auch bekannt ist, dass größere N-terminate Deletionen p53 ebenfalls stabilisieren. Das Modell, dass p53 die Transkription des Schlüssel-Regulators seines eigenen Abbaus antreibt, liefert ein sehr attraktives Modell für die Stabilität des p53-Proteins in Zellen, in denen das Protein transkriptionell inaktiv ist. Dies umfasst Zellen, die nur mutiertes p53 enthalten, wie z. B. der Großteil der humanen Tumorzellen und von DNA-Tumorviren infizierte oder transformierte Zellen, deren Produkte p53 binden und die transkriptionelle Funktion von p53 inaktivieren. Das Modell behauptet, dass diesen Zellen die ausreichende Expression von funktionellem mdm2 fehlt, um auf den p53-Abbau abzuzielen. Das Modell steht in vollkommener Übereinstimmung mit der früheren Feststellung der Erfinder, dass punktmutierte p53-Proteine, die in Transkriptionstests inaktiv sind, bei Transfektion in p53-Null-Zellen stabil, jedoch in Zellen instabil sind, die p53-Aktivitä der Wildform enthalten (Vojtesek und Lane, 1993; Midgley et al., in Vorbereitung). Wenn mdm2 auf den p53-Abbau abzielt, könnte die Inhibierung dieser Wechselwirkung die rasche Umsetzung von neu synthetisiertem p53 verhindern und so die beobachtete Zunahme des transkriptionell aktiven p53 bewirken. Es wäre daher von größtem Interesse, zu erkunden, ob der p53-Anstieg nach UV- oder anderer genotoxischer Schädigung tatsächlich die Freisetzung des Proteins von mdm2 involviert. Dieses Modell stellt daher einen großen Spielraum für weitere Untersuchungen bereit. Es enthält bemerkenswerte Parallelen zum Modell für den HPV-E6-abhängigen p53-Abbau und es ist eine zulässige Vermutung, dass mdm2 auf p53 für den Ubiquitin-abhängigen Abbau abzielt Es wird möglich, auf eine ähnliche Weise wie bei p53 auf andere Proteine für den Abbau abzuzielen, so dass sie in normalen Zellen instabil sind, jedoch durch DNA-Schädigung oder in Zellen, denen mdm2-Aktivität fehlt, stabilisiert werden, indem man auf diese ein mdm2-Erkennungspeptid spleißt, und es ist möglich, überaktive p53-Proteine zu konstruieren, auf die nicht für den Abbau abgezielt werden kann, die jedoch transkriptionell aktiv sind.
Die Ergebnisse der Erfinder legen nahe, dass die Anwendung von Inhibitoren der Wechselwirkung zwischen mdm2 und p53 in wt p53-exprimierenden Tumorzellen der Weg ist, die p53-Transkriptionsaktivität zu induzieren. Diese Medikamente würden potentiell die Wirkung herkömmlicher therapeutischer Krebsbehandlungen nachahmen, welche die wachstumsinhibierenden und apoptotischen Eigenschaften von p53 aufgrund der Induktion von DNA-Schädigung induzieren, ohne die unspezifischen Auswirkungen dieser DNA-Schädigung zu bedingen. Solche Medikamente könnten eine profunde Steigerung therapeutischer Wirkungen aufweisen und mutagene und andere Nebenwirkungen herkömmlicher Therapien vermeiden.
Tabelle 1 In-vitro-Inhibierungspotential von TIPs im Vergleich zu freien Peptiden und Volllängenp53

Inhibitor IC₅₀in nM

TIP wt 15 000

TIP 12/1 300

Trx kleine Inhibierung

Peptid wt 2 000

Peptid 12/1 100

Vollängen-p53 400
Literaturzitate
Die hierin zitierte Literatur ist zur Gänze durch Verweis hierin aufgenommen.

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Claims

Verwendung eines Mittels, das die Eigenschaft hat, die Bindung von p53 und mdm2 zu zerstören oder die Produktion von mdm2 in einer Zellpopulation zu hemmen, zur Herstellung eines Medikaments zum Aktivieren von p53 zur Behandlung von Affektionen, die mit niedriger p53-Aktivität verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, dass die Affektionen nicht mit einer Überexpression von mdm2 verbunden sind.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das p53 zur DNA-spezifischen Bindung und Transkription aktiviert ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Mittel ein Peptid umfasst, das eine Aminosäuresequenz mit zumindest 70%iger Aminosäuresequenzidentität mit einem entsprechenden Abschnitt von Human-p53 aufweist, der die Eigenschaft hat, sich an mdm2 zu binden.
Verwendung nach Anspruch 3, worin das Peptid eine Länge von weniger als 25 Aminosäuren aufweist.
Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, worin das Mittel das Peptidmotiv FxxxW umfasst, worin x eine beliebige Aminosäure ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Mittel die Eigenschaft hat, eine oder mehrere Regionen von mdm2 zu binden, die an der Bindung an p53 beteiligt sind.
Verwendung nach Anspruch 6, worin das Mittel ein Antikörper ist, der zur Blockierung einer p53-Bindungsstelle von mdm2 fähig ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Mittel die Eigenschaft hat, mit mdm2 um die Bindung von p53 zu konkurrieren, aber keine biologische Aktivität von p53 hemmt.
Verwendung nach Anspruch 8, worin das Mittel ein Antikörper ist, der zur Blockierung einer mdm2-Bindungsstelle von p53 fähig ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Mittel ein Antisense-Oligonucleotid ist, das zum Hemmen der Synthese von mdm2 in der Zellpopulation fähig ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Medikament zur Behandlung von Krebs, einer viralen Affektion oder einer anderen Affektion dient, die mit nicht-funktionellem p53 oder mdm2 verbunden ist.
Verfahren zur Aktivierung von p53, das das Einwirkenlassen eines Mittels, das die Eigenschaft hat, die Bindung von p53 und mdm2 zu zerstören oder die Produktion von mdm2 zu hemmen, auf eine Zellpopulation, so dass p53 in den Zellen aktiviert wird, wobei die Zellen mdm2 nicht überexprimieren, wobei das Verfahren kein Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder eines Tierkörpers durch chirurgischen Eingriff oder Therapie oder am menschlichen oder an einem Tierkörper vorgenommenes Diagnoseverfahren ist.
Verfahren nach Anspruch 12, worin das p53 für DNA-spezifische Bindung und Transkription aktiviert wird.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, worin das Mittel wie nach einem der Ansprüche 3 bis 10 definiert ist.
Verfahren zum Screenen von Testsubstanzen bezüglich der Eigenschaft, die Bindung von p53 und mdm2 zu zerstören oder die Produktion von mdm2 zu hemmen, wo bei das Verfahren den Einsatz von Zellen umfasst, die mdm2 nicht überexprimieren, wobei die Zellen mit einem Reporterkonstrukt transfiziert werden, das Nucleinsäure, die für ein Reporterpolypeptid kodiert, unter der Kontrolle von Promotorelementen umfasst, die auf die Menge an p53 ansprechen, das für DNA-spezifische Bindung aktiviert wurde, um die Expression des Reporterpolypeptids zu steuern, wobei das Verfahren das Einwirkenlassen der Kandidatensubstanzen auf die Zellen und das Nachweisen der Gegenwart des Reporterpolypeptids umfasst, wobei das Verfahren kein Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder des Tierkörpers durch chirurgischen Eingriff oder Therapie oder Diagnoseverfahren ist, das am menschlichen oder an einem Tierkörper vorgenommen wird.
Verfahren nach Anspruch 15, worin Testsubstanzen Peptide sind und die Zellen mit einem Expressionsvektor transfiziert werden, der Nucleinsäure umfasst, die für die Peptide kodiert, so dass das Peptid in den Zellen exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, worin die Testsubstanzen als Fusion mit einem Peptid exprimiert werden, das dazu fähig ist, das Testpeptid in die Aktivstellen-Loop insertiert zu präsentieren.
Verfahren nach Anspruch 17, worin die Peptide als Fusion mit Thioredoxin exprimiert werden.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die Testsubstanzen in die Zellen mikroinjiziert werden.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die Testsubstanzen gekoppelt sind, um Moleküle zu transportieren, so dass Testsubstanzen in die Zellen transportiert werden.