KR20210013708A - 항-ox40 항체 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 OX40 (ACT35, CD134 또는 TNFRSF4)에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편, 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물, 및 암과 같은 질환을 치료하기 위한 상기 항체 또는 조성물의 용도를 제공한다. 특히, 본 발명의 항-OX40 항체는 OX40-리간드가 그 수용체에 결합하는 것을 방해하지 않는다.

Description

항-OX40 항체 및 사용 방법
본원에는 인간 OX40에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체를 포함하는 조성물, 및 암 치료를 위한 사용 방법이 개시된다.
OX40 (ACT35, CD134 또는 TNFRSF4로도 알려짐)은 대략 50KD의 I형 막 횡단 당 단백질(type I transmembrane glycoprotein)이며, 종양 괴사 인자 수용체 수퍼 패밀리 (tumor necrosis factor receptor super family, TNFRSF)의 멤버이다 (Croft, 2010; Gough and Weinberg, 2009). 성숙한 인간 OX40은 37 개의 AA 세포질 꼬리(cytoplasmic tail)와 185 개의 AA 세포 외 영역(extracellular region)을 가진 249 개의 아미노산 (AA) 잔기로 구성된다. OX40의 세포 외 도메인은 3 개의 완전 및 1 개의 불완전 시스테인 풍부한 도메인 (CRD)을 함유한다. OX40의 세포 내 도메인은 TRAF2, TRAF3 및 TRAF5를 포함한 여러 TNFR 관련 인자 (TNFR-associated factors, TRAF)에 대한 결합을 매개하여 OX40이 세포 내 키나제(intracellular kinases)에 연결되도록 하는 하나의 보존된 신호 관련 QEE 모티프를 함유한다 (Arch and Thompson, 1998; Willoughby et al., 2017).
OX40은 초기에 활성화된 랫트 CD4+ T 세포에서 발견되었고, 마우스와 인간 동족체(homologues)는 이후 T 세포로부터 클로닝되었다 (al-Shamkhani et al., 1996; Calderhead et al., 1993). T 헬퍼 (Th) 1 세포, Th2 세포, Th17 세포 및 조절 T (Treg) 세포를 포함한 활성된 CD4+ T 세포에서의 발현에 추가하여, OX40 발현은 활성화된 CD8+ T 세포, 자연 살해 (NK) T 세포, 호중구(neutrophils) 및 NK 세포의 표면에서도 발견되었다 (Croft, 2010). 대조적으로, 낮은 OX40 발현은 나이브 CD4+ 및 CD8+ T 세포 뿐만 아니라 대부분의 휴지 기억 T 세포(resting memory T cells)에서 발견된다 (Croft, 2010; Soroosh et al., 2007). 나이브 T 세포에서 OX40의 표면 발현은 일시적이다. TCR 활성화 후, T 세포 상의 OX40 발현은 24 시간 이내에 크게 증가하고, 2 ~ 3 일에 최대치가 된 후, 5 ~ 6 일 동안 지속된다 (Gramaglia et al., 1998).
OX40에 대한 리간드 (OX40L, gp34, CD252 또는 TNFSF4로도 알려짐)는 OX40에 대한 유일한 리간드이다. 다른 TNFSF (종양 괴사 인자 수퍼 패밀리 (tumor necrosis factor superfamily)) 멤버와 유사하게, OX40L은 23 개의 AA 세포 내 도메인과 133 개의 AA 세포 외 도메인을 가지는 183AA를 포함하는 II 형 당 단백질(type II glycoprotein)이다 (Croft, 2010; Gough and Weinberg, 2009). OX40L은 자연적으로 세포 표면에 동종 삼량체 복합체(homomeric trimer complex)를 형성한다. 리간드 삼량체는 주로 수용체의 CRD1, CRD2 및 일부 CRD3 영역을 통해 리간드 단량체-단량체 인터페이스에서 OX40의 3개 카피와 상호작용하지만 CRD4는 관여하지 않는다 (Compaan and Hymowitz, 2006). OX40L은 활성화된 B 세포 (Stuber et al., 1995), 성숙한 기존 수지상 세포 (DC) (Ohshima et al., 1997), 형질세포형 DC (plasmacytoid DC, pDC) (Ito et al., 2004), 대식세포 (Weinberg et al., 1999) 및 Langerhans 세포 (Sato et al., 2002)를 포함하여, 주로 활성화된 항원 제시 세포 (APC)에서 발현된다. 또한, OX40L은 NK 세포, 비만 세포, 활성화 된 T 세포의 서브 세트, 혈관 내피 세포 및 평활근 세포와 같은 다른 세포 유형에서 발현되는 것으로 밝혀졌다 (Croft, 2010; Croft et al., 2009).
삼량체 OX40L에 의한 결찰(ligation)을 통한 OX40 삼량체화(trimerization) 또는 항진성 항체(agonistic antibodies)에 의한 이량체화(dimerization)는 어댑터 분자인 TRAF2, TRAF3 및/또는 TRAF5의 세포 내 QEE 모티프에 대한 모집 (recruitment) 및 도킹(docking)에 기여한다 (Arch and Thompson, 1998; Willoughby et al., 2017). TRAF2 및 TRAF3의 모집 및 도킹은 T 세포의 생존, 분화, 확장(expansion), 사이토카인 생산 및 이펙터 기능을 조절하는데 중요한 역할을 하는 표준(canonical) NF-κB1 및 비표준(non-canonical) NF-κB2 경로 모두의 활성화로 이어질 수 있다 (Croft, 2010; Gramaglia et al., 1998; Huddleston et al., 2006; Rogers et al., 2001; Ruby and Weinberg, 2009; Song et al., 2005a; Song et al., 2005b; Song et al., 2008).
정상 조직에서, OX40 발현은 낮으며 주로 림프 기관의 림프구에서 나타난다 (Durkop et al., 1995). 그러나 면역 세포 상에서 OX40 발현의 상향 조절은 자가 면역 질환 (Carboni et al., 2003; Jacquemin et al., 2015; Szypowska et al., 2014) 및 암 (Kjaergaard et al., 2000; Vetto et al., 1997; Weinberg et al., 2000 같은 병리학적 상태를 가지는 동물 모델과 인간 환자 모두에서 자주 관찰되어 왔다 (Redmond and Weinberg, 2007). 특히, OX40의 증가된 발현은 결장 직장암 및 피부 흑색종 환자에서 더 긴 생존과 관련이 있으며, 원거리 전이 및 더 진행된 종양 특징의 발생과 역상관 관계가 있다 (Ladanyi et al., 2004; Petty et al., 2002; Sarff et al., 2008). 또한 항-OX40 항체 치료가 다양한 마우스 모델에서 항 종양 효능을 이끌어 낼 수 있음이 밝혀졌으며 (Aspeslagh et al., 2016), 이는 면역 치료 표적으로서 OX40의 잠재력을 나타낸다. Curti 등이 항진성(agonistic) 항 OX40 단일 클론 항체로 수행한 암 환자를 대상으로 진행한 첫 번째 임상 시험에서 항 종양 효능 및 종양 특이적 T 세포의 활성화에 대한 증거가 관찰되었고, 이는 OX40 항체가 항 종양 T-세포 반응을 촉진하는데 유용함을 나타낸다 (Curti et al., 2013).
항-종양 효능을 매개하는 항진성 항-OX40 항체의 작용 기전은 주로 마우스 종양 모델에서 연구되었다 (Weinberg et al., 2000). 최근까지 종양에서 항진성 항 -OX40 항체의 작용 기전은 Treg 세포의 분화 및 기능에 대한 억제 효과 뿐만 아니라 이펙터 T 세포에서 공동 자극 신호 전달 경로를 유발하는 능력에 기인하였다 (Aspeslagh et al ., 2016; Ito et al., 2006; St Rose et al., 2013; Voo et al., 2013). 최근 연구에 따르면 동물 종양 모델과 암 환자 모두에서 종양 침윤 Tregs는 이펙터 T 세포 (CD4+ 및 CD8+ 모두) 및 말초 Tregs 보다 더 높은 수준의 OX40을 발현하는 것으로 나타났다 (Lai et al., 2016; Marabelle et al., 2013b; Montler et al., 2016; Soroosh et al., 2007; Timperi et al., 2016). 따라서 항-OX40 항체가 항 종양 반응을 유발하는 2 차 효과는 항체 의존성 세포 독성 (antibody-dependent cytotoxicity, ADCC) 및/또는 항체 의존성 세포 식세포 작용 (antibody-dependent cellular phagocytosis, ADCP)을 통해 종양 내 OX40+ Treg 세포를 고갈시키는데 있어서 Fc 매개 이펙터 기능에 의존한다 (Aspeslagh et al., 2016; Bulliard et al., 2014; Marabelle et al., 2013a; Marabelle et al., 2013b; Smyth et al., 2014). 이 연구는 Fc 매개 이펙터 기능을 갖는 항진성 항-OX40 항체가 종양 내 Treg를 우선적으로 고갈시키고 종양 미세 환경 (tumor microenvironment, TME)에서 CD8+ 이펙터 T 세포 대 Tregs의 비율을 개선 할 수 있고, 그 결과 항 종양 면역 반응을 개선하고 종양 퇴행을 증가시키며 생존율을 개선할 수 있음을 입증한다 (Bulliard et al., 2014; Carboni et al., 2003; Jacquemin et al., 2015; Marabelle et al., 2013b). 이러한 발견에 기초하여, 항진 활성과 Fc 매개 이펙터 기능을 모두 갖는 항진성 항-OX40 항체를 개발하기 위한 충족되지 않은 의학적 니즈가 있다.
현재까지 임상에서 항-OX40 항진 항체는 대부분 OX40-OX40L 상호작용을 차단하는 리간드-경쟁 항체이다 (예 : WO2016196228A1). OX40-OX40L 상호작용은 효과적인 항 종양 면역 강화에 필수적이기 때문에 OX40-OX40L의 차단은 이러한 리간드-경쟁 항체의 효능을 제한한다. 따라서, OX40L과 상호작용하는 OX40을 방해하지 않으면서 OX40에 특이적으로 결합하는 OX40 항진 항체(OX40 agonist antibodies)는 암 및 자가 면역 질환 치료에 유용하다.
al-Shamkhani, A., Birkeland, M.L., Puklavec, M., Brown, M.H., James, W., and Barclay, A.N. (1996). OX40 is differentially expressed on activated rat and mouse T cells and is the sole receptor for the OX40 ligand. European journal of immunology 26, 1695-1699. An Z,　Forrest G,　Moore R,　Cukan M,　Haytko P,　Huang L,　Vitelli S,　Zhao JZ,　Lu P,　Hua J,　Gibson CR,　Harvey BR,　Montgomery D,　Zaller D,　Wang F,　Strohl W. (2009). IgG2m4, an　engineered　antibody　isotype　with　reduced　Fc　function. MAbs. 1,572-579. Arch, R.H., and Thompson, C.B. (1998). 4-1BB and Ox40 are members of a tumor necrosis factor (TNF)-nerve growth factor receptor subfamily that bind TNF receptor-associated factors and activate nuclear factor kappaB. Molecular and cellular biology 18, 558-565. Aspeslagh, S., Postel-Vinay, S., Rusakiewicz, S., Soria, J.C., Zitvogel, L., and Marabelle, A. (2016). Rationale for anti-OX40 cancer immunotherapy. Eur J Cancer 52, 50-66. Bulliard, Y., Jolicoeur, R., Zhang, J., Dranoff, G., Wilson, N.S., and Brogdon, J.L. (2014). OX40 engagement depletes intratumoral Tregs via activating FcgammaRs, leading to antitumor efficacy. Immunology and cell biology 92, 475-480. Calderhead, D.M., Buhlmann, J.E., van den Eertwegh, A.J., Claassen, E., Noelle, R.J., and Fell, H.P. (1993). Cloning of mouse Ox40: a T cell activation marker that may mediate T-B cell interactions. J Immunol 151, 5261-5271. Carboni, S., Aboul-Enein, F., Waltzinger, C., Killeen, N., Lassmann, H., and Pena-Rossi, C. (2003). CD134 plays a crucial role in the pathogenesis of EAE and is upregulated in the CNS of patients with multiple sclerosis. Journal of neuroimmunology 145, 1-11. Compaan, D.M., and Hymowitz, S.G. (2006). The crystal structure of the costimulatory OX40-OX40L complex. Structure 14, 1321-1330. Croft, M. (2010). Control of immunity by the TNFR-related molecule OX40 (CD134). Annual review of immunology 28, 57-78. Croft, M., So, T., Duan, W., and Soroosh, P. (2009). The significance of OX40 and OX40L to T-cell biology and immune disease. Immunological reviews 229, 173-191. Curti, B.D., Kovacsovics-Bankowski, M., Morris, N., Walker, E., Chisholm, L., Floyd, K., Walker, J., Gonzalez, I., Meeuwsen, T., Fox, B.A., et al. (2013). OX40 is a potent immune-stimulating target in late-stage cancer patients. Cancer research 73, 7189-7198. Durkop, H., Latza, U., Himmelreich, P., and Stein, H. (1995). Expression of the human OX40 (hOX40) antigen in normal and neoplastic tissues. British journal of haematology 91, 927-931. Gough, M.J., and Weinberg, A.D. (2009). OX40 (CD134) and OX40L. Advances in experimental medicine and biology 647, 94-107. Gramaglia, I., Weinberg, A.D., Lemon, M., and Croft, M. (1998). Ox-40 ligand: a potent costimulatory molecule for sustaining primary CD4 T cell responses. J Immunol 161, 6510-6517. Guo, Z., Cheng, D., Xia, Z., Luan, M., Wu, L., Wang, G., and Zhang, S. (2013). Combined TIM-3 blockade and CD137 activation affords the long-term protection in a murine model of ovarian cancer. Journal of translational medicine 11, 215. Hori, S., Nomura, T., and Sakaguchi, S. (2003). Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science 299, 1057-1061. Huddleston, C.A., Weinberg, A.D., and Parker, D.C. (2006). OX40 (CD134) engagement drives differentiation of CD4+ T cells to effector cells. European journal of immunology 36, 1093-1103. Ito, T., Amakawa, R., Inaba, M., Hori, T., Ota, M., Nakamura, K., Takebayashi, M., Miyaji, M., Yoshimura, T., Inaba, K., and Fukuhara, S. (2004). Plasmacytoid dendritic cells regulate Th cell responses through OX40 ligand and type I IFNs. J Immunol 172, 4253-4259. Ito, T., Wang, Y.H., Duramad, O., Hanabuchi, S., Perng, O.A., Gilliet, M., Qin, F.X., and Liu, Y.J. (2006). OX40 ligand shuts down IL-10-producing regulatory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103, 13138-13143. Jacquemin, C., Schmitt, N., Contin-Bordes, C., Liu, Y., Narayanan, P., Seneschal, J., Maurouard, T., Dougall, D., Davizon, E.S., Dumortier, H., et al. (2015). OX40 Ligand Contributes to Human Lupus Pathogenesis by Promoting T Follicular Helper Response. Immunity 42, 1159-1170. Kjaergaard, J., Tanaka, J., Kim, J.A., Rothchild, K., Weinberg, A., and Shu, S. (2000). Therapeutic efficacy of OX-40 receptor antibody depends on tumor immunogenicity and anatomic site of tumor growth. Cancer research 60, 5514-5521. Ladanyi, A., Somlai, B., Gilde, K., Fejos, Z., Gaudi, I., and Timar, J. (2004). T-cell activation marker expression on tumor-infiltrating lymphocytes as prognostic factor in cutaneous malignant melanoma. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 10, 521-530. Lai, C., August, S., Albibas, A., Behar, R., Cho, S.Y., Polak, M.E., Theaker, J., MacLeod, A.S., French, R.R., Glennie, M.J., et al. (2016). OX40+ Regulatory T Cells in Cutaneous Squamous Cell Carcinoma Suppress Effector T-Cell Responses and Associate with Metastatic Potential. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 22, 4236-4248. Marabelle, A., Kohrt, H., and Levy, R. (2013a). Intratumoral anti-CTLA-4 therapy: enhancing efficacy while avoiding toxicity. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 19, 5261-5263. Marabelle, A., Kohrt, H., Sagiv-Barfi, I., Ajami, B., Axtell, R.C., Zhou, G., Rajapaksa, R., Green, M.R., Torchia, J., Brody, J., et al. (2013b). Depleting tumor-specific Tregs at a single site eradicates disseminated tumors. The Journal of clinical investigation 123, 2447-2463. Montler, R., Bell, R.B., Thalhofer, C., Leidner, R., Feng, Z., Fox, B.A., Cheng, A.C., Bui, T.G., Tucker, C., Hoen, H., and Weinberg, A. (2016). OX40, PD-1 and CTLA-4 are selectively expressed on tumor-infiltrating T cells in head and neck cancer. Clinical & translational immunology 5, e70. Morris, N.P., Peters, C., Montler, R., Hu, H.M., Curti, B.D., Urba, W.J., and Weinberg, A.D. (2007). Development and characterization of recombinant human Fc:OX40L fusion protein linked via a coiled-coil trimerization domain. Molecular immunology 44, 3112-3121. Ohshima, Y., Tanaka, Y., Tozawa, H., Takahashi, Y., Maliszewski, C., and Delespesse, G. (1997). Expression and function of OX40 ligand on human dendritic cells. J Immunol 159, 3838-3848. Petty, J.K., He, K., Corless, C.L., Vetto, J.T., and Weinberg, A.D. (2002). Survival in human colorectal cancer correlates with expression of the T-cell costimulatory molecule OX-40 (CD134). American journal of surgery 183, 512-518. Redmond, W.L., and Weinberg, A.D. (2007). Targeting OX40 and OX40L for the treatment of autoimmunity and cancer. Critical reviews in immunology 27, 415-436. Rogers, P.R., Song, J., Gramaglia, I., Killeen, N., and Croft, M. (2001). OX40 promotes Bcl-xL and Bcl-2 expression and is essential for long-term survival of CD4 T cells. Immunity 15, 445-455. Ruby, C.E., and Weinberg, A.D. (2009). OX40-enhanced tumor rejection and effector T cell differentiation decreases with age. J Immunol 182, 1481-1489. Sarff, M., Edwards, D., Dhungel, B., Wegmann, K.W., Corless, C., Weinberg, A.D., and Vetto, J.T. (2008). OX40 (CD134) expression in sentinel lymph nodes correlates with prognostic features of primary melanomas. American journal of surgery 195, 621-625; discussion 625. Sato, T., Ishii, N., Murata, K., Kikuchi, K., Nakagawa, S., Ndhlovu, L.C., and Sugamura, K. (2002). Consequences of OX40-OX40 ligand interactions in langerhans cell function: enhanced contact hypersensitivity responses in OX40L-transgenic mice. European journal of immunology 32, 3326-3335. Smyth, M.J., Ngiow, S.F., and Teng, M.W. (2014). Targeting regulatory T cells in tumor immunotherapy. Immunology and cell biology 92, 473-474. Song, A., Tang, X., Harms, K.M., and Croft, M. (2005a). OX40 and Bcl-xL promote the persistence of CD8 T cells to recall tumor-associated antigen. J Immunol 175, 3534-3541. Song, J., So, T., Cheng, M., Tang, X., and Croft, M. (2005b). Sustained survivin expression from OX40 costimulatory signals drives T cell clonal expansion. Immunity 22, 621-631. Song, J., So, T., and Croft, M. (2008). Activation of NF-kappaB1 by OX40 contributes to antigen-driven T cell expansion and survival. J Immunol 180, 7240-7248. Soroosh, P., Ine, S., Sugamura, K., and Ishii, N. (2007). Differential requirements for OX40 signals on generation of effector and central memory CD4+ T cells. J Immunol 179, 5014-5023. St Rose, M.C., Taylor, R.A., Bandyopadhyay, S., Qui, H.Z., Hagymasi, A.T., Vella, A.T., and Adler, A.J. (2013). CD134/CD137 dual costimulation-elicited IFN-gamma maximizes effector T-cell function but limits Treg expansion. Immunology and cell biology 91, 173-183. Stuber, E., Neurath, M., Calderhead, D., Fell, H.P., and Strober, W. (1995). Cross-linking of OX40 ligand, a member of the TNF/NGF cytokine family, induces proliferation and differentiation in murine splenic B cells. Immunity 2, 507-521. Szypowska, A., Stelmaszczyk-Emmel, A., Demkow, U., and Luczynski, W. (2014). High expression of OX40 (CD134) and 4-1BB (CD137) molecules on CD4(+)CD25(high) cells in children with type 1 diabetes. Advances in medical sciences 59, 39-43. Timperi, E., Pacella, I., Schinzari, V., Focaccetti, C., Sacco, L., Farelli, F., Caronna, R., Del Bene, G., Longo, F., Ciardi, A., et al. (2016). Regulatory T cells with multiple suppressive and potentially pro-tumor activities accumulate in human colorectal cancer. Oncoimmunology 5, e1175800. Tourkova, I.L., Yurkovetsky, Z.R., Shurin, M.R., and Shurin, G.V. (2001). Mechanisms of dendritic cell-induced T cell proliferation in the primary MLR assay. Immunology letters 78, 75-82. Vetto, J.T., Lum, S., Morris, A., Sicotte, M., Davis, J., Lemon, M., and Weinberg, A. (1997). Presence of the T-cell activation marker OX-40 on tumor infiltrating lymphocytes and draining lymph node cells from patients with melanoma and head and neck cancers. American journal of surgery 174, 258-265. Voo, K.S., Bover, L., Harline, M.L., Vien, L.T., Facchinetti, V., Arima, K., Kwak, L.W., and Liu, Y.J. (2013). Antibodies targeting human OX40 expand effector T cells and block inducible and natural regulatory T cell function. J Immunol 191, 3641-3650. Weinberg, A.D., Rivera, M.M., Prell, R., Morris, A., Ramstad, T., Vetto, J.T., Urba, W.J., Alvord, G., Bunce, C., and Shields, J. (2000). Engagement of the OX-40 receptor in vivo enhances antitumor immunity. J Immunol 164, 2160-2169. Weinberg, A.D., Wegmann, K.W., Funatake, C., and Whitham, R.H. (1999). Blocking OX-40/OX-40 ligand interaction in vitro and in vivo leads to decreased T cell function and amelioration of experimental allergic encephalomyelitis. J Immunol 162, 1818-1826. Willoughby, J., Griffiths, J., Tews, I., and Cragg, M.S. (2017). OX40: Structure and function - What questions remain? Molecular immunology 83, 13-22. Zander, R.A., Obeng-Adjei, N., Guthmiller, J.J., Kulu, D.I., Li, J., Ongoiba, A., Traore, B., Crompton, P.D., and Butler, N.S. (2015). PD-1 Co-inhibitory and OX40 Co-stimulatory Crosstalk Regulates Helper T Cell Differentiation and Anti-Plasmodium Humoral Immunity. Cell host & microbe 17, 628-641. Zhang, T., Lemoi, B.A., and Sentman, C.L. (2005). Chimeric NK-receptor-bearing T cells mediate antitumor immunotherapy. Blood 106, 1544-1551.
본 발명은 OX40을 활성화하고 면역 세포에서 신호 전달을 유도하여 항 종양 면역을 촉진하는 항진성 항-OX40 항체(agonistic anti-OX40 antibodies) 및 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragments)에 관한 것이다.
일 양태(embodiment)에서, 본 발명은 인간 OX40에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일 관점(aspect)에서, 본 발명의 항체는 OX40L과 경쟁하지 않거나, OX40의 리간드 OX40L에 대한 결합을 방해하지 않는다.
본 발명은 다음의 양태들을 포함한다.
인간 OX40에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 : (i) (a) 서열번호 3의 HCDR (중쇄 상보성 결정 영역) 1, (b) 서열번호 24의 HCDR2, (c) 서열번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열번호 25의 LCDR (경쇄 상보성 결정 영역) 1, (e) 서열번호 19의 LCDR2, 및 (f) 서열번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; (ii) (a) 서열번호 3의 HCDR1, (b) 서열번호 18의 HCDR2, (c) 서열번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열번호 6의 LCDR1, (e) 서열번호 19의 LCDR2, 및 (f) 서열번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; (iii) (a) 서열번호 3의 HCDR1, (b) 서열번호 13의 HCDR2, (c) 서열번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열번호 6의 LCDR1, (e) 서열번호 7의 LCDR2, 및 (f) 서열번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 (iv) (a) 서열번호 3의 HCDR1, (b) 서열번호 4의 HCDR2, (c) 서열번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열번호 6의 LCDR1, (e) 서열번호 7의 LCDR2, 및 (f) 서열번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
청구항 1항의 항체 또는 항원 결합 단편은 다음을 포함한다 : (i) 서열번호 26과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열번호 28과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL); (ii) 서열번호 20과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열번호 22와 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL); (iii) 서열번호 14와 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열번호 16과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL); 또는 (iv) 서열번호 9와 적어도 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열번호 11과 적어도 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL).
서열번호 26, 28, 20, 22, 14, 16, 9, 및/또는 11 내에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산이 삽입, 결실 또는 치환되어 있는, 상기 항체 또는 항원 결합 단편.
(i) 서열번호 26을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열번호 28을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL); (ii) 서열번호 20을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL); (iii) 서열번호 14를 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열번호 16을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL); 또는 (iv) 서열번호 9를 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열번호 11을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는, 상기 항체 또는 항원 결합 단편.
상기 항체 또는 항원 결합 단편은 단일클론 항체(monoclonal antibody), 키메라 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 인간 조작된 항체(human engineered antibody), 단일 사슬 항체 (single chain antibody (scFv)), Fab 단편 (Fab fragment), Fab' 단편 (Fab' fragment), 또는 F(ab')2 단편 (F(ab')2 fragment))인, 상기 항체 또는 항원 결합 단편.
OX40 항진 (agonist) 활성을 갖는, 상기 항체 또는 항원 결합 단편.
인간 OX40의 H153 내지 D170으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에서 인간 OX40에 결합하는, 상기 항체 또는 항원 결합 단편.
인간 OX40의 H153, T154, I165, E167 및 D170으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에서 인간 OX40에 결합하는, 상기 항체 또는 항원 결합 단편.
인간 OX40의 H153, I165 및 E167로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에서 인간 OX40에 결합하는, 상기 항체 또는 항원 결합 단편. 인간 OX40의 H153, I165 및 E167로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에서 인간 OX40에 결합하는, 상기 항체 또는 항원 결합 단편.
서열번호 30에서 또는 그 내부에서 (at or within SEQ ID NO. 30) 인간 OX40에 결합하는, 상기 항체 또는 항원 결합 단편.
표면 플라즈몬 공명 (SPR)으로 측정했을 때 7.28 nM, 9.47 nM, 13.5 nM 또는 17.1 nM 이상의 평형 해리 상수 (equilibrium dissociation constant, KD)로 인간 OX40에 결합하는, 상기 항체 또는 항원 결합 단편.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 의존성 세포 독성 (antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 또는 보체 의존성 세포 독성 (complement dependent cytotoxicity, CDC)을 갖는, 항체 또는 항원 결합 단편.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 감소된 글리코실화 (reduced glycosylation)를 갖거나 글리코실화 되지 않거나 (no glycosylation) 또는 저푸코실화 (hypofucosylated) 되어 있는, 항체 또는 항원 결합 단편.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 증가된 이등분 GlcNac 구조 (bisecting GlcNac structure)를 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
상기 Fc 도메인은 IgG1인, 항체 또는 항원 결합 단편.
상기 Fc 도메인은 IgG4인, 항체 또는 항원 결합 단편.
상기 IgG4는 S228P 치환 (EU 넘버링 시스템에 따름)을 갖는, 항체 또는 항원-결합 단편.
상기 IgG4는 S228P 및 R409K 치환 (EU 넘버링 시스템에 따름)을 갖는, 항체 또는 항원-결합 단편.
다음 특성 중 하나 이상을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편:
(i) cyno OX40과 교차반응(cross-reacting) 할 수 있음;
(ii) OX40-OX40L 상호작용(interaction)을 방해하지 않음;
(iii) T 세포를 자극(stimulating T cells)할 수 있음, 특히 0.06 ng/ml 이상의 EC50에서 그러함;
(iv) CD4+ T-세포를 활성화(activating) 할 수 있음, 특히 혼합 림프구 반응 (mixed lymphocyte reaction, MLR) 분석에서 측정시에 그러함 ;
(v) ADCC를 매개(mediating) 할 수 있음, 특히 젖산 탈수소 효소 (LDH) 방출 기반 ADCC 분석(lactate dehydrogenase (LDH) release-based ADCC assay)에서 측정시에 그러함 ;
(vi) CD4+ Treg를 고갈시킬(depleting) 수 있음;
(vii) CD8+ Teff/Treg 비율을 증가시킬 수 있음; 또는
(viii) 동물 종양 모델에서 종양의 부분 퇴행 (partial regression)를 매개 할 수 있음.
상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고, 약제학적으로 허용되는 담체(carrier)를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
유효량의 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 이를 필요로하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
상기 암은, 이에 한정되지는 않으나, 유방암(breast cancer), 두경부암(head and neck cancer), 위암(gastric cancer), 신장암(kidney cancer), 간암(liver cancer), 소세포 폐암(small cell lung cancer,), 비소세포 폐암( non-small cell lung cancer), 난소암(ovarian cancer), 피부암(skin cancer), 중피종(mesothelioma), 림프종(lymphoma), 백혈병(leukemia), 골수종(myeloma) 및 육종 (sarcoma) 등을 포함하는 방법.
상기 항체 또는 상기 약학적 조성물이 다른 치료제와 병용(combination)하여 투여되는 방법.
상기 치료제는 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 파클리탁셀 제제(paclitaxel agent), 도세탁셀(docetaxel), 카보플라틴(carboplatin), 토포테칸(topotecan), 시스플라틴(cisplatin), 이리노테칸(irinotecan), 독소루비신( doxorubicin), 레날리도마이드(lenalidomide) 또는 5-아자시티딘(5-azacytidine) 인 방법.
상기 치료제가 파클리탁셀 제제, 레날리도마이드 또는 5-아자시티딘인 방법.
상기 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산.
상기 핵산을 포함하는 벡터.
상기 핵산을 포함하는 숙주 세포 (host cell).
상기 숙주 세포를 배양하는 단계 및 배양물로부터 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 공정(process).
유방암, 두경부암, 위암, 신장암, 간암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 난소 암, 피부암, 중피종, 림프종, 백혈병, 골수종 및 육종의 치료 또는 가능성(likelihood)의 감소에 사용하기 위한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
표지된 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 진단 시약(diagnostic reagent).
상기 표지(label)는 방사성 표지(radiolabel), 형광단( fluorophore), 발색단(chromophore), 영상화제(imaging agent) 및 금속 이온(metal ion)으로 구성된 군에서 선택되는 진단 시약.
일 양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 13, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 24 및 서열번호 25로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.
또 다른 양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 13, 서열번호 18, 서열번호 24 및 서열번호 5로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역 (HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 (b) 서열번호 6, 서열번호 25, 서열번호 7, 서열번호 19 및 서열번호 8로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역;을 포함한다.
또 다른 양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 HDCR1; 서열번호 4, 서열번호 13, 서열번호 18, 또는 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 HDCR2; 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 HDCR3;인 3개의 상보성 결정 영역 (HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 (b) 서열번호 6 또는 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1; 서열번호 7 또는 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을갖는 LCDR3;인 3개의 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 HDCR1; 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 HDCR2; 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 HDCR3; 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 HDCR1; 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 HDCR2; 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 HDCR3; 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 HDCR1; 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 HDCR2; 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 HDCR3; 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 HDCR1; 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 HDCR2; 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 HDCR3;인 3개의 상보성 결정 영역 (HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 (b) 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1; 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3; 또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1; 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3; 또는 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1; 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3;인 3개의 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 HDCR1, 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 HDCR2, 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 HDCR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 LCDR, 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 LCDR, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 HDCR1, 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 HDCR2, 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 HDCR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 HDCR1, 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 HDCR2, 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 HDCR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 LCDR, 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 LCDR, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 HDCR1, 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 HDCR2, 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 HDCR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 서열번호 9, 서열번호 14, 서열번호 20 또는 서열번호 26의 아미노산 서열을 가지거나, 서열번호 9, 서열번호 14, 서열번호 20 또는 서열번호 26 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역; 및/또는 (b) 서열번호 11, 서열번호 16, 서열번호 22 또는 서열번호 28의 아미노산 서열을 가지거나, 서열번호 11, 서열번호 16, 서열번호 22 또는 서열번호 28 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 서열번호 9, 서열번호 14, 서열번호 20 또는 서열번호 26의 아미노산 서열 또는 서열번호 9, 서열번호 14, 서열번호 20 또는 서열번호 26의 아미노산 서열에서 1개, 2개 또는 3개 아미노산의 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역; 및/또는 (b) 서열번호 11, 서열번호 16, 서열번호 22 또는 서열번호 28의 아미노산 서열 또는 서열번호 11, 서열번호 16, 서열번호 22 또는 서열번호 28의 아미노산 서열에서 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 아미노산의 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)이다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역; 또는
(b) 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역; 또는
(c) 서열번호 20의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역; 또는
(d) 서열번호 26의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역.
일 양태에서, 본 발명의 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형(isotype)이다. 보다 구체적인 양태에서, 본 발명의 항체는 야생형 인간 IgG1 (인간 IgG1wt 또는 huIgG1이라고도 함) 또는 IgG2의 Fc 도메인을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 (EU 넘버링 시스템에 따라) S228P 및/또는 R409K 치환을 갖는 인간 IgG4의 Fc 도메인을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명의 항체는 1 x 10-6 M 내지 1 x 10-10 M의 결합 친화도 (KD)로 OX40에 결합한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 약 1 x 10-6 M, 약 1 x 10-7 M, 약 1 x 10-8 M, 약 1 x 10-9 M 또는 약 1 x 10-10 M의 결합 친화도 (KD)로 OX40에 결합한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항-인간 OX40 항체는 사이노몰구스 OX40에 대한 종간 결합 활성(cross-species binding activity)을 나타낸다.
일 양태에서, 본 발명의 항-OX40 항체는 OX40-OX40L 상호작용 인터페이스 외부의 인간 OX40의 에피토프에 결합한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 항 -OX40 항체는 OX40에 결합하는 OX40 리간드와 경쟁하지 않는다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 항-OX40 항체는 OX40과 그의 리간드 OX40L 사이의 상호작용을 차단하지 않는다.
본 발명의 항체는 항진성이고(agonistic) 면역 반응을 현저히 향상시킨다. 본 발명은 항 -OX40 항체의 항진 능력(agonistic ability)을 시험하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명의 항체는 혼합 림프구 반응 (MLR) 분석에서 IL-2를 생성하도록 1차 T 세포(primary T cell)를 현저히 자극할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 항체는 강력한 Fc 매개 이펙터 기능(strong Fc-mediated effector functions)을 갖는다. 상기 항체는 NK 세포에 의한 조절 T 세포 (Treg 세포)와 같은 OX40Hi 표적 세포에 대한 항체 의존성 세포 세포 독성 (ADCC)을 매개한다. 일 관점에서, 본 발명은 상이한 OX40 발현 수준에 기초하여 특정 T-세포 서브 세트의 항-OX40 항체-매개 시험관 내 고갈(in vitro depletion)을 평가하는 방법을 제공한다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 OX40-OX40L 상호 작용을 차단하지 않는다. 또한 상기 OX40 항체는 동물 모델에서 볼 수 있듯이 생체 내에서 용량 의존적 항 종양 활성을 나타낸다. 상기 용량 의존적 활성은 OX40-OX40L 상호 작용을 차단하는 항-OX40 항체의 활성 프로파일과 차별화된다.
본 발명은 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 일 양태에서, 상기 단리된 핵산은 서열번호 10, 서열번호 15, 서열번호 21, 또는 서열번호 27의 VH 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 10, 서열번호 15, 서열번호 21, 또는 서열번호 27과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 본 발명의 항체의 VH 영역 또는 항원 결합 단편을 인코딩한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 상기 단리된 핵산은 서열번호 12, 서열번호 17, 서열번호 23, 또는 서열번호 29의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 12, 서열번호 17, 서열번호 23, 또는 서열번호 29과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 본 발명의 항체의 VL 영역 또는 항원 결합 단편을 인코딩한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 선택적으로 약제학상 허용되는 부형제(excipient)를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 OX40 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 OX40 항체 약제학적 조성물을 치료적 유효량으로 이를 필요로하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 양태에서 상기 항체 또는 항원 결합 단편에 의해 치료되는 질환은 암 또는 자가 면역 질환이다.
본 발명은 암 또는 자가 면역 질환과 같은 질환을 치료하기 위한 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 OX40 항체 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
도 1은 OX40-mIgG2a, OX40-huIgG1 및 OX40-His 구축물의 개략도이다. OX40 ECD: OX40 세포 외 도메인. N: N- 말단. C: C- 말단.
도 2는 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의한 정제된 키메라 (ch445) 및 인간화 (445-1, 445-2, 445-3 및 445-3 IgG4) 항-OX40 항체의 친화도 측정을 보여준다.
도 3은 유세포 분석에 의해 OX40 결합을 결정하는 것을 나타낸다. OX40-양성 HuT78/OX40 세포를 다양한 항-OX40 항체 (항체 ch445, 445-1, 445-2, 445-3 및 445-3 IgG4)와 함께 배양하고 FACS 분석을 실시하였다. 그 결과는 평균 형광 강도 (MFI, Y축)로 표시된다.
도 4는 유세포 분석에 의한 OX40 항체의 결합을 보여준다. HuT78/OX40 및 HuT78/cynoOX40 세포를 항체 445-3으로 염색하고 평균 형광 강도(MFI, Y- 축으로 표시)를 유세포 분석에 의해 결정하였다.
도 5는 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의한 OX40 야생형 및 점 돌연변이체에 대한 445-3 Fab의 친화성 결정을 나타낸다.
도 6은 항체 445-3과 OX40 상의 이의 에피토프 사이의 구체적 상호작용을 보여준다. 항체 445-3 및 OX40은 각각 옅은 회색과 검은색으로 표시되었다. 수소 결합 또는 염다리, pi-pi 스태킹 및 Van der Waals (VDW) 상호 작용은 각각 점선, 이중 점선 및 실선으로 표시되었다.
도 7은 항체 445-3이 OX40L 결합을 방해하지 않음을 나타낸다. HEK293/OX40L 세포를 염색하기 전에, OX40-마우스 IgG2a (OX40-mIgG2a) 융합 단백질을 인간 IgG (+ HuIgG), 항체 445-3 (+ 445-3) 또는 항체 1A7.gr1 (+ 1A7.gr1, US 2015/0307617참조)과 함께 1 : 1의 몰비로 사전 인큐베하였다. OX40L의 OX40-mIgG2a/항-OX40 항체 복합체에 대한 결합은 HEK293/OX40L 세포 및 OX40-mIgG2a/항-OX40 항체 복합체의 공동-인큐베이션에 이어 항-마우스 IgG 2차 Ab와의 반응 및 유세포 분석에 의해 결정되었다. 결과는 중복실험(duplicate)의 평균 ± SD로 표시되었다. 통계적 유의성 : P < 0.05; **: P < 0.01.
도 8은 보고된 OX40/OX40L 복합체 (PDBcode : 2HEV)와 OX40/445-3 Fab의 구조적정렬을 보여준다. OX40L은 흰색으로, 445-3 Fab는 회색으로, OX40은 검은색으로 표시되었다.
9A-B는 항-OX40 항체 445-3이 TCR 자극과 함께 IL-2 생산을 유도한다는 것을 보여준다. OX40 양성 HuT78/OX40 세포 (도 9A)는 항-OX40 항체의 존재 하에 인공 항원 제시 세포주 (APC) (HEK293/OS8Low-FcγRI)과 밤새 공동 배양하고, IL-2 생산을 T 세포 자극에 대한 판독으로 사용하였다 (도 9B). ELISA로 배양 상청액의 IL-2를 검출하였고, 그 결과는 3회 실험의 평균 ± SD로 표시하였다.
도 10은 항-OX40 항체가 MLR 반응을 향상시킴을 보여준다. 시험관 내 분화된 수지상 세포 (DC)를 2일 동안 항-OX40 항체 (0.1-10 μg/ml)의 존재하에 동종(allogeneic) CD4+ T 세포와 공동 배양하였다. ELISA에 의해 상청액의 IL-2가 검출되었다. 모든 테스트는 4회 수행되었으며 결과는 평균 ± SD로 표시되었다. 통계적 유의성 : P < 0.05; **: P < 0.01.
도 11은 항-OX40 항체 445-3이 ADCC를 유도한다는 것을 보여준다. ADCC 분석은 NK92MI/CD16V 세포를 이펙터 세포로 사용하고 HuT78/OX40 세포를 표적 세포로 사용하여 항-OX40 항체 (0.004-3μg/ml) 또는 대조군의 존재하에 수행하였다. 동일한 수의 이펙터 세포와 표적 세포를 5시간 동안 공동 배양 한 후 젖산 탈수소 효소 (LDH) 방출을 검출하였다. 세포 독성의 백분율 (Y-축)은 실시예 12에 기술된 바와 같이 제조업체의 프로토콜을 기반으로 계산되었다. 결과는 3회 실험의 평균 ± SD로 표시되었다.
도 12a-12c는 NK 세포와 조합된 항-OX40 항체 445-3이 시험관 내 활성화된 PBMC에서 Treg에 대한 CD8+ 이펙터 T 세포의 비율을 증가 시킨다는 것을 보여준다. 인간 PBMC는 PHA-L (1 ㎍/ml)에 의해 사전 활성화된 다음 항-OX40 항체 또는 대조군의 존재하에 NK92MI/CD16V 세포와 공동 배양되었다. 상이한 T-세포 서브 세트의 백분율은 유세포 분석에 의해 결정되었다. CD8+ 이펙터 T 세포 대 Tregs의 비율을 추가로 계산하였다. 도 12A는 CD8+/총 T 세포의 비율을 보여준다. 도 12B는 Treg/총 T 세포 비율이다. 도 12C는 CD8+/Treg 비율을 보여준다. 데이터는 중복 실험의 평균 ± SD로 표시된다. 표시된 농도에서 445-3과 1A7.gr1 사이의 통계적 유의성이 표시된다. P < 0.05; **: P < 0.01.
도 13a-13b는 1A7.gr1이 아닌, 항-OX40 항체 445-3이 OX40-인간화 마우스(OX40-humanized mice)에서 MC38 결장암 공통 유전자 모델(colorectal cancer syngeneic model)에서 용량 의존적 항 종양 활성을 나타낸다는 것을 보여준다.
도 14a-14b는 OX40 항체에서 만들어진 아미노산 변경표이다.
정의
본원의 다른 곳에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 다른 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.
첨부된 청구범위를 포함하여 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "a", "an" 및 "the"와 같은 단어의 단수 형태는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 대응하는 복수 참조를 포함한다.
용어 "또는 (or)"은 문맥상 달리 명확하게 지시하지 않는 한 "및/또는 (and/or)" 이라는 용어를 의미하기 위해 사용되며 이와 상호 교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 용어 "항암제 (anti-cancer agent)"는 암과 같은 세포 증식성 장애를 치료하는데 사용될 수 있는 임의의 제제를 지칭하며, 비제한적으로 세포 독성제, 화학 요법제, 방사선 요법 및 방사선 요법제, 표적화 된 항암제 및 면역 요법제를 포함한다.
용어 "OX40"은 종양 괴사 인자 수용체 수퍼 패밀리 (tumor necrosis factor receptor super family)의 멤버인 대략 50 KD의 I형 막 횡단 당단백질(type I transmembrane glycoprotein)을 지칭한다. OX40은 ACT35, CD134 또는 TNFRSF4 라고도 한다. humanOX40의 아미노산 서열 (서열번호 1)은 접근번호 NP_003318에서 확인할 수 있으며 OX40 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 접근번호: X75962.1이다. 용어 "OX40 리간드" 또는 "OX40L"은 OX40의 유일한 리간드를 지칭하고 gp34, CD252 또는 TNFSF4와 상호교환될 수 있다.
본원에서 용어 "투여 (administration)", "투여하는 (administrating)", "치료하는 (treating)" 및 "치료 treatment)"는, 동물, 인간, 실험 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생묽학적 유체에 적용할 때, 외인성 약제, 치료제, 진단제 또는 조성물이 상기 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 접촉하는 것을 의미한다. 세포의 치료는 세포에 대한 시약(reagent)의 접촉 뿐만 아니라 세포와 접촉하는 유체에 대한 시약의 접촉을 포함한다. 용어 "투여 (administration)" 및 "치료 (treatment)"는 또한 예를 들어 시약, 진단, 결합 화합물 또는 또 다른 세포에 의해 시험관 내 및 생체 외에서, 예컨대 세포를, 치료하는 것을 의미한다. 본원에서 용어 "대상체 (subject)"는 임의의 유기체, 바람직하게는 동물, 더욱 바람직하게는 포유 동물 (예를 들어, 쥐, 마우스, 개, 고양이, 토끼) 및 가장 바람직하게는 인간을 포함한다. 임의의 질환 또는 장애를 치료하는 것은 일 관점에서, 질환 또는 장애를 개선하는 것 (ameliorating) (즉, 질환 또는 이의 임상 증상 중 적어도 하나의 발달을 늦추거나 억제 또는 감소시키는 것)을 의미한다. 또 다른 측면에서, "치료하다 (treat)", "치료하는 (treating)" 또는 "치료 (treatment)"는 환자가 식별할 수 없는 것들을 포함하는 적어도 하나의 물리적 파라미터를 완화 또는 개선하는 것을 지칭한다. 다른 측면에서, "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 물리적으로 (예 : 식별 가능한 증상의 안정화), 생리학적으로 (예 : 물리적 파라미터의 안정화) 또는 이 모두에 대해 질환 또는 장애를 조절하는 것을 지칭한다. 또 다른 측면에서, "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 질병 또는 장애의 발병 (onset) 또는 발달 (development) 또는 진행 (progression)을 예방 (preventing) 또는 지연 (delaying) 시키는 것을 의미한다.
본 발명의 맥락에서 용어 "대상체 (subject)"는 포유 동물, 예를 들어 영장류, 바람직하게는 고등 영장류, 예를 들어 인간 (예를 들어, 본원에 기술된 장애 를 가지고 있거나 가질 위험이 있는 환자)이다.
본원에 사용된 용어 "친화도 (affinity)"는 항체와 항원 간의 상호작용 강도를 의미한다. 항원 내에서 항체 "팔 (arm)"의 가변 영역은 수많은 부위에서 항원과 비공유력 (non-covalent force)을 통해 상호작용하며, 상호 작용이 많을수록 친화도 (affinity)가 강해진다.
본원에 사용된 용어 "항체 (antibody)"는 상응하는 항원에 비공유적으로, 가역적으로, 및 특정 방식으로, 결합할 수 있는 면역 글로불린 패밀리의 폴리펩타이드를 지칭한다. 예를 들어, 자연 발생 IgG 항체는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 사량체이다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본 명세서에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 세 도메인을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본 명세서에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함하한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라고 하는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역 (CDR)이라고 하는 초 가변 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복실 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서로 배열된 3 개의 CDR과 4 개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분 (Clq)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역 글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
용어 "항체"는 단일클론 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 및 항-이디오 타입 (항 -Id) (anti-idiotypic, anti-Id) 항체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 상기 항체는 임의의 이소타입/클래스 (예 : IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY) 또는 서브 클래스 (예 : IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 일 수 있다.
일부 양태에서, 항-OX40 항체는 적어도 하나의 항원-결합 부위 또는 적어도 하나의 가변 영역을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 항-OX40 항체는 본원에 기재된 OX40 항체로부터의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 항-OX40 항체는 단리되거나 재조합된다.
본원에서 용어 "단일클론 항체 (monoclonal antibody)" 또는 "mAb" 또는 "Mab"는 실질적으로 균질한 항체의 집단을 의미하며, 즉, 집단에 포함된 항체 분자는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연으로 발생되는 돌연변이를 제외하고 아미노산 서열이 동일하다. 대조적으로, 통상적인 (다클론) 항체 제제는 전형적으로 가변 도메인, 특히 종종 상이한 에피토프에 특이적인 상보성 결정 영역 (CDR)에 상이한 아미노산 서열을 갖는 다수의 상이한 항체를 포함한다. 변형 "단일클론"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻어지는 항체의 특성을 나타내며 특정 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 단일클론 항체 (mAb)는 당업자에게 공지된 방법으로 얻을 수 있다. 예를 들어, Kohler et al., Nature 1975 256:495-497; U.S. Pat. No. 4,376,110; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 1992; Harlow et al.,ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold spring Harbor Laboratory1988; and Colligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY 1993를 보라. 본원에 개시된 항체는 IgG, IgM, IgD, IgE, IgA를 포함하는 면역글로불린 클래스 및 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4와 같은 그의 서브 클래스일 수 있다. 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 시험관 내 또는 생체 내에서 배양 될 수 있다. 높은 역가의 단일 클론 항체는 고농도의 원하는 항체를 포함하는 복수 액을 생산하기 위한 pristine-primed Balb/c 마우스와 같이, 개별 하이브리도마의 세포가 마우스에 복강으로 주입되는 생체 내 생산에서 얻을 수 있다. 이소타입 IgM 또는 IgG의 단일클론 항체는 당업자에게 잘 알려진 컬럼 크로마토그래피 방법을 사용하여 복수액 또는 배양 상청액으로부터 정제될 수 있다.
일반적으로, 기본 항체 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각 사량체는 2 개의 동일한 폴리펩타이드 쇄 쌍을 포함하고, 각 쌍은 하나의 "경쇄" (약 25kDa) 및 하나의 "중쇄" (약 50-70kDa)를 갖는다. 각 쇄의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110 개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 중쇄의 카르복시 말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 정의할 수 있다. 일반적으로 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 또한, 인간 중쇄는 일반적으로 α, δ, ε, γ 또는 μ로 분류되며 항체의 이소타입을 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 정의한다. 경쇄 및 중쇄 내에서 가변 및 불변 영역은 약 12 개 이상의 아미노산의 "J"영역에 의해 연결되며, 중쇄는 약 10 개 이상의 아미노산의 "D"영역도 포함한다.
각 경쇄/중쇄 (VL/VH) 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서 일반적으로 온전한 항체에는 두 개의 결합 부위가 있다. 이기능성 (bifunctional) 또는 이중특이성 (bispecific) 항체를 제외하고 두 결합 부위는 일반적으로 동일하다.
전형적으로, 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 도메인은 상대적으로 보존된 프레임워크 영역 (FR) 사이에 위치하는 "상보성 결정 영역 (CDR)"이라고도 하는 3 개의 초가변 영역(hypervariable region)을 포함한다. CDR은 일반적으로 프레임워크 영역에 의해 정렬되어 특정 에피토프에 결합할 수 있다. 일반적으로, N- 말단에서 C- 말단까지 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 모두 FR-1 (또는 FR1), CDR-1 (또는 CDR1), FR-2 (FR2), CDR-2 (CDR2), FR-3 (또는 FR3), CDR-3 (CDR3) 및 FR-4 (또는 FR4)을 포함한다. CDR 및 프레임워크 영역의 위치는 당업계에 잘 알려진 다양한 정의, 예컨대 Kabat, Chothia, and AbM (see, e.g., Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989); Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol., 273:927-748 (1997)). Definitions of antigen combining sites are also described in the following: Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000); and Lefranc, M. P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001); MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996); and Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989); Martin et al., Methods Enzymol., 203:121-153 (1991); and Rees et al., In Sternberg M. J. E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996)를 사용하여 결정될 수 있다. 조합된 Kabat 및 Chothia 넘버링 체계에서, 일부 양태에서 CDR은 Kabat CDR, Chothia CDR 또는 둘 모두의 일부인 아미노산 잔기에 상응한다. 예를 들어, CDR은, VH, 예컨대 포유류 VH, 예를 들어 인간 VH에서 아미노산 잔기 26-35 (HC CDR1), 50-65 (HC CDR2), 및 95-102 (HC CDR3); 및 VL, 예컨대 포유류 VL, 예를 들어 인간 VL에서 아미노산 잔기 24-34 (LC CDR1), 50-56 (LC CDR2) 및 89-97 (LC CDR3)에 상응한다.
용어 "초가변 영역 (hypervariable region)"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 초가변 영역은 "CDR", 즉, 경쇄 가변 도메인에서 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 및 중쇄 가변 도메인에서 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 의 아미노산 잔기를 포함한다. Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (서열로 항체의 CDR 영역을 정의함);와 Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917 (구조로 항체의 CDR 영역을 정의함)를 보라. 용어 "프레임워크 (framework)" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 CDR 잔기로서 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 의미한다.
달리 지시되지 않는 한, "항원 결합 단편 (antigen-binding fragment)"은 항체의 항원 결합 단편, 즉 전장 항체에 의해 결합되는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편, 예컨대 하나 이상의 CDR 영역을 보유하는 단편을 의미한다. 항원 결합 단편의 예는 Fab, Fab ', F (ab') 2 및 Fv; 다이아바디(diabody); 선행 항체 (linear antibodies); 단일 사슬 항체 분자, 예를 들어 단일 사슬 Fv (ScFv); 항체 단편에서 형성된 나노바디 (nanobody) 및 다중 특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
항체는 표적 단백질에 "특이적으로 결합 (specifically binds)" 하는데, 이는 항체가 다른 단백질과 비교하여 그 표적에 대한 우선적인 결합을 나타내는 것을 의미하지만, 이 특이성은 절대 결합 특이성 (absolute binding specificity)을 요구하지 않는다. 항체의 결합이 샘플에서 표적 단백질의 존재를 결정하는 경우, 예컨대 위양성과 같은 원하지 않는 결과를 생성하지 않는 경우, 항체는 의도된 표적에 대해 "특이적"인 것으로 간주된다. 본 발명에 유용한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 비-표적 단백질과의 친화도보다 2 배 이상, 바람직하게는 10 배 이상, 더욱 바람직하게는 20 배 이상, 가장 바람직하게는 100 배 이상 더 큰 친화도로 표적 단백질에 결합할 것이다. 본원에서 항체가 어떤 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 결합하지만 그 서열이 없는 단백질에는 결합하지 않는 경우, 그 항체는 그 주어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 예컨대 인간 OX40 분자의 아미노산 서열에 특이적으로 결합한다고 말할 수 있다.
본원에서 용어 "인간 항체 (human antibody)"는 인간 면역 글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 의미한다. 인간 항체는 마우스, 마우스 세포 또는 마우스 세포에서 파생된 하이브리도마에서 생산되는 경우 마우스의 탄수화물 사슬을 포함할 수 있다. 유사하게, "마우스 항체" 또는 "랫트 항체"는 각각 마우스 또는 랫트 면역 글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 의미한다.
용어 "인간화 항체 (humanized antibody)"는 인간 항체뿐만 아니라 비-인간 (예를 들어,마우스) 항체로부터의 서열을 함유하는 항체의 형태를 의미한다. 이러한 항체는 비인간 면역 글로불린에서 파생된 최소 서열을 함유한다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 모두 적어도 1 개, 전형적으로 2 개의 가변 도메인을 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프(hypervariable loops)는 비-인간 면역 글로불린의 것들에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역 글로불린 서열의 것들이다. 인간화 항체는 선택적으로 또한 면역 글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역 글로불린의 일부를 포함할 것이다. 인간화 항체를 모 설치류 항체와 구별하기 위해 필요한 경우 접두사 "hum", "hu", "Hu" 또는 "h"가 항체 클론 지정에 추가된다. 인간화 형태의 설치류 항체는 일반적으로 모 설치류 항체의 동일한 CDR 서열을 포함할 것이지만, 친화도를 증가시키고, 인간화 항체의 안정성을 증가시키고, 번역 후 변형을 제거하거나 또는 다른 이유로 특정 아미노산 치환이 포함될 수 있다.
용어 "상응하는 인간 생식선 서열 (corresponding human germline sequence)"은 인간 생식선 면역 글로불린 가변 영역 서열에 의해 코딩된 다른 모든 공지된 가변 영역 아미노산 서열과 비교하여 참조 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위 서열과 가장 높은 결정된 아미노산 서열 동일성을 공유하는 인간 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위 서열을 코딩하는 핵산 서열을 의미한다. 상기 상응하는 인간 생식선 서열은 또한 평가된 다른 모든 가변 영역 아미노산 서열과 비교하여 참조 가변 영역 아미노산 서열 또는 서브 서열과 가장 높은 아미노산 서열 동일성을 갖는 인간 가변 영역 아미노산 서열 또는 서브 서열을 지칭할 수 있다. 상기 상응하는 인간 생식선 서열은 프레임 워크 영역 만, 상보성 결정 영역 만, 프레임 워크 및 상보적 결정 영역, 가변 분절 (variable segment) (상기 정의된 바와 같음), 또는 가변 영역을 포함하는 서열 또는 서브 서열의 다른 조합일 수 있다. 서열 동일성은 예를 들어 BLAST, ALIGN 또는 당업계에 공지된 다른 정렬 알고리즘을 사용하여 2 개의 서열을 정렬하는 것과 같이 본원에 기재된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 상응하는 인간 생식선 핵산 또는 아미노산 서열은 참조 가변 영역 핵산 또는 아미노산 서열과 적어도 약 90 %, 91, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 서열 동일성을 가질 수 있다.
용어 "평형 해리 상수 (KD, M)"는 해리 속도 상수 (kd, time-1)를 연관 속도 상수 (ka, time-1, M-1)로 나눈 것을 의미한다. 본 발명의 항체는 일반적으로 약 10-7 또는 10-8 M 미만, 예를 들어 약 10-9 M 또는 10-10 M 미만, 일부 관점에서 약 10-11 M, 10-12 M 또는 10-13 M 미만의 평형 해리 상수를 가질 것이다.
본원에서 용어 "암 (cancer)" 또는 "종양 (tumor)"는 당업계에서 이해되는 바와 같이 가장 넓은 의미를 가지며 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로하는 포유 동물에서의 생리학적 상태를 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 암은 특정 유형 또는 위치에 제한되지 않는다.
용어 "병용 요법 (combination therapy)"은 본 발명에 기재된 치료적 상태 또는 장애를 치료하기위한 둘 이상의 치료제의 투여를 의미한다. 이러한 투여는 실질적으로 동시인 방식으로(substantially simultaneous manner)이러한 치료제의 공동 투여를 포함한다. 이러한 투여는 또한 각 활성 성분에 대해 다중의 또는 별도의 용기 (예 : 캡슐, 분말 및 액체)에서의 공동 투여를 포함한다. 분말 및/또는 액체는 투여 전에 재구성되거나 원하는 용량으로 희석될 수 있다. 또한, 이러한 투여는 대략 동시에 또는 상이한 시간에 순차적 방식으로 각 유형의 치료제의 사용을 포함한다. 어느 경우든, 치료 요법은 본원에 기술된 상태 또는 장애를 치료하는데 있어서 약물 조합 (combination)의 유익한 효과를 제공할 것이다.
본 발명의 맥락에서, 아미노산 서열이 언급될 때, 용어 "보존적 치환 (conservative substitution)"은 항체 또는 단편의 화학적, 물리적 및/또는 기능적 특성을 실질적으로 변경하지 않는, 예컨대 OX40에 대한 결합 친화성을 변경하지 않는, 원래 아미노산의 새로운 아미노산으로의 치환을 의미한다. 구체적으로, 아미노산의 일반적인 보존적 치환은 다음 표에 나타나 있으며 당업계에 잘 알려져 있다.
예시적인 보존적 아미노산 치환
Figure pct00001
서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하는데 적합한 알고리즘의 예는 각각 Altschul et al, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977; 및 Altschul et al.,J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990에 설명된 BLAST 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information을 통해 공개적으로 제공된다. 이 알고리즘은 먼저 데이터베이스 시퀀스에서 동일한 길이의 단어와 정렬 될 때 양수 임계 값 점수 T와 일치하거나 만족하는 쿼리 시퀀스에서 길이가 W 인 짧은 단어를 식별하여 높은 점수 시퀀스 쌍 (HSP)을 식별한다. T는 인접 단어 점수 임계 값이라 한다. 이러한 초기 인접 단어 적중은 검색을 시작하여 더 긴 HSP를 찾기위한 값으로 작동한다. 누적 정렬 점수가 증가할 수 있는 한 단어 히트는 각 시퀀스를 따라 양방향으로 확장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열의 경우 매개 변수 M (일치하는 잔기 쌍에 대한 보상 점수; 항상> 0) 및 N (불일치 잔기에 대한 페널티 점수; 항상 <0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우 점수 매트릭스를 사용하여 누적 점수를 계산한다. 각 방향으로 단어 적중의 확장은 다음과 같은 경우에 중단된다: 누적 정렬 점수가 최대 달성 값에서 수량 X만큼 떨어질 때; 누적 점수가 하나 이상의 네거티브 스코어링 잔류물 정렬의 축적으로 인해 0 이하가 될 때; 또는 두 서열의 끝 (the end of either sequence)에 도달했을 때. BLAST 알고리즘 매개 변수 W, T 및 X는 정렬의 감도와 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열용)은 기본값으로 단어 길이 (W) 11, 기대값 (E) 10, M = 5, N = -4 및 두 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우 BLAST 프로그램은 기본값으로 단어 길이 3, 기대치 (E) 10, BLOSUM62 스코어링 매트릭스 정렬 (Henikoff and Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 참조) (B) 50, 기대치 (E) 10, M = 5, N = -4 및 두 가닥 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 간의 유사성에 대한 통계 분석을 수행한다 ( Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 가지 척도는 최소 합계 확률 (P (N))이며, 이는 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 일치가 우연히 발생할 확률을 나타낸다. 예를 들어, 참고 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소 합 확률 (smallest sum probability)이 약 0.2 미만,보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우 핵산은 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
두 아미노산 서열 간의 동일성 백분율은 두 아미노산 서열 간의 동일성 백분율은 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합되어 PAM120 가중치 잔여 테이블, 간격 길이 패널티 12 및 간격 패널티 4를 사용하는 E. Meyers 및 W. Miller, Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17, (1988)의 알고리즘을 사용하여 결정할 수도 있다. 또한 두 아미노산 서열 간의 동일성 백분율은 BLOSUM62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스와 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 간격 가중치와 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램에 통합된 알고리즘인 Needleman 및 Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453, (1970) 을 사용하여 결정할 수 있다.
용어 "핵산(nucleic acid)"은 본원에서 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"와 상호 교환적으로 사용되며, 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이들의 중합체를 의미한다. 이 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 합성, 자연 발생 및 비자연 발생인 알려진 뉴클레오티드 유사체 또는 변형 된 백본 잔기 또는 연결을 포함하는 핵산을 포함한다. 이러한 유사체의 예는 제한없이 포스포로티오에이트 (phosphorothioates), 포스포라미데이트 (phosphoramidates), 메틸포스포네이트 (methyl phosphonates), 키랄-메틸 포스포 네이트 (chiral-methyl phosphonates), 2-O-메틸 리보뉴클레오티드 (2-O-methyl ribonucleotides), 펩타이드-핵산 (peptide-nucleic acids (PNA))을 포함한다.
핵산과 관련하여 용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 2 개 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA) 분절 사이의 기능적 관계를 의미한다. 일반적으로 이는 전사 조절 서열과 전사되는 서열의 기능적 관계를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열은 적절한 숙주 세포 또는 다른 발현 시스템에서 코딩 서열의 전사를 자극하거나 조절하는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, 전사되는 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 전사 조절 서열은 전사되는 서열에 물리적으로 인접하며, 즉 이들은 시스-작용(cis-acting)이다. 그러나, 인핸서와 같은 일부 전사 조절 서열은 물리적으로 인접하거나 이들이 전사를 향상시키는 코딩 서열에 매우 근접할 필요는 없다.
일부 관점에서, 본 발명은 조성물, 예를 들어, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 제제화된 본원에 기재된 항-OX40 항체를 포함하는 약제학적으로 허용되는 조성물을 제공한다. 본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 부형제"는 생리학적으로 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 부형제는 정맥 내, 근육 내, 피하, 비경구, 직장, 척추 또는 표피 투여 (예 : 주사 (injection) 또는 주입 (infection))에 적합할 수 있다.
본원에 개시된 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 예를 들어, 액체 용액 (예를 들어, 주사용 및 주입용 용액), 분산액 또는 현탁액, 리포솜 및 좌약과 같이 액체, 반고체 및 고체 투여 형태가 포함된다. 적절한 형태는 의도되는 투여 방식 및 치료적 적용에 따라 달라진다. 전형적인 적합한 조성물은 주사용 또는 주입용 용액의 형태이다. 한 가지 적합한 투여 방식은 비경구 (예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내, 근육 내)이다. 일부 양태에서, 항체는 정맥 내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 특정 양태에서, 항체는 근육 내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.
본원에 사용된 용어 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"은 질병, 또는 질병 또는 장애의 임상적 증상 중 적어도 하나를 치료하기 위해 대상체에게 투여될 때, 질병 (disease), 장애 (disorder) 또는 증상 (symptom)에 대한 이러한 치료를 수행하기에 충분한 항체의 양을 지칭한다. "치료적 유효량"은 항체, 질병, 장애 및/또는 질병 또는 장애의 증상, 질병 또는 장애의 중증도 및/또는 질병 또는 장애의 증상, 치료할 대상의 연령 및/또는 치료할 대상의 체중에 따라 다양할 수 있다. 임의의 주어진 예에서 적절한 양은 당업자에게 명백하거나 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있다. 병용 요법의 경우, "치료적 유효량"은 질병, 장애 또는 상태(condition)의 효과적인 치료를 위한 병용 대상의 총량을 의미한다.
상세한 설명
본 발명은 인간 OX40에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편을 제공한다. 또한, 본 발명은 바람직한 약동학적 특성 및 기타 바람직한 속성을 갖는 항체를 제공하고, 따라서 이는 암의 가능성을 감소 시키거나 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 추가로 암 및 관련 장애의 예방 및 치료를 위한 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물 및 이러한 약제학적 조성물을 제조 및 사용 방법을 제공한다.
항-OX40 항체
본 발명은 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 하기 기재된 바와 같이 생성된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 14, 20 또는 26 (표 3)의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함한다. 본 발명은 또한 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 표 3에 열거된 VH CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR을 포함한다. 일 관점에서, 본 발명은 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체는 표 3에 열거된 임의의 VH CDR의 아미노산 서열을 갖는 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 VH CDR을 포함한다 (또는 대안적으로 구성된다).
본 발명은 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열 16, 22 또는 28의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다 (표 3). 본 발명은 또한 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 표 3에 열거된 VL CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR을 포함한다. 특히, 본 발명은 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 표 3에 열거된 임의의 VL CDR의 아미노산 서열을 갖는 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 VL CDR을 포함한다 (또는 대안적으로 구성된다).
본 발명의 다른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 돌연변이 된, 그러나 표 3에 기재된 서열에 기술된 CDR 영역과 CDR 영역에서 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산을 포함한다. 일부 관점에서, 이는 표 3에 기재된 서열에 기술된 CDR 영역과 비교할 때 1, 2, 3, 4 또는 5 개 이하의 아미노산이 CDR 영역에서 돌연변이 된 돌연변이 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 항체는 아미노산 또는 아미노산을 코딩하는 핵산이 돌연변이 된 항체, 그러나 표 3에 기재된 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 항체를, 포함할 수 있다. 일부 관점에서, 이는 표 3에 기재된 순서에 기술된 가변 영역과 비교했을 때, 실질적으로 동일한 치료 활성을 유지하면서, 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 가변 영역에서 돌연변이 된 돌연변이 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 OX40에 특이적으로 결합하는 항체의 VH, VL, 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 이러한 핵산 서열은 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화 될 수 있다.
에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체의 식별
본 발명은 인간 OX40의 에피토프에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 관점에서 상기 항체 및 항원 결합 단편은 OX40의 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명은 또한 표 3에 기재된 항-OX40 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 따라서 추가 항체 및 이의 항원 결합 단편은 결합 분석에서 다른 항체와 교차 경쟁하는 (예를 들어, 통계적으로 유의한 방식으로 결합을 경쟁적으로 억제하는) 능력에 기초하여 확인할 수 있다. OX40에 대한 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편의 결합을 억제하는 시험 항체의 능력은 그 시험 항체가 OX40에 대한 결합에 대해 그 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁할 수 있음을 입증한다. 이러한 항체는, 어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 그것이 경쟁하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 동일하거나 OX40상의 관련된 에피토프 (예를 들어, 구조적으로 유사하거나 공간적으로 근접한)에 결합할 수 있다. 특정 관점에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 같이 OX40상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 인간 또는 인간화 단일클론 항체이다. 이러한 인간 또는 인간화 단일클론 항체는 본원에 기재된 바와 같이 제조 및 분리될 수 있다.
Fc 영역 프레임 워크의 추가 변경
또 다른 관점에서, 상기 Fc 영역은 항체의 이펙터 기능을 변경하기 위해 하나 이상의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체함으로써 변경된다. 예를 들어, 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 가지지만 모 항체의 항원 결합 능력을 유지하도록 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 대체할 수 있다. 친화도가 변경되는 이펙터 리간드는 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이 접근 방식은 예를 들어, Winter et al의 U.S. Pat. Nos. 5,624,821 및 5,648,260에 기재되어 있다.
또 다른 관점에서, 상기 항체는 변경된 C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포 독성 (CDC)을 감소 또는 폐하도록 (abolish) 하나 이상의 아미노산 잔기를 하나 이상의 상이한 아미노산 잔기로 대체할 수 있다. 이 접근 방식은 예를 들어, Idusogie et al.의 U.S. Pat. No. 6,194,551에 기재되어 있다.
또 다른 관점에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경되어 보체를 고정하는 항체의 능력이 변경된다. 이 접근법은 예를 들어 Bodmer et al.의 PCT Publication WO 94/29351에 기재되어 있다. 특정 관점에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 하나 이상의 아미노산은 IgG1 서브 클래스 및 카파 이소타입에 대해 하나 이상의 동종 이형 (allotypic) 아미노산 잔기로 대체된다. 동종 이형 아미노산 잔기는 또한 Jefferis et al., MAbs. 1:332-338 (2009)에 기재된 바와 같이 IgG1, IgG2 및 IgG3 서브 클래스의 중쇄 불변 영역과 카파 이소타입의 경쇄 불변 영역을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 관점에서, 상기 Fc 영역은 하나 이상의 아미노산을 변형함으로써 항체 의존성 세포의 세포 독성 (ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 증가 및/또는 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변형된다. 이 접근법은 예를 들어 Presta의 PCT Publication WO 00/42072에 기재되어 있다. 또한, FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1의 결합 부위가 맵핑되었고 결합이 개선된 변이체가 기술되었다 (Shields et al., J. Biol. Chem. 276 : 6591-6604, 2001 참조).
또 다른 관점에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 비글리코실화 항체 (aglycosylated antibody)가 만들어질 수 있다 (즉, 항체가 글리코실화가 없거나 감소됨). 글리코실화는 예를 들어 "항원"에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 항체 서열 내에서 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임 워크 글리코실화 부위를 제거하여 그 부위에서 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 Co et al.의 U.S. Pat. Nos. 5,714,350 및 6,350,861에 기재되어 있다.
추가적으로, 또는 대안적으로, 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 저푸코실화 된 항체 (hypofucosylated antibody) 또는 증가된 이등분 GlcNac 구조 (bisecting GlcNac structure)를 갖는 항체와 같은 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 변경된 글리코실화 조직(machinery)을 사용하여 숙주 세포에서 항체를 발현함으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 조직을 갖는 세포는 당업계에 설명되어 있으며 재조합 항체를 발현하여 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, Hang et al.의 EP 1,176,195는 해당 세포주에서 발현된 항체가 저푸코실화를 나타내도록 푸코실전이효소를 코딩하는 FUT8 유전자가 기능적으로 파괴된 세포주를 설명한다. Presta의 PCT Publication WO 03/035835는 푸코오스를 Asn (297)-연결된 탄수화물에 부착하는 능력이 감소되어 해당 숙주 세포에서 발현된 항체의 저푸코실화를 초래하는 변이체 CHO 세포주 Lecl3 세포를 설명한다 (Shields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740 참조). Umana et al.의 PCT Pulication WO 99/54342는 당단백질-변형 글리코실트랜스퍼라제 (예 : beta(1,4)-N acetylglucosaminyltransferase III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 설명하는데, 이러한 조작된 세포주에서 발현된 항체는 항체의 ADCC 활성을 증가시키는 증가된 이등분 GlcNac 구조를 나타낸다 (Umana et al., Nat. Biotech. 17:176-180, 1999).
또 다른 관점에서, ADCC의 감소가 필요한 경우, 인간 항체 서브 클래스 IgG4는 많은 이전 보고서에서 적절한 (modest) ADCC만 갖고 CDC 이펙터 기능을 거의 갖지 않는 것으로 나타났다 (Moore G L, et al. 2010 MAbs, 2 : 181-189). 반면에, 천연 IgG4는 산성 완충액 또는 온도 상승과 같은 스트레스 조건에서 덜 안정한 것으로 나타났다 (Angal, S. 1993 Mol Immunol, 30 : 105-108; Dall'Acqua, W. et al, 1998 Biochemistry, 37 : 9266-9273; Aalberse et al. 2002 Immunol, 105 : 9-19). 감소된 ADCC는 감소된 또는 null FcγR 결합 또는 C1q 결합 활성을 갖는 변경의 조합으로 조작된 IgG4를 항체에 작동 가능하게 연결함으로써 달성될 수 있으며, 이에 의해 ADCC 및 CDC 이펙터 기능을 감소 또는 제거할 수 있다. 생물학적 약물로서 항체의 물리 화학적 특성을 고려할 때, IgG4의 덜 바람직하고 내재적인 특성 중 하나는 용액에서 두 개의 중쇄를 동적으로 분리하여 “Fab arm exchange”라 불리는 공정을 통해 절반 항체를 형성하는 것이다. (Van der Neut Kolfschoten M, et al. 2007 Science, 317 : 1554-157). 228번 위치 (EU 넘버링 시스템)에서 세린의 프롤린으로의 돌연변이는 IgG4 중쇄 분리를 억제하는 것으로 나타났다 (Angal, S. 1993 Mol Immunol, 30:105-108; Aalberse et al. 2002 Immunol, 105:9-19). 힌지 및 γFc 영역의 일부 아미노산 잔기는 Fcγ 수용체와의 항체 상호 작용에 영향을 미치는 것으로 보고되었다 (Chappel S M, et al. 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9036-9040; Mukherjee, J. et al., 1995 FASEB J, 9:115-119; Armour, K. L. et al. 1999 Eur J Immunol, 29:2613-2624; Clynes, R. A. et al, 2000 Nature Medicine, 6:443-446; Arnold J. N., 2007 Annu Rev immunol, 25:21-50). 더욱이, 인간 집단에서 드물게 발생하는 일부 IgG4 동형(isoform)은 또한 다른 물리 화학적 특성을 이끌어 낼 수 있다 (Brusco, A. et al. 1998 Eur J Immunogenet, 25 : 349-55; Aalberse et al. 2002 Immunol, 105 : 9-19). 낮은 ADCC, CDC 및 불안정성을 갖는 OX40 항체를 생성하기 위해 인간 IgG4의 힌지 및 Fc 영역을 변형 (modify)하고 많은 변경 (alteration)을 도입할 수 있다. 이러한 변형된 IgG4 Fc 분자는 Li et al.의 U.S. Patent No. 8,735,553, 서열번호 83-88에서 찾을 수있다.
OX40 항체 생산
항-OX40 항체 및 이의 항원 결합 단편은 항체 사량체의 재조합 발현, 화학적 합성 및 효소 소화 (enzyme digestion)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 생성될 수 있는 반면, 전장 단일 클론 항체는 예를 들어 하이브리도마 또는 재조합 생산에 의해 얻을 수 있다. 재조합 발현은 당업계에 공지된 임의의 적절한 숙주 세포, 예를 들어 포유 동물 숙주 세포, 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포 등으로부터 일 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 본원에 기재된 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 세그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 일부 관점에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 15, 21 또는 27로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드와 적어도 85 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 핵산 서열 동일성을 갖는다. 일부 관점에서, 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드는 서열번호 17, 23, 또는 29로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드와 적어도 85 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % , 또는 100 % 핵산 서열 동일성을 갖는다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 항-OX40 항체의 가변 영역 서열을 인코딩할 수 있다. 또한 항체의 가변 영역과 불변 영역을 모두 인코딩 할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열 중 일부는 예시된 항-OX40 항체 중 하나의 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 다른 폴리뉴클레오티드는 각각 마우스 항체 중 하나의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역과 실질적으로 동일한 2 개의 폴리펩타이드 세그먼트를 인코딩한다.
또한, 본 발명은 항-OX40 항체를 생산하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 발현 벡터의 선택은 벡터가 발현되는 숙주 세포에 따라 달라진다. 전형적으로, 발현 벡터는 항-OX40 항체 쇄 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 다른 조절 서열 (예를 들어, 인핸서)을 포함한다. 일부 관점에서, 유도성 프로모터는 유도 조건의 제어 상황에서를 제외하고 삽입된 서열의 발현을 방지하기 위해 사용된다. 유도성 프로모터는 예를 들어 아라비노스, lacZ, 메탈로티오네인 프로모터 또는 열 충격 프로모터를 포함한다. 형질 전환된 유기체의 배양은 발현 생성물이 숙주 세포에 의해 더 잘 견디는 코딩 서열에 대한 집단을 편향시키지 않고 비유도 조건 하에서 확장될 수 있다. 프로모터 외에도 항-OX40 항체 또는 항원 결합 단편의 효율적인 발현을 위해 다른 조절 요소가 필요하거나 요구될 수 있다. 이러한 요소는 일반적으로 ATG 개시 코돈 및 인접한 리보솜 결합 부위 또는 기타 서열을 포함한다. 또한, 사용중인 세포 시스템에 적합한 인핸서를 포함하여 발현 효율을 향상시킬 수 있다 (예를 들어, Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; 및 Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987 참조). 예를 들어, SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서를 사용하여 포유류 숙주 세포에서 발현을 증가시킬 수 있다.
항-OX40 항체 사슬을 보유하고 발현하기 위한 숙주 세포는 원핵 또는 진핵세포 일 수 있다. E. coli는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 발현하는데 유용한 하나의 원핵 숙주이다. 사용에 적합한 다른 미생물 숙주는 바실러스 서브 틸리스 (Bacillus subtilis)와 같은 바실러스 및 살모넬라(Salmonella), 세라티아 (Serratia) 및 다양한 슈도모나스 종 (Pseudomonas species)과 같은 기타 장내 세균과(enterobacteriaceae)를 포함한다. 이러한 원핵 숙주에서, 전형적으로 숙주 세포와 호환되는 발현 조절 서열 (예를 들어, 복제 기점)을 포함하는 발현 벡터를 만들 수도 있다. 또한, 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템 또는 파지 람다의 프로모터 시스템과 같은 다양한 잘 알려진 프로모터가 여러 개(any number) 존재할 수 있다. 프로모터는 전형적으로, 선택적으로 오퍼레이터 서열과 함께, 발현을 제어하고, 전사 및 번역을 개시 및 완료하기 위해 리보솜 결합 부위 서열 등을 갖는다. 효모와 같은 다른 미생물도 항-OX40 폴리펩타이드를 발현하기 위해 사용될 수 있다. 배큘로바이러스 벡터 (baculovirus vector)와 조합하여 곤충 세포도 사용할 수 있다.
다른 관점에서, 포유 동물 숙주 세포는 본 발명의 항-OX40 폴리펩타이드를 발현하고 생산하는데 사용된다. 예를 들어, 이들은 내인성 면역 글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주 또는 외인성 발현 벡터를 보유하는 포유류 세포주일 수 있다. 여기에는 정상의 사멸 또는 정상 또는 비정상의 불멸 동물 또는 인간 세포가 포함된다. 예를 들어, CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HEK 293 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B 세포 및 하이브리도마를 포함하여 온전한 면역 글로불린을 분비할 수있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 개발되었다. 폴리펩타이드를 발현하기위한 포유 동물 조직 세포 배양의 사용은 일반적으로 예를 들어, Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, NY, N.Y., 1987에서 논의된다. 포유류 숙주 세포에 대한 발현 벡터는 복제 기점, 프로모터 및 인핸서와 같은 발현 조절 서열 (예: Queen et al., Immunol. Rev. 89 : 49-68, 1986 참조) 및 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결자 서열과 같은 필요한 처리 정보 부위 (processing information site)을 포함할 수 있다. 이러한 발현 벡터는 일반적으로 포유류 유전자 또는 포유류 바이러스에서 유래한 프로모터를 포함한다. 적합한 프로모터는 구성적 (constitutive), 세포 유형 특이적, 단계 특이적 및/또는 작동 가능 (modulatable)하거나 조절 가능 (regulatable)할 수 있다. 유용한 프로모터에는 메탈로티오네인 프로모터 (metallothionein promoter) , 구성적 아데노 바이러스 주요 후기 프로모터 (constitutive adenovirus major late promoter), 덱사메타손-유도성 MMTV 프로모터 (dexamethasone-inducible MMTV promoter), SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 구성적 MPSV 프로모터, 테트라사이클린-유도성 CMV 프로모터 (예: 인간 즉시 초기 CMV 프로모터 (human immediate-early CMV promoter), 구성적 CMV 프로모터, 및 당업계에 공지된 프로모터-인핸서 조합이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
탐지 (Detection) 및 진단 (Diagnosis) 방법
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 OX40의 검출 방법을 포함하여 다양한 적용에서 유용하나, 이에 제한되지는 않는다. 일 관점에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 생물학적 샘플에서 OX40의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에 사용된 용어 "검출 (detecting)"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 관점에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함한다. 다른 관점에서, 이러한 조직은 다른 조직에 비해 더 높은 수준으로 OX40을 발현하는 정상 및/또는 암 조직을 포함한다.
한 관점에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 OX40의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 특정 관점에서, 상기 방법은 항체와 항원의 결합을 허용하는 조건 하에서 생물학적 샘플을 항-OX40 항체와 접촉시키고 항체와 항원 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 생물학적 샘플에는 소변 또는 혈액 샘플이 포함될 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
또한 OX40의 발현과 관련된 장애를 진단하는 방법이 포함된다. 특정 관점에서, 상기 방법은 시험 세포를 항-OX40 항체와 접촉시키는 단계; OX40 폴리펩타이드에 대한 항-OX40 항체의 결합을 검출함으로써 시험 세포에서 OX40의 발현 수준 (정량적 또는 정성적)을 결정하는 단계; 및 시험 세포에서의 발현 수준을 대조군 세포 (예를 들어, 시험 세포와 동일한 조직 기원의 정상 세포 또는 비-OX40 발현 세포)에서의 OX40 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 대조군 세포와 비교하여 시험 세포에서의 더 높은 수준의 OX40 발현은 OX40의 발현과 관련된 장애의 존재를 나타낸다.
치료 방법
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 이에 제한되지 않으나, OX40-관련 장애 또는 질환의 치료방법을 포함하여 다양한 적용에 유용하다. 일 관점에서, OX40 관련 장애 또는 질환은 암이다.
일 관점에서, 본 발명은 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 관점에서, 상기 방법은 유효량의 항-OX40 항체 또는 항원 결합 단편을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 암은 유방암, 두경부암, 위암, 신장암, 간암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 난소암, 피부암, 중피종, 림프종, 백혈병, 골수종 및 육종을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 비경구, 폐 내 및 비강 내를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 국소 치료를 위해 필요하다면 병변 내 투여될 수 있다. 비경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하 투여가 포함된다. 투여는, 부분적으로 투여가 단기인지 만성인지 여부에 따라, 예를 들어 정맥 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 임의의 적절한 경로에 의할 수 있다. 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 볼루스 투여 (bolus administration) 및 펄스 주입 (pulse infusion)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 투여 스케줄이 본원에서 고려된다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제형화, 용량화(dosed) 되고 투여될 것이다. 이 맥락에서 고려할 요소는 치료할 특정 장애, 치료할 특정 포유 동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정 및 의료 실무자에가 알려진 기타 요인들을 포함한다. 항체는 반드시 그럴 필요는 없지만, 선택적으로 문제의 장애를 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제제 (agent)와 함께 제형화된다. 이러한 다른 제제의 유효량은 제제에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형 및 위에서 논의된 기타 요인에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99 %로, 또는 경험적/임상적으로 적절하다고 결정된 임의의 용량과 경로로 사용될 수 있다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편의 적절한 투여량은 치료할 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 진행 과정, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되었는지 여부, 이전의 요법, 환자의 임상 기록 및 항체에 대한 반응, 그리고 환자의 주치의 재량에 따라 달라질 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 질병의 유형 및 중증도에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg의 항체가, 예를 들어 하나 이상의 개별 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 용량이 될 수 있다. 하나의 전형적인 일일 복용량은 위에서 언급한 요인에 따라 약 1 μg/kg에서 100 mg/kg 또는 그 이상 범위일 수 있다. 며칠 또는 그 이상의 반복 투여의 경우, 상태에 따라 치료는 일반적으로 원하는 질병 증상 억제가 발생할 때까지 지속된다. 이러한 용량은 예를 들어, 매주 또는 3 주마다 (예컨대, 환자가 약 2 내지 약 20 회, 또는 예컨대, 약 6 회 용량의 항체를 받도록) 간헐적으로 투여될 수 있다. 초기 더 높은 로딩 용량에 이어 하나 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 그러나 다른 용량 요법이 유용할 수 있다. 이 요법의 진행은 기존의 기술과 분석으로 쉽게 모니터링된다.
병용 요법
일 관점에서, 본 발명의 OX40 항체는 다른 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 OX40 항체와 함께 사용될 수 있는 다른 치료제는, 이에 제한되지는 않으나, 다음을 포함한다 : 화학 요법제 (예 : 파클리탁셀 (aclitaxel) 또는 파클리탁셀 제제 (paclitaxel agent) ; (예 : Abraxane®), 도세탁셀 (docetaxel) ; 카보플라틴 (carboplatin) ; 토포테칸 (topotecan) ; 시스플라틴 (cisplatin) ; 이리노테칸 (irinotecan), 독소루비신 (doxorubicin), 레날리도마이드 (lenalidomide), 5-아자시티딘 (5-azacytidine), 이포스파미드 (ifosfamide), 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 페메트렉시드 디소듐(pemetrexed disodium), 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide), 에토포사이드 (etoposide), 데시타빈 (decitabine), 플루다 라빈 (fludarabine), 빈크리스틴 (vincristine), 벤다무스틴 (bendamustine), 클로람부실 (chlorambucil), 부설판 (busulfan), 젬시타빈 (gemcitabine), 멜팔란 (melphalan), 펜토스타틴 (pentostatin), 미톡산트론 (mitoxantrone), 페메트렉시드 디소듐(pemetrexed disodium)),티로신 키나제 억제제 (예 : EGFR 억제제 (예 : 에를로티닙 (erlotinib)), 멀티 키나제 억제제 (예 : MGCD265, RGB-286638), CD-20 표적화제 (예 : 리툭시맙 (rituximab), 오파투무맙 (ofatumumab), RO5072759, LFB-R603), CD52 표적화제 (예 : 알렘투주맙 (alemtuzumab)), 프레드니솔론 (prednisolone), 다베포에틴 알파 (darbepoetin alfa), 레날리도마이드 (lenalidomide), Bcl-2 억제제 (예 : 오블리머센 나트륨 (oblimersen sodium)), 오로라 키나제 억제제 (aurora kinase inhibitor) (예 : MLN8237, TAK-901), 프로테아 좀 억제제 (예 : 보르테조밉 (bortezomib)), CD-19 표적화제 (예 : MEDI-551, MOR208), MEK 억제제 (예 : ABT-348), JAK-2 억제제 (예 : INCB018424), mTOR 억제제 (예 : 템시롤리무스 (temsirolimus), 에베롤리무스 (everolimus)), BCR/ABL 억제제 (예 : 이마티닙 (imatinib)), ET-A 수용체 길항제 (예 : ZD4054), TRAIL 수용체 2 (TR-2) 작용제 (예 : CS-1008), HGF/SF 억제제 (예 : AMG 102), EGEN-001, 폴로 유사 키나제 1 억제제 (예 : BI 672).
제약 조성물 및 제제
또한, 항-OX40 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 항 -OX40 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약제학적 제형을 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 양태에서, 상기 조성물은 OX40에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 OX40에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 조성물은 당업계에 잘 알려진 완충제를 포함하는 약제 학적으로 허용되는 부형제와 같은 적합한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 OX40 항체 또는 항원 결합 단편의 제약 제제는 원하는 순도를 갖는 이러한 항체 또는 항원 결합 단편을 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용되는 담체 (Remington 's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합함으로 동결 건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 약제학상 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 이에 제한되지는 않으나, 다음을 포함한다: 인산염, 구연산염 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제 (옥타데실디메틸 벤질 암모늄 클로라이드 (octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride); 헥사메토늄 클로라이드 (hexamethonium chloride); 벤즈 알코늄 클로라이드 (benzalkonium chloride); 벤제토늄 클로라이드 (benzethonium chloride); 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테 콜 (catechol); 레조르시놀 (resorcinol); 사이클로헥산올 (cyclohexanol) ; 3-펜탄올 (3- pentanol) ; 및 m-크레졸 (m-cresol)과 같은); 저 분자량 (잔기 약 10 개 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린과 같은 단백질; 폴리 비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone)과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 포도당, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트 제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 (trehalose) 또는 소르비톨 (sorbitol)과 같은 당; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온 (salt-forming counter-ion); 금속 착물 (예 : Zn-단백질 착물); 및/또는 폴리에틸렌글리콜 (PEG)과 같은 비이온성 계면 활성제. 본원에서 예시적인 약제학상 허용되는 담체는 추가로 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당 단백질 (soluble neutral-active hyaluronidase glycoprotein) (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당 단백질 (human soluble PH-20 hyaluronidase glycoprotein), 예컨대 rHuPH20 (HYLENEX®, BaxterInternational, Inc.)과 같은 간질성 약물 분산제(interstitial drug dispersion)를 포함한다. rHuPH20을 포함하여, 특정 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 US Patents Nos. US 7,871,607 및 2006/0104968에 설명되어 있다. 일 관점에서, sHASEGP는 콘드로이티나제 (chondroitinase)와 같은 하나 이상의 추가 글리코 사미노글리카나제 (glycosaminoglycanase)와 조합된다.
예시적인 동결 건조 항체 제형은 US Patent No. 6,267,958에 기재되어 있다. 수성 항체 제형은 US Patent No. 6,171,586 및 WO 2006 / 044908에 기재된 것들을 포함하며, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
서방형 제제로 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체 (solid hydrophobic polymer)의 반투과성 매트릭스 (semipermeable matrice)를 포함하며, 상기 매트릭스는 예컨대 필름 또는 마이크로 캡슐과 같은 성형 물품 (shaped article)의 형태이다.
생체 내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 무균이다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
실시예
실시예 1: 항-OX40 단일 클론 항체의 생성
통상적인 하이브리도마 융합 기술 (de StGroth and Sheidegger, 1980 J Immunol Methods 35 : 1; Mechetner, 2007 Methods Mol Biol 378 : 1)을 약간 변형하여 항-OX40 단일 클론 항체를 생성하였다. 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA) 및 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석에서 결합 활성이 높은 항체를 추가 특성화를 위해 선택하였다.
면역화 및 결합 분석을위한 OX40 재조합 단백질
전장 인간 OX40 (서열번호 1)을 코딩하는 cDNA는 GenBank 서열 (수탁번호 : X75962.1)을 기반으로 Sino Biological (중국 베이징)에서 합성하였다. OX-40 (서열번호 2)의 아미노산 (AA) 1-216으로 구성된 신호 펩타이드 및 세포 외 도메인 (ECD)의 코딩 영역을 PCR-증폭하고, 마우스 IgG2a의 Fc 도메인, 인간 IgG1 야생형 중쇄의 Fc 도메인 또는 His- 태그에 융합된 C-말단으로 자체 개발된 발현 벡터에 클로닝하여 3개의 재조합 융합 단백질 발현 플라스미드인, OX40-mIgG2a, OX40-huIgG1 및 OX40-His를 각각 생성하였다. OX40 융합 단백질의 개략도는 도 1에 나타내었다. 재조합 융합 단백질 생산을 위해 OX40-mIgG2a, OX40-huIgG1 및 OX40-His 발현 플라스미드를 293G 세포에 일시적으로 형질감염시키고, 회전 교반기(rotating shaker)가 장착된 CO2 인큐베이터에서 7일 동안 배양하였다. 재조합 단백질을 함유하는 상청액을 수집하고 원심분리하여 제거하였다. OX40-mIgG2a 및 OX40-huIgG1은 Protein A 컬럼 (Cat : 17-5438-02, GE Life Sciences)을 사용하여 정제하였다. OX40-His는 Ni 세파로스 컬럼 (Cat : 17-5318-02, GE Life Science)을 사용하여 정제하였다. OX40-mIgG2a, OX40-huIgG 및 OX40-His 단백질을 인산염 완충 식염수 (PBS)에 대해 투석하고 작은 분취량(aliquot)으로 -80℃ 냉동고에 보관하였다.
안정적인 발현 세포주
전장의 인간 OX40 (OX40) 또는 사이노몰구스 원숭이(cynomolgus) OX40 (cynoOX40)을 발현하는 안정한 세포주를 생성하기 위해, 이들 유전자를 레트로바이러스 벡터 pFB-Neo (Cat : 217561, Agilent, USA)에 클로닝하였다. 레트로바이러스 형질도입은 종래 알려진 프로토콜을 기반으로 수행하였다 (Zhang et al., 2005). HuT78 및 HEK293 세포는 각각 인간 OX40 또는 cynoOX40을 함유하는 바이러스로 레트로바이러스로 형질도입되어 HuT78/OX40, HEK293/OX40 및 HuT78/cynoOX40 세포주를 생성하였다.
면역화, 하이브리도마 융합 및 클로닝
8 내지 12 주령 Balb/c 마우스 (HFK BIOSCIENCE CO., LTD, 중국 베이징)를 10㎍의 OX40-mIgG2a 및 Quick-Antibody Immuno-Adjuvant (Cat: KX0210041, KangBiQuan, 중국 베이징)을 함유하는 200 μL의 혼합 항원으로 복강 내 면역화하였다. 이 절차는 3 주간 반복되었다. 2차 면역화 후 2주에, 마우스 혈청을 이용하여 ELISA 및 FACS로 OX40 결합을 평가하였다. 혈청 스크리닝 10일 후, 항-OX40 항체 혈청 역가가 가장 높은 마우스를 10μg의 OX40-mIgG2a i.p. 주사로 부스팅하였다. 부스팅 3일 후, 비장 세포를 분리하고 표준 기술 (Somat Cell Genet, 1977 3: 231)을 사용하여 마우스 골수종 세포주 SP2/0 세포 (ATCC, Manassas VA)에 융합시켰다.
ELISA 및 FACS에 의한 항체의 OX40 결합 활성 평가
하이브리도마 클론의 상청액은 (Methods in Molecular Biology (2007) 378 : 33-52)에 설명된 바를 일부 변형하여, ELISA에 의해 초기 스크리닝되었다. 요약하면, OX40-His 단백질은 96-well plate에 4℃에서 밤새 코팅되었다. PBS/0.05% Tween-20으로 세척한 후, 플레이트를 PBS/3% BSA로 실온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 이어서, 플레이트를 PBS/0.05% Tween-20으로 세척하고 세포 상청액과 함께 실온에서 1 시간 동안 배양(incubate)하였다. HRP-링크된 항 마우스 IgG 항체 (Cat: 115035-008, Jackson ImmunoResearch Inc, Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ 단편 특이적임) 및 기질 (Cat : 00-4201-56, eBioscience, USA)을 사용하여 450nm의 파장에서 색 흡수 신호(color absorbance signal)를 발생시키고, 플레이트 리더(SpectraMax Paradigm, Molecular Devices/PHERAstar, BMG LABTECH)를 사용하여 측정하였다. 간접 ELISA를 사용한 융합 스크리닝에서 양성 모 클론(parental clone)을 수집하였다. ELISA-양성 클론은 위에서 설명한 HuT78/OX40 및 HuT78/cynoOX40 세포를 사용하여 FACS에 의해 추가로 확인하였다. OX40-발현 세포 (105 세포/웰)를 ELISA-양성 하이브리도마 상청액과 함께 인큐베이션 한 다음, Anti-Mouse IgG eFluor® 660 항체 (Cat : 50-4010-82, eBioscience, USA)와 결합시켰다. 유세포 분석기 (Guava easyCyte 8HT, Merck-Millipore, USA)를 사용하여 세포 형광을 정량화하였다.
ELISA 및 FACS 스크리닝 모두에서 양성 신호를 보인 하이브리도마로부터의 배양액(conditioned media)는 인간 면역 세포 기반 분석에서 우수한 기능적 활성을 갖는 항체를 확인하기 위해 기능적 분석에 적용되었다 (다음 섹션 참조). 원하는 기능적 활성을 갖는 항체를 추가로 서브 클로닝하고 특성화하였다.
서브클로닝 및 하이브리도마를 무 혈청 또는 저 혈청 배지에 적응
전술한 바와 같은 ELISA, FACS 및 기능 검정에 의한 1차 스크리닝 후, 클론 성(clonality)을 보장하기 위해 양성 하이브리도마 클론을 제한 희석(limiting dilution)에 의해 서브클로닝 하였다. 상위 항체 서브 클론은 기능적 분석에 의해 검증되었고 3% FBS를 포함하는 CDM4MAb 배지 (Cat : SH30801.02, Hyclone, USA)로 성장을 적응시켰다.
단일 클론 항체의 발현 및 정제
상위 항체 클론을 발현하는 하이브리도마 세포를 CDM4MAb 배지 (Cat : SH30801.02, Hyclone)에서 배양하고 37 ℃의 CO2 인큐베이터에서 5 - 7 일 동안 배양하였다. 배양액(conditioned media)을 원심 분리를 통해 수집하고 정제하기 전에 0.22 μm 멤브레인을 통과시켜 여과하였다. 상층액의 마우스 항체를 적용하고 제조업체의 지침에 따라 Protein A 컬럼 (Cat : 17-5438-02, GE Life Sciences)에 결합시켰다. 이 절차는 일반적으로 90% 이상의 순도로 항체를 산출하였다. 단백질 A- 친화도 정제된 항체를 PBS에 대해 투석하거나 필요한 경우 HiLoad 16/60 Superdex 200 컬럼 (Cat : 28-9893-35, GE Life Sciences)을 사용하여 추가로 정제하고 응집체(aggregates)를 제거하였다. 단백질 농도는 280 nm에서 흡광도를 측정하여 결정g하였다. 최종 항체 제제는 -80 ℃ 냉동고에서 분취량(aliquot)으로 저장되었다.
실시예 2 : 항-OX40 항체의 클로닝 및 서열 분석
제조업체의 프로토콜을 기반으로 Ultrapure RNA 키트 (Cat : 74104, QIAGEN, 독일)를 사용하여 총 세포 RNA를 제조하기 위해 마우스 하이브리도마 클론을 수확하였다. Invitrogen의 cDNA 합성 키트 (Cat : 18080-051)를 사용하여 첫번째 가닥 cDNA를 합성하고, PCR 키트 (Cat : CW0686, CWBio, 중국 베이징)를 사용하여 하이브리도마 항체의 VH 및 VL을 PCR 증폭하였다. 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)의 항체 cDNA 클로닝에 사용된 올리고 프라이머는 이전에 보고된 서열 (Brocks et al. 2001 Mol Med 7 : 461)을 기반으로 Invitrogen (중국 베이징)에 의해 합성되었다. PCR 산물을 시퀀싱에 직접 사용하거나 pEASY-Blunt 클로닝 벡터 (Cat : CB101 TransGen, China)에 서브클로닝 한 다음 Genewiz (중국 베이징)에 의해 시퀀싱하였다. VH 및 VL 영역의 아미노산 서열을 DNA 시퀀싱 결과에서 추론하였다.
마우스 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)은 Kabat (Wu 및 Kabat 1970 J. Exp. Med. 132 : 211-250) 시스템을 기반으로 서열 주석(sequence annotation) 및 컴퓨터 프로그램 서열 분석에 의해 정의되었다. 대표적인 상위 클론 Mu445 (VH 및 VL)의 아미노산 서열을 표 1 (서열번호 9 및 11)에 나열하였다. Mu445의 CDR 서열은 표 2 (서열번호 3-8)에 나열되어 있다.
Mu445 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열
Mu445 VH 서열번호 9 EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYKFTSYIIHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTRYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMEYSSLTSEDSAVYYCARGYYGSSYAMDYWGQGTSVTVSS
Mu445 VL 서열번호 11 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTIKLLIYDTSTLYSGVPSRFSGSGSGTDYFLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEKK
마우스 단일 클론 항체 Mu445 VH 및 VL 영역의 CDR 서열 (아미노산)
항체 서열번호 CDR 서열
Mu445 서열번호 3 HCDR1 (Kabat) SYIIH
서열번호 4 HCDR2 (Kabat) YINPYNDGTRYNEKFKG
서열번호 5 HCDR3 (Kabat) GYYGSSYAMDY
서열번호 6 LCDR1 (Kabat) SASQGISNYLN
서열번호 7 LCDR2 (Kabat) DTSTLYS
서열번호 8 LCDR3 (Kabat) QQYSKLPYT
실시예 3 : 마우스 항-인간 OX40 항체 445의 인간화
항체 인간화 및 엔지니어링
Mu445의 인간화를 위하여, IMGT에서 인간 면역 글로불린 유전자 데이터베이스에 대한 서열 비교에 의해 Mu445 가변 영역의 cDNA 서열에 대해 높은 정도의 상 동성을 공유하는 서열을 인간 생식 계열 IgG 유전자에서 검색하였다. 높은 빈도로 인간 항체 레퍼토리 (Glanville et al., 2009 PNAS 106 : 20216-20221)에 존재하고 Mu445와 매우 상동성이 높은 인간 IGHV 및 IGKV 유전자를 인간화를 위한 주형으로 선택하였다.
인간화는 CDR-이식 (Methods in Molecular Biology, Antibody Engineering, Methods and Protocols, Vol 248 : Humana Press)에 의해 수행되었으며 인간화 항체는 자체 개발된 발현 벡터를 사용하여 인간 IgG1 야생형 형식(format)으로 조작되었다. 인간화의 초기 라운드에서, 프레임워크 영역에서 마우스에서 인간 아미노산 잔기로의 돌연변이는 시뮬레이션 된 3D 구조 분석에 의해 가이드 되었으며, CDR의 표준 구조(canonical structures)를 유지하는데 구조적으로 중요한 마우스 프레임워크 잔기는 인간화 항체 445의 첫 번째 버전에서 유지되었다 (445-1, 표 3 참조). 445-1의 6개의 CDR은 HCDR1 (서열번호 3), HCDR2 (서열번호 13), HCDR3 (서열번호 5) 및 LCDR1 (서열번호 6), LCDR2 (서열번호 7) 및 LCDR3 (서열번호 8)의 아미노산 서열을 가진다. 445-1의 중쇄 가변 영역은 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 (VH) 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변 영역은 (VL) 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 서열번호 16을 갖는다. 구체적으로, Mu445의 LCDR (서열번호 6-8)은 2 개의 마우스 프레임워크 잔기(I44 및 Y71)가 유지된 인간 생식 계열 가변 유전자 IGVK1-39의 프레임워크에 이식되었다 (서열번호 16). HCDR1 (서열번호 3), HCDR2 (서열번호 13) 및 HCDR3 (서열번호 5)은 두 개의 마우스 프레임워크 잔기(L70 및 S72) 가 유지된 인간 생식 계열 가변 유전자 IGHV1-69의 프레임워크에 이식되었다 (서열 번호 14). 시뮬레이션 된 3D 구조에 따라 N-말단 절반만 항원 결합에 중요한 것으로 예측된 바, 상기 445 인간화 변이체 (445-1)에서 Kabat HCDR2의 N-말단 절반만 이식되었다.
445-1은 쉽게 적응하는(adapting) 서브클로닝 부위로 인간 야생형 IgG1 (IgG1wt) 및 카파 쇄의 불변 영역을 각각 포함하는 자체 개발된 발현 벡터를 사용하여 인간화 전장 항체(humanized full-length antibody)로 구축되었다. 445-1 항체는 위의 두 구출물(construct)를 293G 세포로 공동 형질감염하여 발현시키고 단백질 A 컬럼 (Cat : 17-5438-02, GE Life Sciences)을 사용하여 정제하였다. 정제 된 항체를 PBS에서 0.5-10 mg/mL로 농축하고 -80℃ 냉동고에 분취량으로 보관하였다.
445-1 항체를 사용하여, VH 및 VL의 프레임워크 영역에 남아있는 마우스 잔기를 VL의 I44P 및 Y71F 및 VH의 L70I 및 S72A와 같은 상응하는 인간 생식 계열 잔기로 전환함으로써, 몇 가지 단일 아미노산 변화(change)가 이루어졌다. 또한, 잠재적인 이성질화 위험(isomerization risk)을 줄이고 인간화 레벨을 높이기 위하여 CDR에서 몇 가지 단일 아미노산 변화가 이루어졌다. 예를 들어, T51A 및 D50E의 변경(alteration)은 LCDR2에서 이루어졌으며 D56E, G57A 및 N61A 변경은 HCDR2에서 이루어졌다. 모든 인간화 변경은 특정 위치에 돌연변이를 함유하는 프라이머와 부위 지정 돌연변이 유발 키트 (Cat : AP231-11, TransGen, Beijing, China)를 사용하여 이루어졌다. 원하는 변화 여부는 시퀀싱으로 확인하였다.
445-1 항체의 아미노산 변화는 OX40에 대한 결합 및 열 안정성으로 평가되었다. 서열번호 3의 HCDR1, 서열번호 18의 HCDR2, 서열번호 5의 HCDR3, 서열번호 6의 LCDR1, 서열번호 19의 LCDR2 및 서열번호 8의 LCDR3을 포함하는 항체 445-2는 위에서 설명한 특정 변경의 조합으로 구축되었다 (표 3 참조). 두 항체를 비교한 결과,항체 445-2 및 445-1 모두 유사한 결합 친화도를 나타내었다 (하기 표 4 및 표 5 참조).
445-2 항체로 시작하여, VL의 프레임워크 영역에서 몇 가지 추가 아미노산 변화를 만들어, 예를 들어 아미노산 G41D 및 K42G의 변경으로, 결합 친화도/동역학을 추가로 개선하였다. 또한 면역원성 위험을 낮추고 열 안정성을 높이기 위해, 예를 들어 LCDR1의 S24R과 HCDR2의 A61N와 같이, VH와 VL의 CDR에서 몇 가지 단일 아미노산 변경이 이루어졌다. 변화의 결과는 445-2에 비해 향상된 결합 활성 또는 열 안정성을 보여주었다.
인간화 445 항체는 CDR 및 프레임워크 영역에 특정 아미노산 변화를 도입하여 추가로 조작하여, 인간에서 치료 용도로 사용하기 위한 분자 및 생물 물리적 특성을 개선하였다. 고려된 사항에는 결합 활성을 유지하면서 유해한 번역 후 변형 의 제거, 열 안정성 (Tm), 표면 소수성 및 등전자점 (pI)의 개선이 포함되었다.
서열번호 3의 HCDR1, 서열번호 24의 HCDR2, 서열번호 5의 HCDR 3, 서열번호 25의 LCDR1, 서열번호 19의 LCDR2, 서열번호 8의 LCDR3를 포함하는 (표 3 참조), 인간화 모노클로날 항체 445-3은 상기 기재된 성숙 과정으로부터 구축되고, 상세하게 특성화되었다. 항체 445-3은 또한 인간 IgG2의 야생형 중쇄의 Fc 도메인을 포함하는 IgG2 버전 (445-3 IgG2) 및 S228P 및 R409K 돌연변이를 갖는 인간 IgG4의 Fc 도메인을 포함하는 IgG4 버전(445-3 IgG4)으로 만들어졌다. 그 결과는 445-3 및 445-2가 유사한 결합 친화도를 나타냄을 보여주었다 (표 4 및 표 5 참조).
445 항체 서열
항체 서열번호 서열
445-1 서열번호 3 HCDR1 (Kabat) SYIIH
서열번호 13 HCDR2 (Kabat) YINPYNDGTRYNQKFQG
서열번호 5 HCDR3 (Kabat) GYYGSSYAMDY
서열번호 6 LCDR1 (Kabat) SASQGISNYLN
서열번호 7 LCDR2 (Kabat) DTSTLYS
서열번호 8 LCDR3 (Kabat) QQYSKLPYT
서열번호 14 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYKFTSYIIHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGTRYNQKFQGRVTLTSDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYYGSSYAMDYWGQGTTVTVSS
서열번호 16 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQKPGKAIKLLIYDTSTLYSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYSKLPYTFGGGTKVEIK
445-2 서열번호 3 HCDR1 (Kabat) SYIIH
서열번호 18 HCDR2 (Kabat) YINPYNEGTRYAQKFQG
서열번호 5 HCDR3 (Kabat) GYYGSSYAMDY
서열번호 6 LCDR1 (Kabat) SASQGISNYLN
서열번호 19 LCDR2 (Kabat) DASTLYS
서열번호 8 LCDR3 (Kabat) QQYSKLPYT
서열번호 20 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYKFTSYIIHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNEGTRYAQKFQGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYYGSSYAMDYWGQGTTVTVSS
서열번호 22 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQKPGKAIKLLIYDASTLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSKLPYTFGGGTKVEIK
445-3 서열번호 3 HCDR1 (Kabat) SYIIH
서열번호 24 HCDR2 (Kabat) YINPYNEGTRYNQKFQG
서열번호 5 HCDR3 (Kabat) GYYGSSYAMDY
서열번호 25 LCDR1 (Kabat) RASQGISNYLN
서열번호 19 LCDR2 (Kabat) DASTLYS
서열번호 8 LCDR3 (Kabat) QQYSKLPYT
서열번호 26 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYKFTSYIIHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNEGTRYNQKFQGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYYGSSYAMDYWGQGTTVTVSS
서열번호 28 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLNWYQQKPDGAIKLLIYDASTLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSKLPYTFGGGTKVEIK
실시예 4: SPR에 의한 항-OX40 항체의 결합 동역학 및 친화도 결정
항-OX40 항체의 결합 동역학 및 친화도가 BIAcore ™ T-200 (GE Life Sciences)을 사용한 SPR 분석에 특성화되었다. 간략히 설명하면, 항-인간 IgG 항체는 활성화된 CM5 바이오센서 칩 (Cat : BR100530, GE Life Sciences)에 고정하였다. 인간 IgG Fc 영역을 갖는 항체를 칩 표면에 흘려 보내 항 인간 IgG 항체에 포획하였다. 그런 다음 His 태그가 있는 재조합 OX40 단백질(Cat : 10481-H08H, Sino Biological)의 연속 희석액을 칩 표면에 흘려 보내고 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화를 분석하고 일대일 Langmuir 바인딩 모델 (BIA 평가 소프트웨어, GE Life Sciences)을 사용하여 결합 속도 (ka) 및 해리 속도 (kd)를 계산하였다. 평형 해리 상수 (KD)는 비율 kd/ka로 계산되었다. 항-OX40 항체의 SPR-결정된 결합 프로파일의 결과는 도 2와 표 4에 요약되어 있다. 항체 445-3의 평균 KD의 결합 프로파일(9.47 nM)은 항체 445-2 (13.5 nM) 및 445-1 (17.1 nM)보다 약간 더 나은 것으로 나타났고, ch445와 유사하게 나타났다. 445-3 IgG4의 결합 프로파일은 445-3 (IgG1 Fc 포함)과 유사하여, 이는 IgG4와 IgG1 간의 Fc에서의 변화가 445-3 항체의 특이적 결합을 변경하지 않았음을 나타내었다.
SPR에 의한 항-OX40 항체의 결합 친화도
Test Parameters ch445* 445-1 445-2 445-3 445-3 IgG4
Test 1 ka (M -1 s -1 ) 1.74 x 105 1.56 x 105 2.76 x 105 1.82 x 105 1.61 x 105
kd (s -1 ) 1.43 x 10-3 2.77 x 10-3 3.90 x 10-3 1.67 x 10-3 1.61 x 10-3
K D (nM) 8.26 17.8 14.2 9.16 10.0
K A (M -1 ) 1.22 x 108 0.56 x 108 0.71 x 108 1.09 x 108 1.00 x 108
Test 2 ka (M -1 s -1 ) 2.65 x 105 2.37 x 105 2.06 x 105 1.63 x 105 _
kd (s -1 ) 1.67 x 10-3 3.89 x 10-3 2.64 x 10-3 1.59 x 10-3 _
K D (nM) 6.3 16.4 12.8 9.77 _
K A (M -1 ) 1.59 x 108 0.61 x 108 0.78 x 108 1.03 x 108 _
Mean K D (nM) 7.28 17.1 13.5 9.47 10.0
K A (M -1 ) 1.41 x 108 0.59 x 108 0.75 x 108 1.06 x 108 1.00 x 108
* ch445는 인간 IgG1wt/카파 불변 영역에 융합된 Mu445 가변 도메인을 포함한다.
실시예 5 : HuT78 세포에서 발현된 OX40에 대한 항-OX40 항체의 결합 친화도 결정
살아있는 세포 표면에 발현된 OX40에 결합하는 항-OX40 항체의 결합 활성을 평가하기 위해, HuT78 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 인간 OX40으로 형질감염시켜 OX40 발현 라인을 생성하였다. 살아있는 HuT78/OX40 세포를 96-웰 플레이트에 접종하고 다양한 항-OX40 항체의 연속 희석(seiral dilution)과 함께 배양하였다. 염소 항-인간 IgG-FITC (Cat: A0556, Beyotime)를 이차 항체로 사용하여 세포 표면에 결합하는 항체를 검출하였다. 인간 OX40에 대한 용량 의존적 결합에 대한 EC50 값은 용량-반응 데이터(dose-response data)를 GraphPad Prism과 함께 4-파라미터 로지스틱 모델(four-parameter logistic model)에 적용(fitting)하여 결정하였다. 도 3과 표 5에서 볼 수 있듯이, OX40 항체는 OX40에 대해 높은 친화도를 가지는 것으로 나타났다. 또한, 본 발명의 OX40 항체는 유동 세포 측정법에 의해 측정된 상대적으로 더 높은 최고 수준의 형광 강도를 가지는 것으로 나타난 바 (표 5의 마지막 컬럼 참조), 이로부터 OX40로부터 항체가 더 느리가 해리되는 것을 알 수 있었고, 즉, 더 바람직한 결합 프로파일을 나타내는 것을 알 수 있었다.
인간화 된 445 변이체의 OX40에 대한 용량 의존적 결합의 EC50
Antibody EC 50 (μg/mL) Top (MFI)
Test 1 Test 2 Mean Mean
ch445 0.321 0.277 0.299 725
445-1 0.293 0.278 0.285 525
445-2 0.323 0.363 0.343 620
445-3 0.337 0.319 0.328 910
445-3 IgG4 0.263 N/A 0.263 892
실시예 6 : 항-OX40 항체의 교차 반응성 (cross reactivity) 결정
인간 및 사이노몰구스 (cyno) 원숭이 OX40에 대한 항체 445-3의 교차 반응성을 평가하기 위해, 인간 OX40 (HuT78/OX40) 및 사이노 OX40 (HuT78/cynoOX40)을 발현하는 세포를 96 웰 플레이트에 접종하고, 연속 희석된 OX40 항체와 함께 배양하였다. 검출을 위한 2 차 항체로 염소 항-인간 IgG-FITC (Cat: A0556, Beyotime)를 사용하였다. 인간 및 사이노몰구스 원숭이 천연 OX40(native OX40)에 대한 용량 의존적 결합에 대한 EC50 값을 용량-반응 데이터를 GraphPad Prism과 함께 4-파라미터 로지스틱 모델에 적용하여 결정하였다. 그 결과는 도 4와 표 6에 나타내었다. 항체 445-3은 인간 및 사이노몰구스 원숭이 OX40 모두와 교차 반응하며, 아래에 표시된 것과 유사한 EC50 값을 나타내었다.
인간 및 사이노몰구스 원숭이 OX40에 결합하는 항체 445-3의 EC50
Cell line EC 50 (ug/mL)of445-3 Top (MFI)
HuT78/OX40 0.174 575
HuT78/cynoOX40 0.171 594
실시예 7 : 445-3 Fab를 사용한 OX40의 공-결정화(Co-crystallization) 및 구조 결정(structural determination)
본 발명의 항체에 대한 OX40의 결합 메커니즘을 이해하기 위하여, OX40과 445-3의 Fab의 공-결정 구조가 확인되었다. 잔기 T148 및 N160에서의 돌연변이를 도입하여 OX40의 글리코실화를 차단하고 단백질의 균질성(homogeneity)을 향상시켰다. 돌연변이 인간 OX40 (두 개의 돌연변이 부위 T148A 및 N160A가 있는 잔기 M1-D170)을 인코딩하는 DNA를 hexa-His 태그를 포함하는 발현 벡터로 클로닝하고, 이 구축물을 단백질 발현을 위해 293G 세포에 일시적으로 형질감염 시켜 37 ℃에서 7 일간 배양하였다. 세포를 수확하고 상층액을 수집하여 His tag 친화성 수지와 함께 4 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 수지를 20 mM Tris, pH 8.0, 300 mM NaCl 및 30 mM 이미다졸을 함유하는 완충액으로 세 번 세척하였다. OX40 단백질을 20 mM Tris, pH 8.0, 300 mM NaCl 및 250 mM 이미다졸을 함유하는 완충액으로 용출한 다음, 20 mM Tris, pH 8.0, 100 mM NaCl을 포함하는 완충액에서 Superdex 200 (GE Healthcare)으로 추가 정제하였다.
445-3 Fab의 중쇄 및 경쇄의 코딩 서열은 중쇄의 C-말단에 hexa-His 태그가 포함된 발현 벡터로 클로닝되었고, 이들은 단백질 발현을 위해 293G 세포에 일시적으로 공동 형질감염시켜(transiently co-transfected) 37 ℃에서 7 일간 배양하였다. 445-3 Fab의 정제 단계는 위의 돌연변이 OX40 단백질에 사용된 것과 동일하였다.
정제된 OX40 및 445-3 Fab를 1:1의 몰비로 혼합하고 얼음에서 30 분 동안 인큐베이션 한 다음, 20 mM Tris, pH 8.0, 100 mM NaCl을 함유하는 버퍼에서 Superdex 200 (GE Healthcare)으로 추가 정제하였다. 복합 피크(complex peak)를 수집하고 대략 30mg/ml로 농축하였다.
공-결정 스크린(co-crystal screen)은 단백질 복합체와 저장 용액(reservoir solution)을 1:1의 부피비로 혼합하여 수행하였다. 공-결정은 0.1 M HEPES, pH 7.0, 1% PEG 2,000 MME 및 0.95 M 나트륨 숙신산 염(sodium succinate)을 포함하는 저장 용액으로 증기 확산(vapor diffusion)에 의해 20℃에서 배양된 매달린 방울( hanging drop)로부터 얻어졌다.
나일론 루프를 사용하여 공-결정을 수확하고 결정을 10초 동안 20% 글리세롤이 보충된 저장 용액에 담궈 주었다. 회절 데이터(Diffraction data)는 상하이 싱크로트론 방사선 시설(Shanghai Synchrotron Radiation Facility)인 BL17U1에서 수집되어 XDS 프로그램으로 처리되었다. 상(phase)은 분자 대체 검색 모델로 IgG Fab의 구조(PDB의 사슬 C 및 D : 5CZX) 및 OX40의 구조 (PDB의 사슬 R : 2HEV)를 사용하여 프로그램 PHASER로 해결하였다. Phenix.refine 그래픽 인터페이스를 사용하여 강체(rigid body), TLS 및 X-ray 데이터에 대한 제한적 미세 조정(restrained refinement)을 수행한 다음 COOT 프로그램으로 조정하고 Phenix.refine 프로그램에서 추가 미세 조정을 수행하였다. X-ray 데이터 수집 및 미세조정 통계는 표 7에 요약되어 있다.
데이터 수집 및 개선 통계
Data collection
Beamline BL17U1, SSRF
Space group P 31 2 1
Cell dimensions (Å) a=183.96 b=183.96 c=79.09
Angles (°) α=90.00 β=90.00 γ=120.00
Resolution (Å) 159.3-2.55 (2.63-2.55)
Total number of reflections 988771 (81305)
Number of unique reflections 50306 (4625)
Completeness (%) 99.9 (99.9)
Average redundancy 19.7 (17.6)
Rmergea 0.059 (0.962)
I/sigma (I) 29.4 (3.5)
Wilson B factor (Å) 73.9
Refinement
Resolution (Å) 60.22-2.55
Number of reflections 50008
rmsd bond lengths (Å) 0.010
rmsd bond angles (°) 0.856
Rwork b(%) 19.27
Rfree c(%) 21.60
Average B-factors of protein 97.10
Ramachandran plot (%)
Favored 96.34
Allowed 3.48
Outliers 0.17
괄호 안의 값은 가장 높은 해상도의 쉘을 나타낸다.
a Rmerge=
Figure pct00002
, 여기서
Figure pct00003
는 등가(equivalent)의 평균 강도이다.
b Rwork=
Figure pct00004
, 여기서 Fo 및 Fc는 각각 관찰 및 계산된 구조 인자 진폭(structure factor amplitude)이다.
c Rfree=
Figure pct00005
, 관찰된 반영(reflection)에서 무작위로 선택된 총 데이터 중 5%의 테스트 데이터 세트를 사용하여 계산하였다.
실시예 8 : SPR에 의한 항체 445-3의 에피토프 식별
OX40 및 항체 445-3 Fab의 공-결정 구조에 따라, 인간 OX40 단백질에서 일련의 단일 돌연변이를 선택하여 생성하고 본 발명의 항-OX40 항체의 주요 에피토프를 추가로 확인하였다. 단일 점 돌연변이는 부위 지정 돌연변이 유발 키트 (Cat : AP231-11, TransGen)를 사용하여 인간 OX40/IgG1 융합 구축물로 만들어졌다. 원하는 돌연변이는 시퀀싱에 의해 확인되었다. OX40 돌연변이체의 발현 및 제조는 293G 세포로의 형질감염에 의해 달성되었고 단백질 A 컬럼 (Cat : 17-5438-02, GE Life Sciences)을 사용하여 정제되었다.
BIAcore 8K (GE Life Sciences)를 사용한 SPR 분석에 의해 OX40 점 돌연변이 체의 445-3 Fab에 대한 결합 친화도를 특성화하였다. 요약하면, OX40 돌연변이체와 야생형 OX40을 EDC 및 NHS를 사용하여 CM5 바이오 센서칩 (Cat : BR100530, GE Life Sciences)에 고정하였다. 이후, HBS-EP + 버퍼 (Cat : BR-1008-26, GE Life Sciences)에 445-3 Fab를 연속 희석하여 30 μl/min에서 180초의 접촉 시간과 600초의 해리 시간을 사용하여 칩 표면에 흘려보냈다. 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화를 분석하여 일대일 랭 뮤어 결합 모델 (one-to-one Langmuir binding model (BIA Evaluation Software, GE Life Sciences))을 사용하여 결합율 (association rate) (ka) 및 해리율 (dissociation rate) (kd)을 계산하였다. 평형 해리 상수 (KD)는 kd/ka 비율로 계산되었다. 돌연변이체의 KD 시프트 폴드(KD shift fold)는 돌연변이체 KD / WT KD (Mutant KD/WT KD) 비율로 계산되었다. SPR에 의해 결정된 에피토프 식별 프로파일은 도 5 및 표 8에 요약되어 있다. 그 결과는 OX40에서 잔기 H153, I165 및 E167의 알라닌으로의 돌연변이가 OX40에 대한 항체 445-3 결합을 현저하게 감소시켰고, 잔기 T154 및 D170의 알라닌으로의 돌연변이가 OX40에 대한 항체 445-3 결합을 일부 감소(moderate reduction)시킴을 나타내었다.
항체 445-3과 OX40의 잔기 H153, T154, I165, E167 및 D170 간의 세밀한 상호작용(detailed interaction)은 도 6에 나타난 바와 같다. OX40의 H153의 측쇄는 상호작용 인터페이스에서 445-3의 작은 포켓으로 둘러싸여 있으며 heavyS31 및 heavyG102와 함께 수소 결합을 형성하고 heavyY101과 함께 pi-pi 적층(stacking)을 형성하였다. E167의 측쇄는 heavyY50 및 heavyN52와 수소 결합을 형성하는 반면, D170은 각각 heavyS31 및 heavyK28과 수소 결합 및 염 다리(salt bridge)를 형성하여 복합체를 더욱 안정화시킬 수 있었다. T154와 heavyY105, I165 및 heavyR59 사이의 Van der Waals (VDW) 상호작용은 OX40에 대한 항체 445-3의 높은 친화도에 기여하였다.
결론적으로, OX40의 잔기 H153, I165 및 E167은 항체 445-3과 상호작용하는 중요한 잔기로 확인되었다. 또한 OX40의 아미노산 T154와 D170은 항체 445-3의 중요한 접촉 잔기(contact residues)이기도 하다. 이 데이터는 항체 445-3의 에피토프는 OX40의 잔기 H153, T154, I165, E167 및 D170임을 나타낸다. 이들 에피토프는 HT LQPASNSSDA I C E DR D (서열번호 30)의 서열에 존재하며 중요한 접촉 잔기는 볼드체 및 밑줄로 표시되었다.
SPR에 의해 결정된 항체 445-3의 에피토프 식별
Mutants Mutant K D /WTK D
H153A No binding was detected
T154A 8
Q156A 1.9
S161A 1.1
S162A 0.6
I165A 28
E167A 135
D170A 8
중대한 영향 (Significant impact) : 결합이 감지되지 않았거나, 돌연변히 KD/WT KD의 값이 10보다 크게 나타났다. 중간 영향 (Moderate impact) : 돌연변이 KD/WT KD는 5에서 10 사이로 평가되었다. 중요하지 않은 영향 (Non-significant impact) : Mutant KD / WT KD의 값이 5보다 작았다.
실시예 9 : 항-OX40 항체 445-3은 OX40-OX40L 상호작용을 차단하지 않음
항체 445-3이 OX40-OX40L 상호작용을 방해하는지 여부를 결정하기 위해, 세포 기반 유세포 분석이 확립되었다. 이 분석에서는, 항체 445-3, 참조 항체 1A7.gr1, 대조군 huIgG 또는 배지 단독으로 마우스 IgG2a Fc (OX40-mIgG2a)와 함께 인간 OX40 융합 단백질과 사전 인큐베이션하였다. 상기 항체 및 융합 단백질 복합체를 OX40L-발현 HEK293 세포에 첨가하였다. OX40 항체가 OX40-OX40L 상호작용을 방해하지 않는다면, 상기 OX40 항체-OX40 mIgG2a 복합체는 여전히 표면 OX40L에 결합할 것이며,이 상호작용은 항-마우스 Fc 2 차 항체를 사용하여 검출할 수 있다.
도 7에 도시 된 바와 같이, 항체 445-3은 고농도에서도 OX40의 OX40L에 대한 결합을 감소시키지 않았으며, 이는 445-3이 OX40-OX40L 상호작용을 방해하지 않음을 나타낸다. 이는 445-3이 OX40L 결합 부위에서 결합하지 않거나 OX40L 결합을 입체적으로 방해할 만큼 충분히 가깝게 결합하지 않음을 나타낸다. 대조적으로, 양성 대조군 항체인 1A7.gr1은 도 7에서와 같이, OX40L에 대한 OX40 결합을 완전히 차단한다.
또한, 445-3 Fab와의 복합체에서 OX40의 공 결정 구조(co-crystal structure)를 확인하고 도 8에서와 같이 OX40 / OX40L 복합체 (PDB 코드 : 2HEV)와 정렬하였다. OX40 리간드 삼량체(trimer)는 주로 OX40의 CRD1 (시스테인 풍부 도메인), CRD2 및 부분적인 (partial) CRD3 영역을 통해 OX40과 상호작용하는 반면(Compaan and Hymowitz, 2006), 항체 445-3은 오직 CRD4 영역을 통해서만 OX40과 상호작용 한다. 요약하면, 445-3 항체 및 OX40L 삼량체는 OX40의 각기 다른 영역(different respective region)에서 결합하고 항체 445-3은 OX40/OX40L 상호작용을 방해하지 않는다. 이 결과는 위의 실시예에서 설명된 에피토프 매핑 데이터와 관련이 있다. OX40의 CRD4는 아미노산 127-167에 있으며 항체 445-3의 에피토프는이 영역과 부분적으로 오버랩된다. OX40 CRD4 (아미노산 127-167)의 서열이 아래에 나타나 있으며, 445-3 에피토프의 부분적인 오버랩은 볼드체 및 밑줄로 표시되었다: PCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK HT LQPASNSSDA I C E (서열번호: 31).
실시예 10 : 항-OX40 항체 445-3의 항진 (agonist) 활성
항체 445-3의 항진제 기능을 조사하기 위하여, 445-3 또는 1A7.gr1의 존재 또는 부재 조건에서 OX40 양성 T 세포주인 HuT78 / OX40을 인공 항원 제시 세포주 (APC) (HEK293 / OS8low-FcγRI)와 밤새 공동배양 하였고, IL-2 생산을 T 세포 자극(T-cell stimulation)에 대한 판독(readout)으로 사용하였다. HEK293/OS8Low-FcγRI 세포에서 막 결합된 항-CD3 항체 OKT3 (OS8) (미국 특허번호 8,735,553에 개시됨) 및 인간 FcγRI (CD64)를 코딩하는 유전자가 HEK293 세포로 안정적으로 동시 형질도입되었다. 항-OX40 항체 유도 면역 활성화는 항체 가교에 의존적이기 때문에 (Voo et al., 2013), HEK293/OS8Low-FcγRI의 FcγRI는 OX40 및 FcγRI 모두에 대한 항-OX40 항체의 이중 결합 (dual engagement)시 OX40의 항-OX40 항체 매개 가교를 위한 기초를 제공한다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 항-OX40 항체 445-3은 0.06 ng/ml의 EC50을 가지며, 용량 의존적 방식으로 TCR 신호 전달을 매우 강력히 강화였다. 참조 Ab 1A7.gr1의 약간 더 약한 활성도 관찰되었다. 대조적으로, 대조군 인간 IgG (10μg / mL) 또는 블랭크는 IL-2 생산에 영향을 미치지 않았다.
실시예 11 : 혼합 림프구 반응 (MLR) 분석에서 항-OX40 항체 445-3 촉진 면역 반응
항체 445-3이 T 세포 활성화를 자극할 수 있는지 결정하기 위해, 혼합 림프구 반응 (mixed lymphocyte reaction, MLR) 분석이 종래 설명된대로 세팅되었다 (Tourkova et al., 2001). 간단히 말해서, 성숙 DC는 GM-CSF 및 IL-4와의 배양에 의해 인간 PBMC 유래 CD14+ 골수 세포로부터 유도되었으며, 뒤이어 LPS 자극되었다. 다음으로, 미토마이신 C-처리된 DC를 2 일 동안 항-OX40 445-3 항체 (0.1-10 μg/ml)의 존재하에 동종 (allogenic) CD4+ T 세포와 공동 배양하였다. 공동 배양에서 IL-2 생산은 MLR 반응의 판독으로 ELISA에 의해 검출되었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 항체 445-3은 IL-2 생산을 상당히 촉진시켰으며, 이는 445-3이 CD4+ T-세포를 활성화시키는 능력을 나타낸다. 대조적으로, 참조 항체 1A7.gr1은 MLR 분석에서 유의하게 (P<0.05) 약한 활성을 나타내었다.
실시예 12 : 항-OX40 항체 445-3은 ADCC 활성을 나타냄
항체 445-3이 OX40Hi 발현 표적 세포를 죽일 수 있는지 여부를 조사하기 위하여, 젖산 탈수소 효소 (LDH) 방출 기반 ADCC 분석이 세팅되었다. NK92MI/CD16V 세포주는 CD16v158 (V158 대립 유전자) 및 FcRγ 유전자를 NK 세포주 NK92MI (ATCC, Manassas VA)로 공동 형질 도입함으로써 이펙터 세포로서 생성되었다. OX40 발현 T 세포주인 HuT78/OX40을 표적 세포로 사용하였다. 항-OX40 항체 (0.004-3 μg/ml) 또는 대조군 Ab의 존재하에 동일한 수 (3x104)의 표적 세포 및 이펙터 세포를 5 시간 동안 공동 배양하였다. CytoTox 96 비방사성 세포 독성 분석 키트 (CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit) (Promega, Madison, WI)를 사용하여 LDH 방출에 의해 세포 독성을 평가하였다. 특이적 용해(Specific lysis)는 아래의 공식에 의해 계산되었다:
Figure pct00006
도 11에 나타낸 바와 같이, 항체 445-3은 용량 의존적 방식 (EC50 : 0.027 μg/mL)으로 ADCC를 통해 OX40Hi 표적을 죽이는 데 높은 효능을 나타냈다. 항체 445-3의 ADCC 효과는 1A7.grl 대조 항체의 효과와 유사했다. 대조적으로, S228P 및 R409K 돌연변이가 있는 IgG4 Fc 형식의 445-3 (445-3-IgG4)은 대조군 인간 IgG 또는 블랭크와 비교하여 어떠한 중요한 ADCC 효과도 나타내지 않았다. 이 결과는 IgG4 Fc가 ADCC에 약하거나(weak) 침묵한다(silent)는 이전 발견과 일치한다 (An Z, et al. mAbs 2009).
실시예 13 : 항-OX40 항체 445-3은 시험관 내에서 우선적으로 CD4 + Tregs를 고갈시키고 CD8 + Teff/Treg 비율을 증가시킨다.
항-OX40 항체가 종양 침윤 OX40Hi Tregs를 고갈시키고 Tregs에 대한 CD8 + T 세포의 비율을 증가시킬 수 있다는 것이 여러 동물 종양 모델에서 밝혀졌다 (Bulliard et al., 2014; Carboni et al., 2003; Jacquemin et al., 2015; Marabelle et al., 2013b). 결과적으로 면역 반응이 향상되어 종양을 퇴행시키고 생존율이 향상되었다.
시험관 내 활성화 또는 종양 내 CD4+Foxp3+ Tregs가 다른 T 세포 서브 세트보다 OX40을 우선적으로 발현한다는 사실에 기초하여 (Lai et al., 2016; Marabelle et al., 2013b; Montler et al., 2016; Soroosh et al., 2007; Timperi et al., 2016), OX40Hi 세포, 특히 Tregs를 죽이는 항체 445-3의 능력을 조사하기 위해 인간 PBMC 기반 분석이 세팅되었다. 간단히 말해서, PBMC는 OX40 발현 유도를 위해 PHA-L (1 ㎍/mL)에 의해 1 일 동안 사전 활성화되었고 표적 세포로 사용되었다. 이어서, 이펙터 NK92MI/CD16V 세포 (실시예 12에 기재된 바와 같음, 5x104)를 항-OX40 항체 (0.001-10 μg/mL) 또는 플라시보의 존재하에 동일한 수의 표적 세포와 밤새 공동 배양하였다. 각 T-세포 서브세트의 백분율은 유세포 분석에 의해 결정되었다. 도 12A 및 12B에 나타낸 바와 같이, 항체 445-3의 처리는 용량 의존적 방식으로 CD8+ T 세포의 백분율을 증가시키고 CD4+Foxp3+ Tregs의 백분율을 감소시켰다. 그 결과, CD8+ T 세포 대 Tregs의 비율이 크게 향상되었다 (도 12C). 1A7.gr1 처리로는 약한 결과가 얻어졌다. 이 결과는 CD8+ T 세포 기능을 강화하지만 Treg 매개 면역 관용을 제한함으로써 항 종양 면역을 유도하기 위한 445-3의 치료적 저용을 입증한다.
실시예 14 : 항-OX40 항체 445-3은 마우스 종양 모델에서 용량 의존적 항 종양 활성을 발휘한다.
항-OX40 항체 445-3의 효능은 마우스 종양 모델에서 나타났다. 마우스 MC38 결장 종양 세포를 인간 OX40 형질 전환된 C57 마우스(Biocytogen, Beijing China)에 피하 이식하였다. 종양 세포 이식 후, 종양 부피를 매주 2회 측정하고 공식 V = 0.5(a x b2)을 사용하여 mm3로 계산하였다. 여기서, a와 b는 각각 종양의 긴 직경과 짧은 직경이다. 종양의 평균 부피가 대략 190 mm3에 도달하면 마우스를 7 개 그룹으로 무작위로 할당하고, 3 주 동안 일주일에 한 번 445-3 또는 1A7.gr1 항체를 복강 내 주사하였다. 인간 IgG는 이소 타입 대조군으로 투여되었다. 부분 회귀 (PR)는 3 회 연속 측정에서 투여 첫날의 초기 종양 부피의 50 %보다 작은 종양 부피로 정의하였다. 종양 성장 억제 (TGI)는 다음 공식을 사용하여 계산되었다:
Figure pct00007
treated t = 시간 t에서 치료된 종양 부피
treated t0 = 시간 0에서 치료된 종양 부피
placebo t = 시간 t에서 플라시보 종양 부피
placebo t0 = 시간 0에서 플라시보 종양 부피
그 결과는 445-3이 0.4mg/kg, 2mg/kg 및 10mg/kg의 용량으로 복강 내 주사됨으로써 용량 의존적 항 종양 효능을 가짐을 나타낸다. 445-3의 투여는 53 % (0.4 mg/kg), 69 % (2 mg/kg) 및 94 % (10mg/kg)의 종양 성장 억제를 가져왔고, 기준선에서 0 % (0.4 mg/kg), 17 % (2 mg/kg) 및 33 % (10 mg/kg) 부분 회귀(partial regression) 되었다. 대조적으로, 항체 1A7.gr1에 의한 부분 회귀는 관찰되지 않았다. 생체 내 데이터는 리간드 비 차단 항체 445-3이 OX40-OX40L 차단 항체 1A7.gr1보다 항 종양 요법에 더 적합하다는 것을 나타낸다 (도 13A 및 13B, 표 9).
마우스 MC38 결장 종양 마우스 모델에서 445-3 및 1A7.gr1의 효능
Treatment QW Dose (mg/kg) N Partial Regression Rate Mean Tumor Volume on Day 21 (mm 3 ) TGI on Day 21 (%)
445-3 0.4 6 0% 953 53
2 6 17% 696 69
10 6 33% 280 94
1A7.gr1 0.4 6 0% 886 57
2 6 0% 1163 41
10 6 0% 1030 49
실시예 15 : 항-OX40 항체의 아미노산
OX40 항체의 개선을위한 변경을 위해 여러 아미노산이 선택되었다. 친화도를 향상시키거나 인간화를 증가시키기 위해 아미노산을 변화시켰다. PCR 프라이머 세트는 적절한 아미노산 변경을 위해 설계되고 합성되어 항-OX40 항체를 변형시키는데 사용되었다. 예를 들어, 중쇄에서 K28T 및 경쇄에서 S24R의 변경은 원래 445-2 항체에 비해 EC50가 1.7 배 증가되었음이 FACS에 의해 확인되었다. 중쇄에서 Y27G 및 경쇄에서 S24R의 변경으로 인해 원래 445-2 항체에 비해 KD가 1.7 배 증가되었음이 Biacore에 의해 확인되었다. 이러한 변경 사항은 도 14a-14b에 요약되어 있다.
<110> BeiGene, LTD. <120> ANTI-OX40 ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> Pi20-B308 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val 20 25 30 Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro 35 40 45 Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys 50 55 60 Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro 65 70 75 80 Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys 85 90 95 Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly 100 105 110 Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys 115 120 125 Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp 130 135 140 Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn 145 150 155 160 Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro 165 170 175 Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr 180 185 190 Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu 195 200 205 Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val 210 215 220 Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu 225 230 235 240 Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly 245 250 255 Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser 260 265 270 Thr Leu Ala Lys Ile 275 <210> 2 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val 20 25 30 Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro 35 40 45 Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys 50 55 60 Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro 65 70 75 80 Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys 85 90 95 Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly 100 105 110 Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys 115 120 125 Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp 130 135 140 Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn 145 150 155 160 Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro 165 170 175 Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr 180 185 190 Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu 195 200 205 Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala 210 215 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Ser Tyr Ile Ile His 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Arg Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Asp Thr Ser Thr Leu Tyr Ser 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 9 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ile Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Arg Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Tyr Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgaa ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggata taaattcact agctatatta tacactgggt gaagcagaag 120 cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tactaggtac 180 aatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atggagtaca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aaggggttac 300 tacggtagta gctatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360 360 <210> 11 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Thr Ser Thr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Phe Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Lys Lys 100 105 <210> 12 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 12 gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gtgcaagtca gggcattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120 gatggaacta ttaaactcct gatctatgac acatcaacct tatactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattttctca ccatcagcaa cctggaacct 240 gaagatattg ccacttacta ttgtcagcag tatagtaagc ttccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaaaaaa a 321 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-1 HCDR2 <400> 13 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 14 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-1 VH pro <400> 14 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-1 VH DNA <400> 15 caggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaagaagc caggcagctc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg cctctggcta caagttcacc tcctatatca tccactgggt gcggcaggca 120 ccaggacagg gactggagtg gatgggctac atcaaccctt ataatgacgg cacacggtac 180 aaccagaagt ttcagggcag agtgaccctg acaagcgata agtctaccag cacagcctat 240 atggagctgt ctagcctgag gtccgaggac accgccgtgt actattgtgc cagaggctac 300 tatggctcct cttacgccat ggattattgg ggccagggca ccacagtgac agtgagctcc 360 360 <210> 16 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-1 VK pro <400> 16 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Thr Ser Thr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-1 VK DNA <400> 17 gacatccaga tgacccagtc tcccagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtgacc 60 atcacatgca gcgcctccca gggcatctcc aactacctga attggtatca gcagaagcca 120 ggcaaggcca tcaagctgct gatctacgac acctctacac tgtatagcgg cgtgccctcc 180 agattctctg gcagcggctc cggaaccgac tacaccctga caatctctag cctgcagccc 240 gaggatttcg ccacatacta ttgtcagcag tacagcaagc tgccttatac ctttggcggc 300 ggcacaaagg tggagatcaa g 321 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-2 HCDR2 <400> 18 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Glu Gly Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-2 LCDR2 <400> 19 Asp Ala Ser Thr Leu Tyr Ser 1 5 <210> 20 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-2 VH pro <400> 20 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Glu Gly Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-2 VH DNA <400> 21 caggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaagaagc caggcagctc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg cctctggcta caagttcacc tcctatatca tccactgggt gcggcaggca 120 ccaggacagg gactggagtg gatgggctac atcaaccctt ataatgaggg cacacggtac 180 gcccagaagt ttcagggcag agtgaccctg acagccgata agtctaccag cacagcctat 240 atggagctgt ctagcctgag gtccgaggac accgccgtgt actattgtgc cagaggctac 300 tatggctcct cttacgccat ggattattgg ggccagggca ccacagtgac agtgagctcc 360 360 <210> 22 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-2 VK pro <400> 22 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 23 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-2 VK DNA <400> 23 gacatccaga tgacccagtc tcccagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtgacc 60 atcacatgca gcgcctccca gggcatctcc aactacctga attggtatca gcagaagcca 120 ggcaaggcca tcaagctgct gatctacgac gcctctacac tgtatagcgg cgtgccctcc 180 agattctctg gcagcggctc cggaaccgac ttcaccctga caatctctag cctgcagccc 240 gaggatttcg ccacatacta ttgtcagcag tacagcaagc tgccttatac ctttggcggc 300 ggcacaaagg tggagatcaa g 321 <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-3 HCDR2 <400> 24 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Glu Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-3 LCDR1 <400> 25 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 26 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-3 VH pro <400> 26 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Glu Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-3 VH DNA <400> 27 caggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaagaagc caggcagctc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg cctctggcta caagttcacc tcctatatca tccactgggt gcggcaggca 120 ccaggacagg gactggagtg gatgggctac atcaaccctt ataatgaggg cacacggtac 180 aaccagaagt ttcagggcag agtgaccctg acagccgata agtctaccag cacagcctat 240 atggagctgt ctagcctgag gtccgaggac accgccgtgt actattgtgc cagaggctac 300 tatggctcct cttacgccat ggattattgg ggccagggca ccacagtgac agtgagctcc 360 360 <210> 28 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-3 VK pro <400> 28 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Ala Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 29 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-3 VK DNA <400> 29 gacatccaga tgacccagtc tcccagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtgacc 60 atcacatgcc gggcctccca gggcatctcc aactacctga attggtatca gcagaagcca 120 gacggcgcca tcaagctgct gatctacgac gcctctacac tgtatagcgg cgtgccctcc 180 agattctctg gcagcggctc cggaaccgac ttcaccctga caatctctag cctgcagccc 240 gaggatttcg ccacatacta ttgtcagcag tacagcaagc tgccttatac ctttggcggc 300 ggcacaaagg tggagatcaa g 321 <210> 30 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp 1 5 10 15 Arg Asp <210> 31 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys 1 5 10 15 Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala 20 25 30 Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu 35 40

Claims (31)

  1. 인간 OX40에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 :
    (i) (a) 서열번호 3의 HCDR (중쇄 상보성 결정 영역) 1, (b) 서열번호 24의 HCDR2, (c) 서열번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열번호 25의 LCDR (경쇄 상보성 결정 영역) 1, (e) 서열번호 19의 LCDR2, 및 (f) 서열번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (ii) (a) 서열번호 3의 HCDR1, (b) 서열번호 18의 HCDR2, (c) 서열번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열번호 6의 LCDR1, (e) 서열번호 19의 LCDR2, 및 (f) 서열번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (iii) (a) 서열번호 3의 HCDR1, (b) 서열번호 13의 HCDR2, (c) 서열번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열번호 6의 LCDR1, (e) 서열번호 7의 LCDR2, 및 (f) 서열번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (iv) (a) 서열번호 3의 HCDR1, (b) 서열번호 4의 HCDR2, (c) 서열번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열번호 6의 LCDR1, (e) 서열번호 7의 LCDR2, 및 (f) 서열번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  2. 제1항에 있어서, 다음을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 :
    (i) 서열번호 26과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열번호 28과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
    (ii) 서열번호 20과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열번호 22와 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
    (iii) 서열번호 14와 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열번호 16과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL); 또는
    (iv) 서열번호 9와 적어도 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열번호 11과 적어도 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL).
  3. 제2항에 있어서, 서열번호 26, 28, 20, 22, 14, 16, 9, 및/또는 11 내에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산이 삽입, 결실 또는 치환된, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 다음을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 :
    (i) 서열번호 26을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열번호 28을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
    (ii) 서열번호 20을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
    (iii) 서열번호 14를 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열번호 16을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL); 또는
    (iv) 서열번호 9를 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열번호 11을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL).
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 클론 항체 (monoclonal antibody), 키메라 항체 (chimeric antibody), 인간화 항체 (humanized antibody), 인간 조작된 항체 (human engineered antibody), 단일 사슬 항체 (single chain antibody (scFv)), Fab 단편 (Fab fragment), Fab' 단편 (Fab' fragment), 또는 F(ab')2 단편 (F(ab')2 fragment))인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, OX40 항진 (agonist) 활성을 갖는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 OX40의 H153 내지 D170으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에서 인간 OX40에 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 OX40의 H153, T154, I165, E167 및 D170으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에서 인간 OX40에 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 OX40의 H153, I165 및 E167로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에서 인간 OX40에 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 30에서 또는 그 내부에서 (at or within SEQ ID NO. 30) 인간 OX40에 결합하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 항체 의존성 세포 독성 (antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 또는 보체 의존성 세포 독성 (complement dependent cytotoxicity, CDC)을 갖는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 감소된 글리코실화 (reduced glycosylation)를 갖거나 글리코실화 되지 않거나 (no glycosylation) 또는 저푸코실화 된 (hypofucosylated) 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 증가된 이등분 GlcNac 구조 (increased bisecting GlcNac structure)를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 IgG1인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 IgG4인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제15항에 있어서, 상기 IgG4는 S228P 치환 (EU 넘버링 시스템에 따름)을 갖는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  17. 제16항에 있어서, 상기 IgG4는 S228P 및 R409K 치환 (EU 넘버링 시스템에 따름)을 갖는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 특성 중 하나 이상을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (i) cyno OX40과 교차반응(cross-reacting) 할 수 있음;
    (ii) OX40-OX40L 상호작용(interaction)을 방해하지 않음;
    (iii) T 세포를 공동 자극하여(co-stimulating T cells) IL-2를 생산할 수 있음;
    (iv) CD4+ T-세포를 공동 활성화(co-activating) 할 수 있음, 특히 혼합 림프구 반응 (mixed lymphocyte reaction, MLR) 분석에서 측정시에 그러함 ;
    (v) ADCC를 매개(mediating) 할 수 있음, 특히 젖산 탈수소 효소 (LDH) 방출 기반 ADCC 분석(lactate dehydrogenase (LDH) release-based ADCC assay)에서 측정시에 그러함 ;
    (vi) CD4+ Treg를 고갈시킬(depleting) 수 있음;
    (vii) CD8+ Teff/Treg 비율을 증가시킬 수 있음; 또는
    (viii) 동물 종양 모델에서 종양의 부분 퇴행 (partial regression)을 매개 할 수 있음.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고, 약제학적으로 허용되는 담체(carrier)를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  20. 유효량의 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이를 필요로하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 암은 유방암(breast cancer), 두경부암(head and neck cancer), 위암(gastric cancer), 신장암(kidney cancer), 간암(liver cancer), 소세포 폐암(small cell lung cancer,), 비소세포 폐암( non-small cell lung cancer), 난소암(ovarian cancer), 피부암(skin cancer), 중피종(mesothelioma), 림프종(lymphoma), 백혈병(leukemia), 골수종(myeloma) 및 육종 (sarcoma)인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 다른 치료제와 병용(combination)하여 투여되는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 치료제는 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 파클리탁셀 제제(paclitaxel agent), 도세탁셀(docetaxel), 카보플라틴(carboplatin), 토포테칸(topotecan), 시스플라틴(cisplatin), 이리노테칸(irinotecan), 독소루비신( doxorubicin), 레날리도마이드(lenalidomide) 또는 5-아자시티딘(5-azacytidine) 인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 치료제가 파클리탁셀 제제, 레날리도마이드 또는 5- 아자시티딘인 방법.
  25. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산.
  26. 제25항의 핵산을 포함하는 벡터.

  27. 제25항의 핵산 또는 제26항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  28. 제27항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 배양물로부터 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 공정.
  29. 유방암, 두경부암, 위암, 신장암, 간암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 난소 암, 피부암, 중피종, 림프종, 백혈병, 골수종 및 육종의 치료 또는 가능성(likelihood)의 감소에 사용하기 위한, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  30. 표지된 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 진단 시약 (diagnostic reagent).
  31. 제30항에 있어서, 상기 표지(label)는 방사성 표지(radiolabel), 형광단( fluorophore), 발색단(chromophore), 영상화제(imaging agent) 및 금속 이온(metal ion)으로 구성된 군에서 선택되는 진단 시약.
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3100766A1 (en) * 2018-05-23 2019-11-28 Beigene, Ltd. Anti-ox40 antibodies and methods of use
EP4061844A4 (en) * 2019-11-21 2023-12-06 Beigene (Beijing) Co., Ltd. METHODS OF TREATING CANCER WITH ANTI-OX40 ANTIBODY IN COMBINATION WITH CHEMOTHERAPY AGENTS
MX2022006148A (es) * 2019-11-21 2022-08-17 Beigene Ltd Metodos para tratamiento del cancer usando anticuerpos anti-ox40 en combinacion con anticuerpos anti-tigit.
CN114728063B (zh) * 2019-11-21 2024-06-14 百济神州有限公司 用抗ox40抗体和多重激酶抑制剂治疗癌症
JP2023503230A (ja) * 2019-11-21 2023-01-27 ベイジーン リミテッド Ｐｉ３キナーゼデルタ阻害剤との組合せで抗ｏｘ４０抗体を用いる癌治療の方法
MX2022006147A (es) * 2019-11-21 2022-06-17 Beigene Ltd Metodos de tratamiento del cancer utilizando anticuerpos anti-ox40 en combinacion con anticuerpos anti-pd1 o anti-pdl1.
EP4061845A4 (en) * 2019-11-21 2023-12-13 BeiGene, Ltd. METHODS OF TREATING CANCER USING ANTI-OX40 ANTIBODIES IN COMBINATION WITH ANTI-TIM3 ANTIBODIES
TW202144424A (zh) * 2020-04-17 2021-12-01 大陸商和記黃埔醫藥（上海）有限公司 抗ｏｘ４０抗體及其用途
CN115260312A (zh) * 2021-04-30 2022-11-01 保诺科技（北京）有限公司 结合ox40的抗体或抗原结合片段
WO2023109901A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-ox40 antibodies and methods of use
WO2023109900A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-ox40 antibodies, multispecific antibodies and methods of use
WO2023152116A1 (en) 2022-02-08 2023-08-17 Hookipa Biotech Gmbh Combination therapy with arenavirus particles and immune checkpoint modulators or cytokines

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2007334264A1 (en) * 2006-11-15 2008-06-26 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to BTLA and methods of use
PT2609118T (pt) * 2010-08-23 2017-03-22 Univ Texas Anticorpos anti-ox40 e métodos de utilização dos mesmos
BR112015023862A2 (pt) 2013-03-18 2017-10-24 Biocerox Prod Bv anticorpo isolado, molécula de ácido nucléico isolada, vetor, célula hospedeira, método de realçar uma resposta imune, método de tratar câncer, composição farmacêutica, e, anticorpo agonístico isolado
JP6526189B2 (ja) * 2014-07-03 2019-06-05 ベイジーン リミテッド 抗ｐｄ−ｌ１抗体並びにその治療及び診断のための使用
TW201619200A (zh) * 2014-10-10 2016-06-01 麥迪紐有限責任公司 人類化抗－ｏｘ４０抗體及其用途
DE112016001013T5 (de) * 2015-03-03 2017-12-21 Kymab Limited Antikörper, verwendungen und verfahren
MX2017012278A (es) * 2015-03-23 2018-05-23 Bayer Pharma AG Anticuerpos anti-ceacam6 y sus usos.
PE20180926A1 (es) * 2015-05-29 2018-06-08 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos contra el miembro 4 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (ox40) y sus usos
CN114380908B (zh) * 2015-10-15 2023-03-17 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 抗ox40抗体及其应用
GB201519481D0 (en) 2015-11-04 2015-12-16 Cancer Rec Tech Ltd Immunomodulatory antibodies
JP2019526623A (ja) * 2016-08-08 2019-09-19 ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． 抗ｏｘ４０結合タンパク質
CA3100766A1 (en) * 2018-05-23 2019-11-28 Beigene, Ltd. Anti-ox40 antibodies and methods of use

Non-Patent Citations (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
al-Shamkhani, A., Birkeland, M.L., Puklavec, M., Brown, M.H., James, W., and Barclay, A.N. (1996). OX40 is differentially expressed on activated rat and mouse T cells and is the sole receptor for the OX40 ligand. European journal of immunology 26, 1695-1699.
An Z, Forrest G, Moore R, Cukan M, Haytko P, Huang L, Vitelli S, Zhao JZ, Lu P, Hua J, Gibson CR, Harvey BR, Montgomery D, Zaller D, Wang F, Strohl W. (2009). IgG2m4, an engineered antibody isotype with reduced Fc function. MAbs. 1,572-579.
Arch, R.H., and Thompson, C.B. (1998). 4-1BB and Ox40 are members of a tumor necrosis factor (TNF)-nerve growth factor receptor subfamily that bind TNF receptor-associated factors and activate nuclear factor kappaB. Molecular and cellular biology 18, 558-565.
Aspeslagh, S., Postel-Vinay, S., Rusakiewicz, S., Soria, J.C., Zitvogel, L., and Marabelle, A. (2016). Rationale for anti-OX40 cancer immunotherapy. Eur J Cancer 52, 50-66.
Bulliard, Y., Jolicoeur, R., Zhang, J., Dranoff, G., Wilson, N.S., and Brogdon, J.L. (2014). OX40 engagement depletes intratumoral Tregs via activating FcgammaRs, leading to antitumor efficacy. Immunology and cell biology 92, 475-480.
Calderhead, D.M., Buhlmann, J.E., van den Eertwegh, A.J., Claassen, E., Noelle, R.J., and Fell, H.P. (1993). Cloning of mouse Ox40: a T cell activation marker that may mediate T-B cell interactions. J Immunol 151, 5261-5271.
Carboni, S., Aboul-Enein, F., Waltzinger, C., Killeen, N., Lassmann, H., and Pena-Rossi, C. (2003). CD134 plays a crucial role in the pathogenesis of EAE and is upregulated in the CNS of patients with multiple sclerosis. Journal of neuroimmunology 145, 1-11.
Compaan, D.M., and Hymowitz, S.G. (2006). The crystal structure of the costimulatory OX40-OX40L complex. Structure 14, 1321-1330.
Croft, M. (2010). Control of immunity by the TNFR-related molecule OX40 (CD134). Annual review of immunology 28, 57-78.
Croft, M., So, T., Duan, W., and Soroosh, P. (2009). The significance of OX40 and OX40L to T-cell biology and immune disease. Immunological reviews 229, 173-191.
Curti, B.D., Kovacsovics-Bankowski, M., Morris, N., Walker, E., Chisholm, L., Floyd, K., Walker, J., Gonzalez, I., Meeuwsen, T., Fox, B.A., et al. (2013). OX40 is a potent immune-stimulating target in late-stage cancer patients. Cancer research 73, 7189-7198.
Durkop, H., Latza, U., Himmelreich, P., and Stein, H. (1995). Expression of the human OX40 (hOX40) antigen in normal and neoplastic tissues. British journal of haematology 91, 927-931.
Gough, M.J., and Weinberg, A.D. (2009). OX40 (CD134) and OX40L. Advances in experimental medicine and biology 647, 94-107.
Gramaglia, I., Weinberg, A.D., Lemon, M., and Croft, M. (1998). Ox-40 ligand: a potent costimulatory molecule for sustaining primary CD4 T cell responses. J Immunol 161, 6510-6517.
Guo, Z., Cheng, D., Xia, Z., Luan, M., Wu, L., Wang, G., and Zhang, S. (2013). Combined TIM-3 blockade and CD137 activation affords the long-term protection in a murine model of ovarian cancer. Journal of translational medicine 11, 215.
Hori, S., Nomura, T., and Sakaguchi, S. (2003). Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science 299, 1057-1061.
Huddleston, C.A., Weinberg, A.D., and Parker, D.C. (2006). OX40 (CD134) engagement drives differentiation of CD4+ T cells to effector cells. European journal of immunology 36, 1093-1103.
Ito, T., Amakawa, R., Inaba, M., Hori, T., Ota, M., Nakamura, K., Takebayashi, M., Miyaji, M., Yoshimura, T., Inaba, K., and Fukuhara, S. (2004). Plasmacytoid dendritic cells regulate Th cell responses through OX40 ligand and type I IFNs. J Immunol 172, 4253-4259.
Ito, T., Wang, Y.H., Duramad, O., Hanabuchi, S., Perng, O.A., Gilliet, M., Qin, F.X., and Liu, Y.J. (2006). OX40 ligand shuts down IL-10-producing regulatory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103, 13138-13143.
Jacquemin, C., Schmitt, N., Contin-Bordes, C., Liu, Y., Narayanan, P., Seneschal, J., Maurouard, T., Dougall, D., Davizon, E.S., Dumortier, H., et al. (2015). OX40 Ligand Contributes to Human Lupus Pathogenesis by Promoting T Follicular Helper Response. Immunity 42, 1159-1170.
Kjaergaard, J., Tanaka, J., Kim, J.A., Rothchild, K., Weinberg, A., and Shu, S. (2000). Therapeutic efficacy of OX-40 receptor antibody depends on tumor immunogenicity and anatomic site of tumor growth. Cancer research 60, 5514-5521.
Ladanyi, A., Somlai, B., Gilde, K., Fejos, Z., Gaudi, I., and Timar, J. (2004). T-cell activation marker expression on tumor-infiltrating lymphocytes as prognostic factor in cutaneous malignant melanoma. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 10, 521-530.
Lai, C., August, S., Albibas, A., Behar, R., Cho, S.Y., Polak, M.E., Theaker, J., MacLeod, A.S., French, R.R., Glennie, M.J., et al. (2016). OX40+ Regulatory T Cells in Cutaneous Squamous Cell Carcinoma Suppress Effector T-Cell Responses and Associate with Metastatic Potential. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 22, 4236-4248.
Marabelle, A., Kohrt, H., and Levy, R. (2013a). Intratumoral anti-CTLA-4 therapy: enhancing efficacy while avoiding toxicity. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 19, 5261-5263.
Marabelle, A., Kohrt, H., Sagiv-Barfi, I., Ajami, B., Axtell, R.C., Zhou, G., Rajapaksa, R., Green, M.R., Torchia, J., Brody, J., et al. (2013b). Depleting tumor-specific Tregs at a single site eradicates disseminated tumors. The Journal of clinical investigation 123, 2447-2463.
Montler, R., Bell, R.B., Thalhofer, C., Leidner, R., Feng, Z., Fox, B.A., Cheng, A.C., Bui, T.G., Tucker, C., Hoen, H., and Weinberg, A. (2016). OX40, PD-1 and CTLA-4 are selectively expressed on tumor-infiltrating T cells in head and neck cancer. Clinical & translational immunology 5, e70.
Morris, N.P., Peters, C., Montler, R., Hu, H.M., Curti, B.D., Urba, W.J., and Weinberg, A.D. (2007). Development and characterization of recombinant human Fc:OX40L fusion protein linked via a coiled-coil trimerization domain. Molecular immunology 44, 3112-3121.
Ohshima, Y., Tanaka, Y., Tozawa, H., Takahashi, Y., Maliszewski, C., and Delespesse, G. (1997). Expression and function of OX40 ligand on human dendritic cells. J Immunol 159, 3838-3848.
Petty, J.K., He, K., Corless, C.L., Vetto, J.T., and Weinberg, A.D. (2002). Survival in human colorectal cancer correlates with expression of the T-cell costimulatory molecule OX-40 (CD134). American journal of surgery 183, 512-518.
Redmond, W.L., and Weinberg, A.D. (2007). Targeting OX40 and OX40L for the treatment of autoimmunity and cancer. Critical reviews in immunology 27, 415-436.
Rogers, P.R., Song, J., Gramaglia, I., Killeen, N., and Croft, M. (2001). OX40 promotes Bcl-xL and Bcl-2 expression and is essential for long-term survival of CD4 T cells. Immunity 15, 445-455.
Ruby, C.E., and Weinberg, A.D. (2009). OX40-enhanced tumor rejection and effector T cell differentiation decreases with age. J Immunol 182, 1481-1489.
Sarff, M., Edwards, D., Dhungel, B., Wegmann, K.W., Corless, C., Weinberg, A.D., and Vetto, J.T. (2008). OX40 (CD134) expression in sentinel lymph nodes correlates with prognostic features of primary melanomas. American journal of surgery 195, 621-625; discussion 625.
Sato, T., Ishii, N., Murata, K., Kikuchi, K., Nakagawa, S., Ndhlovu, L.C., and Sugamura, K. (2002). Consequences of OX40-OX40 ligand interactions in langerhans cell function: enhanced contact hypersensitivity responses in OX40L-transgenic mice. European journal of immunology 32, 3326-3335.
Smyth, M.J., Ngiow, S.F., and Teng, M.W. (2014). Targeting regulatory T cells in tumor immunotherapy. Immunology and cell biology 92, 473-474.
Song, A., Tang, X., Harms, K.M., and Croft, M. (2005a). OX40 and Bcl-xL promote the persistence of CD8 T cells to recall tumor-associated antigen. J Immunol 175, 3534-3541.
Song, J., So, T., and Croft, M. (2008). Activation of NF-kappaB1 by OX40 contributes to antigen-driven T cell expansion and survival. J Immunol 180, 7240-7248.
Song, J., So, T., Cheng, M., Tang, X., and Croft, M. (2005b). Sustained survivin expression from OX40 costimulatory signals drives T cell clonal expansion. Immunity 22, 621-631.
Soroosh, P., Ine, S., Sugamura, K., and Ishii, N. (2007). Differential requirements for OX40 signals on generation of effector and central memory CD4+ T cells. J Immunol 179, 5014-5023.
St Rose, M.C., Taylor, R.A., Bandyopadhyay, S., Qui, H.Z., Hagymasi, A.T., Vella, A.T., and Adler, A.J. (2013). CD134/CD137 dual costimulation-elicited IFN-gamma maximizes effector T-cell function but limits Treg expansion. Immunology and cell biology 91, 173-183.
Stuber, E., Neurath, M., Calderhead, D., Fell, H.P., and Strober, W. (1995). Cross-linking of OX40 ligand, a member of the TNF/NGF cytokine family, induces proliferation and differentiation in murine splenic B cells. Immunity 2, 507-521.
Szypowska, A., Stelmaszczyk-Emmel, A., Demkow, U., and Luczynski, W. (2014). High expression of OX40 (CD134) and 4-1BB (CD137) molecules on CD4(+)CD25(high) cells in children with type 1 diabetes. Advances in medical sciences 59, 39-43.
Timperi, E., Pacella, I., Schinzari, V., Focaccetti, C., Sacco, L., Farelli, F., Caronna, R., Del Bene, G., Longo, F., Ciardi, A., et al. (2016). Regulatory T cells with multiple suppressive and potentially pro-tumor activities accumulate in human colorectal cancer. Oncoimmunology 5, e1175800.
Tourkova, I.L., Yurkovetsky, Z.R., Shurin, M.R., and Shurin, G.V. (2001). Mechanisms of dendritic cell-induced T cell proliferation in the primary MLR assay. Immunology letters 78, 75-82.
Vetto, J.T., Lum, S., Morris, A., Sicotte, M., Davis, J., Lemon, M., and Weinberg, A. (1997). Presence of the T-cell activation marker OX-40 on tumor infiltrating lymphocytes and draining lymph node cells from patients with melanoma and head and neck cancers. American journal of surgery 174, 258-265.
Voo, K.S., Bover, L., Harline, M.L., Vien, L.T., Facchinetti, V., Arima, K., Kwak, L.W., and Liu, Y.J. (2013). Antibodies targeting human OX40 expand effector T cells and block inducible and natural regulatory T cell function. J Immunol 191, 3641-3650.
Weinberg, A.D., Rivera, M.M., Prell, R., Morris, A., Ramstad, T., Vetto, J.T., Urba, W.J., Alvord, G., Bunce, C., and Shields, J. (2000). Engagement of the OX-40 receptor in vivo enhances antitumor immunity. J Immunol 164, 2160-2169.
Weinberg, A.D., Wegmann, K.W., Funatake, C., and Whitham, R.H. (1999). Blocking OX-40/OX-40 ligand interaction in vitro and in vivo leads to decreased T cell function and amelioration of experimental allergic encephalomyelitis. J Immunol 162, 1818-1826.
Willoughby, J., Griffiths, J., Tews, I., and Cragg, M.S. (2017). OX40: Structure and function - What questions remain? Molecular immunology 83, 13-22.
Zander, R.A., Obeng-Adjei, N., Guthmiller, J.J., Kulu, D.I., Li, J., Ongoiba, A., Traore, B., Crompton, P.D., and Butler, N.S. (2015). PD-1 Co-inhibitory and OX40 Co-stimulatory Crosstalk Regulates Helper T Cell Differentiation and Anti-Plasmodium Humoral Immunity. Cell host & microbe 17, 628-641.
Zhang, T., Lemoi, B.A., and Sentman, C.L. (2005). Chimeric NK-receptor-bearing T cells mediate antitumor immunotherapy. Blood 106, 1544-1551.

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