KR20150023679A - 아미노산 치환을 갖는 인간화된 항-TrkA 항체 - Google Patents

아미노산 치환을 갖는 인간화된 항-TrkA 항체 Download PDF

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그렌마크 파머수티칼스 에스. 아.
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Abstract

본 발명은 인간화된 항-TrkA 항체를 포함하는, TrkA 수용체 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 바뀐 교환 특성을 보이는 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 인간 경쇄 불변 영역 및 가변 인간 IgG4 중쇄 불변 영역을 포함하는 강화된 억제 효능의 인간화된 항-TrkA 항체에 관한 것이다.

Description

개선된 억제 특성을 갖는 항-TrkA 항체 및 이의 유도체{ANTI-TRKA ANTIBODIES WITH ENHANCED INHIBITORY PROPERTIES AND DERIVATIVES THEREOF}
본 출원은 2012년 6월 8일에 출원된 미국 가출원 번호 61/657,184의 이익을 주장하고; 이의 모두는 본 명세서에서 참조로서 통합된다.
[기술분야]
본 발명은 TrkA 수용체(receptor)로 유도된 항체 및 인간화된 항-TrkA 항체와 항-TrkA 항체를 이용한 치료 방법을 포함하는 이의 용도에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 발명은 개선된 억제 특성을 갖는 인간화된 항-TrkA 항체에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 바뀐 교환 특성을 보이는 중쇄 가변부위(heavy chain variable region), 경쇄 가변부위(light chain variable region), 인간 경쇄 불변부위(human light chain constant region) 및 변이체 인간 IgG4 중쇄 불변부위(heavy chain constant region)를 포함하는 개선된 억제 특성을 갖는 인간화된 항-TrkA 항체에 관한 것이다.
뉴로트로핀(neurotrophins)은 펩타이드(peptide) 성장 인자(growth factors)의 패밀리(family)이고(Barde YA(1994) J. Neurobiol. 25(11):1329-33), 구조적으로 관련된 NGF 패밀리의 첫번째 구성원이다(Levi-Montalcini R(1987) EMBO J. 6(5):1145-54). 뉴로트로핀은 말초(peripheral) 뉴런(neurons) 및 중추 신경계(central nervous system) 모두에서 시냅스(synaptic) 전달(transmission)뿐만 아니라, 신경(neuronal) 분화(differentiation) 및 생존(survival)을 조절한다. 또한, NGF는 면역 세포와 같은 다양한 비 신경 조직 및 세포에 작용한다. NGF는 타켓(target) 세포에 존재하는 낮은 친화력(affinity)의 p75 수용체 및 140 kDa의 높은 친화력의 막통과(transmembrane) 당단백질(glycoprotein)인 티로신(tyrosine) 키나아제(kinase) 활성을 갖는 TrkA, 두 개의 막(membrane) 수용체를 통해 작용한다(Kaplan DR et al., (1991) Science 252(5005):554-8; Klein R et al., (1991) Cell 65(1):189-97). NGF 활성의 중요한 매개체(mediator)를 나타내는 TrkA는 기부전뇌(basal fore-brain) 및 선조체(corpus striatum)의 콜린성(cholinergic) 뉴런뿐만 아니라 신경 능선(neural-crest) 뉴런, 교감신경(sympathetic neurons)에서 발현된다(Holtzman DM et al., (1992) Neuron 9(3):465-78; Verge VM et al., (1992) J. Neurosci. 12(10):4011-22). 또한, TrkA는 B 림프구(lymphocytes)를 포함하는 일부 비 신경 조직 및 세포에서 발현된다(Torcia M et al., (1996) Cell 85(3):345-56).
신경 성장 인자(Nerve growth factor, NGF)는 개발 신경계(developing nervous system)에서 감각 및 교감 신경의 생존 인자(survival factor)로서 처음 확인되었다(Gorin PD & Johnson EM(1979) PNAS USA, 76(10):5382-6). 성인의 경우, NGF가 생존을 위해 필수적이진 않지만, 여러 급성(acute) 및 만성(chronic) 통증(pain) 상태에서 통증과 통각과민(hyperalgesia)의 발생에 중요한 역할을 한다. NGF의 발현은 상처와 염증 조직에서 높고, 통각(nociceptive) 뉴런 트리거(triggers)에서 trkA를 활성화하고, 여러 메카니즘(mechani는)에 의해 통증 신호를 강하게 한다. 염증과 관련된 통증은 동물 모델에서 NGF 생물학적 활성(bioactivity)을 중화시킴으로써 상당히 감소시키고(Woolf CJ et al., (1994) Neuroscience 62(2):327-31; McMahon SB et al., (1995) Nat. Med. 1(8):774-80; Koltzenburg M et al., (1999) Eur J. Neurosci. 11(5):1698-704), 뉴로트로핀의 개선된 레벨(level)은 전체 통각과민 반응을 생성시키기 위해 필요하다는 것을 의미한다. 놀랍게도, 다른 뉴로트로핀의 억제는 반감(antagonizing)에 의해 유도된 통각과민에 의한 결과가 아니고, 이는 특정 NGF의 효과임을 시사한다(McMahon SB et al., (1995) Nat. Med. 1(8):774-80); 또한, NGF 억제 결과는 다른 신경병증성(neuropathy)-관련된 통증 프로토콜에서 무통증(analgesia)으로 나타난다(Koltzenburg M et al., (1999) Pain, 81(3):245-55; Christensen MD & Hulsebosch CE (1997) Exp. Neurol. 147(2):463-75).
통증의 치료에는 크고, 미충족(unmet) 의학적 요구가 존재한다. 진통제(analgesic drugs)의 지배적 클래스(dominant classes)인 비스테로이드성 항-염증제(nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs) 및 아편제(opiates)는 효능(efficacy) 및 내약성(tolerability)에 의해 제한된다(Hefti FF et al., (2006) Trends Pharmacol. Sci. 27(2):85-91). 만성통증 환자의 30% 이하는 전기 치료(current therapies)에 의해 충분히 완화되고, 이는 특히 장기간 투여시 많은 부작용이 있다(Kalso E et al., (2004) Pain 112(3):372-80). NGF가 성인의 통증 메커니즘에서 중요한 역할을 한다는 것의 인식은 통증 치료제의 완전히 새로운 클래스를 개발하는 기회를 제공한다.
NGF 대신에 TrkA 타겟팅(targeting)은 나은 치료 선택을 나타내고, 이 수용체는 NGF 기능 매개된 p75 수용체를 방해하지않고, 후에 신경 발달에서 다양한 기능을 갖게된다.
[본 발명의 요약]
본 발명은 인간화된 항-TrkA 항체, 이들의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 하기와 같이 구성된 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편을 제공한다:
a) SEQ ID NOs: 1-5로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인(domain), 및
b) SEQ ID NOs: 6-13으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인,
중쇄 가변 도메인의 CDR2는 적어도 하나의 아미노산 치환(substitution)을 포함하고, 및/또는 중쇄 가변 도메인의 비-CDR 부위는 37, 42 및 89로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 위치의 아미노산 치환을 포함하며, 각 그룹 멤버의 아미노산 위치는 케벳(Kabat)에 설정된 번호붙이기(numbering) 시스템(system)을 이용하여 표시된다.
다른 측면에서, 본 발명은 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 분리된 핵산, 분리된 핵산을 포함하는 벡터 및 분리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다. 또한, 본 발명에 의해 제공되는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편을 제조하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 치료제에 연결된 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물 및 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역접합체(immunoconjugate)를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 약물에 사용, 통증의 치료에 사용, 만성통증의 치료에 사용, 급성통증의 치료에 사용, 하기의 하나 또는 그 이상과 관련된 통증의 치료에 사용되기 위한 조성물 또는 면역접합체를 제공한다: 췌장염(pancreatitis), 신장결석(kidney stones), 자궁내막증(endometriosis), 염증성장질환(IBD), 크론병(Crohn’s disease), 수술후 유착(post surgical adhesions), 담낭석(gall bladder stones), 두통(headaches), 월경통(dysmenorrhea), 근골격 통증(musculoskeletal pain), 염좌(sprains), 내장통(visceral pain), 난소낭종(ovarian cysts), 전립선염(prostatitis), 방광염(cystitis), 간질성 방광염(interstitial cystitis), 수술후 통증(post-operative pain), 편두통(migraine), 삼차신경병증성(trigeminal neuralgia), 화상 및/또는 상처에 의한 통증(pain from burns and/or wounds), 외상과 관련된 통증(pain associated with trauma), 신경병증성 통증(neuropathic pain), 근골격계질환과 관련된 통증(pain associated with musculoskeletal diseases), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골관절염(osteoarthritis), 강직성 척추염(ankylosing spondilitis), 관절주위 병증(periarticular pathologies), 종양통증(oncological pain), 골전이에 의한 통증(pain from bone metastases), 인간면역결핍바이러스 감염(HIV infection), 암의 치료에 사용(for use in the treatment of cancer), 신경장애(a neuronal disorder), 알츠하이머병(Alzheimer’s disease), 당뇨병(diabetes mellitus), 당뇨병성 신장질환(diabetic nephropathy), 바이러스성 장애(a viral disorder), 인간면역결핍바이러스 매개 장애(an HIV mediated disorder), 한센병(leprosy), 또는 염증성 장애, 및 진단 또는 예측에 사용.
다른 측면에서, 본 발명은 염증성 통증(inflammatory pain), 골관절염성 통증(osteoarthritic pain) 및 신경병증성성 통증(neuropathic pain) 치료를 위한 방법을 제공한다. 한 측면에서, 급성 염증성 통각과민(acute inflammatory hyperalgesia)의 생체 내(in vivo) 모델에서 인간화된 항-TrkA 항체의 투여량 0.01 ㎎/㎏의 투여는 급성 염증성 통각과민의 유의한 역전의 결과를 초래한다. 또 다른 측면에서, 만성 염증성 통각과민(chronic inflammatory hyperalgesia)의 생체 내(in vivo) 모델에서 인간화된 항-TrkA 항체의 투여량 0.01 ㎎/㎏의 투여는 만성 염증성 통각과민의 유의하고 일관된 역전의 결과를 초래한다. 또 다른 측면에서, 만성 골관절염성 통각과민(chronic osteoarthritic hyperalgesia)의 생체 내(in vivo) 모델에서 인간화된 항-TrkA 항체의 투여량 0.01 ㎎/㎏의 투여는 만성 골관절염성 통각과민의 유의하고 일관된 역전의 결과를 초래한다. 다른 측면에서, 신경병증성 통증(neuropathic pain)의 생체 내(in vivo) 만성 협착 손상(chronic constriction injury) 모델에서 인간화된 항-TrkA 항체의 투여량 0.01 ㎎/㎏의 투여는 신경병증성 통증의 유의한 역전의 결과를 초래한다.
다른 측면에서, 본 발명은 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편, 조성물 또는 면역접합체를 포함하는 제조물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편, 조성물 또는 면역접합체를 포함하는 키트를 제공한다.
도 1: 항-TrkA 항체의 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon resonance) 측정. 데이터는 반응의 수(단축된 RU; Y 축) 대 시간(X 축)으로 표현된다. MNAC13 항체(도 1A). BXhVH5VL1 항체(도 1B). GBR VH5(V37A)VL1 항체(도 1C). GBR VH5(K3Q, V37A)VL1 항체(도 1D).
도 2: 시차 주사 열량계(differential scanning calorimetry)를 이용한 인간화된 항-TrkA 항체의 열안정성(thermostability) 측정. 데이터는 초과 몰 열용량(excess molar heat capacity)(단축된 Cp[kcal/mol/℃]; Y 축) 대 온도(X 축)으로 표현된다. MNAC13 항체(FAB 절편 Tm값은 74℃에서 Tm1)(도 2A). BXhVH5VL1 항체(FAB 절편 Tm값은 76.5℃에서 Tm3)(도 2B). GBR VH5(V37A)VL1 항체(FAB 절편 Tm값은 73.6℃에서 Tm1)(도 2C). GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 antibody (FAB 절편 Tm값은 73℃에서 Tm1)(도 2D). 도 2C 및 도 2D의 병합(도 2E). 도 2B 및 도 2D의 병합(도 2F). 도 2A 및 도 2D의 병합(도 2G).
도 3: 항-TrkA 항체의 생체활성(bioactivity) 기능. NGF로 유도된 TF-1 세포 증식에 대한 인간화된 항-TrkA 항체의 효과; 데이터는 증식 반응(Y 축) 대 항체 농도(㎍/㎖; X 축)의 %로 표현된다. GBR VH5(V37A)VL1, GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 대 BXhVH5VL1(도 3A). GBR VH5(V37A)VL1, GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 대 MNAC13(도 3B). GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 대 GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P(도 3C). BXhVH5VL1, BXhVH5VL3, GBR VH5(V37A)VL1 대 GBR VH5(V37A)VL3(도 3D). BXhVH5VL1, BXhVH3VL1, GBR VH5(V37A)VL1 대 GBR VH3(V37A)VL1(도 3E).
도 4: 인간화된 항-TrkA 항체의 급성 염증성 발(paw) 통증 역전. 발의 급성 염증성 통각과민은 AMB1 마우스의 뒷다리 발 중 하나에 CFA를 발바닥 내에 투여하여 유도되었고, 동측(ipsilateral)(투여) 및 대측성(contralateral)(비투여) 발(% 동측/대측성, 평균 ± 표준요차)의 체중부하(weight bearing) 사이의 % 비율로 측정되었다. 체중부하 측정은 CFA 주입 23시간(0 시간) 후에 얻고, 치료개시 전인 CFA 24시간 후에 항-TrkA 항체를 0.0001(흰색 막대)(white bars), 0.001(수평선 막대)(horizontally-hatched bars), 0.01(체크무늬 막대)(chequered bars) 및 0.1 ㎎/㎏(대각선 막대)(diagonally hatched bars) 또는 0.1 ㎎/㎏ 동종 대조군 항체(검은 막대)(black bars)를 하나의 복강 내 투여한 다음에 투여 4, 8, 24, 48, 72, 96 및 120 시간 후에 체중부하를 측정하였다. 양성 대조군으로 마우스는 10 ㎎/㎏ 인도메타신(indomethacin)을 구강 내 투여(p.o.)(수직선 막대)(vertically-hatched bars)로 처리하였다.
도 5: 인간화된 항-TrkA 항체의 만성 염증성 관절(joint) 통증 역전. 만성 염증성 통각과민은 AMB1 마우스의 뒷다리 무릎 관절 중 하나에 CFA를 관절 내에 투여하여 유도되었고, 동측(ipsilateral)(투여) 및 대측성(contralateral)(비투여) 팔(% 동측/대측성, 평균 ± 표준요차)의 체중부하(weight bearing) 사이의 % 비율로 측정되었다. 체중부하 측정은 CFA 투여 전(투약하지않은, naive) 및 CFA 3, 7 및 10일 후, 치료개시 전인 CFA 13일 후에 항-TrkA 항체를 0.01(열린 사각형, 점선)(open square, dashed line), 1(막힌 삼각형)(closed triangle) 및 10 ㎎/㎏(열린 원)(open circle) 또는 10 ㎎/㎏ 동종 대조군 항체(막힌 원)(closed circle)를 하나의 복강 내 투여한 다음에 투여 4, 8, 24, 48, 72 및 96 시간(괄호 안) 후에 체중부하를 측정하였다. 양성 대조군으로 마우스는 60 ㎎/㎏ 셀레콕시브(celecoxib)를 13일부터 하루에 두 번(열린 다이아몬드)(open diamond)로 처리하였고, 체중부하는 CFA 13일 후에 투여 1 및 8시간 후 및 CFA 14 내지 17일 후에 투여 1시간 후 측정되었다.
도 6: 인간화된 항-TrkA 항체의 만성 골관절염성 통증 역전. 만성 골관절염성 통각과민은 AMB1 마우스의 뒷다리 무릎 관절 중 하나에 MIA를 관절 내에 투여하여 유도되었고, 동측(ipsilateral)(투여) 및 대측성(contralateral)(비투여) 팔(% 동측/대측성, 평균 ± 표준요차)의 체중부하(weight bearing) 사이의 % 비율로 측정되었다. 기준선(baseline, BL) 체중부하 측정은 MIA 투여 전 및 MIA 3, 7 및 10일 후, 치료개시 전인 MIA 14일 후에 항-TrkA 항체를 1(열린 삼각형)(open triangle), 10(열린 다이아몬드)(open diamond) 및 100 ㎍/㎏(막힌 원, 점선)(closed circle, dashed line) 또는 10 ㎎/㎏ 동종 대조군 항체(막힌 사각형)(closed square)를 하나의 복강 내 투여하였다(도 6A). 비교 대조군으로 동물은 MIA 14일 후 10 ㎎/㎏ 트라마돌(tramadol) 또는 30 ㎎/㎏ 프리가발린(pregabalin)을 구강 내 투여한 다음에 MIA 16 내지 22일 후 매 다른 날 30 ㎎/㎏ 트라마돌 또는 100 ㎎/㎏ 프리가발린을 처리하였다(도 6B). 모든 동물은 MIA 14일 후 내 24시간마다 항체 처리한 그룹, 및 투여 1 및 24시간 후 트라마돌 및 프리가발린 처리한 그룹은 투여 4, 8 및 24시간 후 체중부하를 사용하여 평가되었다.
도 7: 인간화된 항-TrkA 항체의 신경병증성(neuropathic) 통증 역전. 만성 신경병증성 통각과민 및 이질통(allodynia)은 AMB1 마우스 좌골신경(sciatic nerve)의 만성 협착 손상(chronic constriction injury)으로 유도되고, 발 움츠림(paw withdrawal)(g)의 한계력(threshold force) 및 냉각판에서 발 움츠림의 대기 시간(latency time)(초)은 각각 측정된다. 측정은 수술 전 및 수술 7일 후 치료 개시 전(0시간)에 하였다. 동물은 1000 ㎍/㎏ 동종 대조군 항체(막힌 삼각형)(closed triangle) 또는 항-TrkA 항체를 10(막힌 원)(closed circle), 100(막힌 사각형)(closed square) 및 1000 ㎍/㎏(막힌 다이아몬드)(closed diamond)를 하나의 복강 내 투여하였다. 30 ㎎/㎏/10 ㎖ 프리가발린(막힌 역삼각형)(closed inverted triangle)을 구강 내 투여 또는 식염수(saline)(열린 원)(open circle)를 하루에 한번씩 투여 7일 후 투여기간 동안 투여하였다.
본 발명은 인간화된 항-TrkA 항체, 이들의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
용어 "TrkA", "인간 TrkA(human TrkA)", "TrkA 수용체(TrkA receptor)" 또는 "인간 TrkA 수용체(human TrkA receptor)"는 여기에서 동등하게 사용되고, 만약 다른 방법으로 특별하게 표시되지 않는다면 "인간 TrkA(human TrkA)"를 의미한다. 여기에서 사용된 용어 "인간 TrkA(human TrkA)"는 인간 TrkA의 변이체(variants), 이성체(isoforms), 및 종 상동(species homologs)을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체는, 경우에 따라, 인간 이외의 다른 종으로부터의 TrkA와 교차-반응할 수도 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 하나 또는 그 이상의 인간 TrkA 단백질에 대해 완전히 특이적일 수도 있고, 비-인간 교차-반응성의 종 또는 다른 타입을 보이지 않을 수도 있다.
TrkA는 높은 친화력 신경 생장 인자 수용체(high affinity nerve growth factor receptor) 또는 신경영양 타이로신 키나아제 수용체 타입 1(neurotrophic tyrosine kinase receptor type 1) 또는 TRK1-트랜스포밍 타이로신 키나아제 단백질(TRK1-transforming tyrosine kinase protein) 또는 트로포미오신-관련 키나아제 A(Tropomyosin-related kinase A) 또는 타이로신 키나아제 수용체(Tyrosine kinase receptor) 또는 타이로신 키나아제 수용체 A(Tyrosine kinase receptor A) 또는 Trk-A 또는 gp140trk 또는 p140-TrkA 또는 MTC 또는 TRK로 또한 알려져있다. TrkA는 교감(sympathetic) 및 신경(nervous) 뉴런의 증식(proliferation), 분화(differentiation) 및 생존(survival)의 조절을 통해 중추(central) 및 말초(peripheral) 신경계(nervous systems)의 발달(development) 및 성숙(maturation)과 관련된 수용체 타이로신 키나아제(receptor tyrosine kinase)이다. TrkA는 1차 리간드(primary ligand)인 NGF에 대한 높은 친화력 수용체(high affinity receptor)이다; 이는 또한 NTF3/뉴로트로핀-3(neurotrophin-3)에 의해 결합하고, 활성화될 수 있다.
4개로 알려진 인간 TrkA 이성체의 완전한 아미노산 서열은 UniProt/Swiss-Prot 기탁번호 P04629 하에서 발견된다(Consortium TU, (2012) Nucleic Acids Res. 40(D1):(D71-D5). 네 이성체는 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 생성된다: 이성체 TrkA-Ⅰ은 대부분 비-신경 조직(non-neuronal tissues)에서 발견되고(UniProt/Swiss-Prot 기탁번호 P04629-2), 이성체 TrkA-Ⅱ는 신경 세포(neuronal cells)에서 주로 발현되며(UniProt/Swiss-Prot 기탁번호 P04629-1), 및 이성체 TrkA-Ⅲ은 만능 신경 줄기(pluripotent neural stem) 및 신경관 전구세포(neural crest progenitors)에서 특히 발현된다(UniProt/Swiss-Prot 기탁번호 P04629-4). 네번째 이성체는 이성체 TrkA-Ⅱ의 잔기 1-71에서 다르고, 잔기 393 내지 398이 없는 이성체 3으로 알려져있다(UniProt/Swiss-Prot 기탁번호 P04629-3). TrkA-Ⅱ 이성체는 TrkA의 주로 알려진 이성체이다. 이성체 TrkA-Ⅰ은 NTF3 뉴로트로핀의 민감성을 강화하였고, 이성체 TrkA-Ⅲ은 NGF에 결합하지 않고, 지속적으로 활성화되었다. 바람직한 실시예에서, 여기에서 사용되는 TrkA 이성체는 SEQ ID NO: 72를 가진 TrkA-Ⅱ 이성체이고, SEQ ID NO: 25를 포함하는 이의 세포 밖의 부위이다.
용어 "항-TrkA 항체 또는 이의 단편" 또는 "인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편"은 여기에서 사용된 바와 같이, 500 nM 또는 그 이하, 바람직하게 350 nM 또는 그 이하, 더 바람직하게 150 nM 또는 그 이하, 심지어 더 바람직하게 100 nM 또는 그 이하, 가장 바람직하게 50 nM 또는 그 이하, 특히 30 nM 또는 그 이하의 친화도(KD)를 가지는 항체 또는 이의 단편은 인간 TrkA, 예를 들어(e.g.) 분리된 형태로서 인간 TrkA에 결합되고, 구체적으로, 항체 또는 이의 단편은 TrkA-Ⅱ 이성체(SEQ ID NO: 72)에 결합되며, 보다 구체적으로, 항체 및 이의 단편은 TrkA-Ⅱ 이성체의 인간 TrkA 세포 밖의 부위(SEQ ID NO: 25)의 1가 형태에 결합되는 것을 포함한다. 일반적으로 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 TrkA의 기능적 활성(functional activation)을 억제(inhibiting)할 수 있고, 및/또는 TrkA에 NGF 결합에 의해 유도되는 하나 이상의 생물학적 활성(biological activities)을 차단(blocking)하거나 감소(reducing)할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "항-NGF 항체"는 바람직하게는 인간 NGF에 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 일반적으로 항-NGF 항체는 TrkA의 기능적 활성을 억제할 수 있고, 및/또는 TrkA의 하나 이상의 생물학적 활성을 차단하거나 감소할 수 있다. NGF(hNGF와 같은)에 항-NGF 항체의 결합 친화도는 500 nM 또는 그 이하, 바람직하게 100 nM 또는 그 이하 일 수 있다. 일반적으로 항-NGF 항체는 다음의 특징 중 어느 하나 이상을 나타낸다: (a) NGF에 결합하고, NGF 생물학적 활성 및/또는 NGF 신호전달(signaling) 기능에 매개된(mediated) 하기(downstream) 경로를 억제; (b) NGF 수용체 활성의 차단 또는 감소(TrkA 수용체 이합체화(dimerization) 및/또는 자가인산화(autophosphorylation)를 포함); (c) NGF의 제거(clearance) 증가; (d) NGF 합성(synthesis), 생산(production) 또는 방출(release) 억제(감소). 항-NGF 항체는 예를 들어 PCT 공보 번호 WO 01/78698, WO 01/64247, US 특허 번호 5,844,092, 5,877,016 및 6,153,189; Hongo et al., (2000) Hybridoma, 19:215-227; GenBank 등록 번호 U39608, U39609, L17078 또는 L17077를 참조로 당업계에 공지되어있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "TrkA의 기능적 활성을 억제할 수 있는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편"은 다음의 특징 중 어느 하나 이상을 나타내는 인간화된 항-TrkA 항체를 말한다: (a) TrkA에 결합하고, TrkA 생물학적 활성 및/또는 NGF의 결합 또는 NTF3/뉴로트로핀-3 신호전달 기능에 매개된(mediated) 하기(downstream) 경로를 억제; (b) 예방(prevent), 개선(ameliorate), 및 통증의 모든 측면 치료; (c) TrkA 활성화, 또는 이합체화 및/또는 자가인산화 억제 또는 감소; (d) TrkA의 제거 증가; (e) TrkA 합성 및/또는 세포 표면(cell surface) 발현 억제 또는 감소.
본 발명에서 사용되는 용어 "TrkA의 하나 이상의 생물학적 활성을 차단하거나 감소할 수 있는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편"은 TrkA 생물학적 활성을 직접적 또는 간접적으로 감소, 억제, 중화(neutralize) 또는 제거(abolish)하는 인간화된 항-TrkA 항체를 말한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "TrkA의 생물학적 활성" 또는 "TrkA 생물학적 활성"은 다음 중 어느 하나 이상으로 제한되지 않는다: NGF 또는 다른 뉴로트로핀과 결합하는 능력(ability); 동형(homo)-이합체화(dimerize), 또는 이형(hetero)-이합체화 및/또는 자기인산화(autophosphorylate)하는 능력; NGF 유도된 신호전달 경로를 활성화하는 능력; 세포 분화(differentiation), 증식(proliferation), 생존(survival), 성장(growth), 이동(migration) 및 세포 생리(cell physiology)에서 다른 변화, (말초 및 중추 뉴런을 포함하는 뉴런의 경우)뉴런 형태(neuronal morphology)의 변화, 시냅스 형성(synaptogenesis), 시냅스 기능(synaptic function), 신경전달 물질(neurotransmitter) 및/또는 신경펩타이드(neuropeptide) 방출 및 손상 후 재생을 포함하여 촉진하는 능력; 및 통증 및 골 전이(bone metastasis)와 관련된 암 통증을 중재하는 능력.
본 발명에서 사용되는 용어 "IC50"은 억제 중간값(half maximal inhibitory concentration)(IC50)은 예를 들어, NGF-유도된 TF-1 세포의 증식에 대한 인간화된 항-TrkA 항체의 억제와 같은 생물학적 기능 억제에서 화합물의 효과의 측정을 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항체(antibody)"는 전체 길이의 항체 및 어느 항원 결합 단편 또는 이의 단쇄(single chains)를 포함한다. 항체 및 특이적 자연발생(naturally occurring) 항체는 4개의 폴리펩타이드(polypeptide) 쇄로 구성된 Y-형(shaped) 유닛(unit)의 하나 이상의 복사본으로 존재하는 당단백질(glycoproteins)이다. 각각의 "Y" 형은 상대적인 분자량에 의해 이름지어진 중쇄(Heavy(H) chain)의 두 개의 동일한 복사본, 및 경쇄(light(L) chain)의 두 개의 동일한 복사본이 포함되어있다. 중쇄는 각 경쇄와 쌍을 이루고, 및 다른 중쇄는 각 중쇄와 쌍을 이룬다. 공유결합(covalent) 쇄간(interchain) 이황화 결합(disulfide bonds) 및 비 공유결합(non covalent) 상호작용(interactions)은 체인(chain)과 함께 연결된다. 항체 및 특이적 자연발생 항체는 항원 결합 부위의 두 복사본인 가변 영역(variable regions)이 포함되어있다. 파파인(Papain)은 "Y" 형 안에 3개로 분리된 분자인 "Fab" 단편(Fab=항원 결합 단편)으로 불리는 두 개, 및 "Fc" 단편 또는 "Fc 영역"(Fc=단편 결정성)으로 불리는 한 개로 분할된 단백질 가수분해(proteolytic) 효소이다. Fab 단편은 전체의 경쇄 및 중쇄의 일부로 이루어져있다. 중쇄는 하나의 가변 도메인(중쇄 가변 도메인 또는 VH) 및 세 개 또는 네 개의 불변 도메인(CH1, CH2, CH3 및 CH4, 항체 클래스(antibody class) 또는 동종형(isotype)에 따라)이 포함되어있다. CH1 및 CH2 도메인 사이의 영역을 힌지 영역(hinge region)이라 부르고, Y-형 항체 분자의 두 개의 Fab 팔 사이의 유연성을 허용하고, 그들을 열 수 있도록 하고, 고정된 거리에 의해 분리된 두 개의 항원 결정요인에 수용 결합하도록 가깝다. IgA, IgD 및 IgG의 중쇄는 예를 들어(i.e.), 하나의 가변 도메인(VH) 및 세 개의 불변 도메인(CH1-3)인 각 네 개의 도메인을 가지고있다. 중쇄에서 IgE 및 IgM은 하나의 가변 및 네 개의 불변 도메인(CH1-4)을 가지고 있다. 항체의 불변 영역은 숙주 조직 또는 인자에 결합하고, 다양한 세포의 면역 시스템(예를들어, 이펙터(effector) 세포)을 포함하고, 보체계(complement system) 고전적 경로(classical pathway)의 첫번째 요소(C1q)를 매개로 한다. 각 경쇄는 일반적으로 하나의 공유 이황화 결합(covalent disulfide bond)으로 중쇄에 연결된다.각 경쇄는 하나의 가변 도메인(경쇄 가변 도메인 또는 VL) 및 하나의 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 경쇄 불변 도메인은 본 발명에서 IGKC로 지정된 카파(kappa) 경쇄 불변 도메인 또는 본 발명에서 IGLC로 지정된 람다(lambda) 경쇄 불변 도메인이다. 본 발명에서 사용되는 IGKC는 동등하게 Cκ 또는 CK는 같은 의미를 가진다. 본 발명에서 사용되는 IGLC는 동등하게 Cλ 또는 CL은 같은 의미를 가진다. 본 발명에서 사용되는 용어 "IGLC 도메인"은 예를 들어, IGLC1, IGLC2, IGLC3, IGLC6 및 IGLC7로 구성된 그룹으로부터 선택되는 모든 람다 경쇄 불변 도메인으로의 모든 람다 경쇄 불변 도메인을 나타낸다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 부위(complementarity determining regions, CDR)로 불리는 과변이(hypervariability) 영역에서 후에 부분할(subdivided) 되고, 구조형성 영역(framework regions, FR 또는 FW, 또는 "비-CDR 영역")으로 불리는 더 보존된(conserved) 영역이 산재(interspersed)된다. 각 VH 및 VL은 세 개의 CDR 및 네 개의 FR로 구성되어 있고, 아미노-말단(amino-terminus)으로부터 카복시-말단(carbozy-terminus)까지 다음과 같은 순서로 배열되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다.
항체는 클래스(classes)에서 그룹화되었고, 또한 동종형이라 명명되었으며, 불변 영역에 의해 유전적으로 결정되었다. 인간 불변 경쇄는 카파(kappa)(Cκ) 및 람다(lambda)(Cλ) 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤(mu)(μ), 델타(delta)(δ), 감마(gamma)(γ), 알파(alpha)(α), 또는 엡실론(epsilon)(ε)으로 분류되고, 항체의 동종형은 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 정의한다. 따라서, 본 발명에서 사용되는 "동종형"은 이의 불변 영역의 화학적(chemical) 및 항원(antigenic) 특성(characteristics)에 의해 정의된 면역글로불린(immunoglobulins)의 클래스 및/또는 하위 클래스(subclasses) 중 하나를 의미한다. 인간 면역글로불린 동종형은 IgGl(IGHG1), IgG2(IGHG2), IgG3(IGHG3), IgG4(IGHG4), IgAl(IGHA1), IgA2(IGHA2), IgM(IGHM), IgD(IGHD) 및 IgE(IGHE)으로 알려졌다. 이른바 인간 면역글로불린 허위(pseudo)-감마 IGHGP 유전자는 변경된 전환 영역때문에 서열화되었고, 암호화되지않은 단백질인 인간 면역글로불린 무거운 불변 영역 유전자의 추가를 나타낸다(Bensmana M et al., Nucleic Acids Res. 16(7):3108). 변경된 전환 영역을 가지고 있음에도 불구하고, 인간 면역글로불린 허위-감마 IGHGP 유전자는 모든 무거운 불변 도메인(CH1-CH3) 및 힌지에 대한 오픈 리딩 프레임(open reading frames)을 가진다. 정렬된 무거운 불변 도메인에 대한 모든 오픈 리딩 프레임은 예측된 구조적 특징을 가진 모든 인간 면역글로불린 불변 도메인인 단백질 도메인을 암호화한다. 이러한 본 발명에서 사용되는 추가된 허위-감마 동종형은 IgGP 또는 IGHGP이다. 다른 허위 면역글로불린 유전자는 인간 면역글로불린 무거운 불변 도메인 엠실론 P1 및 P2 허위-유전자들(IGHEP1 및 IGHEP2) 등으로 보고되어있다. IgG 클래스는 가장 일반적으로 치료를 목적으로 사용된다. 인간에서 이 클래스는 하위클래스 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 마우스에서 이 클래스는 하위클래스 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c 및 IgG3를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "키메라 항체(chimeric antibody)" 또는 "키메라 항-TrkA 항체"는 하나의 종으로부터 유도된 가변 영역 서열 및 다른 종으로부터 유도된 불변 영역 서열인 항체, 예를 들어, 마우스 항체로부터 유도된 가변 영역 서열 및 인간 항체로부터 유도된 불변 영역 서열인 항체를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "인간화된 항체" 또는 "인간화된 항-TrkA 항체"는 마우스와 같은, 다른 포유류 종의 생식세포(germline)로부터 유래된 CDR 서열이 인간 구조형성(framework) 서열에 접목된(grafted) 항체를 포함한다. 추가적인 구조형성 영역 변형(modifications)은 다른 포유류 종의 생식세포로부터 유래된 CDR 서열 내에서 뿐만 아니라 인간 구조형성 서열 내에서 만들어질 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "Fab" 또는 "Fab 영역"은 VH, CH1, VL 및 CL 면역글로불린 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. Fab는 전체 길이 항체 또는 항체 단편의 맥락에 있어서 분리에 있어서 이 영역 또는 이 영역을 참조할 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "Fc" 또는 "Fc 영역"은 첫 불변 영역 면역글로불린 도메인을 제외한 항체의 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 그러므로 Fc는 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 두 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 IgE 및 IgM의 마지막 세 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 이들 도메인에서 유연한 힌지 N-말단을 말한다. IgA 및 IgM에 대하여, Fc는 J 쇄를 포함할 수도 있다. IgG에 대하여, Fc는 면역글로불린 도메인 C 감마 2 및 C 감마 3(Cγ2 및 Cγ3) 및 C 감마 1(Cγl) 및 C 감마 2(Cγ2) 사이의 힌지을 포함한다. 비록 Fc 영역의 경계가 변할 수도 있고, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 이의 카복실-말단에서 잔기 C226 또는 P230를 포함하는 것으로 보통 정의되고, 여기서 번호붙이기(numbering)는 EU 번호붙이기 시스템에 따른 것이다(Edelman GM et al., (1969) PNAS USA 63(1): 78-85). 인간 IgG1에 대하여 Fc 영역은 여기에서 이의 카복실-말단에서 잔기 P232를 포함하는 것으로 정의되고, 여기서 번호 붙이기는 EU 번호붙이기 시스템에 따른 것이다. Fc는 예를 들어 항체인 Fc 폴리펩타이드의 맥락에 있어서, 분리에서의 이 영역 또는 이 영역을 말한다.
본 발명에서 용어 "힌지" 또는 "힌지 영역" 또는 "항체 힌지 영역"은 항체의 첫 번째 및 두 번째 불변 도메인 사이의 아미노산을 포함하는 유연한 폴리펩타이드를 포함한다. 여기에서 언급된 바와 같이 "힌지 영역"은 두 중쇄를 연결하는 시스테인(cysteine) 잔기를 포함하는, 오직 IgA, IgD 및 IgG에서 나타나는, 길이에 있어서 6-62 아미노산의 서열 영역이다. 구조적으로, IgG CH1 도메인은 EU 위치 220에서 끝나고, 및 IgG CH2 도메인은 잔기 EU 위치 237에서 시작한다. 그러므로 IgG에 대하여 항체 힌지는 여기에서 위치 221(IgG1에서 D221) 내지 231(IgG1에서 A231)을 포함하는 것으로 정의되고, 여기에서 번호붙이기는 EU 번호붙이기 시스템에 따른 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "모 항체(parent antibody)" 또는 "모 면역 글로불린(parent immunoglobulin)"은 변이체를 발생하기 위해 그 뒤에 변형되는 변형되지않은 항체를 포함한다. 상기 모 항체는 자연적으로 발생하는 항체 또는 변이체 또는 자연적으로 발생하는 항체의 조작된 버전(version)일 수도 있다. 모 항체는 항체 자체, 모 항체를 포함하는 조성물, 또는 이를 암호화하는 아미노산 서열을 말할 수도 있다. 본 발명에서 사용된 바와 같이 "모 마우스 항체(parental murine antibody)" 또는 "상응하는 마우스 항체(corresponding murine antibody)"는 항체 또는 면역 글로불린에 의해 인간 TrkA에 결합하고, WO00/73344에 개시된 바와 같이, 변이체, 마우스 항체 MNAC13 특이적으로 변형된다.
본 발명에서 사용된 용어 "변이체 항체(variant antibody)" 또는 "항체 변이체(antibody variant)"는 모체와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형의 장점(virtue)에 의해 모 항체 서열의 그것과 차이가 있는 항체 서열을 포함한다. 여기에서 변이체 항체 서열은 바람직하게 적어도 약 80%, 가장 바람직하게 적어도 약 90%, 더 바람직하게 적어도 약 95% 모 항체 서열과 일치하는 아미노산 서열을 가진다. 항체 변이체는 항체 자체, 항체 변이체를 포함하는 조성물 또는 이를 암호화하는 아미노산 서열을 말할 수 있다.
본 발명에서 용어 "아미노산 변형(amino acid modification)"은 폴리펩타이드 서열에 있어서 아미노산 치환(substitution), 삽입(insertion), 및/또는 결실(deletion)을 포함한다. 본 발명에서 "아미노산 치환" 또는 "치환"은 또 다른 아미노산과 함께 모 폴리펩티드 서열에 있어서 특정 위치에 아미노산의 대체로 의미된다. 예를 들어, 치환 R94K는 변이체 폴리펩타이드, 이 경우에 위치 94에서 아르기닌(arginine)이 라이신(lysine)으로 대체된, 중쇄 가변 구조형성영역 변이체를 말한다. 전술한 실시예에 대하여, 94K는 위치 94의 라이신으로 치환을 나타낸다. 본 발명에서 목적을 위해, 다중 치환은 전형적으로 슬래시(slash)에 의해 분리된다. 예를 들어, R94K/L78V는 치환 R94K 및 L78V를 포함하는 이중 변이체를 말한다. 본 발명에서 사용되는 "아미노산 삽입" 또는 "삽입"에 의해 모 폴리펩타이드 서열에 있어서 특정 위치에서 아미노산의 추가를 의미한다. 예를 들어, 삽입 -94는 위치 94에서 삽입을 나타낸다. 본 발명에서 사용되는 "아미노산 결실" 또는 "결실"은 모 폴리펩타이드 서열에 있어서 특정 위치에서 아미노산의 제거를 의미한다. 예를 들어, R94-는 위치 94에서 아르기닌의 결실을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 용어 "보존적 변형(conservative modifications)" 또는 "보존적 서열 변형(conservative sequence modifications)"은 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 특성에 상당히 영향을 받지않거나 또는 바뀌지 않는 아미노산 변형을 말하는 것으로 의도된다. 이런 보족적 변형은 아미노산 치환, 삽입 및 결실을 포함한다. 변형은 위치-지적 돌연변이(site-directed mutagenesis) 및 PCR-매개 돌연변이(PCR-mediated mutagenesis)와 같은, 당 업계에 잘 알려진 표준 기술에 의해 발명의 항체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기로 대체되는 치환이다. 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기의 패밀리는 당 업계에서 정의되었다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(즉, 라이신(lysine), 아르기닌(arginine), 히스티딘(histidine)), 산성 측쇄(즉, 아스파라트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid)), 비하전된 극성(uncharged polar) 측쇄(즉, 글라이신(glycine, 아스파라긴(asparagine), 글루타민(glutamine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 타이로신(tyrosine), 시스테인(cysteine), 트립토판(tryptophan)), 비극성 측쇄(즉, 알라닌(alanine), 발린(valine), 루신(leucine), 이소루신(isoleucine), 프롤린(proline), 페닐알라닌(phenyl alanine), 메티오닌(methionine)), 베타-분지된 측쇄(즉, 트레오닌, 발린, 이소루신) 및 방향족 측쇄(즉, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)의 아미노산을 포함한다. 그러므로, CDR 내에 또는 본 발명의 항체의 구조형성 영역 내에 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고 및 변형된 항체(변이체 항체)는 보유된 기능을 위해 시험될 수 있다.
모든 인간 면역 글로불린 중쇄 불변 도메인에 대하여 번호붙이기는 "EU 번호붙이기 시스템(EU numbering system)"에 따른 것이다(Edelman GM et al., ibid). 인간 카파 면역 글로불린 경쇄 불변 도메인(IGKC)에 대하여, 번호붙이기는 "EU 번호붙이기 시스템"에 따른 것이다(Edelman GM et al., ibid). 인간 람다 면역 글로불린 경쇄 불변 도메인(IGLC1, IGLC2, IGLC3, IGLC6, 및 IGLC7)에 대하여, 번호붙이기는 Dariavach P et al., (1987) PNAS USA, 84(24):9074-8 및 Frangione B et al., (1985) PNAS USA, 82(10):3415-9에 의해 설명된 바와 같이 "케벳(Kabat) 번호붙이기 시스템"에 따른 것이다(Kabat EA et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition-US Department of Health and Human Services, NIH publication n° 91-3242).
용어 "가변 도메인(variable domain)"은 항원-결합을 매개하고 및 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의하는 도메인을 말한다. 자연적으로 발생하는 항체에서, 항원-결합 부위(site)는 특이성: 중쇄에 위치한 하나, 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄에 위치한 다른 하나, 경쇄 가변 도메인(VL)으로 정의하는 두 개의 가변 도메인으로 구성된다. 일부 경우에, 특이성은 카멜리드(camelids)에서 발견되는 중쇄 항체로부터 단일-도메인 항체와 같이 두 도메인 중 오직 하나에 배제적으로 존재할 수도 있다. V 영역은 보통 약 110 아미노산 길이이고, 및 7-17 아미노산 길이인 "과가변영역(hypervariable regions)"으로 불리는 극가변성의 더 짧은 영역에 의해 분리된 15-30 아미노산의 구조형성 영역(FRs 또는 비-CDR 영역)으로 불리는 아미노산 서열의 상대적으로 불변 스트래치(stretches)로 구성된다. 선천적 중 및 경쇄의 가변 도메인은 루프를 형성하는, 세 개의 과가변 영역에 의해 연결된, 베타-시트(beat sheet) 배열을 거의 적용하는, 4 개의 FRs를 포함한다. 각 쇄에 있는 과가변영역은 서로 FRs에 의해 아주 근접하여 서로 붙잡히고, 및 다른 쇄로부터 과가변영역과 함께, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(Kabat EA et al., ibid 참조). 본 발명에서 사용되는 용어 "과가변영역"은 항원 결합에 책임이 있는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 과가변영역은 일반적으로 "상보적 결정 부위(complementary determining region)" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함하고, 후자는 가장 높은 서열 가변성이고 및/또는 항원 인식이 포함된다. 모든 가변 도메인에 대하여 번호붙이기는 케벳에 따른 것이다(Kabat EA et al., ibid).
많은 CDR 정의는 본 발명에서 포함되고, 사용된다. 케벳 정의는 서열 가변성에 기반하고 및 가장 일반적으로 사용된다(Kabat EA et al., ibid). 코티아(Chothia)는 대신에 구조적 루프의 위치를 말한다(Chothia & Lesk J. (1987) Mol. Biol. 196:901-917). AbM 정의는 케벳 및 코티아 사이에서 포함되는 및 Oxford Molecular's AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다(Martin ACR et al., (1989) PNAS USA, 86:9268-9272; Martin ACR et al., (1991) Methods Enzymol. 203:121-153; Pedersen JT et al., (1992) Immunomethods 1:126-136; Rees AR et al., (1996) In Sternberg M.J.E. (ed.) Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172). 접촉 정의는 최근 소개되었고(MacCallum RM et al., (1996) J. Mol. Biol. 262:732-745) 및 Protein Databank에 사용할 수 있는 사용할 수 있는 복합체 구조의 분석에 기반한다. IMGT®에 의한 CDR의 정의는, 국제적인 ImMunoGeneTics information system®(http://www.imgt.org)은 모든 종의 모든 면역글로블린 및 T 세포 수용체 V-REGIONs를 위한 IMGT 번호붙이기에 기반한다(IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system®; Lefranc MP et al., (1999) Nucleic Acids Res. 27(1):209-12; Ruiz M et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):219-21; Lefranc MP (2001) Nucleic Acids Res. 29(1):207-9; Lefranc MP (2003) Nucleic Acids Res. 31(1):307-10; Lefranc MP et al., (2005) Dev. Comp. Immunol. 29(3):185-203; Kaas Q et al., (2007) Briefings in Functional Genomics & Proteomics, 6(4):253-64).
본 발명에서 모든 상보성 결정 영역(Complementarity Determining Regions, CDRs)은 바람직하게는 다음과 같이 정의된다(Kabat EA et al., ibid에 따른 번호붙이기): LCDR1: 24-34; LCDR2: 50-56; LCDR3: 89-98; HCDR1: 26-35; HCDR2: 50-56; HCDR3: 95-102. 가변 도메인의 "비-CDR 영역"은 구조형성 영역(FR)으로 알려져있다. 본 발명에서 사용된 VL 영역의 "비-CDR 영역"은 아미노산 서열: 1-23 (FR1), 35-49 (FR2), 57-88(FR3), 및 99-107 (FR4)를 포함한다. 본 발명에서 사용된 VH 영역의 "비-CDR 영역"은 아미노산 서열: 1-25 (FR1), 36-49 (FR2), 66-94 (FR3), 및 103-113 (FR4)를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "전체 길이 항체(full length antibody)"는 가변 및 불변 영역을 포함하는, 자연적인 생물학적 형태의 항체를 구성하는 구조를 포함한다. 예를 들어, 인간 및 마우스를 포함하는 대부분의 포유류에서, IgG 클래스의 전체 길이 항체는 사량체 및 두 면역 글로불린 쇄의 두 개의 일치하는 쌍의 구성, 하나의 경 및 하나의 중쇄를 가지는 각 쌍, 면역 글로불린 도메인 VL 및 CL을 포함하는 각 경쇄 및 면역 글로불린 도메인 VH, CH1 (Cγ1), CH2 (Cγ2), 및 CH3 (Cγ3)을 포함하는 각 중쇄로 구성된다. 일부 포유류에서, 예를 들어 낙타(camels) 및 라마(llamas)에서, IgG 항체는 오직 두 중쇄, Fc 영역에 접합된 가변 도메인을 포함하는 각 중쇄로 구성될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항체 단편은, (i) Fab' 및 Fab'-SH를 포함하는, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 Fab 단편, (ii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편, (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (iv) 단일 가변 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature, 341:544-546), (v) 두 연결된 Fab 단편을 포함하는 이가 단편, F(ab')2 단편 (vi) 여기서 VH 도메인 및 VL 도메인은 두 도메인이 항원 결합 부위와 관련이 있을 수 있는 펩티드 링커(linker)에 의해 연결된, 단쇄 Fv 분자(scFv)(Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) PNAS USA, 85:5879-5883), (vii) 이특이적(bispecific) 단쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965), (viii) "디아체(diabodies)" 또는 "트리아체(triabodies)", 유전자 융합에 의해 만들어진 다중가 또는 다중특이적 단편(Tomlinson I et al., (2000) Methods Enzymol. 326:461-479; WO94/13804; Holliger et al., (1993) PNAS USA 90:6444-6448) 및 (ix) 동일한 또는 다른 항체에 유전적으로 융합된 scFv(Coloma & Morrison (1997) Nature Biotech. 15:159-163)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "효과기 기능(effector function)"은 Fc 수용체 또는 리간드와 항체 Fc 영역의 상호작용으로부터 야기하는 생화학적 사건을 포함한다. 효과기 기능은 ADCC(항체 의존적 세포-매개된 세포 독성) 및 ADCP(항체 의존적 세포-매개된 식세포작용)와 같은 FcγR-매개된 효과기 기능, 및 CDC(상보적 의존적 세포독성)와 같은 상보적-매개된 효과기 기능을 포함한다. 항체의 효과기 기능은 Fc 수용체 또는 상보적 구성성분과 같은 효과기 분자에 대한 항체의 친화도를 변화함, 즉 강화하거나 또는 완화하거나, 바람직하게 강화함에 의해 변화될 수도 있다. 결합 친화도는 일반적으로 효과기 분자 결합 부위를 변형함에 의해 일반적으로 바뀔 것이고, 및 이 경우 흥미의 부위를 위치하고 적절한 방법으로 부위의 적어도 부분을 변형하는 것이 적절하다. 또한, 효과기 분자에 대한 항체에 있는 결합 부위에서 변경은 전체 결합 친화도를 상당히 바뀔 필요는 없으나 비-생산적 결합으로서 비효율적인 효과기 기전을 만드는 상호작용의 기하학을 바뀔 수도 있다고 또한 예상된다. 상기 효과기 기능은 또한 효과기 분자 결합을 직접 포함하지 않는 부위를 변형함에 의해 바뀔 수도 있으나, 그렇지 않으면 효과기 기능의 수행에 포함될 수도 있다. 항체의 효과기 기능을 바꿈에 의해 면역 반응의 다양한 측면을 조절하는 것, 예를 들어 진단 및 치료에서 가능한 이득이 되는 효과와 함께, 면역 시스템의 다양한 반응을 강화하거나 또는 억제하는 것이 가능할 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개체(subject)"는 어느 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물(vertebrates), 예를 들어, 영장류(primates), 양(sheep), 개(dogs), 고양이(cats), 말(horses), 소(cows), 닭(chickens), 양서류(amphibians), 파충류(reptiles) 등과 같은, 포유류 및 비-포유류를 포함한다. 바람직하게 개체는 인간이다.
본 발명의 항체
첫 번째 측면에서 본 발명은 하기와 같이 구성된 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편을 제공한다:
a) SEQ ID NOs: 1-5로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인(domain), 및
b) SEQ ID NOs: 6-13으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인,
중쇄 가변 도메인의 CDR2는 적어도 하나의 아미노산 치환(substitution)을 포함하고, 및/또는 중쇄 가변 도메인의 비-CDR 부위는 37, 42 및 89로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 위치의 아미노산 치환을 포함하며, 각 그룹 멤버의 아미노산 위치는 케벳(Kabat)에 설정된 번호붙이기(numbering) 시스템(system)을 이용하여 표시된다.
일부 실시형태에 있어서, 중쇄 가변 도메인의 CDR2는 적어도 하나의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 중쇄 가변 도메인의 비-CDR 영역은 37, 42 및 89로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 위치에서의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 중쇄 가변 도메인의 CDR2는 SEQ ID NO: 15의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 중쇄 가변 도메인은 SEQ ID NOs: 1, 3 및 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 SEQ ID NOs: 6 및 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 조합을 포함하고, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6의 서열 또는 SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 8의 서열인 것이 바람직하고, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6의 서열인 것이 더욱 바람직하다.
일부 실시형태에 있어서, 본 발명에서 제공되는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편의 중쇄 가변 도메인은 SEQ ID NO: 71의 서열을 포함하지않는다.
일부 실시형태에 있어서, 본 발명에서 제공되는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편의 중쇄 가변 도메인은 위치 87의 세린(serine)이 없고, 상기 각 그룹 구성원의 아미노산 위치는 케벳에 설정된 번호붙이기 시스템을 이용하여 나타내었다.
일부 실시형태에 있어서, 본 발명에서 제공되는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편의 중쇄 가변 도메인은 위치 87에 트레오닌(threonine)을 포함하고, 상기 각 그룹 구성원의 아미노산 위치는 케벳에 설정된 번호붙이기 시스템을 이용하여 나타내었다.
일부 실시형태에 있어서, 중쇄 가변 도메인의 CDR2의 아미노산 치환은 50, 60 및 62로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함하고, 60 및 62로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 상기 각 그룹 구성원의 아미노산 위치는 케벳에 설정된 번호붙이기 시스템을 이용하여 나타내었다.
일부 실시형태에 있어서, 중쇄 가변 도메인의 CDR2의 아미노산 치환은 Y50A, P60A 및 T62S로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하지 않고, 상기 각 그룹 구성원의 아미노산 위치는 케벳에 설정된 번호붙이기 시스템을 이용하여 나타내었다.
일부 실시형태에 있어서, 만일 중쇄 가변 도메인의 비-CDR 부위에서의 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편의 아미노산 치환이 A49S라면, 중쇄 가변 도메인의 CDR2에서의 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편의 아미노산 치환은 Y50A가 아니다.
일부 실시형태에 있어서, 중쇄 가변 도메인의 비-CDR 부위에서의 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편의 아미노산 치환이 A49S가 아니면, 및/또는 중쇄 가변 도메인의 CDR2에서의 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편의 아미노산 치환은 Y50A가 아니다.
일부 실시형태에 있어서, 항체 또는 이의 단편의 중쇄 가변 도메인의 비-CDR 부위의 아미노산 치환은 V37A, G42E 및 V89L로 선택되는 아미노산 치환을 포함하고, V37A인 것이 바람직하며, 상기 각 그룹 구성원의 아미노산 위치는 케벳에 설정된 번호붙이기 시스템을 이용하여 나타내었다.
일부 실시형태에 있어서, 항체는 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 상기 중쇄 가변 도메인의 비-CDR 부위의 아미노산 치환은 V37A, T40A, G42E, R44G, A49S 및 V89L로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하며, V37A, T40A, G42E, R44G 및 V89L로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 상기 각 그룹 구성원의 아미노산 위치는 케벳에 설정된 번호붙이기 시스템을 이용하여 나타내었다.
일부 실시형태에 있어서, 항체는 SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 6의 서열을 포함하거나 또는 SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 8의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 조합을 포함하고, 상기 중쇄 가변 도메인의 비-CDR 부위의 아미노산 치환은 V37A, T40A, G42E, R44G, A49S 및 V89L로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하며, V37A, T40A, G42E, R44G 및 V89L로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 상기 각 그룹 구성원의 아미노산 위치는 케벳에 설정된 번호붙이기 시스템을 이용하여 나타내었다.
일부 실시형태에 있어서, 중쇄 가변 도메인의 비-CDR 부위의 아미노산 치환은 K3Q, V37A, G42E, A49S, V89L 및 R94K로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하고, K3Q, V37A, G42E, V89L 및 R94K로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, K3Q 및 V37A 아미노산 치환을 포함하는 것이 더욱 바람직하고, V37A 아미노산 치환인 것이 가장 바람직하며, 상기 각 그룹 구성원의 아미노산 위치는 케벳에 설정된 번호붙이기 시스템을 이용하여 나타내었다. 동등하게 가장 바람직한 실시형태로의 상기 중쇄 가변 도메인의 비-CDR 부위의 아미노산 치환은 V37A 및 K3Q으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하고, 상기 각 그룹 구성원의 아미노산 위치는 케벳에 설정된 번호붙이기 시스템을 이용하여 나타내었다.
일부 실시형태에 있어서, 항체는 SEQ ID NO: 5의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 상기 중쇄 가변 도메인의 비-CDR 부위의 아미노산 치환은 K3Q, V37A, G42E, A49S, V89L 및 R94K로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하고, K3Q, V37A, G42E, V89L 및 R94K로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, K3Q 및 V37A 아미노산 치환을 포함하는 것이 더욱 바람직하고, V37A 아미노산 치환인 것이 가장 바람직하며, 상기 각 그룹 구성원의 아미노산 위치는 케벳에 설정된 번호붙이기 시스템을 이용하여 나타내었다. 동등하게 가장 바람직한 실시형태로의 상기 항체는 SEQ ID NO: 5의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 상기 중쇄 가변 도메인의 비-CDR 부위의 아미노산 치환은 V37A 및 K3Q으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하며, 상기 각 그룹 구성원의 아미노산 위치는 케벳에 설정된 번호붙이기 시스템을 이용하여 나타내었다.
또 다른 측면에서 본 발명은 하기와 같이 구성된 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편을 제공한다:
a) SEQ ID NOs: 31-49로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인, 및
b) SEQ ID NOs: 6-13으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인.
일부 실시형태에 있어서, 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 하기와 같이 구성된다:
a) SEQ ID NOs: 32, 36, 39, 43, 48 및 49로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인, 및
b) SEQ ID NOs: 6-13으로 구성되는 군으로부터 선택되는 또는 SEQ ID NOs: 6 및 8로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인.
일부 실시형태에 있어서, 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 하기와 같이 구성된다:
a) SEQ ID NOs: 32, 36, 48 및 49로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인, 및
b) SEQ ID NOs: 6 또는 8로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인.
일부 실시형태에 있어서, 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 하기와 같이 구성된다:
a) SEQ ID NOs: 32 및 36으로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인, 및
b) SEQ ID NO: 6의 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인.
일부 실시형태에 있어서, 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 하기와 같이 구성된다:
a) SEQ ID NOs: 36의 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인, 및
b) SEQ ID NO: 6의 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인.
일부 실시형태에 있어서, 인간화된 항-TrkA 항체는 SEQ ID NO: 32 및 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 32 및 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 36 및 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 48 및 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 49 및 SEQ ID NO: 6, 및 SEQ ID NO: 49 및 SEQ ID NO: 8의 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 조합을 포함하고, SEQ ID NO: 32 및 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 32 및 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 36 및 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 49 및 SEQ ID NO: 6, 및 SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 8의 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, SEQ ID NO: 36 및 SEQ ID NO: 6의 서열의 조합으로부터 선택되는 것이 가장 바람직하다.
일부 실시형태에 있어서, 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 중 및/또는 경 불변 영역을 더 포함하고, 중 및/또는 경 불변 영역 및 힌지 영역이 바람직하다. 바람직한 중 불변 영역은 인간 기원(origin)이고, 예를 들어, 인간 IgG1(IGHG1), IgG2(IGHG2), IgG3(IGHG3), IgG4(IGHG4), IgA1(IGHA1), IgA2(IGHA2), IgM(IGHM), IgD(IGHD), 또는 IgE(IGHE) 동종형이 있다. 더 바람직한 중 불변 영역은 인간 IGHG1 동종형 또는 인간 IGHG4 동종형이다. 바람직한 경 불변 영역은 인간 기원이고, 인간 카파(CK) 또는 인간 람다(Cλ) 경 불변 도메인이며, 바람직하게는 인간 카파 경 불변 도메인이다.
일부 실시형태에 있어서, 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 중 및/또는 경 불변 영역 및 힌지 영역을 더 포함하고, 상기 중 불변 영역 및 힌지 영역은 인간 IGHG1 동종형 또는 인간 IGHG4 동종형이다.
일부 실시형태에 있어서, 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 중 및/또는 경 불변 영역 및 힌지 영역을 더 포함하고, 상기 중 불변 영역 및 힌지 영역은 인간 IGHG4 동종형이며, 및 상기 힌지 영역은 S228P 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 위치는 EU 번호붙이기 시스템을 이용하여 나타내었다.
또 다른 측면에서 본 발명은 하기와 같이 구성된 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편을 제공한다:
a) SEQ ID NOs: 50 내지 70으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 중쇄, 및
b) SEQ ID NOs: 29 및 30으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 경쇄.
일부 실시형태에 있어서, 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 하기와 같이 구성된다:
a) SEQ ID NOs: 51, 52, 56, 57, 60, 64, 69 및 70으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 중쇄, 및
b) SEQ ID NOs: 29 및 30으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 경쇄, 바람직하게는 SEQ ID NO: 29.
일부 실시형태에 있어서, 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 하기와 같이 구성된다:
a) SEQ ID NOs: 51, 52, 56, 57, 69 및 70으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 중쇄, 및
b) SEQ ID NOs: 29 및 30으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 경쇄, 바람직하게는 SEQ ID NO: 29.
일부 실시형태에 있어서, 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 하기와 같이 구성된다:
a) SEQ ID NOs: 51, 52, 56, 57 및 70으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 중쇄, 및
b) SEQ ID NOs: 29 및 30으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 경쇄, 바람직하게는 SEQ ID NO: 29.
일부 실시형태에 있어서, 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 하기와 같이 구성된다:
a) SEQ ID NOs: 51, 52, 56 및 57로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 중쇄, 및
b) SEQ ID NOs: 29 및 30으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 경쇄, 바람직하게는 SEQ ID NO: 29.
일부 실시형태에 있어서, 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 하기와 같이 구성된다:
a) SEQ ID NO: 57의 서열을 갖는 중쇄, 및
b) SEQ ID NO: 29의 서열을 갖는 경쇄.
일부 실시형태에 있어서, 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 전체 길이 항체이다.
일부 실시형태에 있어서, 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, Fd, Fv, dAb , F(ab')2, scFv, 이특이성(bispecific) 단쇄(single chain) Fv 이량체, 디아체(diabodies), 트리아체(triabodies) 및 동일한 또한 다른 항체에 유전적으로 융합된 scFv로 구성된 군으로부터 선택되는 항체 단편이고, 바람직하게는 scFv, 또는 Fab이며, 더 바람직하게는 scFv 이량체 또는 디아체 또는 F(ab')2 이다.
일부 실시형태에 있어서, 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 모 항체의 Fc 영역에 대하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하고, 반면에 항체는 모 항체와 비교하여 바뀐 효과기 기능을 보이는 변이체 Fc 영역을 포함한다.
Fc 영역 내에서의 아미노산 변형은 보통 예를 들어 혈청 반감기(serum half-life), 보체 고정(complement fixation), Fc 수용체 또는 리간드 결합과 관련있는 효과기 기능, 및/또는 항원-의존성 세포독해작용(antigen-dependent cellular cytotoxicity)의 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경한다. 하기에 설명된대로 Fc 영역 내에서의 변형은 Fc 영역에서 잔기의 EU 번호붙이기에 따른다. 하나의 실시형태에 있어서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역의 시스테인 잔기의 번호가 변형되도록 하여, 예를 들어, 증가되거나 감소되도록 변경된다. 이 방법은 Bodmer et al에 의한 미국 특허 번호 5,677,425에 추가적으로 설명되어있다. CH1의 힌지 영역에 있는 시스테인 잔기의 수는 예를 들어, 경 및 중쇄의 집합을 촉진하거나, 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소하도록 변경시킨다. 다른 실시형태에 있어서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소하도록 돌연변이시킨다. 보다 구체적으로, 하나 또는 그 이상의 아미노산 돌연변이를 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 접촉면 영역으로 도입시켜 항체가 고유의 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비해 포도상구균(Staphylococcyl) 단백질 A(SpA) 결합에 약하다. 상기 접근 방법은 Ward et al에 의한 미국 특허번호 6,165,745에서 추가적으로 상세히 설명하고있다. 다른 실시형태에 있어서, 항체는 자체의 생물학적 반감기를 증가시키기 위해 변형된다. 다양한 접근방법이 가능하다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 하기의 돌연변이가 도입될 수 있다: Ward에 의한 미국 특허번호 6,277,375에서 설명된 T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는 Presta et al에 의한 미국 특허번호 5,869,046 및 6,121,022에서 설명된 바와 같이, IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프(loop)로부터 수용된 항원 결정기에 결합하는 구조 수용체를 포함하는 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다. 추가적인 실시형태에 있어서, 항체의 효과 기능을 변경시키기 위해 Fc 영역은 적어도 하나의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 대체하여 변경된다. 예를 들어, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 아미노산은 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 상기 항체는 효과기 리간드를 위한 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력은 유지한다. 변경된 친화도에 효과기 리간드는, 예를 들어, Fc 수용체 또는 보완물의 C1 구성요소일 수 있다. 상기 접근방법은 Winter et al에 의한 미국 특허번호 5,624,821 및 5,648,260에서 추가적으로 상세히 설명되어 있다. 또 다른 예에서, 아미노산 잔기 329, 331 및 332로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 아미노산은 다른 아미노산 잔기로 대체되어 항체는 C1q 결합을 변경하고 및/또는 보체 의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC)을 감소하거나 폐지한다. 상기 접근방법은 Idusogie et al에 의한 미국 특허번호 6,194,551에서 추가적으로 상세히 설명되고 있다. 또 다른 예에서, CH2 도메인의 N-말단 영역의 아미노산 위치 231 내지 238 내의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기는 변경되어 항체의 능력을 변경시키고 보체를 고정시킨다. 상기 접근방법은 Bodmer et al에 의한 PCT 공개 WO 94/29351에서 추가적으로 설명되고 있다. 또 다른 예에서, Fc 영역은 하기의 위치에서 하나 또는 그 이상의 아미노산을 변형시켜 항체 의존적 세포독성(ADCC) 매개 항체의 능력을 증가시키고 및/또는 Fcγ 수용체를 위한 항체의 친화도를 증가시킨다: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439. 상기 접근방법은 Presta에 의한 PCT 공개 WO 00/42072에서 추가적으로 설명되고 있다. 또한, 본 발명의 항체는 화학적으로 수정된(예를 들어, 하나 또는 그 이상의 화학적 부분이 항체에 부착될 수 있음) 또는 이의 당화과정(glycosylation)을 수정할 수 있다.
본 발명의 항체의 특성
일부 실시형태에 있어서, 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 TrkA의 기능적 활성을 억제할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 인간화된 항-TrkA 항체는 TrkA의 하나 또는 그 이상의 생물학적 활성을 차단 또는 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 500 nM 또는 그 이하의 인간 TrkA에 결합하는 친화도(KD) , 바람직하게 350 nM 또는 그 이하, 더 바람직하게 150 nM 또는 그 이하, 심지어 더 바람직하게 100 nM 또는 그 이하, 가장 바람직하게 50 nM 또는 그 이하, 특히 30 nM 또는 그 이하 예를 들어, BIAcore 2000 측정기(GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, 스위스)를 사용하여 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR)으로 측정하였고, 또는 당업계에 공지된 상응하는 기기인 측정물질로 사용된 재조합 1가(monovalent) 인간 TrkA 세포 밖 도메인(SEQ ID NO: 25)과 함께 기기 센서 칩에 대한 항체를 캡쳐하였다. 본 발명에서 사용된 "1가"는 인위적으로 이량 또는 다량 되지않는, 이는 예를 들어, 도메인이 될 경우에는 아미노-말단 부분에 면역 글로불린 Fc 부분이 융합되거나, 또는 자연적으로 이량 되지않는, 이는 예를 들어, 도메인이 될 경우에는 자연적 리간드 NGF와 관련된 인간 TrkA 세포 밖 도메인과 같은 인간 TrkA 수용체 도메인과 관련된 TrkA 수용체를 사용하여 친화도 측정에 관한 것이다.
예를 들어 인간 TrkA와 같은 항체의 결합 능력을 측정하기 위한 표준 분석(standard assays)은 ELISAs, BIAcore, 웨스턴블롯(western blots), RIAs 및 유세포 분석기(flow cytometry analysis)을 포함하는 예로 당업계에 알려져있다. 적합한 분석은 실시예에 상세히 설명되어 있다. 항체의 결합역동(binding kinetics)(예: KD와 같은 결합친화도)은 당업계에서 알려진 스캐차드(Scatchard) 또는 BIAcore 시스템 분석과 같은 표준분석에 의해 평가될 수 있다. 상대적인 결합친화도 Ki는 당업계에서 알려진 표준 경쟁분석에 의해 평가될 수 있다. 조작된 항-TrkA 항체는 TF-1 세포 증식 분석에서의 TrkA의 기능적 활성 억제하는 그들의 능력에 대해 분석될 수 있다. 억제 중간값(IC50)은 생물학적 기능을 억제하는 화합물의 효과를 측정하여 바람직한 항체를 선택하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 예를 들어, 인자(factor) 유래(dependent) 인간 백혈병(erythroleukemic) 세포주(cell line) TF-1을 사용하여 세포 표면의 TrkA/베타-NGF 매개된 세포 증식을 차단하는 항체의 능력에 의해 측정된 모 마우스 항체에 해당하는 TF-1 세포 증식 분석에서 적어도 동등하거나 낮은 IC50을 갖는다(Kitamura et al., (1989) J. Cellular Physiology 140(2):323-34). 바람직하게는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 TF-1 세포 증식 분석에서 1 ㎍/㎖ 또는 그 이하의 IC50을 가지고, 더 바람직하게는 0.75 ㎍/㎖ 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는 0.5 ㎍/㎖ 또는 그 이하, 가장 바람직하게는 0.3 ㎍/㎖ 또는 그 이하, 특히 0.1 ㎍/㎖ 또는 그 이하이다.
일부 실시형태에 있어서, 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 65℃ 보다 더 높은 FAB 단편 내열성 온도를 갖고, 바람직하게는 70℃보다 더 높다. FAB 단편 열 안정도 분석을 위해서, 차 주사열량측정(differential scanning calorimetry)이 사용되었고, 반면에 전장 IgG의 조건에서 FAB 단편의 중간 지점 녹는 온도가 확인되었다. 산기 종류의 열량 측정은 당업자에게 알려져있고, 예를 들어, Garber & Demarest (2007) BBRC 355:751-7에 따라 수행될 수 있다. 놀랍게도, 본 발명의 인간화된 항체는 모 마우스 항체의 FAB 단편 내열성 온도와 동등한 FAB 단편 내열성 온도를 갖고, 동등한 친화도는 SPR에 의해 측정되었고, 및 개선된 효능은 TF-1 세포 증식 분석에 의해 측정되어 발견되었다. 따라서, 본 발명은 인간 TrkA에 대한 동등한 친화도 및 개선된 억제 성질에 대한 모 마우스 항체의 동등한 FAB 단편 내열성 온도와 같은 FAB 단편 내열성 온도를 가진 인간화된 항-TrkA 항체를 제공한다.
본 발명에서 사용된 "모 마우스 항체의 FAB 단편 내열성 온도와 동등한 FAB 단편 내열성 온도"는 FAB 단편 내열성 온도를 가지는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 모 마우스 항체의 FAB 단편 내열성 온도의 ±20%의 범위 내, 바람직하게는 ±15%의 범위 내, 더 바람직하게는 ±10%의 범위 내, 더욱더 바람직하게는 ±5%의 범위 내이다. 바람직하게는, 본 발명의 인간화된 항체는 모 마우스 항체의 FAB 단편 내열성 온도보다 15% 이상 낮지않은 FAB 단편 내열성 온도를 갖는다.
본 발명에서 사용된 "인간 TrkA의 동등한 친화도"는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편의 친화도는 모 마우스 항체의 ±20%의 범위 내, 바람직하게는 ±15%의 범위 내, 더 바람직하게는 ±10%의 범위 내이다. 바람직하게는, 본 발명의 인간화된 항체는 모 마우스 항체의 KD보다 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10% 낮은 KD를 갖는다.
본 발명은 또한 통증 치료에 사용될 수 있는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
인간화된 항-TrkA 항체의 효과는 뒷발(hind paw)에 완전 프로인트 보조제(Complete Freunds adjuvant, CFA)의 발바닥 내(intraplantar) 투여에 의해 유도되는 급성 염증성 통각과민(acute inflammatory hyperalgesia)으로 고통받는 마우스로 시험하였다(실시예 2 참조). 인간화된 항-TrkA 항체의 0.1 ㎎/㎏ 농도 또는 그 이상의 투여는 NSAID 인도메타신(indomethacin)에서 관찰된 것과 유사한 통각과민의 유의한 변화를 생산한다.
인간화된 항-TrkA 항체의 효과는 무릎 관절(knee joint)에 CFA의 관절 내(intra-articular) 투여에 의해 유도되는 만성 염증성 통각과민(chronic inflammatory hyperalgesia)으로 고통받는 마우스로 시험하였다(실시예 3 참조). 인간화된 항-TrkA 항체의 0.1 ㎎/㎏ 농도 또는 그 이상의 단일 투여는 COX-2 선택적 NSAID 셀레콕시브(celecoxib)의 다중 투여에서 관찰된 것과 유사한 통각과민의 유의한 변화를 생산한다.
인간화된 항-TrkA 항체의 효과는 무릎 관절에 모노소듐 아이오도아세테이트(monosodium iodoacetate, MIA)의 관절 내 투여에 의해 유도되는 만성 골관절염성 통각과민(chronic osteoarthritic hyperalgesia)으로 고통받는 마우스로 시험하였다(실시예 4 참조). 인간화된 항-TrkA 항체의 0.1 ㎎/㎏ 농도 또는 그 이상의 단일 투여는 아편 트라마돌(opiate tramadol) 및 프리가발린(pregabalin)의 다중 투여에서 관찰된 것과 유사한 통각과민의 유의한 변화를 생산한다.
인간화된 항-TrkA 항체의 효과는 좌골신경(sciatic nerve)의 만성 협착(chronic constriction)에 의해 유도되는 신경병증성 통증(neuropathic pain)으로 고통받는 마우스로 시험하였다(CCI 모델; 실시예 5 참조). 인간화된 항-TrkA 항체의 0.1 ㎎/㎏ 농도 또는 그 이상의 단일 투여는 프리가발린의 1 ㎎/㎏의, 최대 용량으로 실험된, 다중 투여에서 관찰된 것과 유사한 기계적 통각과민(mechanical hyperalgesia) 및 냉 이질통(cold allodynia)의 유의한 변화를 생산한다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시예는 급성 염증성 통증, 만성 염증성 통증, 골관절염성 통증 및/또는 신경병증성 통증을 앓고있는 환자의 치료를 위한 인간화된 항-TrkA 항체를 제공한다.
헥산 , 벡터 및 숙주 세포
본 발명은 또한 항-TrkA 항체 및 이의 단편을 암호화하는 분리된 핵산, 벡터, 및 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다. 상기 핵산은 전체 세포, 세포 용해물, 또는 부분 정제 또는 충분한 순수형태(substantially pure form)로 존재할 수 있다. 상기 핵산은 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에서 잘 알려진 다른 것을 포함하는 표준 기술에 의해, 다른 세포 구성요소 또는 다른 오염물질, 예를 들면, 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 떨어져 정제될 때 “분리된”또는 “제공된 충분한 순수(rendered substantially pure)”이고, Ausubel F et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York을 참고하면 된다. 본 발명의 핵산은, 예를 들면, DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론(intronic) 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 핵산은 cDNA 분자이다.
본 발명의 핵산은 표준분자생물기술(standard molecular biology techniques)을 사용하여 얻을 수 있는데, 예를 들면, 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하거나 VH 및 VL 부분을 암호화하는 cDNAs는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 얻을 수 있다. 면역 글로불린유전자 라이브러리로부터 얻어진 항체에 대하여(예: 파지 디스플레이 기술(phage display techniques)을 이용하여), 상기 항체를 암호화하는 하나 또는 그 이상의 핵산은 라이브러리로부터 회수(recovered)될 수 있다. 숙주세포로 외인성(exogenous) 핵산을 도입하는 방법은 당업계에서 잘 알려져있고, 사용되는 숙주세포와 같이 다양하다. 기술은 덱스트란-매개된 형질주입(dextran-mediated transfection), 칼슘포스페이트 침전(calcium phosphate precipitation), 칼슘클로라이드 처리(calcium chloride treatment), 폴리에틸렌이민(polyethylenimine) 매개된 형질주입, 폴리브렌(polybrene) 매개된 형질주입, 원형질체(protoplast) 융합, 전기천공(electroporation), 바이러스 또는 파지 감염, 리포솜(liposomes)에서 폴리뉴클레오티드의 캡슐화(encapsulation), 및 핵으로 DNA의 직접 미세주사(microinjection)를 포함한다. 포유류 세포의 경우에서, 형질주입은 일시적 또는 안정적일 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 항-TrkA 항체 및 이의 단편을 암호화하는 분리된 핵산은 SEQ ID NOs 73-116으로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하고, 일반적으로 경쇄 가변 영역 또는 경쇄는 SEQ ID NOs: 113, 114, 115 및 116으로 구성된 군으로부터, 및/또는 중쇄 가변 영역 또는 중쇄는 SEQ ID NOs: 73-112로 구성된 군으로부터 선택되는 암호화하는 핵산 분자이다.
본 발명의 바람직한 핵산 분자는 SEQ ID NOs: 113 및 114로 구성된 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NOs: 74, 78, 81, 85, 90 및 91로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역을 암호화한다. 더 바람직한 핵산 분자는 SEQ ID NOs: 74 및 78로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NOs: 113 및 114로 구성된 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역을 암호화한다. 가장 바람직한 핵산 분자는 SEQ ID NO: 74 또는 78의 핵산 서열로 구성되는 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 113의 핵산 서열로 구성되는 경쇄 가변 영역을 암호화한다.
본 발명의 다른 바람직한 핵산 분자는 SEQ ID NO: 115 및 116로 구성된 군으로부터 선택되는 경쇄 및/또는 SEQ ID NO: 93, 94, 98, 99, 102, 106, 111 및 112로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄를 암호화한다. 더 바람직한 핵산 분자는 SEQ ID NO: 93, 94, 98 및 99의 핵산 서열을 포함하는 중쇄를 암호화하고, 및/또는 SEQ ID NO: 115 및 116으로 구성된 군으로부터 선택되는 경쇄를 암호화한다. 가장 바람직한 핵산 분자는 SEQ ID NO: 93, 94, 98 및 99의 핵산 서열로 구성되는 중쇄를 암호화하고, 및/또는 SEQ ID NO: 115의 핵산 서열을 포함하는 경쇄를 암호화한다.
VH 및 VL 부분을 암호화하는 DNA 단편이 얻어지면, 상기 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기술, 예를 들면, 가변영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자로, 또는 Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자와 같은 상기에서 설명된 단편에 상응하는 단편 유전자로 전환시키는 기술에 의해 추가적으로 조작할 수 있다. 상기 조작에서, VL- 또는 VH-암호화 DNA 단편은 항체 불변영역 또는 유연한 링커(flexible linker)와 같은 다른 단백질을 암호화하는 다른 DNA 단편과 작동적으로 링크된다. 상기 조건에서 사용된 것처럼, 용어 “작동적으로 링크(operatively linked)”는 2개의 DNA 단편에 의해 암호화되는 아미노산 서열이 프레임 내(in-frame)에 남아있는 것과 같이 2개의 DNA 단편이 합쳐지는 의미를 의도한다. VH 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 VH-암호화 DNA를 중쇄 불변영역(CH1, CH2 및 CH3)를 암호화하는 다른 DNA로 작동적으로 링크하여 전체 길이 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변영역 유전자의 서열은 당업계에서 알려져 있고(예를 들면, Kabat EA et al., ibid. 참조), 상기 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻을 수 있다. 중쇄 불변영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변영역일 수 있으나, 가장 바람직하게는 IgG4 불변영역이고, 여기에서 바람직한 인간 IGHG4 불변 영역은 S228P 아미노산 치환을 포함하는 힌지 영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자에 대하여, VH-암호화 DNA는 단지 중쇄 CH1 불변영역을 암호화하는 다른 DNA 분자로 작동적으로 링크될 수 있다. VL 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 VL-암호화 DNA를 경쇄 불변영역, CL로 암호화하는 다른 DNA 분자로 작동적으로 링크하여 전장 경쇄유전자(Fab 경쇄 유전자뿐만 아니라)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변영역 유전자의 서열은 당업계에서 알려져 있고(예를 들면, Kabat EA et al., ibid. 참조), 상기 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의하여 얻을 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 불변영역이고, 바람직하게는 카파 불변영역일 수 있다. scFv 유전자를 만들기 위해서, VH- 및 VL-암호화 DNA 단편을 유연한 링커를 암호화하는, 예를 들면, 아미노산 서열(Gly4-Ser3)를 암호화하는 다른 단편으로 작동적으로 링크하여, VH 및 VL 서열이 유연한 링커에 의해 결합된 VL 및 VH 영역을 갖는 인접한 단일-사슬 단백질로서 발현될 수 있다(예를 들면, Bird et al., ibid.; Huston et al., ibid.; McCafferty et al., (1990) Nature, 348: 552-554 참조). 다양한 기술이 항체의 항체 단편을 생성을 위해 발달하여 왔다. 통상적으로, 상기 단편은 온전한 항체의 단백질분해 소화를 경유하여 유래하였다(예를 들면, Morimoto et al., (1992) J. Biochem. Biophysical Methods, 24: 107-117 및 Brennan et al., (1985) Science, 229: 81 참조). 그러나, 상기 단편은 재조합 숙주세포에 의해 직접적으로 현재 생성될 수 있다. 예를 들면, 항체 단편은 상기에서 언급된 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 대장균(E. coli)으로부터 직접적으로 회수될 수 있고 F(ab')2 단편을 형성하기 위해 화학적으로 커플화될 수 있다(Carter et al., (1992) Bio/Technology, 10: 163-167). 다른 접근방법에 따라서, F(ab')2 단편은 재조합 숙주세포 배양으로부터 직접적으로 분리될 수 있다. 항체 단편을 생성하기 위한 다른 기술은 숙련된 기술자에게 분명하게 될 것이다. 다른 실시형태에서, 선택한 항체는 단일-사슬 Fv 단편(scFv)이고, 예를 들면, WO93/16185; 미국 특허번호 5,571,894 및 미국 특허번호 5,587,458 참조하시오. 항체 단편은, 예를 들면, 미국 특허번호 5,641,870에서 설명된 바와 같이 또한 “직선 항체(linear antibody)”일 수 있다.
본 발명의 항체를 암호화하는 핵산은 단백질을 발현시키기 위해서 벡터로, 바람직하게는 발현벡터로 통합(incorporate)될 수 있다. 다양한 발현벡터는 단백질 발현을 위해서 활용될 수 있다. 발현벡터는 자가-복제 염색체외(self-replicating extra- chromosomal) 벡터 또는 숙주 유전체로 통합하는 벡터를 포함할 수 있다. 발현벡터는 숙주세포 유형과 호환성이 되도록 구성된다. 따라서, 본 발명에서 사용되는 벡터, 바람직하게 발현 벡터는 포유류 세포, 박테리아, 곤충 세포, 효모 및 시험관 내 시스템에서 단백질 발현을 가능하게 하는 것을 포함하나 제한적이지 않다. 당업계에서 알려진 바와 같이, 상업적으로 또는 그 이외에, 항체 발현을 위해 본 발명에서 사용하여 발견한 다양한 발현벡터를 활용할 수 있다.
발현벡터는 통상적으로 제어(control) 또는 조절 서열, 선택마커(selectable markers), 임의 융합 파트너, 및/또는 첨가 요소와 사용가능하게 링크(operably linked)된 단백질을 포함한다. 본 명세서에서 “사용가능하게 링크”는 핵산이 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 수 있음을 의미한다. 용어 “조절서열(regulatory sequence)”은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터(promoters), 증강자(enhancers) 및 다른 발현 제어요소(예: 아데닐중합체형성(polyadenylation) 신호)를 포함하도록 의도된다. 상기 조절서열은 예를 들면, Goeddel에 의해 설명된다(Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). 일반적으로, 상기 발현벡터는 항체를 암호화하는 핵산에 사용가능하게 링크된 전사 및 번역 조절 핵산을 포함하고, 통상적으로 단백질을 발현하기 위해서 사용된 숙주세포에 적합하다. 일반적으로, 전사 및 번역 조절서열은 프로모터 서열, 리보솜 결합 위치, 전사 시작 및 정지 서열, 번역 시작 및 정지 서열, 증강자(enhancer) 또는 활성체(activator) 서열을 포함할 수 있다. 당업계에 알려진 바와 같이, 통상적으로 발현벡터는 발현벡터를 포함하는 변형된 숙주세포를 선택하도록 선택 유전자(selection gene) 또는 마커를 포함한다. 선택 유전자는 당업계에 잘 알려져 있고 사용된 숙주세포와 같이 다양할 것이다. 예를 들면, 통상적으로 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주세포상에서 G418, 하이그로마이신(hygromycin) 또는 메토트렉세이트(methotrexate)와 같은 약물에 저항을 부여한다. 바람직한 선택 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(dihydrofolate reductase, DHFR)) 유전자(메토트렉세이트 선별/증폭을 갖는 dhfr- 숙주세포에서 사용하기 위해) 및 네오(neo) 유전자(G418 선별을 위한)를 포함한다.
본 명세서에서 벡터에 있는 DNA를 클로닝(cloning) 또는 발현(expressing)하기 위한 적합한 숙주세포는 원핵(prokaryote), 효모(yeast) 또는 고등 진핵세포(higher eukaryote cells)이다. 상기 목적을 위한 적합한 원핵은 진정세균(eubacteria)을 포함하고, 그람음성(gram-negative) 또는 그람양성(gram-positive) 생물, 예를 들면, 대장균속(Escherichia)과 같은 장내세균(Enterobacteriaceae), 예를 들어, E. coli, 엔테레로박터(Enterobacter), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들면, 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들면, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella) 뿐만 아니라, 고초균(B. subtilis) 및 바실러스 리체니포르미스(B. licheniformis)와 같은 바실리(Bacilli), 녹농균(P. aeruginosa)과 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 적합한 E. coli 클로닝 숙주는 E. coli 294(ATCC 31,446), E. coli B, E. coli X1776(ATCC 31,537), 및 E. coli W3110(ATCC 27,325)을 포함한다.
원핵 뿐만 아니라, 실모양 곰팡이(filamentous fungi) 또는 효모와 같은 진핵 미생물(eukaryotic microbes)은 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 일반 빵의 효모를 저등(lower) 진핵숙주 미생물 사이에서 가장 많이 사용한다. 본 발명의 재조합 항체의 발현을 위한 숙주세포는 바람직하게는 중국 햄스터 난소세포(Chinese Hamster Ovary, CHO cells)(dhfr-CHO 세포를 포함하여, Urlaub & Chasin (1980) PNAS USA 77: 4216-4220에서 설명됨, 예를 들면, Kaufman & Sharp (1982) J. Mol. Biol, 159: 601-621에서 설명한 것처럼, DHFR 선별 마커와 같이 사용됨), NSO 골수종(myeloma) 세포, COS 세포, SP2 세포 및 HEK293-EBNA1 세포(ATCC® 카달로그 번호: CRL-10852)를 포함하는 포유류 세포이다. 특히, NSO 골수종 세포를 위하여, 다른 바람직한 발현 시스템은 WO87/04462, WO89/01036 및 EP338841에서 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다.
항체의 제조 및 생산
TrkA 폴리펩타이드에 대하여 생성된 항체는 예를 들면, 잘 알려진 일상적 절차에 의해 폴리펩티드를 동물, 바람직하게는 비-인간 동물에 투여하여 동물의 면역화에 의해 얻을 수 있는데, 예를 들어, 실험면역학의 실험안내서(Handbook of Experimental Immunology, Weir DM(ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, (1986))를 참조할 수 있다. 토끼, 마우스, 래트, 양, 소, 낙타 또는 돼지와 같은 많은 온혈동물이 접종될 수 있다. 그러나, 마우스, 토끼, 돼지 및 래트, 특히 마우스가 일반적으로 가장 적합하다. 항체는 당업자에게 알려진 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 추가적으로 항체는 자연적으로 발생한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 인간화 항체는 비-인간 동물(예: 마우스)로부터 VH 및/또는 VL 영역으로부터 하나 또는 그 이상의 CDRs 또는 이들의 부분을 인간 VH 및/또는 VL 영역으로부터 하나 또는 그 이상의 구조형성영역으로 전달하여 생성될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 인간화 항체는 WO00/73344에 개시된 바와 같이, 마우스 MNAC13 항체로부터 VH 및/또는 VL 영역으로부터 하나 또는 그 이상의 CDRs 또는 이들의 부분을 인간 VH 및/또는 VL 영역으로부터 하나 또는 그 이상의 구조형성영역으로 전달하여 생성될 수 있다. 선택적으로, 항체의 면역원성(immunogenicity) 감소 및/또는 결합친화도를 유지하기 위해 필요하거나 원할 때, VH 및/또는 VL 영역에 존재하는 인간 구조형성 잔기는 상응하는 비인간(예: 마우스) 잔기를 대체하여 생성될 수 있다. 선택적으로, CDRs에 존재하는 비-인간 아미노산 잔기는 인간 잔기로 대체될 수 있다. 본 발명의 키메라 또는 인간화 항체는 상기에서 설명한 바와 같이 비-인간 단일클론 항체의 서열상에 기반하여 제조될 수 있다. DNA 암호화 중 및 경쇄 면역 글로불린은 관심대상의 비-인간 하이브리도마(hybridoma)로부터 얻을 수 있고 표준분자생물 기술(standard molecular biology techniques)을 사용하여 비-마우스(non-murine)(예: 인간) 면역 글로불린 서열을 포함하기 위해 조작될 수 있다. 예를 들면, 키메라 항체를 만들기 위해, 당업계에 알려진 방법을 사용하여 마우스 가변영역을 인간 불변영역과 링크할 수 있다(예: Cabilly et al의 미국 특허번호 4,816,567 참조). 인간화 항체를 만들기 위해, 마우스 CDR 영역을 당업계에 알려진 방법을 사용하여 인간 구조형성으로 삽입할 수 있다(예: Winter의 미국 특허번호 5,225,539 및 Queen et al의 미국 특허번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 참조).
본 발명의 인간화 항체는 중쇄 가변영역을 위한 인간 수용분자가 마우스 항체의 잠재적 수용 분자 가변영역과 중쇄 가변영역 사이에 상동 고려에 기반하여 선택된다. 생식세포 후보 인간 수용 분자는 잠재적 면역원성을 감소시키기 위해 바람직하다. 생식세포 데이타베이스는 중쇄 FW3 영역의 말단을 통하여 부분적으로 CDR3 서열로 읽는 항체 서열로 만들어져 있다. FW4 영역의 선택을 위해서, 선택된 생식세포 분자로부터 유래한 성숙 항체 서열의 데이타베이스를 조사할 수 있거나 또는 인간 기증으로부터 선택된 데이타베이스 분자로부터 유래하는 항체 서열을 사용할 수 있다. 인간 수용 분자는 바람직하게는 마우스 기증 분자로서, 마우스 기증 분자의 가변영역의 동일한 정규구조 클래스의 동일한 중쇄 클래스로부터 선택된다. 중쇄 가변영역을 위한 인간 수용 분자의 선별을 위한 두 번째 고려는 마우스 기증 분자와 인간 수용 분자 사이에 CDR 길이에 있는 상동을 피하는 것이다. 비록 케벳과 같은 다른 데이타베이스와 공동 NCBI 데이타베이스가 또한 사용될 수 있지만, 인간 수용 항체 분자는 바람직하게는 V-BASE 데이타베이스에 상동 조사에 의해 선택된다.
본 발명의 인간화 항체는 경쇄 가변영역을 위한 인간 수용분자가 마우스 항체의 잠재적 수용 분자 가변영역과 경쇄 가변영역 사이에 상동 고려에 기반하여 선택된다. 생식세포 후보 인간 수용 분자는 잠재적 면역원성을 감소시키기 위해 바람직하다. 생식세포 데이타베이스는 중쇄 FW3 영역의 말단을 통하고 부분적으로 CDR3 서열로 읽는 항체 서열로 만들어져 있다. FW4 영역의 선별을 위해서, 선택된 생식세포 분자로부터 유래한 성숙 항체 서열의 데이타베이스를 조사할 수 있거나 또는 인간 기증으로부터 선택된 데이타베이스 분자로부터 유래하는 항체 서열을 사용할 수 있다. 인간 수용 분자는 바람직하게는 마우스 기증 분자로서 마우스 기증 분자의 가변영역의 동일한 정규 구조 클래스의 동일한 경쇄 클래스로부터 선택된다. 경쇄 가변영역을 위한 인간 수용 분자의 선택을 위한 두번째 고려는 마우스 기증 분자와 인간 수용 분자 사이에 CDR 길이에 있는 상동을 포함하는 것이다. 인간 수용 항체 분자는 바람직하게는 V-BASE 데이타베이스에 상동 조사에 의해 선택되고, 케벳과 같은 다른 데이타베이스와 공동 NCBI 데이타베이스도 사용될 수 있다.
항체는 재조합 항체에 의해 예를 들면, 포유류 숙주세포에 도입하여 제조하는 경우, 항체는 숙주세포에서 항체의 발현을 허용하기에 충분한 시간 동안 숙주세포를 배양함으로써 생산되고, 더욱 바람직하게는 항체의 분비가 되도록 충분한 시간 동안 숙주세포를 배양하여 생성시킨다. 인간 TrkA에 결합하는 항체를 생성시키기 위한 유용한 숙주세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. Ham's F10(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, 스위스), 최소기본배지(Minimal Essential Medium(MEM; Sigma-Aldrich Chemie GmbH)), RPMI-1640(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Basel, 스위스), EX-CELL 293, HEK293-serum free medium(Sigma, Buchs, 스위스) 및 둘베코스 변형된 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM; Sigma-Aldrich Chemie GmbH))와 같은 상업적으로 활용가능한 배지가 숙주세포 배양을 위해 적합하다. 항체는 표준 단백질 정제방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
항체는 발현되는 단백질, 정제, 스크리닝, 디스플레이 등의 표적이 가능하도록 융합 파트너와 사용가능하게 링크될 수 있다. 융합 파트너는 링커 서열을 경유하여 항체서열로 링크될 수 있다. 링커 서열은 긴 링커가 사용될 수도 있지만, 일반적으로 소수의 아미노산, 통상적으로 10 미만을 포함한다. 통상적으로 링커 서열은 유연하고 분해로부터 저항하도록 선택된다. 당업자라면 알 수 있는 바와 같이, 임의 넓은 다양한 서열이 링커로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 일반적 링커 서열은 아미노산 서열 GGGGS를 포함한다. 융합 파트너는 항체 및 원하는 세포 위치 또는 여분의 세포 배지에 임의 연결된 융합 파트너에 직접적인 표적 또는 신호서열일 수 있다. 당업계에서 알려진 바와 같이, 확실한 신호서열은 성장 배지 또는 세포막 내부와 외부 사이에 위치하는 세포질 공간(periplasmic space)으로 분비되는 단백질을 표적할 수 있다. 융합 파트너는 또한 정제 및/또는 스크리닝을 가능하게 하는 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 서열일 수 있다. 상기 융합 파트너는 폴리히스티딘 태그(polyhistidine tags(His-tags))(예를 들면, 고정화 금속 친화 크로마토그래피(Immobilized Metal Affinity Chromatography(IMAC)시스템(예: Ni2 + 친화 컬럼(affinity columns))으로 사용을 위한 H6 및 H10 또는 다른 태그), GST 융합, MBP 융합, 스트랩-태그(Strep-tag), 박테리아 효소 BirA의 BSP 바이오틴화된 표적서열, 및 항체에 의해 표적되는 항원 결정기 태그(예를 들면, c-myc 태그, 플래그-태그 등)을 포함하나 이에 제한하는 것은 아니다. 당업자라면 알 수 있는 바와 같이, 상기 태그는 정제를 위해서, 스크리닝을 위해서 또는 둘 다에 유용할 수 있다.
항- TrkA 항체의 특성 및 정제
항체를 위한 스크리닝은 인간 TrkA에 결합을 측정하기 위한 분석 및/또는 자체의 리간드 NGF에 TrkA의 결합을 차단하는 능력을 측정하기 위한 분석을 사용하여 수행할 수 있다. 결합분석의 실시예는 ELISA이다. 또한, 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석은 예를 들어 실시예에서 항체의 결합 동력학(kinetics)의 결합(association) 및 분해(dissociation) 속도 상수를 측정하기 위해 사용된다. 차단 분석(blocking assay)의 예는 TrkA에 결합하는 NGF 리간드의 차단을 측정하는 유세포(flow cytometry)에 기반하는 분석이다. 항-TrkA 항체의 기능적 활성을 평가하는 분석은 예를 들어, 여기에서 인자 의존성 인간 백혈병 세포주 TF-1을 사용하여 분석되는 세포 표면 TrkA/베타-NGF 매개된 세포 증식 차단하는 항체의 능력은 TF-1 세포 증식 분석을 사용할 수 있다(Kitamura T et al., (1989) J. Cellular Physioligy 140(2):323-34).
본 발명의 항체는 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 분리 또는 정제될 수 있다. 표준 정제방법은 이온 교환(ion exchange), 소수성 상호작용(hydrophobic interaction), 친화도(affinity), 가호(sizing) 또는 겔 여과(gel filtration) 및 역상(reversed-phase)을 포함하여 대기압 또는 FPLC 및 HPLC와 같은 시스템을 사용하는 고압에서 수행되는 크로마토그래픽 기술(chromatographic techniques)을 포함한다. 정제방법은 또한 전기영동(electrophoretic), 면역(immunological), 침전(precipitation), 투석(dialysis) 및 크로마토포커싱(chromatofocusing) 기술을 포함한다. 초미세여과(utrafiltration) 및 여과작용(diafiltration) 기술은, 단백질 농도와 함께 또한 유용하다. TrkA 항체를 정제하기 위해, 선별된 숙주세포는 단일클론 항체 정제를 위한 교반-플라스크에서 자라게 할 수 있다. 상층액은 단백질 A-세파로오스(Pharmacia, Piscataway, NJ)가 있는 친화 크로마토그래피 전에 여과되고 농축될 수 있다. 순도를 확실하게 하기 위해서 용리된 항체를 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피로 점검할 수 있다. 본 발명의 바람직한 항체는 분리 및/또는 정제된 인간 TrkA에 결합하는 항체이다.
면역접합체
다른 측면에서, 본 발명은 세포독성, 약물(예: 면역억제제) 또는 방사선독소와 같은 치료제와 링크되어 있는 인간 TrkA에 결합하는 길항제 TrkA(anTrkA) 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 상기 접합체는 본 명세서에서 “면역접합체”로 언급한다. 하나 또는 그 이상의 세포독성을 포함하는 면역접합체는 “면역독소”로 언급한다. 세포독성 또는 세포독성제는 세포에 유해한(예: 사멸) 임의 제제를 포함한다. 실시예는 탁솔(taxol), 사이토칼라신 B(cytochalasin B), 그라미시딘 D(gramicidin D), 에티디움 브로마이드(ethidium bromide), 에메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포사이드(etoposide), 테노포사이드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜키신(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디하이드록시 안트라신 디온(dihydroxy anthracin dione), 미톡산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 악티노마이신(actinomycin D), 1-디하이드로테스토스테론(1-dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로프라놀롤(propranolol), 및 퓨로마이신(puromycin) 및 이의 유사체 또는 동종을 포함한다. 또한, 치료제는 예를 들면, 항대사물질(antimetabolites)(예: 메토트렉세이트(methotrexate), 6-머갑토퓨린(6-mercaptopurine), 티오구아닌(6-thioguanine), 시타라빈(cytarabine), 5-플루오로유라실데카르바진(5-fluorouracil decarbazine)), 알킬화제(alkylating agents)(예: 메클로르에타민(mechlorethamine), 티오에파클로람뷰실(thioepa chlorambucil), 멜팔란(melphalan), 카르무스틴(carmustine(BSNU)) 및 로무스틴(lomustine(CCNU)), 사이클로포스파미드(cyclothosphamide), 부설판(busulfan), 디브로모마니톨(dibromomannitol), 스트렙토조토신(streptozotocin), 미토마이신 C(mitomycin C), 및 시스-디클로로디아민플래티늄(II)(DDP)시스플라틴(cis-dichlorodiamine platinum(II)(DDP) cisplatin)), 안트라사이클린(anthracyclines)(예: 다우노루비신(daunorubicin)(이전에 다우노마이신(daunomycin)) 및 독소루비신), 항생제(예: 닥티노마이신(dactinomycin)(이전에 악티노마이신), 블레오마이신(bleomycin), 미트라마이신(mithramycin), 및 안트라미이신(anthramycin(AMC)), 및 항-유사분열제(anti-mitotic agents)(예: 빈크리스틴(vincristine) 및 빈블라스틴(vinblastine))을 포함한다. 본 발명의 항체와 링크될 수 있는 치료 세포독성의 다른 실시예는 듀오카르마이신(duocarmycins), 칼리케아미신(calicheamicins), 메이탄시네스(maytansines) 및 아우리스타틴스(auristatins), 및 이의 유도체를 포함한다. 칼리케아미신 항체 접합체의 실시예는 상업적으로 이용가능하다(마일로타그(Mylotarg(R)); American Home Products). 세포독성은 당업계에서 이용가능한 링커 기술을 사용하여 본 발명의 항체와 링크될 수 있다. 항체에 세포독성을 접합시켜 사용된 링커 유형의 실시예는 하이드라존(hydrazones), 티오에테르(thioethers), 에스테르(esters), 디설피드(disulfides) 및 펩타이드-포함 링커를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 링커는 예를 들면, 리소좀 구획 내의 낮은 pH에 의한 절단에 민감하거나 또는 카텝신(cathepsins)(예: 카텝신 B,C,D)과 같은 종양조직에서 우선적으로 발현되는 프로테아제에 의한 절단에 민감하게 선택될 수 있다. 세포독성 유형의 추가 논의에서, 항체에 치료제를 접합시키기 위한 링커 및 방법은 Saito G et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail PA et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne G (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen TM (2002) Nat. Rev. Cancer, 2:750-763; Pastan I & Kreitman RJ (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter PD & Springer CJ (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264를 참조하면 된다. 본 발명의 항체는 또한, 방사능면역접합체(radioimmunoconjugates)라고도 언급되는 세포독성 방사능제약을 생산하기 위해서 방사능 동위원소와 링크될 수 있다. 진단적 또는 치료적 사용을 위해 항체에 접합될 수 있는 방사능 동위원소의 실시예는 요요드-131(iodine-131), 인듐-111(indium-111), 이트륨-90(yttrium-90) 및 루테튬-177(lutetium-177)을 포함하지만 제한되는 것은 아니다. 방사능면역접합체 제조를 위한 방법은 당업계에서 정착되었다. 방사능면역접합체의 실시예는 제발린®(Zevalin®)(EDEC Pharmaceuticals) 및 벡사르®(Bexxar®)(Corixa Pharmaceuticals)를 포함하여 상업적으로 이용가능하고, 유사한 방법은 본 발명의 항체를 사용하여 방사능면역접합체를 제조하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 면역접합체는 주어진 생물학적 반응을 변형시키는데 사용될 수 있고, 약물 부분은 기존의 화학적 치료제로서 제한적으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들면, 약물 부분은 원하는 생물학적 활성을 함유하는 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들면, 아브린(abrin), 리신 A(ricin A), 녹농균 외독소(pseudomonas exotoxin), 또는 디프테리아 독소(diphtheria toxin)와 같은 효소적으로 활성 독소, 또는 활성적 이들의 단편; 종양괴사인자 또는 인터페론-γ와 같은 단백질; 또는 예를 들어, 림포카인(lymphokines), 인터루킨-1(interleukin-1(IL-1)), 인터루킨-2(interleukin-2(IL-2)), 인터루킨-6(interleukin-6(IL-6)), 과립구 대식세포 집락 촉진인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor(GM-CSF)), 과립구 집락 촉진인자(granulocyte colony stimulating factor(G-CSF)), 또는 다른 성장인자(growth factors)와 같은 생물학적 반응 변경자를 포함할 수 있다. 항체에 상기 치료제를 링크하는 기술은 잘 알려져 있고, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al., (eds.), pp. 243- 56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985) and Thorpe et al ., Immunol. Rev. 62:119-58 (1982)를 참조하면 된다.
다른 측면에서, 본 발명은 세포독성, 약물(예: 면역억제제) 또는 방사선독소와 같은 치료제와 함께 투여되는 인간 TrkA에 결합하는 길항제 TrkA 항체 또는 이들의 단편을 제공한다.
약학적 조성물
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이들의 단편 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물, 예를 들면, 약학적 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 항체의 하나 또는 조합(예: 2개 또는 그 이상 다른), 및/또는 본 발명의 면역접합체 및/또는 상기에서 설명된 세포독성, 약물(예: 면역억제제) 또는 방사선독소와 같은 치료제를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 약학적 조성물은 표적 항원 또는 보완적 활성을 갖는 다른 항원 결정기에 결합하는 항체(또는 면역접합체)의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 조합 치료(combination therapy), 즉, 다른 치료제와 조합으로 투여될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, “약학적으로 허용가능한 담체”는 생리적으로 호환되는 임의 및 모든 용매, 분산매, 코팅, 항박테리아제 및 항곰팡이제, 등장(isotonic)제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 상기 담체는 정맥내투여(intravenous), 근육내(intramuscular), 피하(subcutaneous), 비경구(parenteral), 척수(spinal) 또는 표피(epidermal) 투여(예: 주사 또는 주입에 의해)가 적합하다. 투여경로에 따라서, 활성화합물, 즉, 항체 또는 면역접합체는 화합물이 비활성화될 수 있는 산의 작용과 다른 고유의 조건으로부터 화합물을 보호하기 위해 물질로 코팅될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 멸균 주사용액 또는 분산액의 임시제조를 위한 멸균된 수용액 또는 멸균 분말을 포함한다. 상기 배지의 사용 및 약학적으로 활성물질의 제제는 당업계에서 알려져 있다. 종래의 배지 또는 제제의 범위 내에서 활성화합물과의 모순을 제외하고는, 본 발명의 약학적 조성물에서 이들의 사용은 심사숙고된다. 보충 활성화합물은 또한 조성물로 혼합될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 다른 약학적 활성제를 포함하는 본 발명의 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는 다른 약학적 활성제는 아래에 설명된 대로 하나 또는 그 이상의: a) 진통제(analgestic agent), b) 다른 항-TrkA 항체, c)NGF, d) 항암제, e) 항-NGF 항체이다.
다른 측면에서, 본 발명은 치료제 및 약학적으로 허용가능한 담체에 링크된 인간 TrkA에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역접합체를 포함하는 조성물을 제공한다. 사용될 수 있는 면역접합체 및 치료제는 상기에서 설명되었다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 항산화제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 항산화제의 실시예는: (1) 아스코르빈산(ascorbic acid), 시스테인 하이드로클로라이드(cysteine hydrochloride), 소듐 비설페이트(sodium bisulfate), 소듐 메타비설피트(sodium metabisulfite), 소듐 설피트(sodium sulfite) 등과 같은 물 용해 항산화제; (2) 아스코르빌 팔미테이트(ascorbyl palmitate), 부틸화된 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole(BHA)), 부틸화된 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene(BHT)), 레시틴(lecithin), 프로필갈레이트(propyl gallate), 알파-토코페롤(alpha-tocopherol) 등과 같은 오일-용해 항산화제; (3) 시트르산(citric acid), 에틸렌디아민 테트라아세트산(ethylenediamine tetraacetic-acid(EDTA)), 소르비톨(sorbitol), 타르타르산(tartaric acid), 인산(phosphoric acid) 등과 같은 금속 킬레이트제(chelating agents)를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에서 사용될 수 있는 적합한 수용성 및 비수용성 담체의 실시예는 물, 에탄올, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 채소오일, 및 에틸오레이트와 같은 주사용 유기 에스테르를 포함한다. 적당한 유동성은 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용에 의해, 분산의 경우에서 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 상기 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보강제를 포함할 수 있다. 미생물 존재의 예방은 상기의 멸균절차에 의해, 및 다양한 항박테리아 및 항곰팡이제 함유물, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올 등에 의해 보장될 수 있다. 설탕, 소금 등과 같은 등장제(isotonic agent)를 조성물로 포함하는 것은 바람직하다. 추가적으로, 주사용 약학적 형태의 연장된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트(aluminum monostearate) 및 젤라틴(gelatin)과 같이 흡수를 지연하는 제제의 함유물에 의해 초래될 수 있다.
치료 및 다른 용도
본 발명의 항체는 다양한 카테고리 아래에 명시된 바와 같이, 다양한 질환/증상을 치료하기 위한 의약품으로 사용될 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 언급된 증상을 치료하기 위한 항체 또는 유도체의 치료적 유효량을 적합하게는 포유류 개체, 특히, 이를 필요로 하는 인간 개체, 개체에 투여하는 것을 포함하는 하기에 언급한 증상의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 하기에 언급한 증상의 치료를 위한 약제의 제조에 본 발명에 언급된 바와 같이 항체 또는 유도체의 사용을 제공한다.
여기에서 용어 "치료"는 기존의 질환/증상의 치료(therapeutic treatment)를 포함한다. 또한 이는 예방적 치료를 포함한다. 더 나아가 환자의 특정 질환/증상이 나아지지 않더라도, 하나 또는 그 이상의 이상 증상의 개선을 포함한다. 예를 들어, 통증을 완화하거나 또는 감소할 수 있다.
바람직한 치료용은 통증의 치료이다. 국제 통증 연구학회(International Association for the Study of Pain)("IASP")에 따르면 통증은 "불쾌한 감각 및 실제 또는 잠재적인 조직 손상, 또는 손상 또는 두 가지 모두로 설명되는 감정적 경함과 관련된 것이다"로 일반적으로 정의된다. 통증의 모든 형태에서 필수적인 요소는 전문적인 높은-임계 수용체 및 잠재적인 조직 손상의 유기체에 경고하는 신경 섬유의 활성화이다. 염증성 세포 및 프로세스의 참여는 많은 통증 상태에서 일반적인 요소이다. 용어 "급성 통증"은 절단, 압착, 화상, 또는 화학적 자극에 의한 손상으로 인해 초래되는 즉각적인, 일반적으로 높은 임계값, 고통을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 용어 "만성 통증"은 급성 통증 이외의 통증, 염증성 및 신경병증성 기원의 둘 다를 의미한다. 종종 만성 통증은 예를 들어, 수개월 또는 수년의, 비교적 긴 기간 및 연속적 또는 간헐적일 수 있는 것으로 이해된다. 본 발명의 항체는 만성 통증 또는 급성 통증 치료에 사용될 수 있다. 만성 통증의 치료가 바람직하다.
통증은 예를 들거나, 다음 중 하나와 연관될 수 있다: 염증성 통증(inflammatory pain), 수술 후 통증(post-surgical pain), 수술 후 통증(post-operative pain)(치과 통증(dental pain) 포함), 신경병증성 통증(neuropathic pain), 말초신경병증(peripheral neuropathy), 당뇨성 신경병증(diabetic neuropathy), 당뇨성 신장질환(diabetic nephropathy), 골절 통증(fracture pain), 통풍 관절 통증(gout joint pain), 대상포진 후 신경통(post-herpetic neuralgia), 암 통증(cancer pain), 골관절염(osteoarthritis) 또는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 통증, 좌골신경통(sciatica), 겸상적혈구 위기와 관련된 통증(pains associated with sickle cell crises), 두통(headaches)(예를 들어, 편두통(migraines), 긴장성 두통(tension headache), 군발 두통(cluster headache)), 월경통(dysmenorrhea), 자궁내막증(endometriosis), 자궁유 섬유종(uterine fibroids), 근골격통증(musculoskeletal pain), 만성 허리 통증(chronic low back pain), 섬유근육통(fibromyalgia), 염좌(sprains), 내장 통증(visceral pain), 난소 낭종(ovarian cysts), 전립선염(prostatitis), 만성 골반 통증 증후군(chronic pelvic pain syndrome), 방광염(cystitis), 간질성 방광염(interstitial cystitis), 통증성 방광 증후군(painful bladder syndrome) 및/또는 방광 통증 증후군(bladder pain syndrome), 만성 무균성 전립선염과 관련된 통증(pain associated with chronic abacterial prostatitis), 절개 통증(incisional pain), 편두통(migraine), 3차 신경병증(trigeminal neuralgia), 화상(burns) 및/또는 상처(wounds)로부터의 통증, 외상(trauma)과 관련된 통증, 근골격계 질환(musculoskeletal diseases)과 관련된 통증, 강직성 척추염(ankylosing spondilitis), 관절주위 병변(periarticular pathologies), 골 전이(bone metastases)로부터의 통증, 인간면역결핍바이러스(HIV)로부터의 통증, 피부홍통증(erythromelalgia) 또는 췌장염(pancreatitis) 또는 신장결석(kidney stones)에 의해 발생하는 통증, 악성 흑색종(malignant melanoma), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 천식(asthma), (예를 들어, 심각한 기도과민반응성(severe airway hyper-responsiveness)으로 조절되지않는 천식(uncontrolled asthma)), 다루기힘든 기침(intractable cough), 탈수초 질환(demyelinating diseases), 만성 알코올중독(chronic alcoholism), 뇌졸중(stroke), 시상 통증 증후군(thalamic pain syndrome), 독소(toxins)로부터 통증, 화학요법(chemotherapy)으로부터 통증, 염증성 장 질환(inflammatory bowel disorders), 과민성 장 증후군(irritable bowel syndrome), 염증성 눈 질환(inflammatory eye disorders), 염증성 또는 불안정한(unstable) 방광 질환(bladder disorders), 건선(psoriasis), 염증성 요소에 의한 피부 통증(skin complaints), 일광화상(sunburn), 심장염(carditis), 피부염(dermatitis), 근염(myositis), 신경염(neuritis), 교원 혈관 질환(collagen vascular diseases), 만성 염증성 증상(chronic inflammatory conditions), 염증성 통증과 관련된 통각과민(hyperalgesia) 및 이질통(allodynia), 신경병증성 통증과 관련된 통각과민 및 이질통, 당뇨성 신경병증성 통증(diabetic neuropathy pain), 작열통(causalgia), 교감신경이 관여하는 통증(sympathetically maintained pain), 구심로차단 증후군(deafferentation syndromes), 상피 조직 손상(epithelial tissue damage) 또는 기능장애(dysfunction), 호흡기에서 내장고유리듬의 장애(disturbances of visceral motility at respiratory), 비뇨생식기(genitourinary), 위장(gastrointestinal) 또는 혈관 영역(vascular regions), 알레르기성 피부 반응(allergic skin reactions), 소양증(pruritis), 백반증(vitiligo), 일반적인 위장 장애(gastrointestinal disorders), 대장염(colitis), 위 궤양(gastric ulceration), 십이지장 궤양(duodenal ulcers), 혈관운동(vasomotor) 또는 알레르기성 비염(allergic rhinitis), 기관지 질환(bronchial disorders), 소화불량(dyspepsia), 위식도 역류(gastroesophageal reflux), 췌장염, 장기통(visceralgia) 및 뼈의 섬유이형성증(fibrous dysplasia, FD).
통증은 예를 들거나, 다음 중 하나와 연관될 수 있다: 췌장염, 신장결석, 자궁내막증, IBD, 크론병(Crohn's disease), 수술 후 유착(post surgical adhesions), 담낭 결석(gall bladder stones), 두통, 월경통, 근골격계 통증(musculoskeletal pain), 염좌(sprains), 내장 통증(visceral pain), 난소 낭종, 전립선염, 방광염, 간질성 방광염, 수술 후 통증, 편두통, 3차 신경병증, 화상 및/또는 상처로부터의 통증, 외상과 관련된 통증, 신경병증성 통증, 근골격계 질환과 관련된 통증, 류마티스성 관절염, 골관절염, 강직성 척추염, 관절주위 병변, 종양성 통증(oncological pain), 골 전이로부터의 통증, HIV 감염(infection).
공지된 다양한 모델을 통해 통증을 평가할 수 있고, 이의 항체/유도체의 스크리닝에 사용될 수 있다. 예를 들어, WO 00/73344에 개시된 바와 같이, 예를 들어, 통각 열판 실험을 사용할 수 있다. 실험은 항체/유도체를 면역접합체로 사용하여, McMahon et al., 1995(Nature Med. 1:774-780)에 따라 수행하였다. 항체/유도체는 3주 동안 또는 삼투압 미니-펌프에 의해 성인 랫트의 뒷 다리에 피하주사로 주입되었다. 통각수용(nociception) 민감도(sensitivity)는 염증또는 신경의 부분적 손상에 따른 통각과민 상황을 모방하여, 핫 플레이트 테스트(Eddy & Leimbach (1953) J. Phar. Exp. Ther. 107:385-393)를 사용하여 간격으로 평가된다. 통각수용 자극은 단순 반사보다 높은 통합적인 조정력으로 추측되는 경우의 반응(발 핥기 및/또는 점프)을 유도한다. 테스트에 따르면, 동물은 보통 56℃인, 원하는 온도를 기반으로 가열된 플레이트를 갖는 우리에 배치한다. 두 반응(발 핥기 및 점프)중 어느 하나의 반응시간은 대조군(비 관련 항체의 처리) 및 항-TrkA 항체/유도체를 처리한 이들에서 측정된다.
핫 플레이트 테스트의 대안으로, 포르말린에 대한 통각수용 반응은 평가될 수 있다. 이 테스트는 Porro & Cavazzuti, 1993(Prog. Neurobiol, 41:565-607)에 의해 개시되었고, WO06/137106에서 사용되었다. 이는 주어진 후보에 테스트 전에 투여되었을 때, 발 핥기 감소 이후 분석에 의해 통증 반응의 감소를 평가하는 것을 포함한다. 염(saline)은 통상적으로 음성 대조군으로 사용된다.
통각과민의 평가는 체중 부하 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 마우스는 일반적으로 그들의 두 팔다리 사이에 동등하게 자신의 체중을 배포할 수 있다. 다음과 같이 예를 들어, 뒷발(발바닥 내(intraplantar)) 또는 무릎 관절(관절 내(intra-articular))에 완전 프로인트 보조제(Complete Freunds adjuvant, CFA) 또는 모노소듐 아이오도아세테이트(monosodium iodoacetate, MIA)의 국소 투여에 의해 팔다리에 통증유도 자극을 주고, 체중은 투여 팔다리에 기반을 둔 감소 및 비-투여 팔다리에 기반을 둔 증가로 재분배된다. 체중 부하는 분리된 센서에 기반한 뒷발 및 두 뒷다리에 기록된 가해진 평균 힘은 통증 측정 장치(incapacitance tester)를 사용하여 측정되었다. 체중 부하는 CFA의 발바닥 내 투여에 따른 급성 염증성 통각과민 결과, CFA의 관절 내 투여에 따른 만성 염증성 통각과민 결과 또는 MIA의 관절 내 투여에 따른 만성 골관절염성 통각과민 결과 평가에 사용될 수 있고, 각각 실시예 2, 3 및 4에 설명되어있다.
기계적 통각과민의 평가는, 예를 들어, Von Frey filaments 또는 Randall-Selitto analgesiometer의 다수의 방법에 의해 수행될 수 있다. 발 빼내는 역치값은 Von Frey filaments로 발바닥 뒷발 표면 및 Randall-Selitto analgesiometer의 쐐기-모양의 탐침으로 등쪽 뒷발 표면에서 압력 자극에 대한 반응의 증가는 측정한다. 뒷발 빼내기의 반응시간은 대조군 및 항-TrkA 항체/유도체를 처리한 군에서 측정된다. 이러한 방법은 실시예 5에 설명된 바와 같이, 만성 수축 손상(Chronic Constriction Injury, CCI) 동물 모델로부터의 기계적 통각과민 결과를 평가하기 위해 사용될 수 있다.
CCI 모델은 또한 이미 알려진 동물 모델이다. 이는 좌골 신경의 만성 수축을 포함하고, 마우스 또는 랫트와 같은 설치류에서 신경병증성 자연의 만성 통증을 유도하는데 사용된다. 이 모델은 Bennett & Xie, 1998 in Pain 33:87-107에 의해 설명된다. 이는 예를 들어, WO 06/131592에서 사용되었다. 많은 신경병증성 통증 상태의 주요 특징은 일반적으로 무해한 시원한 자극이 통증을 생성하기 시작한다는 것이다. 비-통증 자극의 증가된 반응은 이질통이라 불린다. 유도된 신경병증성 통증 상태의 정도는 실시예 5에 설명된 바와 같이, 이질통을 위한 차가운 플레이트 테스트를 사용하여 측정된다. 동물은 -5℃ 내지 15℃의 범위 내에 있을 수 있는, 원하는 온도로 냉각된 플레이트를 갖는 우리에 배치한다. 뒷발 빼내기의 반응시간은 대조군 및 항-TrkA 항체/유도체를 처리한 군에서 측정된다. 일반적으로 빼내기의 반응시간은 5℃ 및 그 아래의 표면 온도를 기준으로 달라지기 시작한다.
항체는 암, 신경 질환, 알츠하이머 병(Alzheimer’s disease), 당뇨병(diabetes mellitus), 당뇨병성 신장질환(diabetic nephropathy), 바이러스성 질환(viral disorder), HIV 매개 질환, 한센병(leprosy) 또는 염증성 질환의 치료에 사용될 수 있다. 게다가, 항체는 또한, 예를 들어, 홍반 루푸스(lupus erythematosus), 대상포진(shingles), 대상포진 후 신경통(postherpetic neuralgia), 및 통각과민(hyperalgesia)을 포함하는 NGF의 레벨 증가와 연관된 다른 질환의 치료에 유용하다.
다양한 암은 TrkA를 발현한다. NGF와 TrkA의 상호작용은 종양 성장(예를 들어, 전립선 및 췌장암)에 관련되어있다. 실제로 암의 특정 형태, NGF의 과잉은 신경 섬유의 성장 및 침투를 용이하게 한다. NGF의 작용을 차단함으로써, 신경종(neuromas)의 형성을 유의하게 감소시킬 수 있다. 뿐만 아니라, 단순한 차단 효과를 제공하는 대안으로, 항체는 세포독성제에 연결될 수 있고, TrkA를 발현하는 암세포를 표적으로 사용할 수 있다. 그러나, 독소에 항체는 연결될 필요가 없다. ADCC(항체-의존성 세포-매개 세포 독성)은 표적 세포를 도포하여, 시스템의 공격에 취약하게 만들어(예를 들어, T 세포, 보체 활성화 등에 의해), 항체의 면역 반응에 의해 발생한다. 바람직한 암은 전립선 암(prostate cancer), 갑상선 암(thyroid cancer), 폐암(lung cancer), 프로락틴종(prolactinoma), 흑색종(melanoma) 또는 골 전이와 연관된 암 통증을 포함하는 골암(bone cancer) 통증이 치료된다. 바람직한 암은 골 전이와 연관된 암 통증을 포함하는 골 암 통증이 치료된다.
항체는 또한, 퇴행성 질환(neurodegenerative disorders)을 포함하는 다양한 신경 질환의 치료에 사용될 수 있고, 예를 들어, 항체는 신경종의 형성의 감소에 사용될 수 있다. 이들은 또한 알츠하이머 병 또는 신경재생(neuroregenerative) 요법의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 NGF의 바람직하지않은 작용물질 효과 감소 등의 치료에 유용할 수 있다(또한, 하기의 "병용 요법" 참조). 더불어, 항체는 전술한 바와 같이, 신경병증성 통증 치료에 사용될 수 있다. 이는 신경계의 병변 및 기능장애와 연관될 수 있다. NGF는 당뇨병 및 한센병의 치료에 잠재적인 용도가 있지만, 본 발명의 항체를 사용하여 피할 수 있는 통증 민감도의 증가를 포함하는 바람직하지않은 작용물질 특성이 있다.
또 다른 응용은 염증성 질환의 치료에 있다. NGF는 염증 과정이 발생하는 말초 위치에서의 비만 세포, 섬유아세포 및 다른 세포 유형에서 방출된다. 특히, 비만 세포는 핵심적인 역할을 하는 것으로 보인다. 이는 NGF 생산 및 이의 표면에 기능적인 TrkA 수용체가 동시에 발현된다. NGF/TrkA 시스템은 통증유발(algogenic) 염증성 신호의 구역 증폭을 허용하는 오토크라인(autocrine) 긍정적 피드백 메커니즘을 통해 비만세포 활성화 매개를 나타낸다. 치료될 수 있는 염증성 질환의 예는 요로(urinary tract) 및 골반부(pelvic region)의 염증성 형태, 관절염, 다발성 경화증(multiple sclerosis), 대장염, 염증성 장 질환, 방광 방광염(bladder cystitis), 습진(eczema), 접촉성 피부염(contact dermititis), 관절염, 만성 관절염 및 류마티스 관절염 포함, 크론병, 건선 및 천식을 포함한다.
본 발명의 항체는 전술한 바와 같이, NGF의 바람직하지 않은 작용물질 효과 감소시키기 위한 치료에 유용할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 유도체는 예를 들어, 병용 요법의 약제학적 활성제와 같은 하나 또는 그 이상의 다른 활성제와 함께 사용될 수 있다. 이는 약물에 동시, 순차적 또는 담합 투여를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 유도체는 오피오이드(opioid) 진통제 또는 비-오피오이드 진통제와 같은 진통제와 결합된다. 이는 WO06/137106에 개시된 TrkA 생물학적 활성을 차단할 수 있는 분자의 소량은 오피오이드의 진통효과를 증가시킨다. 이러한 오피오이드 진통제는 다음으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 화합물을 포함한다: 모르핀(morphine), 코데인(codeine), 디하이드로코데인(dihydrocodeine), 디아세틸모르핀(diacetylmorphine), 하이드로코돈(hydrocodone), 하이드로모르폰(hydromorphone), 레보르파놀(levorphanol), 옥시모르폰(oxymorphone), 알펜타닐(alfentanil), 부프레노르핀(buprenorphine), 부토르파놀(butorphanol), 펜타닐(fentanyl), 수펜타닐(sufentanyl), 메페리딘(meperidine), 메타돈(methadone), 나부메톤(nabumetone), 프로폭시펜(propoxyphene), 펜타조신(pentazocine); 및 이의 약학적으로 허용가능한 이의 유도체(예를 들어, 이의 약학적으로 허용가능한 염). 적절한 비-오피오이드 진통제는 비-스테로이드성 소염제(non-steroidal inflammatory drugs, NSAIDs) 뿐만 아니라, 아세트아미노펜(acetaminophen)과 같은 다른 진통제를 포함한다. 일반적으로 사용되는 NSAID는 급성 염증성 통증을 치료하기 위한 아스피린(asprin), 이부프로펜(ibuprofen), 인도메타신(indomethacin), 나프록센(naproxen) 및 케토프로펜(ketoprofen)을 포함 및 만성 염증성 통증을 치료하기 위한 셀레콕시브(celecoxib) 및 멜록시캄(meloxicam)을 포함한다.
상기 조합은 하나 또는 그 이상의 다른 항체와 함께 본 발명의 하나 또는 그 이상의 항체이다. 바람직한 조합은 하나 또는 그 이상의 항-TrkA 및/또는 항-NGF 항체이다. 이러한 조합은 단일 항체의 처리에 의해 본 발명에 개시된 질환의 하나 또는 그 이상의 치료하는 증가된 효능을 제공한다. 본 발명에서 사용된 분석절차에서 가장 효과적인 것 중에 둘 또는 그 이상의 항체의 조합을 예로 사용할 수 있다.
상기 조합은 NGF와 본 발명의 항체에 관한 것이다. 상술한 바와 같이, 알츠하이머 병, 당뇨병, 한센병, 등의 다양한 질환의 치료에서의 NGF의 사용은 제안되어있지만, 통증 민감도의 증가가 말초 표적 쪽으로 작용물질 특성으로부터 발생하는 것이 잘 알려져있다. 다시, 본 발명의 항체 또는 유도체를 이용하여, 통증 민감도를 감소시킬 수 있고, 그렇게 함으로써 NGF-기반 치료를 더 끌리도록 만든다.
상기 조합은 예를 들어, 알킬화제(alkylating agent), 항대사물질(antimetabolite), 토포이소머라아제 II 억제제(topoisomerase II inhibitor), 토포이소머라아제 I 억제제(topoisomerase I inhibitor), 항유사분열 약물(antimitotic drug) 또는 백금 유도체(platinum derivative)와 같은 항암제와 함께 본 발명의 항체에 관한 것이다.
본 발명의 항체는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 이는 복강내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 정맥내(intravenous), 피하(subcutaneous), 기관내(intratracheal), 경구(oral), 장내(enteral), 비경구(parenteral), 비강내(intranasal) 또는 경피(dermal) 투여를 포함한다(하지만 이에 제한되지 않는다.).
항체는 일반적으로 액체 제형의 투여(복강내 또는 두개내(intracranial)-일반적으로 대뇌 뇌실(cerebral ventricle)-또는 심막내(intrapericardiac) 또는 낭내(intrabursal)) 또는 고체 제형의 섭취(알약, 정제, 캡슐제의 형태) 및 액체 제형(에멀젼(emulsions) 및 솔류션(solutions)의 형태)으로 국소 외용으로 관리된다. 비경구 투여용 조성물은 일반적으로 호환성있는 면역 글로불린 용해된 용액, 바람직하게는 수용액을 포함한다. 이러한 제형의 항체/유도체의 농도는 0.005% 내지 15-20% w/v 보다 적은 형태에 따라 달라진다. 이는 액체, 점도, 등의 부피에 따라, 원하는 특정 투여 방식에 따라 선택된다. 대안적으로, 항체는 고체형으로 투여를 위해 제조될 수 있다. 항체는 결정 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 젤라틴(gelatin) 또는 아랍식 고무(Arabic rubber)와 같은 리간드(ligands); 락토오스(lactose) 또는 녹말(starch)의 수혜자(recipients); 알긴산(alginic acid), 프리모겔(Primogel) 또는 옥수수 녹말(corn starch)과 같은 중개자(agents); 마그네슘 스테아레트(magnesium stearate), 콜로이드성 이산화규소(colloidal silicon dioxide)와 같은 윤활제(lubricants); 사카로오스(saccharose) 또는 사카린(saccharin)과 같은 감미료(sweeteners); 또는 민트(mint) 및 살리실산 메틸(methyl salicylate)과 같은 풍미제(flavours)를 포함하는 다른 비활성(inert) 또는 부형제(excipient) 물질과 결합될 수 있다. 다른 약제학적 투약 시스템은 히드로겔(hydrogel), 히드록시메틸셀룰로오스(hydroxymethylcellulose), 리포솜(liposomes), 마이크로캡슐(microcapsules), 마이크로에멀젼(microemulsions), 마이크로스피어(microspheres), 등을 포함한다.
만약 질환이 국부적이라면, 질환/그것과 가까운 국소투여에 즉시 영향을 받는 사이트가 투여의 바람직한 모드이다. 항-TrkA 항체는 적절하게 온 몸에 투여된다. 전신 투여(systemic administration)는 예를 들어, 연속 정맥내 주사(continuous intravenous infusion), 급속 정맥 주사(bolus intravenous infusion), 피하(subcutaneous) 또는 근육내(intramuscular) 주사의 주사로 수행될 수 있다.
대안적으로, 투여의 다른 형태(예를 들어, 경구, 점막(mucosal), 흡입을 통해(via inhalation), 혀 밑(sublingually), 등)도 또한 사용될 수 있다. 경우에 따라, 그러나, 항체/유도체의 전달은 영향받는 조직의 부근에 국소 투여(예를 들어, 관절내 주사 또는 피하, 근육내 주사)해야한다.
항-TrkA 항체/유도체는 적절하게 유도된 투여 경로에 적합한 약제학적 조성물로 제제화될 것이다. 주사를 위한 용액은 적절한 버퍼 및 몰 농도의 변경(예를 들어, 인산, 염 및/또는 포도당)을 적절히 포함하는 수성 용매(예를 들어, 주입을 위한 물)로 항체/유도체 용해 또는 분산이 포함된다.
치료 제도(즉, 용량, 타이밍 및 반복)는, 선택된 투여 경로에 의한 생성물의 단일 또는 반복 투여(예를 들어, 주사)로 표현될 수 있다. 투여량의 간격은 임상 반응의 범위 및 지속기간뿐만 아니라, 특정 개인 및 개인 병력에 따라 변형 대상이 될 수 있다.
적절하게 항-TrkA 항체/유도체는 활동의 긴 지속기간을 갖는다. 특히, 항체의 임상 효과는 동물 연구로 결정된 바와 같이, 투여 21일 정도까지 연장된다. 더욱이, 항-TrkA 항체는 혈청 또는 혈장과 같은 투여가 중요한 생물학적 매트릭스에서 검출될 수 있는 것보다 더 긴 기간동안 임상 효과를 나타낼 수 있다.
활동의 긴 지속기간(즉, 1주 이상 적절한 효과의 지속, 또는 바람직하게는 적어도 2주 예를 들어, 적어도 3주 또는 적어도 4주)에 비추어볼 때, 항체/유도체는 주당 1회 이하 예를 들어, 2주당 1회 이하 또는 3주당 1회 이하 또는 4주당 1회 이하의 간격으로 피험자에 투여될 수 있다.
항-TrkA 항체/유도체의 적절한 하루 투여량은 일반적으로 체중의 0.1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏ 범위이다. 급성 및 만성 염증성 통증의 치료를 위한 항-TrkA 항체의 적절한 투여량은 적어도 0.1 ㎎/㎏이다(실시예 2 및 3 참조). 골관절염성 통증의 치료를 위한 항-TrkA 항체의 적절한 투여량은 적어도 0.1 ㎎/㎏이다(실시예 4 참조). 신경병증성 통증의 치료를 위한 항-TrkA 항체의 적절한 투여량은 적어도 0.01 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.1 ㎎/㎏ 및 가장 바람직하게는 1 ㎎/㎏이다(실시예 5 참조). 이 용량은 마우스의 생체내(in vivo) 조건과 관련이 있다. 본 발명은 통각과민이 NSAID의 투여에 의해 관찰된 것과 동일한 범위에서 유의하게 반전된 것을 특징으로 하는 급성 염증성 통증의 치료에서의 인간화된 항-TrkA 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 통각과민이 NSAID의 투여에 의해 관찰된 것과 동일한 범위에서 유의하게 반전된 것을 특징으로 하는 만성 염증성 통증의 치료에서의 인간화된 항-TrkA 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 통각과민이 프리가발린 및 아편의 투여에 의해 관찰된 것과 동일한 범위에서 유의하게 반전된 것을 특징으로 하는 골관절염성 통증의 치료에서의 인간화된 항-TrkA 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 통각과민이 프리가발린의 투여에 의해 관찰된 것과 동일한 범위에서 유의하게 반전된 것을 특징으로 하는 신경병증성 통증의 치료에서의 인간화된 항-TrkA 항체의 용도에 관한 것이다. 특별히 종양에 대한 투여로 돌아가면, 투여는 종양 또는 종양 부위 근처 조직에 직접 및 국소 주입을 통해 할 수 있다. 전신 투여의 경우, 용량은 하루에 0.05 ㎎/㎏ 내지 하루에 500 ㎎/㎏으로 다르며, 왜냐하면 이들은 쉽게 관리할 수 있기 때문에, 범위의 낮은 영역의 투여량이 바람직하다. 투여량은 예를 들어, 항체/유도체의 혈장에서 특정 레벨을 보장하고(약 5-30 ㎎/㎖의 범위, 바람직하게는 10-15 ㎎/㎖ 사이), 임상적 결과가 달성될 때까지 시간의 주어진 기간을 위한 레벨을 유지하기위해 보정된다.
췌장 또는 전립선 종양의 단계를 측정 또는 평가하기위한 효과적인 방법은 혈액에서의 전립선 특이 항원(prostate specific antigen, PSA)의 측정, 췌장 종양의 생존 시간의 측정, 두 가지 종양 유형의 경우 전이 확산의 감속 또는 억제의 측정을 기초로 한다.
종양 부위의 수준에서 직접적인 투여의 경우, 투여량은 많은 다른 변수들과 함께, 종양의 종류, 단계 및 부피를 포함하는 다른 요인에 의존한다.
종양의 부피에 따라, 일반적인 치료 용량은 0.01 ㎎/㎏ 및 10 ㎎/㎏ 주사로 다를 수 있고, 필요한 빈도로 투여할 수 있다.
어쨌든 치료의 성질, 인간화된 항체는 훨씬 더 느리게 제거되고, 비-인간화된 항체보다 혈장에서 효과적인 수준을 유지하기 위해 더 낮은 투여량을 요구한다. 또한, 친화도가 높은 항체로, 투여는 낮은 친화도를 갖는 항체보다 적은 빈도 및 작은 크기일 수 있다.
각 항체/유도체의 치료학적 유효량은 의사와 같은 당업자에 의한 치료동안 결정된다. 만약 필요한, 투여량은 감소시키거나(예를 들어, 부작용 감소를 위해) 또는 증가시킬 수 있다(치료 효과를 증가시키기 위해).
투여에 앞서, 본 발명의 항체의 제제는 동결 또는 감압하에 동결건조하여 보관할 수 있다. 이는 적절한 버퍼에 사용하기 전에 즉시 재구성할 수 있다. 동결건조 및 재구성은 활성의 손실의 결과를 가져올 수 있고, 항체 투여 수준은 이 사실을 보상하기 위해 조절될 수 있다.(통상적인 면역 글로불린의 경우, IgM 항체는 IgG 항체보다 더 큰 활성의 손실을 갖는 경향이 있다.) 저장 수명 또한, 항체가 특정 저장 기간 후에 사용되지 않도록 할당되어야한다.
본 발명의 항체 또는 이의 유도체는 의료 용도와 관련하여 기술된 질환/증상 중 어느 하나의 진단 또는 예후에 사용될 수 있다. 예를 들어, 이는 알츠하이머 병 등의 생성의 조숙 마커로서, TrkA 양성 종양 마커의 검출을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다.
이는 또한, CIPA("선천성통각상실 및 무한증")("congenital insensitivity to pain with anhydrosis")의 진단에 사용될 수 있다. 이는 유전적(hereditary), 열성(recessive), 재발성 에피소딕 발열(recurrent episodic fever)이 특징인 상염색체 증후군(autosomal syndrome), 무한증, 고통을 주는 자극에 대한 반응의 부재, 정신지체(mental retardation) 및 자가-손상의 경향이다. 이는 TrkA 유전자의 돌연변이에 의해 발생한다. 실제로 본 발명의 항체 또는 유도체는 TrkA의 비정상적인 발현(건강한 개인 또는 건강한 조직 샘플에서의 TrkA의 발현에 비해) 또는 TrkA 관련된 비정상적 활성을 포함하는 넓은 범위의 증상의 진단 및 예후에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 환자로부터 얻어진 생물학적 샘플을 수득하고, 본 발명의 항체 또는 유도체와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 만약 원한다면, 항체/유도체가 고정화될 수 있다. 상기 방법은 정량적 또는 정성적 방식으로 상기 샘플을 항체/유도체의 결합에 의해 분석하는 것을 포함할 수 있다. 만약 원한다면, 참조 및/또는 양성 대조군(건강한 상태를 나타냄) 또는 음성 대조군(질환의 존재/우도를 나타냄)으로 수행될 수 있다. 진단 목적을 위해, 항체는 모두 검출 표지 또는 비표지 될 수 있다.(본 발명에서 사용되는 용어 "표지"는 라벨 또는 임의의 다른 검출가능한 부분/표지 변경할 수 있는 계기의 부분이다.)
제조 물품 및 키트
본 발명의 다른 실시형태에서, 항체 또는 이들의 단편, 조성물 또는 상기 언급한 하나 또는 그 이상의 질병/증상의 치료를 위한 본 발명의 면역접합체를 포함하는 제조물품이 제공된다. 상기 제조물품은 용기(container) 및 용기와 연결된 라벨 또는 패키지 삽입부(package insert) 또는 용기와 연결을 포함할 수 있다. 예를 들면, 적합한 용기는 병, 바이알(vials) 또는 주사기를 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 상태를 치료하는데 효과적일 수 있는 조성물을 지탱하고, 멸균 접속포트(access port)(예: 상기 용기는 피하주사 바늘에 의해 접합할 수 있는 마개를 갖는 정맥내 투여 용액 백 또는 바이알 일 수 있다)를 가질 수 있다. 조성물에서 적어도 하나의 활성제는 본 명세서에서 설명된 항체일 수 있다. 상기 라벨 또는 패키지 삽입부는 상기 조성물이 선택의 증상을 치료하는데 사용될 수 있다.
나아가, 제조물품은 하기를 포함할 수 있다: (a) 조성물이 들어있는 첫 번째 용기, 여기서 상기 조성물은 본 명세서의 항체를 포함하고, (b) 조성물이 들어있는 두 번째 용기, 여기서 상기 조성물은 본 명세서의 항체보다 치료제를 포함한다. 본 명세서의 상기 실시형태의 제조물품은 패키지 삽입부를 추가적으로 포함할 수 있고, 첫 번째와 두 번째 조성물은 조합하여 사용될 수 있음을 나타낸다. 상기 치료제는 이전 섹션에서 설명된 임의 부속물 치료제일 수 있다(예: 혈전 용해제(thrombolytic agent), 항혈소판제(anti-platelet agent), 화학요법제(chemotherapeutic agent), 항혈관형제(anti-angiogenic agent), 항호르몬 화합물(anti-hormonal compound), 심장보호제(cardioprotectant), 및/또는 사이토카인을 포함하여 포유류에 있는 면역기능 조절인자). 대안적으로, 또는 부가적으로, 상기 제조물품은 주사용 정균 물(bacteriostatic water for injection (BWFI)), 인산염완충식염수(phosphate-buffered saline), 링거용액(Ringer's solution) 및 포도당 용액과 같은 약학적으로 허용가능한 버퍼를 포함하는 두 번째(또는 세 번째) 용기를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기는 다른 버퍼, 희석액, 여과기, 바늘, 및 주사기를 포함하여 상업적 및 사용자의 관점으로부터 원하는 다른 물질을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 범위 내에서, 키트는 항체, 본 발명의 조성물 또는 면역접합체 및 사용 안내서를 포함한다. 상기 키트는 면역억제제, 세포독성제 또는 방사선독성제, 또는 하나 이상의 본 발명의 추가 길항제 항체(예: 첫번째 길항제 항체로부터 구별되는 TrkA 항원에 있는 항원결정기에 결합된 보완되는 활성을 갖는 항체)와 같은 하나 이상의 추가 시약을 포함할 수 있다.
추가적인 설명 없이, 당업계의 보통기술의 하나는, 선행 설명 및 하기의 분명한 실시예를 사용하여, 본 개시의 제제를 만들고 활용하고 청구된 방법을 실행할 수 있음을 확신하게 한다. 하기의 실용적 실시예는 본 발명의 실행을 용이하게 하는 것을 제공하고, 본 개시의 나머지를 임의 방식으로 제한하여 해석되어서는 안 된다.
실시예
본 발명에 기술된 인간화된 항-TrkA 항체는 TrkA의 기능적 활성을 억제하는데 매우 효과적인, 항-TrkA 항체의 신규한 하위집단을 나타낸다. WO00/73344에 개시된 MNAC13으로 알려진 항-TrkA 마우스 단일클론 항체, 및 예를 들어, 치료의 증가로 억제의 높은 수준으로 이어질 수 있는 통증의 치료 및 암 관련 통증의 특정 상황하에 요구되는 억제의 같은 레벨에 도달하지않는 WO09/098238에 개시된 이의 인간화된 다양한 항체. 따라서, 높은 수준의 TrkA의 억제 효과를 나타내는 인간화된 항-TrkA 항체를 개발하는 것이 바람직하다.
TrkA의 기능적 활성의 항체 매개된 억제 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, TF-1 세포 증식 분석을 포함하며, 여기에서 세포 표면 TrkA/베타-NGF 매개된 세포 증식 억제를 위한 항체의 능력은 인자 의존적인 인간 백혈병 세포주 TF-1을 사용하여 분석된다(Kitamura T et al., (1989) J. Cellular Physiology 140(2):323-34). WO09/098238에 개시된 인간화된 항체는 MNAC13 마우스 항체의 인간화된 변이체 사이에 높은 억제도를 가지는 BXhVH5VL1 후보와 TF-1 증식 분석에서 억제 활성을 보여주었다. 또한, WO09/098238에 개시된 인간화된 항체는 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR) 기술을 이용하여 TrkA의 세포 밖 영역에 직접적인 결합을 증명한다. 따라서, WO09/098238에 개시된 인간화된 항체의 선택된 부분 집합인 BXhVH5VL1 인간화된 변이체 위에 인간 TrkA에 대한 개선된 결합 친화도와 TF-1 세포 증식 분석에서 더 중요하게 개선된 억제 잠재력을 가진 마우스 MNAC13 항체의 인간화된 변이체의 새로운 디자인의 설계를 위한 시작점으로 사용되었다.
다음 문서에서 "BXh"는 VH 또는 VL 또는 둘 다이다. VH 또는 VL은 각각, 특정한 수인 예를 들어, BXhVH5로 나타내는 특이적 중쇄 가변 도메인와 IGHG1 동종형을 가지는 중쇄, 또는 특정한 수인 예를 들어, BXhVL1로 나타내는 특이적 경쇄 가변 도메인과 카파 동종형을 가지는 경쇄를 나타낸다. 특정한 수를 가지는 VH 뿐만 아니라 특정 수를 가지는 VL 둘 다 "BXh" 예를 들어, BXhVH5VL1 뒤에 기술될 때, 이는 중 및 경 쇄 예를 들어, BXhVH5VL1 항체를 나타내는 BXhVH5 중쇄 및 BXhVL1 경쇄를 가지는 항체의 특이적 조합으로 구성되는 특이적 항체 분자를 나타낸다. WO09-098238에 개시된 VH 및 VL 가변 도메인의 선택된 부분집합에 기초하여 새로 설계된 인간화된 변이체는 "GBR" 항체로 지칭하였다. 반대로, 같은 명명법 시스템은 GBR 항체에 대해 유효하다. 본 발명에서 사용되는 가변 중쇄 도메인에서 만든 특이적 치환은 괄호로 표시된다. 모든 GBR 항체는 달리 명시되지 않는 한 IGHG1 중쇄 동종형과 카파 동종형 경쇄이다.
실시예 1: 항체 설계
WO09-098238에 개시된 40개의 항채 가운데, 5개의 인간화된 항체는 설계를 위한 입력으로 선택되었다: 중쇄 가변 도메인 VH1(SEQ ID NO: 1) 및 경쇄 가변 도메인 VL1(SEQ ID NO: 6)을 가지는 BXhVH1VL1, 중쇄 가변 도메인 VH3(SEQ ID NO: 3) 및 경쇄 가변 도메인 VL1을 가지는 BXhVH3VL1, 중쇄 가변 도메인 VH3 및 경쇄 가변 도메인 VL3(SEQ ID NO: 8)을 가지는 BXhVH3VL3, 중쇄 가변 도메인 VH5(SEQ ID NO: 5) 및 경쇄 가변 도메인 VL1을 가지는 BXhVH5VL1, 및 중쇄 가변 도메인 VH5 및 경쇄 가변 도메인 VL1을 가지는 BXhVH5VL3. 본 발명에서 사용되는 MNAC13 마우스 항체는 SEQ ID NO: 20의 중쇄 가변 도메인 MNAC13 VH, SEQ ID NO: 21의 중쇄, 및 SEQ ID NO: 22의 경쇄를 가진다.
놀랍게도, 모든 설계된 항체는 중쇄 가변 도메인의 위치 37(케벳 번호붙이기 (KaBat EA et al, ibid)에서 발린에서 알라닌(마우스 복귀-돌연변이)의 간단한 변화로 유용하게 되었다. 이러한 치환은 SPR에 의해 측정된 모든 설계된 항체 사이에 인간 TrkA에 대한 친화도를 크게 향상시키는 독특한 속성을 가진다. 더 중요한 것은, 같은 치환은 VH5와 쌍을 이루는 VL1 도메인(GBR VH5(V37A)VL1 항체)에 예기치않게 도입된 대부분의 변이체를 위한 TF-1 세포 증식 분석에서의 효력 증가로 이어져서, BXhVH5VL1 인간화된 항체에 비해 10배 증가한다. 특히, 같은 GBR VH5(V37A)VL1 항체 또한, MNAC13 마우스 항체에 비해 TF-1 세포 증식 분석에서 3배 효력 증가를 보였다.
인간화된 항체에서 마우스 유래 잔기의 수 증가는 면역원성(immunogenicity)의 위험을 증가시킬수 있고(Harding FA et al., (2010) MAbs 2(3):256-65), 상기 연구는 설계된 항체에서 마우스 잔기의 수를 감소시킬 수 있다. GBR VH5(V37A)VL1 항체에서 위치 3의 마우스 잔기 라이신을 글루타민으로의 변화의 결과인 GBR VH5(K3Q, V37A)VL1 항체는 BXhVH5VL1 인간화된 항체에 비해 마우스 잔기의 같은 수를 가지지만, 결합 친화도를 증가시키고, 모 마우스 MNAC13 항체의 FAB 열-안정성을 동등하게 하고, 및 억제 효능을 증가시켰다.
마지막으로, 항체-매개된 효과기 기능은 상기 유일한 TrkA 차단에 필요한 해로운 치료법일 수 있고, 이는 면역 세포에서 TrkA 발현 세포의 사멸을 매개하지않고 TrkA를 억제할수 있는 항-TrkA 항체를 개발하는 것이 바람직하다. 인간 IGHG4 동종형은 ADCC 또는 CDC와 같은 효과기 기능을 수행하지 않고, 효과기 기능이 필요하지않거나, 치료에 해가 될 때, 특히 적합한 항체 형식이다. 그러나, 자연적으로 발생하는 인간 IGHG4 동종형의 하나의 단점은 자연적으로 발생하는 인간 IGHG4 항체의 생체 내 중쇄 교환으로 공지되어있는 "FAB 교환" 현상으로 알려져있다(Labrijn AF et al., (2009) Nat. Biotechnol. 27(8):767-71). 재조합 및 내생의 인간 IGHG4s 사이의 중쇄 교환 억제 방법은 당업계에 공지되어 있고, 교환은 인간 IGHG1 동종형에서 발견한 구조적 힌지 구조를 모방하는 힌지 영역에 위치한 위치 228(EU 번호붙이기, Edelman GM et al., ibid)의 세린 잔기를 프롤린 잔기로의 치환에 의해 효율적으로 차단된다(Lewis KB et al., (2009) Mol. Immunol. 46(16):3488-94). GBR VH5(V37A)VL1 및 GBR VH5(K3Q, V37A)VL1은 둘 다 전술한 치료 목적을 위한 IGHG4 S228P로 형식화되고, 이의 IGHG1 동종형 대응과 동등한 효과를 보이며, 만들어진 두 GBR VH5(V37A)VL1 IGHG4 S228P 및 GBR VH5(K3Q, V37A)VL1 IGHG4 S228P 항체는 인간 치료에 적합하고, 이에 있어서 유일한 TrkA 차단이 필요하다.
방법
조작된 변이체의 디자인
가변 도메인의 VH5-VL1 쌍을 위한 3D 모델은 구조 상동-모델링 서버 SWISS-MODEL(Arnold K et al., (2006) Bioinformatics 22(2):195-201; http://swissmodel.expasy.org)을 자동 모드로 설정하여 사용하여 계산된다. 검색된 모델 주형(template)는 실험적으로 해결된 MNAC13 FAB 3D 구조이다(PDB code 1SEQ, www.pdb.org, Berman HM et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):235-42, Covaceuszach S et al., (2005) Proteins 58(3):717-27). MNAC13 VH, VH1, VH3, VH5의 서열 정렬 및 생식세포 VH3-023*01(SEQ ID NO: 23)도메인은 위치에 따라 다른 아미노산 함량을 보였다: 3, 5, 19, 37, 40, 42, 44, 49, 50, 52A, 53, 60, 62, 74, 82A, 83, 84, 89, 및 94(케벳 번호붙이기). 모델 분석은 CDR 영역 및/또는 중쇄-경쇄 가변 도메인 패킹(packing)에 미치는 영향에 기초하여, 위치의 부분집합의 선택을 허용했다. 이 위치의 부분집합의 구성은: 3, 37, 40, 42, 44, 49, 50, 60, 62, 89, 및 94(케벳 번호붙이기). 따라서 조작된 항체는 상기 기재된 위치의 부분집합으로부터 선택된 전술된 가변 도메인 서열(각각 SEQ ID NO: 1, 3, 5인 VH1, VH3, 및 VH5)에서의 단일 또는 다수 위치에서 치환을 포괄하는 중쇄 가변 도메인을 가지고있다. 보다 구체적으로, 조작된 항체는 전술한 하나 또는 둘 경쇄 가변 도메인 VL1 또는 VL3(SEQ ID NO 6 및 8)과 쌍으로 상기 기재된 치환된 중쇄 가변 도메인으로 구성되어 있다.
분자 생물학
조작된 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 DNA 서열(cDNAs)은 WO 09/098238에 개시된 PCR 주형으로 BXhVH1, BXhVH3, 및 BXhVH5의 벡터 DNAs를 사용하여 표준 돌연변이 유발 기술로 제조하였다. 마찬가지로, 경쇄 가변 도메인 cDNAs는 WO 09/098238에 개시된 BXhVL1 및 BXhVL3의 벡터 DNAs로부터 직접적으로 증폭하였다. 가변 도메인의 cDNAs는 PCR 조립(assembly) 기술을 사용하여 그들 각각의 불변 도메인 cDNA 서열의 업스트림(upstream)에 조립되었다. 마지막으로, 완전한 중 및 경쇄 cDNAs는 CMV 프로모터 및 소 성장 호르몬 폴리-아데닐화 신호(Bovine Growth Hormone poly-adenylation signal)를 전달하는 변형된 pcDNA3.1 벡터(Invitrogen, CA, 미국)를 기반으로 독립 벡터에 라이게이션하였다. 경쇄 특이적 벡터는 BamHⅠ 및 BsiWⅠ 제한효소 위치를 사용하여 카파 경쇄 불변 도메인 cDNA의 앞에 관심있는 경쇄 가변 도메인 cDNA의 라이게이션에 의해 카파 동종형 경쇄의 발현을 허용한다; 중쇄 특이적 벡터는 BamHⅠ 및 SalⅠ 제한효소 위치를 사용하여 IGHG1 CH1, IGHG1 힌지 영역, IGHG1 CH2, 및 IGHG1 CH3 불변 도메인을 암호화하는 cDNA 서열의 앞에 관심있는 중쇄 가변 도메인 cDNA의 라이게이션에 의해 조작된다. 두 중 및 경쇄 발현 벡터에서, 분비는 BamHⅠ 위치를 포함하는 마우스 VJ2C 리더 펩타이드에 의해 구동되었다. BsiWⅠ 제한효소 위치는 카파 불변 도메인에 위치하고; SalⅠ 제한효소 위치는 IGHG1 CH1 도메인에서 발견된다.
S228P 치환을 갖는 IGHG4 면역 글로불린 서식설정(formatting)은 전술한 중쇄 특이적 벡터에서 cDNA 서열을 암호화하는 S228P 치환을 갖는 IGHG4 CH1, IGHG4 힌지 영역, IGHG4 CH2, 및 IGHG4 CH3 불변 도메인의 cDNA 서열을 암호화하는 IGHG1 CH1, IGHG1 힌지 영역, IGHG1 CH2, 및 IGHG1 CH3 불변 도메인을 대체하여 달성된다. S228P 치환은 표준 PCR 돌연변이 유발 기술에 의해 인간 IGHG4 중쇄 cDNA를 템플레이트로 도입된다.
항체 생산
항체의 일시적 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄 벡터의 동일한 양은 폴리에틸렌이민(polyethylenimine)(jetPEI®, 폴리플러스-형질감염, Illkirch Cedex, 프랑스)을 사용하여 현탁액-적응된 HEK293-EBNA1 세포(ATCC® 카달로그 번호: CRL-10852)안으로 공동-형질감염하였다. 통상적으로, 1 ml당 0.8-1.2 백만개의 세포 밀도로 현탁된 세포 100 ml은 중쇄가 암호화된 발현 벡터 50 ㎍ 및 경쇄가 암호화된 발현 벡터 50 ㎍을 포함하는 DNA-jetPEI® 혼합물로 형질감염하였다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 숙주 세포 내로 도입될 때, 항체는 0.1% 플루로닉산(pluronic acid), 4 mM 글루타민(glutamine), 및 0.25 ㎍/㎖ 제네티신(geneticin)을 보충물로 배양 배지(EX-CELL 293, HEK293-무혈청 배지; Sigma, Buchs, 스위스) 내로 분비되도록 4 내지 5일 동안 세포를 배양함으로써 생산된다.
항체는 재조합 단백질-A 유선형 배지(GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, 스위스)를 사용하여 무세포 상층액으로부터 정제되고, 이전의 분석에서 인산완충식염수로 버퍼를 교환하였다.
시차주사 열량측정법( differential scanning calorimetry )을 이용한 안정성( stability ) 테스트
열량 측정(calorimetric measurement)은 VP-DSC 시차주사 초소형 열량계(differential scanning microcalorimeter)(GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, 스위스)로 수행되었다. 세포 부피는 0.128 ㎖이고, 가열 속도는 200℃/h이었으며, 초과압(excess pressure)은 65 p.s.i로 유지하였다. 모든 항체는 PBS(pH 7.4)에 1 ㎎/㎖의 농도로 사용되었다. 항체의 몰 열용량(molar heat capacity)는 항체가 제외된 동일한 완충액을 포함하는 이중(duplicate) 샘플과의 비교에 의해 추정되었다. 부분 몰 열용량 및 녹는 곡선(melting curve)은 표준 절차를 사용하여 분석되었다. 온도기록도(thermogram)는 기준선으로 수정되었고, 농도는 오리진(origin) 소프트웨어(v7.0, GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, 스위스)에 있어서 비-두 상태 모델(Non-Two State model)을 사용하여 추가적으로 분석되기 전에 정규화되었다(normalized).
SPR 로 친화도( affinity ) 측정
SPR 분석은 다른 항체(마우스 및 인간화된 항체)의 결합 동력학(binding kinetics)에서 결합 및 해리 속도 상수를 측정하는데 사용된다. 마우스 항체 및 인간화된 변이체의 결합 동력학은 상온에서 BIACORE 2000 기구(GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, 스위스)로 측정되고, 및 BiaEvaluation 소프트웨어(v4.1, GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, 스위스)로 분석되었다.
항체는 이가 분자이기 때문에, 이는 센서 칩 상에 항체를 고정화하는 것이 최선이다. 만약 항체가 분석물로 사용된다면, SPR 측정은 친화도에 더하여 원자가의 구성요소를 견딘다. BIAcore 평가 소프트웨어는 이가 모델 및 친화도 상수 추출할 수 있지만, 이는 가능한 단일가의 분석물과 협력하여 어느 원자가 성향을 회피하는 것이 바람직하다. 이를 위해, 인간 TrkA 세포 밖 영역의 단일가 형태는 HEK293-EBNA1 세포에서 만든 재조합 인간 TrkA-Fc 융합 단백질(SEQ ID NO: 24)의 소화(digestion)에 의해 제조하였다. 융합 단백질은 인간 TrkA 세포밖 영역(SEQ ID NO: 25)에 융합된 IGHG1 Fc 영역으로 구성되어 있고, 여기에서 프로테아제(protease)-특이적인 절단 서열은 두 영역(TEV 절단 프로테아제 아미노산 서열: ENLYFQS) 사이에 포함된다. 프로테아제 절단 후, 인간 TrkA 세포 밖 영역의 단일가 형태는 상기된 Fc 단편을 제거하는 단백질-A 과정을 포함하는 표준 크로마토그래픽 기술을 사용하여 동질성으로 정제하였다. 마지막으로, 단일가 인간 TrkA 세포 밖 영역 단백질은 친화도 측정을 위해 Biacore 러닝 버퍼로 희석되기 전에 PBS로 버퍼-교환되었다. 샘플 순도, 균일성 및 분자량은 SDS-PAGE 및 크기-배제 분석으로 확인하였다.
항체는 센서 칩 표면상에 정확한 방향으로 허용하기 위해 이의 Fc 부분의 캡쳐를 통해 고정하였다. 단일클론 마우스 항-인간 IgG(Fc) 항체 센서 칩은 이의 동종형에 관계없이 모든 인간화된 항체를 캡쳐하는데 사용되었고(인간 항체 캡쳐 키트(Human Antibody Capture Kit), 카달로그 번호 BR-1008-39, GE Healthcare Europe GmbH), 및 다중클론 토끼 항-마우스 면역 글로불린 센서 칩은 MNAC13 마우스 항체를 캡쳐하는데 사용되었다(마우스 항체 캡쳐 키트(Mouse Antibody Capture Kit), 카달로그 번호 BR-1008-38, GE Healthcare Europe GmbH).
데이터(센서그램: fc2-fc1)은 질량 전달 테스트에서 거의 질량 전달 한계를 갖는 질량 전달에도 불구하고, 1:1 랭뮤어(Langmuir) 모델을 장착하였다. 각 측정의 시작 부분에 캡쳐된 항체의 실험적 변이를 고려하기 위해, Rmax 값이 모든 맞춤(fit에 있어서 일부(local)에 설정되었다. 해리시간(dissociation times)은 적어도 350초였다. 측정은 3번 수행되었고, 참조를 위해 0 농도의 샘플을 포함하였다. Ch12 및 잔기의 값 모두는 실험 데이터 및 개별 결합 모델 사이의 맞춤의 양을 측정하기 위해 사용되었다.
TF -1 세포의 증식 분석
현탁액 적응된 TF-1 세포(ATCC® 카달로그 번호: CRL-2003)는 10% FCS, 및 5 ng/ml rhuβNGF(재조합 인간 베타-NGF, R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, 영국)를 포함하는 완전한 RPMI 배지에서 배양하였다. 분석에서, TF-1 세포는 인간-베타 NGF가 없는 완전한 RPMI에서 5시간 동안 배양하였다. 기아 단계에 따라, 세포를 원심분리하고, 각 항체의 다양한 농도로 있는 바닥이 평평한 96 웰(well) 플레이트에 접종하였고, 재조합 베타-NGF의 농도를 고정하였다. TF-1 세포는 7000 세포/웰의 밀도로 접종하였고, 5 ng/ml의 인간 베타-NGF(마지막 농도)와 함께 전체 항체-세포 혼합물 부피는 200 ㎕였다. 이 혼합물은 CO2 보충과 함께 37℃에서 4일 동안 배양하였다. 3일에, 배양 조건의 어떤 변화 없이 비색 염색 Alamar 블루(AbD Serotec, Morphosys AbD GmbH, Dusseldorf, 독일)를 각 웰에 첨가하였다. 4일째에, 형광은 530 내지 560 nm 여기 파장(excitation wavelength) 및 590 nm 방출(emission) 파장으로 Bio-Tek Synergy™ 2 분광광도계(spectrophotometer)/마이크로플레이트 리더(BioTek Instruments GmbH, Luzern, 스위스)에서 판독하였다. 실험은 적어도 두 번 수행하였고, 각 항체 농도에 대한 측정은 3번 반복 수행하였다.
결과
BXhVH5VL1 을 기반으로 하는 조작된 새로운 인간화된 항- TrkA 항체
가변 도메인의 VH5-VL1 쌍에 대한 3D 모델을 기초로 하여, 다른 중쇄 가변 도메인(VH1, VH3, 및 VH5) 내의 공통 3D 위치들의 부분집합은 마우스에서 인간뿐만 아니라, 인간에서 마우스 돌연변이에서 선택된다; 이 그룹은 위치로 구성되어있다: 3, 37, 40, 42, 44, 49, 50, 60, 62, 89, 및 94(케벳 번호붙이기). 본 발명에 사용되는 치환의 조합에 관한 조작 전략은 CDR 영역 및/또는 가변 도메인 패킹 및/또는 면역원성에 미치는 영향에 대한 추정의 관점에서 다른 치환의 상보성에 기초하였다.
첫번째 방법에서 마우스에서 인간 및 인간에서 마우스 돌연변이는 IGHG1 동종형 포맷의 맥락에서 BXhVH5VL1 후보로 조작되었다. 마우스에서 인간 돌연변이는 다음과 같은 치환을 포함한다: K3Q, T40A, R44G, A49S, Y50A, P60A, T62S, 및 R94K. 조작된 항-TrkA 항체의 일부의 생산 수율 및 친화도는 각각 표 1 및 2에 나타낸 바와 같이, 단일 또는 조합의 치환을 기초로 한다. 대부분 또는 모든 마우스에서 인간 돌연변이 결합은 낮은 생산 수율 및 TrkA 결합의 전체 손실을 주도한다. 예를 들어, 마우스에서 인간 치환 A49S와 Y50A의 결합은 결합의 완전한 폐기를 유도하고, 다른 마우스에서 인간 치환을 구제하지않고, 마우스에서 인간 치환 K3Q, T40A, R44G, 및 R94K는 다른 마우스에서 인간 치환과 함께 단독 또는 조합으로 사용했을 때, 친화도의 개선을 이끌지않았다.
인간에서 마우스 돌연변이는 다음과 같은 치환을 포함한다: V37A, G42E, 및 V89L. 인간에서 마우스 치환 V37A는 가장 긍정적인 효과를 가지고있고, 친화도가 적어도 2배 증가하였다(KD는 적어도 두 배 감소)(표 2 및 도 1); 친화도의 2.5배 증가는 GBR VH5(V37A)VL1 IGHG1항체에서 기록되었다. 친화도의 증가는 마우스에서 인간 치환 P60A 및 T62S와 인간에서 마우스 치환 V37A가 결합할 때 폐지되고, 그러나 마우스에서 인간 치환 K3Q 및/또는 R44G의 조합하였을 때 유지되었다. 이러한 결과는 종합적으로 결합하도록 하는 위치 49 및 50의 중요성과 적어도 두 배로 BXhVH5VL1의 친화도를 증가시키는데 인간에서 마우스 치환 V37A의 고유 특성을 확인하였다. 항체-매개된 효과기 기능은 상기 유일한 TrkA 차단이 필요한 치료는 불리할 수 있고, GBR VH5(V37A)VL1 및 GBR VH5(K3Q, V37A)VL1은 S228P 치환을 갖는 전술된 IGHG4 동종형에서 모두 포맷을 새로한다. 둘 다 조작된 항체는 이의 IGHG1 동종형 대체로 유사한 친화도를 보이고, 동종형 스위치 영향을 받지않은 V37A 치환에 의해 친화도 개선을 나타낸다.
BXhVH1VL1 , BXhVH3VL1 BXhVH3VL1 및 BXhVH5VL3 을 기반으로 하는 조작된 새로운 인간화된 항- TrkA 항체
두번째 방법으로, V37A 치환은 WO 09/098238으로부터 발생하여 선택된 다른 후보, 및 SPR에 의해 BXhVH5VL1 및 MNAC13 항체에 결합하여 벤치마킹하는 조작된 항-TrkA 항체의 친화력으로 도입되었다. V37A 치환된 항체의 생산 수율 및 친화도는 각각, 표 3 및 4에 개시되었다. 조작된 항체가 생산 수율의 차이를 가지고 있지만, 모든 조작된 항체는 V37A 치환의 도입에서 친화성 향상을 나타낸다. 친화도는 BXhVH3VL1, BXhVH1VL1, BXhVH3VL3, 및 BXhVH5VL3에서 각각 8, 20, 30, 및 55% 향상되었다. 따라서, 인간에서 마우스 치환 V37A는 BXhVH5VL1에 도입될 경우, 친화도의 증가를 유도하지 않지만, 가장 예기치않게 또한, 모든 인간화 변이체 사이의 친화도가 증가되었다. 특히, GBR VH5(V37A)VL1 또는 GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 둘 다 IGHG1 또는 IGHG4 S228P 동종형은 MNAC13 마우스 항체에 대한 친화도 측정이 친화도와 일치했다(표 2 및 4); BXhVH5VL1 항체에 비해 적어도 두 배만큼 둘 다 증가하였다(각각, KD는 2.5 내지 2.7배 감소).
표 3 및 도 2는 조작된 항체 내에서 측정된 FAB 부분의 용융 온도를 포함한다. 단일클론 항체 용융 개요는 그들 동종형의 특징이지만, FAB 단편의 중간-지점 용융 온도(Tm)은 전체-길이 면역 글로불린의 맥락에서 선별될 수 있다(Garber E and Demarest SJ (2007) Biochem. Biophys. Res. Commun. 355(3):751-7). 이러한 FAB 부분의 중간-지점 용융은 조작된 후보들의 안정성을 모니터링하는데 사용되었다. GBR VH5(V37A)VL1 및 GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 FAB 단편은 각각 73.6 및 73℃에서 하나의 전이를 각각 표시하고, 일반적으로 설계 프로세스 FAB 안정성 유지에 성공했음을 나타내는 빽빽하게 접히는 Fab 단편에 대해 관찰되는 둘 다 동등한 모양의 열-안정성과 협동 언폴딩(unfolding)의 부합하는 FAB 전이의 진폭이다. 추가적인 예시는, GBR VH5(V37A)VL1의 FAB Tm 또는 MNAC13 FAB Tm(74℃)의 GBR VH5(K3Q,V37A)VL1를 비교할 때, 차이가 1℃ 이내이다.
조작된 항- TrkA 항체의 기능 시험
조작된 항-TrkA 항체는 TF-1 세포 증식 분석에서의 TrkA의 기능적 활성을 억제하는 그들의 능력에 대해 분석하였다(도 3). 생물학적 기능을 억제하는 화합물의 효과의 측정한 억제 중간값(half maximal inhibitory concentration)(IC50)은 각 곡선에 대해 계산하였으며, 그 결과를 표 5에 나타내었다. GBR VH1(V37A)VL1은 SRP에 낮은 친화도 때문에 분석되지 않았다.
이는 GBR VH5(V37A)VL1이 동일한 IC50을 가진 GBR VH5(K3Q, V37A)VL1, GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P, 및 GBR VH3(V37A)VL1 보다 최고의 결과인 것을 발견하였다. GBR VH3(V37A)VL3 및 GBR VH5(V37A)VL3 항체는 IC50이 약간 높았지만, 모든 조작된 항체의 시험에서 BXhVH5VL1, GBR VH5(V37A)VL1 보다 10배 더 나은 결과를 나타냈다. 특히, GBR VH5(V37A)VL1 항체는 또한, MNAC13 마우스 항체와 비교하여 TF-1 세포 증식 분석에서 3배 증가 효능을 나타냈다. 모든 V37A 변이체는 마우스 모 항체와 비교하여 동등하거나 더 나은 IC50을 가졌다.
BXhVH5VL1에 기초하여 조작된 항-TrkA 항체의 선택에서의 생산 수율; 모든 항체는 별도의 언급을 제외하고는 IGHG1 동종형이다. (*) S228P 치환된 IGHG4 동종형. + 실시예 1에 기술된 바와 같이, 마우스에서 인간 및 인간에서 마우스 돌연변이 포함.
인간화된 항-TrkA 항체 SEQ ID NOs 돌연변이의 수+ 일시적 발현(mg/l)
BXhVH5VL1 28, 29 8 10
GBR VH5(K3Q)VL1 50, 29 7 16
GBR VH5(V37A)VL1 51, 29 9 19
GBR VH5(V37A)VL1 (*) 52, 29 9 11
GBR VH5(G42E)VL1 53, 29 9 19
GBR VH5(V89L)VL1 54, 29 9 17
GBR VH5(R94K)VL1 55, 29 7 15
GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 56, 29 8 52
GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 (*) 57, 29 8 11
GBR VH5(K3Q,T40A)VL1 58, 29 6 3
GBR VH5(P60A,T62S)VL1 59, 29 6 7
GBR VH5(K3Q,V37A,R44G)VL1 60, 29 7 24
GBR VH5(K3Q,A49S,Y50A)VL1 61, 29 5 15
GBR VH5(K3Q,P60A,T62S)VL1 62, 29 5 7
GBR VH5(K3Q,T40A,P60A,T62S)VL1 63, 29 4 8
GBR VH5(K3Q,V37A,T40A,P60A,T62S)VL1 64, 29 5 12
GBR VH5(K3Q,T40A,R44G,A49S,Y50A)VL1 65, 29 3 22
GBR VH5(K3Q,A49S,Y50A,P60A,T62S)VL1 66, 29 3 16
GBR VH5(K3Q,T40A,R44G,A49S,Y50A,P60A,T62S)VL1 67, 29 1 3
GBR VH5(K3Q,T40A,R44G,A49S,Y50A,P60A,T62S,R94K)VL1 68, 29 0 3
BXhVH5VL1에 기초하여 조작된 항-TrkA 항체의 선택에서의 친화도; 모든 항체는 별도의 언급을 제외하고는 IGHG1 동종형이다. (*) S228P 치환된 IGHG4 동종형. N.B. 결합하지않은 것을 나타냄.
인간화된 항-TrkA 항체 KD(nM)
BXhVH5VL1 40.9
GBR VH5(V37A)VL1 16
GBR VH5(V37A)VL1 (*) 15
GBR VH5(R94K)VL1 52
GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 15.4
GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 (*) 15
GBR VH5(K3Q,V37A,R44G)VL1 20
GBR VH5(K3Q,A49S,Y50A)VL1 N.B.
GBR VH5(K3Q,V37A,T40A,P60A,T62S)VL1 48
GBR VH5(K3Q,T40A,R44G,A49S,Y50A)VL1 N.B.
GBR VH5(K3Q,A49S,Y50A,P60A,T62S)VL1 N.B.
GBR VH5(K3Q,T40A,R44G,A49S,Y50A,P60A,T62S)VL1 N.B.
GBR VH5(K3Q,T40A,R44G,A49S,Y50A,P60A,T62S,R94K)VL1 N.B.
조작된 항-TrkA 항체의 선택에서의 생산 수율 및 FAB 열안정성 데이타; 모든 항체는 별도의 언급을 제외하고는 IGHG1 동종형이다.
항-TrkA 항체 SEQ ID NOs 발현(mg/l) Tm Fab(℃)
MNAC13 21, 22 5 74
BXhVH1VL1 26, 29 10 64.7
GBR VH1(V37A)VL1 69, 29 16 65.3
BXhVH3VL1 27, 29 9 71.3
GBR VH3(V37A)VL1 70, 29 1 70.2
BXhVH3VL3 27, 30 6 71
GBR VH3(V37A)VL3 70, 30 9 69.3
BXhVH5VL1 28, 29 16 76.5
GBR VH5(V37A)VL1 51, 29 19 73.6
GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 56, 29 52 73
BXhVH5VL3 28, 30 16 76.4
GBR VH5(V37A)VL3 51, 30 19 73.3
V37A 조작된 항-TrkA 항체의 친화도; 모든 항체는 별도의 언급을 제외하고는 IGHG1 동종형이다.
항-TrkA 항체 kon(1/Ms) koff(1/s) KD(nM)
MNAC13 6.02 1.09 18
BXhVH1VL1 3.13 1.33 426
GBR VH1(V37A)VL1 1.96 6.63 338
BXhVH3VL1 4.65 6.19 133
GBR VH3(V37A)VL1 3.82 4.71 123
BXhVH3VL3 3.14 4.59 134
GBR VH3(V37A)VL3 3.1 2.95 95
BXhVH5VL1 1.04 4.26 40.9
GBR VH5(V37A)VL1 1.4 2.25 16
GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 1.7 2.62 15.4
BXhVH5VL3 6.23 3.95 63
GBR VH5(V37A)VL3 7.45 2.05 28
V37A 조작된 항-TrkA 항체의 TF-1 세포 증식 분석 IC50s; 모든 항체는 별도의 언급을 제외하고는 IGHG1 동종형이다. (*) S228P 치환된 IGHG4 동종형. N.D. 결정되지않은 것을 나타냄.
항-TrkA 항체 IC50(㎍/㎖)
MNAC13 0.23
BXhVH5VL1 0.73
GBR VH1(V37A)VL1 N.D.
GBR VH3(V37A)VL1 0.15
GBR VH3(V37A)VL3 0.29
GBR VH5(V37A)VL1 0.075
GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 0.15
GBR VH5(K3Q,V37A)VL1(*) 0.15
GBR VH5(V37A)VL3 0.22
실시예 2: 인간화된 항- TrkA 항체는 CFA 의 발바닥 내 주사로 유도된 발의 급성 염증성 통각과민을 반전시킨다.
마우스의 뒷발 중 하나에 완전 프로인트 보조제(Complete Freunds adjuvant, CFA)의 발바닥 내 투여는 급성 염증성 통각과민을 발생하게하고, 이는 체중 부하 방법을 사용하여 평가된다. 투여하지않은 마우스는 일반적으로 그들의 두 뒷발 사이에 동등하게 체중을 배포한다. 그러나, CFA 주입된 뒷발은 염증과 고통이 있어, 체중은 주입된 발(동측) 쪽은 줄이고, 비-주입된(반대측) 뒷발에 증가되도록 재배치된다.
방법
각 뒷다리를 통한 체중 부하는 통증 측정 장치(incapacitance tester)(Linton Instruments, 영국)을 사용하여 측정된다. 마우스는 뒷발에 별도의 센서를 착용하고 통증 측정 장치 안에 놓아두고, 양쪽 뒷다리에 가해진 힘의 평균은 2초 이상 기록하였다. 투여하지않은 AMB1 마우스는 음식과 물은 가능한 자유롭게 제공하였고, 그들의 홈 케이지 안에서 실험 방에 순응하였다. AMB1 마우스는 인간에 대응하는 마우스 TrkA의 엑손 1의 교체뿐만 아니라 인간 TrkA 단백질의 배타적인 발현으로 생성된다. 통증 측정 장치의 습관화는 며칠 동안 실시하였다. 기준 체중 부하 기록은 이전 모욕의 유도로 얻었다.
염증성 통각과민은 왼쪽 뒷발에 CFA(1.5 ㎎/㎖ 용액의 20 ㎕)의 발바닥 내 주입으로 유도되었다. 전-처리 체중 부하 판독은 CFA 23시간 후 통각과민을 평가하기 위해 얻어졌다. 동물은 라틴 사각형 디자인에서 CFA 창에 따라 무작위로 순위화되었다. CFA 24시간 후, 동물은 동종형 대조군 0.1 ㎎/㎏ 복강내 주사 또는 항체 GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P의 0.0001, 0.001, 0.01 및 0.1 ㎎/㎏ 복강내 주사(투여 부피 10 ㎖/㎏)의 단일 복강내 주사 투여로 처리되었다. 비-선택적 NSAID 인도메타신은 양성 대조군으로 10 ㎎/㎏(투여 부피 5 ㎖/㎏) 구강내 주입으로 사용하였다. 체중 부하 판독은 항체/약 처리 4, 8, 24, 48, 72, 96 및 120 시간 후에 얻었다.
행동 평가는 블라인드로 하였다. 체중 부하(g) 측정값은 모두 동측 또는 반대측 뒷발에 대해 수행하였고, 체중 부하 차이를 %로 표현하였다(% 투여군(ipsi)/대조군(contra)). 데이터는 각 시점에서 동종형 대조군과 비교하여 분석하였다. 통계 분석은 InVivoStat을 사용하여 계획된 비교테스트한 다음에 ANOVA 반복 측정으로 하였다(p<0.05 유의하다고 판단).
결과
CFA의 발바닥 내 투여로 유도된 뚜렷한 통각과민은 동측에서 반대측 뒷발로 체중 부하의 변화에 의해 % ipsi/contra 비율에서 저하를 초래하는 것이 CFA 23시간 후 측정된다(도 4). CFA 24시간 후 개시된 동종형 대조군 처리는 통각과민의 효과를 보이지 않는다. 통각과민의 유의한 반전은 동종형 대조군에 비해 투여 후 4-48 시간부터 항체 GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P의 0.01 및 0.1 ㎎/㎏에서 관찰된다. 항체 GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P의 0.001 ㎎/㎏ 투여량 또는 이보다 아래는 통각과민의 반전에 효과가 없었다. 인도메타신(10 ㎎/㎏)은 실험의 모든 시간 포인트에 통각과민의 유의한 반전을 보였다. 결론적으로, 항체 GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P는 인도메타신과 유사한 발의 급성 염증성 통각과민의 유의한 반전을 보인다. 또한, GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P 주입된(0.01 및 0.1 ㎎/㎏)의 유효 투여량은 인도메타신(10 ㎎/㎏)의 유효 투여량보다 몇 배 낮고, 항-TrkA 항체가 이 조건을 위한 표준 투여보다 훨씬 낮은 투여량으로 투여될 수 있음을 입증하였다.
실시예 3: 인간화된 항- TrkA 항체는 CFA 의 관절 내 주사로 유도된 무릎 관절의 만성 염증성 통각과민을 반전시킨다.
마우스의 뒷다리의 무릎 관절 중 하나에 CFA의 관절 내 투여는 만성 염증성 통각과민을 발생하게하고, 이는 체중 부하 방법을 사용하여 평가된다. CFA 주입된 관절은 염증과 고통이 있어, 체중은 주입된(동측) 관절이 있는 다리 쪽은 줄이고, 비-주입된(반대측) 관절이 있는 다리에 증가되도록 재배치된다. 이 동물 모델에서 이러한 징후의 개발은 그들이 골관절염 및 류마티스 관절염과 같은 기본 조건과 관련된 만성 염증성 관절 통증을 제시 환자에 의해 표시되는 증상을 반영하여 임상적으로 관련이 있을 것으로 추정된다.
방법
투여하지않은 AMB1 마우스는 음식과 물은 가능한 자유롭게 제공하였고, 그들의 홈 케이지 안에서 실험 방에 순응하였다. AMB1 마우스는 인간에 대응하는 마우스 TrkA의 엑손 1의 교체뿐만 아니라 인간 TrkA 단백질의 배타적인 발현으로 생성된다. 통증 측정 장치의 습관화를 실시하였다. 기준 체중 부하 기록은 즉시 CFA 주입으로 얻었다. 동물은 무균 조건에서 이소플루란 및 산소를 3:1로 혼합 사용하여 마취시켰다. 무릎 지역은 면도하고, 히비스크럽(hibiscrub) 용액으로 깨끗하게 하였다. 왼쪽 무릎은 10 ㎎/㎖의 10 ㎕ CFA를 주입하였다. 동물은 자신의 홈 케이지로 돌아가기 전에 따뜻한 환경에서 회복하였다. 동물은 CFA 4, 7 및 10일 후 체중 부하 판독을 사용하여 염증성 통각과민의 발생을 평가하였다. CFA 10일 후 측정을 기초로 하여, 동물은 그들의 CFA 창에 따른 치료 그룹으로 무작위로 순위화되었다. 통각과민이 잘 확립된 CFA 13일 후, 동물은 다른 동종형 대조군 항체의 10 ㎎/㎏ 복강내 주사 또는 항체 GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P의 0.001, 0.01 및 0.1 ㎎/㎏ 복강내 주사의 단일 투여로 처리되었다. COX-2 선택적 NSAID 셀레콕시브는 양성 대조군으로 하루에 두 번 60 ㎎/㎏ 구강내 주입으로 사용하였다. 항체 처리 그룹의 체중 부하는 투여 후 4, 8, 24 및 96 시간 후 측정되었다. 셀레콕시브 투여 그룹의 체중 부하는 CFA 13일 후에 투여 후 1 및 8시간 후, 및 CFA 14-17일 후에 투여 후 1시간 후에 특정되었다. 행동 평가는 블라인드로 하였다. 체중 부하(g) 측정값은 모두 동측 또는 반대측 뒷다리에 대해 수행하였고, 체중 부하 차이를 %로 표현하였다(% 투여군(ipsi)/대조군(contra)). 데이터는 각 시점에서 동종형 대조군과 비교하여 분석하였다. 통계 분석은 InVivoStat을 사용하여 계획된 비교테스트한 다음에 ANOVA 반복 측정으로 하였다(p<0.05 유의하다고 판단).
결과
CFA의 무릎 관절 내 투여로 표시 및 오래-지속되는 통각과민의 원인은 동측에서 반대측 뒷다리로 체중 부하의 변화에 의해 % ipsi/contra 비율에서 저하를 초래하는 것이 CFA 3일에서 측정된다(도 5). 동종형 대조군 항체 처리는 통각과민에서 효과를 보이지 않는다. 통각과민의 유의한 반전은 항체 GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P의 0.01, 1 및 10 ㎎/㎏의 단일 투여의 투여 4-72시간 후 동종형 대조군에 비해 96시간에 비해 가장 높은 두 용량이 유의적으로 관찰되었다. 결론적으로, 0.01 ㎎/㎏ 항체 GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P 또는 이상의 단일 투여는 셀레콕시브의 다중 투여와 유사한 무릎 관절의 만성 염증성 통각과민의 유의하고 지속적인 반전을 보인다. 또한, 0.01 ㎎/㎏ 항체 GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P의 단일 투여는 60 ㎎/㎏ 셀레콕시브의 다중 투여에 비하여 효과를 달성하기위해 요구되었고, 항체 GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P는 NSAID 셀레콕시브보다 훨씬 낮은 용량 및 적은 반복으로 제공되어, 이는 치료의 현재 표준임을 나타낸다.
실시예 4: 인간화된 항- TrkA 항체는 CFA 의 관절 내 주사로 유도된 무릎 관절의 만성 골관절염성 통각과민을 반전시킨다.
마우스의 뒷다리의 무릎 관절 중 하나에 모노소듐 아이오도아세테이트(monosodium iodoacetate, MIA)의 관절 내 투여는 국소 관절 염증(local joint inflammation)과 연골 분해(cartilage degradation)의 결합으로 만성 골관절염성 통각과민을 발생시킨다. 이와 같이, MIA 모델에서의 통각과민 측정은 골관절염성-관련 통증과 많이 비슷하다. 또한, 연골 분해는 신경병증성과 같은 특성으로 만성 신경 손상을 이끈다. 항경련약물(anticonvulsant)인 프리가발린(pregabalin)은 신경병증성 통증의 치료에서 권장하는 1차 약물로 비교 화합물로 본 발명에서 사용된다. 약한 μ-오피오이드 수용체 작용제인 트라마돌(tramadol)은 NSAID와 달리, 트라마돌은 위장관 출혈이나 신장에 문제를 일으키지 않으며, 이는 관절 연골에 영향을 미치지 않기 때문에 OA의 치료에 점점 사용되고 있다. 이러한 이유로 트라마돌의 경우, 항체 GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P에 대한 비교로 프리가발린과 함께 사용되었다.
방법
투여하지않은 AMB1 마우스는 음식과 물은 가능한 자유롭게 제공하였고, 그들의 홈 케이지 안에서 실험 방에 순응하였다. AMB1 마우스는 인간에 대응하는 마우스 TrkA의 엑손 1의 교체뿐만 아니라 인간 TrkA 단백질의 배타적인 발현으로 생성된다. 통증 측정 장치의 습관화는 며칠 동안 실시하였다. 기준 체중 부하 기록은 측정하여 얻었다. 동물은 무균 조건에서 이소플루란 및 산소를 3:1로 혼합 사용하여 마취시켰다. 무릎 지역은 면도하고, 히비스크럽(hibiscrub) 용액으로 깨끗하게 하였다. 100 ㎎/㎖의 5 ㎕(500 ㎍) MIA 또는 식염수(가짜)는 왼쪽 뒷다리 무릎의 무릎 관절에 주입하였다. 동물은 자신의 홈 케이지로 돌아가기 전에 따뜻한 환경에서 회복하였다. 동물은 CFA 3-23일 후 체중 부하 판독을 사용하여 정기적으로 무릎 관절 통각과민의 발생을 평가하였다. 체중 부하 측정은 MIA 14일 후 동종형 대조군 항체의 100 ㎍/㎏(5 ㎖/㎏의 투여 부피) 또는 항체 GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P의 1, 10 및 100 ㎍/㎏ 단일 복강내 주사로 처리한 다음 MIA 반응 창에 따른 치료 그룹으로 무작위로 순위화되었다. 비교 대조군으로 동물은, MIA 14일 후 트라마돌 10 ㎎/㎏ 또는 프리가발린 30 ㎎/㎏ 경구투여(5 ㎖/㎏의 투여 부피) 다음에 트라마돌 30 ㎎/㎏ 또는 프리가발린 100 ㎎/㎏을 MIA 16-22일까지 매일 다른 날 처리하였다(5 ㎖/㎏의 투여 부피). 모든 동물은 매 24시간 마다 항체 처리한 그룹은 MIA 14일 후 투여 4, 8, 및 24시간 후, 트라마돌 및 프리가발린 처리한 그룹은 투여 1 및 24시간 후 체중 부하를 사용하여 측정되었다. 행동 평가는 블라인드로 하였다. 체중 부하(g) 측정값은 모두 동측 또는 반대측 뒷다리에 대해 수행하였고, 체중 부하 차이를 %로 표현하였다(% 투여군(ipsi)/대조군(contra)). 데이터는 통각과민에서 MIA의 효과에 미치는 영향에 대해, 각 시점(MIA 3-14일 후)에서 가짜군과 비교하여 분석하였다. 투여 후 데이터는 각 시점에서 동종형 대조군과 처리 그룹을 비교하여 분석하였다. 통계 분석은 InVivoStat을 사용하여 계획된 비교테스트한 다음에 ANOVA 반복 측정으로 하였다(p<0.05 유의하다고 판단).
결과
MIA 500 ㎍의 무릎 관절 내 투여로 표시되는 통각과민의 원인은 동측에서 반대측 뒷다리로 체중 부하의 변화에 의해 % ipsi/contra 비율에서 저하를 초래하는 것이 CFA 3일에서 측정된다. 통각과민의 유의한 반전은 항체 GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P의 10 및 100 ㎍/㎏의 단일 투여의 투여 4 시간-7일 후 각 시점에서 동종형 대조군에 비해 관찰되었다(도 6A). 1 ㎍/㎏의 항체 GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P는 통각과민의 효과를 가지지않았다. 트라마돌(10 ㎎/㎏) 및 프리가발린(30 ㎎/㎏)은 MIA 14일 후 투여 1시간 후 효과가 없었으나, 투여 4시간 후 통각과민의 유의한 반전을 보였다(도 6B). MIA 14일 후 투여 1시간 후 효과가 없기 때문에, 트라마돌은 30 ㎎/㎏으로 증가시키고, 프리가발린은 100 ㎎/㎏으로 증가시켜서, 둘 다 MIA 16, 18 및 20일 후 투여 1시간 후 통각과민의 유의한 반전을 보였다. 결론적으로, 10 ㎍/㎏ 항체 GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P 또는 이상의 단일 투여는 트라마돌 및 프리가발린의 다중 투여와 유사한 무릎 관절의 만성 골관절염성 통각과민의 유의하고 지속적인 반전을 보인다. 또한, 10 ㎍/㎏ 항체 GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P의 단일 투여는 훨씬 높은 용량 사용되는 트라마돌 및 프리가발린(각각, 30 ㎎/㎏ 및 100 ㎎/㎏), 두 약의 다중 투여에 비하여 효과를 달성하기위해 요구되었다. 따라서, 항-TrkA 항체는 프리가발린 및 트라마돌 보다 훨씬 낮은 투여량 및 낮은 용량 빈도수로 투여될 수 있다.
실시예 5: 인간화된 항- TrkA 항체는 좌골 신경의 만성 수축 손상으로 유도된 말초 신경병증성 통각과민 및 이질통을 반전시킨다.
말초 신경병증성 통증은 손상, 기능 장애 또는 말초 신경계의 질환으로 인한 통증의 만성 형태이다. 이는 전형적 통각(통증 자극에 응답하여 고조)뿐만 아니라 이질통(비-통증 자극에 대한 통증 응답)을 포함한다. 신경병증성 통증은 말초 신경의 손상에 의해 실험 동물에서 유도할 수 있고, 이는 일반적으로 느슨한 라이게이션을 통해 좌골 신경의 만성 협착 손상)chronic constriction injury, CCI)에 의해 달성된다(Bennett & Xie (1998) Pain, 33: 87- 107). 프리가발린은 신경병증성 통증의 치료에서 권장하는 1차 약물이기 때문에 비교 화합물로 본 발명에서 사용된다.
방법
CCI 수술은 케타민 자일라진(ketamine xylazine)(복강내 주사, 100 및 10 mg/kg/10 ml) 마취하에 AMB1 수컷 및 암컷 마우스에서 수행하였다. AMB1 마우스는 인간에 대응하는 마우스 TrkA의 엑손 1의 교체에 의해 생성하고, 인간 TrkA 단백질을 독점적으로 발현한다. 털은 잘라내고, 왼쪽 좌골 신경은 허벅지 중간 부분에 노출, 무균처리하였다. 3개의 느근한 끈(4-0 검은 실크 사용)은 신경의 분기 이전에 1-2 mm의 좌골 신경 주위에 위치했다. 수술 부위는 피부 봉합 후 베타딘(betadine) 용액으로 처리하였다. 동물은 다음 7일 동안 회복하였다. 실험 하루 전에, 동물은 측정 장치(냉각 판)에 적응시켰고, 투여 전 발 움츠림 임계값을 기록하였다(0시간). 동물은 6군으로 재편성하였다. 다음날, 동물들은 동종형 대조군 항체(1000 ㎍/㎏/10 ㎖) 또는 항체 GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P(10, 100 & 1000 ㎍/㎏/10 ㎖)의 다른 용량의 단일 복강내 주사 주입하여 처리하였다. 프리가발린(30 ㎎/㎏/10 ㎖, 구강내 주입) 또는 식염수는 7일 후 투여기간 동안 하루에 한번 투여하였다. 투여 후 판독은 매일 투여 후 7일 후 4시간, 24시간 기록하였다. 투여 후 판독은 프리가발린 및 식염수 투여한 모든 날 1시간 후 기록하였다. 투여 후 판독은 기계적 통각과민의 첫번째와 차가운 이질통의 5분 후 기록하였다. 기계적 통각과민은 동적 발바닥 촉각계(dynamic plantar aesthesiometer)를 사용하여 발 움츠림 사용을 유도하여 임계력(g)을 측정하였다(Plantar Von Frey instrument; Ugo Basile Srl, 이태리). 차가운 이질통은 초에서 냉각판에서 발 움츠림에 걸리는 시간으로 측정하였다(IITC Life Science Inc., 미국).
결과
CCI 수술 7일 후, 마우스는 기계적 통각과민(도 7A) 및 차가운 이질통(도 7B)을 나타내고, 각각 자신의 발 움츠림 임계값과 발 움츠림 반응 시간의 급격한 감소로 나타내었다. 항체 GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P의 모든 용량은 기계적 통각과민의 반전을 주었고, 발 움츠림 반응이 증가된 것과 같이, 발 움츠림 임계값(도 7A) 및 차가운 이질통(도 7B)의 증가를 나타내었다. 이 반전의 범위와 기간은 모두 판독된 1 ㎎/㎏(1000 ㎍/㎏)의 고용량의 프리가발린에 비해 명확한 농도에 따라 나타났다. 1 ㎎/㎏의 항체 GBR VH5(K3Q,V37A)VL1 IGHG4 S228P의 용량은 단일 용량으로 투여되었을 때, 30 ㎎/㎏의 프리가발린의 다중 용량에 비해 효과적이며, 항-TrkA 항체는 프리가발린의 표준 치료에 비해 낮은 투여량 및 낮은 용량 빈도수로 투여될 수 있음을 다시 보여준다.
<110> Glenmark Pharmaceuticals S.A. <120> ANTI-TRKA ANTIBODIES WITH ENHANCED INHIBITORY PROPERTIES AND DERIVATIVES THEREOF <130> 2014FPI-12-005 <150> US 61/657,184 <151> 2012-06-08 <150> WO 2013/183032 A2 <151> 2013-07-06 <160> 116 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1 domain <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Lys Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Ala Met Tyr Gly Asn Asp Phe Phe Tyr Pro Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH2 domain <400> 2 Glu Val 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ccaggtgtcc ctgacctgtc tggtgaaggg cttctacccc 1140 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac ggccagcccg agaacaacta caagaccacc 1200 ccccctgtgc tggacagcga cggcagcttc ttcctgtaca gcaagctgac cgtggacaag 1260 agccggtggc agcagggcaa cgtgttcagc tgctccgtga tgcacgaggc cctgcacaac 1320 cactacaccc agaagagcct gagcctgtcc cccggcaag 1359 <210> 101 <211> 1359 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GBR VH5(P60A,T62S) heavy chain IGHG1 cDNA <400> 101 gaagtgaaac tgctggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggaag cctgagactg 60 agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc acctacacca tgagctgggt ccgacagacc 120 cccggcaagc ggctggaatg ggtggcctac atcagcaagg gcggaggcag cacctactac 180 gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaggcgct 300 atgtacggca acgacttctt ctaccctatg gactactggg gccagggcac caccgtgacc 360 gtgtctagcg cgtcgaccaa gggccccagc gtgttcccgc tagcccccag cagcaagagc 420 accagcggcg gcacagccgc cctgggctgc ctggtgaagg actacttccc cgagcccgtg 480 accgtgtcct 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cgagcccgtg 480 accgtgtcct ggaactctgg agccctgacc tccggcgtgc acaccttccc cgccgtgctc 540 cagagcagcg gcctgtacag cctgagcagc gtggtgacag tgcccagcag cagcctggga 600 acccagacct acatctgcaa cgtgaaccac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaag 660 gtggagccca agagctgcga caagacccac acctgccccc cctgccctgc ccctgagctg 720 ctgggcggac cctccgtgtt cctgttcccc cccaagccca aggacaccct gatgatcagc 780 cggacccccg aggtgacctg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaggaccc tgaggtgaag 840 ttcaattggt acgtggacgg cgtggaggtg cacaacgcca agaccaagcc ccgggaggaa 900 cagtacaaca gcacctaccg ggtggtgtcc gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg 960 aacggcaagg aatacaagtg caaggtctcc aacaaggccc tgcctgcccc catcgaaaag 1020 accatcagca aggccaaggg ccagcccagg gagccccagg tgtacaccct gcccccctcc 1080 cgggacgagc tgaccaagaa ccaggtgtcc ctgacctgtc tggtgaaggg cttctacccc 1140 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac ggccagcccg agaacaacta caagaccacc 1200 ccccctgtgc tggacagcga cggcagcttc ttcctgtaca gcaagctgac cgtggacaag 1260 agccggtggc agcagggcaa cgtgttcagc tgctccgtga tgcacgaggc cctgcacaac 1320 cactacaccc agaagagcct gagcctgtcc cccggcaag 1359 <210> 113 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL1 variable domain cDNA <400> 113 gagatcgtgc tgacccagag ccccgccacc ctgtctctga gccctggcga gagagccacc 60 ctgagctgta gcgcctccag cagcgtgtcc tacatgcact ggtatcagca gaagcccggc 120 caggccccca gactgctgat ctacaccacc agcaacctgg ccagcggcat ccccgccaga 180 ttttctggca gcggcagcgg caccgacttc accctgacca tcagcagcct ggaacccgag 240 gatttcgccg tgtattattg ccaccagtgg tccagctacc cctggacctt cggccagggg 300 accaagctgg aaatcaag 318 <210> 114 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL3 variable domain cDNA <400> 114 cagatcgtgc tgacccagag ccccgccacc ctgagcctga gcccaggcga gagggccacc 60 ctgtcctgca gcgccagcag cagcgtgagc tacatgcact ggtaccagca gaagcccggc 120 cagagcccaa gactgctgat ctacaccacc tccaacctgg ccagcggcat ccccagcagg 180 ttcagcggca gcggctccgg caccttctac accctgacca tcagcagcct ggaacccgag 240 gacttcgccg tgtactactg ccaccagtgg agcagctacc cctggacctt cggcggcggg 300 accaagctgg aaatcaag 318 <210> 115 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BXhVL1 light chain cDNA <400> 115 gagatcgtgc tgacccagag ccccgccacc ctgtctctga gccctggcga gagagccacc 60 ctgagctgta gcgcctccag cagcgtgtcc tacatgcact ggtatcagca gaagcccggc 120 caggccccca gactgctgat ctacaccacc agcaacctgg ccagcggcat ccccgccaga 180 ttttctggca gcggcagcgg caccgacttc accctgacca tcagcagcct ggaacccgag 240 gatttcgccg tgtattattg ccaccagtgg tccagctacc cctggacctt cggccagggg 300 accaagctgg aaatcaagcg tacggtggcc gctcccagcg tgttcatctt cccccccagc 360 gacgagcagc tgaagagcgg caccgcctcc gtggtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc 420 cgggaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctcc agagcggcaa cagccaggaa 480 agcgtcaccg agcaggacag caaggactcc acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg 540 agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aggtgaccca ccagggcctg 600 tccagccccg tgaccaagag cttcaaccgg ggcgagtgc 639 <210> 116 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BXhVL3 light chain cDNA <400> 116 cagatcgtgc tgacccagag ccccgccacc ctgagcctga gcccaggcga gagggccacc 60 ctgtcctgca gcgccagcag cagcgtgagc tacatgcact ggtaccagca gaagcccggc 120 cagagcccaa gactgctgat ctacaccacc tccaacctgg ccagcggcat ccccagcagg 180 ttcagcggca gcggctccgg caccttctac accctgacca tcagcagcct ggaacccgag 240 gacttcgccg tgtactactg ccaccagtgg agcagctacc cctggacctt cggcggcggg 300 accaagctgg aaatcaagcg tacggtggcc gctcccagcg tgttcatctt cccccccagc 360 gacgagcagc tgaagagcgg caccgcctcc gtggtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc 420 cgggaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctcc agagcggcaa cagccaggaa 480 agcgtcaccg agcaggacag caaggactcc acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg 540 agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aggtgaccca ccagggcctg 600 tccagccccg tgaccaagag cttcaaccgg ggcgagtgc 639

Claims (56)

  1. 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편:
    a) SEQ ID NOs: 1-5로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인(domain), 및
    b) SEQ ID NOs: 6-13으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인,
    중쇄 가변 도메인의 CDR2는 적어도 하나의 아미노산 치환(substitution)을 포함하고, 및/또는 중쇄 가변 도메인의 비-CDR 부위는 37, 42 및 89로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 위치의 아미노산 치환을 포함하며, 각 그룹 멤버의 아미노산 위치는 케벳(Kabat)에 설정된 번호붙이기(numbering) 시스템(system)을 이용하여 표시된다.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인의 CDR2는 SEQ ID NO: 15의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인은 SEQ ID NOs: 1, 3 및 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 SEQ ID NOs: 6 및 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6의 서열을 포함하는 또는 SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 8의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인의 CDR2의 아미노산 치환은 50, 60 및 62로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 각 군 구성원(member)의 아미노산 위치는 케벳 번호(Kabat numbering)에 따라 나타내어지는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인의 CDR2의 아미노산 치환은 Y50A, P60A 및 T62S로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함하지않고, 여기서 각 군 구성원의 아미노산 위치는 케벳 번호 따라 나타내어지는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인의 비-CDR2의 아미노산 치환은 V37A, G42E 및 V89L로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 각 군 구성원의 아미노산 위치는 케벳 번호에 따라 나타내어지는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인의 비-CDR2의 아미노산 치환은 V37A를 포함하고, 여기서 각 군 구성원의 아미노산 위치는 케벳 번호에 따라 나타내어지는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 6의 서열을 포함하는 또는 SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 8의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 조합을 포함하고, 상기 중쇄 가변 도메인의 비-CDR 부위의 아미노산 치환은 V37A, T40A, G42E, R44G, A49S 및 V89L로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 각 군 구성원의 아미노산 위치는 케벳 번호에 따라 나타내어지는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  12. 제 6항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인의 비-CDR 부위의 아미노산 치환은 K3Q, V37A, G42E, A49S, V89L 및 R94K로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 각 군 구성원의 아미노산 위치는 케벳 번호에 따라 나타내어지는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  13. 제 6항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인의 비-CDR 부위의 아미노산 치환은 K3Q 및 V37A 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 각 군 구성원의 아미노산 위치는 케벳 번호에 따라 나타내어지는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  14. 제 6항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인의 비-CDR 부위의 아미노산 치환은 V37A 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 각 군 구성원의 아미노산 위치는 케벳 번호에 따라 나타내어지는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  15. 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편:
    a) SEQ ID NOs: 31-49로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인, 및
    b) SEQ ID NOs: 6-13으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 항체는
    a) SEQ ID NOs: 32 및 36으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인, 및
    b) SEQ ID NOs: 6의 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적으로 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  18. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적으로 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역 및 힌지 영역을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역 및 힌지 영역은 인간 IGHG1 동종형 또는 인간 IGHG4 동종형인 것을 특징으로 하는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  19. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적으로 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역 및 힌지 영역을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역 및 힌지 영역은 인간 IGHG4 동종형이며, 상기 아미노산 위치는 EU 번호에 따라 나타내어지는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  20. 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편:
    a) SEQ ID NOs: 50 내지 70으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 중쇄, 및
    b) SEQ ID NOs: 29 및 30으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 경쇄.
  21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 전체 길이 항체인 것을 특징으로 하는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  22. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 Fab, Fab', Fab'-SH, Fd, Fv, dAb, F(ab')2, scFv, 이특이성(bispecific) 단쇄(single chain) Fv 이량체, 디아체(diabodies), 트리아체(triabodies) 및 동일한 또한 다른 항체에 유전적으로 융합된 scFv로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  23. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 모 항체의 Fc 영역에 대하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하고, 항체는 모 항체와 비교하여 바뀐 효과기 기능을 보이는 변이체 Fc 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  24. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 TrkA의 기능적 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  25. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 TrkA의 하나 또는 그 이상의 생물학적 활성을 차단 또는 감소시키는 것을 특징으로 하는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  26. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 500 nM 또는 그 이하의 인간 TrkA에 결합하는 친화도(KD)인 것을 특징으로 하는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  27. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편은 모 마우스 항체에 해당하는 TF-1 세포 증식 분석에서 적어도 동등하거나 낮은 IC50을 갖는 것을 특징으로 하는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  28. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화된 항-TrkA 항체는 65℃ 보다 더 높은 FAB 단편 내열성 온도를 갖는 것을 특징으로 하는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 인간화된 항-TrkA 항체의 FAB 단편 내열성 온도는 모 마우스 항체의 FAB 단편 내열성 온도와 동등한 것을 특징으로 하는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편.
  30. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 따른 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 분리된 핵산.
  31. 제 30항에 있어서, SEQ ID NOs 73-116으로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  32. 제 30항 또는 제 31항에 따른 분리된 핵산을 포함하는 벡터.
  33. 제 30항 또는 31항에 따른 분리된 핵산 또는 제 32항에 따른 벡터를 포함하는 숙주세포(host cell).
  34. 제 33항에 따른 숙주세포를 배양하여 핵산이 발현되고, 항체가 생산되는 것을 포함하는 인간 TrkA에 결합하는 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편을 생산하는 방법.
  35. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 따른 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편의 고정된 형태(immobilised form).
  36. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 따른 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체(carrier)를 포함하는 조성물.
  37. 치료제에 결합된 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 따른 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역접합체(immunoconjugate).
  38. 제 37항에 따른 면역접합체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
  39. 제 36항 또는 제 38항에 있어서 다른 약학적 활성제를 추가적으로 포함하는 조성물.
  40. 제 39항에 있어서, 상기 다른 약학적 활성제는 하나 또는 그 이상을 포함하는 조성물:
    a) 진통제(analgestic agent)
    b) 다른 항-TrkA 항체
    c) NGF
    d) 항암제
    e) 항-NGF 항체.
  41. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항의 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편, 제 36항, 제 38항, 제 39항 또는 제 40항의 조성물, 또는 제 37항의 면역접합체의 약제로의 용도.
  42. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항의 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편, 제 36항, 제 38항, 제 39항 또는 제 40항의 조성물, 또는 제 37항의 면역접합체의 통증의 치료로의 용도.
  43. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항의 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편, 제 36항, 제 38항, 제 39항 또는 제 40항의 조성물, 또는 제 37항의 면역접합체의 만성 통증의 치료로의 용도.
  44. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항의 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편, 제 36항, 제 38항, 제 39항 또는 제 40항의 조성물, 또는 제 37항의 면역접합체의 급성 통증의 치료로의 용도.
  45. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항의 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편, 제 36항, 제 38항, 제 39항 또는 제 40항의 조성물, 또는 제 37항의 면역접합체의 하기의 하나 또는 그 이상과 연관된 통증의 치료로의 용도: 염증성 통증(inflammatory pain), 수술 후 통증(post-surgical pain), 수술 후 통증(post-operative pain)(치과 통증(dental pain) 포함), 신경병증성 통증(neuropathic pain), 말초신경병증(peripheral neuropathy), 당뇨성 신경병증(diabetic neuropathy), 당뇨성 신장질환(diabetic nephropathy), 골절 통증(fracture pain), 통풍 관절 통증(gout joint pain), 대상포진 후 신경통(post-herpetic neuralgia), 암 통증(cancer pain), 골관절염(osteoarthritis) 또는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 통증, 좌골신경통(sciatica), 겸상적혈구 위기와 관련된 통증(pains associated with sickle cell crises), 두통(headaches)(예를 들어, 편두통(migraines), 긴장성 두통(tension headache), 군발 두통(cluster headache)), 월경통(dysmenorrhea), 자궁내막증(endometriosis), 자궁유 섬유종(uterine fibroids), 근골격통증(musculoskeletal pain), 만성 허리 통증(chronic low back pain), 섬유근육통(fibromyalgia), 염좌(sprains), 내장 통증(visceral pain), 난소 낭종(ovarian cysts), 전립선염(prostatitis), 만성 골반 통증 증후군(chronic pelvic pain syndrome), 방광염(cystitis), 간질성 방광염(interstitial cystitis), 통증성 방광 증후군(painful bladder syndrome) 및/또는 방광 통증 증후군(bladder pain syndrome), 만성 무균성 전립선염과 관련된 통증(pain associated with chronic abacterial prostatitis), 절개 통증(incisional pain), 편두통(migraine), 3차 신경병증(trigeminal neuralgia), 화상(burns) 및/또는 상처(wounds)로부터의 통증, 외상(trauma)과 관련된 통증, 근골격계 질환(musculoskeletal diseases)과 관련된 통증, 강직성 척추염(ankylosing spondilitis), 관절주위 병변(periarticular pathologies), 골 전이(bone metastases)로부터의 통증, 인간면역결핍바이러스(HIV)로부터의 통증, 피부홍통증(erythromelalgia) 또는 췌장염(pancreatitis) 또는 신장결석(kidney stones)에 의해 발생하는 통증, 악성 흑색종(malignant melanoma), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 천식(asthma), (예를 들어, 심각한 기도과민반응성(severe airway hyper-responsiveness)으로 조절되지않는 천식(uncontrolled asthma)), 다루기힘든 기침(intractable cough), 탈수초 질환(demyelinating diseases), 만성 알코올중독(chronic alcoholism), 뇌졸중(stroke), 시상 통증 증후군(thalamic pain syndrome), 독소(toxins)로부터 통증, 화학요법(chemotherapy)으로부터 통증, 염증성 장 질환(inflammatory bowel disorders), 과민성 장 증후군(irritable bowel syndrome), 염증성 눈 질환(inflammatory eye disorders), 염증성 또는 불안정한(unstable) 방광 질환(bladder disorders), 건선(psoriasis), 염증성 요소에 의한 피부 통증(skin complaints), 일광화상(sunburn), 심장염(carditis), 피부염(dermatitis), 근염(myositis), 신경염(neuritis), 교원 혈관 질환(collagen vascular diseases), 만성 염증성 증상(chronic inflammatory conditions), 염증성 통증과 관련된 통각과민(hyperalgesia) 및 이질통(allodynia), 신경병증성 통증과 관련된 통각과민 및 이질통, 당뇨성 신경병증성 통증(diabetic neuropathy pain), 작열통(causalgia), 교감신경이 관여하는 통증(sympathetically maintained pain), 구심로차단 증후군(deafferentation syndromes), 상피 조직 손상(epithelial tissue damage) 또는 기능장애(dysfunction), 호흡기에서 내장고유리듬의 장애(disturbances of visceral motility at respiratory), 비뇨생식기(genitourinary), 위장(gastrointestinal) 또는 혈관 영역(vascular regions), 알레르기성 피부 반응(allergic skin reactions), 소양증(pruritis), 백반증(vitiligo), 일반적인 위장 장애(gastrointestinal disorders), 대장염(colitis), 위 궤양(gastric ulceration), 십이지장 궤양(duodenal ulcers), 혈관운동(vasomotor) 또는 알레르기성 비염(allergic rhinitis), 기관지 질환(bronchial disorders), 소화불량(dyspepsia), 위식도 역류(gastroesophageal reflux), 췌장염, 장기통(visceralgia) 및 뼈의 섬유이형성증(fibrous dysplasia, FD).
  46. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항의 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편, 제 36항, 제 38항, 제 39항 또는 제 40항의 조성물, 또는 제 37항의 면역접합체의 하기의 하나 또는 그 이상과 연관된 통증의 치료로의 용도: 췌장염, 신장결석, 자궁내막증, IBD, 크론병(Crohn's disease), 수술 후 유착(post surgical adhesions), 담낭 결석(gall bladder stones), 두통, 월경통, 근골격계 통증(musculoskeletal pain), 염좌(sprains), 내장 통증(visceral pain), 난소 낭종, 전립선염, 방광염, 간질성 방광염, 수술 후 통증, 편두통, 3차 신경병증, 화상 및/또는 상처로부터의 통증, 외상과 관련된 통증, 신경병증성 통증, 근골격계 질환과 관련된 통증, 류마티스성 관절염, 골관절염, 강직성 척추염, 관절주위 병변, 종양성 통증(oncological pain), 골 전이로부터의 통증, HIV 감염(infection).
  47. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항의 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편, 제 36항, 제 38항, 제 39항 또는 제 40항의 조성물, 또는 제 37항의 면역접합체의 암, 신경 질환, 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 당뇨병(diabetes mellitus), 당뇨병성 신장질환(diabetic nephropathy), 바이러스성 질환(viral disorder), HIV 매개 질환, 한센병(leprosy) 또는 염증성 질환의 치료 치료로의 용도.
  48. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항의 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편, 제 36항, 제 38항, 제 39항 또는 제 40항의 조성물, 또는 제 37항의 면역접합체의 상기 통각과민은 NSAID와 같이 동일한 범위로 유의적으로 반전되는 급성 염증성 통증의 치료로의 용도.
  49. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항의 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편, 제 36항, 제 38항, 제 39항 또는 제 40항의 조성물, 또는 제 37항의 면역접합체의 상기 통각과민은 NSAID와 같이 동일한 범위로 유의적으로 반전되는 만성 염증성 통증의 치료로의 용도.
  50. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항의 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편, 제 36항, 제 38항, 제 39항 또는 제 40항의 조성물, 또는 제 37항의 면역접합체의 상기 통각과민은 프리가발린(pregabalin) 및 아편(opiate)과 같이 동일한 범위로 유의적으로 반전되는 골관절염성 통증의 치료로의 용도.
  51. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항의 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편, 제 36항, 제 38항, 제 39항 또는 제 40항의 조성물, 또는 제 37항의 면역접합체의 상기 통각과민 및 이질통은 프리가발린 같이 동일한 범위로 유의적으로 반전되는 신경병증성 통증의 치료로의 용도.
  52. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항의 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편, 제 36항, 제 38항, 제 39항 또는 제 40항의 조성물, 또는 제 37항의 면역접합체의 진단 또는 예후로의 용도.
  53. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항의 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편, 제 36항, 제 38항, 제 39항 또는 제 40항의 조성물, 또는 제 37항의 면역접합체의 TrkA의 비정상적인 발현 또는 TrkA 관련된 비정상적인 활성을 포함하는 증상의 진단 또는 예후로의 용도.
  54. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항의 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편, 제 36항, 제 38항, 제 39항 또는 제 40항의 조성물, 또는 제 37항의 면역접합체의 제 41항 내지 제 47항에 개시된 질환 또는 장애의 어느 것의 진단 또는 예후로의 용도.
  55. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항의 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편, 제 36항, 제 38항, 제 39항 또는 제 40항의 조성물, 또는 제 37항의 면역접합체를 포함하는 제조물품.
  56. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항의 인간화된 항-TrkA 항체 또는 이의 단편, 제 36항, 제 38항, 제 39항 또는 제 40항의 조성물, 또는 제 37항의 면역접합체를 포함하는 키트.



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