CN114516917B - 人源化抗TrkA的抗体及其应用 - Google Patents

人源化抗TrkA的抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114516917B
CN114516917B CN202111365634.3A CN202111365634A CN114516917B CN 114516917 B CN114516917 B CN 114516917B CN 202111365634 A CN202111365634 A CN 202111365634A CN 114516917 B CN114516917 B CN 114516917B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
val
thr
gly
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111365634.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114516917A (zh
Inventor
任志衡
董军纪
何转娣
王克柱
卢杰联
林树珊
刘亮
李想
张阔
蒋燕
李晓平
陈小锋
李文佳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong HEC Pharmaceutical
Original Assignee
Sunshine Lake Pharma Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sunshine Lake Pharma Co Ltd filed Critical Sunshine Lake Pharma Co Ltd
Publication of CN114516917A publication Critical patent/CN114516917A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114516917B publication Critical patent/CN114516917B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)

Abstract

本发明提出了一种能够特异性识别TrkA的人源化抗体或其抗原结合片段及其用途。该抗体具有SEQ ID NO：2‑8任一项所示氨基酸序列的重链可变区，SEQ ID NO：10～13任一项所示氨基酸序列的轻链可变区。根据本发明实施例的上述抗体能够特异性的靶向结合TrkA受体，阻断NGF和TrkA结合。

Description

人源化抗TrkA的抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及人源化抗TrkA的抗体及其应用，更具体地，本发明涉及能够特异性识别TrkA的人源化抗体或其抗原结合片段、核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物、制药用途以及检测TrkA的试剂盒。
背景技术
目前临床上对于轻至中度疼痛，主要使用非阿片类镇痛药，如非甾体类抗炎药(NSAIDs)；对于中至重度疼痛，主要使用阿片类镇痛药。然而，NSAIDs存在“封顶效应”，阿片仅能使不到30％的非肿瘤性慢性疼痛得到有效缓解，20％的癌痛患者存在阿片类药物耐药。此外，NSAIDs存在胃肠道和心血管安全性隐患，长期用药过程中尤其明显。对于阿片类镇痛药，多年的药物改进实验未能有效的降低其成瘾性和其它诸多副作用，患者期许新的更安全有效的药物。
神经生长因子(NGF，nerve growth factor)参与疼痛的病理生理过程，主要通过结合高亲和力的酪氨酸激酶(tyrosine-nase，TrkA)受体激活NGF/TrKA信号通路，影响炎症介质的释放、离子通道的开放以及促进神经纤维的生长，从而参与疼痛的发生，传导以及增敏过程。研究表明，阻断NGF-TrkA信号通路可以有效的缓解疼痛和痛觉过敏，NGF-TrkA信号通路是开发新型镇痛药物的有效靶点。然而NGF可能具有多种不期望的激动剂特性。通过TrkA单克隆抗体选择性的靶向结合TrkA受体，不仅可以阻断NGF对TrkA信号通路的激活，有效的抑制疼痛信号的传递，又不会发生像使用抗NGF抗体过度中和NGF所带来的骨关节坏死等不可预测的毒副作用。因此，针对NGF-TrkA靶点的靶向TrkA的镇痛药物，可能代表一种更好的治疗选择。
在人类中动物来源的单克隆抗体的治疗性和诊断性应用具有基本禁忌征候，特别是对于必需重复给药的治疗方案。具体地，鼠单克隆抗体具有相对短的半衰期，并且当用于人类时，缺乏一些免疫球蛋白的基本功能特性，如补体依赖性细胞毒性和细胞介导的细胞毒性。另外，如果注射入患者体内的话，非人源的单克隆抗体包含免疫原性氨基酸序列。尽管所谓嵌合性抗体(可变的鼠区域连接到人源的恒定区)已经产生了一些阳性结果，但仍然会存在免疫原性问题。
发明内容
本申请是基于发明人对下列问题和事实的发现而提出的：
NGF-TrkA信号通路作为开发新型镇痛药物的有效靶点，如果通过TrkA单克隆抗体选择性的靶向结合TrkA受体，不仅可以阻断NGF对TrkA信号通路的激活，有效的抑制疼痛信号的传递，又不会发生像使用抗NGF抗体过度中和NGF所带来的骨关节坏死等不可预测的毒副作用。但由于TrkA分子是受体膜蛋白，筛选阻断型抗TrkA单克隆抗体的难度比较大，其次，设计阻断TrkA受体抗体存在由于抗体介导免疫反应导致的安全性风险，因此，设计开发针对TrkA的单克隆抗体难度比较大。
本申请的发明人前期不仅成功地筛选到了一种新型的具有长效镇痛作用的抗TrkA单克隆抗体，更重要的是，发明人将筛选出来的鼠源抗TrKA单克隆抗体经人源化改造成了人源化单克隆抗体。具体地，将杂交瘤技术筛选得到的鼠源抗TrKA单克隆抗体的FR区和恒定区替换为人源的，保留鼠源抗TrKA单克隆抗体可变区的CDR，得到了一系列的抗TrkA的人源化单克隆抗体。发明人发现，本申请所获得的这些人源化抗体候选物，具有和人鼠嵌合抗TrkA单克隆抗体23E12基本一致的体内外活性，不仅能够特异性的靶向结合TrkA受体，阻断NGF和TrkA结合，有效的抑制疼痛，而且相比于人鼠嵌合抗TrkA单克隆抗体具有更低的免疫原性以及更优的药代动力学参数。
其中，人鼠嵌合抗TrkA单克隆抗体23E12具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的重链可变区VH0，和SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的轻链可变区VL0。
在本发明的的第一方面，本发明提出了一种能够特异性识别TrkA的人源化抗体或其抗原结合片段。根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段具有重链可变区，其包含SEQ ID NO:41所示的VH-CDR1、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43所示的VH-CDR2和SEQ IDNO:44所示的VH-CDR3；和
轻链可变区，其包含SEQ ID NO:45所示的VL-CDR1、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47所示的所示的VL-CDR2和SEQ ID NO:48所示的VL-CDR3。
GYAFTNYWLG(SEQ ID NO:41)。
DFYPRTGNTF(SEQ ID NO:42)。
GFYPRTGNTF(SEQ ID NO:43)。
ARAGTGFDY(SEQ ID NO:44)。
ENVGGYVS(SEQ ID NO:45)。
GASSRHT(SEQ ID NO:46)。
GASSRAT(SEQ ID NO:47)。
NYIYPFT(SEQ ID NO:48)。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段具有重链可变区，其包含SEQID NO:41所示的VH-CDR1、SEQ ID NO:42所示的VH-CDR2和SEQ ID NO:44所示的VH-CDR3；和
轻链可变区，其包含SEQ ID NO:45所示的VL-CDR1、SEQ ID NO:46所示的所示的VL-CDR2和SEQ ID NO:48所示的VL-CDR3。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段具有重链可变区，其包含SEQID NO:41所示的VH-CDR1、SEQ ID NO:43所示的VH-CDR2和SEQ ID NO:44所示的VH-CDR3；和
轻链可变区，其包含SEQ ID NO:45所示的VL-CDR1、SEQ ID NO:46所示的所示的VL-CDR2和SEQ ID NO:48所示的VL-CDR3。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段具有重链可变区，其包含SEQID NO:41所示的VH-CDR1、SEQ ID NO:42所示的VH-CDR2和SEQ ID NO:44所示的VH-CDR3；和
轻链可变区，其包含SEQ ID NO:45所示的VL-CDR1、SEQ ID NO:47所示的所示的VL-CDR2和SEQ ID NO:48所示的VL-CDR3。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段具有重链可变区，其包含SEQID NO:41所示的VH-CDR1、SEQ ID NO:43所示的VH-CDR2和SEQ ID NO:44所示的VH-CDR3；和
轻链可变区，其包含SEQ ID NO:45所示的VL-CDR1、SEQ ID NO:47所示的所示的VL-CDR2和SEQ ID NO:48所示的VL-CDR3。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段具有SEQ ID NO：2-8任一项所示氨基酸序列的重链可变区，和SEQ ID NO：10～13任一项所示氨基酸序列的轻链可变区。在本申请中，所述可变区包含鼠源的CDR和人源的框架区。
在本申请中，SEQ ID NO：2-8依次被称为VH1-VH7。SEQ ID NO：10～13依次被称为VL1-VL4。
VH0:QVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWMKQRPGHGLEWIGDFYPRTGNTFYNENFKGKVTLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYLCARAGTGFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:1)。
VH1:EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCKASGYAFTNYWLGWMKQRPGHGLEWIGDFYPRTGNTFYNENFKGKVTLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYLCARAGTGFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:2)。
VH2:EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCKASGYAFTNYWLGWMKQRPGHGLEWIGGFYPRTGNTFYNENFKGKVTLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYLCARAGTGFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:3)。
VH3:EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCKASGYAFTNYWLGWMKQRPGHGLEWIGDFYPRTGNTFYNENFKGQVTMSVDKSITTAYLQWNSLKASDTAMYYCARAGTGFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:4)。
VH4:QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYAFTNYWLGWMKQRPGHGLEWIGDFYPRTGNTFYNENFKGQVTMSVDKSITTAYLQWNSLKASDTAMYYCARAGTGFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:5)。
VH5:QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYAFTNYWLGWMKQRPGHGLEWIGDFYPRTGNTFYNENFKGKVTITADKSITTAYMQLSSLKASDTAVYYCARAGTGFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:6)。
VH6:QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYAFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDFYPRTGNTFYNENFKGKVTITADKSITTAYMQLSSLKASDTAVYYCARAGTGFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:7)。
VH7:QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYAFTNYWLGWMKQRPGHGLEWIGDFYPRTGNTFYNENFKGKVTLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYLCARAGTGFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:8)。
VL0:SIVMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGGYVSWYQQKPDQSPKLLIYGASSRHTGVPDRFTGSGSETDFTLTISSVQAEDLAAYHCGQNYIYPFTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:9)。
VL1:EIVMTQSPATLSLSVGERVTLSCKASENVGGYVSWYQQKPDQSPKLLIYGASSRHTGVPDRFTGSGSETDFTLTISSVQAEDLAAYHCGQNYIYPFTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:10)。
VL2:EIVMTQSPATLSLSVGERVTLSCKASENVGGYVSWYQQKPDQSPKLLIYGASSRATGVPDRFTGSGSETDFTLTISSVQAEDLAAYHCGQNYIYPFTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:11)。
VL3:EIVMTQSPATLSLSVGERVTLSCKASENVGGYVSWYQQKPDQSPKLLIYGASSRHTGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYHCGQNYIYPFTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:12)。
VL4:EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASENVGGYVSWYQQKPDQSPKLLIYGASSRHTGVPDRFTGSGSETDFTLTISSVQAEDLAAYHCGQNYIYPFTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:13)。
其中，划线部分分别为重链可变区CDR序列和轻链可变区CDR序列。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段具有选自下述的重链可变区和轻链可变区：
(a)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的重链可变区和由SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的轻链可变区；
(b)由SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的重链可变区和由SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的轻链可变区；或
(c)由SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的重链可变区和由SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的轻链可变区。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别TrkA的胞外区。
根据本发明的实施例，所述抗体含有重链框架区序列和轻链框架区序列的至少之一，所述重链框架区序列和轻链框架区均来自于人源IgG抗体或其突变体。进而所述抗体的免疫原性可以得到有效降低。
根据本发明的实施例，所述抗体的轻链恒定区来自于人源的Kappa轻链恒定区；重链恒定区来自于人源IgG4的重链恒定区。
根据本发明的实施例，所述抗体的Fc区域与人源IgG4野生型的Fc相比具有S10P，F16A，L17A，R191K突变以及229K缺失突变。其中，上述氨基酸位置的定位是以人源IgG4野生型Fc序列SEQ ID NO:16所示氨基酸序列进行定位的，如S10P，是指SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的第10位S突变为P，依次类推。发明人发现，所述抗体的Fc区域具有上述突变以及缺失后，抗体的安全性、稳定性可以得到显著提高，抗体在体内的半衰期也显著延长。
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:16)。
根据本发明的实施例，所述抗体恒定区的全长序列如SEQ ID NO:14或15所示。
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:14)。
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:15)。
其中，上述SEQ ID NO:14所示的抗体恒定区的全长序列为IgG4轻链恒定区。上述SEQ ID NO:15所示的抗体恒定区的全长序列包括IgG4重链恒定区和Fc区，其中，IgG4重链恒定区序列为ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV，Fc区序列为ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG。
根据本发明的实施例，所述抗体具有SEQ ID NO:17～23任一项所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:24～27任一项所示氨基酸序列的轻链。在本申请中，SEQ ID NO：17～23依次被称为H1-H7。SEQ ID NO：24～27依次被称为L1-L4。另外，人鼠嵌合抗TrkA单克隆抗体23E12具有SEQ ID NO：28所示氨基酸序列的重链H0，和SEQ ID NO：29所示氨基酸序列的轻链L0。
H1:EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCKASGYAFTNYWLGWMKQRPGHGLEWIGDFYPRTGNTFYNENFKGKVTLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYLCARAGTGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQID NO:17)。
H2:EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCKASGYAFTNYWLGWMKQRPGHGLEWIGGFYPRTGNTFYNENFKGKVTLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYLCARAGTGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQID NO:18)。
H3:EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCKASGYAFTNYWLGWMKQRPGHGLEWIGDFYPRTGNTFYNENFKGQVTMSVDKSITTAYLQWNSLKASDTAMYYCARAGTGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQID NO:19)。
H4:QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYAFTNYWLGWMKQRPGHGLEWIGDFYPRTGNTFYNENFKGQVTMSVDKSITTAYLQWNSLKASDTAMYYCARAGTGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQID NO:20)。
H5:QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYAFTNYWLGWMKQRPGHGLEWIGDFYPRTGNTFYNENFKGKVTITADKSITTAYMQLSSLKASDTAVYYCARAGTGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQID NO:21)。
H6:QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYAFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDFYPRTGNTFYNENFKGKVTITADKSITTAYMQLSSLKASDTAVYYCARAGTGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQID NO:22)。
H7:QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYAFTNYWLGWMKQRPGHGLEWIGDFYPRTGNTFYNENFKGKVTLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYLCARAGTGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQID NO:23)。
L1:EIVMTQSPATLSLSVGERVTLSCKASENVGGYVSWYQQKPDQSPKLLIYGASSRHTGVPDRFTGSGSETDFTLTISSVQAEDLAAYHCGQNYIYPFTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:24)。
L2:EIVMTQSPATLSLSVGERVTLSCKASENVGGYVSWYQQKPDQSPKLLIYGASSRATGVPDRFTGSGSETDFTLTISSVQAEDLAAYHCGQNYIYPFTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:25)。
L3:EIVMTQSPATLSLSVGERVTLSCKASENVGGYVSWYQQKPDQSPKLLIYGASSRHTGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYHCGQNYIYPFTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:26)。
L4:EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASENVGGYVSWYQQKPDQSPKLLIYGASSRHTGVPDRFTGSGSETDFTLTISSVQAEDLAAYHCGQNYIYPFTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:27)。
H0:QVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWMKQRPGHGLEWIGDFYPRTGNTFYNENFKGKVTLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYLCARAGTGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQID NO:28)。
L0:SIVMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGGYVSWYQQKPDQSPKLLIYGASSRHTGVPDRFTGSGSETDFTLTISSVQAEDLAAYHCGQNYIYPFTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:29)。
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:49)。
上述SEQ ID NO:49所示的抗体恒定区的全长序列包括IgG1重链恒定区和Fc区，其中，IgG1重链恒定区序列为ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV，Fc区序列为EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
根据本发明的实施例，所述抗体具有所述抗体选自下述的重链和轻链：
(a)由SEQ ID NO：17所示氨基酸序列的重链和由SEQ ID NO：24所示氨基酸序列的轻链；
(b)由SEQ ID NO：19所示氨基酸序列的重链和由SEQ ID NO：24所示氨基酸序列的轻链；或
(c)由SEQ ID NO：19所示氨基酸序列的重链和由SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的轻链。
在本申请中，上述H1和L1所组成的具有IGHG4重链同型和Kappa同型轻链的人源化单克隆抗体被称为H1L1-IgG4，上述H3和L1所组成的具有IGHG4重链同型和Kappa同型轻链的抗体被称为H3L1-IgG4，上述H3和L2所组成的具有IGHG4重链同型和Kappa同型轻链的抗体被称为H3L2-IgG4，上述H1和L1所组成的具有IGHG1重链同型和Kappa同型轻链的人源化单克隆抗体被称为H1L1-IgG1。依次类推。
根据本发明的实施例，所述抗体为单链抗体、多聚体抗体、CDR移植抗体。
根据本发明的实施例，所述单链抗体包括SEQ ID NO:2-8任一项所示氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO:10-13任一项所示氨基酸序列的轻链可变区，其中所述重链可变区的C端通过连接肽linker与所述轻链可变区的N端相连，或所述轻链可变区的C端通过连接肽linker与所述重链可变区的N端相连。需要说明的是，本申请所述的单链抗体的“连接肽linker”为用于连接抗体重链可变区和轻链可变区的连接肽，其可为制备单链抗体的常用连接肽linker，也可为经过科研工作者改造后的连接肽Linker。在某些实施方式中，所述连接肽可以为富含G的多肽，例如，其可以选自(G)3-S(即“GGGS”)、(G)4-S(即“GGGGS”)和(G)5-S(即“GGGGGS”)，例如GGGGSGGGGSGGGGS。
根据本发明的实施例，所述抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、Fv、scFv-Fc融合蛋白、scFv-Fv融合蛋白以及最小识别单位的至少之一。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码前面所述的抗体或其抗原结合片段。根据本发明实施例的核酸分子所编码的抗体或抗原结合片段可特异性靶向结合TrkA，阻断NGF和TrkA的结合。
根据本发明的实施例，上述核酸分子还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述核酸分子为DNA。
根据本发明的实施例，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:30～36任一项所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:37～40任一项所示核苷酸序列。
GAGGTGCAGCTGCTGGAGTCTGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGCTCTCTGAAGCTGTCCTGCAA GGCCAGCGGCTACGCTTTCACCAACTATTGGCTGGGATGGATGAAGCAGAGGCCAGGACACGGACTGGAGTGGATC GGCGACTTTTACCCTCGGACCGGCAACACATTCTATAACGAGAACTTCAAGGGCAAGGTGACCCTGACAGCCGATA AGTCCAGCAATACCGCTTACATGCAGCTGTCTTCCCTGACATCCGAGGACTCCGCCGTGTACCTGTGCGCTAGGGC TGGAACCGGATTCGATTATTGGGGCCAGGGCACCACACTGACAGTGAGCTCTGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCCGGTCCACCTCCGAGTCCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAACCCGTTACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTTTAACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCCGCTGTGCTCCAGTCCTCCGGTTTATACTCTTTATCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTCGGCACCAAGACCTACACTTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGACCTCCTTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCTGGCGGACCCTCCGTGTTCCTCTTCCCCCCCAAACCCAAGGACACTTTAATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACTTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAAGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTCACCGTGCTGCATCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGACTGCCCAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCTCAAGTTTATACACTGCCCCCCAGCCAAGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTTTCTTTAACTTGTTTAGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAAAACAATTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGTTCTTTTTTTTTATACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTTGGCAAGAAGGCAACGTGTTCTCTTGTAGCGTGATGCACGAGGCTTTACACAACCACTACACCCAGAAGTCTTTATCTCTGTCTTTAGGC(SEQ ID NO:30)。
GAGGTGCAGCTGCTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAAGCTGAGCTGCAA GGCCAGCGGCTACGCCTTCACCAACTACTGGCTGGGCTGGATGAAGCAGAGGCCCGGCCACGGCCTGGAGTGGATC GGCGGCTTCTACCCCAGGACCGGCAACACCTTCTACAACGAGAACTTCAAGGGCAAGGTGACCCTGACCGCCGACA AGAGCAGCAACACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACCTGTGCGCCAGGGC CGGCACCGGCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCCGGTCCACCTCCGAGTCCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAACCCGTTACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTTTAACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCCGCTGTGCTCCAGTCCTCCGGTTTATACTCTTTATCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTCGGCACCAAGACCTACACTTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGACCTCCTTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCTGGCGGACCCTCCGTGTTCCTCTTCCCCCCCAAACCCAAGGACACTTTAATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACTTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAAGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTCACCGTGCTGCATCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGACTGCCCAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCTCAAGTTTATACACTGCCCCCCAGCCAAGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTTTCTTTAACTTGTTTAGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAAAACAATTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGTTCTTTTTTTTTATACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTTGGCAAGAAGGCAACGTGTTCTCTTGTAGCGTGATGCACGAGGCTTTACACAACCACTACACCCAGAAGTCTTTATCTCTGTCTTTAGGC(SEQ ID NO:31)。
GAGGTGCAGCTGCTGGAGTCCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGCTCTCTGAAGCTGTCCTGCAA GGCCAGCGGCTACGCTTTCACCAACTATTGGCTGGGATGGATGAAGCAGAGGCCAGGACACGGACTGGAGTGGATC GGCGACTTTTACCCTCGGACCGGCAATACATTCTATAACGAGAACTTCAAGGGCCAGGTGACAATGTCTGTGGATA AGTCCATCACCACAGCCTACCTGCAGTGGAACAGCCTGAAGGCCTCTGACACCGCTATGTACTATTGTGCCAGGGC TGGCACAGGCTTCGATTATTGGGGCCAGGGCACCACACTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCCGGTCCACCTCCGAGTCCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAACCCGTTACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTTTAACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCCGCTGTGCTCCAGTCCTCCGGTTTATACTCTTTATCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTCGGCACCAAGACCTACACTTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGACCTCCTTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCTGGCGGACCCTCCGTGTTCCTCTTCCCCCCCAAACCCAAGGACACTTTAATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACTTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAAGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTCACCGTGCTGCATCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGACTGCCCAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCTCAAGTTTATACACTGCCCCCCAGCCAAGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTTTCTTTAACTTGTTTAGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAAAACAATTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGTTCTTTTTTTTTATACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTTGGCAAGAAGGCAACGTGTTCTCTTGTAGCGTGATGCACGAGGCTTTACACAACCACTACACCCAGAAGTCTTTATCTCTGTCTTTAGGC(SEQ ID NO:32)。
CAAGTGCAACTGGTTCAATCTGGAGTGGAAGTTAAGAAGCCTGGTGCCAGCGTTAAAGTGAGTTGCAA AGCCAGCGGATATGCCTTTACCAACTATTGGCTGGGCTGGATGAAACAGAGGCCTGGCCATGGTCTGGAATGGATC GGAGACTTTTATCCACGCACCGGCAACACATTCTATAACGAGAACTTCAAAGGTCAGGTGACCATGTCCGTGGATA AGAGCATCACTACCGCTTACCTCCAGTGGAACAGTCTGAAGGCTTCTGACACCGCCATGTACTACTGCGCTAGGGC AGGCACCGGGTTCGACTACTGGGGTCAAGGGACCACCCTCACCGTGAGTAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCCGGTCCACCTCCGAGTCCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAACCCGTTACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTTTAACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCCGCTGTGCTCCAGTCCTCCGGTTTATACTCTTTATCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTCGGCACCAAGACCTACACTTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGACCTCCTTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCTGGCGGACCCTCCGTGTTCCTCTTCCCCCCCAAACCCAAGGACACTTTAATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACTTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAAGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTCACCGTGCTGCATCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGACTGCCCAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCTCAAGTTTATACACTGCCCCCCAGCCAAGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTTTCTTTAACTTGTTTAGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAAAACAATTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGTTCTTTTTTTTTATACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTTGGCAAGAAGGCAACGTGTTCTCTTGTAGCGTGATGCACGAGGCTTTACACAACCACTACACCCAGAAGTCTTTATCTCTGTCTTTAGGC(SEQ ID NO:33)。
CAAGTGCAGCTGGTTCAAAGTGGTGTTGAAGTTAAGAAGCCTGGAGCTAGTGTGAAGGTGTCCTGTAA GGCCTCCGGCTATGCCTTTACAAACTACTGGCTCGGGTGGATGAAGCAGCGCCCAGGACACGGTCTGGAATGGATT GGCGACTTTTACCCACGGACAGGAAATACATTCTATAATGAAAACTTCAAAGGCAAAGTGACCATCACAGCCGATA AGTCCATTACCACTGCATACATGCAGCTCAGTAGTCTCAAAGCTAGTGATACAGCAGTGTATTACTGCGCCAGGGC CGGCACCGGGTTCGACTACTGGGGGCAGGGAACCACCCTCACCGTGAGCTCTGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCCGGTCCACCTCCGAGTCCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAACCCGTTACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTTTAACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCCGCTGTGCTCCAGTCCTCCGGTTTATACTCTTTATCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTCGGCACCAAGACCTACACTTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGACCTCCTTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCTGGCGGACCCTCCGTGTTCCTCTTCCCCCCCAAACCCAAGGACACTTTAATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACTTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAAGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTCACCGTGCTGCATCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGACTGCCCAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCTCAAGTTTATACACTGCCCCCCAGCCAAGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTTTCTTTAACTTGTTTAGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAAAACAATTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGTTCTTTTTTTTTATACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTTGGCAAGAAGGCAACGTGTTCTCTTGTAGCGTGATGCACGAGGCTTTACACAACCACTACACCCAGAAGTCTTTATCTCTGTCTTTAGGC(SEQ ID NO:34)。
CAAGTCCAACTGGTTCAATCTGGCGTGGAAGTCAAGAAGCCCGGAGCCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAA GGCAAGCGGCTATGCATTCACTAACTACTGGCTCGGATGGGTGAAACAACGGCCAGGACATGGCCTGGAATGGATC GGCGACTTCTACCCTAGGACTGGCAACACTTTCTATAACGAGAACTTTAAGGGCAAGGTCACCATTACAGCTGATA AGAGTATCACTACCGCCTACATGCAGCTGTCTTCCCTGAAAGCTAGTGATACAGCCGTTTATTACTGTGCTCGGGC TGGCACAGGATTCGATTATTGGGGACAGGGTACCACACTCACAGTGTCCTCTGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCCGGTCCACCTCCGAGTCCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAACCCGTTACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTTTAACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCCGCTGTGCTCCAGTCCTCCGGTTTATACTCTTTATCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTCGGCACCAAGACCTACACTTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGACCTCCTTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCTGGCGGACCCTCCGTGTTCCTCTTCCCCCCCAAACCCAAGGACACTTTAATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACTTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAAGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTCACCGTGCTGCATCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGACTGCCCAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCTCAAGTTTATACACTGCCCCCCAGCCAAGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTTTCTTTAACTTGTTTAGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAAAACAATTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGTTCTTTTTTTTTATACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTTGGCAAGAAGGCAACGTGTTCTCTTGTAGCGTGATGCACGAGGCTTTACACAACCACTACACCCAGAAGTCTTTATCTCTGTCTTTAGGC(SEQ ID NO:35)。
CAAGTTCAGCTGGTGCAATCCGGTGTCGAGGTGAAGAAACCAGGCGCAAGCGTGAAAGTCTCCTGCAA GGCTTCTGGCTATGCCTTCACTAACTACTGGCTCGGCTGGATGAAGCAGAGGCCCGGACATGGGCTGGAGTGGATC GGAGACTTCTATCCCAGAACTGGAAACACCTTTTACAACGAGAATTTCAAGGGCAAGGTCACCCTGACTGCCGACA AATCCTCTAACACAGCTTACATGCAGCTGAGCAGTCTGACATCCGAAGACTCTGCAGTTTACCTGTGTGCTCGGGC AGGCACAGGCTTCGATTATTGGGGGCAAGGGACCACTCTGACTGTGTCTTCCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCCGGTCCACCTCCGAGTCCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAACCCGTTACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTTTAACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCCGCTGTGCTCCAGTCCTCCGGTTTATACTCTTTATCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTCGGCACCAAGACCTACACTTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGACCTCCTTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCTGGCGGACCCTCCGTGTTCCTCTTCCCCCCCAAACCCAAGGACACTTTAATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACTTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAAGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTCACCGTGCTGCATCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGACTGCCCAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCTCAAGTTTATACACTGCCCCCCAGCCAAGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTTTCTTTAACTTGTTTAGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAAAACAATTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGTTCTTTTTTTTTATACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTTGGCAAGAAGGCAACGTGTTCTCTTGTAGCGTGATGCACGAGGCTTTACACAACCACTACACCCAGAAGTCTTTATCTCTGTCTTTAGGC(SEQ ID NO:36)。
GAGATCGTGATGACCCAGTCCCCAGCCACACTGAGCCTGTCTGTGGGAGAGAGGGTGACCCTGTCTTG CAAGGCTTCCGAGAACGTGGGCGGCTACGTGAGCTGGTATCAGCAGAAGCCCGACCAGTCTCCTAAGCTGCTGATC TACGGAGCCTCCAGCAGGCACACAGGAGTGCCAGACCGGTTCACCGGATCCGGAAGCGAGACAGACTTCACCCTGA CAATCTCTTCCGTGCAGGCTGAGGATCTGGCCGCTTATCATTGTGGCCAGAATTACATCTATCCCTTCACCTTTGG CGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGCGGACCGTGGCTGCCCCCTCCGTGTTCATCTTCCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCTAGCGTGGTGTGTTTACTGAACAACTTCTACCCTCGTGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCTTTACAGTCCGGCAACTCCCAAGAATCCGTGACCGAGCAAGATTCCAAGGACTCCACCTACTCTTTATCCTCCACTTTAACTTTATCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAGGTGACCCATCAAGGTTTATCCTCCCCCGTGACCAAGTCCTTCAATCGTGGCGAGTGC(SEQ ID NO:37)。
GAGATCGTGATGACCCAGTCCCCAGCCACACTGAGCCTGTCTGTGGGAGAGAGGGTGACCCTGTCTTG CAAGGCTTCCGAGAACGTGGGCGGCTACGTGAGCTGGTATCAGCAGAAGCCCGACCAGTCTCCTAAGCTGCTGATC TACGGAGCCTCCAGCAGGGCTACAGGAGTGCCAGACCGGTTCACCGGATCCGGAAGCGAGACAGACTTCACCCTGACAATCTCTTCCGTGCAGGCCGAGGATCTGGCCGCTTATCACTGTGGCCAGAATTACATCTATCCCTTCACCTTTGG CGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGCGGACCGTGGCTGCCCCCTCCGTGTTCATCTTCCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCTAGCGTGGTGTGTTTACTGAACAACTTCTACCCTCGTGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCTTTACAGTCCGGCAACTCCCAAGAATCCGTGACCGAGCAAGATTCCAAGGACTCCACCTACTCTTTATCCTCCACTTTAACTTTATCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAGGTGACCCATCAAGGTTTATCCTCCCCCGTGACCAAGTCCTTCAATCGTGGCGAGTGC(SEQ ID NO:38)。
GAGATCGTGATGACCCAGAGCCCTGCCACACTGAGCCTGTCTGTGGGCGAGAGGGTGACCCTGTCCTG CAAGGCCTCCGAGAACGTGGGCGGCTACGTGTCTTGGTATCAGCAGAAGCCCGACCAGTCCCCTAAGCTGCTGATC TACGGAGCCTCCAGCAGGCACACCGGAGTGCCAGCTCGGTTCTCCGGAAGCGGATCTGGCACAGACTTTACCCTGA CAATCTCTTCCCTGGAGCCAGAGGATTTCGCCGTGTATCATTGTGGCCAGAATTACATCTATCCCTTCACCTTTGG CGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGCGGACCGTGGCTGCCCCCTCCGTGTTCATCTTCCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCTAGCGTGGTGTGTTTACTGAACAACTTCTACCCTCGTGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCTTTACAGTCCGGCAACTCCCAAGAATCCGTGACCGAGCAAGATTCCAAGGACTCCACCTACTCTTTATCCTCCACTTTAACTTTATCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAGGTGACCCATCAAGGTTTATCCTCCCCCGTGACCAAGTCCTTCAATCGTGGCGAGTGC(SEQ ID NO:39)。
GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCTGCTACTCTGTCCCTGTCTCCTGGTGAACGGGCCACTCTGAGCTG CAAGGCCAGTGAAAATGTGGGTGGCTATGTTAGCTGGTATCAGCAAAAGCCCGACCAGTCTCCCAAACTGCTGATC TACGGCGCTTCCAGTCGGCACACAGGCGTGCCAGATCGCTTTACTGGGAGCGGCTCTGAGACTGACTTCACACTGA CCATTAGCAGTGTCCAGGCCGAAGATCTCGCAGCCTATCATTGCGGCCAGAACTACATCTATCCATTCACCTTCGG TGGAGGAACCAAACTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCTGCCCCCTCCGTGTTCATCTTCCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCTAGCGTGGTGTGTTTACTGAACAACTTCTACCCTCGTGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCTTTACAGTCCGGCAACTCCCAAGAATCCGTGACCGAGCAAGATTCCAAGGACTCCACCTACTCTTTATCCTCCACTTTAACTTTATCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAGGTGACCCATCAAGGTTTATCCTCCCCCGTGACCAAGTCCTTCAATCGTGGCGAGTGC(SEQ ID NO:40)。
其中，上述SEQ ID NO:30～36所示核苷酸序列分别编码重链H1～H7，上述SEQ IDNO:37～40所示核苷酸序列分别编码轻链L1～L4。划线部分分别编码重链可变区VH1～VH7，以及轻链可变区VL1～VL4。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带前面所述的核酸分子。根据本发明实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前面所述的特异性识别TrkA的人源化抗体或其抗原结合片段表达，进而实现所述人源化抗体或抗原结合片段的体外大量获得。
根据本发明的实施例，上述表达载体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述表达载体为真核表达载体。进而实现前面所述的特异性识别TrkA的人源化抗体或其抗原结合片段在真核细胞中的表达，如CHO细胞。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带前面所述的核酸分子，或者表达前面所述的人源化抗体或其抗原结合片段。根据本发明实施例的重组细胞可用于前面所述的特异性识别TrkA的人源化抗体或其抗原结合片段体外表达和大量获得。
根据本发明的实施例，上述重组细胞还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过将前面所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。
根据本发明的实施例，通过电转导的方法将所述表达载体引入所述宿主细胞中。
根据本发明的实施例，所述重组细胞为真核细胞。
根据本发明的实施例，所述重组细胞为哺乳动物细胞。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物含有前面所述的抗体，前面所述的核酸分子，前面所述的表达载体或前面所述的重组细胞。根据本发明实施例的药物组合物中所包含的人源化抗体或表达的人源化抗体具有和人鼠嵌合抗TrkA单克隆抗体23E12基本一致的体内外活性，不仅能够特异性的靶向结合TrkA受体，阻断NGF和TrkA结合，有效的抑制疼痛，基本没有抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)的特点，而且相比人鼠嵌合抗TrkA单克隆抗体23E12具有更低的免疫原性以及更优的药代动力学参数。
在本发明的第六方面，本发明提出了前面所述的抗体、前面所述的核酸分子、前面所述的表达载体或前面所述的重组细胞、前面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防疼痛、癌症、炎症或炎性疾病、神经变性疾病、舍格伦氏综合征、子宫内膜异位、糖尿病性周围神经病变、前列腺炎、盆腔疼痛综合征、与骨重塑调节失衡相关的疾病以及由结缔组织生长因子异常信号传导引起的疾病。
根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或预防神经性疼痛、炎性疼痛、与癌症有关的疼痛、与骨折有关的疼痛、与手术有关的疼痛、炎性肺病、间质性膀胱炎、痛性膀胱综合征、炎性肠疾病、炎性皮肤病、雷诺氏综合征、特发性肺纤维化、瘢痕(肥大型、瘢痕瘤型和其他形式)、硬化、心内膜心肌纤维化、心房纤维化、骨髓纤维化、进行性块状纤维化(肺)、肾源性系统性纤维化、硬皮病、系统性硬化、关节纤维化、眼部纤维化、非小细胞肺癌、乳头状甲状腺癌、多形性成胶质细胞瘤、结肠直肠癌、黑色素瘤、胆管癌或肉瘤、急性骨髓性白血病、大细胞神经内分泌癌、成神经细胞瘤、前列腺癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、黑色素瘤、头颈鳞状细胞癌或胃癌。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种检测TrkA的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括前面任一所述的抗体。前面所述的TrkA抗体能够特异性靶向结合TrkA，根据本发明实施例的试剂盒可以实现TrkA的特异性检测，如当抗体结合有荧光基团时，可以采用荧光检测装置实现对TrkA的定位或实时检测。
在本发明的第八方面，本发明提出了前面所述的抗体、前面所述的核酸分子、前面所述的表达载体或前面所述的重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测TrkA或者诊断TrkA相关的疾病。
附图说明
图1是根据本发明实施例的应用SEC-HPLC纯度检测方法评价人源化抗体的单体纯度的结果图；
图2是根据本发明实施例的应用流式细胞术检测人源化抗体与Human-TrKA的结合能力的实验结果图；
图3是根据本发明实施例的应用流式细胞术检测人源化抗体与Mouse-TrKA的结合能力的实验结果图；
图4是根据本发明实施例的应用流式细胞术检测人源化抗体对Human-NGF和Human-TrKA结合的抑制作用的结果图；
图5是根据本发明实施例的应用流式细胞术检测人源化抗体对Mouse-NGF和Mouse-TrKA结合的抑制作用的结果图；
图6A～6D是根据本发明实施例的应用流式细胞术检测人源化抗体与靶标Human-TrKA结合的特异性的结果图；
图7是根据本发明实施例的应用ELISA方法评价人源化抗体小鼠体内的ADA的结果图；
图8是根据本发明实施例的应用ELISA方法评价人源化抗体小鼠体内的药代动力学的结果图；
图9是根据本发明实施例的应用荧光素酶报告基因系统检测人源化抗体的ADCC活性的结果图；
图10是根据本发明实施例的应用完全弗氏佐剂诱导炎疼痛模型评价人源化抗体的体内镇痛活性的结果图；
图11是根据本发明实施例的应用NIH-3T3-TrkA细胞模型检测人源化抗体的CDC活性的结果图；
图12是根据本发明实施例的应用NIH-3T3-TrkA细胞模型评价人源化抗体的体外活性的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在对本发明描述的过程中，对于本文中有关的术语进行了解释和说明，这些解释和说明仅仅是为了方便对于方案的理解，并不能看做是对本发明保护方案的限制。
抗体
本文中，术语“抗体”是能够与特异性抗原结合的免疫球蛋白分子。包括两条分子量较轻的轻链和两条分子量较重的重链，重链(H链)和轻链(L链)由二硫键连接形成一个四肽链分子。其中，肽链的氨基端(N端)氨基酸序列变化很大，称为可变区(V区)，羧基端(C端)相对稳定，变化很小，称为恒定区(C区)。抗体的恒定区可介导该免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq)。L链和H链的V区分别称为VL和VH。
在可变区中某些区域氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度，称为高变区(Hypervariable region，HVR)，高变区为抗原和抗体结合的位置，因此也称为决定簇互补区(complementarity-determining region，CDR)，它们散布在称为框架区(FR)的更保守的区域中。每个VH和VL可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。。
本发明利用TrkA胞外段，通过免疫获得了高特异性的高亲和力的抗TrkA的Fab(antigen-binding fragment)抗体片段。利用该抗体片段能够与TrkA抗原特异性结合，从而可以靶向性治疗疼痛或肿瘤等疾病。
在一些实施方案中，本发明提供了一种人源化抗体或抗原结合片段，所述人源化抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO：2～8任一项所示氨基酸序列的重链可变区和具有SEQID NO：10～13任一项所示氨基酸序列的轻链可变区。发明人通过抗体序列比对数据库(NCBI、IMGT)可得到上述抗重链可变区序列的CDR区和轻链可变区序列的CDR区。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区序列与SEQ ID NO:2～8所示氨基酸序列相比，具有保守氨基酸取代。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区序列与SEQ ID NO:10～13任一项所示氨基酸序列相比，具有保守氨基酸取代。“抗原结合片段”是指保持特异性结合抗原(ROR2)能力的抗体片段。抗原结合片段的实施例包括但不限于Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、Fab片段、(Fab)2、scFv-Fc融合蛋白、scFv-Fv融合蛋白、Fv-Fc融合蛋白、由抗原结合片段形成的多特异性抗体、单结构域抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或最小识别单位的至少之一。“保守氨基酸取代”指的是氨基酸被另一氨基酸发生生物学上、化学上或者结构上相似的残基所取代。当然，这些保守氨基酸取代不会对抗体或者抗原结合片段的生物学功能带来改变。在一些具体方式中，这些保守氨基酸取代可以发生在重链可变区和轻链可变区中除了CDR区之外的氨基酸上。生物学上相似的指的是该取代不破坏TrkA抗体或者与TrkA抗原的生物学活性。结构上相似指的是氨基酸具有相似长度的侧链，如丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸，或具有相似大小的侧链。化学相似性指的是氨基酸具有相同的荷电或者都是亲水或者疏水的。例如疏水残基异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或者甲硫氨酸相互取代。或者极性氨基酸相互取代，例如用精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺，丝氨酸取代苏氨酸等等。
术语“鼠源抗体”通常是指将来源于免疫接种过的小鼠的B细胞与骨髓瘤细胞融合，继而筛选出既能无限增殖又能分泌抗体的鼠杂交融合细胞，进而筛选、制备抗体以及纯化。
术语“嵌合抗体”是指通过组合非人源遗传物质与人源遗传物质而得来的抗体。“嵌合抗体”或“嵌合抗TrkA抗体”在本文中包括可变区序列源自一种物种而恒定区序列源自另一种物种的抗体，例如，可变区序列源自小鼠抗体而恒定区序列源自人抗体的抗体。
术语“人源化抗体”是指来源于非人物种但其蛋白序列已经被修改以增加其与人天然生成抗体的相似度的抗体。具体地，人源化抗体是指具有基本来源于非人物种免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其中所述分子其余的免疫球蛋白结构基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。所述抗原结合位点可包含融合至恒定结构域的完整可变结构域或仅包含移植(graft)至可变结构域中适当的构架区的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可为野生型的，或者通过一个或更多个氨基酸替换进行修饰，例如，进行修饰以与人免疫球蛋白更为类似。一些形式的人源化抗体保留了全部CDR序列(例如，含有来自小鼠抗体的全部六个CDR的人源化小鼠抗体)。其它形式具有一个或更多个相对于原始抗体而言发生了改变的CDR。
在一些优选方案中，本发明提供了一种人源化抗TrkA抗体，该抗体具有SEQ IDNO:17～23任一项所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:24～27任一项所示氨基酸序列的轻链。
在一些优选方案中，本发明提供了一种人源化抗TrkA单链抗体，该单链抗体包括SEQ ID NO:2-8任一项所示氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO:10-13任一项所示氨基酸序列的轻链可变区，其中所述重链可变区的C端通过连接肽linker与所述轻链可变区的N端相连，或所述轻链可变区的C端通过连接肽linker与所述重链可变区的N端相连。
核酸分子、表达载体、重组细胞
在制备或者获取这些抗体的过程中，可以利用表达这些抗体的核酸分子，与不同的载体连接，然后在不同细胞中表达，来获得相应抗体。
为此，本发明还提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码上述所述的抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述分离核酸分子具有如SEQ ID NO:30～36任一项所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:37～40任一项所示核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述分离的核酸分子与上述SEQ ID NO:30～36所示的核苷酸序列至少具有90％以上的同源性，优选具有95％以上的同源性，更优选具有98％、99％以上的同源性。在至少一些实施方案中，所述分离的多核苷酸与所述SEQ ID NO:37～40所示的核苷酸序列至少具有90％以上的同源性，优选具有95％以上的同源性，更优选具有98％、99％以上的同源性。这些与SEQ ID NO:30～36或SEQ ID NO:37～40所示核苷酸序列具有同源性的序列，能够表达与SEQ ID NO:17～23或SEQ ID NO:24～27相似的氨基酸序列，从而能够与TrkA抗原特异性结合，实现抗体的靶向性功能。
在一些优选实施方式中，所述分离的核酸分子具有SEQ ID NO:30～36所示的重链核苷酸序列和SEQ ID NO:37～40所示的轻链核苷酸序列。这些核苷酸序列经过种属优化，更易在哺乳动物细胞中表达。
本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体包含上述分离的核酸分子。在将上述分离的多核苷酸连接到载体上时，可以将多核苷酸与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制多核苷酸的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。当然，多核苷酸与控制元件进行可操作地连接即可。本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。当然用来编码抗体重链和轻链的多核苷酸，可以分别独立的插入到不同的载体上，常见的是插入到同一载体上。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。例如Plasmid-X质粒。
本发明还提供了一种重组细胞，该重组细胞中包含有该表达载体。可以将表达载体导入到哺乳动物细胞中，构建获得重组细胞，然后利用这些重组细胞表达本发明提供的人源化抗体或者抗原结合片段。通过该重组细胞进行培养，即可以获得相应抗体。这些可用的哺乳动物细胞例如可以为CHO细胞等。
药物组合物、试剂盒及制药用途和在制备试剂盒中的用途。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述所述的抗体或者抗原结合片段和药学可接受的载体。
本文提供的抗TrkA人源化抗体可以掺入适合受试者施用的药物组合物中。通常，这些药物组合物包括本文提供的抗TrkA人源化抗体以及药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”可以包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等等。具体实例可以是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的组合物中的一种或多种。有许多情况下，药物组合物中包括等渗剂，例如糖类、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠等。当然药学上可接受的载体还可包括微量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，用来延长抗体的保存限期或效力。
例如，本发明的抗体可掺入适用于胃肠外施用(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)的药物组合物中。这些药物组合物可以被制备成各种形式。例如液体、半固体和固体剂型等，包括但不限于液体溶液(例如，注射溶液和输注溶液)、分散剂或悬浮剂、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。典型的药物组合物为注射溶液或输注溶液形式。所述抗体可通过静脉输注或注射或肌肉内或皮下注射来施用。
当然，本文中的抗TrkA人源化抗体还可以根据需要被制成试剂盒或者其他诊断性试剂的一部分。根据本发明的实施例，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述TrkA抗体。应用本发明提供的试剂盒，例如可以用于免疫印迹、免疫沉淀等涉及到利用TrkA抗原和抗体特异性结合性能，来检测的试剂盒等。这些试剂盒可包含下列中的任意一种或多种：拮抗剂、抗TrkA人源化抗体或者药物参照材料；蛋白纯化柱；免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂；细胞的测定稀释剂；说明书或者文献等。抗TrkA人源化抗体可被用于不同类型的诊断测试，例如可以在体外或者体内检测各种各样的疾病或者药物、毒素或者其他蛋白等的存在。例如可以通过对受试者的血清或者血液进行检测，用来测试相关疾病。这种相关疾病可包括TrkA相关疾病，例如疼痛、癌症、炎症或炎性疾病、神经变性疾病、舍格伦氏综合征、子宫内膜异位、糖尿病性周围神经病变、前列腺炎、盆腔疼痛综合征、与骨重塑调节失衡相关的疾病以及由结缔组织生长因子异常信号传导引起的疾病等等。当然本文提供的抗体也可以用于上述疾病的放射免疫检测和放射免疫治疗等等。
具体地，上述疼痛、炎症或炎性疾病、神经变性疾病、舍格伦氏综合征、子宫内膜异位、糖尿病性周围神经病变、前列腺炎、盆腔疼痛综合征、与骨重塑调节失衡相关的疾病以及由结缔组织生长因子异常信号传导引起的疾病包括神经性疼痛、炎性疼痛、与癌症有关的疼痛、与骨折有关的疼痛、与手术有关的疼痛、炎性肺病、间质性膀胱炎、痛性膀胱综合征、炎性肠疾病、炎性皮肤病、雷诺氏综合征、特发性肺纤维化、瘢痕(肥大型、瘢痕瘤型和其他形式)、硬化、心内膜心肌纤维化、心房纤维化、骨髓纤维化、进行性块状纤维化(肺)、肾源性系统性纤维化、硬皮病、系统性硬化、关节纤维化、眼部纤维化。
这些癌症或者肿瘤可以是任何不受调控的细胞生长。具体地，可以是非小细胞肺癌、乳头状甲状腺癌、多形性成胶质细胞瘤、结肠直肠癌、黑色素瘤、胆管癌或肉瘤、急性骨髓性白血病、大细胞神经内分泌癌、前列腺癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、黑色素瘤、头颈鳞状细胞癌或胃癌等等。
在利用本发明所提供的抗TrkA人源化抗体治疗上述疾病时，可以将本发明提供的抗TrkA人源化抗体提供给受试者即可。为此，本发明提供了一种用于治疗上述疾病的方法，包括向有需要的受试者施用本发明所提供的的抗体或其抗原结合片段。
实施例1鼠源抗TrKA单克隆抗体23E12可变区的人源化设计
使用B细胞表位分析软件AbEpiMax，针对鼠源抗TrKA单克隆抗体23E12的可变区进行B细胞表位的免疫原性分析，找出抗体FR区具有较强B细胞表位的序列。
然后，使用人类抗体FR库中与原始序列具有高度3D结构同源性并且具有较弱的B细胞表位的序列替换抗体FR区具有强B细胞表位的序列，鼠源抗TrKA单克隆抗体23E12重轻链可变区以及23E12改造后的重轻链可变区序列如表1。
表1
Figure BDA0003360636980000221
Figure BDA0003360636980000231
实施例2载体的构建
将采用分子克隆的方法构建一系列(H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4)人源化抗体表达载体，在CHO表达系统中，重组表达人源化抗体。编码一系列(H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4)人源化单克隆抗体轻重链的核苷酸序列是委托金斯瑞生物科技有限公司通过化学合成获得的，所获得的序列经双酶切后，插入到真核表达载体的相同酶切位点间，构建一系列(H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4)人源化单克隆抗体表达载体。然后采用Invitrogen质粒提取试剂盒提取一系列经验证正确的表达载体，并用限制性内切酶进行线性化后纯化回收，-20℃保藏。
实施例3编码一系列人源化抗体载体转染并在细胞中表达
将CHO宿主细胞用CD CHO培养基复苏培养后，当细胞密度约8*105cell/mL时收集细胞进行转染。转染细胞约1*107cell，载体约40μg，通过电击方法转染(Bio-Rad，Genepulser Xcell)。电击后细胞于20mL CD CHO培养基中培养。培养第二天，离心收集细胞，并在加入MSX至终浓度50μM的20mL CD CHO培养基中重悬培养。当细胞密度约0.6*106cell/mL时，对获得的混合克隆株用CD CHO培养基进行传代，传代细胞密度约0.2*106cell/mL。当细胞存活率约90％时，收集细胞培养液。
实施例4收集细胞发酵培养液纯化人源化抗体
对一系列人源化单克隆抗体进行翻译水平上的检测。采用Protein A层析柱对收集的细胞培养液进行纯化，并收集吸收峰，进行质谱检测，质谱检测一系列嵌合抗体分子量150KD左右，与理论分子量一致，为二聚体形式。同时对收集的样品经还原与非还原后通过10％SDS-PAGE电泳检测，还原型SDS-PAGE电泳图谱显示二条带，分别在25KD和50KD左右，非还原型SDS-PAGE电泳图谱显示单一条带，在150KD左右，电泳图谱条带大小与理论一致。纯化后样品采用pH7.0的0.01M PBS缓冲液在4℃透析过夜。
实施例5应用SEC-HPLC纯度检测方法评价人源化抗体的单体纯度
将人源化抗体(H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4)样品以及嵌合抗体(H0L0-IgG4)样品离心,取上清约80ug注入HPLC检测，通过SEC-HPLC检测人源化抗体的单体峰面积百分比，峰面积百分比越高，单体纯度越高。结果见图1。图中结果显示，人源化抗体H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4的单体峰面积百分比分别为99.847％，99.738％，99.836％，嵌合抗体H0L0-IgG4的单体峰面积百分比为99.621％。表明，人源化抗体H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4以及嵌合抗体H0L0-IgG4的单体纯度高。
实施例6应用流式细胞术评价人源化抗体与Human-TrKA的结合能力
利用慢病毒技术构建HEK293T-HumanTrkA细胞模型。将人源化抗体(H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4)样品以及嵌合抗体(H0L0-IgG4)样品分别用PBS缓冲液稀释至11个浓度梯度(20μg/mL，10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.625μg/mL，0.313μg/mL，0.156μg/mL，0.078μg/mL，0.039μg/mL，0.019μg/mL)，通过流式细胞术检测各浓度梯度人源化抗体与HEK293T-HumanTrKA细胞表面Human-TrKA受体的结合情况，从细胞水平评价各人源化抗体与Human-TrKA的结合能力，结果见图2。图中，EC50(半数结合浓度)值反映抗体与Human-TrKA的结合能力；EC50值越小，抗体与Human-TrKA的结合能力越强，抗体亲和力越高。通常认为，高亲和力抗体的EC50值低于1.5μg/mL。图中结果显示，人源化抗体H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4的EC50值分别为0.1307μg/mL，0.1268μg/mL，0.1683μg/mL，嵌合抗体H0L0-IgG4的EC50值为0.08669μg/mL。表明，人源化抗体H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4以及嵌合抗体H0L0-IgG4与Human-TrKA都有很强的结合能力；与嵌合抗体H0L0-IgG4相比，人源化抗体H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4与Human-TrKA结合的亲和力基本保持不变。
实施例7应用流式细胞术评价人源化抗体与Mouse-TrKA的结合能力
利用慢病毒技术构建HEK293T-MouseTrkA细胞模型。将人源化抗体(H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4)样品以及嵌合抗体(H0L0-IgG4)样品分别用PBS缓冲液稀释至11个浓度梯度(20μg/mL，10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.625μg/mL，0.313μg/mL，0.156μg/mL，0.078μg/mL，0.039μg/mL，0.019μg/mL)，通过流式细胞术检测各浓度梯度人源化抗体与HEK293T-MouseTrKA细胞表面Human-TrKA受体的结合情况，从细胞水平评价各人源化抗体与Mouse-TrKA的结合能力，结果见图3。图中，EC50(半数结合浓度)值反映抗体与Mouse-TrKA的结合能力；EC50值越小，抗体与Mouse-TrKA的结合能力越强，抗体亲和力越高。通常认为，高亲和力抗体的EC50值低于1.5μg/mL。图中结果显示，人源化抗体H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4的EC50值分别为0.1341μg/mL，0.1110μg/mL，0.1254μg/mL，嵌合抗体H0L0-IgG4的EC50值为0.1048μg/mL。表明，人源化抗体H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4以及嵌合抗体H0L0-IgG4与Mouse-TrKA都有很强的结合能力；与嵌合抗体H0L0-IgG4相比，人源化抗体H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4与Mouse-TrKA结合的亲和力基本保持不变。
实施例8应用流式细胞术检测人源化抗体对Human-NGF和Human-TrKA结合的抑制作用
将Human-NGF生物素化，利用Human-NGF可以结合HEK293T-HumanTrkA细胞上的Human-TrkA蛋白胞外区，抗TrkA单克隆抗体也可以结合HEK293T-HumanTrkA细胞上的Human-TrkA蛋白胞外区，设计竞争性实验，通过流式细胞术，检测不同浓度(20μg/mL，10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.625μg/mL，0.313μg/mL，0.156μg/mL，0.078μg/mL，0.039μg/mL，0.019μg/mL)各人源化抗体(H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4)以及嵌合抗体(H0L0-IgG4)作用下，Human-NGF与HEK293T-HumanTrkA细胞上Human-TrkA蛋白胞外区结合情况，研究各人源化抗体对Human-NGF和Human-TrKA结合的抑制作用。实验结果见图4。图中，parent％值反映了与HEK293T-HumanTrkA细胞上Human-TrKA蛋白胞外区结合的Human-NGF信号，读值越低，与HEK293T-HumanTrkA细胞上Human-TrkA蛋白胞外区结合的Human-NGF信号越弱，抗体抑制Human-NGF与Human-TrKA结合的作用越大；如图所示，随着各人源化抗体(H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4)以及嵌合抗体(H0L0-IgG4)浓度的增加，parent％值逐渐降低，直到趋近于零，即与Human-TrkA蛋白胞外区结合的Human-NGF信号逐渐降低，直到没有Human-NGF结合Human-TrkA蛋白胞外区，Human-NGF与Human-TrkA的结合全部抑制。人源化抗体(H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4)的IC50分别为0.7963μg/mL、0.7405μg/mL、0.6653μg/mL，嵌合抗体(H0L0-IgG4)的IC50为0.8810μg/mL；可见，一定的浓度范围内，各人源化抗体H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4)以及嵌合抗体(H0L0-IgG4)在细胞水平上能够剂量依赖性的抑制Human-NGF与Human-TrkA的结合；与嵌合抗体(H0L0-IgG4)相比，人源化抗体H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4)对Human-NGF和Human-TrKA结合的抑制作用基本保持不变。
实施例9应用流式细胞术检测人源化抗体对Mouse-NGF和Mouse-TrKA结合的抑制作用
将Mouse-NGF生物素化，利用Mouse-NGF可以结合HEK293T-MouseTrkA细胞上的Mouse-TrkA蛋白胞外区，抗TrkA单克隆抗体也可以结合HEK293T-MouseTrkA细胞上的Mouse-TrkA蛋白胞外区，设计竞争性实验，通过流式细胞术，检测不同浓度(20μg/mL，10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.625μg/mL，0.313μg/mL，0.156μg/mL，0.078μg/mL，0.039μg/mL，0.019μg/mL)各人源化抗体(H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4)以及嵌合抗体(H0L0-IgG4)作用下，Mouse-NGF与HEK293T-MouseTrkA细胞上Mouse-TrkA蛋白胞外区结合情况，研究各人源化抗体对Mouse-NGF和Mouse-TrKA结合的抑制作用。实验结果见图5。图中，parent％值反映了与HEK293T-MouseTrkA细胞上Mouse-TrKA蛋白胞外区结合的Mouse-NGF信号，读值越低，与HEK293T-MouseTrkA细胞上Mouse-TrkA蛋白胞外区结合的Mouse-NGF信号越弱，抗体抑制Mouse-NGF与Mouse-TrKA结合的作用越大；如图所示，随着各人源化抗体(H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4)以及嵌合抗体(H0L0-IgG4)浓度的增加，parent％值逐渐降低，直到趋近于零，即与Mouse-TrkA蛋白胞外区结合的Mouse-NGF信号逐渐降低，直到没有Mouse-NGF结合Mouse-TrkA蛋白胞外区，Mouse-NGF与Mouse-TrkA的结合全部抑制。人源化抗体(H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4)的IC50分别为0.3848μg/mL、0.2826μg/mL、0.2524μg/mL，嵌合抗体(H0L0-IgG4)的IC50为0.3959μg/mL；可见，一定的浓度范围内，各人源化抗体H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4)以及嵌合抗体(H0L0-IgG4)在细胞水平上能够剂量依赖性的抑制Mouse-NGF与Mouse-TrkA的结合；与嵌合抗体(H0L0-IgG4)相比，人源化抗体H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4)对Mouse-NGF和Mouse-TrKA结合的抑制作用基本保持不变。
实施例10应用ELISA方法评价人源化抗体与靶标Human-TrKA结合的特异性
TrkA受体家族属于受体酪氨酸激酶(RTKs)，包括TrkA、TrkB和TrkC，它们具有很高的同源性。TrkA是神经生长因子(NGF)的受体酪氨酸激酶，选择性结合NGF，是NGF的功能性受体。除高亲和力受体TrkA外，NGF还可与其低亲和力受体p75结合。试验中，通过ELISA方法检测不同浓度(20μg/mL，10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.625μg/mL，0.313μg/mL，0.156μg/mL，0.078μg/mL，0.039μg/mL，0.019μg/mL)人源化抗体(H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4)以及嵌合抗体(H0L0-IgG4)分别与TrKA、TrKB、TrKC、P75的结合情况，评价受试抗体与靶标Human-TrKA结合的特异性，结果如图6所示。图中，一定的抗体浓度下，OD450值反映抗体与蛋白的结合强弱，读值越大抗体与蛋白的结合越强。实验结果显示，人源化抗体(H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4)以及嵌合抗体(H0L0-IgG4)与TrKA受体都有很好的结合(受试抗体浓度由0μg/mL增加到20μg/mL，OD450值逐渐增加直至趋近稳定，接近3左右)，与TrKB、TrKC、P75基本不结合(各受试抗体浓度由0μg/mL增加到20μg/mL，OD450值基本没有变化，接近于0)。可见，受试抗体与靶标Human-TrKA结合的特异性都很好。
实施例11应用ELISA方法评价人源化抗体小鼠体内的ADA情况
试验中，将人源化抗体(H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4)以及嵌合抗体(H0L0-IgG4)分别免疫5只小鼠，在给药后第14天D14取尾静脉血。使用PBS稀释各人源化抗体(H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4)以及嵌合抗体(H0L0-IgG4)至1μg/mL包被酶标板，每孔加入100μL，4℃过夜反应；使用PBS溶液洗板3次，使用5％milk-PBS在室温封闭1hr；然后使用PBS溶液洗板1次；使用5％Milk-PBS缓冲液梯度稀释小鼠尾血(1:500、1:1000、1:5000、1:10000、1:50000)，并室温放置1hr，然后再将预反应的尾血加入至酶标板中，每孔100μL，并设置阴性对照(NC)，室温反应1hr；然后使用PBS溶液洗板3次，并进行拍干后，加入1:2000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG(Fc)二抗，室温反应1hr；PBS溶液洗板5次后，拍干，加入100μL底物显色液TMB，避光、室温条件下反应20min；然后加入50μL终止液，混匀后在酶标仪上读取OD450值，结果见下图7。图中，OD450值反映产生的ADA强弱，读值越大，产生的ADA越强。实验结果显示，与嵌合抗体(H0L0-IgG4)相比，人源化抗体(H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4)产生的ADA较弱；可见，人源化抗体(H1L1-IgG4、H3L1-IgG4、H3L2-IgG4)较嵌合抗体(H0L0-IgG4)具有更低的免疫原性。
实施例12应用ELISA方法评价人源化抗体小鼠体内药代动力学情况
雄性ICR小鼠12只，随机平均分为4组，3只/组，按1mg/kg分别静脉注射或皮下注射给予嵌合抗体H0L0-IgG4和人源化抗体H1L1-IgG4。分别于给药后1、6、24、72、168、336、504、672h采血并分离血浆(EDTA-K2抗凝)，静脉给药组增加0.25h采血。采用间接ECLA法分析各样本中H0L0-IgG4或H1L1-IgG4的浓度。根据血浆药物浓度计算药代动力学参数，主要PK参数结果见表2，药时曲线见图8。结果显示，ICR小鼠静脉注射H0L0-IgG4或H1L1-IgG4后，平均血浆半衰期分别为97h和143h；皮下注射H0L0-IgG4或H1L1-IgG4后，平均达峰时间分别为40h和56h，平均Cmax分别为6.61μg/mL和9.49μg/mL，平均AUClast分别为2120μg·h/mL和3020μg·h/mL，平均血浆半衰期分别为75h和122h，绝对生物利用度分别为89％和101％。可见，与嵌合抗体H0L0-IgG4相比，人源化抗体H1L1-IgG4具有更优的小鼠体内药代动力学参数。
表2
Figure BDA0003360636980000271
实施例13应用荧光素酶报告基因系统检测人源化抗体的ADCC活性
抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)是指，当IgG抗体通过Fab段与靶细胞表面抗原决定簇特异性结合后，其Fc段可与有FcγR的杀伤细胞(NK细胞、单核-巨噬细胞、中性粒细胞)等效应细胞结合，触发效应细胞的杀伤活性，直接杀伤靶细胞。试验中，应用了稳定转染CD16受体和NFAT(Nuclear Factor of Activated T-cells)反应原件的Jurkat-NFAT-Luc-CD16荧光素酶报告基因细胞系。当受试抗体的Fab段与靶细胞HEK293T-HumanTrKA细胞上抗原结合以后，抗体的Fc段与效应细胞Jurkat-NFAT-Luciferase-CD16细胞表面的(FcγRIIIA)结合，引起Jurkat-NFAT-Luciferase-CD16细胞内NFAT相关信号通路活化，进而导致荧光素酶表达水平上升。通过检测不同浓度(100μg/mL，20μg/mL，4μg/mL，0.8μg/mL，0.16μg/mL，0.032μg/mL，0.0064μg/mL，0.00128μg/mL，0.000256μg/mL，0.0000512μg/mL)人源化抗体(H1L1-IgG4、H1L1-IgG1)作用下，效应细胞Jurkat-NFAT-Luciferase-CD16的荧光素酶表达水平情况，评价人源化抗体的ADCC活性，结果见下图9。图中，Mean Value反映荧光素酶表达水平，读值越大，表达水平越高，对应抗体的ADCC活性越强。实验结果显示，随着抗体浓度的增高，阴性对照融合蛋白Dulaglutide-IgG4以及人源化抗体H1L1-IgG4的Mean Value基本不变且接近于零，而人源化抗体H1L1-IgG1的Mean Value逐渐增大一直到达平台值，半数达峰浓度EC50为0.02281μg/mL；可见，人源化抗体H1L1-IgG1具有很强的ADCC活性，H1L1-IgG4基本没有ADCC活性。
实施例14应用完全弗氏佐剂诱导炎痛模型评价人源化抗体的体内镇痛活性
完全弗氏佐剂诱导炎症痛模型通过在小鼠掌心注射完全弗氏佐剂来产生类似骨关节炎症的慢性炎症疼痛刺激及应答的疼痛模型，通过机械痛测试对疼痛测量，机械刺激力度越大，说明动物对疼痛的耐受性越强。试验中，选用18-25g雄性C57BL/6小鼠，在小鼠右后脚的足底中央注射10uL的CFA。在造模24hr后，利用机械痛觉超敏法进行测试，筛选出缩足阈值小于0.5克力的动物，并根据疼痛敏感随机分为溶剂对照组、萘普生100mg/kg剂量组，Tanezumab 2mg/kg剂量组、MNAC13 2mg/kg剂量组、H1L1-IgG4 2mg/kg剂量组，共5组，n＝10只/组。其中，Tanezumab为抗NGF单克隆抗体，MNAC13为抗TrkA单克隆抗体。溶剂对照组、Tanezumab、MNAC13、H1L1-IgG4剂量组经皮下注射给药后42hr、96hr，分别进行机械痛觉超敏测试，萘普生剂量组在测试前2小时灌胃给药。结果见图10，纵坐标表示机械刺激力度，小鼠爪子撤离的压力阈值越大，镇痛效果越好。结果显示：阳性对照组萘普生以剂量100mg/kg口服2小时后，表现出抑制C57BL/6小鼠CFA模型诱导的机械痛觉超敏；Tanezumab以剂量2mg/kg皮下给药后42小时测试，表现出抑制C57BL/6小鼠CFA模型诱导的机械痛觉超敏，而在给药后96小时测试，没有表现出这种抑制；MNAC13以剂量2mg/kg皮下给药后42、96小时测试，都没有表现出抑制C57BL/6小鼠CFA模型诱导的机械痛觉超敏；H1L1-IgG4以剂量2mg/kg皮下给药后96小时测试，表现出抑制C57BL/6小鼠CFA模型诱导的机械痛觉超敏，而在给药后42小时测试，没有表现出这种抑制。结论：H1L1-IgG4在皮下给药96小时后显著抑制C57BL/6小鼠CFA模型诱导的机械痛觉超敏，具有缓解炎症疼痛的活性。
实施例15应用NIH-3T3-TrkA细胞模型检测人源化抗体的CDC活性
补体依赖的细胞毒性作用(CDC)，指的是补体参与的细胞毒作用，即通过特异性抗体与细胞膜表面相应抗原结合，形成复合物而激活补体经典途径，所形成的攻膜复合物对靶细胞发挥裂解效应。试验中，通过CCK8法检测不同浓度(16.67μg/mL，5.56μg/mL，1.85μg/mL，0.62μg/ml、0.21μg/ml、0.069μg/ml、0.023μg/ml、0.008μg/ml、0.003μg/ml)人源化抗体(H1L1-IgG4、H1L1-IgG1)及阴性对照融合蛋白Dulaglutide-IgG4作用下，靶细胞NIH-3T3-TrKA的细胞活力情况，评价人源化Anti-TrKA抗体的CDC活性，结果见图11。图中结果显示，随着抗体浓度的升高，人源化抗体H1L1-IgG1对靶细胞NIH-3T3-TrKA细胞的杀伤作用逐渐增强，半数达峰浓度IC50为0.2219μg/mL；人源化抗体H1L1-IgG4及阴性对照融合蛋白Dulaglutide-IgG4对靶细胞NIH-3T3-TrKA细胞基本没有杀伤作用；可见，人源化抗体H1L1-IgG1具有很强的CDC活性，H1L1-IgG4基本没有CDC活性。
实施例16应用NIH-3T3-TrkA细胞模型评价人源化抗体的体外活性
在NGF刺激下，NIH-3T3-TrkA细胞膜上的TrkA蛋白酪氨酸磷酸化水平上调，TrkA下游信号通路激活。人源化Anti-TrKA抗体可以结合NIH-3T3-TrkA细胞膜表面的TrkA蛋白，抑制NGF的刺激，下调TrkA蛋白酪氨酸磷酸化水平。试验中，通过AlphaLISA的方法检测不同浓度(1000μg/mL，333.33μg/mL，111.11μg/mL，37.04μg/mL，12.35μg/mL，4.12μg/mL，1.37μg/mL，0.45μg/mL，0.15μg/mL，0.05μg/mL，0.017μg/mL，0.005μg/mL)人源化抗体作用下，TrkA蛋白的酪氨酸磷酸化水平下调情况，衡量受试抗体的体外活性，p-TrkA检测结果见图12。实验结果显示，人源化Anti-TrKA抗体H1L1-IgG4能够抑制NGF-TrKA信号通路，剂量依赖性地下调TrkA蛋白酪氨酸磷酸化水平，IC50为0.02072μg/mL。可见，人源化Anti-TrKA抗体H1L1-IgG4能够抑制NGF对TrKA下游信号通路的激活。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东东阳光药业有限公司
<120> 人源化抗TrkA的抗体及其应用
<130> 2021.11.18
<160> 49
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链可变区
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Phe Tyr Pro Arg Thr Gly Asn Thr Phe Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链可变区
<400> 2
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Phe Tyr Pro Arg Thr Gly Asn Thr Phe Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链可变区
<400> 3
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Phe Tyr Pro Arg Thr Gly Asn Thr Phe Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链可变区
<400> 4
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Phe Tyr Pro Arg Thr Gly Asn Thr Phe Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Val Thr Met Ser Val Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链可变区
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Phe Tyr Pro Arg Thr Gly Asn Thr Phe Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Val Thr Met Ser Val Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链可变区
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Phe Tyr Pro Arg Thr Gly Asn Thr Phe Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链可变区
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Phe Tyr Pro Arg Thr Gly Asn Thr Phe Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链可变区
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Phe Tyr Pro Arg Thr Gly Asn Thr Phe Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 9
Ser Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Ala Tyr His Cys Gly Gln Asn Tyr Ile Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 10
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Ala Tyr His Cys Gly Gln Asn Tyr Ile Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 11
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Ala Tyr His Cys Gly Gln Asn Tyr Ile Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 12
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg His Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr His Cys Gly Gln Asn Tyr Ile Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 13
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Ala Tyr His Cys Gly Gln Asn Tyr Ile Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 抗体恒定区的全长序列
<400> 14
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 15
<211> 326
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 抗体恒定区的全长序列
<400> 15
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
325
<210> 16
<211> 229
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源IgG4野生型Fc序列
<400> 16
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 17
<211> 442
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链
<400> 17
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Phe Tyr Pro Arg Thr Gly Asn Thr Phe Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
340 345 350
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355 360 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
<210> 18
<211> 442
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链
<400> 18
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Phe Tyr Pro Arg Thr Gly Asn Thr Phe Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
340 345 350
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355 360 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
<210> 19
<211> 442
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链
<400> 19
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Phe Tyr Pro Arg Thr Gly Asn Thr Phe Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Val Thr Met Ser Val Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
340 345 350
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355 360 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
<210> 20
<211> 442
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Phe Tyr Pro Arg Thr Gly Asn Thr Phe Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Val Thr Met Ser Val Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
340 345 350
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355 360 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
<210> 21
<211> 442
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Phe Tyr Pro Arg Thr Gly Asn Thr Phe Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
340 345 350
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355 360 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
<210> 22
<211> 442
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Phe Tyr Pro Arg Thr Gly Asn Thr Phe Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
340 345 350
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355 360 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
<210> 23
<211> 442
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Phe Tyr Pro Arg Thr Gly Asn Thr Phe Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
340 345 350
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355 360 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
<210> 24
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链
<400> 24
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Ala Tyr His Cys Gly Gln Asn Tyr Ile Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 25
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链
<400> 25
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Ala Tyr His Cys Gly Gln Asn Tyr Ile Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 26
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链
<400> 26
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg His Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr His Cys Gly Gln Asn Tyr Ile Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 27
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链
<400> 27
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Ala Tyr His Cys Gly Gln Asn Tyr Ile Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 28
<211> 442
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链
<400> 28
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Phe Tyr Pro Arg Thr Gly Asn Thr Phe Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
340 345 350
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355 360 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
<210> 29
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链
<400> 29
Ser Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Ala Tyr His Cys Gly Gln Asn Tyr Ile Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 30
<211> 1326
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 核酸分子
<400> 30
gaggtgcagc tgctggagtc tggaggagga ctggtgcagc caggaggctc tctgaagctg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cgctttcacc aactattggc tgggatggat gaagcagagg 120
ccaggacacg gactggagtg gatcggcgac ttttaccctc ggaccggcaa cacattctat 180
aacgagaact tcaagggcaa ggtgaccctg acagccgata agtccagcaa taccgcttac 240
atgcagctgt cttccctgac atccgaggac tccgccgtgt acctgtgcgc tagggctgga 300
accggattcg attattgggg ccagggcacc acactgacag tgagctctgc cagcaccaag 360
ggccccagcg tgttccctct ggctccttgt agccggtcca cctccgagtc cacagctgct 420
ctgggctgcc tcgtgaagga ctactttccc gaacccgtta ccgtgagctg gaatagcggc 480
gctttaacct ccggagtgca caccttcccc gctgtgctcc agtcctccgg tttatactct 540
ttatcctccg tggtgaccgt gccttcctcc agcctcggca ccaagaccta cacttgtaac 600
gtggaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaggg tggagtccaa gtacggacct 660
ccttgtcccc cttgccccgc ccccgaggcc gctggcggac cctccgtgtt cctcttcccc 720
cccaaaccca aggacacttt aatgatctcc cggacccccg aagtgacttg tgtggtggtg 780
gacgtgtccc aagaagaccc cgaggtgcag tttaactggt acgtggatgg cgtggaggtg 840
cacaacgcca agaccaagcc tagggaggaa cagttcaact ccacctaccg ggtggtgtcc 900
gtgctcaccg tgctgcatca agattggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtgagc 960
aacaagggac tgcccagctc catcgagaag accatcagca aggccaaagg ccagccccgg 1020
gaacctcaag tttatacact gccccccagc caagaagaga tgaccaagaa ccaagtttct 1080
ttaacttgtt tagtgaaggg cttctaccct agcgacatcg ctgtggagtg ggagtccaat 1140
ggccagcccg aaaacaatta taagaccacc ccccccgtgc tggactccga tggttctttt 1200
tttttatact ccaagctgac agtggacaag tctcgttggc aagaaggcaa cgtgttctct 1260
tgtagcgtga tgcacgaggc tttacacaac cactacaccc agaagtcttt atctctgtct 1320
ttaggc 1326
<210> 31
<211> 1326
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 核酸分子
<400> 31
gaggtgcagc tgctggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaagctg 60
agctgcaagg ccagcggcta cgccttcacc aactactggc tgggctggat gaagcagagg 120
cccggccacg gcctggagtg gatcggcggc ttctacccca ggaccggcaa caccttctac 180
aacgagaact tcaagggcaa ggtgaccctg accgccgaca agagcagcaa caccgcctac 240
atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt acctgtgcgc cagggccggc 300
accggcttcg actactgggg ccagggcacc accctgaccg tgagcagcgc cagcaccaag 360
ggccccagcg tgttccctct ggctccttgt agccggtcca cctccgagtc cacagctgct 420
ctgggctgcc tcgtgaagga ctactttccc gaacccgtta ccgtgagctg gaatagcggc 480
gctttaacct ccggagtgca caccttcccc gctgtgctcc agtcctccgg tttatactct 540
ttatcctccg tggtgaccgt gccttcctcc agcctcggca ccaagaccta cacttgtaac 600
gtggaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaggg tggagtccaa gtacggacct 660
ccttgtcccc cttgccccgc ccccgaggcc gctggcggac cctccgtgtt cctcttcccc 720
cccaaaccca aggacacttt aatgatctcc cggacccccg aagtgacttg tgtggtggtg 780
gacgtgtccc aagaagaccc cgaggtgcag tttaactggt acgtggatgg cgtggaggtg 840
cacaacgcca agaccaagcc tagggaggaa cagttcaact ccacctaccg ggtggtgtcc 900
gtgctcaccg tgctgcatca agattggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtgagc 960
aacaagggac tgcccagctc catcgagaag accatcagca aggccaaagg ccagccccgg 1020
gaacctcaag tttatacact gccccccagc caagaagaga tgaccaagaa ccaagtttct 1080
ttaacttgtt tagtgaaggg cttctaccct agcgacatcg ctgtggagtg ggagtccaat 1140
ggccagcccg aaaacaatta taagaccacc ccccccgtgc tggactccga tggttctttt 1200
tttttatact ccaagctgac agtggacaag tctcgttggc aagaaggcaa cgtgttctct 1260
tgtagcgtga tgcacgaggc tttacacaac cactacaccc agaagtcttt atctctgtct 1320
ttaggc 1326
<210> 32
<211> 1326
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 核酸分子
<400> 32
gaggtgcagc tgctggagtc cggaggagga ctggtgcagc caggaggctc tctgaagctg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cgctttcacc aactattggc tgggatggat gaagcagagg 120
ccaggacacg gactggagtg gatcggcgac ttttaccctc ggaccggcaa tacattctat 180
aacgagaact tcaagggcca ggtgacaatg tctgtggata agtccatcac cacagcctac 240
ctgcagtgga acagcctgaa ggcctctgac accgctatgt actattgtgc cagggctggc 300
acaggcttcg attattgggg ccagggcacc acactgaccg tgtccagcgc cagcaccaag 360
ggccccagcg tgttccctct ggctccttgt agccggtcca cctccgagtc cacagctgct 420
ctgggctgcc tcgtgaagga ctactttccc gaacccgtta ccgtgagctg gaatagcggc 480
gctttaacct ccggagtgca caccttcccc gctgtgctcc agtcctccgg tttatactct 540
ttatcctccg tggtgaccgt gccttcctcc agcctcggca ccaagaccta cacttgtaac 600
gtggaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaggg tggagtccaa gtacggacct 660
ccttgtcccc cttgccccgc ccccgaggcc gctggcggac cctccgtgtt cctcttcccc 720
cccaaaccca aggacacttt aatgatctcc cggacccccg aagtgacttg tgtggtggtg 780
gacgtgtccc aagaagaccc cgaggtgcag tttaactggt acgtggatgg cgtggaggtg 840
cacaacgcca agaccaagcc tagggaggaa cagttcaact ccacctaccg ggtggtgtcc 900
gtgctcaccg tgctgcatca agattggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtgagc 960
aacaagggac tgcccagctc catcgagaag accatcagca aggccaaagg ccagccccgg 1020
gaacctcaag tttatacact gccccccagc caagaagaga tgaccaagaa ccaagtttct 1080
ttaacttgtt tagtgaaggg cttctaccct agcgacatcg ctgtggagtg ggagtccaat 1140
ggccagcccg aaaacaatta taagaccacc ccccccgtgc tggactccga tggttctttt 1200
tttttatact ccaagctgac agtggacaag tctcgttggc aagaaggcaa cgtgttctct 1260
tgtagcgtga tgcacgaggc tttacacaac cactacaccc agaagtcttt atctctgtct 1320
ttaggc 1326
<210> 33
<211> 1326
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 核酸分子
<400> 33
caagtgcaac tggttcaatc tggagtggaa gttaagaagc ctggtgccag cgttaaagtg 60
agttgcaaag ccagcggata tgcctttacc aactattggc tgggctggat gaaacagagg 120
cctggccatg gtctggaatg gatcggagac ttttatccac gcaccggcaa cacattctat 180
aacgagaact tcaaaggtca ggtgaccatg tccgtggata agagcatcac taccgcttac 240
ctccagtgga acagtctgaa ggcttctgac accgccatgt actactgcgc tagggcaggc 300
accgggttcg actactgggg tcaagggacc accctcaccg tgagtagcgc cagcaccaag 360
ggccccagcg tgttccctct ggctccttgt agccggtcca cctccgagtc cacagctgct 420
ctgggctgcc tcgtgaagga ctactttccc gaacccgtta ccgtgagctg gaatagcggc 480
gctttaacct ccggagtgca caccttcccc gctgtgctcc agtcctccgg tttatactct 540
ttatcctccg tggtgaccgt gccttcctcc agcctcggca ccaagaccta cacttgtaac 600
gtggaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaggg tggagtccaa gtacggacct 660
ccttgtcccc cttgccccgc ccccgaggcc gctggcggac cctccgtgtt cctcttcccc 720
cccaaaccca aggacacttt aatgatctcc cggacccccg aagtgacttg tgtggtggtg 780
gacgtgtccc aagaagaccc cgaggtgcag tttaactggt acgtggatgg cgtggaggtg 840
cacaacgcca agaccaagcc tagggaggaa cagttcaact ccacctaccg ggtggtgtcc 900
gtgctcaccg tgctgcatca agattggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtgagc 960
aacaagggac tgcccagctc catcgagaag accatcagca aggccaaagg ccagccccgg 1020
gaacctcaag tttatacact gccccccagc caagaagaga tgaccaagaa ccaagtttct 1080
ttaacttgtt tagtgaaggg cttctaccct agcgacatcg ctgtggagtg ggagtccaat 1140
ggccagcccg aaaacaatta taagaccacc ccccccgtgc tggactccga tggttctttt 1200
tttttatact ccaagctgac agtggacaag tctcgttggc aagaaggcaa cgtgttctct 1260
tgtagcgtga tgcacgaggc tttacacaac cactacaccc agaagtcttt atctctgtct 1320
ttaggc 1326
<210> 34
<211> 1326
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 核酸分子
<400> 34
caagtgcagc tggttcaaag tggtgttgaa gttaagaagc ctggagctag tgtgaaggtg 60
tcctgtaagg cctccggcta tgcctttaca aactactggc tcgggtggat gaagcagcgc 120
ccaggacacg gtctggaatg gattggcgac ttttacccac ggacaggaaa tacattctat 180
aatgaaaact tcaaaggcaa agtgaccatc acagccgata agtccattac cactgcatac 240
atgcagctca gtagtctcaa agctagtgat acagcagtgt attactgcgc cagggccggc 300
accgggttcg actactgggg gcagggaacc accctcaccg tgagctctgc cagcaccaag 360
ggccccagcg tgttccctct ggctccttgt agccggtcca cctccgagtc cacagctgct 420
ctgggctgcc tcgtgaagga ctactttccc gaacccgtta ccgtgagctg gaatagcggc 480
gctttaacct ccggagtgca caccttcccc gctgtgctcc agtcctccgg tttatactct 540
ttatcctccg tggtgaccgt gccttcctcc agcctcggca ccaagaccta cacttgtaac 600
gtggaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaggg tggagtccaa gtacggacct 660
ccttgtcccc cttgccccgc ccccgaggcc gctggcggac cctccgtgtt cctcttcccc 720
cccaaaccca aggacacttt aatgatctcc cggacccccg aagtgacttg tgtggtggtg 780
gacgtgtccc aagaagaccc cgaggtgcag tttaactggt acgtggatgg cgtggaggtg 840
cacaacgcca agaccaagcc tagggaggaa cagttcaact ccacctaccg ggtggtgtcc 900
gtgctcaccg tgctgcatca agattggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtgagc 960
aacaagggac tgcccagctc catcgagaag accatcagca aggccaaagg ccagccccgg 1020
gaacctcaag tttatacact gccccccagc caagaagaga tgaccaagaa ccaagtttct 1080
ttaacttgtt tagtgaaggg cttctaccct agcgacatcg ctgtggagtg ggagtccaat 1140
ggccagcccg aaaacaatta taagaccacc ccccccgtgc tggactccga tggttctttt 1200
tttttatact ccaagctgac agtggacaag tctcgttggc aagaaggcaa cgtgttctct 1260
tgtagcgtga tgcacgaggc tttacacaac cactacaccc agaagtcttt atctctgtct 1320
ttaggc 1326
<210> 35
<211> 1326
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 核酸分子
<400> 35
caagtccaac tggttcaatc tggcgtggaa gtcaagaagc ccggagcctc cgtgaaggtg 60
agctgcaagg caagcggcta tgcattcact aactactggc tcggatgggt gaaacaacgg 120
ccaggacatg gcctggaatg gatcggcgac ttctacccta ggactggcaa cactttctat 180
aacgagaact ttaagggcaa ggtcaccatt acagctgata agagtatcac taccgcctac 240
atgcagctgt cttccctgaa agctagtgat acagccgttt attactgtgc tcgggctggc 300
acaggattcg attattgggg acagggtacc acactcacag tgtcctctgc cagcaccaag 360
ggccccagcg tgttccctct ggctccttgt agccggtcca cctccgagtc cacagctgct 420
ctgggctgcc tcgtgaagga ctactttccc gaacccgtta ccgtgagctg gaatagcggc 480
gctttaacct ccggagtgca caccttcccc gctgtgctcc agtcctccgg tttatactct 540
ttatcctccg tggtgaccgt gccttcctcc agcctcggca ccaagaccta cacttgtaac 600
gtggaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaggg tggagtccaa gtacggacct 660
ccttgtcccc cttgccccgc ccccgaggcc gctggcggac cctccgtgtt cctcttcccc 720
cccaaaccca aggacacttt aatgatctcc cggacccccg aagtgacttg tgtggtggtg 780
gacgtgtccc aagaagaccc cgaggtgcag tttaactggt acgtggatgg cgtggaggtg 840
cacaacgcca agaccaagcc tagggaggaa cagttcaact ccacctaccg ggtggtgtcc 900
gtgctcaccg tgctgcatca agattggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtgagc 960
aacaagggac tgcccagctc catcgagaag accatcagca aggccaaagg ccagccccgg 1020
gaacctcaag tttatacact gccccccagc caagaagaga tgaccaagaa ccaagtttct 1080
ttaacttgtt tagtgaaggg cttctaccct agcgacatcg ctgtggagtg ggagtccaat 1140
ggccagcccg aaaacaatta taagaccacc ccccccgtgc tggactccga tggttctttt 1200
tttttatact ccaagctgac agtggacaag tctcgttggc aagaaggcaa cgtgttctct 1260
tgtagcgtga tgcacgaggc tttacacaac cactacaccc agaagtcttt atctctgtct 1320
ttaggc 1326
<210> 36
<211> 1326
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 核酸分子
<400> 36
caagttcagc tggtgcaatc cggtgtcgag gtgaagaaac caggcgcaag cgtgaaagtc 60
tcctgcaagg cttctggcta tgccttcact aactactggc tcggctggat gaagcagagg 120
cccggacatg ggctggagtg gatcggagac ttctatccca gaactggaaa caccttttac 180
aacgagaatt tcaagggcaa ggtcaccctg actgccgaca aatcctctaa cacagcttac 240
atgcagctga gcagtctgac atccgaagac tctgcagttt acctgtgtgc tcgggcaggc 300
acaggcttcg attattgggg gcaagggacc actctgactg tgtcttccgc cagcaccaag 360
ggccccagcg tgttccctct ggctccttgt agccggtcca cctccgagtc cacagctgct 420
ctgggctgcc tcgtgaagga ctactttccc gaacccgtta ccgtgagctg gaatagcggc 480
gctttaacct ccggagtgca caccttcccc gctgtgctcc agtcctccgg tttatactct 540
ttatcctccg tggtgaccgt gccttcctcc agcctcggca ccaagaccta cacttgtaac 600
gtggaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaggg tggagtccaa gtacggacct 660
ccttgtcccc cttgccccgc ccccgaggcc gctggcggac cctccgtgtt cctcttcccc 720
cccaaaccca aggacacttt aatgatctcc cggacccccg aagtgacttg tgtggtggtg 780
gacgtgtccc aagaagaccc cgaggtgcag tttaactggt acgtggatgg cgtggaggtg 840
cacaacgcca agaccaagcc tagggaggaa cagttcaact ccacctaccg ggtggtgtcc 900
gtgctcaccg tgctgcatca agattggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtgagc 960
aacaagggac tgcccagctc catcgagaag accatcagca aggccaaagg ccagccccgg 1020
gaacctcaag tttatacact gccccccagc caagaagaga tgaccaagaa ccaagtttct 1080
ttaacttgtt tagtgaaggg cttctaccct agcgacatcg ctgtggagtg ggagtccaat 1140
ggccagcccg aaaacaatta taagaccacc ccccccgtgc tggactccga tggttctttt 1200
tttttatact ccaagctgac agtggacaag tctcgttggc aagaaggcaa cgtgttctct 1260
tgtagcgtga tgcacgaggc tttacacaac cactacaccc agaagtcttt atctctgtct 1320
ttaggc 1326
<210> 37
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 核酸分子
<400> 37
gagatcgtga tgacccagtc cccagccaca ctgagcctgt ctgtgggaga gagggtgacc 60
ctgtcttgca aggcttccga gaacgtgggc ggctacgtga gctggtatca gcagaagccc 120
gaccagtctc ctaagctgct gatctacgga gcctccagca ggcacacagg agtgccagac 180
cggttcaccg gatccggaag cgagacagac ttcaccctga caatctcttc cgtgcaggct 240
gaggatctgg ccgcttatca ttgtggccag aattacatct atcccttcac ctttggcggc 300
ggcacaaagc tggagatcaa gcggaccgtg gctgccccct ccgtgttcat cttcccccct 360
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgct agcgtggtgt gtttactgaa caacttctac 420
cctcgtgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgctt tacagtccgg caactcccaa 480
gaatccgtga ccgagcaaga ttccaaggac tccacctact ctttatcctc cactttaact 540
ttatccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgctt gtgaggtgac ccatcaaggt 600
ttatcctccc ccgtgaccaa gtccttcaat cgtggcgagt gc 642
<210> 38
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 核酸分子
<400> 38
gagatcgtga tgacccagtc cccagccaca ctgagcctgt ctgtgggaga gagggtgacc 60
ctgtcttgca aggcttccga gaacgtgggc ggctacgtga gctggtatca gcagaagccc 120
gaccagtctc ctaagctgct gatctacgga gcctccagca gggctacagg agtgccagac 180
cggttcaccg gatccggaag cgagacagac ttcaccctga caatctcttc cgtgcaggcc 240
gaggatctgg ccgcttatca ctgtggccag aattacatct atcccttcac ctttggcggc 300
ggcacaaagc tggagatcaa gcggaccgtg gctgccccct ccgtgttcat cttcccccct 360
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgct agcgtggtgt gtttactgaa caacttctac 420
cctcgtgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgctt tacagtccgg caactcccaa 480
gaatccgtga ccgagcaaga ttccaaggac tccacctact ctttatcctc cactttaact 540
ttatccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgctt gtgaggtgac ccatcaaggt 600
ttatcctccc ccgtgaccaa gtccttcaat cgtggcgagt gc 642
<210> 39
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 核酸分子
<400> 39
gagatcgtga tgacccagag ccctgccaca ctgagcctgt ctgtgggcga gagggtgacc 60
ctgtcctgca aggcctccga gaacgtgggc ggctacgtgt cttggtatca gcagaagccc 120
gaccagtccc ctaagctgct gatctacgga gcctccagca ggcacaccgg agtgccagct 180
cggttctccg gaagcggatc tggcacagac tttaccctga caatctcttc cctggagcca 240
gaggatttcg ccgtgtatca ttgtggccag aattacatct atcccttcac ctttggcggc 300
ggcacaaagc tggagatcaa gcggaccgtg gctgccccct ccgtgttcat cttcccccct 360
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgct agcgtggtgt gtttactgaa caacttctac 420
cctcgtgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgctt tacagtccgg caactcccaa 480
gaatccgtga ccgagcaaga ttccaaggac tccacctact ctttatcctc cactttaact 540
ttatccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgctt gtgaggtgac ccatcaaggt 600
ttatcctccc ccgtgaccaa gtccttcaat cgtggcgagt gc 642
<210> 40
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 核酸分子
<400> 40
gaaattgtgc tgactcagtc tcctgctact ctgtccctgt ctcctggtga acgggccact 60
ctgagctgca aggccagtga aaatgtgggt ggctatgtta gctggtatca gcaaaagccc 120
gaccagtctc ccaaactgct gatctacggc gcttccagtc ggcacacagg cgtgccagat 180
cgctttactg ggagcggctc tgagactgac ttcacactga ccattagcag tgtccaggcc 240
gaagatctcg cagcctatca ttgcggccag aactacatct atccattcac cttcggtgga 300
ggaaccaaac tggaaatcaa gcggaccgtg gctgccccct ccgtgttcat cttcccccct 360
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgct agcgtggtgt gtttactgaa caacttctac 420
cctcgtgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgctt tacagtccgg caactcccaa 480
gaatccgtga ccgagcaaga ttccaaggac tccacctact ctttatcctc cactttaact 540
ttatccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgctt gtgaggtgac ccatcaaggt 600
ttatcctccc ccgtgaccaa gtccttcaat cgtggcgagt gc 642
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链CDR1
<400> 41
Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr Trp Leu Gly
1 5 10
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链CDR2
<400> 42
Asp Phe Tyr Pro Arg Thr Gly Asn Thr Phe
1 5 10
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链CDR2
<400> 43
Gly Phe Tyr Pro Arg Thr Gly Asn Thr Phe
1 5 10
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链CDR3
<400> 44
Ala Arg Ala Gly Thr Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链CDR1
<400> 45
Glu Asn Val Gly Gly Tyr Val Ser
1 5
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链CDR2
<400> 46
Gly Ala Ser Ser Arg His Thr
1 5
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链CDR2
<400> 47
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链CDR3
<400> 48
Asn Tyr Ile Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 49
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 抗体恒定区的全长序列
<400> 49
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330

Claims (25)

1.一种能够特异性识别TrkA的人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段具有选自下述的重链可变区和轻链可变区：
(a)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的重链可变区和由SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的轻链可变区。
2.根据权利要求1所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别TrkA的胞外区。
3.根据权利要求1所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体含有重链恒定区和轻链恒定区的至少之一，所述重链恒定区和轻链恒定区均来自于人源IgG抗体或其突变体。
4.根据权利要求1所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的轻链恒定区来自于人源的Kappa轻链恒定区；重链恒定区来自于人源IgG4的重链恒定区。
5.根据权利要求4所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的Fc区域与人源IgG4野生型的Fc相比具有S10P，F16A，L17A，R191K突变以及229K缺失突变，其中人源IgG4野生型的Fc具有SEQ ID NO:16所示氨基酸序列。
6.根据权利要求4所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体恒定区的全长序列如SEQ ID NO:14或15所示。
7.根据权利要求1所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体选自下述的重链和轻链：
(a)由SEQ ID NO：17所示氨基酸序列的重链和由SEQ ID NO：24所示氨基酸序列的轻链。
8.根据权利要求1所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单链抗体、多聚体抗体、CDR移植抗体。
9.根据权利要求8所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单链抗体包括SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的轻链可变区，其中所述重链可变区的C端通过连接肽linker与所述轻链可变区的N端相连，或所述轻链可变区的C端通过连接肽linker与所述重链可变区的N端相连。
10.根据权利要求1所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、Fv、scFv-Fc融合蛋白、scFv-Fv融合蛋白以及最小识别单位的至少之一。
11.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1～10任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段。
12.根据权利要求11所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为DNA。
13.根据权利要求12所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:30所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:37所示核苷酸序列。
14.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求11～13任一项所述的核酸分子。
15.根据权利要求14所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为真核表达载体。
16.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞携带权利要求11～13任一项所述的核酸分子，或者表达权利要求1～10任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段。
17.根据权利要求16所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过将权利要求17或18所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。
18.根据权利要求17所述的重组细胞，其特征在于，通过电转导的方法将所述表达载体引入所述宿主细胞中。
19.根据权利要求16所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为真核细胞。
20.根据权利要求16所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为哺乳动物细胞。
21.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1～10任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，权利要求11～13任一项所述的核酸分子，权利要求14～15任一项所述的表达载体或权利要求16～20任一项所述的重组细胞。
22.权利要求1～10任一项所述的人源化抗体、权利要求11～13任一项所述的核酸分子、权利要求14～15任一项所述的表达载体、权利要求16～20任一项所述的重组细胞或权利要求21所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防疼痛、癌症、炎症或炎性疾病、神经变性疾病、舍格伦氏综合征、子宫内膜异位、糖尿病性周围神经病变、前列腺炎、盆腔疼痛综合征、与骨重塑调节失衡相关的疾病以及由结缔组织生长因子异常信号传导引起的疾病。
23.根据权利要求22所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗或预防神经性疼痛、炎性疼痛、与癌症有关的疼痛、与骨折有关的疼痛、与手术有关的疼痛、炎性肺病、间质性膀胱炎、痛性膀胱综合征、炎性肠疾病、炎性皮肤病、雷诺氏综合征、特发性肺纤维化、瘢痕(肥大型、瘢痕瘤型和其他形式)、硬化、心内膜心肌纤维化、心房纤维化、骨髓纤维化、进行性块状纤维化(肺)、肾源性系统性纤维化、硬皮病、系统性硬化、关节纤维化、眼部纤维化、非小细胞肺癌、乳头状甲状腺癌、多形性成胶质细胞瘤、结肠直肠癌、黑色素瘤、胆管癌或肉瘤、急性骨髓性白血病、大细胞神经内分泌癌、成神经细胞瘤、前列腺癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、黑色素瘤、头颈鳞状细胞癌或胃癌。
24.一种检测TrkA的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～10任一项所述的人源化抗体。
25.权利要求1～10任一项所述的人源化抗体、权利要求11～13任一项所述的核酸分子、权利要求14～15任一项所述的表达载体或权利要求16～20任一项所述的重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测TrkA或者诊断TrkA相关的疾病。
CN202111365634.3A 2020-11-20 2021-11-18 人源化抗TrkA的抗体及其应用 Active CN114516917B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011307482 2020-11-20
CN2020113074827 2020-11-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114516917A CN114516917A (zh) 2022-05-20
CN114516917B true CN114516917B (zh) 2022-11-18

Family

ID=81595256

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111365634.3A Active CN114516917B (zh) 2020-11-20 2021-11-18 人源化抗TrkA的抗体及其应用

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230357411A1 (zh)
EP (1) EP4247852A1 (zh)
JP (1) JP2023549300A (zh)
CN (1) CN114516917B (zh)
AU (1) AU2021382828A1 (zh)
TW (1) TW202227500A (zh)
WO (1) WO2022105814A1 (zh)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001273115C1 (en) * 2000-06-29 2009-03-26 Quick Med Technologies, Inc. Cosmetic composition and method
DK2252633T3 (da) * 2008-02-04 2013-11-11 Lay Line Genomics Spa Anti-TrkA antistoffer og derivater deraf
US9539324B2 (en) * 2010-12-01 2017-01-10 Alderbio Holdings, Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
JP2015520182A (ja) * 2012-06-08 2015-07-16 グレンマーク ファーマシューティカルズ， エセ．アー． アミノ酸置換を有するヒト化抗ＴｒｋＡ抗体
US20150183885A1 (en) * 2012-06-08 2015-07-02 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Anti-trka antibodies with enhanced inhibitory properties and derivatives thereof
US20170362327A1 (en) * 2015-04-24 2017-12-21 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Anti-trka antibodies with enhanced inhibitory properties and derivatives thereof for use in treating bone associated pain
CN114230663B (zh) * 2019-05-30 2022-09-27 广东东阳光药业有限公司 TrkA的抗体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
TW202227500A (zh) 2022-07-16
US20230357411A1 (en) 2023-11-09
EP4247852A1 (en) 2023-09-27
JP2023549300A (ja) 2023-11-24
WO2022105814A1 (en) 2022-05-27
CN114516917A (zh) 2022-05-20
AU2021382828A1 (en) 2022-10-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113347994B (zh) 使用her3抗原结合分子治疗和预防癌症
CN109563169B (zh) 抗hla-g特异性抗体
JP2021535743A (ja) 抗ｃｄ４７抗体及びその応用
WO2017071625A1 (zh) 一种抗pd-1单克隆抗体、其药物组合物及其用途
EP2997042B1 (en) Anti-cxcl1, cxcl7 and cxcl8 antibodies and their applications
CN112566662A (zh) 针对cd47的阻断抗体及其使用方法
CN112010978B (zh) TrkA的抗体及其应用
KR20190134614A (ko) B7-h3 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이의 의학적 용도
KR20200139725A (ko) Her3 항원 결합 분자
WO2010130751A1 (en) Humanized axl antibodies
EP4067377A1 (en) Development and application of therapeutic agents for tslp-related diseases
CN113227148B (zh) 抗gpc3抗体、其抗原结合片段及其医药用途
WO2023025315A1 (zh) 抗b7-h3抗体、其制备方法及用途
CN114516917B (zh) 人源化抗TrkA的抗体及其应用
CN113444176B (zh) Ngf的抗体及其应用
CN114761434B (zh) Pd-1抗体及其制备方法与应用
CN111704668B (zh) 抗ccr4抗体及其在治疗癌症中的应用
CN114426580B (zh) 抗csf-1r抗体及其产品、方法和用途
EP4289865A1 (en) Anti-tnfr2 antibody and use thereof
EP4289864A1 (en) Method for inhibiting tumour cell growth based on ccdc112
JP7346576B2 (ja) 抗ｏｘ４０モノクローナル抗体とその応用
CN115572330A (zh) 一种特异性抗体及其制备方法和应用
CN116284406A (zh) 一种pd-1结合蛋白及其应用
CN115819582A (zh) Pvrig的抗体或其抗原结合片段及其应用
AU2022217845A9 (en) Anti-tnfr2 antibody and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: 523808 No.1, Gongye North Road, Songshanhu Park, Dongguan City, Guangdong Province

Patentee after: Guangdong Dongyangguang Pharmaceutical Co.,Ltd.

Address before: 523808 No.1, Gongye North Road, Songshanhu Park, Dongguan City, Guangdong Province

Patentee before: SUNSHINE LAKE PHARMA Co.,Ltd.

CP01 Change in the name or title of a patent holder