KR101782857B1

KR101782857B1 - 항―ｔｒｋａ 항체 및 이의 유도체

Info

Publication number: KR101782857B1
Application number: KR1020107019748A
Authority: KR
Inventors: 파비오 베니니; 다니엘 디'엠브리오
Original assignee: 레이 라인 지노믹스 에스.피.에이.
Priority date: 2008-02-04
Filing date: 2009-02-04
Publication date: 2017-09-28
Also published as: DK2252633T3; JP5719596B2; ES2435917T9; IL207390A; MX2010008571A; EA021284B1; PT2252633E; AP2010005379A0; JP2011514314A; CA2713786A1; MY191348A; AU2009211340A1; CN101939337B; US20110145941A1; NZ587701A; IL207390A0; WO2009098238A1; ZA201006218B; PL2252633T3; AP2929A

Abstract

a) 도 1a에 기재된 바와 같은 BXhVH1, BXhVH2, BXhVH3, BXhVH4, BXhVH5, 또는 HuVHWOv로부터 선택되거나, 이의 유도체로부터 선택되는 서열을 포함하는 가변 중쇄 및/또는
b) 도 1b에 기재된 바와 같은 BXhVL1, BXhVL2, BXhVL3, BXhVL4, BXhVL5, BXhVL6, BXhVL7 또는 BXhVL8로부터 선택되는 서열을 포함하는 가변 경쇄, 또는 이들 서열의 유도체를 포함하는 항-TrkA 항체를 제공한다.
또한, TrkA 결합 유도체를 제공한다.
본 발명의 항체 및 유도체는 통증 치료를 포함한, 다양한 치료방법에 이용될 수 있다.

Description

항―ＴＲＫＡ 항체 및 이의 유도체{Anti-TRKA Antibodies and derivatives thereof}

본 발명은 항체 및 이의 유도체에 대한 것으로, 특히 인간화된 항체 및 이의 유도체에 대한 것이다.

신경 성장 인자(Nerve growth factor, NGF)는 두개의 막 수용체를 통하여 작용을 한다. 하나는 p75 수용체와 낮은 친화성을 가지는 것이고, 다른 하나는 TrkA로 알려진, 140KDa의 높은 친화성을 갖는 것이다.

NGF는 알츠하이머 병을 포함하는 다양한 신경 퇴행성 질환, 당뇨병(diabetes) 및 나병(leprosy)과 같은 다양한 질환의 치료에 이용될 수 있는 가능성이 있다.

그러나, NGF는 여러가지 원하지 않은 효능 활성(agonist properties)을 갖을 수 있다. 여기에는 통증 민감도의 증대를 포함한다. NGF-TrkA 시스템은 통증 치료에 대한 잠재적인 타겟을 제공한다.

다양한 항-TrkA 항체가 생산되었다. 그중에 하나의 항체는, WO97/21732(McGill University)에 5C3으로 표기되어 있는 단일 클론 항체이다. 그러나, 이것은 TrkA 효능제임이 밝혀졌으며, 따라서, 통증을 완화시키는데 유용하지 못하다. 특히, TrkA와 결합 하였을 시에, 이 항체는 TrkA 의 기능을 억제하지 못한다.

WO00/73344 (Societa Italiana Per La Ricerca Scientifica)에 개시되어 있는 MNAC13로 알려진 항 TrkA 단일클론항체가 있는데, 이로부터 EP-B-118138 (Lay Line Genomics SpA)이 유래되었다. 이 항체와 이의 유도체는 생물학적 시스템의 범위내에서 TrkA의 활성을 억제하는 효과적이라고 말해진다. MNAC13 단일클론항체는 표준 통증수용 테스트(standard nociception test)에 이용었으며, 현저한 통각과민(hypoalgesia) 효과가 있음이 밝혀졌다.

이 항체의 단일 사슬 Fv(ScFv) 유도체 또한 WO 00/73344에 개시되어 있는데, MNAC13 ScFv라고 표기되어 있다. 이것은 VL 영역의 C 말단과 VH 영역의 N 말단이 결합 펩타이드에 의해 함께 연결된 보다 커진 항체의 다양한 경쇄와 중쇄를 갖는다. 이 유도체는 MNAC13 정도로 TrkA에 효과적으로 결합하는 것이 밝혀졌다. 경쇄와 중쇄의 가변 영역의 서열은, WO97/21732에 개시된 항체의 대응되는 영역과 비교되었는데, 전반적인 서열 상동성은 매우 낮음이 밝혀졌다.

WO 06/131952 (Lay Line Genomics SpA)에서는 만성 통증을 치료하는데 항 TrkA 항체가 의학적 용도로 이용되는 것을 개시하였다. 여기서는, 특히 만성협착손상(Chronic Constriction Injury) 모델과 같은, 지속적인 통증 모델을 이용하여 이러한 사실을 밝혀냈었다.

WO 06/137106 (Lay Line Genomics SpA)에서는 NGF와 TrkA와의 결합을 억제할 수 있는 항TrkA 항체를, 통증 치료 또는 억제를 위해 이용되는, 하나 이상의 오피오이드 진통제(opioid analgesic)와 함께 이용한 것을 개시하고 있다. 많은 용량의 진통제를 이용하여 얻을 수 있는 통증 완화 효과과 동일한 효과를 얻기 위하여, 상기 혼합 치료방법은 오피오이드 용량을 감소시켜준다. 이것은 오피오이드 용량을 적게 사용해도 되기 때문에, 오피오이드에 의한 부작용을 감소시켜주기 때문에 매우 유용할 수 있다.

WO 05/061540 (Lay Line Genomics SpA & Scuolo Internazionale Superiore Di Studi Avanzati-Sissa)에서는 항체를 인간화시키는 방법에 대하여 개시하고 있는데, 여기서는 결정학 연구로부터 얻어진 구조 정보가 인간화를 위한 첫번째 설계 단계 수행에 이용되었다. 그 예로서, WO 05/061540은 WO00/73344에 개시된 항TrkA 항체와 항 NGF 항체를 개시점으로 취하여, 개시된 방법을 이용하여 그것들을 다시 설계하였다.

WO 05/061540에 인간화된 항체가 매우 유용하다는 것이 개시되어 있지만, 효과적인 치료 가능성을 확장하기 위하여 추가적인 인간화된 항체를 제공할 필요성이 있다.

본 발명은 WO 05/061540에 개시되지 않은 항 TrkA 항체 및 이의 유도체에 대한 것을 제공한다. 본 발명자들은 또한 이러한 항체의 유용성을 제시하는 자료를 제공하였다. 본 발명의 이전에는, 이러한 항체는 당업계에 알려지지 않았고, 상기 자료들은 예측할 수 없다.

본 발명의 한 측면에서, 하기의 구성요소를 포함하는 항 TrkA 항체를 제공한다:

a) 도 1a에 기재된 BXhVH1 (서열번호 1), BXhVH2 (서열번호 2), BXhVH3 (서열번호 3), BXhVH4 (서열번호 4), BXhVH5 (서열번호 5), 또는 HuVHWOv(서열번호 6) 으로 부터 선택되는 서열; 또는 상기 서열의 유도체를 포함하는 가변 중쇄;

및/또는

b) 도 1b에 기재된 XhVL1 (서열번호 7), BXhVL2 (서열번호 8), BXhVL3 (서열번호 9), BXhVL4 (서열번호 10), BXhVL5 (서열번호 11), BXhVL6 (서열번호 12), BXhVL7 (서열번호 13) 또는 BXhVL8(서열번호 14)로부터 선택되는 서열; 또는 상기 서열의 유도체를 포함하는 가변 경쇄.

또한, TrkA에 결합할 수 있는 특징이 있는, 상기 항체의 유도체를 제공한다.

보다 바람직하게는, 상기의 항체는 상기 a)에서 기술된 가변 중쇄와 상기 b)에서 기술된 가변 경쇄를 모두 포함하며, 즉, 이것은 다음의 경쇄와 중쇄의 조합을 포함한다:

BXhVH1VL1, BXhVH1VL2, BXhVH1VL3, BXhVH1VL4, BXhVH1VL5, BXhVH1VL6, BXhVH1VL7, BXhVH1VL8,

BXhVH2VL1, BXhVH2VL2, BXhVH2VL3, BXhVH2VL4, BXhVH2VL5, BXhVH2VL6, BXhVH2VL7, BXhVH2VL8,

BXhVH3VL1, BXhVH3VL2, BXhVH3VL3, BXhVH3VL4, BXhVH3VL5, BXhVH3VL6, BXhVH3VL7, BXhVH3VL8,

BXhVH4VL1, BXhVH4VL2, BXhVH4VL3, BXhVH4VL4, BXhVH4VL5, BXhVH4VL6, BXhVH4VL7, BXhVH4VL8,

BXhVH5VL1, BXhVH5VL2, BXhVH5VL3, BXhVH5VL4, BXhVH5VL5, BXhVH5VL6, BXhVH5VL7, BXhVH5VL8,

또는 HuVHWOv/HuVLWO.

항체의 유도체는, 각 서열에 대해 도 1a 및 도 1b의 밑줄로 표기된 영역에서 선택되거나, 밑줄로 표기된 각 영역에서 아미노산이 2개까지 치환된(바람직하게는 1개의 아미노산이 치환된) 이의 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 CDR 영역을 갖는다.

보다 바람직하게, 상기 항체의 유도체는, 각 서열에 대해 도 1a 및 도 1b의 밑줄로 표기된 영역에서 선택되거나, 밑줄로 표기된 각 영역에서 아미노산이 2개까지 치환된(바람직하게는 1개의 아미노산이 치환된) 이의 유도체로부터 선택되는 다수의 CDR 영역을 갖는다.

따라서, 항체는 상기 CDR 영역을 한 개, 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개 또는 여섯 개(선택적으로 한 개 이상의 서로 다른 CDR 영역을 조합으로)로 포함할 수 있다.

바람직하게는 적어도 중쇄의 3번째 CDR 영역을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 중쇄와 경쇄의 세번째 CDR 영역을 포함할 수 있다.

그러나, 가장 바람직하게는 각 서열에 대해 도 1a 및 도 1b의 밑줄로 표기된 여섯개의 CDR 영역에 상응하는 여섯 개의 CDR 영역을 갖거나, 밑줄로 표기된 영역에서 2개 이하의 아미노산이 치환된 유도체에 상응하는 여섯개의 CDR 영역을 갖는 것이다.

사실, 대부분의 경우, CDR 서열에서 변이가 없거나 거의 없는 것이 바람직하다. 따라서, 한 개, 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 또는 심지어 모두 여섯 개의 CDR 영역은 도 1a 및 도 1b에 표시된 것과 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.

구조형성영역(framework regions)에서는, 도 1a 및/또는 도 1b에서 기재된 밑줄이 표기되지 않은 서열 또는 밑줄이 표기되지 않은 서열과 적어도 75%의 상동성을 같는 유도체인 것이 바람직하며, 예를 들어, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 상동성을 갖는 것이 바람직하다.

아미노산의 서열 상동성 정도는 간격없이 서열의 단순한 정렬과 서열의 차이점의 결정에 의해 측정될 수 있다.

서열은 카밧 번호 체계(Kabat's numbering scheme)에 의해 정렬되었으며, 서열 상동성은 그에 따라 결정되었다(Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda MD, 1987 & 1991 참조). 상기 번호 체계는 WO 05/061540 (Reference can also be made to Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196, 901 (1987) and to Chothia et al., Nature, 342, 878 (1989))에서 논의된 바 있다.

덜 바람직하게는, 한개 또는 그 이상의 간격이 허용가능하며(예를 들어 하나 이상의 아미노산이 삽입 또는 결실되는 것에 대해), 이때 간격 불이익이 부여될 수 있다.

서열 상동성은 서열 분석 프로그램인, BLAST나 BLASTP(www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 에서 이용 가능)을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어 두개의 서로 다른 서열을 각각 “블라스팅(Blasting)”하는 것처럼, 뉴클레오티드 서열을 위해 BLASTN을 이용하여 두개의 서열을 비교하기위한 기본매개변수(default parameters)는 매치(match)=1, 미스매치의 벌점(penalty of mismatch)=2, 열린 간격(open gap)=5 및 확장 간격(extension gap)=2 로 한다. 단백질 서열을 위한 BLASTP를 사용할 때, 매치(match)=0, 미스매치의 벌점(penalty of mismatch)= 0, 열린 간격(open gap)= 11, 및 확장 간격(extension gap)= 1으로 한다.

보다 바람직하게는, 구조형성영역의 다양성이 존재하며, 이 영역은 도 1a 및 도 1b에서 개시되는 밑줄로 표기되지 않은 영역이나, 그것과 서열 상동성이 적어도 75%를 갖는 유도체(예를 들면, 그 서열 상동성은 적어도 80% 이상일 수 있으며, 90%, 95% 또는 98% 일 수 있다)로부터 선택된다.

도 1a 및 1b에서 개시된 각 서열은 4개의 구조형성영역을 갖는다. 따라서, 이것은 적어도 2개이상, 3개나 4개 이상의 영역이나 이의 유도체가 있는 것이 바람직하다.

가장 바람직하게는, 4개의 구조형성영역이나 이의 유도체가 있는 것이다.

하나 이상의 구조형성영역에서, 이러한 영역과 대응되는 부위의 설치류 서열(murine sequence)에 있는 아미노산으로 치환될 수 있는 아미노산의 치환을 포함하지 않는 것이 바람직하다.

비교를 위하여 사용될 수 있는 관련된 설치류 아미노산(murine amino acid)은 각각 도 1a 및 도 1b의 mVHEP 및 mVLEP에 표시되었다. 다만, 상기에서 언급한 바를 표기하기 위하여, mVHEP와 mVLEP 에서 몇개의 이탈릭체로 표기된 아미노산은 비-설치류로 고려된다. 이러한 위치에서, 쥐과(murine)라고 고려되는 잔기는 하기위 표에 기재되었으며, 도에서는 이탈릭체의 잔기로 표시되었다.

따라서, 하나 이상의 구조형성영역에서 그것이 인간화되는 정도는, 설치류 잔기 정도를 필수적으로 증가시키지 않는 아미노산의 치환으로 감소될 수 있습니다.

이것은 보존적인 비-설치류 아미노산 치환 및/또는 비보존적인 비-설치류 치환에 기인한 것이다.

그러나, 가장 바람직한 것은 보존적인 치환에 의한 것이다.

아미노산은 하기의 그룹으로 분류될 수 있다:

그룹 I (소수성 곁사슬(lateral chain)): M, A, V, L, I;

그룹 II (중성 친수성 곁사슬): C, S, T, N, Q;

그룹 III (산성 곁사슬): D, E;

그룹 IV (염기성 곁사슬): K, R;

그룹 V (주사슬의 방향성에 영향을 미치는 잔기): G, P; 및

그룹 VI (방향성 곁사슬): F, Y, W.

보존적인 아미노산의 치환은 같은 그룹간의 아미노산간의 치환을 수반하나, 비보존적인 아미노산의 치환은 서로 다른 그룹간의 치환을 수반한다.

경쇄와 중쇄의 서로 다른 부위에 어떠한 서열이 존재하든지, 본 발명의 항체와 이의 유도체는 같은 기능적 특징을 갖는 것이 바람직하다.

TrkA에 결합하는 것과 더불어, 본 발명의 항체와 이의 유도체는 TrkA에 대한 NGF의 결합을 억제하거나 감소시키는 것이 바람직하다.

바람직하게, 항체나 이의 유도체는 NGF와 TrkA 수용체와의 결합에 의해 야기되는 하나이상의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시킬 수 있다.

따라서, 효능제(agonist)이기 보다는, NGF의 TrkA에 대한 결합에 의해 유도되는 하나이상의 활성에 대항 길항제(antagonist)가 바람직하다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 이의 유도체는 TrkA에 대한 기능을 억제할 수 있다. 그 결과, 항체 및 이의 유도체에 의한 TrkA 기능의 억제는 in vivo에서 무통증을 일으킬 수 있다.

다양한 검사 방법이 이용될 수 있다.

표준적인 분석은 in vitro 검사에서 전형적인 PC12에 대한 것이다. 이 방법에서 PC12 세포는 NGF와 함께 배양되며, 후보 물질들은 NGF에 의해 유도되는 신경 성장의 정도를 감소시키는 효과를 관찰하면서 평가되어 진다. 이 모델은 WO00/73344의 실시예에서 이용되었다.

또 다른 분석에서, 도 2에 개시된 TrkA-IgG 결합 검사에서 0.1보다 큰 값의 OD_450/630 nm 값을 갖는 적절한 항체를 생산하였다. 보다 바람직하게는 OD_450/630 nm 값은 0.2 이상이고, 0.3 이상 되는 것이 가장 바람직하다.

추가적인 분석에서, 바람직한 항체 또는 이의 유도체는 실시예에서 기재된 FACS 기반 검사에서 TF1 세포의 FACS 염색의 증가를 제공한다(표 2 참조). 이것은 1.0 배 이상되는 것이 바람직하다. 1.5배 이상인 것이 보다 바람직하고, 적어도 2.0 배나, 2.5배가 바람직하다. 가장 바람직한 것은 3.0배 이상이다.

추가적인 분석에서, 본 발명의 약학적 용도와 관련되어 이후에 설명하는 것 처럼, 통증 감소에 대한 분석을 포함한다(본 발명의 항체/이의 유도체는 통증 반응에 대하여는 작용제보다는 길항제로서 작용하는, 의학적인 적용에 대한 것이 바람직하다.).

본 발명의 바람직한 항체 및 이의 유도체는, TrkB 보다 TrkA에 대한 높은 결합 친화도(실시예에서 도 2의 검은 컬럼과 흰 컬럼의 비교에서)를 갖는 것에서 선택된다.

실시예에서, 이것들은 TrkB에 대한 친화도에 비하여, 바람직하게는, 적어도 2배 이상의 결합 친화도를 갖으며, 적어도 4배 또는 적어도 6배 이상의 TrkA에 대한 친화도를 갖는다.

TrkB 에 비하여 상대적으로 높은 TrkA에 대한 친화도는 선택성을 높여 줄 수 있으며, 의도하지 않은 부작용에 대한 위험 부담을 낮출 수 있다.

결합 친화도는, 도 2에서 보여준바와 같이, 상대적인 결합력에 대한 연구를 통하여 쉽게 조사될 수 있다.

본 발명의 매우 바람직한 항체로서는, 경쇄와 중쇄의 하기와 같은 조합을 포함할 수 있다: BXhVH3VL3, BXhVH5VL1 또는 BXhVH5VL3.

이러한 조합은 도 3에서 나타낸 바와 같이, 검사에서 가장 좋은 결과가 나타났다.

BXhVH3VL3, BXhVH5VL1 또는 BXhVH5VL3이 바람직한 유도체이다.

다양한 항체 및 이의 유도체가 본 발명의 범주안에 포함되며, 이에 대하여는 이후에 논의될 것이다.

여기에는 하기 사항을 포함하는 다양한 적용예를 갖는다:

의약적 적용

본 발명의 항체 또는 이의 유도체는 의약에 이용될 수 있다.

이것들은 하기의 다양한 범주의, 여러가지 질환/장애를 치료하는데 이용될 수 있다.

따라서, 치료를 필요로 하는 개체에 본 발명의 약학적으로 유용한 항체 또는 유도체를 여기에 기술한 바와 같이 투여하는 단계를 포함하는 하기의 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 이때 개체는 포유동물인 것이 적절하며, 특히 인간인 것이 가장 바람직하다. 그 결과 질환들은 치료되었다.

본 발명은 하기에 언급된 질환을 치료하기 위한 의약을 제조하기 위하여 여기에 개시된 바와 같이 항체 또는 이의 유도체를 이용하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 여기에 기술한 바와 같이 항체 또는 이의 유도체를 포함하는 키트를 제공하며, 상기 키트는 하기에 언급된 질환의 치료를 위하여 개체에 사용하는 용법에 대한 설명서를 함께 포함한다.

여기에서 ‘치료(treatment)’라는 용어는 존재하는 장애(disorder)/질환(condition)의 약학적 치료를 포함한다. 또한, 이것은 예방적인 치료도 포함한다. 아울러, 비록, 환자들이 상기 장애/질환에 대하여 치료되지 않더라도, 나쁜 증상들의 개선을 의미한다.

통증

바람직한 약학적 용도는 통증에 대한 치료이다.

통증 연구에 대한 세계적인 학회(International Association for the Study of Pain, "IASP")따르면, 통증은 일반적으로 “실제 또는 잠재적인 조직 손상과 관련되거나, 그러한 손상면에서 기술된, 불쾌한 감각 및 감정적인 경험”이라고 정의된다. 통증의 모든 형태에서 중요한 요인은 특히 높은 역치의 수용체의 활성 및 잠재적인 조직 손상의 조직을 경고하기 위한 신경 섬유의 활성이다. 많은 통증에서, 염증 세포의 관여와 그러한 반응 관려는 일반적인 구성요소이다. "급성 통증(acute pain)"은 즉각적이고, 일반적으로 높은 역치를 갖는, 창상(cut), 압궤(cr미국h), 화상 또는 화학적 자극과 같은 상처에 의해 야기되는 통증을 의미한다. 여기서 사용된“만성 통증(chronic pain)"이라는 용어는 급성 통증과 다른, 염증성 원인이나 신경병 원인(neuropathic origin)의 통증을 의미한다.

본 발명의 항체는 만성 통증이나 급성 통증을 치료하는 이용될 수 있다.

보다 바람직하게 만성 통증의 치료에 이용될 수 있다.

통증 치료를 위한 항TrkA 항체의 이용에 대한 것은 WO 00/73344, WO 05/061540 및 WO 06/131952의 실시예에 기재되어 있다.

통증은 예를 들어 다음의 어느하나와 관련된 것이다: 췌장염(pancreatitis), 신장 결석(kidney stones), 자궁내막증(endometriosis), 염증성장질환(IBD), 크론병(Crohn’s disease), 수술후 협착증(post surgical adhesions) , 맹장결석(gall bladder stones), 두통(headaches), 월경통(dysmenorrhea), 근골격계통증(m미국culoskeletal pain), 염좌(sprains), 내장통(visceral pain), 난소낭종(ovarian cysts), 전립선염(prostatitis), 방광염(cystitis), 간질성방광염(interstitial cystitis), 수술후 통증(post-operative pain), 편두통(migraine), 삼차 신경병증(trigeminal neuralgia), 화상이나 상처에 의한 통증(pain from burns and/or wounds), 정신적 외상과 관련된 통증(pain associated with trauma), 신경병증 통증(neuropathic pain), 근골격계질환과 관련된 통증(pain associated with m미국culoskeletal diseases), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 퇴행성 관절염(osteoarthritis), 강직성 척추염(ankylosing spondilitis), 관절주변 병리 이상(periarticular pathologies), 종양 통증(oncological pain), 골전이에 의한 통증(pain from bone metastases), HIV 감염(HIV infection).

통증을 평가하기 위한 다양한 모델이 알려져 있으며, 이러한 모델은 항체 및 이의 유도체를 스크리닝하는데 이용될 수 있다.

예를 들어, WO 00/73344에서 기술된 바와 같이, 통증 핫 플레이트 테스트(nociception hot plate test)가 이용될 수 있다. 상기 실험은 McMahon et al., Nature Medicine, 1, 774-780 (1995)에서처럼, 면역접합체(immunoadhesin)로서 항체 및 유도체를 이용할 수 있다. 항체 및 유도체는 3 주동안 성체 래트의 뒷발에 피하로 투여하거나, 삼투압 미니 펌프로 투여하였다. 통증에 대한 민감도는 핫 플레이트 테스트 (Eddy and Leimbach, J. Phar. Exp. Ther., 107, 385-393(1953))를 이용하여 간격을 두고 측정되었고, 이것은 염증이나 신경에 대한 부분적인 손상과 같은 통각과민 현상을 모방한다. 이러한 경우, 통증 자극은 뒷발을 핥거나 점프를 하는 것과 같은 반응을 유발하며, 이것은 단순 반사보다 높은 통합적인 조정으로 간주된다. 테스트에 따라, 동물들은 최저로서, 통상 56℃의 적절한 온도로 가열된 플레이트를 같는 펜(pen)위에 놓여진다. 뒤발 핥기와 점프와 같은 두가지 반응 중 지연기간은 관련된 항체를 투여하지 않은 대조군 동물 모델과 항TrkA 항체 및 유도체로 처리된 실험군을 이용하여 측정되어졌다.

핫 플레이트 테스트의 대체로서, 포르말린(형태alin)에 대한 통증 반응으로 측정될 수 있다. 이러한 테스트는 Prog. Neurobiol., 41:565-607(1993) 의 Porro and Cavazzuti 에 의해 개시되었으며, WO 06/137106에서 사용되었다. 이는 주어진 후보물질이 시험 전에 투여되었을 때 발에서 모든 후속 저하를 분석함으로써 통증 반응에서 감소를 평가하는 것을 포함한다. 살린은 음성 대조군으로써 일반적으로 사용되었다.

또한, 상기 만성 협색 손상(CCI) 모델은은 잘 알려진 동물 모델이다. 상기 모델은 좌골 신경의 만성 협색을 포함하고, 신경병 환자 특유의 만성 통증의 평가에 사용한다. 상기 모델은 Bennett and Xie in Pain, 33, 87-107(1988)에 의해 개시되었다. 이는 예를 들면, WO 06/131592에서 사용되었다.

암

또한, 상기 항체/유도체는 암의 치료에 사용될 수 있다.

다양한 암에서 TrkA가 발현된다. TrkA와 NGF의 상호작용은 종양 발달에 관련되어 있을 수 있다(예를 들어 전립선 및 췌장 암). 실제로 암의 특정 형태에서는 NGF의 발현이 신경 섬유의 성장 및 침투를 촉진시킬 수 있다. NGF의 활성을 막음으로써, 신경종의 형성을 유의하게 감소시키는 것이 가능하다.

게다가, 저지 효과를 간단히 제공하기 위한 대안으로써, 하기에서 더욱 상세히 설명하는 바와 같이 상기 항체/유도체를 세포독성 제제와 결합시킬 수 있고, TrkA를 발현하는 암 세포를 표적하는데 사용할 수 있다.

그러나 상기 항체/유도체를 독소와 결합시키는 것은 불필요하다. 표적 세포를 코팅함으로써 항체/유도체가 시스템에 의한 공격(예를 들어 T 세포에 의한 것, 보체 활성화에 의한 것 등.)에 대하여 취약해질 수 있는 부위에서 ADCC(항체-의존성 세포-매개 세포독성)가 면역반응 동안 일어날 수 있다.

신경 장애

또한, 상기 항체/유도체는 다양한 신경 장애의 치료에 사용될 수 있다.

상기에서 나타난 바와 같이 상기 항체/유도체는 신경종의 형성을 감소시키는데 사용될 수 있다.

또한, 그들은 신경퇴행성 장애의 치료에 사용될 수 있다. 이전에 논술한 바와 같이, NGF는 알츠하이머병의 치료에서 잠재적 용도를 가지나, 통증 민감성의 증가를 포함하여 원하지 않는 작용제 특성을 가지고 있다. 본 발명의 항체/유도체는 NGF의 원하지 않는 작용제 효과를 감소시키기 위한 치료와 같은 곳에서 유용할 수 있다(또한, 하기 "병용 요법" 부분 참조).

게다가, 상술한 바와 같이 상기 항체/유도체는 신경병 환자의 통증을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이는 신경계의 손상 또는 기능 장애와 연관되어 있을 수 있다.

염증성 장애

더 나아간 응용은 염증성 장애의 치료이다.

NGF는 비만세포, 섬유아세포 및 염증 과정이 발생한 말초 부위의 다른 세포 형태에서 분비된다. 특히, 비만세포는 기본적인 역할을 하는 것으로 나타난다. 그들은 NGF를 생산하고 동시에 그들의 표면에서 기능적 TrkA 수용체를 발현한다. 상기 NGF/TrkA 시스템은 자가분비 양성 피드백 기작을 통해 알러지성 염증 신호를 국지적으로 증폭시키는 비만세포 활성화를 매개하는 것으로 나타난다. 치료될 수 있는 염증성 장애의 예시는 요로 및 골반 부위의 염증성 형태, 골관절염, 류마티스성 관절염, 천식을 포함한다.

기타 장애

이전에 논술한 바와 같이, NGF는 당뇨병 및 나병에서 잠재적 용도를 가지나, 통증 민감성의 증가를 포함하여 원하지 않는 작용제 특성도 가진다. 본 발명의 항체/유도체는 NGF의 원하지 않는 작용제 효과를 감소시키기 위한 치료와 같은 곳에서 유용할 수 있다(또한, 하기 "병용 요법" 부분 참조).

병용 요법

본 발명의 항체 또는 그들의 유도체는 병용 요법에서 하나 이상의 다른 활성 제제와 함께 사용될 수 있다. 그들은 약제와 동시에, 순차적으로 또는 합의된 투여방법으로 사용될 수 있다.

예를 들면, 상기 항체 또는 유도체는 진통성 오피오이드(진통제 opioid)와 조합될 수 있다.

TrkA의 생물학적 활성을 막을 수 있는 분자의 적은 양을 설명하는 WO 06/137106은 오피오이드의 진통 효과를 가능하게 할 수 있다.

이와 같은 오피오이드는 하기에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함한다:모르핀(morphine), 코데인(codeine), 디하이드로코데인 디아세틸모르핀(dihydrocodeine diacetylmorphine), 하이드로코돈(hydrocodone), 하이드로모르폰(hydomorphone), 레보르파놀(levorphanol), 옥시모르폰(oxymorphone), 알펜타닐(alfentanil), 부프레노르핀(buprenorphine), 부토르파놀(butorphanol), 펜타닐(fentanyl), 서펜타닐(sufentanyl), 메페리딘(meperidine), 메타돈(methadone), 나불피나(nabulfina), 프로폭시펜(propoxyphene), 펜타조신(pentazocine) 및 그들의 약학적으로 허용가능한 유도체(예를 들어 그들의 약학적으로 허용가능한 염).

대안적으로, 상기 항체 또는 유도체는 하나 이상의 비-오피오이드 진통제와 병용 요법에서 사용될 수 있다.

나아간 조합은 상기 항체 또는 유도체와 NGF이다. 상술한 바와 같이, 알츠하이머병, 진성 당뇨병, 나병 등을 포함하는 다양한 장애의 치료에서 NGF의 용도는 제안되었으나, 말초 표적에 대한 작용제 특성에 의해 발생되는 통증 민감성이 증가한다. 본 발명의 항체 또는 유도체를 사용함으로써, 다시 통증 민감성이 감소될 수 있고, 그것에 의하여 NGF-기반 치료가 더욱 매력적이게 된다.

나아간 조합은 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 유도체를 하나 이상의 다른 항체에 더하는 것이다. 바람직한 조합은 하나 이상의 다른 항-TrkA 또는 항-NGF 항체이다. 이와 같은 조합은 하나의 단일 항체를 사용한 치료와 연관된 상술한 장애 중 하나 이상의 치료에서 증가된 효능을 제공할 수 있다. 예를 들면 두 개 이상의 항체의 조합은 본 발명에서 이용할 수 있는 분석 절차에서 가장 효과적임을 발견하였다.

약학적 조성물, 담체 및 투여 경로

본 발명의 항체/유도체는 모든 적당한 루트를 통해 투여될 수 있다.

적당한 루트는 복막내, 근육내, 정맥내, 피하, 기도내, 구강, 장관, 장관외, 비강내 또는 피부 투여를 포함한다(하지만 이에 한정되지 않는다).

그러므로 본 발명은 항체 또는 그들의 유도체와 더불어 약학적으로 허용가능한 담체 또는 첨가제를 포함한느 약학적 조성물을 제공한다.

상기 항체/유도체는 일반적으로 액상 제형의 주사(복막내 또는 두개내-일반적으로 뇌실- 또는 심막내 또는 점액낭내) 또는, 고체 제형(환약, 정제, 캡슐의 형태로) 또는 액상 제형(유제 및 용액의 형태로)의 섭취를 통한 국소 적용으로 투여될 수 있다.

장관외 투여를 위한 조성물은 일반적으로 양립할 수 있는, 바람직하게는 수용액에 용해된 면역글로불린의 용액을 포함한다. 상기 제형에서 상기 항체/유도체의 농도는 0.005% 내지 15-20% w/v 이하에서 변화될 수 있다. 이는 액체의 부피, 점도 등에 따라서, 원하는 특정 투여 방법에 따라서 주로 선택된다.

대안적으로, 상기 항체/유도체는 고체 형태의 투여를 위해 제조될 수 있다. 상기 항체는 미정질의 셀룰로스, 젤라틴 또는 아라빅 고무와 같은 리간드; 락토스 또는 녹말과 같은 수령자; 알긴산 프리모겔(Primogel) 또는 곡물 녹말과 같은 제제; 마그네슘 스테아르산, 교질 이산화 규소와 같은 윤활제; 사카로스 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 민트 및 메틸 살리실산염과 같은 풍미제를 포함할 수 있는 다른 비활성 기체 또는 첨가제 물질과 조합될 수 있다. 다른 약학적 투여 시스템은 하이드로겔, 하이드록시메틸셀룰로오스, 리포좀, 마이크로캡슐, 마이크로에멀젼, 마이크로스피어 등을 포함한다.

장애에 의해 영향을 받거나/거기에 가까운 부위에 직접적으로 국소 주사하는 것은 장애가 국지적일 경우 투여 방법으로 적합하다.

항-종양 기반 치료와 대조적으로 WO 06/131952는 통증의 치료에서 다양한 항-TrkA 항체의 용도에 대하여 논한다.

여기서 전신에 적절하게 투여된 항-TrkA 항체를 설명하였다. 전신 투여는 예를 들어 연속적 정맥내 주입, 환약 정맥내 주입, 피하 또는 근육내 주사인 주사를 통해 수행될 수 있다. 또한, 대안적으로, 투여의 다른 형태(예를 들어 흡입을 통해 구강, 점막, 설하선 등)도 사용될 수 있다.

그러나, 만약 원한다면, 항체/유도체의 전달은 영향을 받은 조직의 부근에 국소 투여(예를 들어 관절내 주사 또는 피하, 근육내 주사)를 통해 수행될 수 있다.

상기 항-TrkA 항체/유도체는 투여의 계획된 루트에 적당한 약학적 조성물로 적절히 제형화될 것이다. 주사를 위한 용액은 적당한 완충액 및 몰농도 변형물(예를 들어 인산, 염 및 또는 덱스트로스)를 포함하는 적당한 수성 매질(예를 들어 주사를 위한 물)에 용해되거나 분산된 항체/유도체를 적당히 포함할 것이다.

상기 치료 체제(예를 들어 투여량, 시기 및 반복)는 상기 선택된 투여 루트에 의해 상기의 생성물의 한번 또는 반복된 투여로 이루어질 수 있다.

상기 투여량의 투여 간격은 임상 반응의 범위 및 기간 뿐만 아니라, 특정 개체 및 개체의 임상적 경력에 의존적으로 변형될 수 있다.

상기 항-TrkA 항체/유도체는 적절하게 장기간의 활성을 가진다. 특히 투여에 따른 상기 항체의 임상적 효과는 동물 실험을 통해 결정된 바에 따르면 적어도 21일간 지속된다. 게다가, 항-TrkA 항체/유도체는 그의 투여 후에 혈청 또는 혈장과 같은 관련된 생물학적 매트릭스에서 탐지될 수 있는 그의 존재보다 더 긴 기간 동안 임상적 효과가 나타날 수 있다.

의도된 장기간의 활성의 측면에서(예를 들어 적어도 1주, 또는 바람직하게는 적어도 2주, 예를 들어 적어도 3주, 또는 적어도 4주 동안 적절히 유지되는 효과), 상기 항체/유도체는 주당 한번 이하의 빈도, 예를 들어 2주에 한번 이하 또는, 3 주에 한번 또는 4주에 한번 이하로 개체내로 적절히 투여될 수 있다.

상기 항-TrkA 항체/유도체의 적절한 일일 투여량은 0.l mg/kg 내지 10 mg/kg 체중의 일반적 범위일 것이다.

(인간에서는 더 낮은 투여량이 당연히 바람직할 것임에도 불구하고, 2 mg/kg의 투여량에서 유의한 진통제 특성이 실험용 동물에서 관찰된 인간화된 항-TrkA 항체 및 CCI 모델을 이용하는 것은 WO 06/131592에 개시되었다)

종양의 측면에서 투여로 넘어가서, 투여는 종양 또는 종양 부위 근처의 조직에 직접 또는 국소 주사를 통할 수 있다. 전신 투여에 있어서, 투여량은 하루 0.05 mg/kg 내지 하루 500 mg/kg에서 변화될 수 있으나, 관리자에게 더욱 용이하기 때문에 상기 범위보다 낮은 투여량이 바람직하다. 투여량은 예를 들면 상기 항체/유도체의 혈장내의 특정 수준(대략 5-30 mg/ml, 바람직하게는 10-15 mg/ml의 범위로)을 보장하고, 이를 임상 결과를 얻을 때까지 주어진 기간의 시간동안 유지하기 위하여 조정될 수 있다.

췌장 또는 전립선 종양의 단계를 측정하거나 평가하는 효과적인 방법은 혈액내의 전립선 특이 항원(PSA)의 측정값, 췌장 종양의 생존 시간의 측정값, 상기 두 종양 형태의 경우에서 전이의 확산의 감속 또는 억제의 측정값에 기반한다.

종양 부위의 단계에서 직접적 주사에 있어서, 투여량은 많은 다른 변수들과 함께 형태, 단계 및 상기 종양의 용적을 포함하는 다른 인자에 의존적이다.

종양 용적에 의존하여, 전형적인 치료적 투여량은 필요한 빈도로 투여될 수 있는 0.01 mg/ml 내지 10 mg/ml 주사로 다양할 수 있다.

치료의 본질이 무엇이든 간에, 인간화된 항체/유도체는 더욱 천천히 제거될 수 있고, 비-인간화된 항체보다 혈장 내에서 효과적인 수준으로 유지하기 위하여 낮은 투여량이 요구된다. 게다가, 항체/유도체의 높은 친화성에 있어서, 투여는 낮은 친화성을 갖는 항체에 비하여 낮은 빈도 및 적은 크기일 수 있다.

각 항체/유도체의 치료적으로 효과적인 투여량은 의학분야의 당업자에 의해 치료 동안 결정될 수 있다. 만약 필요하다면, 투여량은 감소되거나(예를 들어 부작용을 감소시키기 위하여) 증가될(활성을 증가시키기 위하여) 수 있다.

투여에 앞서서, 본 발명의 항체/유도체의 준비는 얼리거나 감압건조하여 저장될 수 있다. 상기 항체/유도체는 이후 사용 전에 적절한 완충액에서 즉시 재구성될 수 있다. 주어진 상기 감압건조 및 재구성은 활성의 감소를 야기할 수 있고, 항체 투여 수준은 상기 사실을 보충하기 위하여 조정될 수 있다(전통적 면역글로불린에 대하여, IgM 항체는 IgG 항체에 비하여 더 큰 활성의 감소를 갖는 경향이 있다). 또한, 저장 기간은 항체/유도체를 특정 저장 기간 이후에 사용되지 않도록 하기 위하여 지정될 수 있다.

진단 및 예후 적용

본 발명의 항체 또는 그들의 유도체는 의학적 용도에 관련된 상술한 모든 질병/조건의 진단 또는 예후에 사용될 수 있다.

예를 들면 이는 알츠하이머병 등의 발병의 시기적으로 이른 마커로서 TrkA 양성 종양 마커의 탐지를 촉진시키기 위하여 사용될 수 있다.

또한, 이는 CIPA의 진단에 사용될 수 있다("땀샘의 결실을 동반한 통증의 선천적 무감각"). 이는 정기적으로 일어나는 일시적인 발열, 땀샘의 결실, 통증 자극에 대한 반응의 부재, 정신 지체 및 자해의 경향으로 특정지을 수 있는 유전성, 열성, 상염색체성 증후군이다. 이는 TrkA 유전자의 돌연변이에 기인한다.

실제로 본 발명의 항체 또는 유도체는 T가A의 유도체의 발현을 포함하는 넓은 범위의 조건의 진단 또는 예후에 사용될 수 있다(건강한 개체 또는 건강한 조직 샘플에서의 TrkA의 발현과 비교하여).

그러므로 본 발명의 범주에는 환자로부터 생물학적 시료를 얻는 단계 및 상기 시료로부터 본 발명의 항체 또는 유도체를 탐지하는 단계를 포함하는 방법이 포함된다.

만약 원한다면, 상기 항체/유도체는 고정화될 수 있다. 이는 진단 키트의 형태에서 제공될 수 있다.

상기 방법은 이후 상기 시료에서 정량적 및 정성적 방법으로 상기 항체/유도체의 결합을 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 만약 원한다면, 상기 방법은 양성 대조군(건강한 상태를 가리키는 것) 또는 음성 대조군(장애의 존재 또는 있음직함을 가리키는 것)을 참조하여 수행될 수 있다.

진단의 목적에 있어서, 상기 항체/유도체는 표적이 있는 탐지용 마커일 수 있고, 표지되지 않을 수도 있다(본 발명에서 사용된 상기 용어"마커"는 탐지가능한 변화를 일으킬 수 있는 표지 또는 모든 다른 탐지가능한 모이어티/부분을 포함한다)

표지되지 않은 항체는 인간화된 또는 인간 항체에 대하여 반응하는(예를 들어, 인간 면역글로불린의 불변 부위에 특이적인 항체) 다른 표지된 항체(2차 항체)와 조합하여 사용될 수 있다.

대안적으로, 항체는 직접 표지될 수 있다. 마커의 폭넓은 유도체, 예를 들어 방사성 핵종, 형광단, 발색제, 효소, 효소 기질, 효소 인자, 효소 억제제, 리간드 등이 사용될 수 있다.

특히, 진단 또는 예후의 이미징 적용에 있어서, 탐지가능한 제제는 탐지가능한 항체에 접합되거나 탐지가능한 방사성 동위 원소(예를 들어 요오드, 인듐, 테크네튬과 같은 방사성 동위 원소)나 상자성 방법(천이 원소, 악티니드 및 희토, 특히 망간 II, 구리 II 및 코발트 II와 같은 상자성 원소 또는 이온으로)으로 표지된다.

이미징 절차는 정맥내, 복막내 또는 피하주사를 수반할 수 있고(림프절 전이를 확인하기 위해 림프 고름 부위에서), 이뮤노사이언티그라피(immunoscintigraphy)의 경우에서 방사성 핵종 방출(β 카운터의 섬광과 같은)의 탐지자로 사용할 수 있다.

만약, 상자성 흔적이 사용되었다면, NMR 분광계를 사용할 수 있다.

기타 적용

상기 항체/이의 유도체는 나아간 항체를 발굴하기 위한 시작점으로써 사용될 수 있다. 그러므로 그들은 디자인 도구로서 사용될 수 있다.

그들은 하나 이상의 결합/기능 분석을 통해 스크리닝 될 수 있고, 그러므로 약물 발굴 프로그램의 부분이 될 수 있다.

그들은 법의학 연구 등을 위한 조직 타이핑(typing)을 위해 사용될 수 있다.

그들은 연구 도구로서 사용될 수 있다.

예를 들면 그들은 TrkA 및/또는 TrkA가 NGF에 결합되는 것에 관련된 장애(또는 다른 TrkA 결합 제제)의 나아간 연구에 사용될 수 있다. 그들은 결합 및/또는 활성화를 연구하기 위하여 사용될 수 있다.

상기 항체/유도체의 상술된 모든 적용은 본 발명의 범주에 들어간다.

항체 및 항체 유도체의 성질

본 발명에서 사용할 수 있는 항체 및 이의 유도체의 폭넓은 범위는 상기 서술에 의해 올바르게 이해될 것이다.

용어 "항체" 및 "항체 유도체"에 대한 의심을 기피하기 위하여, 하기에 더욱 상세히 기술하였다.

항체

본 발명의 항체는 모든 원하는 면역글로불린 구조의 형태일 수 있다.

그러나 IgG 및 IgM이 바람직하며, IgG가 가장 바람직하다. IgG의 아형에서 IgG1이 바람직하지만, IgG4를 포함하는 다른 형태도 사용할 수 있다.

상기 항체는 예를 들어, 자연상태에서는 다른 하나와 정상적으로 연관될 수 없는 하나 이상의 부위를 포함하는 키메라이다. 더욱 상세하게는, 하나 이상의 설치류-유래 CDR 부위를 항체에 나타내지만, 다른 부위(특히 불변 부위)는 바람직하게는 인간 또는 인간화된 것이다.

인간화된 부위는 상응하는 마우스 면역글로불린 부위와 비교하여 일반적으로 주어진 인간 면역글로불린 부위만큼 더 많은 잔기를 갖는다. 바람직하게는 아미노산 서열 수준에서 인간 부위와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 상동성을 갖는다. 더욱 바람직하게는 그들은 하나 이상의 비-CDR 부위에서 100% 서열 상동성을 갖는다(예를 들어 불변 부위).

그러나 어떤 경우에서 특정 변화를 도입하는 것이 유리할 수 있다.

예를 들면, 그들은 하기 그룹에서 하나 이상을 막거나/감소시키는 변화를 도입하는 것이 바람직하다:

a) 보체 시스템의 활성화

b) 보체 매개성 용해

c) T 세포의 활성화

d) Fc 수용체와의 결합.

돌연변이는 상술한 것 중 하나 이상의 특허에서 언급한 것이 달성될 수 있음을 나타낸다. 그러므로 상기 돌연변이 중 하나 이상은 본 발명의 항체/유도체를 포함할 수 있다.

예를 들면, 미국 특허 제 6,194,551호는 IgG 분자의 불변 중쇄 부위에서 아미노산 부위 322, 329 및/또는 331(카밧 번호 체계를 사용)에서 아미노산 치환을 제안하고, 그들이 C1q에 결합하는 Fc를 폐기함으로써 보체의 원하지 않는 활성화를 막거나 감소시키는데 사용될 수 있음을 제시한다(또한 Ward and Ghetie, Therapeutic Immunology 2: 77-94(1995) 참조). 미국 특허 제 6,194,551호는 프롤린이 인간 IgG의 329번째 위치에서 보존되어 있다고 설명한다. 상기 잔기(글리코실화 되고, 그것에 의하여 보체 시스템을 활성화하는 것을 포함할 수 있는)는 바람직하게는 알라닌으로 치환된다. 그러나 예를 들어, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글리신 또는 발린과 같은 다른 모든 아미노산은 심사숙고해야한다. 또한, 미국 특허 제 6,194,551호는 프롤린은 인간 IgG1, IgG2 and IgG3의 331위치에서 보존되어 있지만 IgG4(331 위치에 세린 잔기를 갖는)에서는 그렇지 않다고 설명한다. 331번째 잔기는 바람직하게는 알라닌 또는 예를 들어 세린(IgG4를 제외한 IgG 부위에 대하여), 글리신 또는 발린의 다른 아미노산으로 교체된다. 나아가 논의된 가능성은 322 위치에서 치환을 도입하는 것이다. 리신 322는 인간 IgG에서 보존되어 있고, 상기 잔기는 다른 모든 아미노산 잔기는 심사숙고해야할지라도 바람직하게는 알라닌 잔기로 교체될 수 있다(예를 들어 세린, 트레오닌, 글리신 또는 발린).

미국 특허 제 6,491,916호는 인간화된 항체의 대략 230 위치 내지 대략 240 위치 부위에서의 돌연변이가 특정 이점을 생산할 수 있음을 드러낸다. 여기서 Fc에 결합하는 항체 및 Fc에 결합하지 않는 항체의 비교는 T 세포를 활성화 시키지 않는 항-CD3 항체에서 기인한 상기 부위의 변화를 제시한다. 예를 들면, 바람직한 항체의 몇몇은 234 위치에서, 235 위치에서 또는 둘 다에서 돌연변이를 포함한다. 항-CD3 항체는 이점을 갖는 것으로 기대되는 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 또는 240 위치의 하나이상에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 또한, 상기 특허는 IgG1 Fc 부위를 갖고, 234 및 2325 위치 모두에서 알라닌을 갖도록 돌연변이된 항체는 보체의 C1q 성분에 결합지 않고, 보체-매개 캐스케이드를 시작하지 않는 것을 나타낸다. 나아가, 상기 특허는 320 Lys의 Gln으로의 돌연변이는 야생형 보다 C1q에 대하여 오직 조금 약한 친화성을 갖지만, 용해되지 않는다고 설명하였다.

미국 특허 제 5,624,821호는 잔기 318(Glu), 320(Lys) 및 322(Lys) 잔기 중 어떤 하나를 Ala로 변화시킴으로써, C1q 결합을 폐지하는 것이 가능함을 밝혔다. 상기 특허는 C1q 결합을 폐지하기 위해 Ala로 이온성 잔기를 교체시킬 필요 뿐만 아니라 C1q 결합을 폐지하기 위하여 상기 세 잔기 중 어느 하나를 치환하는데 Gly, Ile, Leu 또는 Val과 같은 또는 Phe, Tyr, Trp 및 Pro와 같은 방향족 비-극성 잔기와 같은 다른 알킬-치환된 비-이온성 잔기를 사용하는 것이 가능할 것임을 지적하였다. 또한, Clq 결합 활성을 폐지하기 위하여 318을 제외한 320 및 322 잔기를 치환하는데 Ser, Tyr, Cys 및 Met와 같은 극성 비-이온성 잔기 같은 것을 사용하는 것이 가능할 것이다. 나아가 미국 특허 제 5,624,821호는 잔기 297(Asn) 잔기를 Ala로 교체하는 것은 C1q에 대한 친화성에 대하여 오직 약한 감소(대략 세 배 약함)만을 나타낼 때 용해 활성을 제거하는 결과를 야기하는 것을 밝혔다. 이는 상기 변화가 상기 글리코실화 부위를 파괴함으로써 일어난 다는 생각 및 탄수화물의 존재가 보체 활성화에 필요하다는 것을 설명한다. 또한, 이는 상기 위치에서 어떤 다른 치환도 상기 글리코실화 부위를 파괴할 것임을 지적한다. 또한, 미국 특허 제 5,624,821호는 경첩 연결 부위에서 근처거나 가까운 부위에서의 돌연변이(예를 들어 234, 236 또는 237을 Ala로 교체)가 234, 235, 236 및 237 잔기의 변화에서 상기 Fc 감마 R1 수용체에 대한 친화성에 적어도 영향을 미치는 것을 가리키는 것을 밝혔다.

하나 이상의 아미노산 변화(전형적인 보존된 아미노산 변화)는 당연히 생물학적 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않고 통합될 수 있다. 그러므로 가능한 돌연변이는 상술한 바에 제한되지 않는다.

어떤 성질의 항체라도 단일클론 형태(예를 들어 동일한 항체와 조합되어) 또는 다중클론 형태(예를 들어 다른 항체와 조합되어)로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 단일클론 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마는 본 발명의 범주에 들어간다.

항체 유도체

상기 용어 "항체 유도체"는 원하는 기능적 특성이 남아있게 제조된 항체에 관하여 만들어질 수 있는 구조적 변화의 광범위한 범주에 대하여서 허용하는 것이 의도되었다.

그러므로, 예를 들면, 바람직하게는 TrkA에 대한 결합 친화성은 남아있어야 한다.

또한, 바람직하게는, 상기 유도체는 본 발명에서 서술한 하나 이상의 기능적 분석에 효과적이다.

의심을 기피하기 위하여 하기 그룹 모두가 본 발명의 항체의 유도체로 여겨질 수 있음을 기재하였다:

a) 상기 항체의 단편

b) 상기 항체의 단편의 복수를 포함하는 다량체("단편 멀티머"로서 지칭되는)

c) 상기 항체, 단편 또는 단편 멀티머 및 다른 부위의 융합 산물

d) 상기 항체, 단편, 단편 멀티머 또는 융합 산물과 적어도 75%의 서열 상동성을 갖는 유도체.

그러므로 상기 용어 "유도체"는 광범위하게 해석될 수 있다.

본 발명의 단편으로 돌아가서, 이들은 바람직하게는 적어도 7개 아미노산 길이이다(그러므로 그들은 적어도 본 발명의 중쇄 및 경쇄에 대한 도 1a 및 도 1b에 나타난 가장 짧은 CDR 부위보다 길다). 더욱 바람직하게는, 그들은 적어도 10, 적어도 15 또는 적어도 10개 아미노산 길이이다.

그들은 전체 항체로부터 시작하여 단백질 가수분해성 절단의 방법을 통해 또는 상기 중쇄 및 경쇄의 가변 부위를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 벡터에서 원하는 위치에 종결 코돈을 삽입함으로써 제조될 수 있다. 이는 Fav 단편을 생산하기 위해 CH₁ 부위 다음에 또는 (Fab')₂ 단편을 생성하기 위해 경첨 부위 다음에서 이루어질 수 있다.

ScFv 사슬의 형태인 유도체는 링커의 방법을 통해 중쇄 및 경쇄의 가변부위를 결합시킴으로써 얻을 수 있다(H미국ton et al, PNAS, 85, 5879(1988); Bird et al, Science, 242,423(1988)). Fv 또는 Fab 단편은 대장균(Buchner and Rudolph, Bio/Technology, 9, 157(1991); Skerra et al., Bio/Technology, 9, 273(1991)) 또는 바람직하게는 포유 동물 유래의 진핵세포에서 발현될 수 있다.

Nature Biotechnology, Vol 23, 제 9, 1126-1136(2005)에서 Holliger & Hudson가 논의했던 것들을 포함해서 실제로 다양한 범위의 단편 형태가 가능하다.

이들은 모두 본 발명의 범주에 들어간다. 그들은 개별 VH 또는 VL 사슬(때때로 "도메인 항체" 또는 "dAbs"로 알려져 있음) 또는 상기 사슬의 단편(예를 들어 개별 CDR 부위)까지로 구성된 단편을 포함할 수 있다. 또한, 미니바디(minibodies), bis(또는 다중)-ScFv, 2중항체(diabodies), 3중항체(triabodies), 4중항체(tetrabodies), Fab 멀티머s 등(본 발명에서"단편 멀티머"로 지칭됨)등과 같은 멀티머 형태도 포함한다.

게다가, 다양한 다른 모이어티들이 유리한 특성을 제공하기 위하여 본 발명의 항체/단편과 공유결합될 수 있다. 이러한 "융합 산물"은 본 발명의 유도체의 범주에 들어간다. 예를 들면, 모이어티는 진단 제제, 치료 제제, 탐지 제제, 상기 산물의 수명을 증가시키는 제제, 또는 면역원성을 감소시키는 제제(바람직하게는 인간 숙주에서)일 수 있다.

예를 들면, PEG화된 항체/단편의 형태인 융합 산물로 제조될 수 있다. PEG는 항체의 면역원성을 감소시키고 순환 수명을 중가시키기 위하여 널리 사용되고 있다. 또한, 이는 종양을 표적하는 것과 같은 특정 임상 조건에서 항체를 사용하는 것에서 이로운 효과를 가질 수 있다.

융합 산물의 부분은 화학적으로 같이 연결될 수 있다. 예를 들면, 이중기능이성체(heterobifunctional) 제제(예를 들어 SPDP, 카보다이이미드, 글루타르알데히드 등)를 사용하여 교차-결합함으로써 이루어질 수 있다.

융합 단백질의 경우에서, 그들은 바람직하게는 유전공학기술을 이용하여 제조된다. 그러므로 원하는 융합 단백질을 암호화하는 유전자 코드에 기반한 적당한 암호화 서열이 준비되어야 하고, 적절한 발현 벡터를 사용하여 숙주 세포로 복제되어야 한다. 발현은 구조적 또는 유도성 대조군의 조절 하에서 이루어져야 한다. 발현된 융합 단백질은 표준 기술[예를 들어 면역친화성(immunoffinity] 절차를 사용함으로써)을 이용하여 정제될 수 있다. 세포기반 또는 무세포 발현 시스템을 사용할 수 있다.

예를 들면, 융합 단백질은 세포독소와 융합된 본 발명의 항체/단편을 포함할 수 있다. 결과로서 생기는 융합 단백질은 이후 예를 들어 TrkA 발현 종양 세포인 TrkA 수용체를 발현하는 표적 세포에 사용될 수 있다.

다양한 세포독성 면역독소의 생산은 Thorpe et al, Monoclonal Antibody in Clinical Agent, Academic Press, 168(1982)에서 보고되었다. 실제로 세포독성 제제의 다수가 면역독소로 사용하기에 적절하다. 상기 제제는 요오드 131 또는 요오드의 다른 동위원소, 이트륨 90, 레늄 188 및 비스뮤트 212 또는 알파입자를 방사하는 다른 동위원소와 같은 방사성 핵종, 빈데신, 메토트렉사트, 아드리아마이신 및 시스플라틴과 다수의 화학요법 약물; 리보좀을 억제하는 단백질과 같은 세포독성 단백질[예를 들어 미국자리공(pokeweed) 항바이러스 단백질, 슈도모나스 외독소 A, 디프테리아 독소, 아채 유래의 리신 A(ricin A) 및 클라빈(clavin)], 또는 세포 표면에서 활성화되는 제제(예를 들어 인지질가수분해효소 C와 같은 인지질가수분해효소)를 포함한다.

때때로 상기 면역독소의 세포독성 부위는 면역원성일 수 있고, 그 결과 만성 또는 장기간 치료의 경우 융합단백질의 임상적 유용성이 제한된다.

상기 면역원성의 문제를 회피하기 위한 대안은 DNA와 상호작용하고 상기 융합 단백질에 결합하는 단백질인 항체/유도체의 결합 도메인이 발현되는 것과 상기 독소 발현 카세트를 포함하는 벡터(예를 들면 플라스미드)가 융합되는 것이다. DNA에 결합하는 인간 단백질인 프로타민의 다수의 양성 전하는 DNA의 음성 전하와 항체/유도체의 중성 전하를 위한 융합 파트너를 생성하는 안정된 방법으로 상호작용할 수 있다. 이는 상기 독소 자체보다 더욱 안정적이고 면역원성은 덜 띈다. 상기 항체-벡터 복합체가 수용체 매개 엔도시토시스를 통해 내면화된 이후, 상기 독소의 발현은 세포의 죽음을 야기한다.

게다가, 만약 원한다면, 유도성 또는 세포-특이적 대조군을 상기 독소 발현 카세트에 제공할 수 있다. 이러한 접근은 독성 부작용은 최소화하면서 종양 세포의 선택적 제거를 최대화하기 위한 목적이다(Chen et al, Gene 상기r., 2, 116(1995)).

또한, 융합 단백질은 다른 항체/유도체와의 융합을 포함할 수 있다. 예를 들면 특이적 항원에 대한 dAb를 길게 지속되는 혈청 단백질에 결합하는 능력의 다른 dAb와 융합시키는 것이 혈청 내 수명을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 가변 중쇄 및 경쇄 서열은 하나 이상의 항원, 이들 중 하나는 TrkA, 또는 TrkA 내의 하나 이상의 에피토프에 대한 특이성을 갖는 다중 항체의 일부 형태일 수 있다.

다중 항체의 하나 이상의 항원 중 하나는 TrkA이다.

발현 시스템

많은 발현 시스템이 발명의 항체/유도체를 제조하는데 사용될 수 있다.

예를 들면, 원핵세포 시스템이 사용될 수 있고, 잘 특성화 되어 있다.

본 발명의 DNA 서열을 클로닝하는데 특히 유용한 원핵세포 숙주의 하나는 대장균이다. 게다가, 예를 들면, lac 또는 trp 오페론 또는 ß-락타마제 또는 λ 파지와 같은 잘 특성화된 다수의 대조군이 사용가능하다. 일반적으로, 상기 대조군은 발현을 조절하고, 리보좀 결합 부위, 전사 및 해독의 정확한 시작점 및 종결점을 유지한다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)와 접합되어 원핵세포 시스템에서 생산된 본 발명의 인간화된 면역글로불린의 수명이 증가하는 것이 가능하다.

효모와 같은 다른 단일-세포 유기체를 발현에 사용할 수 있다. 선택된 숙주는 발현 조절, 복제 종결 및 복제 시작점 서열을 제공하는 적절한 담체를 사용하는 사카로마이세스이다.

면역글로불린의 가변 부위의 서열을 나타내는 파지-디스플레이 라이브러리는 잘 알려져 있고, 결합 연구에서 사용될 수 있다[Cesareni, FEBS Letts, 307, 66(1992); Swimmer et al. PNAS, 89, 3756(1992); Gram et al. PNAS, 89, 3576(1992); Clackson et al. Nature, 352, 624(1991); Scott & Smith, Science, 249, 386(1990); Garrard et al. Bio/Techniques, 9,1373(1991)].

또한, 곤충 세포 배양을 사용할 수 있는데, 일반적으로 사용되는 안정된 방법으로 형질전환된 S2 초파리의 세포 또는 바큘로바이러스(Baculovir미국) 기반의 발현 시스템을 갖는 도둑나방(Spodoptera frugiperda) 세포를 사용한다(Putlitz et al. Bio/Technology, 8, 651(1990)).

식물 또는 식물 세포의 배양조차 사용될 수 있다(Larrick & Fry, Hum. Antibodies Hybridomas, 2, 172(1991); Benvenuto et al. Plant Mol. Biol, 17 865(1991); Durin et al. Plant Mol. Biol,; 15,281(1990); Hiatt et al. Nature, 342,76(1989))

또한, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 포유동물 세포의 조직 배양을 사용하는 것도 가능하다. 이는 인간 글리코실화 패턴을 얻는것에서 이점이 있을 수 있다. 다른 이소타입을 발현할 수 있다. IgG4가 종종 진단 적용에 사용되지만(Riechmann et al., Nature, 332,323(1988)), IgG1은 면역 반응의 유도에 가장 효과적인 이소타입으로써 증명되었다(Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, NY,(1987)).

또한, 보체 활성화를 폐기하거나 감소시키는 변형된 형태는 이전에 미국 특허 제 6,194,551호, 미국 특허 제5,624,821호 및/또는 미국 특허 제6,491,916호에서 논술된 바와 같이 제공될 수 있다.

특히, 포유동물 세포가 바람직하다. 다수의 숙주 세포주가 전체 면역글로불린의 분비를 위해 개발 되었고, 그들 중에는 CHO 세포주, 몇몇의 COS 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주(NSO, SP/2, YB/0 e P3X63.Ag8.653), 형질전환된 B 세포 또는 하이브리도마가 있다. 상기 세포에 대한 발현 벡터는 복제 기점, 조절부위, 인핸서(Queen et al, PNAS, 86:10029(1989)) 및 리보좀 결합, RNA 스플라이싱 및 폴리아데닐화에 필요한 서열 및 전사 종결을 위한 서열과 같은 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 선택된 발현 조절 서열은 면역글로불린 유전자로부터 및, SV40, 아데노바이러스, 소과 우두종 바이러스, 사이토메갈로바이러스와 같은 종류의 것과 같은 바이러스로부터 유래한 대조군이다. 일반적으로, 상기 발현 벡터는 네오마이신에 대하여 저항성이 있는 것과 같은 선별 마커를 포함한다.

인간화된 항체의 발현을 위해, 무혈청 배지에서 포유동물 세포주를 배양하는 것이 바람직하다. 예를 들면 HUDREG-55 세포주가 시그마(미국)의 카탈로그 번호 S-2897인무혈청 및 무단백질 배지에서 쉽게 자랄 수 있다.

핵산, 벡터, 형질전환 동물

본 발명의 항체/유도체/항체 사슬을 암호화하는 핵산 서열은 본 발명에서 제공하는 중요 가변 부위에 대한 아미노산 서열 및 유전자 코드를 사용하여 준비할 수 있는 상응하는 암호화 서열을 가지고 표준 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 상기 서열은 발현 벡터에 통합되거나 및/또는 세포내로 클로닝 될 수 있다.

실제로 설치류 CDR 부위 및 인간화된 구조형성영역 부이를 갖는 "재구성된 항체"를 생산하고 클로닝하는 기술은 잘 알려져 있다. 이들은 예를 들면, Jones, Dear, Foote, Neuberger and Winter, Nature, 321, 522-4(1986); in Riechmann, Clark, Waldman and Winter, Nature, 332, 323-327(1988) and in Verhoeyen, Milstein and Winter, Science, 239, 1534-1536(1988)에 개시되었다.

이와 같은 핵산은 당업계에서 잘 알려진 바 및 상술한 바와 같이 플라스미드, 파지 등을 포함하는 발현벡터에 통합될 수 있다.

또한, 본 발명의 핵산은 프로브 또는 프라이머를 설계하는데 이용될 수 있다. 이들은 예를 들면 본 발명의 핵산을 동정하거나 증폭시키기 위해 사용될 수 있다.

그러므로 프로브 또는 프라이머는 본 발명의 범주에 들어간다. 일반적으로 그들은 적어도 10, 적어도 15 또는 적어도 20 염기 길이이다. 바람직하게는 그들은 엄격한 조건 내에서 본 발명의 항체/유도체를 암호화하는 핵산 가닥 또는 그들의 상보 가닥과 혼성화된다. 엄격한 혼성화 조건의 한 예는 5 × SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA(pH 8.0)의 사전 세척 용액을 사용하고, 5 × SSC를 사용하여 55℃에서 밤새 혼성화를 시도하는 것을 포함한다. 그러나, 그들은 많은 다른 가능성이 있다. 이들 중 몇몇은 예를 들면, WO98/45435의 표 1에 나타나있다(특히 상기 표에서 A-F에 내타난 조건, 덜 바람직하게는 G 내지 L 또는 M 내지 R에 나타난 조건을 참조).

본 발명의 나아간 측면에서 핵산은 비-인간 형질전환동물, 바람직하게는 마우스를 생산하는 것에 사용하기 위한 트랜스유전자를 제공하기 위해 사용될 수 있는 이점이 있다. 이때 상기 항체/유도체가 유도성 방법 또는 구조적 대조군의 조절 하에서 발현될 수 있다.

이러한 동물은 특히 신경 퇴행성 병상과 같은 NGF/TrkA 상호작용이 억제된 인간 병상에 대한 약물을 연구하고 실험하는데 사용하는 것에 대한 이점이 있을 수 있다.

상기 항체/유도체는 젖 또는 혈청과 같은 회수가능한 체액에서 유용하게 발현될 수 있고, 이로부터 표준 기술을 이용하여 회수하고, 정제할 수 있다.

상기 형질전환 동물을 생산하는데 사용하는 트랜스유전자는 설치류 면역글로불린 또는 카제인 유전자의 조절자/인핸서와 같은 조절자에 효과적으로 결합하는 상보 암호화 서열을 일반적으로 인핸서 서열과 함께 조합하여 포함할 수 있다(Buhler et al., Bio/Technology; 8,140(1990); Meade et al., Bio/Technology, 8, 443(1990)).

상기 트랜스유전자는 상동성 재조합의 방법을 통해 세포 배아로 형질전환될 수 있다. 마우스, 래트, 양, 소, 염소 등을 포함하는 비-인간 형질전환 동물의 광범위한 범위가 제조될 수 있다(WO 91/08216 참조).

상술한 설명으로부터 본 발명이 제공하는 신규한 항체, 유도체, 핵산 등의 범위에 대하여 용이하게 이해될 것이다.

만약 원한다면, 이들은 실질적으로 정제된 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 이러한 목적은 특정 조성물의 건조 중량의 과반수가 본 발명의 항체, 유도체, 핵산 등인 것을 의미한다. 예를 들면 그들은 상기 건조 중량의 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98%를 차지할 수 있다.

그들은 분리된 형태로 제공될 수 있다. 이는 천연상태에서 일반적으로 통합될 수 있는 하나 이상의 다른 구성요소로부터 그들을 제거한다는 것을 의미한다(예를 들면 세포로부터 분리될 수 있는 형태에서 핵산을 제공할 수 있다).

그들은 다른 다양한 형태로 제공될 수 있다. 예를 들면 그들은 이종기원의 모이어티와 융합되거나 및/또는 고정화될 수 있다.

상술한 모든 형태는 본 발명의 범주에 들어간다.

본 발명은 이제 하기의 첨부된 도에 대한 참조와 함께, 예시적인 방법으로 설명될 것이다:
도 1a & 1b는 다양한 중쇄 및 경쇄에 대한 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다.
도 2는 COS-7세포에서 인간화된 MNAC13 유도체의 일시적 발현을 포함하는 실험으로부터 얻은 다양한 클론의 상청액에 대한 TrkA-IgG에 특이적인 항원 결합에 대한 결과를 나타낸다.
도 3은 유세포 분석을 통해 분석된 TF-1 세포에 발현된 T가A에 대한 항체의 세포 결합에 대한 실험의 결과를 나타낸다.
도 4는 도 3에서 선별된 최고의 결합물(BXhVH3VL3, BXhVH5VL1, BXhVH5VL3 및 HuMNACWOv)을 HuMNACWO와 비교하여 보다 더 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 다른 인간화된 후보물을 쥐과의 MNAC13 항체(muMNACEP), chimMNAC13, HuMNACWO과 표준 대조군으로써 인간 IgG1과 나란히 분석한 것에 대한 분석의 결과를 나타낸다.
도 6은 불변 부위를 포함하는 BXhVH5VL1에 대한 중쇄 및 경쇄 부위를 나타낸다(불변 부위의 첫 아미노산에 밑줄로 표시하였다. 불변 부위의 첫 아미노산에 밑줄로 표시하였다.)
도 7은 불변부위를 포함하는 BXhVH5VL1 N297A의 중쇄를 나타낸다(불변 부위의 첫 아미노산에 밑줄로 표시하였고, 297A 위치는 볼드체 및 밑줄 표시하였다).
도 8은 huTrkA를 발현하는 세포주에 대한 BXhVH5VL1 및 BXhVH5VL1 N297A의 결합을 나타낸다.
도 9는 인간 비만세포주에서 NGF-유도 MIP-1b 생산에서 다양한 항체의 효과를 보여준다.
도 10은 BXhVH5VL1 N297A와 비교하여 THP1 세포주에서 세포 결합된 Fc 수용체에 대한 BXhVH5VL1의 결합을 나타낸다.
도 11은 rhNGF와 공동-주입되었을 때 BXhVH5VL1 N297A 또는 대조군 hIgG의 국소 피내 주사의 진통 효과를 설명하기 위한 실험을 나타낸다.
도 12는 rhNGF와 공동-주입되었을 때 muMNACEP 또는 대조군 mIgG의 국소 피부내 주사의 진통 효과를 설명하기 위한 실험을 나타낸다.
도 13은 NGF-유도 통증의 동물 모델에서 대조군 hIgG와 비교하였을 때 BXhVH5VL1 N297A의 전신 투여의 진통 효과를 설명하기 위한 실험을 나타낸다.
도 14는 NGF-유도 통증의 동물 모델에서 대조군 hIgG와 비교하였을 때 muMNACEP의 전신 투여의 진통 효과를 설명하기 위한 실험을 나타낸다.

실시예

실시예를 상세히 설명하기 전에, 본 명세서에서 사용된 몇몇의 용어를 하기에 기술한다:

muMNACEP

상기 용어는 EP1181318에서 개시된 바와 같이 쥐과 항체 MNAC13을 지칭하기 위해 사용되었다.

상기 항체의 중쇄 가변 부위는 본 명세서에서 mVHEP(서열번호 15)라고 지칭하였다. 경쇄 가변 부위는 본 명세서에서 mVLEP(서열번호 16)라고 지칭하였다.

HuMNACWO

상기 용어는 WO 05/061540에서 개시된 바와 같이 인간화된 항체 MNAC13을 지칭하기 위해 사용되었다.

상기 항체의 중쇄 가변 부위는 본 명세서에서 HuVHWO(서열번호 17)라고 지칭하였다. 경쇄 가변 부위는 본 명세서에서 HuVLWO(서열번호 18)라고 지칭하였다.

HuMNACWOv

상기 용어는 CDR3 부위를 muMNACEP에 존재하는 그에 상응하는 중쇄 CDR3 부위로 교체된, HuMNACWO(상기 참조)에서 기재된 항체의 유도체을 가리키는데 사용되었다. 상기 유도체는 신규하고, 본 발명의 범주에 들어간다.

상기 항체의 중쇄 가변 부위는 본 명세서에서 HuVHWOv(서열번호 6)로 지칭되었다. 상기 경쇄 가변 부위는 본 명세서에서 HuVLWOv로 지칭되었다. 그러나 그것이 HuVLWO(서열번호 18)와 동일하기 때문에 중복을 피하기 위하여 도 1b에서 나타내지 않았다.

ChimMNAC13

이는 muMNACEP와 일치하지만, 마우스 불변 부위 대신에 인간 불변 부위를 갖는다.

상기 항체의 중쇄 가변 부위는 본 명세서에서 mVHEP(서열번호 15)로 지칭되었다.

상기 경쇄는 본 명세서에서 mVLEP(서열번호 16)로 지칭되었다.

3-23*01(서열번호 19), JH4(서열번호 20), L6*01(서열번호 21) 및 JK1(서열번호 22)

이들은 인간 생식 세포 유전자로부터 유래한 암호화 서열이다.

이들은 표 1에서 인간화의 정도를 평가하는데 사용된다. 그러므로 만약 인간 생식계열 서열과 상대적으로 변화가 없다면, 그들은 100% 인간화된 것으로 여겨진다.

[인간화 백분율 = 변화 개수 × 100]

비교한 잔기의 전체 개수

하기 표는 다른 유도체에 대한 인간화 백분율을 나타낸다:

서열 유도체	FW에서 쥐과 AA 수/FW에서 전체 AA 수	인간화 %(FW 서열과 비교)	CDR AA를 포함하는 쥐과 AA 수/가변부위에서 전체 AA 수	인간화 %(전체 가변 서열과 비교)
BXhVH1	0/87	100	36/123	70.7
BXhVH2	3/87	96.6	39/123	68.3
BXhVH3	3/87	96.6	39/123	68.3
BXhVH4	3/87	96.6	39/123	68.3
BXhVH5	5/87	94.2	41/123	66.7
BXhVHWO	12/87	86.2	48/123	61.0
BXhVL1	0/80	100	26/106	75.5
BXhVL2	4/80	95	30/106	71.7
BXhVL3	6/80	92.5	32/106	69.8
BXhVL4	6/80	92.5	32/106	69.8
BXhVL5	6/80	92.5	32/106	69.8
BXhVL6	8/80	90	34/106	67.9
BXhVL7	8/80	90	34/106	67.9
BXhVL8	11/80	86.2	37/106	65.1
BXhVLWO	9/80	88.8	35/106	67

상기 모든 유도체 가변 사슬이 구조형성영역 부이에서 85% 이상 인간화 정도를 갖는 것을 볼 수 있다.

"BX" 서열

"BX"로 시작하는 암호로 표지된 상기 서열은 본 발명의 신규 서열이다. "BX" 다음의 문자는 각각 중쇄 또는 경쇄 가변 사슬을 가리키는 VH 또는 VL 중 하나이다. 상기 서열은 이후 주어진 사슬에 대하여 도 1a 및 도1b에서 나타난 것과 연속적으로 간단히 번호를 매겼다.

5개 중쇄 서열이 있다. 그러므로 그들은 하기와 같이 번호를 매겼다:

BXhVH1(서열번호 1)

BXhVH2(서열번호 2)

BXhVH3(서열번호 3)

BXhVH4(서열번호 4)

BXhVH5(서열번호 5)

8개 경쇄 서열이 있다. 그러므로 그들은 하기와 같이 번호를 매겼다:

BXhVL1(서열번호 7)

BXhVL2(서열번호 8)

BXhVL3(서열번호 9)

BXhVL4(서열번호 10)

BXhVL5(서열번호 11)

BXhVL6(서열번호 12)

BXhVL7(서열번호 13)

BXhVL8(서열번호 14)

사슬은 항체 및 이의 유도체와 결합될 수 있다.

40개의 조합 모두가 생산되었으며, 그것은 다음과 같다:

BXhVH5VL1, BXhVH5VL2, BXhVH5VL3, BXhVH5VL4, BXhVH5VL5, BXhVH5VL6, BXhVH5VL7, BXhVH5VL8.

"N297A"

항체의 명칭 뒤의 명칭 "N297A"는 중쇄 불변 부위에서 N이 A로 변이된 297 위치를 가리킨다.

BXhVH5VL1 N297A 서열은 서열번호 23으로 제공된다.

발현 벡터

항체 발현 시스템으로 클로닝하기 위한 cDNA에 적당한 암호화 서열에 대하여 5'의 분비 신호 및 3'의 스플라이싱 도너 서열을 암호화하는 서열을 융합하였다.

상기 DNA 단편은 IgG1 발현벡터에 클로닝하였다.

상기 발현 벡터는 인간 불변 도메인을 암호화하는 게놈 서열 및 hVH 및 hVL 서열의 선별된 cDNA 단편의 삽입을 위한 클로닝 카세트에 기반하였다.

COS-7 세포에서 인간화된 MNAC13 유도체의 일시적 발현 및 항체 역가 결정

중쇄 및 경쇄의 각 조합은 COS-7 세포에 일시적으로 형질전환되었고, 항체 역가를 결정하였다.

경쇄 및 중쇄를 암호화하는 상기 발현 벡터는 24웰 형식에서 제조사의 설명서에 따라 리포펙타민(Invitrogen, 독일)을 사용하여 리포펙션을 통해 COS-7 세포로 일시적으로 공동 형질전환하였다.

형질전환 후에 배지를 10%FCS 및 2% L-글루타민를 함유하는 DMEM으로 교체하였고, 형질전환 4일 후에 COS-7 세포의 상청액을 수집하였다.

형질전환된 COS-7 세포의 상청액으로 분비된 인간화된 항체의 항체 역가는 샌드위치 ELISA를 통해 분석하였다.

간략하면, 항체(BD)를 인지하는 마우스 항-인간 카파 사슬을 96 웰 플레이트에 고정시키고, 블로킹한 후, 형질전환된 COS-7 세포의 희석된 상청액과 배양하였다. 항체의 존재는 POD 접합 토끼 항-인간 IgG(H+L) 항체(Dianova, 독일)를 통해 탐지하였다. 키메라 대조군 항체는 1 내지 10 ng/ml의 농도로 표준물로써 사용되었다. 결정된 항체 농도는 나아가 표준화된 항체 농도를 갖는 내부 표준 샘플로 보정되었다.

실시예 1

ELISA에서 TrkA-IgG에 결합된 인간화된 항체의 비교

상기 측정된 항체 농도를 기본으로, 모든 샘플의 상청액은 같은 항체 농도로 조정하였다.

모든 인간화된 항체 유도체의 결합 활성은 TrkA-IgG 항원 ELISA를 통해 분석되었따. 그것들은 상기 ChimMNAC13 및 HuMNACWOv의 결합 활성을 비교하였다.

항체 및 항원은 녹이고, 분주하여 -20℃에서 보관하였다. 사용한 분주된 상기 항체는 최대 2주동안 4℃에서 보관하였다.

항원 ELISA는 다음과 같이 수행되었다: Maxisorb 플레이트(Nunc, Germany)는 0.125, 0.25, 0.5 및 1 ug/ml TrkA-IgG로 코팅하였다. 항체-항원 결합의 특이성을 확인하기 위하여 음성 대조군으로 TrkB-IgG(1 ug/ml)을 사용하였다.

항체 유도체의 일시적 발현은 1, 10, 및 100 ng/ml을 사용하였다.

다음과 같은 세부적 절차:

코팅

플레이트: Nunc MaxiSorp 96웰

Carbonate 완충용액 0.1M pH 9.6에 녹인 TrkA-IgG를 2 ug/ml의 농도로 100 ul/웰로 처리(음성 대조군으로 사용한 TrkB-IgG)

플레이트를 싸고 +4℃에서 하룻밤동안 반응

200 ul의 세척 완충용액으로 3 번 세척

블락킹(Blocking)

각 웰에 PBS에 들어있는 SuperBlock 블락킹 완충용액(Pierce Prod # 37515) 200 ul 첨가에 의해 플레이트를 블락.

뒤집어서 상기 플레이트를 즉시 비운다.

추가로 두 번 더 반복한다.

37℃에서 2시간동안 반응한다.

1차 항체

상청액을 제거하고 TEST 완충용액(표준 곡선 범위: 50-5000 pg/ml)에서 적당히 희석된 정제된 mAb를 100ul 첨가한다.

플레이트를 싸고 37℃에서 2시간 동안 반응시킨다.

(민감도를 증가시키기 위해서는 +4℃에서 반응한다)

세척 완충용액으로 4번 세척한다.

2차 항체

TEST 완충용액으로 1:10000 희석된 HRP-접합 염소 항 마우스 IgG(Pierce cat. 31430) 100 ul를 첨가한다.

37℃에서 1시간 동안 반응시킨다.

세척 완충용액으로 4번 세척한다.

발색

각 웰에 기질 용액을 100 ul 첨가한다. 상온에서 반응시킨다.

100 ul의 H₂SO₄ 2M로 반응을 중지한다.

마이크로타이터(microtiter) 리더 450nm를 이용하여 각 웰의 흡광도를 측정한다.

결과

상기 ELISA 분석을 이용하여 다양한 클론으로부터 얻은 상청액에 대해 측정된 항원 결합 특이성에 대한 결과는 도 2에서 나타내었다.

구체적으로, 특이적 항원인 TrkA-IgG(검은색 바) 및 음성 대조군인 TRKB-IgG(흰색 바)는 다른 96-웰 플레이트에 1 ug/ml의 농도로 코팅되었다.

항체 상청액은 정량하고, 적당히 희석하여, 5 ng/ml의 농도로 테스트하였다. 세척 후에, 결합은 적당한 HRP-표지된 2차 항체로 검출되고, 발색 반응에 의해 드러나며, OD450/630nm 측정에 의해 정량되었다.

상기 인간화된 항체의 대부분은 TrkA 항원에 높은 강도로 비교적 선택적인 친화성을 나타낸다.

더불어, 그 결합 특이성은 모 쥐과(murine) 항-인간 TrkA 항체와 그 키메라 동종체와 크게 다르지 않고, 이것은 항원 선택성이 상기 인간화 절차에 따라 전체적으로 보존되었음을 가리킨다.

실시예 2

TF-1 세포에서 표면에 발현된 TrkA의 cytofluorimetric 분석에 의한 새로운 후보물질의 세포 내 결합 분석

절차

하나의 세포 부유액으로 준비된 배양액으로부터 세포를 수집한다.

(최대 항원의 발현을 얻기 위해 하루 전에 세포를 1:3으로 나눈다).

0.3-0.4×10⁶ 세포/샘플로 나누고, 1X의 차가운 FACS 완충용액(PBS pH 7.4 + 0.1% NaN3 + 0.1% BSA)으로 세척한다.

350×g에서 5분 동안 원심분리한다.

상청액을 제거하고 얼음에 튜브를 둔다.

Fc 수용체 블락킹(Blocking)

FACS 완충용액에 들어있는 인간 IgG[300 ug/ml]을 샘플당 50 ul첨가하고, 부드럽게 볼텍싱(wortexing)하여 혼합한다.

4℃에서 15분 동안 반응시킨다.

1차 항체

FACS 완충용액에 들어있는 1차 항체 muMNAC13[4 ug/ml]을 샘플당 100 ul 첨가하고, 부드럽게 볼텍싱(wortexing)하여 혼합한다.

음성 대조군으로 같은 농도의 정제된 마우스 IgG1 동종형 대조군을 사용한다.

4℃에서 30분 동안 반응시킨다.

FACS 완충용액 1 ml로 2X 세척하고, 350×g에서 5분 동안 스핀(spin)한 다음, 상청액을 제거한다.

2차 항체

FACS 완충용액에 들어있는 R-Phycoerythrin 접합된 당나귀 항 마우스 IgG(H+L) Jackson ImmunoResearch cat.# 715-116-151을 샘플당 100 ul 첨가하고, 부드럽게 볼텍싱(wortexing)하여 혼합한다.

4℃에서 30분 동안 반응시킨다.

FACS 완충용액 0.5 ml로 재부유시킨다.

flow cytometer에서 샘플의 결과를 얻는다.

결과

TF-1 세포는 대조군인 HuMNACWO 및 HuMNACWOv 항체(4 ug/ml)뿐만 아니라, 모든 클론으로부터 얻은 상청액으로 4℃에서 30분 동안 염색되었다.

염색은 적당한 PE-표지된 2차 항체로 확인되었고, 결합의 형광 강도를 측정하기 위한 cytofluorimetric 분석에 의해 정량되었다.

상기 결과는 하기의 표를 기본으로 하여, 도 3에서 나타내었다.

		Geo 평균 형광도			증가 배수
N°.	유도체	평균	±	표준편차	평균	±	표준편차
1	mVHEP/mVLEP	11.0	±	2.2	3.2	±	0.7
2	hVHWOv/hVLWO	8.9	±	1.9	2.6	±	0.6
3	hVH1/hVL1	5.7	±	0.4	1.7	±	0.1
4	hVH1/hVL2	4.6	±	0.4	1.3	±	0.1
5	hVH1/hVL3	6.1	±	0.6	1.8	±	0.2
6	hVH1/hVL4	5.1	±	0.5	1.5	±	0.2
7	hVH1/hVL5	4.5	±	0.3	1.3	±	0.1
8	hVH1/hVL6	4.9	±	0.4	1.4	±	0.1
9	hVH1/hVL7	5.1	±	0.4	1.5	±	0.1
10	hVH1/hVL8	5.2	±	0.1	1.5	±	0.0
11	hVH2/hVL1	9.2	±	1.3	2.6	±	0.4
12	hVH2/hVL2	6.4	±	0.7	1.8	±	0.2
13	hVH2/hVL3	10.8	±	1.3	3.1	±	0.4
14	hVH2/hVL4	6.1	±	0.3	1.8	±	0.1
15	hVH2/hVL5	6.4	±	0.2	1.8	±	0.1
16	hVH2/hVL6	6.4	±	0.7	1.8	±	0.2
17	hVH2/hVL7	6.5	±	0.8	1.9	±	0.3
18	hVH2/hVL8	6.5	±	1.0	1.9	±	0.3
19	hVH3/hVL1	8.6	±	1.5	2.5	±	0.5
20	hVH3/hVL2	7.1	±	2.1	2.0	±	0.6
21	hVH3/hVL3	12.6	±	0.6	3.6	±	0.2
22	hVH3/hVL4	7.1	±	0.1	2.0	±	0.0
23	hVH3/hVL5	6.9	±	0.5	2.0	±	0.2
24	hVH3/hVL6	6.4	±	0.5	1.8	±	0.2
25	hVH3/hVL7	7.1	±	1.0	2.0	±	0.3
26	hVH3/hVL8	6.5	±	1.2	1.9	±	0.3
27	hVH4/hVL1	10.4	±	2.4	3.0	±	0.7
28	hVH4/hVL2	8.3	±	2.5	2.4	±	0.7
29	hVH4/hVL3	10.9	±	3.0	3.1	±	0.9
30	hVH4/hVL4	8.0	±	2.2	2.3	±	0.6
31	hVH4/hVL5	8.6	±	1.7	2.5	±	0.5
32	hVH4/hVL6	8.0	±	1.4	2.3	±	0.4
33	hVH4/hVL7	8.7	±	2.5	2.5	±	0.7
34	hVH4/hVL8	8.3	±	1.9	2.4	±	0.6
35	hVH5/hVL1	11.3	±	2.7	3.2	±	0.8
36	hVH5/hVL2	8.6	±	2.3	2.5	±	0.7
37	hVH5/hVL3	13.7	±	2.1	3.9	±	0.6
38	hVH5/hVL4	9.1	±	2.2	2.6	±	0.7
39	hVH5/hVL5	8.3	±	2.0	2.4	±	0.6
40	hVH5/hVL6	9.1	±	1.5	2.6	±	0.5
41	hVH5/hVL7	8.6	±	2.0	2.5	±	0.6
42	hVH5/hVL8	8.3	±	1.6	2.4	±	0.5
43	huIgG 3.5	3.5	±	0.0	1.0	±	0.0

상기 결과는 HuMNACWOv뿐 아니라, 테스트된 모든 클론들이 다른 범위라고 생각되는 TF1 세포에서 막-연관된 TrkA 수용체에 양성적으로 검출된다는 것을 나타낸다. HuMNACWO는 표면 TrkA 수용체를 낮은 농도로 가지는, TF1 세포를 염색할 수 없다.

추가로 테스트된 40 클론에서 확인하기 위하여, 가장 훌륭한 결합체(best binder)가 추가 분석을 위해 선택되었다.

두 가지 분리된 실험의 평가에 따라(도 4) BXHVH3VL3, BXhVH5VL1, BXhVH5VL3, 및 HuMNACWOv는 HuMNACWO와 비교되었다.

상기 선택된 리드(lead)는 훌륭한 결합체(biner)로 확인되었고, HuMNACWOv와 비교할 때 약간 더 나은 하이퍼포머(performer)이다.

또한 표면 수용체 hTrkA가 다양한 농도로 발현되는 TF-1, HMC-1 및 PC12-hTrkA 세포주에서도 참조 항체인 muMNACEP 및 HuMNACWO와 함께 상기 인간화된 항체 동종체 BXhVH5VL1 N297A 및 BXhVH5VL1의 결합능을 분석하였다.

도 8에서 보는 바와 같이, 세포 표면의 수용체 농도와는 독립적으로, BXhVH5VL1 N297A 및 BXhVH5VL1 항체는 모든 시험 세포주에 동등하게 결합한다. 두 가지 항체는 상기 모 muMNACEP와 비교할 때 더욱 효과적인 것으로 나타난다. HuMNACWO만이 표면 수용체의 농도가 높은 세포주 PC12-hTrkA에 결합한다.

실시예 3

TR-1 세포에서 증식 분석을 통한 인간화된 항체의 시험관 내(in vitro) 생물학적 활성의 비교

항-인간 TrkA 단클론 항체의 세포 표면 TrkA-β-NGF에 의해 매개되는 생물학적 활성을 저해하는 능력을 측정하기 위하여, 인자-의존적인 인간 erythroleukemic 세포주, TF-1(Kitamura, T. et al., 1989, J. Cell Physiol. 140:323-334)을 이용한 세포 증식 분석을 사용하였다.

TF-1 세포는 96 플랫(flat) 웰 배양 플레이트에서 다양한 농도의 항체와 함께 37℃에서 0.5시간 동안 반응시켰다.

이러한 전-반응 단계 다음으로, 재조합 인간 β-NGF(rec-hu-β-NGF, R&D Systems)가 상기 세포-항체 혼합물에 첨가되었다.

다양한 농도로 나타내어지는 항체, 5.0 ng/ml의 인간 β-NGF 및 5X103 세포/웰의 TF-1 세포를 포함하는, 총 부피 200ul의 분석 혼합물은 습윤한 CO₂ 배양기에서 37℃에서 5일 동안 배양하였다.

상기 플레이트를 원심분리하는 과정 후에, 상청액을 제거한 후, 세포를 용해하기 위해 -80℃에 얼렸다.

CyQUANT 세포 증식 분석 키트(Molecular Probes)가 세포 증식을 측정하기 위해 제조사의 지시에 따라 이용되었다.

이 실험은 두 번 수행되었다.

결과

다양한 인간화된 후보물질들은 쥐과 MNAC13 항체(muMNACEP), chimMNAC13, HuMNACWO및 표준 대조군인 인간 IgG1과 병행하여 분석되었다(도 5).

IC50은 개별 곡선에서 계산되었으며, 상기 결과는 다음 페이지의 표에서 나타내었다.

항체 BXhVH5VL1이 상기 후보물질 중에서 가장 좋은 퍼포머(performer)로 확인되었다.

그러므로 이 항체의 중쇄 및 경쇄를 도 6에 나타내었다.

일련의 실험을 통한 쥐과 MNAC13의 평균 IC50은 0.54±0.47 ug/ml이었다.

TF1 세포에서 증식 분석 IC50(ug/ml)
			평균	표준편차
muMNACEP			0.54	0.47
	EXP-1	EXP-2
ChimMNAC13	0.06	0.58
BXhVH5VL1	0.17	1.84
BXhVH3VL3	0.41	2.38
BXhVH5VL3	1.40	1.21
HuMNACWO	-	-
HuIgGstd	-	-

실시예 4

표면 플라즈몬 공명 분석(Surface plasmon resonance analysis)

표면 플라즈몬 공명 분석은 TrkA-IgG에 대한 상기 다양한 항체(쥐과, 키메라, 5 인간화된 유도체)의 결합 반응 속도를 위한 결합 및 분리 속도 상수를 측정하기 위해 BIACORE 2000(Biacore AB, Uppsala, Sweden)을 이용을 통해 사용되었다. TrkA-IgG는 1100 RU의 고정화 강도에 도달하도록 제조사의 지시에 따라 CM-5 센서에 고정화되었다. 각각의 항체 샘플은 20-0.63 ug/ml의 항체 농도 범위에서 분석되었다. 센소그램(sensogram)으로부터의 계산은 BIA evaluation 버전 3(1999) 소프트웨어의 이용에 의해 수행되었다.

센소그램의 개별 세트(set)의 분석은 BIA evaluation 버전 3(1999) 소프트웨어로 수행되었다. 반응 속도 결과에 적합하도록 테스트된 다양한 모델 중에서, 가장 좋은 적합성은 "구분 1:1" 알고리즘에서 얻어졌다. 이 모델에서, 초기 결합 및 분리 곡선에서 결정된 범위만이 상기 계산에 이용되었다. 이러한 곡선의 초기 상태 동안에, 대량 이동과 같은 오버레이 효과, 리바인딩(rebinding) 또는 다른 계산에 영향을 주지 않는 것으로 가정한다.

결과

상기 분리 상수(K_D)는 다양한 항체에 대해 결정되었으며, 증가된 순서로 다음 페이지의 표에서 설명하였다.

상기 K_D 값은 특정 단백질에 대한 결합 부위가 절반을 차지하는 리간드의 농도에 부합하는, molar unit(M)를 갖는다. 값이 작아질수록, 리간드의 결합은 더 단단해지거나, 리간드 및 단백질간(여기서는 항원 및 항체간) 친화도는 높아진다.

항체	K_on (1/Ms)	K_off (1/s)	K_D [M]
ChimMNAC13	2.68x10⁵	3.53x10^-4	1.51x10^-10
MNAC13	8.50x10⁵	1.67x10^-4	2.50x10^-10
BXhVH5VL1	7.68x10⁵	4.70x10^-4	6.15x10^-10
BXhVH5VL3	1.00x10⁶	6.38x10^-4	6.62x10^-10
BXhVH3VL3	3.25x10⁵	4.42x10^-4	1.45x10^-9
HuMNACWOv	1.62x10⁶	3.86x10^-3	2.48x10^-9
HuMNACWO(분리된 실험)	7.39x10⁵	3.09x10^-2	4.18x10^-8

상기 표로부터 쥐과(murine) 및 키메라 동종체에서 계산된 K_D가 서로 비교되어질 수 있음이 나타내어 질 수 있다.

그것은 약간 낮기는 하지만, 상기 인간화된 유도체 BXhVH5VL1 및 BXhVH5VL3와 같은 크기 순서이다.

이에 반하여, 상기 인간화된 유도체 HuMNACWOv 및 BXhVH3VL3는 쥐과 및 키메라 유도체에서 관찰되는 것보다 더 높은 K_D 크기의 한가지 순서로 나타난다.

하지만, 여기에서 K_D 값은 상기 선행 인간화된 항체 HuMNACWO와 비교하여 여전히 낮다.

실제로, 이 모델에서 사용된 본 발명의 항체/유도체의 K_D 값은 4.18 X 10^-8아래인 것이 바람직하다(따라서 그것은 인간화된 선행 항체 HuMNACWO의 값보다 낮다).

2.48 X 10^-9아래 인것이 더욱 바람직하다(그러므로 그것은 같은 구조형성영역 부위를 갖지만, 중쇄의 세번째 CDR이 변형된 HuMNACWO의 유도체인 HuMNACWOv보다 낮다).

상기 K_D 값은 1 X 10^-9 아래인 것이 가장 바람직하다(그러므로 그것은 상기 쥐과 및 키메라 동종체와 일반적으로 같은 크기 순서이다).

결과적으로, 상기 "구분" 알고리즘을 이용하여 계산된 결과를 기반으로 한, 위의 표에서 주어진 순위는 오버레이 플롯(overlay plot)의 모든 조사된 유도체의 센소그램의 시각 검사에 의해 얻어진 순위가 아주 잘 반영되어 있다.

실시예 5

HMC-1 비만세포주에서 케모킨(chemokine) 분비 분석을 통한 인간화된 항체의 시험관 내(in vitro) 생물학적 활성의 비교

NGF는 말초 및 중추 감작 모두에 기여하는, 염증성 통증에서 중요한 중간체로 작용한다. 말초 통각수용기의 감작은 매우 빠를 수 있고, 비만세포와 같은 비신경계 세포와 관련될 수 있다.

항-인간 TrkA 단클론 항체의 β-NGF로 유도된 MIPIα 분비에 대한 저해능을 측정하기 위하여, 비만세포주인 HMC-1(Ahamed, J. et al., J Immunol. 2004 Jun 1;172(11):6961-8.)을 이용한 생물학적 분석이 이용되었다.

HMC-1 세포(0.1 X 10⁶/웰)는 96 플랫(flat) 웰 배양 플레이트에 컴플리트 성장 배지(complete growth medium)에서 트리플리케이트(triplicate)로 플레이팅하였고, 다양한 농도의 단클론 항체로 37℃에서 0.5시간동안 배양하였다.

이러한 전-배양 과정 다음으로, 재조합 인간 β-NGF(rec-hu-β-NGF, R&D Systems)를 상기 세포-항체 혼합물에 최종 농도가 50 ng/ml이 되되록 첨가하였고, 37℃에서 배양은 습윤한 CO2 배양기에서 6시간동안 연장하였다.

상청액을 수집한 다음 R&D System의 인간 CCL4/MIP1-b용 DuoSetElisa 키트(Cat. Nr. DY271)를 이용한 샌드위치(sandiwich) ELISA를 통해 MIP-1β의 농도를 정량하였다.

얻어진 결과는 반응의 %로 나타내었고, 비선형 회귀 분석, log(저해제) vs. 정상 반응-변수 기울기 방정식을 이용한 GraphPad Prism 5 소프트웨어로 분석하였다.

결과

BXhVH5VL1 N297A 항체는 표준 대조군으로 쥐과 muMNACEP, HuMNACWO 및 인간 IgG1을 함께 병행하여 분석하였다. IC50 값은 각 곡선에서 계산되었고, 상기 결과는 도 9에서 나타내었다. BXhVH5VL1 N297A의 저해 활성은 상기 인간화된 항체 HuMNACWO보다 현저히 높았다.

실시예 6

BXhVH5VL1 N297A 및 BXhVH5VL1의 시험관 내(in vitro) 특성. THP-1 세포에서 세포 FcRs과의 결합 평가

인간 급성 단구성 백혈병 세포주 THP1(ATCC)는 RPMI1640/GLUTAMAX(Invitrogen) + 10% 우태아 혈청(Invitrogen) + Pen/Strep.에서 배양하였고, 2-9X100,000 세포/웰 사이에서 유지되었다.

세포는 배양액으로부터 수획하였고, 단일 세포 부유액으로 준비하였다. 0.3-0.4 X 10⁶ 세포/샘플을 96-웰 라운드 바작 조직 배양 플레이트(Costar, Cambridge, MA)에 나눈 다음 1X의 차가운 FACS 완충용액으로 세척하였다.

350 X g에서 5분동안 원심분리한 후에, 상청액을 제거하고 플레이트를 얼음에 두었다. THP-1 세포에서 FcRs에 대한 IgG의 결합은 30 ug/ml로 시작하여 0.02 ug/ml(1:3 희석)까지 총 부피 100 ul의 FACS 완충용액 내 단량체 IgG를 4℃에서 30분 동안 반응시킴으로써 수행되었다.

세포는 200 ul의 FACS 완충용액응로 세 번 세척한 다음, IgG 결합 검출은 FACS 완충용액으로 1:100 희석한 R-Phycoerythin이 접합된 당나귀 항 인간 IgG(H+L)를 100ul 첨가하여 이루어졌다. 부드럽게 볼텍싱(vortexing)한 후, 세포를 4℃에서 30분동안 반응시켰다.

플레이트를 200ul FACS 완충용액으로 2번 세척하였고, 세포는 최종적으로 0.5 ml의 FACS 완충용액에 재부유하고 이동시키고, flow cytometer를 이용하여 획득하였다.

결과

도 10은 선행 개시(미국 특허 5,624,821 Winter 참조)를 기반으로 예상된 바와 같이 돌연변이된 동종체 BXhVH5VL1 N297A가 세포의 Fc 수용체에 대한 결합 능이 현저히 결여되어 있음을 명확히 보여준다.

실시예 7

생체 내(In vivo) 실험

본 발명의 항체/우도체의 추가적 분석을 위해 수행된 생체 내(In vivo) 실험은 하기와 같다;

NGF에 의해 매개되는 통증 모델

Nerve growth factor(NGF)와 그 수용체 TrkA는 염증성 통증에서 특징적인 통증 감각의 결정적인 중간매개자이다.

고전적으로, NGF는 감각 및 교감 신경 발달의 생존 요소로 알려져 있으나, 성체 동물에서는 감각 신경의 세포 바디에 퇴행적으로 이송되는, 말초에서 합성이 계속된다(Hendry et al.,1974, Otten et al 1980).

염증 및 신경 손상은 NGF의 방출을 유도하고, 일차 구심성 섬유를 자극하고, 행동 감작을 유도한다. 랫트에서 NGF의 피하내 만성적 치료는 통각과민을 유발하고, 국소적 피부 감각을 변형시킨다.

인간 아래팔 및 인간의 교근내로 rhNGF의 피부내 주사는 통각과민 및 이통증을 유발하고, 국소적 피부 감각이 변형되며, 주사후 3시간에 시작되고 주사 후 1-7 일에 제일 높으며 21일째에 회복되었다(Dyck et al., 1997; Svensson et al., 2003).

그러므로, 랫트 후족부 내 rhNGF의 주사는 여기에서 행동 감작 모델로 사용되었으며, NGF에 의해 특이적으로 발생되었다.

본 실험은 두 개의 다른 프로토콜(protocol)과 연관된다:

1. 처음에는 랫트 발에 재조합 인간(rh) NGF만을 피부내 주사한 것이 통각과민에 대한 표준 통증 테스트(Hargreave’s plantar test)에 의해 측정되는 행동 감작을 야기할 수 있는지를 실험하였다. 다음으로 쥐과 IgG, muMNACEP, 인간 IgG, 및 BXhVH5VL1 N297A 항체를 100ug의 투여량으로 피부내 동시-주사하는 것이 상기 rhNGF에 의해 유도되는 감작에 영향을 줄 수 있는지를 확립하였다. 쥐과 IgG1 및 인간 IgG 항체는 음성 대조군으로 적당한 투여량이 사용되었다.

2. 다음으로 muMNACEP 항체(8, 3, 및 1 mg/Kg 투여량, i.p.) 및 BXhVH5VL1 N297A(8, 3, 및 1 mg/Kg 투여량, i.p.)의 시스템적 전-치료가 말초적으로 rhNGF 감작을 유도하는데 영향을 줄 수 있는지를 확립하였다.

첫번째 프로토콜(protocol)에서, 국소적으로 투여되는 치료에 있어서, 수컷 Lewis 랫트(Charles River, 5-6주령 200g)는 상기 셋팅(set)된 방법에 따라 주사된, 4 마리를 실험군으로, 군당 8-9 마리의 동물을 이용하였다. 주사는 블라인드(blind)로 수행되었다. 상기 치료에 대한 요약은 아래 표에서 설명하였다.

두번째 프로토콜에서, rhNGF 발 주사 24시간 이전에 시스템적으로(i.p.) 투여되는 치료에 있어서, 수컷 Lewis 랫트(Charles River, 5-6주령 200g)는 10 마리를 실험군으로, 군당 10-12마리의 동물을 이용하였다. 주사는 블라인드(blind)로 수행되었다. 상기 치료에 대한 요약은 아래 표에서 설명하였다.

분석

모든 동물에 번호를 부여한 다음 실험을 시작하기 전 24-48시간에 행동-실험 절차를 위해 적응시켰다. 행동의 리드아웃(readout)은 통각과민의 측정에 따른 플란타(planta) 테스트에서 발 움추림 잠복기(paw withdrawal latency)였다.

기준 기록은 발 움추림 잠복기를 확립함에 따라 수행되었다. 통증 민감도는 시간 포인트 0에 주사된 피부내 rhNGF에 의해 유도되었고 행동 통증 민감도는 rhNGF 주사에 따라 30분, 1시간, 2시간, 24시간 및 48시간에 모니터링되었다. 치료제는 하기와 같이 블라인드(blind)로 투여되었다:

프로토콜 1: 시간 0에 피부내 주사에 의한 치료제 투여.

프로토콜 2: rhNGF 발 주사 전 24시간에 IP내 시스템적인 단회 주사에 의한 치료제 투여.

기준 플란타(plantar) 및 본 프레이(von Frey) 테스트는 약물 치료가 투여되기 전에 수행되었다.

통각과민에 대한 측정값은 rhNGF 주사 후 30분, 1시간, 2시간, 24시간 및 48시간에 측정되었다. 세 번 내지 네 번의 기록이 rhNGF 주사에 대한 각 후족부 같은쪽(오른쪽 발, rhNGF-주사) 및 반대쪽(왼쪽 발, 비-주사)에서 측정되었다.

개별 치료제 군으로부터 얻은 동물 결과를 합치고, 상기 반대쪽 및 같은쪽의 발의 반응에 대한 평균 및 표준편차를 계산하였다.

통각과민이 있다는 것은 대조군 반대쪽 발과 비교하는 경우(대응 t-test에 의해) 및 주사전/치료전 기준과 비교하는 경우(일원분산분석에 의해) rhNGF가 주사된 같은쪽 후족부에서 발 움추림 잠복기의 뚜렷한 저하에 의해 나타났다.

피부내 항-통각과민 효능

NGF에 의해 유도되는 통각과민 모델에서 피부내 주사에 의한 BXhVH5VL1 N297A(도 11)과 muMNACEP(도 12)(상대적 대조군으로 mIgG1 및 hIgG를 더한)의 항-통각과민 효능을 비교하였다.

BXhVH5VL1 N297A 및 muMNACEP와 rhNGF를 함께 주사하였을 때, rhNGF를 주사한 같은쪽 및 반대쪽 발의 움추림 반응 사이에 현저한 차이가 나타나지 않음으로, 통각과민은 현저히 유발되지 않았다(도 11 및 12).

rhNGF를 주사한 같은쪽 발 반응에서 통각과민은 음성 대조군(mIgG1, hIgG)과 함께 주사함에 따라 항상 나타났다.

결과는 평균 ± 95% CI, 전(기준) 및 각각의 치료제와 함께 500ng의 rhNGF가 피부내로 주사(화살표)된 후로 나타내었다. rhNGF가 주사된 같은쪽 발 움추림 잠복기에서 뚜렷한 저하는 반대쪽 발 움추림과 비교하여 '*''**'(p<0.05, p<0.01, 동등 t-test)로 나타내었다.

시스템적 항-통각과민 효능

NGF에 의해 유도되는 통각과민 모델에서 시스템적인 주사에 의한 BXhVH5VL1 N297A, muMNACEP mIgG1, 및 hIgG의 항-통각과민 효능을 비교하였다.

BXhVH5VL1 N297A 및 대조군 hIgG(1, 3, 및 8 mg/kg)이 세 가지 다른 투여량으로 실험되었다(도 13). 이와 유사하게, muMNACEP 및 mIgG1는 1 mg/kg 및 8 mg/kg의 두 가지 다른 투여량으로 실험되었다(도 14). 모든 치료제는 rhNGF의 피부내 주사 이전 24시간에 i.p로 투여되었다.

8 및 3 mg/kg의 BXhVH5VL1 N297A의 시스템적인 전-치료는 rhNGF가 주사된 같은쪽 및 다른쪽 발 움추림 반응 간 현저한 차이를 나타내지 않으므로, rhNGF 주사에 따라 유발되는 통각과민을 뚜렷이 예방하였다(도 13).

쥐과 모 항체 mMNACEP(8 mg/Kg)의 시스템적 전-처리 또한 rhNGF에 의해 유도되는 통각과민의 유발을 예방하였다(도 14). 그러나, BXhVH5VL1 N297A의 전체적인 진통제 반응은 mMNACEP 항체와 비교하여 더 높게 나타났다.

같은 투여량에서, rhNGF를 주사한 같은쪽 발 반응에서 통각과민은 음성 대조군(mIgG1, hIgG)과 함께 주사함에 따라 항상 나타났다.

실시예 8

본 발명의 항체/우도체의 추가적 분석을 위해 수행된 생체 내(In vivo) 실험은 하기와 같다:

포르말린(Formalin) 테스트

마우스는 상기 항체/유도체를 복막내로 전처리하였고 18시간 후에 5% 포르말린(Formalin)을 오른쪽 후면 발바닥에 주사하였다. 리킹(licking) 시간(접종한 발을 핥는 시간)을 1시간 동안 측정하였다.

만성 협색 손상 테스트

마우스는 좌골 신경의 외과적 협색을 통해 준비하여, 신경장해성 이통증을 유도하였다. 다음으로 동물을 항체/유도체로 치료한 다음 상처입은 팔다리 대 반대쪽 팔다리에 위치하는 기계적 자극에 대한 움추림 반응을 측정하였다.

관절염 모델

랫트는 꼬리 기저부에 complete Freund’s 보조제를 피부내로 주사한다. 약 3주 후에 상기 마우스는 통증을 동반하는 것을 특징으로 하는 시스템적 관절염이 발병하게 된다. 동물은 상기 항체/유도체로 치료하고 그 진통 효과는 관절의 부드러운 조작에 따른 발성 강도의 측정값을 포함하는 발성 분석에 의해 평가된다.

카라기난(carrageenan)에 의해 유도되는 원숭이 통증 모델

붉은털 원숭이(Rhes미국 macaques)에 상기 항체/유도체를 정맥내로 전처리하였다. 다음날, 동물의 꼬리에 카라기난(carrageenan)을 피하로 주사하였다. 열 자극에 따른 움추림 시간을 측정하였다.

일반적 사항

상기 문맥에서 달리 표시하지 않는 한, 하기와 같은 일반적인 사항이 적용된다:

1) 본 문서에 언급된 모든 문헌은 참조로 통합되는 것으로 간주된다.

2) 상기 용어 "포함하는"은 "포함하는"뿐만 아니라 "구성하는"까지 커버하는 것으로 이에 제한하지 않는다. 따라서, 상기 단어 '포함하는' 및 '포함한다' 와 '포함하는 것'과 같은 변화는 명시된 인티거(integer), 스텝(step), 인티거(integer) 군 또는 스텝(step) 군을 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해될 수 있으나, 상기 기타 인티거(integer), 스텝(step), 인티거(integer) 군 또는 스텝(step) 군을 제외하지 않는다.

3) 본 문서에 언급된 본 발명의 측면과 동일한 것은, 비록 그 동일한 것이 구체적으로 언급되지 않았다 할지라도, 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.

<110> BioXell S.p.A. Benigni, Fabio d'Ambrosio, Daniele <120> Anti-TRKA Antibodies and derivatives thereof <130> 10fpi-08-09 <150> US 61/025,995 <151> 2008-02-04 <150> PCT/EP2009/051285 <151> 2009-02-04 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Lys Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Ala Met Tyr Gly Asn Asp Phe Phe Tyr Pro Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 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Phe Phe Tyr Pro Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Lys Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Met Tyr Gly Asn Asp Phe Phe Tyr Pro Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr 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Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 13 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Thr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 14 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Glu Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Thr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 15 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Glu Val Lys Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Ala Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Lys Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Met Tyr Gly Asn Asp Phe Phe Tyr Pro Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gln Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Thr 35 40 45 Thr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Lys Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 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Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 21 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro 85 90 95 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 23 <211> 453 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Lys Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Met Tyr Gly Asn Asp Phe Phe Tyr Pro Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 225 230 235 240 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Gly Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly Lys 450

Claims

하기의 경쇄 및 중쇄의 조합중의 어느 하나를 포함하는 항-TrkA 항체:
서열번호 3 및 서열번호 9, 서열번호 5 및 서열번호 7, 또는 서열번호 5 및 서열번호 9.
삭제
제 1항에 있어서, TrkB 보다 TrkA에 더 강한 결합력(affinity)으로 결합하는 항체.
제 1항에 있어서, NGF가 TrkA 수용체(receptor)에 결합하는 것을 차단 또는 감소시킬 수 있는 항체.
제 1항에 있어서, NGF와 TrkA 수용체의 결합에 의해 유도되는 하나 또는 그 이상의 생물학적 활성을 차단 또는 감소시킬 수 있는 항체.
제 1항에 있어서, 비설치류(non-rodent) 유래의 불변 부위(constant region) 를 포함하는 항체.
제 1항에 있어서, 인간 불변 부위 또는 인간 불변 부위와 적어도 75% 서열 상동성을 갖는 불변 부위를 포함하는 항체.
제 1항에 있어서, 인간 IgG 불변 부위 또는 이와 적어도 75% 서열 상동성을 갖는 불변 부위를 포함하는 항체.
제 1항에 있어서, 하기 중 하나 이상을 억제/감소시키는 인간 면역글로불린 불변 부위에 대하여 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환된 불변 부위를 포함하는 항체:
a) 보체 활성화
b) 보체-매개성 용해
c) T 세포의 활성화
d) Fc 수용체와의 결합.
제 1항에 있어서, TrkA-IgG ELISA 결합 분석에서 OD_450/630 nm 값이 0.1 이상인 것을 제공하는 항체.
제 1항에 있어서, TF1 세포의 TrkA 표면 발현에 대한 FACS에 기초한 세포 결합 분석에 있어서 TF1 세포의 FACS 염색에 있어서 1.0 배 이상 증가한 것을 제공하는 항체.
제 1항에 있어서, 표면 플라즈몬 공명 분석에 있어서 TrkA-IgG 결합에 대해 1 x 10^-9 M 이하의 K_D 값을 갖고, 여기서 TrkA-IgG는 CM-5 센서 칩에 고정된 항체.
제 1항에 있어서, 적어도 한 쇄의 가변 영역의 전체 구조형성영역 전체에 걸쳐 측정하였을 때(결합된 CDR 부위 제외) 적어도 90% 인간화를 갖는 항체.
제 1항에 있어서, 적어도 한 쇄의 가변 영역의 전체 구조형성영역 전체에 걸쳐 측정하였을 때(결합된 CDR 부위 제외) 적어도 95% 인간화를 갖는 항체.
제 13항에 있어서, 경쇄 및 중쇄 모두의 구조형성영역에 대해 적어도 청구항 제 13항에 주어진 인간화 비율(percentage)을 갖는 항체.
제 1항의 항체의 유도체, 여기서 유도체는
a) TrkA에 결합하는 상기 항체의 단편,
b) 상기 단편의 다량체 및
c) 상기 항체 단편 또는 단편의 다량체와 다른 부분의 융합 생성물에서 선택되는 어느 하나로써,
여기서 다른 부분은 진단용 제제, 치료용 제제, 표지용 제제, 인간 숙주에서 상기 유도체의 반감기를 증가시키는 제제, 인간숙주에서 상기 유도체의 면역원성을 감소시키는 제제 및 인간 숙주에서 상기 유도체의 반감기를 증가시키고 면역원성을 감소시키는 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제제.
삭제
제 16항에 있어서, 치료용 제제는 사이토톡신(cytotoxin)인 유도체.
제 1항 및 제 3항 내지 제 15항 중의 어느 한 항에 있어서, PEG화된 것인 항체.
제 1항 및 제 3항 내지 제 15항 중의 어느 한 항에 있어서, 고정된 형태인 항체.
제 1항 및 제 3항 내지 제 15항 중의 어느 한 항에 있어서, 약제로 이용되기 위한 항체.
제 1항 및 제 3항 내지 제 15항 중의 어느 한 항에 있어서, 통증의 치료에 이용되기 위한 항체.
제 1항 및 제 3항 내지 제 15항 중의 어느 한 항에 있어서, 만성 통증의 치료에 이용되기 위한 항체.
제 1항 및 제 3항 내지 제 15항 중의 어느 한 항에 있어서, 급성 통증의 치료에 이용되기 위한 항체.
제 1항 및 제 3항 내지 제 15항 중의 어느 한 항에 있어서, 하기의 하나 또는 그 이상과 관련된 통증의 치료에 이용되기 위한 항체:
췌장염(pancreatitis), 신장 결석(kidney stones), 자궁내막증(endometriosis), 염증성장질환(IBD), 크론병(Crohn’s disease), 수술후 협착증(post surgical adhesions) , 맹장결석(gall bladder stones), 두통(headaches), 월경통(dysmenorrhea), 근골격계통증(musaculoskeletal pain), 염좌(sprains), 내장통(visceral pain), 난소낭종(ovarian cysts), 전립선염(prostatitis), 방광염(cystitis), 간질성방광염(interstitial cystitis), 수술후 통증(post-operative pain), 편두통(migraine), 삼차 신경병증(trigeminal neuralgia), 화상이나 상처에 의한 통증(pain from burns 및/또는 wounds), 정신적 외상과 관련된 통증(pain associated with trauma), 신경병증 통증(neuropathic pain), 근골격계질환과 관련된 통증(pain associated with musaculoskeletal diseases), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 퇴행성 관절염(osteoarthritis), 강직성 척추염(ankylosing spondilitis), 관절주변 병리 이상(periarticular pathologies), 종양 통증(oncological pain), 골전이에 의한 통증(pain from bone metastases), HIV 감염(HIV infection).
제 1항 및 제 3항 내지 제 15항 중의 어느 한 항에 있어서, 암, 신경 장애(예를 들어, 신경 퇴화 장애), 알츠하이머 병, 당뇨병, 바이러스 장애, HIV 매개 장애, 나병 또는 염증 장애의 치료에 이용되기 위한 항체.
제 22항에 있어서, 치료는 ADCC를 포함하는 항체.
TrkA의 생물학적 활성을 억제하기 위해 동시, 순차적 또는 공동 투여(concerted administration)되는, 제 25항 내지 제 26항의 어느 한 항의 질병 및 장애로부터 선택되는 어느 하나의 치료를 위한 제 1항 및 제 3항 내지 제 15항 중의 어느 한 항의 항체 또는 제 16항의 유도체, 및 진통제의 조합물.
TrkA의 생물학적 활성을 억제하기 위해 동시, 순차적 또는 공동 투여되는, 제 25항 내지 제 26항의 어느 한 항의 질병 및 장애로부터 선택되는 어느 하나의 치료를 위한 제 1항 및 제 3항 내지 제 15항 중의 어느 한 항의 항체 또는 제 16항의 유도체, 및 NGF의 조합물.
TrkA의 생물학적 활성을 억제하기 위해 동시, 순차적 또는 공동 투여되는, 제 25항 내지 제 26항의 어느 한 항의 질병 및 장애로부터 선택되는 어느 하나의 치료를 위한 제 1항 및 제 3항 내지 제 15항 중의 어느 한 항의 항체 또는 제 16항의 유도체, 및 추가적인 항-TrkA 항체 또는 이의 유도체의 조합물.
제 1항의 항체 또는 제 16항의 유도체, 및 약학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier) 또는 부형제(excipient)를 포함하는 제 25항 내지 제 26항의 어느 한 항의 질병 및 장애로부터 선택되는 어느 하나의 치료를 위한 약학적 조성물.
제 1항의 항체 또는 제 16항의 유도체, 및 다른 약제 활성제(pharmaceutically active agent)를 포함하는 제 25항 내지 제 26항의 어느 한 항의 질병 및 장애로부터 선택되는 어느 하나의 치료를 위한 약학적 조성물.
제 32항에 있어서, 상기 다른 약제 활성제는 하기의 하나 또는 그 이상인 약학적 조성물:
a) 진통제
b) 다른 항-TrkA 항체 및 이의 유도체
c) NGF
d) 항암제.
제 1항 및 제 3항 내지 제 15항 중의 어느 한 항에 있어서, 진단 또는 예후에 사용되기 위한 항체.
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하기의 단계를 포함하는 제 25항 내지 제 26항의 어느 한 항의 질병 및 장애로부터 선택되는 어느 하나의 질병의 진단 또는 예후에 대한 정보를 제공하기 위한 방법,
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 제 1항의 항체와 반응시키는 단계 및
(b) 양성 또는 음성 대조군 시료와 상기 항체와 상기 시료의 결합 결과를 비교하는 단계.
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제 1항 및 제 3항 내지 제 15항 중의 어느 한 항의 항체 또는 제 16항의 이의 유도체를 암호화하는 핵산.
제 38항의 핵산을 포함하는 벡터.
제 1항 및 제 3항 내지 제 15항 중의 어느 한 항의 항체 또는 제 16항의 이의 유도체를 발현하거나, 상기 발현 제공을 유도시킬 수 있는 발현 시스템.
제 1항 및 제 3항 내지 제 15항 중의 어느 한 항의 항체 또는 제 16항의 이의 유도체를 발현하거나, 상기 발현 제공을 유도시킬 수 있는 비-인간 형질전환 동물.
제 1항 및 제 3항 내지 제 15항 중의 어느 한 항의 항체 또는 제 16항의 이의 유도체와 진통제로서 개체에 사용되기 위한 지시사항을 함께 포함하는 일부의 키트.
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