JP5719596B2 - 抗体及びその誘導体 - Google Patents

Description

本発明は、抗体及びその誘導体、特にヒト化抗体及びその誘導体に関する。

神経成長因子（ＮＧＦ）は、２つの膜受容体を介して作用する。膜受容体の１つは比較的親和性の低いｐ７５受容体である。もう１つは親和性の高い受容体（１４０ＫＤａ）（ＴｒｋＡ）である。

ＮＧＦは、様々な神経変性障害（アルツハイマー病等）、糖尿病及びハンセン病等の様々な障害の治療において使用することができる可能性がある。

しかしながら、ＮＧＦは望ましくないアゴニスト特性を有し得る。アゴニスト特性の例としては、疼痛感受性の増加が挙げられる。従って、ＮＧＦ−ＴｒｋＡ系は疼痛治療の対象となる可能性がある。

様々な抗ＴｒｋＡ抗体が製造されている。その１つは、国際公開第ＷＯ９７／２１７３２号（マギル大学）において５Ｃ３と記載されているモノクローナル抗体である。しかしながら、このモノクローナル抗体はＴｒｋＡアゴニストであり、痛みを減少させるために有用ではない。すなわち、ＴｒｋＡに結合した際に、この抗体はＴｒｋＡの機能的活性化を防止しない。

ＭＮＡＣ１３として知られている抗ＴｒｋＡモノクローナル抗体が国際公開第ＷＯ００／７３３４４号（Ｓｏｃｉｅｔａ Ｉｔａｌｉａｎａ Ｐｅｒ Ｌａ Ｒｉｃｅｒｃａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃａ）に開示されている（欧州特許第１１８１３８号（Ｌａｙ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＳｐＡ）も参照されたい）。この抗体及びその各種誘導体は、様々な生物系においてＴｒｋＡの機能的活性化を防止するために有効であるとされている。ＭＮＡＣ１３モノクローナル抗体は標準的な侵害受容試験に使用され、顕著な痛覚鈍麻を生じさせることが分かっている。

ＭＮＡＣ１３モノクローナル抗体の単一鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）変異体（ＭＮＡＣ１３ ＳｃＦｖ）が国際公開第ＷＯ００／７３３４４号に開示されている。この変異体は、ＶＬ領域のＣ末端とＶＨ領域のＮ末端を結合するリンカーポリペプチドによって結合されたより大きな抗体の軽鎖及び重鎖可変領域を含む。この変異体は、ＭＮＡＣ１３と同程度に効率的にＴｒｋＡと結合することが判明している。軽鎖及び重鎖可変領域の配列を国際公開第ＷＯ９７／２１７３２号に記載された抗体の対応領域と比較すると、総合的な配列相同性は低いことが判明した。

国際公開第ＷＯ０６／１３１９５２号（Ｌａｙ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＳｐＡ）は、慢性の痛みの治療における抗ＴｒｋＡ抗体の使用について開示している。持続的な疼痛モデル、特に慢性絞扼性神経損傷（ＣＣＩ）モデルを使用して証拠を提示している。

国際公開第ＷＯ０６／１３７１０６号（Ｌａｙ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＳｐＡ）は、ＮＧＦとＴｒｋＡの結合を阻害することができる抗ＴｒｋＡ抗体と、痛みを治療又は予防するための少なくとも１種のオピオイド鎮痛薬と、を使用することを開示している。このような併用療法により、少ないオピオイド投与量で同程度の疼痛寛解をもたらすことができるとされている。投与量を減少させることができるため、疼痛治療におけるオピオイド副作用を減少させるために有用であり得る。

国際公開第ＷＯ０５／０６１５４０号（Ｌａｙ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＳｐＡ ＆ Ｓｃｕｏｌｏ Ｉｎｔｅｒｎａｚｉｏｎａｌｅ Ｓｕｐｅｒｉｏｒｅ Ｄｉ Ｓｔｕｄｉ Ａｖａｎｚａｔｉ−Ｓｉｓｓａ）は、結晶学的研究から得られた構造データを最初のヒト化設計段階を行うために使用する、抗体のヒト化方法を開示している。例えば、国際公開第ＷＯ０５／０６１５４０号では、国際公開第ＷＯ００／７３３４４号に開示されている抗ＴｒｋＡ抗体及び抗ＮＧＦ抗体を出発点とし、開示された方法を使用してそれらを再設計する。

国際公開第ＷＯ０５／０６１５４０号に開示されたヒト化抗体は有用だが、有効な治療の可能性を拡大するためのヒト化抗体が求められている。

本願発明者らは、国際公開第ＷＯ０５／０６１５４０号に開示されていない様々な抗ＴｒｋＡ抗体及びその誘導体を見出した。また、本願発明者らは、それらの抗体の有用性を示すデータを得た。本発明がなされる前には、それらの抗体は当業界において知られておらず、上記データを予測することは不可能だった。

本発明の第１の態様は、
ａ）図１ａに示すＢＸｈＶＨ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）、ＢＸｈＶＨ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）、ＢＸｈＶＨ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）、ＢＸｈＶＨ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）、ＢＸｈＶＨ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）、ＨｕＶＨＷＯｖ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）及び前記配列の変異体から選択される配列を含む可変重鎖及び／又はｂ）図１ｂに示すＢＸｈＶＬ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）、ＢＸｈＶＬ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８）、ＢＸｈＶＬ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９）、ＢＸｈＶＬ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）、ＢＸｈＶＬ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１）、ＢＸｈＶＬ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２）、ＢＸｈＶＬ７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３）、ＢＸｈＶＬ８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４）及び前記配列の変異体から選択される配列を含む可変軽鎖を含む抗ＴｒｋＡ抗体を提供する。

また、ＴｒｋＡに結合することができる、前記抗体の誘導体を提供する。

より好ましくは、抗体は、ａ）に記載する可変重鎖及びｂ）に記載する可変軽鎖の両方、すなわち、以下の軽鎖及び重鎖の組み合わせの１つを含む。
ＢＸｈＶＨ１ＶＬ１、ＢＸｈＶＨ１ＶＬ２、ＢＸｈＶＨ１ＶＬ３、ＢＸｈＶＨ１ＶＬ４、ＢＸｈＶＨ１ＶＬ５、ＢＸｈＶＨ１ＶＬ６、ＢＸｈＶＨ１ＶＬ７、ＢＸｈＶＨ１ＶＬ８、
ＢＸｈＶＨ２ＶＬ１、ＢＸｈＶＨ２ＶＬ２、ＢＸｈＶＨ２ＶＬ３、ＢＸｈＶＨ２ＶＬ４、ＢＸｈＶＨ２ＶＬ５、ＢＸｈＶＨ２ＶＬ６、ＢＸｈＶＨ２ＶＬ７、ＢＸｈＶＨ２ＶＬ８、
ＢＸｈＶＨ３ＶＬ１、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ２、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ３、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ４、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ５、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ６、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ７、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ８、
ＢＸｈＶＨ４ＶＬ１、ＢＸｈＶＨ４ＶＬ２、ＢＸｈＶＨ４ＶＬ３、ＢＸｈＶＨ４ＶＬ４、ＢＸｈＶＨ４ＶＬ５、ＢＸｈＶＨ４ＶＬ６、ＢＸｈＶＨ４ＶＬ７、ＢＸｈＶＨ４ＶＬ８、
ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ２、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ３、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ４、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ５、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ６、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ７、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ８、
又はＨｕＶＨＷＯｖ／ＨｕＶＬＷＯ。

望ましくは、抗体の誘導体は、図１ａ及び図１ｂにおいて各配列について下線を付した領域及び下線を付した領域当たり２以下（好ましくは１以下）のアミノ酸変化を有するそれらの変異体から選択される少なくとも１つのＣＤＲ領域を有する。

より望ましくは、抗体の誘導体は、図１ａ及び図１ｂにおいて各配列について下線を付した領域及び下線を付した領域当たり２以下（好ましくは１以下）のアミノ酸変化を有するそれらの変異体から選択される複数のＣＤＲ領域を有する。

従って、抗体の誘導体は、（任意に１以上の他のＣＤＲ領域と組み合わせて）１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲ領域を含む。

好ましくは、抗体の誘導体は、少なくとも重鎖の第３のＣＤＲ領域、より好ましくは少なくとも重鎖及び軽鎖の第３のＣＤＲ領域を含む。

ただし、より望ましくは、抗体の誘導体は、図１ａ及び図１ｂにおいて各配列について下線を付した６つのＣＤＲ領域又は下線を付した領域当たり２以下のアミノ酸変化を有するそれらの変異体に対応する６つのＣＤＲ領域を有する。

多くの場合、ＣＤＲ配列がほとんど又は全く変化していないことが好ましい。従って、１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲ領域は、図１ａ及び図１ｂに示すような同一のアミノ酸配列を有することができる。

フレームワーク領域については、誘導体は、図１ａ及び図１ｂに示す下線を付していない配列及びそれらの配列と少なくとも７５％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％）のアミノ酸配列相同性を有するそれらの変異体から選択される少なくとも１つのフレームワーク領域を有することが好ましい。

アミノ酸配列相同性は、配列をギャップがないように単純に並べ合わせ、配列の相違を判定することによって決定することができる。

配列はＫａｂａｔ付番法に従って並べ合わせ、配列相同性を決定することができる（Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ，１９８７ ＆ １９９１を参照）。Ｋａｂａｔ付番法については、国際公開第ＷＯ０５／０６１５４０号に記載されている（Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１（１９８７）及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２，８７８（１９８９）も参照）。

あまり好ましくはないが、１以上のギャップ（例えば、１以上のアミノ酸挿入／欠失）があってもよく、ギャップにはギャップペナルティを割り当てることができる。

配列相同性は、配列分析ソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰ（ｗｗｗ． ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で入手可能）を使用して決定することができる。ＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列用）によって２つの配列を比較する（例えば、２つの配列を「Ｂｌａｓｔ」する）ためのデフォルトパラメータは、ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｍａｔｃｈ＝１、ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ＝２、ｏｐｅｎ ｇａｐ＝５、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ＝２である。ＢＬＡＳＴＰをタンパク質配列に使用する場合には、デフォルトパラメータは、ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｍａｔｃｈ＝０、ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ＝０、ｏｐｅｎ ｇａｐ＝１１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ＝１である。

より好ましくは、複数のフレームワーク領域が存在し、複数のフレームワーク領域は、図１ａ及び図１ｂに示す下線を付していない配列及びそれらの配列と少なくとも７５％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％）のアミノ酸配列相同性を有するそれらの変異体から選択される。

図１ａ及び図１ｂに示す各鎖は、４つのフレームワーク領域を有する。従って、少なくとも２、少なくとも３又は４つのそのような領域／それらの変異体が存在することが好ましい。

最も好ましくは、４つのフレームワーク領域の全て又はそれらの変異体が存在する。

１以上の変異体フレームワーク領域が存在する場合には、これらの領域は、対応する位置においてマウスの配列に存在するアミノ酸を変化させるアミノ酸置換を含まないことが通常は好ましい。

比較として使用することができる関連するマウスのアミノ酸を図１ａ及び図１ｂにそれぞれ示す（ｍＶＨＥＰ及びｍＶＬＥＰ）。ただし、ｍＶＨＥＰ及びｍＶＬＥＰに示すイタリック体のアミノ酸はマウス由来ではないと考えられる。これらの位置において、マウス由来であると考えられる残基を、図１ａ及び図１ｂにおいてイタリック体で示す残基の順に以下の表に示す。

従って、１以上のフレームワーク領域のヒト化の割合は、必ずしもマウス残基の割合を増加させないアミノ酸置換によって減少する場合がある。

これは、保存的な非マウスアミノ酸置換及び／又は非保存的な非マウスアミノ酸置換によって生じ得る。

ただし、保存的置換が最も好ましい。

アミノ酸は以下のように分類することができる。
第Ｉ群（疎水性側鎖）：Ｍ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ；
第ＩＩ群（中性の親水性側鎖）：Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ；
第ＩＩＩ群（酸性側鎖）：Ｄ、Ｅ；
第ＩＶ群（塩基性側鎖）：Ｋ、Ｒ；
第Ｖ群（主鎖の配向に影響を及ぼす残基）：Ｇ、Ｐ
第ＶＩ群（芳香族側鎖）：Ｆ，Ｙ、Ｗ；

保存的アミノ酸置換は同じ群のアミノ酸の置換を伴い、非保存的アミノ酸置換は異なる群のアミノ酸の交換を伴う。

軽鎖及び／又は重鎖の異なる領域に存在する配列にかかわらず、本発明の抗体又は誘導体は所定の機能的特性を有することが好ましい。

ＴｒｋＡへの結合に加えて、本発明の抗体又は誘導体は、ＮＧＦのＴｒｋＡへの結合を阻害又は減少させることができることが好ましい。

好ましくは、本発明の抗体又は誘導体は、ＮＧＦのＴｒｋＡ受容体への結合によって誘起され得る１以上の生物学的活性を阻害又は減少させることができる。

従って、本発明の抗体又は誘導体は、ＮＧＦのＴｒｋＡへの結合によって誘起され得る１以上の活性のアンタゴニストである（アゴニストではない）ことが好ましい。このようにして、本発明に係る抗体及びその誘導体は、ＴｒｋＡの機能的活性化を好適に防止する。抗体及びその誘導体によるＴｒｋＡの機能的活性化の阻害により、生体内において痛覚消失が生じ得る。

様々な検定法を使用することができる。

標準的な検定法は、ＰＣ１２細胞をＮＧＦと共に培養し、侯補を評価してＮＧＦ誘発神経突起成長の進展を減少させるために有効であるか否かを確認する古典的なＰＣ１２インビトロ検定である。このモデルは、例えば国際公開第ＷＯ００／７３３４４号において使用されている。

別の検定法では、好ましい抗体は、ＴｒｋＡ−ＩｇＧ結合検定において０．１を超えるＯＤ４５０／６３０ｎｍ値を有する（図２を参照）。ＯＤ４５０／６３０ｎｍ値は０．２よりも大きいことがより好ましい。ＯＤ４５０／６３０ｎｍ値は０．３よりも大きいことが最も好ましい。

さらに別の検定法では、好ましい抗体又はその誘導体は、実施例に記載するＦＡＣＳ検定においてＴＦ１細胞のＦＡＣＳ染色を増加させる（表２を参照）。好ましくは１．０倍を超える増加である。より好ましくは、少なくとも１．５倍、少なくとも２．０倍又は少なくとも２．５倍の増加である。最も好ましくは、少なくとも３．０倍の増加である。

さらに別の検定法は、本発明の医学的使用に関して後述するように、痛み減少検定を含む（医療用途においては、抗体及びその誘導体は疼痛反応の点で痛反応の点でアゴニストよりもアンタゴニストとして機能することが特に望ましい）。

望ましい本発明の抗体及び誘導体は、ＴｒｋＢよりも高い親和性でＴｒｋＡに結合するという点において選択的である（例えば、図２に示す黒と白のバーを比較されたい）。

例えば、本発明の抗体及び誘導体は、ＴｒｋＢに対する結合親和性の少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍の結合親和性をＴｒｋＡに対して有することが好ましい。

ＴｒｋＢよりもＴｒｋＡに対して高い結合親和性を有することにより、選択性が高まると共に望ましくない副作用の危険性が減少する。

結合親和性は、図２に示すような比較結合調査によって容易に評価することができる。

特に好ましい本発明の抗体は、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ３、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１及びＢＸｈＶＨ５ＶＬ３からなる軽鎖及び重鎖の組み合わせのいずれかを含む。

これらの組み合わせにより、図３で示す検定において最良の結果が得られた。

好ましい誘導体は、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ３、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１又はＢＸｈＶＨ５ＶＬ３の誘導体である。

各重鎖のアミノ酸配列アラインメントを示す。 各軽鎖のアミノ酸配列アラインメントを示す。 ＣＯＳ７細胞におけるヒト化ＭＮＡＣ１３変異体の一時的発現に関する実験によって得られた各クローンの上清に関するＴｒｋＡ−ＩｇＧに対する抗原結合特異性の結果を示す。 ＴＦ１細胞に発現させたＴｒｋＡに対する抗体の細胞結合を細胞蛍光分析によって分析した実験の結果を示す。 図３（ＢＸｈＶＨ３ＶＬ３、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ３、ＨｕＭＮＡＣＷＯｖ）から特定された最良のバインダーをＨｕＭＮＡＣＷＯと比較した分析の結果を示す。 マウスＭＮＡＣ１３抗体（ｍｕＭＮＡＣＥＰ）、ｃｈｉｍＭＮＡＣ１３、ＨｕＭＮＡＣＷＯ及びＨｕｍａｎ ＩｇＧ１（標準対照）を使用して各ヒト化侯補について平行して検定を行った結果を示す。 定常領域（定常領域の第１のアミノ酸には下線を付した）を含むＢＸｈＶＨ５ＶＬ１の重鎖及び軽鎖を示す。 定常領域（定常領域の第１のアミノ酸には下線を付し、位置２９７Ａを太字及び下線で示す）を含むＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ Ｎ２９７Ａの重鎖を示す。 ｈｕＴｒｋＡ発現細胞株に結合するＢＸｈＶＨ５ＶＬ１及びＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ Ｎ２９７Ａを示す。 ヒト肥満細胞株ＨＭＣ−１におけるＮＧＦ誘発ＭＩＰ−１ｂ産生に対する各抗体の影響を示す。 ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ Ｎ２９７Ａと比較した場合のＴＨＰ１細胞のＦｃ受容体に結合した細胞へのＢＸｈＶＨ５ＶＬ１の結合を示す。 ｒｈＮＧＦと同時投与した場合のＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ Ｎ２９７Ａ又は対照ｈＩｇＧの局所皮内注射の鎮痛作用を実証する実験を示す。 ｒｈＮＧＦと同時投与した場合のｍｕＭＮＡＣＥＰ又は対照ｍＩｇＧの局所皮内注射の鎮痛作用を実証する実験を示す。 ＮＧＦ誘発疼痛動物モデルにおける対照ｈＩｇＧと比較した場合のＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ Ｎ２９７Ａの全身投与の鎮痛作用を実証する実験を示す。 ＮＧＦ誘発疼痛動物モデルにおける対照ｈＩｇＧと比較した場合のｍｕＭＮＡＣＥＰの全身投与の鎮痛作用を実証する実験を示す。

以下、図面を参照して本発明の実施形態について説明する。

上記説明から明らかなように、様々な抗体及びその誘導体が本発明の範囲に含まれる。

これらの抗体及びその誘導体は、以下に記載する用途等の多くの用途を有する。

医療用途
本発明の抗体又は誘導体は、医学において使用することができる。

発明の抗体又は誘導体は、以下に記載する様々なカテゴリの様々な障害／症状を治療するために使用することができる。

従って、本発明は、以下に記載する症状の治療方法であって、前記症状を治療するために、治療有効量の本願明細書に開示する抗体又は誘導体を治療（投与）を必要とする被投与者、好適には哺乳類の被投与者、特にヒトの被投与者に投与することを含む方法を提供する。

また、本発明は、本願明細書に開示する抗体又は誘導体の、以下に記載する症状を治療するための薬剤の製造における使用を提供する。

また、本発明は、本願明細書に開示する抗体又は誘導体と、以下に記載する症状を治療するための被投与者による使用方法を指示する説明書と、を含むキットを提供する。

「治療」という用語は、既存の障害／症状の治療的治療を含む。また、「治療」という用語は予防的治療も含む。さらに、「治療」という用語は、患者の所与の障害／症状が治癒しない場合であっても、１以上の有害な症状が改善されることを含む。例えば、痛みを軽減又は減少させることができる。

痛み
好ましい医学的使用は痛みの治療である。

国際疼痛研究学会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｐａｉｎ（ＩＡＳＰ））によれば、痛みは「実際又は潜在的な組織損傷に関連付けられる及び／又はそのような損傷によって説明される不快な知覚及び感情的な経験」と通常は定義される。あらゆる形態の痛みの本質的な要素は、潜在的な組織損傷について有機体に警告を与える、特異的な高閾値受容体及び神経線維の活性化である。炎症細胞及び炎症過程は多くの痛みの状態に共通する要素である。「急性の痛み（急性疼痛）」という用語は、即時的かつ通常は高い閾値を有し、切り傷、挫傷、火傷等の傷害又は化学刺激によって引き起こされる痛みを意味する。本願明細書において使用する「慢性の痛み（慢性疼痛）」という用語は、急性の痛み以外の炎症性又は神経障害性の痛みを意味する。慢性の痛みは比較的長期間（例えば、数ヶ月又は数年）に及ぶ場合が多く、連続的又は間欠的であり得る。

本発明の抗体は、慢性の痛み又は急性の痛みを治療するために使用することができる。

慢性の痛みの治療が好ましい。

痛みの治療における抗ＴｒｋＡ抗体の使用は、例えば、国際公開第ＷＯ００／７３３４４号、国際公開第ＷＯ０５／０６１５４０号、国際公開第ＷＯ０６／１３１９５２号に記載されている。

例えば、痛みは、膵臓炎、腎石、子宮内膜症、ＩＢＤ、クローン病、術後癒着、胆嚢結石症、頭痛、月経困難症、筋骨格痛、捻挫、内臓痛、卵巣嚢腫、前立腺炎、膀胱炎、間質性膀胱炎、術後痛、片頭痛、三叉神経痛、火傷及び／又は創傷の痛み、損傷に関連する痛み、神経性疼痛、筋骨格疾患に関連する痛み、関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎、関節周囲の病理、腫瘍による痛み、骨転移の痛み、ＨＩＶ感染のいずれかに関連するものであってもよい。

痛みを評価するための様々なモデルが知られており、抗体及びその誘導体のスクリーニングに使用することができる。

例えば、国際公開第ＷＯ００／７３３４４号で開示されているように、痛覚ホットプレート試験（ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｏｎ ｈｏｔ ｐｌａｔｅ ｔｅｓｔ）を使用することができる。実験は、抗体及び誘導体を免疫接着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）として使用し、ＭｃＭａｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１，７７４−７８０（１９９５）に従って行うことができる。抗体及び誘導体を、３週間にわたって成体ラットの後足に皮下注入するか、浸透圧ミニポンプによって注入する。炎症又は部分的な神経損傷に続く痛覚過敏状態を模擬するホットプレート試験（Ｅｄｄｙ ａｎｄ Ｌｅｉｍｂａｃｈ，Ｊ．Ｐｈａｒ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１０７，３８５−３９３（１９５３））により、間隔を空けて痛覚感受性を評価する。このような場合、痛覚刺激によって単純な反射作用よりも高い統合協調を推定する反応（足をなめる及び／又はジャンプする）が生じる。上記試験では、所望の温度（通常は５６℃）に加熱したプレート（基体）を有する囲いに動物を入れる。対照動物（非関連性抗体を投与）及び抗ＴｒｋＡ抗体及び誘導体を投与した動物における２つの反応（足なめ及びジャンプ）のいずれかの待ち時間を測定する。

ホットプレート試験を行う代わりに、ホルマリンに対する侵害反応（ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を評価することができる。この試験はＰｏｒｒｏ ａｎｄ Ｃａｖａｚｚｕｔｉ，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，４１：５６５−６０７（１９９３）に開示されており、国際公開第ＷＯ０６／１３７１０６号において使用されている。この試験では、試験前に所与の侯補物質を投与した場合の足なめの減少を分析することによって疼痛反応の減少を評価する。通常は生理的食塩水を陰性対照として使用する。

また、絞扼性神経損傷（ｃｈｒｏｎｉｃ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ（ＣＣＩ））モデルも周知の動物モデルである。ＣＣＩモデルは坐骨神経の慢性絞扼（収縮）を有し、神経性の慢性の痛みを評価するために使用される。ＣＣＩモデルはＢｅｎｎｅｔｔ ａｎｄ Ｘｉｅ，Ｐａｉｎ，３３，８７−１０７（１９８８）に記載されている。ＣＣＩモデルは、例えば国際公開第ＷＯ０６／１３１５９２号において使用されている。

癌
また、抗体及び誘導体は癌の治療において使用することができる。

様々な癌がＴｒｋＡを発現する。ＴｒｋＡとＮＧＦの相互作用は、腫瘍成長（例えば、前立腺及び膵臓癌）に関与する。特定の癌では、過剰なＮＧＦは神経線維の成長及び浸潤を促進し得る。ＮＧＦの作用を阻害することにより、神経腫の形成を有意に抑制することができる。

また、単に阻害作用を与える代わりに、抗体及び誘導体を細胞毒性物質に結合させ、ＴｒｋＡを発現する癌細胞を標的とするように使用することができる（詳細は後述する）。

ただし、抗体及び誘導体を毒素に結合させる必要はない。ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害）は、抗体及び誘導体が標的細胞を被覆することにより、（例えば、Ｔ細胞、補体活性化等によって）攻撃しやすくする免疫応答によって生じる。

神経障害
また、抗体及び誘導体は様々な神経障害の治療において使用することができる。

上述したように、抗体及び誘導体は神経腫の形成を減少させるために使用することができる。

また、抗体及び誘導体は神経変性障害の治療において使用することができる。上述したように、ＮＧＦはアルツハイマー病の治療において使用することができる可能性があるが、疼痛感受性の上昇を含む、望ましくないアゴニスト特性を有する。本発明の抗体及び誘導体は、ＮＧＦの望ましくないアゴニスト作用を減少させるためにそのような治療において有用である可能性がある（以下の「併用療法」の記載も参照されたい）。

また、本発明の抗体及び誘導体は、神経因性疼痛を治療するために使用することができる。神経因性疼痛は、神経系の病巣又は機能不全によって生じる場合がある。

炎症性障害
炎症性障害の治療も好ましい用途である。

ＮＧＦは、炎症過程が生じる末梢部位において肥満細胞、線維芽細胞及びその他の細胞型によって放出される。特に、肥満細胞が基本的な役割を果たすように思われる。肥満細胞はＮＧＦを産生し、その表面において機能的ＴｒｋＡ受容体を発現する。ＮＧＦ／ＴｒｋＡ系は、発痛炎症シグナルの局所増幅を可能とする正の自己分泌フィードバック機構を介して肥満細胞の活性化を調停すると考えられる。治療することができる炎症性障害の例としては、尿路及び骨盤領域の炎症、変形性関節症、リウマチ性関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｉｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、喘息が挙げられる。

その他の障害
上述したように、ＮＧＦは糖尿病及びハンセン病の治療において使用することができる可能性があるが、疼痛感受性の上昇を含む、望ましくないアゴニスト特性を有する。本発明の抗体及び誘導体は、ＮＧＦの望ましくないアゴニスト作用を減少させるためにそのような治療において有用である可能性がある（以下の「併用療法」の記載も参照されたい）。

併用療法
本発明の抗体又はその誘導体は、併用療法において１以上の他の活性物質と共に使用することができる。それらは、薬剤による同時、連続又は協調投与に使用することができる。

例えば、抗体又は誘導体はオピオイド鎮痛薬と併用することができる。

国際公開第ＷＯ０６／１３７１０６号によれば、ＴｒｋＡ生物学的活性を阻害することができる少量の分子によってオピオイドの鎮痛作用を増強することができる。

オピオイドの例としては、モルヒネ、コデイン、ジヒドロコデインジアセチルモルヒネ、ヒドロコドン、ハイドロモルフォン、レボルファノール、オキシモルフォン、アルフェンタニル、ブプレノルフィン、ブトルファノール、フェンタニール、スフェンタニル、メペリディン、メサドン、ナルブフィナ、プロポキシフェン、ペンタゾシン及びそれらの製薬学的に許容し得る誘導体（例えば、製薬学的に許容しうる塩）から選択される１以上の化合物が挙げられる。
あるいは、抗体又は誘導体は１以上の非オピオイド鎮痛剤と共に併用療法において使用することができる。

抗体又は誘導体とＮＧＦの組み合わせも使用することができる。上述したように、アルツハイマー病、糖尿病、ハンセン病等を含む様々な障害の治療におけるＮＧＦの使用が提案されているが、周辺標的に対するアゴニスト特性によって疼痛感受性が上昇する。しかし、本発明の抗体又は誘導体を使用することによって疼痛感受性を減少させ、ＮＧＦ療法をより魅力的なものとすることができる。

また、１以上の本発明の抗体又はその誘導体を１以上の他の抗体と共に使用することができる。好ましい組み合わせは、抗ＴｒｋＡ抗体又は抗ＮＧＦ抗体との組み合わせである。そのような組み合わせにより、単一の抗体による治療と比較して、本願明細書に記載する障害の１以上の治療における効果を増加させることができる。例えば、本願明細書において使用する検定によって最も有効であると判明した２以上の抗体の組み合わせを使用することができる。

医薬組成物、賦形剤及び投与経路
本発明の抗体及び誘導体は適当な経路で投与することができる。

投与経路の例としては、腹腔内投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、気管内投与、経口投与、経腸投与、非経口投与、鼻腔内投与、経皮投与が挙げられる。

従って、本発明は、抗体又はその誘導体と、製薬学的に許容し得る担体又は賦形剤と、を含む医薬組成物を提供する。

通常、抗体及び誘導体は、液体製剤の注入（注射）（脳室における脳内又は腹腔内投与、心膜内又は滑液内投与）又は固形製剤（丸薬、錠剤又はカプセル）又は液体製剤（乳液又は溶液）の投与（摂取）によって局所的に投与することができる。

非経口投与用組成物は、相容性溶液、好ましくは水溶液に溶解した免疫グロブリンの溶液を通常は含む。これらの製剤における抗体及び誘導体の濃度は、０．００５％未満（ｗ／ｖ）から１５〜２０％（ｗ／ｖ）の範囲とすることができる。抗体及び誘導体の濃度は、主として液体の体積、粘度等及び所望の投与方法に応じて選択される。

あるいは、抗体及び誘導体は固形投与用に調製することができる。抗体は、異なる不活性物質又は賦形物質と組み合わせることができ、そのような物質は、微晶性セルロース、ゼラチン又はアラビアゴム等のリガンド；乳糖又は澱粉等のレシピエント；アルギン酸、プリモゲル又はトウモロコシ澱粉等の物質；ステアリン酸マグネシウム又はコロイド状二酸化ケイ素等の潤滑剤；サッカロース又はサッカリン等の甘味剤；ミント又はサリチル酸メチル等の香味料を含むことができる。他の医薬投与系としては、ヒドロゲル、ヒドロキシメチルセルロース、リポソーム、マイクロカプセル、マイクロエマルション、微小球体等が挙げられる。

障害が局所的なものである場合には、障害のある部位又は障害のある部位に近接する部位への直接的な局所注入が投与方法として好ましい。

国際公開第ＷＯ０６／１３１９５２号は、抗腫瘍療法ではなく、痛みの治療における各種抗ＴｒｋＡ抗体の使用について開示している。

国際公開第ＷＯ０６／１３１９５２号には、抗ＴｒｋＡ抗体を全身投与することが記載されている。全身投与は、例えば、連続静脈内点滴、ボーラス静脈内点滴、皮下又は筋肉内注射等の注射（点滴）によって行うことができる。あるいは、他の投与形態（例えば、経口投与、粘膜投与、吸入投与又は舌下投与等）を使用することもできる。

ただし、必要に応じて、抗体及び誘導体は、罹患組織付近における局所投与（例えば、関節内注射又は皮下又は筋肉内注射）によって送達することもできる。

抗ＴｒｋＡ抗体及び誘導体は、所期の投与経路に適した医薬組成物に処方する。注射液は、必要に応じて適当な緩衝液及びモル濃度調整剤（例えば、リン酸塩、塩及び／又はブドウ糖）を含む水系媒体（例えば、注射用水）に溶解又は分散された抗体及び誘導体を含むことが好適である。

治療計画（投与量、投与時期及び反復投与）は、選択した投与経路による製品の単一投与又は反復投与（例えば、注射）によって表すことができる。

投与間隔は、臨床反応の程度と持続時間、治療対象の個体及び病歴に応じて変更することができる。

好適には、抗ＴｒｋＡ抗体及び誘導体は長い作用持続時間を有する。特に、投与後の抗体の臨床効果は、動物実験によって測定した２１日間であることができる。また、抗ＴｒｋＡ抗体及び誘導体は、投与後に、関連する生体マトリックス（血清又は血漿）内におけるその存在が検出される期間よりも長い期間にわたって臨床的効果を発揮することができる。

所期の長い作用持続時間（すなわち、少なくとも１週間、好ましくは少なくとも２週間（例えば、少なくとも３週間又は少なくとも４週間）にわたって作用が持続）を考慮して、抗体及び誘導体は、１週間に１回以下（例えば、２週間に１回以下又は３週間に１回以下又は４週間に１回以下）の頻度で被投与者に投与することができる。

抗ＴｒｋＡ抗体及び誘導体の好適な１日当たりの投与量は、通常は０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）である。

ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体とＣＣＩモデルを使用した場合、国際公開第ＷＯ０６／１３１５９２号には、実験動物において２ｍｇ／ｋｇの投与量で有意な鎮痛特性が観察されたことが記載されている。ただし、ヒトの場合にはそれよりも少ない投与量が好ましい場合がある。

腫瘍の治療における投与の場合、腫瘍部位又は腫瘍部位の近傍の組織に直接かつ局所的に注入（注射）することができる。全身投与の場合には、投与量は１日当たり０．０５〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができる。ただし、投与が容易であるため、より低い投与量範囲が好ましい。投与量は、例えば、血漿中における抗体及び誘導体の特定の濃度（約５〜３０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜１５ｍｇ／ｍＬ）を保証し、臨床結果が達成されるまで所定の期間にわたって特定の濃度を維持するために調節することができる。

膵臓又は前立腺腫瘍の病期を測定又は評価するための効果的な方法は、血液中の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の測定、膵臓腫瘍の生存期間の測定又は膵臓又は前立腺腫瘍の転移の拡散の遅延又は阻害の測定に基づく方法である。

腫瘍部位に直接注入する場合、腫瘍の種類、病期及び大きさ並びにその他の多くの可変要因に応じて投与量を決定する。

腫瘍の大きさによる場合、典型的な治療的な投与量は０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲であり、必要な頻度で投与することができる。

治療の性質にかかわらず、ヒト化抗体及び誘導体は非常にゆっくりと排出され、非ヒト化抗体よりも少ない投与量で血漿中における有効な濃度を維持することができる。また、親和性の高い抗体及び誘導体の場合には、親和性の低い抗体と比較して少ない頻度及び投与量で投与することができる。

各抗体及び誘導体の治療的有効量は、熟練した医師によって治療中に決定される。必要であれば、投与量を減少（例えば、副作用を減少させるため）又は増加（活性を高めるため）させることができる。

投与前に、本発明の抗体及び誘導体の製剤は、凍結又は凍結乾燥した状態で保存することができる。そして、使用直前に適当な緩衝液を使用して元の状態に戻すことができる。製剤を凍結乾燥し、元の状態に戻すことによって活性が低下するため、活性ｎ低下を補うために抗体投与量を調節することができる。従来の免疫グロブリンの場合には、ＩｇＭ抗体の活性低下はＩｇＧ抗体よりも大きい傾向がある。また、抗体及び誘導体がある期間にわたる保存後に使用されないように、貯蔵期限を設けることができる。

診断及び予後用途
本発明の抗体又はその誘導体は、医学的使用に関連して上述した疾患／症状のいずれかの予後又は診断に使用することができる。

例えば、抗体又はその誘導体は、アルツハイマー病の早期マーカー（ｐｒｅｃｏｃｉｏｕｓ ｍａｒｋｅｒ）としてのＴｒｋＡ陽性腫瘍マーカーの検出を容易にするために使用することができる。

また、抗体又はその誘導体は、ＣＩＰＡ（先天性無痛無汗症（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｐａｉｎ ｗｉｔｈ ａｎｈｙｄｒｏｓｉｓ））の診断に使用することができる。反復挿間性発熱病、無汗症、侵害刺激に対する反応の欠如、精神遅滞及び自傷傾向を特徴とする遺伝劣性常染色体性症候群がある。これは、ＴｒｋＡ遺伝子の突然変異によって生じるものである。

本発明の抗体又は誘導体は、（健常者又は健全な組織試料におけるＴｒｋＡの発現と比較して）ＴｒｋＡの異常な発現を示す様々な症状の診断又は予後において使用することができる。

従って、本発明は、患者から生体試料を得、試料を本発明の抗体又は誘導体に接触させることを含む方法を含む。

必要に応じて、抗体及び誘導体を固定することができる。抗体及び誘導体は診断キットとして提供することができる。

方法は、試料における抗体及び誘導体の結合を質的又は量的に測定することを含むことができる。必要に応じて、抗体及び誘導体の結合は、参照物質及び／又は陽性対照（健康な状態を示す）又は陰性対照（障害の存在／可能性を示す）を使用して測定することができる。

診断用途では、抗体及び誘導体を検出可能なマーカーで標識して使用するか、標識することなく使用することができる。本願明細書において使用する「マーカー」という用語は、標識又は他の検出可能な部位又は検出可能な変化を引き起こすことができる部位を意味する。

未標識の抗体は、ヒト化又はヒト抗体（ヒト免疫グロブリンの定常領域に特異的な抗体等）に対する活性を有する標識された他の抗体（二次抗体）と組み合わせて使用することができる。

あるいは、抗体は直接標識することができる。放射性核種、フルオロフォア、着色物質、酵素、酵素基質、酵素因子、酵素阻害剤、リガンド等の様々なマーカーを使用することができる。

特に、診断又は予後撮像用途においては、検出可能又は検出可能な放射性同位体（例えば、ヨウ素、インジウム、テクネチウム等の放射性同位体）で標識又は常磁性的（遷移元素、アクチノイド元素、希土類等の常磁性原子又はイオン、特にマンガン（ＩＩ）、銅（ＩＩ）又はコバルト（ＩＩ））に標識された検出可能な物質を抗体に結合させる。

撮像では、静脈内、腹腔内又は皮下注入（リンパ節転移を特定するためのリンパ排液領域）を使用することができ、免疫シンチグラフィの場合には放射性核種放出（シンチレーションβカウンタ等）の検出器を使用することができる。

常磁性標識を使用する場合には、ＮＭＲ分光器を使用することができる。

その他の用途
抗体及びその誘導体は、別の抗体を開発するための出発点として使用することができる。従って、抗体及びその誘導体を設計手段として使用することができる。

抗体及びその誘導体は、１以上の結合／機能的検定によってスクリーニングすることができ、従って薬剤開発計画の一部とすることができる。

抗体及びその誘導体は、組織適合検査、法医学的研究等に使用することができる。

抗体及びその誘導体は、研究手段として使用することができる。

例えば、抗体及びその誘導体は、ＴｒｋＡ及び／又はＮＧＦ（又は他のＴｒｋＡ結合物質）へのＴｒｋＡの結合が関与し得る障害の研究のために使用することができる。抗体及びその誘導体は、結合及び／又は活性化を調べるために使用することができる。

上述した抗体／誘導体の用途の全てが本発明の範囲に含まれる。

抗体及び抗体誘導体の性質
上記説明から明らかなように、様々な抗体及びその誘導体を本発明において使用することができる。

「抗体」及び「抗体誘導体」という用語について以下に詳細に説明する。

抗体
本発明の抗体は、任意の所望の免疫グロブリン構造を有することができる。

ただし、ＩｇＧ及びＩｇＭが好ましく、ＩｇＧが最も好ましい。ＩｇＧアイソフォームとしてはＩｇＧ１が好ましいが、ＩｇＧ４を含む他のアイソフォームを使用することもできる。

抗体はキメラである。すなわち、抗体は、通常は互いに関連付けられていない１以上が領域を含む。より具体的には、１以上のマウス由来ＣＤＲ領域が抗体に存在するが、他の領域（特に定常領域）は好ましくはヒト由来又はヒト化領域である。

ヒト化領域は、対応するマウス免疫グロブリン領域よりも多くの所与のヒト免疫グロブリン領域と共通する残基を有する。好ましくは、ヒト化領域は、アミノ酸配列レべルにおいて、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％がヒト領域を同一である。より好ましくは、１以上の非ＣＤＲ領域（例えば、定常領域）には１００％の配列相同性がある。

ただし、所定の変化を導入することが有利な場合もある。

例えば、以下の１以上を妨げるか、減少させる変化を導入することが望ましい場合がある。
ａ）補体系の活性化
ｂ）補体媒介性溶菌
ｃ）Ｔ細胞の活性化
ｄ）Ｆｃ受容体への結合

上記の１以上の達成を可能とする突然変異が様々な特許文献に記載されている。従って、前記突然変異の１以上が本発明の抗体／誘導体に含まれていてもよい。

例えば、米国特許第６，１９４，５５１号は、ＩｇＧ分子の定常重鎖領域のアミノ酸位置３２２、３２９及び／又は３３１（Ｋａｂａｔ付番法による）におけるアミノ酸置換を提案しており、Ｃ１ｑへのＦｃの結合を無効にすることによって補体系の望ましくない活性化を妨げるか、減少させることができることを示唆している（Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｇｈｅｔｉｅ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２：７７−９４（１９９５）も参照されたい）。米国特許第６，１９４，５５１号によれば、プロリンはヒトＩｇＧの位置３２９に保存される。この残基（グリコシル化され、補体系の活性化に関与し得るはアラニンで置換することが好ましい。しかしながら、セリン、トレオニン、アスパラギン、グリシン、バリン等の他のアミノ酸による置換も可能である。米国特許第６，１９４，５５１号によれば、プロリンはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３の位置３３１においても保存されるが、ヒトＩｇＧ４（位置３３１にセリン残基を有する）では保存されない。残基３３１は、アラニン又は他のアミノ酸（例えば、セリン（ＩｇＧ４以外のＩｇＧ領域）、グリシン、バリン）によって置換することが好ましい。別の可能性として、位置３２２に置換を導入することが記載されている。リジン３２２はヒトＩｇＧにおいて保存され、好ましくはアラニン残基で置換される。ただし、他のアミノ酸（例えば、セリン、トレオニン、グリシン又はバリン）による置換も可能である。

米国特許第６，４９１，９１６号は、ヒト化抗体の約位置２３０から約位置２４０の領域における突然変異は特有の利点を有することを開示している。米国特許第６，４９１，９１６号によれば、Ｆｃに結合する抗体とＦｃに結合しない抗体との比較は、当該領域結果における変化によってＴ細胞を活性化しない抗ＣＤ３抗体が得られることを示唆している。例えば、好ましい抗体のいくつかは、位置２３４及び／又は位置２３５に突然変異を含む。位置２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９及び２４０の１以上に１、２、３、４又は５以上の突然変異を含む抗ＣＤ３抗体が利点を有すると予想されている。米国特許第６，４９１，９１６号は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を有し、位置２３４及び２３５にアラニンを有するように突然変異させた抗体は、Ｃ１ｑ補体成分に結合せず、補体媒介カスケードを開始させないことを開示している。また、ＧｌｎへのＬｙｓ３２０の突然変異は、Ｃｌｑに対して非溶解野生型よりもわずかに低い親和性を有することが記載されている。

米国特許第５，６２４，８２１号は、残基３１８（Ｇｌｕ）、３２０（Ｌｙｓ）及び３２２（Ｌｙｓ）のいずれかをＡｌａに変更することにより、Ｃｌｑ結合を無効にすることができることを開示している。米国特許第５，６２４，８２１号によれば、Ｃｌｑ結合を無効にするためにイオン性残基をＡｌａのみによって置換することは必要ではなく、３つの残基の代わりにＧｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ及びＶａｌ等の他のアルキル置換非イオン性残基又はＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ及びＰｒｏ等の芳香族非極性残基を使用することもできる。また、残基３１８ではなく、残基３２０及び３２２の代わりに、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ及びＭｅｔ等の極性を有する非イオン性残基を使用することも可能である。また、米国特許第５，６２４，８２１号は、残基２９７（Ａｓｎ）をＡｌａで置換することにより、Ｃｌｑに対する親和性をわずかに減少（約３倍の減少）させるだけで溶解活性を除去することができることを開示している。米国特許第５，６２４，８２１号によれば、変化によってグリコシル化部位が破壊すされるために上記現象が生じ、補体の活性化には糖質の存在が必要である。そして、上記部位におけるその他の置換によってもグリコシル化部位が破壊されるとしている。また、米国特許第５，６２４，８２１号は、ヒンジ結合領域又はその近傍の部位における突然変異（例えば、残基２３４、２３６又は２３７をＡｌａで置換）は、残基２３４、２３５、２３６及び２３７における変化がＦｃγＲ１受容体に対する親和性に少なくとも影響を与えることを示していると記載している。

なお、実質的に生物学的性質に影響を与えない１以上のアミノ酸変化（通常は保存的アミノ酸変化）を導入することができる。従って、利用可能な突然変異は上記突然変異に限定されるものではない。

抗体は、モノクローナル抗体（同じ抗体との組み合わせ）又はポリクローナル抗体（異なる抗体との組み合わせ）であってもよい。本発明のモノクローナル抗体を産生することができるハイブリドーマも本発明の範囲に含まれる。

抗体誘導体
「抗体誘導体」という用語は、所望の機能的特性を維持しながら、抗体に対して行うことができる様々な構造変化を許容することを意図する。

例えば、ＴｒｋＡに対する結合親和性は維持されることが望ましい。

好ましくは、誘導体も本願明細書に開示する機能的検定の１以上において有効である。

以下の全てが本発明の抗体の誘導体であるとみなされる。
ａ）前記抗体のフラグメント
ｂ）前記抗体の複数のフラグメントを含む多量体（以下、「フラグメント多量体」という）
ｃ）前記抗体、フラグメント又はフラグメント多量体と他の部位との融合産物
ｄ）前記抗体、フラグメント、フラグメント多量体又は融合産物と少なくとも７５％の配列相同性を有する、前記抗体、フラグメント、フラグメント多量体又は融合産物の変異体

本発明における「誘導体」という用語はこのように広い意味で解釈される。

本発明のフラグメントは、好ましくは少なくとも７個のアミノ酸に対応する長さを有する（従って、本発明の重鎖及び軽鎖について図１ａ及び図１ｂに示す最も短いＣＤＲ領域と少なくとも同じ長さを有する）。より好ましくは、本発明のフラグメントは、少なくとも１０、少なくとも１５又は少なくとも２０個のアミノ酸に対応する長さを有する。

本発明のフラグメントは、完全抗体からのタンパク質分解又は重鎖及び軽鎖の可変領域のコードされたＤＮＡ配列を有するベクターの所望の位置に停止コドンを挿入することによって得ることができる。これは、ＣＨ_１領域の後にＦａｂフラグメントを産生するか、ヒンジ領域の後に（Ｆａｂ’）_２フラグメントを産生することによって行うことができる。

ＳｃＦｖ鎖としての誘導体は、重鎖と軽鎖の可変領域をリンカーを介して接合することによって得ることができる（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，８５，５８７９（１９８８）；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３（１９８８））。Ｆｖ又はＦａｂフラグメントは大腸菌（Ｂｕｃｈｎｅｒ ａｎｄ Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，１５７（１９９１）；Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，２７３（１９９１））又は（好ましくは哺乳動物の）真核細胞において発現させることができる。

Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ＆ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ２３，Ｎｏ ９，１１２６−１１３６（２００５）に記載されたフラグメントを含む様々な形態のフラグメントが可能である。

あらゆるフラグメントが本発明の範囲に含まれる。フラグメントには、ＶＨ鎖又はＶＬ鎖からなるフラグメント（「ドメイン抗体」又は「ｄＡｂｓ」としても知られている）又は前記鎖のフラグメント（例えば、ＣＤＲ領域）も含まれる。また、小型抗体、ビス（又は高）−ＳｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、Ｆａｂ多量体（以下、「フラグメント多量体」という）等の多重体フラグメントも含まれる。

さらに、他の様々な部位を本発明の抗体／フラグメントに共有結合によって結合させて有利な特性を得ることができる。そのような融合産物は、本発明の誘導体の範囲に含まれる。例えば、前記部位は、診断物質、治療物質、標識物質、産物の半衰期を増加させる物質又は（好ましくはヒト宿主における）免疫原性を減少させる物質であってもよい。

例えば、ＰＥＧ化抗体／フラグメントとしての融合産物を使用することができる。ＰＥＧは、免疫原性を減少させ、抗体の循環半減期を増加させるために主として使用されている。また、腫瘍ターゲッティング等の所定の臨床状況における抗体の使用に対して有益な効果を有する。

融合産物の部分を化学的に結合させることができる。化学的結合は、例えば、ヘテロ二官能性物質（例えば、ＳＰＤＰ、カルボジイミド、グルタルアルデヒド）を使用した交差結合によって行うことができる。

融合タンパク質の場合には、遺伝子工学技術を使用して作成することが好ましい。そのため、所望の融合タンパク質をコードする遺伝コードに基づく適切なコード配列を提供することができ、適当な表現ベクターを使用して宿主細胞にクローニングすることができる。発現は、構成的プロモーター又は誘導プロモーターの制御下で行うことができる。発現した融合タンパク質は、標準的な方法（例えば、免疫アフィニティー法）を使用して精製することができる。細胞又は無細胞発現系を使用することができる。

例えば、融合タンパク質は、細胞毒に融合した本発明の抗体／フラグメントを含むことができる。得られた融合タンパク質は、ＴｒｋＡ発現腫瘍細胞等のＴｒｋＡ受容体を発現する細胞を標的とするために使用することができる。

様々な細胞傷害性免疫毒素の産生は、Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１６８（１９８２）に報告されている。多くの細胞毒性物質を免疫毒素において好適に使用することができる。そのような物質の例としては、ヨウ素１３１、ヨウ素の他の同位体、イットリウム９０、レニウム１８８、ビスマス２１２及びアルファ粒子を放射する他の同位体等の放射性核種、ビンデシン、メトトレキサート、アドリアマイシン及びシスプラチン等の化学療法薬、リボソームを阻害するタンパク質（例えば、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、シュードモナス菌外毒素Ａ、ジフテリア毒素、リシンＡ、植物由来クラビン）等の細胞毒性タンパク質、細胞表面レベルで活性な物質（例えば、ホスホリパーゼＣ等のホスホリパーゼ酵素）が挙げられる。

場合によっては、免疫毒素の細胞傷害性領域は免疫原性であり、慢性又は長期治療の場合に融合タンパク質の臨床有用性を制限し得る。

免疫原性の問題を回避するための代替手段は、抗体／誘導体の結合領域との融合において、ＤＮＡと相互作用し、毒素発現カセットを含むベクター（例えば、プラスミド）を融合タンパク質に結合させることができるタンパク質を発現させることである。ＤＮＡと結合するヒトタンパク質であるプロタミンの多数の正電荷は、安定的にＤＮＡの負電荷と相互作用し、中性の抗体／誘導体の融合相手を発生させることができる。これは、毒素よりもはるかに安定し、免疫原性が少ない。受容体媒介エンドサイトーシスによる抗体−ベクター複合体の内在化後、毒素の発現によって細胞死が生じる。

また、必要に応じて、誘導性又は細胞特異的プロモーターを毒素発現カセットに設けることができる。この方法は、しながらゆったり過ごす、 腫瘍細胞の選択的脱離を最大化すると共に毒性副作用を最小化することを目的とするものである（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２，１１６（１９９５））。

また、融合タンパク質は、他の抗体／誘導体との融合体を含むことができる。例えば、血清タンパク質（例えば、血清アルブミン）と持続的に結合することができる他のｄＡｂｓに特異的な抗原とｄＡｂｓの融合体が血清の半減期を向上させるために使用されている。

本発明の可変重鎖及び軽鎖配列は、１以上の抗原（ＴｒｋＡ等）に対する特異性を有する多価抗体又はＴｒｋＡの１以上の抗原決定基の一部を較正することができる。

発現系
本発明の抗体／誘導体を得るために多くの発現系を使用することができる。

例えば、原核細胞系を使用されることができ、原核細胞系は十分に特性分析されている。

大腸菌は、本発明のＤＮＡ配列をクローニングするために特に有用な原核生物宿主の１つである。また、十分に特性分析された多くのプロモーター（ｌａｃ又はｔｒｐオペロン又はβラクタマーゼ又はλファージ）も使用可能である。通常、これらのプロモーターは発現を制御するためのリボゾーム結合部位を有する。原核細胞系において産生した本発明のヒト化免疫グロブリンの半減期は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との結合によって向上させることができる。

酵母等のその他の単細胞生物も発現に使用することができる。最適な宿主はサッカロミセスであり、発現制御、複製終結及び起源配列のための適当な担体を使用する。

免疫グロブリンの可変領域の配列を有するファージディスプレイライブラリーが報告されており、結合研究に使用することができる（Ｃｅｓａｒｅｎｉ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ，３０７，６６（１９９２）；Ｓｗｉｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ，８９，３７５６（１９９２）；Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ，８９，３５７６（１９９２）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，６２４（１９９１）；Ｓｃｏｔｔ ＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，３８６（１９９０）；Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，９，１３７３（１９９１））。

また、昆虫細胞培養物も使用することができ、通常は、安定的に感染させたＳ２ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの細胞又はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの細胞をバキュロウイルスに基づく発現系と共に使用する（Ｐｕｔｌｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，６５１（１９９０））。

植物細胞培養物も使用することができる（Ｌａｒｒｉｃｋ ＆ Ｆｒｙ，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，２，１７２（１９９１）；Ｂｅｎｖｅｎｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１７ ８６５（１９９１）；Ｄｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，；１５，２８１（１９９０）；Ｈｉａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２，７６（１９８９））。

また、哺乳動物細胞の組織培養物を使用して本発明のポリペプチドを発現させることもできる。これは、ヒトグリコシル化パターンを得るため有利な場合がある。異なるアイソタイプを発現させることができる。ＩｇＧ１は免疫応答の誘発における最も効果的なアイソタイプであることが分かっており（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，（１９８７））、ＩｇＧ４は診断用途に使用される場合が多い（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３（１９８８））。

また、米国特許第６，１９４，５５１号、米国特許第５，６２４，８２１号及び／又は米国特許第６，４９１，９１６号を参照して上述したように、補体の活性化を無効にするか、減少させる突然変異型を使用することができる。

特に、哺乳動物細胞が好ましい。完全免疫グロブリンの分泌のために多くの宿主細胞株が開発されており、ＣＨＯ細胞株、いくつかのＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株（ＮＳＯ，ＳＰ／２，ＹＢ／０ ｅ Ｐ３Ｘ６３．Ａｇ８．６５３）、形質転換Ｂ細胞及びハイブリドーマが例として挙げられる。これらの細胞の発現ベクターは、発現制御配列、例えば、複製開始点、プロモーター、エンハンサー（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，８６：１００２９（１９８９））、リボソーム結合、ＲＮＡスプライシング、ポリアデニル化に必要な配列及び転写終結のための配列を含むことができる。最適な発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子及びウイルス（例えば、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、サイトメガロウイルス）に由来するプロモーターである。通常、発現ベクターは、ネオマイシン抵抗等の選択可能マーカーを含むことができる。

ヒト化抗体を発現させる場合には、無血清培地で哺乳動物細胞株を培養することが望ましい。例えば、Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ−２８９７）（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）内においてＨＵＤＲＥＧ−５５細胞株を容易に増殖させることができる。

核酸、ベクター及びトランスジェニック動物
本発明の抗体／誘導体／抗体鎖をコードする核酸配列は、主要な可変領域のアミノ酸配列を用意し、遺伝コードを使用して対応するコード配列を用意することができる場合には、標準的な方法で製造することができる。これらの配列は、発現ベクターに導入及び／又は細胞にクローニングすることができる。

齧歯動物のＣＤＲ領域とヒト化フレームワーク領域を使用して再作成抗体（ｒｅｓｈａｐｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を製造及びクローニングする方法が周知となっている。そのような方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ，Ｄｅａｒ，Ｆｏｏｔｅ，Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２−４（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｃｌａｒｋ，Ｗａｌｄｍａｎ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，１５３４−１５３６（１９８８）に記載されている。

そのような核酸は、当技術分野で知られているように（上述）、プラスミド、ファージ等を含む発現ベクターに導入することができる。

また、本発明の核酸は、プローブ又はプライマーを設計するために使用することができる。これらは、例えば、本発明の核酸を単離又は増幅するために使用することができる。

従って、プローブ又はプライマーは本発明の範囲に含まれる。通常、それらは、少なくとも１０個、少なくとも１５個又は少なくとも２０個の塩基に対応する長さを有する。好ましくは、それらは、ストリンジェントな条件下において本発明の抗体／誘導体をコードする核酸鎖又はその相補鎖にハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、５ Ｘ ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液を使用し、５Ｘ ＳＳＣを使用して５５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行うことが挙げられる。ただし、上記条件に限定されるものではない。例えば、それらのいくつかが国際公開第ＷＯ９８／４５４３５号の表１に記載されている（特に、表１のＡ〜Ｆに記載された条件（あるいはＧ〜Ｌ又はＭ〜Ｒに記載された条件）を参照）。

本発明の別の態様において、非ヒトトランスジェニック動物、好ましはマウスを製造するために使用するトランス遺伝子を得るために核酸を有利に使用することができる。抗体／誘導体は誘導的に発現させるか、構成的プロモーターの制御下で発現させることができる。

トランスジェニック動物は、ヒト病理学（ＮＧＦ／ＴｒｋＡ相互作用は阻害）、特に神経変性病理学のための薬剤の研究及び試験に有利に使用することができる。

抗体／誘導体は、乳又は血清等の回収可能な体液において有利に発現させ、回収し、標準的な方法を使用して精製することができる。

トランスジェニック動物を製造するために使用するトランス遺伝子は、プロモーターに作動的に結合した関連コード配列を含むことができ、通常は、齧歯動物の免疫グロブリンのエンハンサー配列又はカゼイン遺伝子のプロモーター／エンハンサーも含む（Ｂｕｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；８，１４０（１９９０）；Ｍｅａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，４４３（１９９０））。

トランス遺伝子は、相同組み換えによって細胞又は胚種に導入することができる。マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ヤギ等の様々な非ヒトトランスジェニック動物を製造することができる（国際公開第ＷＯ９１／０８２１６号を参照）。

上記説明から明らかなように、本発明は様々な新規抗体、誘導体、核酸等を提供するものである。

必要に応じて、抗体、誘導体、核酸等は実質的に精製された形態で提供することができる。本発明の場合には、抗体、誘導体、核酸等が特定の組成物の乾燥重量の大部分を占めることを意味する。例えば、抗体、誘導体、核酸等は、乾燥重量の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％を占めることができる。

抗体、誘導体、核酸等は、単離された形態で提供することができる。これは、抗体、誘導体、核酸等が通常伴う１以上の他の成分から抗体、誘導体、核酸等を除去することを意味する。例えば、核酸は細胞から単離した形態で提供することができる。

抗体、誘導体、核酸等は、その他の様々な形態で提供することができる。例えば、抗体、誘導体、核酸等を異種部位に融合及び／又は固定することができる。

上述した全ての形態は本発明の範囲に含まれる。

実施例について詳細に説明する前に、実施例において使用する命名法について記載する。

ｍｕＭＮＡＣＥＰ
「ｍｕＭＮＡＣＥＰ」という用語は、マウス抗体ＭＮＡＣ１３を意味する（欧州特許第１１８１３１８号を参照）。

この抗体の重鎖可変領域は本願明細書においてｍＶＨＥＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５）と呼ぶ。この抗体の軽鎖可変領域は本願明細書においてｍＶＬＥＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６）と呼ぶ。

ＨｕＭＮＡＣＷＯ
「ＨｕＭＮＡＣＷＯ」という用語は、ヒト化抗体ＭＮＡＣ１３を意味する（国際公開第ＷＯ０５／０６１５４０号を参照）。

この抗体の重鎖可変領域は本願明細書においてＨｕＶＨＷＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７）と呼ぶ。この抗体の軽鎖可変領域は本願明細書においてＨｕＶＬＷＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８）と呼ぶ。

ＨｕＭＮＡＣＷＯｖ
「ＨｕＭＮＡＣＷＯｖ」という用語は、重鎖ＣＤＲ３領域がｍｕＭＮＡＣＥＰに存在するＣＤＲ３領域に対応するＣＤＲ３領域で置換されたＨｕＭＮＡＣＷＯ抗体（上述）の変異体を意味する。上記変異体は新規であり、本発明の範囲に含まれる。

この抗体の重鎖可変領域は本願明細書においてＨｕＶＨＷＯｖ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）と呼ぶ。この抗体の軽鎖可変領域は本願明細書においてＨｕＶＬＷＯｖと呼ぶ。この抗体の軽鎖可変領域はＨｕＶＬＷＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８）と同一であるため、重複を避けるために図１ｂには示していない。

ＣｈｉｍＭＮＡＣ１３
ＣｈｉｍＭＮＡＣ１３はｍｕＭＮＡＣＥＰに対応するが、マウス定常領域の代わりにヒト定常領域を有する。

この抗体の重鎖可変領域は本願明細書においてｍＶＨＥＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５）と呼ぶ。

軽鎖領域は本願明細書においてｍＶＬＥＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６）、３−２３＊０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９）、ＪＨ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０）、Ｌ６＊０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１）、ＪＫ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）と呼ぶ。

これらは、ヒト生殖系列遺伝子に由来するコード配列である。

これらは、表１におけるヒト化度を評価するために使用する。従って、ヒト生殖系列配列に対して変化がない場合には、ヒト化度は１００％とみなす。
ヒト化度（％）＝変化の数／比較した残基の総数×１００
表１に各変異体のヒト化度（％）を示す。

表１に示すように、全ての変異体可変鎖はフレームワーク領域に対して８５％を超えるヒト化度を有する。

ＢＸ配列
「ＢＸ」という符号で始まる名称を有する配列は本発明の新規な配列である。「ＢＸ」に続く「ＶＨ」又は「ＶＬ」は可変重鎖又は可変軽鎖を示す。そして、配列は所与の鎖について図１ａ及び図１ｂ示す順序で連続して付番する。

５つの重鎖配列があり、それらは次のように付番する。
ＢＸｈＶＨ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）
ＢＸｈＶＨ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）
ＢＸｈＶＨ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）
ＢＸｈＶＨ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）
ＢＸｈＶＨ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）

８つの軽鎖配列があり、それらは次のように付番する。
ＢＸｈＶＬ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）
ＢＸｈＶＬ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８）
ＢＸｈＶＬ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９）
ＢＸｈＶＬ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）
ＢＸｈＶＬ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１）
ＢＸｈＶＬ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２）
ＢＸｈＶＬ７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３）
ＢＸｈＶＬ８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４）
重鎖と軽鎖は抗体又はその誘導体において組み合わせることができる。

４０個の可能な組み合わせがある。
ＢＸｈＶＨ１ＶＬ１、ＢＸｈＶＨ１ＶＬ２、ＢＸｈＶＨ１ＶＬ３、ＢＸｈＶＨ１ＶＬ４、ＢＸｈＶＨ１ＶＬ５、ＢＸｈＶＨ１ＶＬ６、ＢＸｈＶＨ１ＶＬ７、ＢＸｈＶＨ１ＶＬ８、
ＢＸｈＶＨ２ＶＬ１、ＢＸｈＶＨ２ＶＬ２、ＢＸｈＶＨ２ＶＬ３、ＢＸｈＶＨ２ＶＬ４、ＢＸｈＶＨ２ＶＬ５、ＢＸｈＶＨ２ＶＬ６、ＢＸｈＶＨ２ＶＬ７、ＢＸｈＶＨ２ＶＬ８、
ＢＸｈＶＨ３ＶＬ１、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ２、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ３、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ４、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ５、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ６、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ７、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ８、
ＢＸｈＶＨ４ＶＬ１、ＢＸｈＶＨ４ＶＬ２、ＢＸｈＶＨ４ＶＬ３、ＢＸｈＶＨ４ＶＬ４、ＢＸｈＶＨ４ＶＬ５、ＢＸｈＶＨ４ＶＬ６、ＢＸｈＶＨ４ＶＬ７、ＢＸｈＶＨ４ＶＬ８、
ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ２、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ３、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ４、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ５、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ６、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ７、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ８。

Ｎ２９７Ａ
抗体の名称の後に付す「Ｎ２９７Ａ」は、重鎖定常領域の位置２９７がＮからＡに変異していることを示す。

ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ Ｎ２９７Ａの配列をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２３として示す。

発現ベクター
抗体発現系にクローニングするためのｃＤＮＡについて、適切なコード配列を分泌シグナル５’及びスプライスドナー配列３’をコードする配列に融合した。

ＤＮＡフラグメントをＩｇＧ１発現ベクターにクローニングした。

これらの発現ベクターは、ｈＶＨ及びｈＶＬ配列の選択されたｃＤＮＡフラグメントを挿入するためのヒト定常領域及びクローニングカセットをコードするゲノム配列に基づくものである。

ＣＯＳ７細胞におけるヒト化ＭＮＡＣ１３変異体の一時的発現及び抗体価の測定
重鎖及び軽鎖の各組み合わせをＣＯＳ−７細胞に一時的に導入し、抗体価を測定した。

２４ウェルプレートを使用する場合の製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ドイツ）の取扱説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎを使用したリポフェクションにより、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターをＣＯＳ−７細胞に一時的に導入した。

導入後、培地を１０％ＦＣＳ及び２％Ｌ−グルタミンを含むＤＭＥＭに交換し、ＣＯＳ７細胞の上清を導入後４日目に回収した。

感染させたＣＯＳ７細胞の上清に分泌されたヒト化抗体の抗体価をサンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。

簡単に説明すると、抗体（ＢＤ）を認識するマウス抗ヒトカッパ鎖を９６ウェルプレートに固定した後、ブロックし、感染させたＣＯＳ７細胞の希上清で培養した。抗体の存在は、ＰＯＤ結合ウサギ抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｄｉａｎｏｖａ、ドイツ）によって検出した。キメラ対照抗体を標準として１〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度で使用した。決定した抗体濃度を、標準化された抗体濃度を有する内部標準試料によってさらに調整した。

実施例１
ＥＬＩＳＡによるＴｒｋＡ−ＩｇＧへのヒト化抗体の結合の比較
決定した抗体濃度に基づき、全ての試料の上清を同じ抗体濃度に調節した。

全てのヒト化抗体変異体の結合活性をＴｒｋＡ−ＩｇＧ抗原ＥＬＩＳＡによって分析した。ヒト化抗体変異体の結合活性をＣｈｉｍＭＮＡＣ１３及びＨｕＭＮＡＣＷＯｖの結合活性と比較した。

抗体及び抗原を解凍し、一定量に分割し、−２０℃で保存した。使用する抗体のアリコートは４℃で最大２週間保存した。

抗原ＥＬＩＳＡは以下のようにして行った。Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（ヌンク、ドイツ）を０．１２５、０．２５、０．５又は１μｇ／ｍＬの１ＴｒｋＡ−ＩｇＧでコーティングした。抗体−抗原結合特異性を確認するために、ＴｒｋＢ−ＩｇＧ（１μｇ／ｍＬ）を陰性対照として使用した。

一時的に発現させた抗体変異体は１、１０又は１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用した。

詳細な手順は以下の通りである。
コーティング
プレート：Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェル
炭酸緩衝液０．１Ｍ（ｐＨ９．６）に２μｇ／ｍＬの濃度で添加したＴｒｋＡ−ＩｇＧ（１００μＬ／ウェル）（ＴｒｋＢ−ＩｇＧを陰性対照として使用）
プレートを密閉し、＋４℃で一晩培養。
２００μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄。

ブロッキング
ＰＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｄ ＃ ３７５１５）に添加したＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング緩衝液２００μｌを各ウェルに添加することによってプレートをブロック。
反転によってプレートを空にする。
さらに２回繰り返す。
３７℃で２時間培養。

一次抗体
上清を捨て、ＴＥＳＴ緩衝液で適当に希釈した１００μｌの精製ｍＡｂを添加（標準曲線範囲：５０〜５０００ｐｇ／ｍＬ）。
プレートを密閉し、３７℃で２時間培養。
感受性を増加させるために＋４℃で一晩培養。
洗浄緩衝液で４回洗浄。

二次抗体
ＴＥＳＴ緩衝液で１：１００００に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ ｃａｔ．３１４３０）を添加。
３７℃で１時間培養。
洗浄緩衝液で４回洗浄。

手順
１００μＬの基質溶液を各ウェルに添加。室温で培養。
１００μＬの２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で反応を停止。
マイクロタイタリーダーを使用して各ウェルの光学濃度を測定（４５０ｎｍに）。

結果
ＥＬＩＳＡ検定を使用して抗原結合特異性について評価した各クローンの上清について得られた結果を図２に示す。

簡単に説明すると、抗原ＴｒｋＡ−ＩｇＧ（黒いバー）及び陰性対照ＴＲＫＢ−ＩｇＧ（白いバー）を異なる９６ウェルプレートに１μｇ／ｍＬの濃度でコーティングした。

抗体上清を定量し、適切に希釈して５ｎｇ／ｍＬの濃度で試験を行った。洗浄後、発色反応によってＨＲＰ標識二次抗体で結合を検出し、ＯＤ４５０／６３０ｎｍで定量した。

ヒト化抗体のほとんどは高密度ＴｒｋＡ抗原に対して同様な選択的親和性を示した。

また、ヒト化抗体の結合特異性は、親マウス抗ヒトＴｒｋＡ抗体及びそのキメラアイソフォームと有意に異なるものではなく、抗原選択性がヒト化手順において完全に保存されていたことを示した。

実施例２
ＴＦ１細胞におけるＴｒｋＡ表面発現の細胞蛍光分析による新たな候補の細胞結合検定

手順
培養物から細胞を採取し、単一細胞懸濁液を調製する。
抗原発現を最大化するために、前日に細胞を１：３に分割。
０．３〜０．４×１０^６ｃｅｌｌｓ／試料を添加し、冷却したＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋０．１％アジ化ナトリウム＋０．１％ＢＳＡ）で１回洗浄。
３５０ｘｇで５分間遠心分離。
上清を捨て、チューブを氷上に保持。
Ｆｃ受容体ブロッキング
ＦＡＣＳ緩衝液に添加したヒトＩｇＧ（３００μｇ／ｍＬ）の試料５０μＬを添加し、穏やかなボルテックスによって混合。
４℃で１５分間培養。

一次抗体
ＦＡＣＳ緩衝液に添加した一次抗体ｍｕＭＮＡＣ１３（４μｇ／ｍＬ）の試料１００μＬを添加し、穏やかなボルテックスによって混合。
精製したマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照を同じ濃度で陰性対照として使用。
４℃で３０分間培養。
１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、３５０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を捨てる。

二次抗体
ＦＡＣＳ緩衝液に添加したロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｒ−フィコエリトリン（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｃａｔ． ＃７１５−１１６−１５１）の試料１００μＬを添加し、穏やかなボルテックスによって混合。
４℃で３０分間培養。
１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、３５０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を捨てる。
０．５ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁。
フローサイトメータで試料データを得る。

結果
ＴＦ１細胞を、全てのクローン及び対照としてのＨｕＭＮＡＣＷＯ及びＨｕＭＮＡＣＷＯｖ抗体の上清（４μｇ／ｍＬ）で４℃で３０分間染色した。

適切なＰＥ標識二次抗体で染色を確認し、細胞蛍光分析で定量して結合の蛍光強度を評価した。

結果を表２に基づく図３に示す。

上記結果は、程度は異なるが、試験を行った全てのクローン及びＨｕＭＮＡＣＷＯｖがＴＦ１細胞における膜関連ＴｒｋＡ受容体を検出したことを示している。ＨｕＭＮＡＣＷＯは、表面ＴｒｋＡ受容体の密度が低いＴＦ１細胞を染色することができなかった。

さらなる確認のために、最も良好に結合したクローンを選択してさらに分析を行った。

２つの別々の実験により（図４）、ＢＸＨＶＨ３ＶＬ３、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ３及びＨｕＭＮＡＣＷＯｖをＨｕＭＮＡＣＷＯと比較した。

選択したクローンは良好なバインダーであることが確認され、ＨｕＭＮＡＣＷＯｖと比較するとわずかに優れていた。

また、ヒト化抗体アイソフォームＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ Ｎ２９７Ａ及びＢＸｈＶＨ５ＶＬ１並びに参考抗体ｍｕＭＮＡＣＥＰ及びＨｕＭＮＡＣＷＯについても、膜表面受容体ｈＴｒｋＡを異なる濃度で発現するＴＦ−１、ＨＭＣ−１及びＰＣ１２−ｈＴｒｋＡ細胞株に対する結合性を評価した。

図８に示すように、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ Ｎ２９７Ａ及びＢＸｈＶＨ５ＶＬ１抗体は、細胞表面の受容体密度とは無関係に、試験を行った全ての細胞株に同等に結合した。これらの抗体は、親ｍｕＭＮＡＣＥＰと比較してより効率的に結合するように思われた。ＨｕＭＮＡＣＷＯは、表面受容体密度の高い細胞株ＰＣ１２−ｈＴｒｋＡのみに結合した。

実施例３
ＴＦ１細胞における増殖検定によるヒト化抗体のインビトロ生物学的活性の比較
細胞表面ＴｒｋＡ−β−ＮＧＦ媒介生物学的活性に対する抗ヒトＴｒｋＡモノクローナル抗体の阻害能力を測定するために、因子依存性ヒト赤白血病細胞株ＴＦ−１を使用した細胞増殖検定（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４０：３２３−３３４）を行った。

ＴＦ１細胞を、フラットな９６ウェル培養プレート上において３７℃で０．５時間にわたって様々な濃度の抗体と共に培養した。

上記前培養期間の終了後、組替えヒトβＮＧＦ（ｒｅｃ−ｈｕ−β−ＮＧＦ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を細胞抗体混合物に添加した。

異なる濃度の抗体、５．０ｎｇ／ｍＬのヒトβ−ＮＧＦ及び５×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのＴＦ１細胞を含む、２００μＬの検定混合物を加湿ＣＯ_２インキュベーター内において３７℃で５日間培養した。

次に、プレートを遠心分離し、上清を除去した後に細胞を溶解させるために−８０℃で凍結した。

ＣｙＱＵＡＮＴ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を取扱説明書に従って細胞増殖測定に使用した。

実験は２回行った。

結果
マウスＭＮＡＣ１３抗体（ｍｕＭＮＡＣＥＰ）、ｃｈｉｍＭＮＡＣ１３、ＨｕＭＮＡＣＷＯ及びＨｕｍａｎ ＩｇＧ１（標準対照）を使用して各ヒト化侯補について平行して検定を行った（図５）。

各曲線についてＩＣ５０を算出した。結果を表３に示す。

抗体ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１が侯補の中の最も良好であることが分かった。

抗体ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１の重鎖及び軽鎖を図６に示す。

一連の実験におけるマウスＭＮＡＣ１３に対する平均ＩＣ５０は０．５４±０．４７μｇ／ｍＬだった。

実施例４
表面プラズモン共鳴分析
表面プラズモン共鳴分析により、ＢＩＡＣＯＲＥ ２０００（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、スウェーデン・ウプサラ）を使用してＴｒｋＡ−ＩｇＧに対する各抗体（マウス、キメラ、５つのヒト化変異体）の結合反応速度の会合及び解離速度定数を測定した。製造者の試験条件に従ってＴｒｋＡ−ＩｇＧをＣＭ−５センサーチップに固定した（固定密度：１１００ＲＵ）。２０〜０．６３μｇ／ｍｌの抗体濃度範囲で各抗体試料を分析した。ＢＩＡ評価バージョン３（１９９９）ソフトウェアを使用してセンソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）から計算を行った。

ＢＩＡ評価バージョン３（１９９９）ソフトウェアを使用して各組のセンソグラムから分析を行った。反応速度データに適合するように試験を行ったモデルのうち、「ｓｅｐａｒａｔｅｄ １：１」アルゴリズムが最適だった。このモデルでは、初期の会合及び解離曲線の所定の範囲のみを計算に使用した。曲線の初期段階では、物質移動又は再結合等のオーバーレイ作用は計算に影響を与えない。

結果
各抗体について解離定数（ＫＤ）を決定した。結果を表４に示す。

Ｋ_Ｄ値（Ｍ）は、特定のタンパク質上の結合部位が半分占有されるリガンド濃度に対応する。Ｋ_Ｄ値が低い程、リガンドはより強固に結合しているか、リガンドとタンパク質（ここでは抗原と抗体）の親和性がより高いことを示す。

表４に示すように、マウス及びキメラアイソフォームについて算出したＫ_Ｄ値は非常に似通っていた。

それらは、僅かに低いが、ヒト化変異体ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１及びＢＸｈＶＨ５ＶＬ３と同レベルだった。

一方、ヒト化変異体ＨｕＭＮＡＣＷＯｖ及びＢＸｈＶＨ３ＶＬ３は、マウス及びキメラ変異体について得られたＫ_Ｄ値よりも一桁高いＫ_Ｄ値を示した。

それでも、Ｋ_Ｄ値は従来のヒト化抗体ＨｕＭＮＡＣＷＯよりも低かった。

このモデルを使用した本発明の抗体／変異体の好ましいＫ_Ｄ値は４．１８×１０^−８未満である（従って、従来のヒト化抗体ＨｕＭＮＡＣＷＯよりも低い）。

より好ましくは、Ｋ_Ｄ値は２．４８×１０^−９未満である（従って、同じフレームワーク領域を有するが、重鎖の第３のＣＤＲが異なるＨｕＭＮＡＣＷＯの変異体であるＨｕＭＮＡＣＷＯｖよりも低い）。

最も好ましくは、Ｋ_Ｄ値は１×１０^−９未満である（従って、マウス及びキメラアイソフォームと同桁）。

「ｓｅｐａｒａｔｅｄ」アルゴリズムを使用して算出したデータに基づく表４に示す順位は、重ね合わせプロットにおける全ての変異体のセンソグラムの目視検査によって得られた順位を非常によく反映している。

実施例５
ＨＭＣ−１肥満細胞株におけるケモカイン分泌分析によるヒト化抗体のインビトロ生物学的活性の比較
ＮＧＦは炎症性疼痛において重要な媒介物質として機能し、末梢及び中枢性感作の両方に関与する。末梢性侵害受容器の感作は非常に急速である場合があり、肥満細胞等の非神経性細胞が関与する。

β−ＮＧＦ誘発ＭＩＰ１α分泌に対する抗ヒトＴｒｋＡモノクローナル抗体の阻害能力を測定するために、肥満細胞株ＨＭＣ−１を使用した生物学的検定（Ａｈａｍｅｄ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４ Ｊｕｎ １；１７２（１１）：６９６１−８．）を行った。

ＨＭＣ−１細胞（０．１×１０^６／ｗｅｌｌ）（３倍）を、フラットな９６ウェル培地内の完全成長培地に添加し、３７℃で０．５時間にわたって様々な濃度の抗体と共に培養した。

上記前培養期間の終了後、組替えヒトβ−ＮＧＦ（ｒｅｃ−ｈｕ−β−ＮＧＦ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を細胞抗体混合物に添加し（最終濃度：５０ｎｇ／ｍＬ）、加湿ＣＯ_２インキュベーター内において３７℃で６時間培養した。

上清を回収し、ＤｕｏＳｅｔ（登録商標）Ｅｌｉｓａ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ ＣＣＬ４／ＭＩＰ１−ｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＹ２７１）を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡによってＭＩＰ−１ｂ濃度を定量した。

得られたデータは％応答で示し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアにより、非線形回帰分析（ｌｏｇ（阻害剤）ｖｓ．正規化応答−可変勾配式（ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｌｏｐｅ ｅｑｕａｔｉｏｎ））を使用して分析した。

結果
ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ Ｎ２９７Ａ抗体について、マウスｍｕＭＮＡＣＥＰ、ＨｕＭＮＡＣＷＯ及びＨｕｍａｎ ＩｇＧ１（標準対照）と平行して検定を行った。各曲線についてＩＣ５０を算出した。結果を図９に示す。ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ Ｎ２９７Ａの阻害活性はヒト化抗体ＨｕＭＮＡＣＷＯよりも有意に高かった。

実施例６
ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ Ｎ２９７Ａ及びＢＸｈＶＨ５ＶＬ１のインビトロ特性分析
ＴＨＰ−１細胞上の細胞ＦｃＲｓへの結合の評価
ヒト急性単球性白血病細胞株ＴＨＰ１（ＡＴＣＣ）を、ＲＰＭＩ１６４０／ＧＬＵＴＡＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１０％胎児ウシ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ内において培養し、２〜９×１００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬに維持した。

培養物から細胞を採取し、単一細胞懸濁液を調製した。０．３〜０．４×１０^６ｃｅｌｌｓ／試料を９６ウェル丸底組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）に添加し、冷却したＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。

３５０ｘｇで５分間遠心分離した後、上清を捨て、プレートを氷上に置いた。ＦＡＣＳ緩衝液内においてＩｇＧ単量体を４℃で３０分間培養（３０μｇ／ｍＬから０．０２μｇ／ｍＬ（希釈１：３）、総量：１００μＬ）することによってＴＨＰ−１細胞上のＦｃγＲｓにＩｇＧを結合させた。

細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に添加したロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｒ−フィコエリトリン（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｃａｔ． ＃７０９−１１６−１４９）（１：１００）１００μＬを添加することによってＩｇＧの結合を検出した。穏やかにボルテックスした後、細胞を４℃で３０分間培養した。

プレートを２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、細胞を再懸濁させ、０．５ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液に添加し、フローサイトメータを使用してデータを得た。

結果
図１０は、先行技術の開示（米国特許第５，６２４，８２１号、Ｗｉｎｔｅｒ）に基づいて予想されたように、変異アイソフォームＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ Ｎ２９７Ａは細胞Ｆｃ受容体に対する有意な結合能を有していなかった。

実施例７
インビボ実験
本発明の抗体／誘導体をさらに評価するために行ったインビボ実験について以下に記載する。

ＮＧＦ媒介疼痛モデル
神経成長因子（ＮＧＦ）及びその受容体ＴｒｋＡは、炎症性疼痛に特有な痛覚の重要な媒介物質である。

ＮＧＦは感覚及び交感神経ニューロンの発生的生存因子として知られているが、成体動物の末梢において合成され、感覚性ニューロンの細胞体に逆行的に輸送される（Ｈｅｎｄｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９７４，Ｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ，１９８０）。

炎症及び神経損傷により、一次求心性線維を刺激し、行動性感作を引き起こすＮＧＦが放出される。ラットにおけるＮＧＦによる皮下慢性治療では痛覚過敏が生じ、局所皮膚感覚が変化する（Ｌｅｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ａｎｄｒｅｅｖ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。

ｒｈＮＧＦをヒト前腕及び咬筋に皮内注射すると、痛覚過敏及び異痛が生じ、注射後３時間で開始し、１〜７日目でピークに達し、２１日目に回復する局所皮膚感覚の変化が生じる（Ｄｙｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。

従って、ＮＧＦによって特異的に発生する行動性感作のモデルとして、ラットの後足にｒｈＮＧＦを注射した。

本実験は２つの異なるプロトコルからなる。
１．最初に、ラットの足への組替えヒト（ｒｈ）ＮＧＦの皮内注射が、痛覚過敏の標準的な侵害受容試験で測定される行動性感作を引き起こすか否かを調べた（Ｈａｒｇｒｅａｖｅの足裏試験）。次に、１００ｇのマウスＩｇＧ、ｍｕＭＮＡＣＥＰ、ヒトＩｇＧ及びＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ Ｎ２９７Ａ抗体の皮内同時投与によってｒｈＮＧＦ誘発感作が影響を受けるか否かを調べた。マウスＩｇＧ１及びヒトＩｇＧ抗体を陰性対照として適当な投与量で使用した。

２．次に、ｍｕＭＮＡＣＥＰ抗体（８、１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）及びＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ Ｎ２９７Ａ（８、３、１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）による全身前治療によって末梢性誘発ｒｈＮＧＦ感作が影響を受けるか否かを調べた。

局所的投与を行う第１のプロトコルでは、雄のＬｅｗｉｓラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、５〜６週齢、２００ｇ）を４群（１群当たり８〜９匹）に分け、上記方法に従って注射を行った。注射はブラインドで行った。治療の概要を以下の表に示す。

足へのｒｈＮＧＦの注射を行う２４時間前に全身投与（腹腔内）を行う第２のプロトコルでは、雄のＬｅｗｉｓラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、５〜６週齢、２００ｇ）を１０群（１群当たり１０〜１２匹）に分けた。注射はブラインドで行った。治療の概要を以下の表に示す。

検定
全てのラットに番号を付け、実験を開始する前の２４〜４８時間にわたって試験手順に慣れさせた。行動は痛覚過敏の尺度としての足裏試験に対する足引き戻し時間（足を引っ込めるまでの時間）で調べた。

ベースライン記録を取り、足引き戻し時間とした。時点０においてｒｈＮＧＦの皮内注射によって侵害性感受性を誘発し、ｒｈＮＧＦの注射後３０分、１時間、２時間、２４時間、４８時間の時点で行動侵害性感受性をモニターした。投与は以下のようにブラインドで行った。
プロトコル１：時点０での皮内注射による治療投与
プロトコル２：後足にｒｈＮＧＦを注射する２４時間前の１回の全身投与（腹腔内）による治療投与
薬物療法を行う前に、ベースライン足裏及びフォンフライ試験を行った。

ｒｈＮＧＦ注射後３０分、１時間、２時間、２４時間、４８時間の時点で痛覚過敏測定を行った。後足の同側（右足、ｒｈＮＧＦを注射）及び対側（左足、注射していない）について３〜４回記録した。

各投与群の動物のデータを照合し、同側及び対側の応答について平均値と標準偏差を算出した。

痛覚過敏の存在は、対照となる対側の足（対応のあるｔ−検定）及び前注射／前治療ベースライン（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）と比較した場合の、ｒｈＮＧＦを注入した後足の足引き戻し時間（秒）の有意な減少によって示される。

皮内抗痛覚過敏有効性
ＮＧＦ誘発痛覚過敏のモデルにおける皮内注射によるＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ Ｎ２９７Ａ（図１１）及びｍｕＭＮＡＣＥＰ（図１２）（並びに相対対照としてのｍＩｇＧ_１及びｈＩｇＧ）の抗痛覚過敏有効性を比較した。

ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ Ｎ２９７Ａ及びｍｕＭＮＡＣＥＰをｒｈＮＧＦと共に注射した場合には、同側と対側の足後退応答（図１１及び図１２）の有意差がなかったことに示されるように、痛覚過敏の有意な発生は見られなかった。

陰性対照（ｍＩｇＧ_１、ｈＩｇＧ）の同時投与後は、同側の足応答において痛覚過敏が常に存在していた。

データは、各治療（矢印）による５００ｎｇのｒｈＮＧＦの皮内注射の前（ベースライン）後の平均±９５％ＣＩとして示す。対側の足後退と比較した場合の同側の足引き戻し時間の有意な減少は「＊」及び「＊＊」（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、対応のあるｔ−検定）によって示す。

全身抗痛覚過敏有効性
ＮＧＦ誘発痛覚過敏のモデルにおける全身投与によるＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ Ｎ２９７Ａ、ｍｕＭＮＡＣＥＰ ｍＩｇＧ１及びｈＩｇＧの抗痛覚過敏有効性を比較した。

３種類の投与量（１、３、８ｍｇ／ｋｇ）のＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ Ｎ２９７Ａと対照ｈＩｇＧの試験を行った（図１３）。同様に、２種類の投与量（１、８ｍｇ／ｋｇ）のｍｕＭＮＡＣＥＰとｍＩｇＧ１の試験を行った（図１４）。全ての場合において、ｒｈＮＧＦの皮内注射の２４時間前に腹腔内投与を行った。

８ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇのＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ Ｎ２９７Ａによる全身前治療により、同側と対側の足後退応答（図１３）の有意差がなかったことに示されるように、ｒｈＮＧＦ注射後の痛覚過敏の発生が有意に防止された。

マウス親抗体ｍＭＮＡＣＥＰ（８ｍｇ／ｋｇ）の全身前治療でもｒｈＮＧＦ誘発痛覚過敏の発生は有意に防止された（図１４）。しかしながら、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ Ｎ２９７Ａの総合的な鎮痛反応はｍＭＮＡＣＥＰ抗体と比較してより良好なように思われた。

同じ投与量では、陰性対照（ｍＩｇＧ１、ｈＩｇＧ）の同時投与後は、同側の足応答において痛覚過敏が常に存在していた。

データは、各治療（矢印）による５００ｎｇのｒｈＮＧＦの皮内注射の前（ベースライン）後の平均±９５％ＣＩとして示す。対側の足後退と比較した場合の同側の足引き戻し時間の有意な減少は「＊」及び「＊＊」（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、対応のあるｔ−検定）によって示す。

実施例８
本発明の抗体／誘導体をさらに評価するために行った別のインビボ実験について以下に記載する。

ホルマリン試験
抗体／誘導体をマウスに腹腔内前注射した。１８時間後、５％ホルマリンを右の足蹠に注射した。なめ時間（負傷した足をなめた時間）を１時間まで測定した。

慢性絞扼損傷試験
神経障害性異痛を引き起こすために、マウスの坐骨神経を外科的に絞扼した。その後、抗体／誘導体を投与し、対側肢と比較した場合の、外傷肢への局部的な機械的刺激に対する後退応答を測定した。

関節炎モデル
ラットの尾の付け根に完全フロイントアジュバントを皮内注射した。約３週間後、ラットは関節痛を特徴とする全身性多発関節炎を発症した。ラットに抗体／誘導体を投与し、関節を穏やかに動かした場合の発声強度を測定する発声検定によって鎮痛作用を評価した。

サルカラゲナン誘発疼痛モデル
アカゲザルに抗体／誘導体を静脈内投与（前投与）した。翌日、アカゲザルの尾にカラゲナンを皮下注射した。熱刺激に対する引き戻し時間を測定した。

全般的事項
文脈によってその他の解釈がなされない限りにおいて、以下の全般的事項が適用される。
１）上述した参考文献の開示内容は、上記参照によって本願に援用するものとする。
２）「含む」という用語は非限定的であり、「有する」及び「からなる」を含む。従って、「含む」という用語は、記載された実体、ステップ、複数の実体又は複数のステップが含まれることを意味し、その他の実体、ステップ、複数の実体又は複数のステップが排除されることを意味するものではない。
３）具体的に記載されていない場合であっても、本発明の態様の均等物は、本発明の範囲に含まれる。

Claims (40)

1. 以下の軽鎖及び重鎖の組み合わせの一種を含む、抗ＴｒｋＡ抗体。
   ＢＸｈＶＨ３ＶＬ３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９）、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７）、又はＢＸｈＶＨ５ＶＬ３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９）
2. 請求項１において、ＴｒｋＡに対してＴｒｋＢよりも高い親和性で結合する抗体。
3. 請求項１又は請求項２において、ＴｒｋＡ受容体へのＮＧＦの結合を阻害又は減少させることができる抗体。
4. 請求項１ないし請求項３のいずれか１項において、ＴｒｋＡ受容体へのＮＧＦの結合によって誘起され得る１以上の生物学的活性を阻害又は減少させることができる抗体。
5. 請求項１ないし請求項４のいずれか１項において、非齧歯動物に由来する定常領域を含む抗体。
6. 請求項１ないし請求項５のいずれか１項において、ヒト定常領域又はヒト定常領域と少なくとも７５％の配列相同性を有する定常領域を含む抗体。
7. 請求項１ないし請求項６のいずれか１項において、ヒトＩｇＧ定常領域又はヒトＩｇＧ定常領域と少なくとも７５％の配列相同性を有する定常領域を含む抗体。
8. 請求項１ないし請求項７のいずれか１項において、図２に示されるＴｒｋＡ−ＩｇＧ結合検定において０．１を超えるＯＤ４５０／６３０ｎｍ値を有する抗体。
9. 請求項１ないし請求項８のいずれか１項において、ＦＡＣＳ検定においてＴＦ１細胞のＦＡＣＳ染色を１倍を超えて増加させる抗体。
10. 請求項１ないし請求項９のいずれか１項において、ＴｒｋＡ−ＩｇＧへの結合について４．１８×１０^−８Ｍ未満のＫ_Ｄ値を有する抗体。
11. 請求項１ないし請求項１０のいずれか１項において、少なくとも１つの鎖の可変領域の全フレームワーク領域について測定した場合に、アミノ酸配列において少なくとも９０％がヒト化された抗体。
12. 請求項１ないし請求項１１のいずれか１項において、少なくとも１つの鎖の可変領域の全フレームワーク領域について測定した場合に、アミノ酸配列において少なくとも９５％がヒト化された抗体。
13. 請求項１１又は請求項１２において、軽鎖及び重鎖の両方のフレームワーク領域について測定した場合に、前記アミノ酸配列において少なくとも９０％がヒト化された抗体。
14. 以下のいずれかである、請求項１ないし請求項１３のいずれか１項に記載の抗体の誘導体。
    ａ）前記抗体のフラグメント
    ｂ）フラグメント多量体
    ｃ）前記抗体、フラグメント又はフラグメント多量体と、診断物質、治療物質、標識物質、産物の半衰期を増加させる物質、及びヒト宿主における免疫原性を減少させる物質から選択されるいずれかの物質の部位との融合産物。
15. 請求項１４において、前記誘導体が前記融合産物である誘導体。
16. 請求項１５において、前記治療物質が細胞毒である誘導体。
17. 請求項１ないし請求項１６のいずれか１項において、ＰＥＧ化されている抗体又は誘導体。
18. 請求項１ないし請求項１７のいずれか１項において、固定されている抗体又は誘導体。
19. 請求項１ないし請求項１８のいずれか１項において、医学に使用される抗体又は誘導体。
20. 請求項１ないし請求項１８のいずれか１項において、痛みの治療に使用される抗体又は誘導体。
21. 請求項１ないし請求項１８のいずれか１項において、慢性の痛みの治療に使用される抗体又は誘導体。
22. 請求項１ないし請求項１８のいずれか１項において、急性の痛みの治療に使用される抗体又は誘導体。
23. 請求項１ないし請求項１８のいずれか１項において、膵臓炎、腎石、子宮内膜症、ＩＢＤ、クローン病、術後癒着、胆嚢結石症、頭痛、月経困難症、筋骨格痛、捻挫、内臓痛、卵巣嚢腫、前立腺炎、膀胱炎、間質性膀胱炎、術後痛、片頭痛、三叉神経痛、火傷及び／又は創傷の痛み、損傷に関連する痛み、神経性疼痛、筋骨格疾患に関連する痛み、関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎、関節周囲の病理、腫瘍による痛み、骨転移の痛み、ＨＩＶ感染の１以上に関連する痛みの治療に使用される抗体又は誘導体。
24. 請求項１ないし請求項１８のいずれか１項において、癌、神経障害、アルツハイマー病、糖尿病、ウイルス性障害、ＨＩＶ媒介性障害、ハンセン病、又は炎症性障害の治療に使用される抗体又は誘導体。
25. 請求項２０ないし請求項２４のいずれか１項において、前記治療が抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）の治療を含む抗体又は誘導体。
26. 請求項１ないし請求項１８のいずれか１項に記載の抗体又は誘導体と、医療における同時、連続又は協調投与のための鎮痛剤と、の組合せ。
27. 請求項１ないし請求項１８のいずれか１項に記載の抗体又は誘導体と、医療における同時、連続又は協調投与のためのＮＧＦと、の組合せ。
28. 請求項１ないし請求項１８のいずれか１項に記載の抗体又は誘導体と、医療における同時、連続又は協調投与のための抗ＴｒｋＡ抗体又はその誘導体と、の組合せ。
29. 請求項１ないし請求項１８のいずれか１項に記載の抗体又は誘導体と、製薬学的に許容し得る担体又は賦形剤と、を含むことを特徴とする、医薬組成物。
30. 請求項１ないし請求項２９のいずれか１項に記載の抗体と、別の薬学的活性物質と、を含むことを特徴とする、医薬組成物。
31. 請求項３０において、前記別の物質が以下の１以上である医薬組成物。
    ａ）鎮痛薬
    ｂ）別の抗ＴｒｋＡ抗体又は誘導体
    ｃ）ＮＧＦ
    ｄ）抗癌剤
32. 請求項１ないし請求項１８のいずれか１項において、診断又は予後に使用される抗体又は誘導体。
33. 請求項２０ないし請求項２４のいずれか１項に記載の疾患又は障害の診断又は予後に使用するための抗体又は誘導体。
34. 請求項１ないし請求項１８のいずれか１項に記載の抗体又は誘導体の可変軽鎖及び可変重鎖を含むポリペプチド。
35. 請求項３４において、１以上のヒト定常領域を含むポリペプチド。
36. 請求項１ないし請求項１５のいずれか１項に記載の抗体若しくは誘導体又は請求項３４または請求項３５に記載のポリペプチドをコードする核酸。
37. 請求項３６に記載の核酸を含むベクター。
38. 請求項１ないし請求項１８のいずれか１項に記載の抗体若しくは誘導体又は請求項３４または請求項３５に記載のポリペプチドを発現する発現系若しくはそのような発現を行うように誘発することができる発現系。
39. 請求項１ないし請求項１８のいずれか１項に記載の抗体若しくは誘導体又は請求項３４
    または請求項３５に記載のポリペプチドを発現する非ヒト遺伝子組換え哺乳動物若しくはそのような発現を行うように誘発することができる非ヒト遺伝子組換え哺乳動物。
40. 請求項１ないし請求項１８のいずれか１項に記載の抗体又は誘導体と、被投与者による鎮痛剤としての使用を指示する説明書と、を含むキット。