ES2283084T3 - Proteinas quimericas para el tratamiento de diabetes. - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a nuevas proteínas quiméricas de fusión que comprenden epítopes inmunodominantes de GAD e insulina. También se refiere a procedimientos inmunoreguladores para el empleo de éstas proteínas tanto en la prevención como para tratamiento de la diabetes mellitus Tipo 1. Las proteínas de fusión quiméricas con útiles para predecir el riesgo de aparición de diabetes mellitus Tipo 1, determinando prognosis de diabetes Tipo 1 en pacientes en una etapa precoz del desarrollo de la enfermedad y evaluando la capacidad de los pacientes para recibir adecuadamente un transplante de células o tejidos pancreáticos. La administración de proteína de esta invención conforme a los procedimientos inmunoreguladores citados produce efectos beneficiosos en el desarrollo de la enfermedad y sobre su gravedad en pacientes que sufren la diabetes mellitus, o que se les ha predicho riesgo, así como el resultado del trasplante de células o tejidos pancreáticos en pacientes con diabetes Tipo 1.
Description
Proteínas quiméricas para el tratamiento de
diabetes.
La discusión en esta sección no se limita a la
materia objeto que se califica como "técnica anterior" frente
a la presente invención. Por lo tanto, no se debe de presuponer o
inferir la admisión de tal estado de técnica anterior por la
inclusión de la materia objeto particular en esta discusión, y no se
debe presuponer ninguna declaración contra los intereses de los
presentes inventores por razón de dicha inclusión.
La diabetes mellitus es la enfermedad endocrina
más habitual, y se caracteriza por anormalidades del metabolismo de
la glucosa. El metabolismo anormal de la glucosa asociado con esta
enfermedad da como resultado hiperglucemia (glucemia elevada) y
eventualmente provoca complicaciones de múltiples sistemas
orgánicos, incluyendo los ojos, riñones, nervios, y vasos
sanguíneos. Generalmente, los pacientes con hiperglucemia
persistente o con una tolerancia anormal a la glucosa se
diagnostican con la enfermedad, aunque muy habitualmente los
pacientes presentan inicialmente una micción excesiva (poliuria) y
una necesidad frecuente de beber debido a la sed extrema
(polidipsia). Estos síntomas iniciales típicos resultan de los
efectos osmóticos de la hiperglucemia.
La patogénesis de la diabetes mellitus está
asociada típicamente con disfunción pancreática, particularmente de
las células beta de los islotes pancreáticos de Langerhans. Esta
disfunción puede conducir a la destrucción de las células beta de
los islotes, que producen insulina, una hormona peptídica reguladora
de la glucosa. La diabetes mellitus se ha categorizado generalmente
como insulinodependiente o de tipo 1, frente a la no
insulinodependiente, o de tipo 2. Sin embargo, esta terminología ha
evolucionado a medida que la enfermedad se ha comprendido mejor.
Por ejemplo, se ha encontrado que en algunos pacientes que sufren
diabetes no insulinodependiente, la enfermedad avanza hacia una
forma insulinodependiente, mientras que en otros pacientes no se
desarrolla una dependencia de la insulina.
De este modo, los pacientes se categorizan a
menudo en extremos de los mecanismos de patogénesis de la
destrucción de los islotes, y la denominación de tipo 1 se usa
ahora para hacer referencia a la patogénesis de los islotes
autoinmunitaria, es decir, a diabetes provocada por un ataque
autoinmunitario específico de los islotes, y como tal se usa aquí
en este documento. La expresión diabetes mellitus dependiente de
insulina (IDDM) se refiere a diabetes de tipo 1 que ha evolucionado
hasta una etapa en la que se ha producido una destrucción
autoinmunitaria suficiente de las células beta pancreáticas para
producir síntomas manifiestos. El extremo pre-IDDM
se refiere a un estado autoinmunitario que se puede detectar
mediante biopsia o mediante análisis de las respuestas
autoinmunitarias, en las que las células beta de los islotes
pancreáticos están siendo sometidas a un ataque autoinmunitario
específico en un grado en el que algunas células pueden estar
sometidas a la destrucción. Sin embargo, en
pre-IDDM, la destrucción (si la hay) no ha
progresado hasta un grado suficiente para requerir la administración
de insulina. Puesto que puede haber un punto en las etapas
tempranas de la diabetes de tipo 1 en el que se observan síntomas
manifiestos pero aún continúan funcionando los islotes (lo que se
conoce con el nombre de "período de luna de miel"), no todas
las diabetes de tipo 1 se clasifican como IDDM, y no todas las
pre-IDDM se presentan sin síntomas manifiestos.
Complicaciones de la diabetes de tipo 1.
Las complicaciones metabólicas asociadas con el metabolismo anormal
provocado por la insuficiencia de insulina pueden afectar a
numerosos sistemas orgánicos. La complicación metabólica aguda más
habitual es aquella de la cetoacidosis diabética, caracterizada por
una grave hiperglucemia (y la hipovolemia resultante provocada por
diuresis osmótica), así como la acidosis metabólica inducida por la
liberación de ácidos grasos libres en exceso y la producción de
cuerpos cetónicos.
Además de la complicación metabólica aguda de la
cetoacidosis, el paciente diabético es susceptible a una serie de
complicaciones tardías que provocan una considerable morbilidad y
una mortalidad prematura. La aterosclerosis se produce de forma más
extendida y de forma más temprana en los diabéticos que en la
población general como resultado de anormalidades tanto en el
metabolismo de la glucosa como en el de los lípidos. Esta patología
vascular puede conducir, entre otras, a arteriopatía
coronaria, a apoplejía, y a insuficiencia venosa periférica con
gangrena. La retinopatía es otra complicación vascular de la
diabetes. La retinopatía diabética es una causa principal de
ceguera, y se inicia por el aumento de permeabilidad de los
capilares retinianos, lo que puede evolucionar hasta la oclusión,
hemorragia, formación de aneurismas, y neovascularización conocida
como retinopatía proliferativa.
Además de las complicaciones vasculares, las
complicaciones habituales de la diabetes son las enfermedades del
riñón y neurológicas (nefropatías y neuropatías). La nefropatía
diabética provoca aproximadamente la mitad de la nefropatía
terminal en los Estados Unidos de América. Histológicamente, la
nefropatía se caracteriza porque la membrana basal glomerular se
hace más ancha, y por un engrosamiento mesangial. Las señales
iniciales incluyen un aumento de la proteinuria, conduciendo la
azotemia en último lugar a la insuficiencia renal. La neuropatía
diabética puede afectar a cualquier parte del sistema nervioso, con
la posible excepción del cerebro. La neuropatía se observa más
habitualmente como polineuropatía periférica, con síntomas que
incluyen entumecimiento, parestesias, hiperestesias graves, y
dolor. La neuropatía neurovegetativa puede provocar disfunción
gastrointestinal, hipotensión ortostática, disfunción de la vejiga
o parálisis, e impotencia. Las úlceras de pie de los diabéticos
representan un problema especial de los diabéticos, y parece que son
debidas principalmente a la distribución anormal de la presión como
consecuencia de la neuropatía diabética. Las lesiones ulcerosas
empeoran a menudo por la insuficiencia venosa periférica
concomitante y por la infección.
Como se mencionó anteriormente, el control
meticuloso de la glucemia se ha asociado con una mejora de las
complicaciones tardías de la diabetes de tipo 1, sugiriendo que la
conservación o restauración de la función de las células beta
podría reducir o eliminar la mayoría de las complicaciones
patológicas de la enfermedad.
Patogénesis de la diabetes de tipo 1. La
diabetes de tipo 1 sólo se desarrolla en individuos genéticamente
susceptibles, y los síntomas generalmente aparecen antes de los 40
años de edad, produciéndose la incidencia pico del comienzo de la
sintomatología manifiesta en la segunda década de la vida. La
patogénesis de la diabetes tipo 1 se caracteriza por una fase
inicial de infiltración leucocitaria en los islotes, denominada
insulitis, seguido durante un período de tiempo de la destrucción
real de las células beta de los islotes por ataque autoinmunitario.
La fase de insulitis se caracteriza por la infiltración de islotes
pancreáticos tanto por linfocitos como por células del linaje de
monocitos/macrófagos, e implica tanto la inflamación mediada por
células así como el ataque por anticuerpos citotóxicos específicos
de los islotes. Los síntomas clínicos manifiestos de la diabetes
mellitus se manifiestan generalmente cuando se destruye
aproximadamente el 90% de las células beta de los islotes; sin
embargo, como se explica de forma más completa a continuación, ahora
es posible detectar de forma exacta individuos que sufren etapas
tempranas de la patogénesis de tipo 1, es decir, antes de que se
hayan perdido suficientes células beta de los islotes para producir
síntomas clínicos manifiestos.
Generalmente se piensa que el proceso
autoinmunitario está inducido por un estímulo medioambiental. Una
razón para esta creencia es que un gemelo idéntico sólo tiene una
posibilidad de cincuenta/cincuenta de desarrollar IDDM si el
hermano idéntico tiene la enfermedad.
Células T. La destrucción autoinmunitaria
de las células beta de los islotes pancreáticos en la diabetes de
tipo 1 se cree que está iniciada por células blancas de la sangre
(leucocitos), de forma más importante por las células T. Las
células T, o linfocitos T, son células sanguíneas blancas
mononucleares que proporcionan muchas funciones inmunitarias
esenciales. La importancia de las células T en enfermedades
autoinmunitarias humanas se ha apreciado de forma creciente en las
últimas dos décadas. Los estudios que usan tratamientos que dan
como resultado una inmunosupresión generalizada han definido un
papel crítico para un subconjunto de células T, conocido como
CD4^{+} o células T auxiliares, como reguladores principales de
todas las respuestas inmunitarias (tanto celulares como humorales)
frente a antígenos proteínicos o peptídicos.
Las células T median la lesión tisular a través
de medios indirectos y directos. Las células T de los subconjuntos
tanto de CD8^{+} (citotóxicas) como CD4^{+} (auxiliares)
segregan una variedad de citoquinas inflamatorias que pueden dañar
tejidos indirectamente activando otros diversos tipos de células
blancas de la sangre. Los ejemplos de tales efectos de las células
T incluyen la activación de células B que segregan anticuerpos (que
estimulan la actividad inmunitaria humoral), y la activación de
macrófagos, lo que puede provocar un daño agudo de los tejidos y la
inflamación al liberar enzimas hidrolíticas, especies oxigenadas
reactivas, y citoquinas proinflamatorias adicionales. Además de
estos efectos indirectos de la actividad de las células T, el daño
directo de los tejidos puede estar mediado por células T citotóxicas
CD8^{+} que atacan células que presentan antígenos diana.
Un aspecto único de la fisiología de las células
T es la presencia, sobre sus superficies celulares, de estructuras
de unión semejantes a anticuerpos unidos a membrana, denominadas
receptores de células T (TCR). Al igual que los anticuerpos, los
TCR se unen con una especificidad elevada a antígenos particulares.
Al igual que las células productoras de anticuerpos, que se
desarrollan como clones multitudinarios de células, produciendo
cada clon anticuerpos con especificidades únicas, las células T se
desarrollan como un basto número de clones distintos, y cualquier
clon de célula T particular expresa un único tipo de TCR con una
especificidad de unión definida. Los clones de células T con TCR
que se unen específicamente a autoantígenos son los responsables
del desarrollo de enfermedades autoinmunitarias.
Los estudios de las interacciones de anticuerpos
y TCR con sus antígenos específicos han mostrado que un antígeno
polipeptídico particular comprende típicamente numerosas
características submoleculares, conocidas como epítopos, que pueden
servir cada una como un sitio de unión distinto para un anticuerpo o
TCR particular.
Células T y enfermedades
autoinmunitarias. En las enfermedades autoinmunitarias, sólo un
número limitado de clones de células T, que reaccionan con diversos
epítopos de un número pequeño de autoantígenos, se activa y se ve
implicado en la patogénesis. Incluso en individuos que sufren
enfermedades autoinmunitarias, se sabe que sólo un pequeño
porcentaje de clones de células T (0,1-1%) reconocen
los autoantígenos.
Se han postulado diversos mecanismos que
desempeñan un papel en la activación patogénica de células T
autorreactivas que provocan una enfermedad. La activación principal
de células que presentan antígenos (APC) por infección o
inflamación local está implicada en uno de tales mecanismos. Las APC
activadas de esta manera pueden proporcionar entonces una
coestimulación poderosa para las células T hasta ahora no
reactivas.
Otros mecanismos propuestos implican la
activación policlonal, mediante superagentes, tales como toxinas
bacterianas, de las células T autorreactivas previamente inactivas;
o una imitación molecular con incidente entre autoantígenos y
antígenos extraños (Abbas et al. 1994). En este último caso,
el sistema inmunitario del hospedante organiza una respuesta a un
epítopo sobre una proteína expresada por un patógeno, tal como un
virus, que se asemeja a un epítopo homólogo en una proteína del
hospedante. El ataque autoinmunitario resulta entonces de la
respuesta inmunitaria reactiva cruzada que sigue.
Además de factores externos, subyacente a la
aparición de toda enfermedad autoinmunitaria mediada por células T
existe un patrón complejo de susceptibilidad heredada determinada
por factores multigénicos. Para discusiones adicionales de estos
diversos factores, Steinman, 1995, repasa teorías actuales de
autoinmunidad.
Las alteraciones en el repertorio de células T
se producen naturalmente durante el desarrollo de las células T.
Sólo una pequeña fracción de timocitos (células T inmaduras)
sobreviven al desarrollo intratímico y a sucesos de selección que
dan como resultado la emigración de células T en desarrollo a la
circulación periférica y la terminación de su maduración (von
Boehmer, 1988; Marrack y Kappler, 1987). Las pruebas experimentales
sugieren fuertemente que inicialmente están presentes en el timo un
gran número de timocitos que poseen receptores para autoantígenos.
Estudios recientes han dado pruebas que sugieren que un proceso
denominado muerte celular programada, o apoptosis, destruye estos
timocitos autorreactivos en el timo, mientras que perdona a los
timocitos que no son autorreactivos. De este modo, la apoptosis
desempeña un papel importante a la hora de conformar y mantener el
repertorio de células T, y contribuye al establecimiento de la
autotolerancia eliminando activamente células que expresan
TCR
autorreactivos.
autorreactivos.
Se ha descubierto recientemente que las células
T son sensibles a la muerte celular apoptótica inducida por una
variedad de estímulos en múltiples puntos de su vida (véase, por
ejemplo, Lenardo 1991; Boehme y Lenardo 1993; Critchfield et
al. 1994). También se cree que factores de selección positiva
desempeñan un papel a la hora de regular la supervivencia de clones
de células T específicos. La reducción o expansión del número de
células T individuales de un clon particular en un organismo, por
estos y otros mecanismos, sirve para modular la sensibilidad del
sistema inmunitario del organismo frente a un antígeno particular.
Ahora está firmemente establecido en varios modelos de enfermedad
autoinmunitaria, así como en ciertas infecciones víricas, que la
apoptosis se puede inducir (con la exposición a antígeno en ciertas
condiciones definidas) en linfocitos T periféricos maduros,
específicos de antígenos, así como en timocitos inmaduros.
La apoptosis se produce en muchos sistemas
biológicos (véase, por ejemplo, Kerr et al. 1991; Lockshin y
Zakeri, 1991; Cohen et al. 1992; Duvall y Wyllie, 1986;
Cotter et al. 1990). Una célula que sufre apoptosis sufre un
programa específico de sucesos - procesos celulares y bioquímicos
que dependen del metabolismo activo y contribuyen a la
autodestrucción de la célula. En las células T apoptóticas, el
núcleo se contrae, la cromatina se condensa, el material genético
(ADN) se degrada progresivamente en pequeños fragmentos (de tamaño
repetido nucleosómico), existe una compactación citoplásmica, la
membrana celular forma ampollas, y la célula eventualmente colapsa
(Kawabe y Ochi, 1991; Smith et al. 1989). Las células no se
pueden recuperar de la apoptosis, y dan como resultado la muerte
celular irreversible (Kawabe y Ochi, 1991; Smith et al.
1989).
Informes recientes han sugerido un papel para la
citoquina relacionada con TNF, conocida como el ligando FAS y su
receptor, CD95 (el receptor de FAS), en la inducción de la apoptosis
en células T (Crispe et al. 1994; Nagata y Suda, 1995;
Strasser, 1995; Dhein et al., 1995; Brunner et al.,
1995; y Ju et al., 1995).
Autoantígenos de las células beta de los
islotes. Como se ha discutido anteriormente, el comienzo de la
diabetes de tipo 1 se considera que está mediado por células T. Se
cree que la enfermedad es una consecuencia de las respuestas
inapropiadas de las células T específicas a ciertas proteínas de las
células beta de los islotes, que actúan como autoantígenos. Además
de las células T autorreactivas, también se han dado a conocer en
pacientes con IDDM anticuerpos contra diversos autoantígenos. Los
antígenos que se afirma que son unidos por estos autoanticuerpos
incluyen muchos de aquellos que se afirma que son reconocidos por
células T autorreactivas.
Los autoantígenos que son el objeto de
respuestas autoinmunitarias en pacientes con diabetes de tipo 1
incluyen los autoantígenos GAD (glutamatodescarboxilasa) de
64-65 kDa y GAD de 67 kDa; la insulina;
sialiglucolípido; un antígeno de 38 kD procedente de los gránulos
secretores de células beta; un antígeno que reacciona de forma
cruzada con anticuerpos frente a albúmina bovina, denominado como la
proteína p69 de las células beta, PM-1, o un
antígeno que modifica la enfermedad, una proteína citoesquelética de
las células beta conocida como periferina, proteínas
transportadoras de glucosa, incluyendo GLUT-2; la
proteína 65 del choque de calor (HSP 65), incluyendo el péptido
p277; la carboxipeptidasa H; un mimético molecular de 52 kD del
antígeno del virus de la rubéola; una proteína de 150 kDa asociada
a la membrana de las células beta; un antígeno proteínico localizado
en el polo secretor de la estirpe celular RINm38 del insulinoma de
rata, denominado como el antígeno polar RIN; y antígenos (en
principio) malamente caracterizados aislados mediante inmunocribado
de una librería de expresión de ADNc de los islotes, denominados
como ICA12 e ICA512. ICA512, ahora también conocido como
IA-2, está relacionado inmunológicamente con
fogrina, que también es objeto de respuestas autoinmunitarias en
pacientes con diabetes de tipo 1 (Hatfield et al.,
1997).
1997).
La importancia relativa de estos diversos
autoantígenos en la patogénesis autoinmunitaria, y la oportunidad
con la que cada uno desempeña un papel durante el transcurso del
comienzo y desarrollo de la enfermedad, son el objeto de una
considerable incertidumbre y de la controversia consiguiente en la
técnica. Otra incertidumbre deriva del hecho de que cada
autoantígeno supuesto comprende numerosos epítopos, algunos de los
cuales pueden tener efectos promotores de la enfermedad, mientras
que otros pueden tener efectos supresores de la enfermedad.
Aunque no se desea estar atados por ninguna
teoría particular de operación, según ciertos aspectos de la
invención se cree que la insulina y GAD proporcionan los efectos
terapéuticos más eficaces en el desarrollo de la diabetes de tipo 1
de cualquiera de los autoantígenos implicados en el desarrollo de un
papel en la patogénesis de la enfermedad.
Los autoanticuerpos frente a GAD de
64-65 kD (en lo sucesivo GAD 65) normalmente se
detectan antes del comienzo de la diabetes mellitus de tipo 1
clínica insulinodependiente, y entre familiares no diabéticos de
pacientes con IDDM así como de otros que tengan riesgo. Se ha
sugerido que estos autoanticuerpos son el mejor marcador predictivo
de anticuerpos para diabetes de tipo 1 inminente.
GAD 65 y GAD 67 están codificados por diferentes
genes en diferentes cromosomas, teniendo los genes aproximadamente
70% de homología. Los islotes humanos sólo expresan GAD 65, aunque
ambas formas proteínicas se encuentran en el cerebro. Se han
demostrado pruebas de inmunidad específica linfocitaria frente a GAD
65, y se ha encontrado que está estrechamente asociada con IDDM.
Estudios recientes en el modelo de ratón NOD de diabetes han
indicado que las respuestas de células T frente a GAD 65 preceden a
las de otros autoantígenos putativos, y que la inducción temprana
de la tolerancia de las células T a GAD 65 puede prevenir el
comienzo de la enfermedad.
Kaufman et al (1993) y Tisch et al
(1993) han presentado datos que sugieren que las respuestas frente a
GAD son lo más importante en el desarrollo de la enfermedad, puesto
que se informó que se elevaban durante el desarrollo de la diabetes
de tipo 1, apareciendo respuestas frente a otros autoantígenos de
las células beta sólo mucho más tarde durante el transcurso de la
enfermedad, estando la reactividad a la insulina entre las últimas
en aparecer. Se interpretó que estos hallazgos indicaban que GAD 65
es el autoantígeno clave en la diabetes de tipo 1, y que la
modulación de la reactividad autoinmunitaria con GAD sería la diana
más apropiada para reducir la patología de la enfermedad. Según
esta comprensión teórica de la progresión de la enfermedad, la
modulación de las células T reactivas a insulina sería como cerrar
la puerta del granero después de que todos los caballos se hubiesen
ido, observándose las reacciones frente a la insulina tan tarde en
la progresión de la enfermedad que no sería de esperar que su
modulación afectase el comienzo o la gravedad de la enfermedad.
Los autoanticuerpos frente a la insulina (IAA)
se pueden detectar en aproximadamente el 50% de nuevos pacientes
con comienzo de la enfermedad, y están muy asociados con los
autoanticuerpos de las células de los islotes (ICA) y con el
fenotipo HLA-DR4. Otros estudios sugieren que los
individuos tanto con ICA como IAA tienen un riesgo mucho mayor de
desarrollar diabetes de tipo 1 manifiesta que aquellos con
cualquiera de los marcadores solo. También se han descrito las
respuestas de las células T frente a la insulina como autoantígeno.
En un estudio, las respuestas celulares frente a insulina humana
estuvieron presentes en casi el 90% de los familiares en primer
grado, positivos a ICA, de pacientes con IDDM. También, como se
expone más abajo en los ejemplos, las células T reactivas a
insulina procedentes de ratones NOD diabéticos pueden transferir la
diabetes a ratones NOD no diabéticos.
Las respuestas de las células T de pacientes con
diabetes de tipo 1 o de individuos en riesgo a preparaciones de
células de los islotes indefinidas han sugerido que las células T
también responden a otros antígenos de las células de los islotes.
Estos incluyen un antígeno de 38 kD procedente de los gránulos
secretores de células beta, y seroalbúmina. Además, se ha implicado
a la proteína de choque térmico (HSP) 65 como un autoantígeno de
células T basándose en el hallazgo de que las células T específicas
de HSP transfieren la enfermedad en ratones NOD.
La carboxipeptidasa H es una molécula encontrada
en gránulos secretores de los islotes, y está asociada con la
producción de hormonas peptídicas y neurotransmisores. Se identificó
como un autoantígeno potencial de los islotes mediante la
identificación sistemática de librerías de expresión de ADNc con
sueros procedentes de pacientes con IDDM o
pre-IDDM.
Otros diversos antígenos putativos de las
células de los islotes, tales como ICA12 e ICA512, también se han
identificado mediante identificación sistemática de librerías de
expresión de ADNc.
La diseminación intraantigénica e
interantigénica de la autorreactividad ("diseminación de
epítopos") son fenómenos relacionados asociados con enfermedades
autoinmunitarias en las que epítopos adicionales dentro de un
antígeno, o antígenos adicionales dentro de un tejido diana, son
seleccionados como dianas por las células T autorreactivas durante
la progresión de la enfermedad. Tal diseminación antigénica se ha
observado durante el transcurso del proceso autoinmunitario
inflamatorio en los modelos murinos de encefalomielitis alérgica
experimental (EA) y de diabetes insulinodependiente (Lehmann et
al. 1992; McCarron et al. 1990; Kaufman et al.
1993; Tisch et al. 1993).
Estos hallazgos de la diseminación
antigénica/epitópica sugieren que, para que un tratamiento
terapéutico proporcione una tolerancia inmunitaria eficaz a
autoantígenos de células beta de los islotes, el tratamiento
necesitará seleccionar como diana una población heterogénea de
células T autorreactivas específicas. Por lo tanto, a fin de que la
administración antigénica sea eficaz máximamente en la prevención y
tratamiento de la diabetes de tipo 1, es deseable que se presente
una pluralidad de los epítopos inmunodominantes de tanto la
insulina como GAD 65 a los linfocitos T autorreactivos que producen
la enfermedad.
Predicción y diagnóstico de la enfermedad de
tipo 1. Como se ha explicado anteriormente, hay un aspecto
genético de la incidencia de la diabetes de tipo 1. En
consecuencia, los ensayos genéticos pueden identificar a ciertos
individuos con riesgo mayor de desarrollar la enfermedad (véase, por
ejemplo, Walston et al. 1995). Además, los individuos con un
antecedente familiar conocido de la enfermedad se pueden monitorizar
en busca de señales preclínicas tempranas del desarrollo de la
enfermedad, por ejemplo monitorizando los niveles de los
autoanticuerpos y de células T autorreactivas explicados aquí.
Autoanticuerpos. Entre los
autoanticuerpos que se sabe están asociados con la diabetes de tipo
1, aquellos dirigidos contra GAD 65 son los que aparecen de forma
más temprana y están presentes en el mayor número de pacientes.
Globalmente, estudios recientes han mostrado que aproximadamente el
80% de los individuos con diabetes preclínica tienen
autoanticuerpos específicos contra GAD. En este caso, un individuo
con enfermedad preclínica se define como un familiar de primer
grado de un paciente con diabetes de tipo 1 con ICA. Los antígenos
identificados mediante ICA están definidos por la enfermedad, pero
junto con autoanticuerpos específicos contra IAA y GAD producen un
valor altamente predictivo del comienzo de diabetes en individuos
preclínicos. De forma interesante, en la enfermedad de comienzo
temprano real, disminuye la frecuencia de anticuerpos específicos
contra GAD. Esto podría ser debido al hecho de que la reactividad
de GAD 65 desciende con la destrucción de las células beta.
La predicción de la diabetes de tipo 1 también
se puede facilitar monitorizando los niveles de glucemia del
sujeto, preferentemente en conjunción con la administración al
sujeto de un ensayo de tolerancia a la glucosa. Tales
procedimientos se llevan a cabo preferentemente en combinación con
la monitorización de los títulos de los autoanticuerpos circulantes
anti-IAA, ICA y GAD del sujeto.
Según la presente invención, las proteínas
quiméricas de la invención son proteínas de fusión que se pueden
usar como sustratos antigénicos para la detección de autoanticuerpos
circulantes, particularmente autoanticuerpos
anti-IAA y/o GAD 65, en ensayos de diagnóstico tales
como transferencia western, ELISA, RIA, ELISPOT, y similares.
Células T. Los ensayos para la detección
de células T con reactividades específicas son conocidos en la
técnica, e incluyen la reacción linfocítica mixta (MLR) y el ensayo
ELISPOT. Los ensayos ELISPOT se describen, por ejemplo, en Taguchi
et al., J Immunol Meth 1990, 128:65 y Sun et al., J
Immunol 1991 146:1490. Según la invención, las proteínas de fusión
quiméricas de la invención se pueden usar como sustratos en tales
ensayos para la detección y cuantificación de células T reactivas a
insulina y/o células T reactivas a GAD 65 y/o células T reactivas a
IA-2.
Métodos actuales para la prevención y
tratamiento de la diabetes de tipo 1. Aunque la diabetes se ha
estudiado durante siglos, sólo existen unos pocos tratamientos
eficaces para la enfermedad de tipo 1. La primera línea de
tratamiento es la dieta, con una ingesta calórica apropiada basada
en el peso corporal ideal y una distribución definida entre
proteína, glucosa y grasa. Sin embargo, en pacientes con IDDM, el
componente más importante de la terapia es la administración de
insulina, cuya meta es mantener los niveles de glucosa tan próximos
al intervalo normal como sea posible durante el día. La insulina
está disponible en formulaciones de actuación rápida, intermedia y
prolongada, que varían en el comienzo, el pico y la duración de la
acción, y se pueden usar en calendarios variables de administración
en un intento por regular óptimamente los niveles de glucosa en
plasma.
La terapia intensiva con insulina se refiere a
un régimen riguroso de administración de insulina hormonalmente
eficaz, y a la monitorización de los niveles de azúcar en la sangre.
Este régimen se diseña para controlar la glucemia de forma tan
precisa como sea posible. Los resultados del ensayo multicéntrico
del control y de las complicaciones de la diabetes establecieron
que las complicaciones de la diabetes disminuyen significativamente
mediante un mejor control de los niveles de glucemia, y de este modo
demostraron el deseo de la terapia intensiva con insulina. Un
problema con este enfoque es que la terapia intensiva con insulina
requiere un alto grado de conciencia y de cumplimiento por parte
del paciente, así como un equipo sanitario de médicos, enfermeras y
bromatólogos altamente especializados. De este modo, las metas de la
terapia intensiva con insulina son extremadamente difíciles de
lograr, incluso con pacientes motivados y educados. Otro problema es
que se observa una mayor tasa de hipoglucemia en tales pacientes
rigurosamente tratados que en pacientes que reciben regímenes de
insulina estándares, menos rigurosos.
El Ensayo de Control y de Complicaciones de la
Diabetes resaltó no sólo el beneficio de mantener los niveles
normales de glucemia para la salud metabólica general, sino también
un problema fundamental asociado con el tratamiento de la diabetes
de tipo 1, a saber, que los síntomas manifiestos de la enfermedad se
manifiestan sólo cuando se destruyen esencialmente todos los
islotes de los pacientes. Los agentes orales para la diabetes,
tales como las sulfonilureas, actúan principalmente estimulando la
liberación de insulina a partir de células beta disfuncionales, y
de este modo no son útiles para la mayoría de los pacientes con la
enfermedad de tipo 1, es decir, para aquellos pacientes con
IDDM.
Un objetivo principal en el tratamiento de la
diabetes ha sido el desarrollo de terapias capaces de abortar el
ataque autoinmunitario sobre las células beta de los islotes antes
de su destrucción total, conservando de ese modo suficiente función
endógena para mantener el control metabólico normal.
Inducción de tolerancia. En el modelo de
diabetes de ratón NOD (diabético no obeso), se ha mostrado que la
alimentación oral de insulina retrasó el comienzo y redujo la
gravedad de la enfermedad. El mecanismo propuesto para explicar la
tolerancia oral es que la administración oral de antígenos induce
poblaciones de células T Th2, específicas contra antígenos, que
segregan citoquinas antiinflamatorias tales como
IL-4, IL-10, y
TGF-beta. Estas células T circulan y se activan
para segregar citoquinas sólo en presencia de su antígeno
específico. De este modo, las células T Th2, específicas de la
insulina, se activarían sólo en el páncreas, donde producirían
citoquinas supresoras para modular el proceso autoinmunitario. Este
mecanismo no requiere, por lo tanto, que el antígeno oral
represente realmente un autoantígeno específico de la enfermedad,
sino más bien sólo que se exprese de una manera específica de
tejidos.
Por el contrario, los métodos diseñados para
producir tolerancia a las células T (por ejemplo, mediante anergia
o apoptosis) requieren la identificación de los autoantígenos reales
específicos de la enfermedad, que son seleccionados como dianas
mediante el ataque autoinmunitario. Tales antígenos se administran
entonces a pacientes de una manera apropiada tolerante (que también
puede inducir efectos tolerantes no específicos de antígenos). Dado
que la diabetes de tipo 1 es en gran medida una enfermedad mediada
por células T autorreactivas específicas de los islotes, en
principio la terapia de este tipo debería de ser factible. De este
modo, la inducción de tolerancia neonatal a GAD 65, como se cita
anteriormente, evitó el comienzo de la enfermedad en ratones NOD.
Además, la inyección de extractos brutos de los islotes de forma
intratímica, donde tiene lugar la tolerancia para desarrollar
células T, también ha protegido tanto a ratones NOD como a ratas BB
prediabéticas de desarrollar la enfermedad clínica.
Un enfoque tomado para inducir tolerancia a la
insulina implica la administración parenteral de insulina, en
combinación con un adyuvante convencional (por ejemplo, el adyuvante
de Freund). Típicamente, este enfoque implica la administración de
dosis de insulina que no serían suficientemente grandes para esperar
que se provocase un choque insulínico en el paciente. De forma
notable, los fragmentos de insulina de las proteínas de fusión
quiméricas de la presente invención son hormonalmente ineficaces, y
de este modo son adecuados para uso según los métodos de la
solicitud PCT WO 97/09061, presentada a nombre de Yi Wang.
Apoptosis. La apoptosis es una forma de
muerte celular programada que se produce en muchos sistemas
biológicos (Kerr et al., 1991; Lockshin y Zakeri, 1991;
Cohen et al., 1992; Duvall y Wyllie, 1986; Cotter et
al., 1990). Como se explica anteriormente, una célula
apoptótica sufre un programa específico de sucesos que dependen del
metabolismo activo y contribuyen a su propia autodestrucción. Las
células T que no sufren apoptosis, pero que se han activado,
llevarán a cabo sus funciones "efectoras" provocando citolisis,
o segregando linfoquinas que provocan respuestas de células B u
otros efectos inmunitarios (Paul, 1989, p. 3-38).
Estas funciones "efectoras" son la causa del daño al tejido en
enfermedades autoinmunitarias y en otras enfermedades. Un enfoque
poderoso para evitar la enfermedad es, de este modo, eliminar
permanentemente, mediante apoptosis, sólo aquellas células T que
reaccionen con antígenos que inciten a una enfermedad
autoinmunitaria, dejando intacto la mayoría del repertorio de
células T. El uso de autoantígenos para llevar a cabo este enfoque
se describe en la publicación de patente PCT nº 94/28926,
presentada a nombre de Michael J. Lenardo, y titulada "muerte
celular de linfocitos T estimulada por
interleuquina-2 para el tratamiento de enfermedades
autoinmunitarias, trastornos alérgicos y rechazo de injertos", y
en la publicación de patente PCT nº 94/03202, presentada a nombre de
Michael J. Lenardo, Stefen A. Boehme, y Jeffrey Critchfield, y
titulada "muerte celular de linfocitos T estimulada por
interleuquina-4".
Transplante. El transplante de páncreas
sano, tejido pancreático, o islotes pancreáticos aislados, en
pacientes que sufren diabetes de tipo 1, proporciona una modalidad
de tratamiento eficaz. Desafortunadamente, la duración del
beneficio terapéutico de tales transplantes está actualmente
limitada por los mismos fenómenos autoinmunitarios que provocan la
enfermedad de tipo 1 en primer lugar. En consecuencia, el
tratamiento de un paciente diabético usando las proteínas de fusión
quiméricas de la invención según los métodos de la presente
invención, cuando se lleva a cabo antes, concomitantemente con, y/o
poco después de tal transplante, aumentará la longevidad de tales
transplantes y, de ese modo, potenciará el efecto terapéutico de
tales procedimientos de transplante.
Las figuras adjuntas, que se incorporan en la
memoria descriptiva y constituyen parte de ella, ilustran ciertos
aspectos de la invención, y junto con la descripción sirven para
explicar los principios de la invención. Se entenderá, por
supuesto, que tanto las figuras como la descripción son solamente
explicativas, y no son limitativas de la invención.
El documento WO 96/26218 describe péptidos que
comprenden proinsulina y un epítopo de GAD 65 y su uso potencial en
el tratamiento de IDDM y pre-IDDM.
La Figura 1a muestra un diagrama esquemático de
la proteína de fusión IG1 (SEC ID nº:1). Los números después de las
barras inclinadas hacia la derecha, en la leyenda, indican el
fragmento peptídico de GAD 65 al que corresponde la región. Para
hGAD 65/473-5- -, 5- - indica 555.
La Figura 1b muestra un diagrama esquemático de
la proteína de fusión IG2 (SEC ID nº:2). Los números después de las
barras inclinadas hacia la derecha, en la leyenda, indican el
fragmento peptídico de GAD 65 al que corresponde la región. Para
hGAD 65/473-5- -, 5- - indica 555.
La Figura 1c muestra un diagrama esquemático de
la proteína de fusión IG3 (SEC ID nº:3). Los números después de las
barras inclinadas hacia la derecha, en la leyenda, indican el
fragmento peptídico de GAD 65 al que corresponde la región. Para
hGAD 65/473-5- -, 5- - indica 519.
La Figura 2 muestra los resultados de
experimentos de IDDM inducida por CYTOXAN, en los que se trataron
ratones NOD con seroalbúmina bovina (BSA, como control), con la
cadena B de insulina (ICB), con el péptido 250-273
de GAD 65 humana, o el péptido 520-555 de GAD 65
humana (un péptido con una secuencia que corresponde a los residuos
de aminoácidos 139-173 de SEC ID nº:2).
La Figura 3 muestra los resultados de
experimentos de IDDM inducida por CYTOXAN, en los que se trataron
ratones NOD con seroalbúmina bovina (BSA, como control), o con las
siguientes mezclas de cadena B de insulina (ICB) y péptidos de GAD
65 humana: 1) 100 \mug de cada uno de ICB y del péptido
250-273 de GAD 65 humana, 2) 250 \mug de cada
uno de ICB y del péptido 250-273 de GAD 65 humana,
3) 100 \mug de cada uno de ICB, del péptido
250-273 de GAD 65 humana, y del péptido
520-555 de GAD 65 humana, y 4) 250 \mug de cada
uno de ICB, del péptido 250-273 de GAD 65 humana, y
del péptido 520-555 de GAD 65 humana.
La Figura 4 muestra los resultados de los
experimentos de IDDM inducida por CYTOXAN, en los que se trataron
ratones NOD con seroalbúmina bovina (BSA, como control) o con 100
\mug de la proteína quimérica IG1, 250 \mug de la proteína
quimérica IG1, 100 \mug de la proteína quimérica IG2, o 250 \mug
de la proteína quimérica IG2.
La Figura 5 muestra los resultados de la
transferencia adoptiva de experimentos de IDDM.
La Figura 6 muestra un diagrama esquemático de
la proteína de fusión IG4 (SEC ID nº:4). Los números después de las
barras inclinadas hacia la derecha, en la leyenda, indican la
posición del componente del fragmento peptídico indicado en GAD 65
humana nativa a partir del cual se derivó su secuencia, mientras que
los números aa en paréntesis indican los números de aminoácidos
correspondientes en SEC ID nº:4, y la notación GGG indica la
incorporación en ese punto de un ligador de ruptura de hélice de
tres glicinas.
La Figura 7 muestra un diagrama esquemático de
la proteína de fusión IG5 (SEC ID nº:5). Los números después de las
barras inclinadas hacia la derecha, en la leyenda, indican la
posición del componente del fragmento peptídico indicado en GAD 65
humana nativa a partir del cual se derivó su secuencia, mientras que
los números aa en paréntesis indican los números de aminoácidos
correspondientes en SEC ID nº:5, y la notación GGG indica la
incorporación en ese punto de un ligador de ruptura de hélice de
tres glicinas.
La Figura 8 muestra un diagrama esquemático de
la proteína de fusión IG6 (SEC ID nº:6). Los números después de las
barras inclinadas hacia la derecha, en la leyenda, indican la
posición del componente del fragmento peptídico indicado en GAD 65
humana nativa a partir del cual se derivó su secuencia, mientras que
los números aa en paréntesis indican los números de aminoácidos
correspondientes en SEC ID nº:6, y la notación GGG indica la
incorporación en ese punto de un ligador de ruptura de hélice de
tres glicinas. Como se indica en la leyenda, IG6 comprende, además
de las porciones indicadas de insulina humana y GAD 65 humana (hGAD
65), una porción C-terminal de IA-2
humano (hIA2) que abarca los aminoácidos 771-979 de
la proteína humana nativa (aminoácidos 176-387 de
SEC ID nº:6), con un ligador de ruptura de hélice de tres glicinas
incorporado en el extremo N de esta porción de
IA-2.
La Figura 9 muestra un diagrama esquemático de
la proteína de fusión IG7 (SEC ID nº:7). Los números después de las
barras inclinadas hacia la derecha, en la leyenda, indican la
posición del componente peptídico de la proteína humana nativa a
partir del cual se derivó su secuencia, mientras que los números aa
en paréntesis indican los números de aminoácidos correspondientes
en SEC ID nº:7, y la notación GGG indica la incorporación en ese
punto de un ligador de ruptura de hélice de tres glicinas. Como se
indica en la leyenda, IG7 comprende, además de las porciones
indicadas de insulina humana y GAD 65 humana (hGAD 65), una porción
C-terminal de IA-2 humano (hIA2)
que abarca los aminoácidos 771-979 de la proteína
humana nativa (aminoácidos 228-439 de SEC ID nº:7),
con un ligador de ruptura de hélice de tres glicinas incorporado en
el extremo N de esta porción de IA-2.
A la vista de lo anterior, los objetos de esta
invención incluyen la provisión de nuevas proteínas de fusión
quiméricas que actúan como entidades moleculares individuales que 1)
facilitan la evaluación de diagnóstico y pronóstico de individuos
que se sospecha que tienen predisposición a desarrollar IDDM, así
como también aquellos que sufren IDDM y/o el síndrome de
Stiff-Man, y 2) proporcionan efectos beneficiosos
potenciados cuando se administran a animales (incluyendo pacientes
humanos) que sufren o tienen riesgo de desarrollar diabetes
autoinmunitaria (de tipo 1). Para estos fines, la invención
proporciona proteínas de fusión quiméricas que comprenden epítopos
tanto de GAD (glutamato descarboxilasa) 65 como de insulina.
Preferentemente, la GAD y la insulina son GAD e insulina
humanas.
Según la invención, la combinación de péptidos
de GAD 65 y de insulina en una única proteína de fusión proporciona
un reactivo de diagnóstico más conveniente para la detección y
evaluación del pronóstico de diabetes o del síndrome de
Stiff-Man. La explicación del síndrome de
Stiff-Man se puede encontrar, por ejemplo, en la
patente US nº 5.691.448.
Según la invención, (y como se establece en los
ejemplos, descritos a continuación) la combinación de cadenas y/o
péptidos de GAD 65 y de insulina en una única proteína de fusión
quimérica proporciona además un compuesto que se puede administrar
para proporcionar un tratamiento terapéutico inmunomodulador más
eficaz que la combinación de los mismos péptidos y/o cadenas de
insulina como fragmentos peptídicos y cadenas de insulina
individuales discretos. Más específicamente, las proteínas de
fusión quiméricas preferidas de la invención, cuando se estudian en
un ensayo en un modelo de ratón de IDDM, proporcionan una reducción
en la frecuencia de comienzo de diabetes mayor que una mezcla de
control que contiene cantidades equimolares de cada uno de los
diversos fragmentos peptídicos y cadenas de insulina individuales
discretos comprendidos por la proteína de fusión quimérica, no
estando cada uno de dichos fragmentos peptídicos y cadenas de
insulina individuales unidos covalentemente a ningún otro de dichos
fragmentos peptídicos y cadenas de insulina individuales en dicha
mezcla, en el que el ensayo se lleva a cabo mediante la
administración parenteral repetida de un número de dosis medidas,
teniendo cada dosis una cantidad molar predeterminada de dicha
proteína de fusión quimérica en un vehículo farmacéuticamente
eficaz, o de dicha mezcla de control en el vehículo
farmacéuticamente eficaz, realizándose la administración a
intervalos no menores que doce horas y no mayores que 72 horas entre
cada una de las dosis.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
frase "los mismos péptidos y cadenas de insulina como fragmentos
peptídicos individuales discretos", usada en comparación con una
proteína de fusión quimérica particular de la invención, indica una
combinación de péptidos y cadenas de insulina aislados que no están
enlazados covalentemente entre sí (por ejemplo, mediante enlaces
peptídicos), en el que la unión (vía enlaces peptídicos) de los
péptidos y cadenas de insulina juntos en el orden apropiado (por
ejemplo, la misma posición relativa en la secuencia desde el amino
terminal hasta el carboxilo terminal, como se encuentra en GAD 65 de
longitud completa y en las cadenas de insulina de longitud
completa) produciría la proteína de fusión quimérica particular de
la invención.
Aunque no se desea estar atados por ninguna
teoría particular de operación, se cree que los complejos efectos
de procesamiento y presentación de antígenos in vivo son los
responsables de los inesperados efectos sinérgicos procedentes de
la combinación de los péptidos y/o polipéptidos de GAD 65 y de
insulina en una única proteína de fusión quimérica.
Las proteínas de fusión quiméricas de la
invención combinan cada una en una única entidad molecular los
epítopos autoantigénicos clave (inmunodominantes) tanto de la
insulina como de GAD 65. Al hacerlo así, proporcionan compuestos de
diagnóstico y terapéuticos de un único componente. Las proteínas de
fusión quiméricas de la invención proporcionan efectos beneficiosos
potenciados tras la administración a animales (incluyendo pacientes
humanos), cuando se comparan con la administración de combinaciones
de los péptidos individuales que representan los mismos epítopos
inmunodominantes tal como están comprendidos dentro de las proteínas
de fusión quiméricas.
Las proteínas de fusión quiméricas de la
invención comprenden la cadena B de insulina (por ejemplo, los
aminoácidos 1-31 de la insulina humana), y
preferentemente comprenden además la cadena C de insulina (el
"fragmento C", por ejemplo, los aminoácidos
32-38 de insulina humana). Se conocen las secuencias
de aminoácidos de las cadenas de insulina. Véase, por ejemplo, la
patente US nº 4.431.740 para la descripción de cadenas de insulina,
y el contenido de las secuencias de insulina allí. Véase también la
patente US nº 5.008.241.
Las proteínas de fusión quiméricas de la
invención comprenden además al menos un péptido de GAD.
Según la invención, el al menos un péptido de
GAD es un péptido de GAD 65 seleccionado de entre el grupo que
consiste en los péptidos 115-127 de GAD 65 humana
(un péptido que corresponde a los residuos de aminoácidos
39-50 de SEC ID nº:2), 247-286 (un
péptido que corresponde a los residuos de aminoácidos
51-90 de SEC ID nº:2), y 473-519
(un péptido que corresponde a los residuos de aminoácidos
92-144 de SEC ID nº:2). Se conocen las secuencias
de aminoácidos completas de los polipéptidos de GAD 65. Véase, por
ejemplo, la patente US nº 5.691.448.
Los resultados de estudios descritos más abajo
sugieren que la inclusión del péptido 520-555 de GAD
65 humana (un péptido con una secuencia de aminoácidos que
corresponde a residuos de aminoácidos 139-173 de SEC
ID nº:2) tiene un efecto nocivo con el resultado inmunomodulador de
la administración de proteínas o péptidos de insulina y de GAD. En
consecuencia, aunque dentro del alcance de la invención, las
proteínas de fusión quiméricas que comprenden el péptido
520-555 de GAD 65 humana están desfavorecidas. Las
proteínas de fusión quiméricas de la invención no incluyen
secuencias peptídicas que corresponden a aquellos péptidos de GAD 65
humana (particularmente aquellos péptidos de GAD 65
aminoterminales) identificados como inhibidores de la solubilidad de
GAD en la patente US nº 5.691.448, y que no contienen regiones
peptídicas de GAD 65 que están asociadas con la patogénesis del
síndrome de Stiff-Man. De este modo, según las
enseñanzas de Butler et al., 1993, con respecto a epítopos
dominantes de GAD reconocidos por autoanticuerpos en el síndrome de
Stiff-Man, las proteínas de fusión quiméricas de la
invención no incluyen regiones peptídicas que comprenden los
aminoácidos 1-95 de GAD 65; adicionalmente, no
incluyen regiones peptídicas que comprenden cualquiera o ambos
aminoácidos 475-484 ó 571-585 de GAD
65.
Preferentemente, los péptidos de GAD están
dispuestos adyacentemente entre sí (es decir, sin que intervengan
más de aproximadamente tres aminoácidos entre ellos) en el mismo
orden como se encuentran en GAD 65, y las cadenas de insulina están
dispuestas adyacentemente entre sí en el mismo orden como se
encuentran en preproinsulina. En algunas formas de realización de
la invención, también se prefiere una disposición en la que las
cadenas de insulina están en aminoterminal con respecto a los
péptidos de GAD.
En algunas formas de realización preferidas, al
menos uno (preferentemente cada uno) de los residuos de cisteína en
las secuencias de aminoácidos de los diversos antígenos y péptidos
antigénicos combinados para formar las proteínas de fusión
quiméricas de la invención se sustituye por un aminoácido no cargado
(es decir, un aminoácido que no está cargado a un pH entre 6 y 7)
que tiene un peso molecular menor que aproximadamente 150. En otra
forma de realización preferida, no se sustituye ninguno de tales
residuos de cisteína, es decir, no se realizan sustituciones de
ninguno de los residuos de cisteína presentes en cualquiera de los
diversos antígenos y péptidos antigénicos combinados para formar la
proteína de fusión quimérica. Cuando se sustituyen los residuos de
cisteína, el aminoácido no cargado es preferentemente un aminoácido
estándar. Preferentemente, el aminoácido estándar es alanina o
serina. Preferentemente, la sustitución de cisteína por otro
aminoácido neutro es una sustitución neutra de epítopo, es decir,
no da como resultado una conversión de epítopo en ninguno de los
epítopos inmunodominantes conocidos de la proteína de fusión
quimérica, particularmente los de GAD o de insulina.
En el documento WO 9634622 (solicitud US nº de
serie 08/431.644, presentada el 2 de mayo de 1995 a nombre de
Steven H. Nye et al.), por ejemplo en las páginas
34-36 de la memoria descriptiva de esa solicitud tal
como se presentó, se pueden encontrar explicaciones detalladas de
las sustituciones neutras de epítopos y de la conversión de
epítopos. Los expertos en la materia comprenderán fácilmente la
aplicación de aquellas enseñanzas a las proteínas de fusión
quiméricas de la presente invención.
Es un objetivo adicional proporcionar métodos
inmunomoduladores tanto para la prevención como para el tratamiento
de diabetes mellitus de tipo 1 y la mejora de los defectos
autoinmunitarios subyacentes a esta enfermedad. En consecuencia, es
un objetivo adicional de la invención proporcionar el uso de las
proteínas de fusión quiméricas de la invención en la fabricación de
medicamentos inmunomoduladores.
Para alcanzar estos y otros objetos, la
invención proporciona métodos para tratar un paciente que necesite
tal tratamiento, por ejemplo un paciente seleccionado de entre el
grupo de pacientes que consiste en pacientes con riesgo de
desarrollar diabetes de tipo 1 y pacientes que sufren diabetes de
tipo 1, para retrasar el comienzo o reducir los síntomas de
diabetes en el paciente, y/o para mejorar la destrucción
autoinmunitaria de las células beta pancreáticas en pacientes
tratados. Tal tratamiento es particularmente ventajoso, y
preferentemente se lleva a cabo, durante el "período de luna de
miel", durante una fase temprana de la progresión de la
enfermedad, antes de que todas las células beta del paciente hayan
sido destruidas por la enfermedad, o en una fase tardía de la
progresión de la enfermedad, cuando un paciente es un candidato para
el transplante de células de los islotes o de tejidos que contienen
tales células.
Estos métodos comprenden la administración de al
menos un polipéptido de la invención al paciente. En una forma de
realización preferida, dicha administración se lleva a cabo en un
programa modulador de células T terapéutico, es decir, un programa
diseñado para inducir apoptosis, anergia, u otra modulación de la
actividad autoinmunitaria de células T que reaccionan con al menos
un epítopo del al menos un polipéptido. Las características
particulares de tales programas moduladores de células T
terapéuticos se exponen más abajo. Otros métodos preferidos de
tratamiento de la invención incluyen la administración de al menos
un polipéptido de la invención al paciente mediante las vías oral,
intravenosa, o, preferentemente, subcutánea, o vía administración
parenteral con, o preferentemente sin, un adyuvante tal como el
adyuvante incompleto de Freund, el adyuvante completo de Freund, el
adyuvante de alumbre, u otros adyuvantes inmunogénicos conocidos
ahora o desarrollados subsiguientemente.
Proteínas de fusión quiméricas. Todos los
polipéptidos sintetizados en sistemas biológicos están formados
inicialmente con un residuo de metionina N-terminal.
Los residuos de aminoácidos N-terminales y
C-terminales extremos no se consideran esenciales
para el uso funcional de los polipéptidos de la invención, que,
aunque no se prefiere particularmente, se pueden producir sin
dichos residuos. Por ejemplo, los polipéptidos se pueden sintetizar
químicamente sin las metioninas N-terminales. Las
proteínas quiméricas de la invención incluyen así IG1 (que
comprende los residuos de aminoácidos que comienzan en
aproximadamente el residuo 2 y que terminan en aproximadamente el
residuo 153 de SEC ID nº:1), IG2 (que comprende los residuos de
aminoácidos que comienzan en aproximadamente el residuo 2 y que
terminan en aproximadamente el residuo 173 de SEC ID nº:2).
Preferentemente, IG1 comprende los residuos de aminoácidos
1-154 de SEC ID nº:1, e IG2 comprende los residuos
de aminoácidos 1-174 de SEC ID nº:2.
En ciertas formas de realización preferidas,
estas proteínas quiméricas pueden comprender además una etiqueta de
histidina (es decir, un tramo de al menos cinco y preferentemente
seis residuos de histidina contiguos, lo que facilita la
purificación de la proteína de fusión quimérica mediante
cromatografía mediante quelación con un metal). Preferentemente, la
etiqueta de histidina está localizada en el extremo C extremo de la
proteína de fusión quimérica. Las etiquetas de histidina se
explican con mayor detalle en el documento WO 9634622 (solicitudes
de patentes US nº de serie 08/431.644 y nº 08/482.114).
En consecuencia, en algunas de estas formas de
realización preferidas, IG1 comprende los residuos de aminoácidos
1-160 de SEC ID nº:1 y tiene un peso molecular
predicho de aproximadamente 18,8 kDa, e IG2 comprende los residuos
de aminoácidos 1-180 de SEC ID nº:2 y tiene un peso
molecular predicho de aproximadamente 21,2 kDa.
Al diseñar IG4 (SEC ID nº:4), IG5 (SEC ID nº:5)
e IG6 (SEC ID nº:6), se puso atención particular a las estructuras
secundarias predichas de los polipéptidos de la invención. IG4 se
diseñó inicialmente uniendo hipotéticamente epítopos peptídicos de
interés para formar una única secuencia hipotética, IG4NHB (SEC ID
nº:8).
La predicción de la estructura secundaria de
IG4NHB (SEC ID nº:8) según Chou y Fasman, 1978, según Chou 1990, y
según Garnier et al., 1978, se realizó usando el programa de
ordenador de análisis de secuencia LASERGENE (DNASTAR, Madison WI).
Este algoritmo predice la estructura secundaria de proteínas a
partir de sus secuencias de aminoácidos. También se pueden usar
para este fin otros programas de ordenador de análisis de
secuencias, incluyendo otro programa de ordenador comercialmente
disponible tal como GCG o MACVECTOR.
Se predijo que toda la secuencia, desde el
aminoácido 77 (Phe 77) hasta el aminoácido 134 (Thr 134), de IG4NHB
(SEC ID nº:8) tiene características formadoras de hélice. La
tendencia a la formación de hélice larga real disminuye muy
rápidamente para secuencias superiores de 20 aminoácidos, no
conteniendo las hélices más largas no rotas típicamente más de 26
aminoácidos. De este modo, sería de esperar que la secuencia de 57
aminoácidos formadora de hélice, desde el aminoácido 77 hasta el
134 de IG4NHB (SEC ID nº:8), se rompiese en puntos impredecibles,
si no aleatorios, para formar una variedad de estructuras
diferentes. Tales estructuras son indeseables en las proteínas de
fusión quiméricas, puesto que probablemente tendrían tendencia a la
agregación incontrolable, y sería de esperar que difiriesen de las
estructuras secundarias nativas de los epítopos en los péptidos
aislados comprendidos por las proteínas de fusión quiméricas y en
las proteínas nativas de las que se derivan los péptidos (por
ejemplo, insulina, GAD 65, o IA-2), cuyas
estructuras secundarias nativas se prefieren para los epítopos
contenidos dentro de las proteínas de fusión quiméricas. Por lo
tanto, en ciertas formas de realización preferidas, se insertan
rompedores de hélices (véase el siguiente párrafo) entre los
epítopos para 1) bloquear la formación de una hélice muy larga y 2)
separar de forma predecible los epítopos en distintas entidades
estructurales con distintas estructuras secundarias.
Los rompedores de hélices son aminoácidos, o
grupos de aminoácidos secuenciales, que actúan bloqueando la
propagación de las estructuras secundarias helicoidales en cadenas
polipeptídicas nacientes. Se sabe que Gly y Pro son fuertes
rompedores de hélices, Asn y Tyr son débiles rompedores de hélices.
La inserción de cualquiera de estos aminoácidos o sus combinaciones
en un polipéptido tenderá a provocar que una hélice de estructura
secundaria polipeptídica naciente termine en el punto de la
inserción. Para asegurar la terminación de la hélice y la
separación de los epítopos deseados, se prefiere un rompedor de
hélices que tenga una longitud de al menos dos aminoácidos (en el
que cada uno de los aminoácidos es igual o diferente del otro, y se
selecciona del grupo que consiste en Gly, Pro, Asn y Tyr), más
preferentemente tal rompedor de hélices tiene una longitud de al
menos tres aminoácidos. Lo más preferible, el rompedor de hélices
tiene una longitud de exactamente tres aminoácidos. Los rompedores
de hélices muy preferidos son
Pro-Pro-Pro (SEC ID nº:9) y
Gly-Gly-Gly (SEC ID nº:10), siendo
éste último el más preferido de estos.
Dosificación. Según la presente
invención, cuando se usan como agentes terapéuticos, las proteínas
quiméricas de la invención se administran a pacientes que necesitan
tal tratamiento en cantidades que oscilan desde aproximadamente 6,9
pM/kg/paciente hasta aproximadamente 8,6 \muM/kg/paciente.
Preferentemente, las cantidades oscilan desde aproximadamente 34,5
pM/kg/paciente hasta aproximadamente 5,2 \muM/kg/paciente. Más
preferentemente, las cantidades oscilan desde aproximadamente 170
pM/kg/paciente hasta aproximadamente 3,5 \muM/kg/paciente. Lo más
preferible, las cantidades oscilan desde aproximadamente 0,5
\muM/kg/paciente hasta aproximadamente 3,5
\muM/kg/paciente.
En algunos de sus aspectos, la presente
invención también proporciona la administración repetida de dosis
que contienen menores cantidades de las proteínas de fusión
quiméricas de la invención a un paciente que necesite tal
tratamiento. Aunque se prefieren menos, en la práctica de la
presente invención se pueden usar dosis que contienen cantidades
por debajo de aproximadamente 6,9 pM/kg/paciente, y tan bajas como
aproximadamente 1 pM/kg/paciente.
Preferentemente, las proteínas quiméricas se
administran sin la administración concomitante de un adyuvante; sin
embargo, cuando se usan para realizar ensayos con células T (por
ejemplo, en ratones transgénicos tales como los descritos en Wong
et al. 1998), la administración inicial a animales
experimentales se realiza preferentemente con adyuvante.
Según la invención, un programa modulador de
células T terapéutico implica la administración de dosis que
contienen las proteínas quiméricas de la invención, preferentemente
en un vehículo farmacéuticamente eficaz, de forma repetida al
paciente, al menos dos veces en un intervalo de al menos seis, y
preferentemente al menos doce horas, con un intervalo no mayor de
siete días, preferentemente no más de 72 horas, más preferentemente
no más de 48 horas, y lo más preferible no más de 24 horas entre
dosis.
Según la presente invención, las proteínas de
fusión quiméricas de la invención se administran preferentemente de
forma parenteral sin la administración concomitante de un adyuvante.
La administración mediante una vía parenteral será típicamente vía
inyección, tal como la inyección intravascular (por ejemplo,
infusión intravenosa), inyección subcutánea, o inyección
intramuscular. Si se desea, se pueden usar otras vías de
administración no orales, por ejemplo mucosal, mediante inhalación,
transdérmica, mediante ultrasonidos, y similares, y pueden ser
practicables para el polipéptido particular a administrar.
Aunque menos preferido, las proteínas de fusión
quiméricas de la invención también se pueden administrar oralmente;
sin embargo, las dosificaciones para la administración oral serán
típicamente uno o dos órdenes de magnitud mayores que las
explicadas anteriormente en el encabezado de
"Dosificación".
Las formulaciones adecuadas para inyección y
para otras vías de administración son bien conocidas en la técnica,
y se pueden encontrar, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical
Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17ª
edición (1985). Las formulaciones preferidas para la administración
parenteral de las proteínas de la invención son aquellas descritas
para la insulina en la USP 23/NF 18 (1995).
Las formulaciones parenterales deben ser
estériles y apirógenas, y generalmente incluirán un vehículo
farmacéuticamente eficaz, tal como disolución salina, disolución
salina tamponada (por ejemplo, tamponada con fosfato), disolución
de Hank, disolución de Ringer, dextrosa/disolución salina,
disoluciones de glucosa, y similares. Las formulaciones también
pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables,
según se requiera, tales como agentes que ajustan la tonicidad,
agentes humectantes, agentes bactericidas, conservantes,
estabilizantes, y similares.
Otras discusiones de la dosificación y
administración de polipéptidos usando programas moduladores de
células T terapéuticos se pueden encontrar en los documentos WO
9634622 (solicitudes de patentes US nº de serie 08/431.644 y nº
08/482.114) (discutido anteriormente) y WO 9709065 (solicitud de
patente US nº de serie 08/565.769, presentada el 1 de diciembre de
1995 a nombre de Yi Wang), para describir de forma más completa el
estado de la técnica a la que pertenece la presente invención.
Sin pretender limitarla de ninguna manera, la
presente invención se describirá de forma más completa mediante los
siguientes ejemplos.
Los ratones diabéticos no obesos (NOD) son una
raza de ratones que tienen tendencia a desarrollar diabetes, y
representan un sistema de modelo aceptado para el estudio de
diabetes mellitus. Estos ratones, denominados
NOD/MrkTacfBR, se adquirieron de Taconic Farms (Germantown, NY). Los ratones NOD SCID, denominados NOD/SCID, están disponibles de Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME. La incidencia de diabetes a los 200 días de edad en estos ratones es de 80% en hembras y 50% en machos. A los 110 días de edad, poco más del 15% de los ratones NOD machos se hicieron diabéticos.
NOD/MrkTacfBR, se adquirieron de Taconic Farms (Germantown, NY). Los ratones NOD SCID, denominados NOD/SCID, están disponibles de Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME. La incidencia de diabetes a los 200 días de edad en estos ratones es de 80% en hembras y 50% en machos. A los 110 días de edad, poco más del 15% de los ratones NOD machos se hicieron diabéticos.
Experimentos de inducción con CYTOXAN: El
tratamiento con CYTOXAN (ciclofosfamida) puede incrementar la
incidencia y acelerar el comienzo de diabetes en ratones NOD no
diabéticos. Se inyectaron (ip) ratones NOD machos no diabéticos,
seleccionados al azar, que tenían 100 a 110 días, con ciclofosfamida
(250 mg/kg) en el día 0.
Todos los ratones se sometieron a medida de
glucosuria 2-3 veces por semana durante un período
de 21 días después de la inyección de ciclofosfamida. El comienzo
de la diabetes se registró como el primer punto en el que se
obtuvieron dos días consecutivos de resultados positivos de
glucosuria. También se midió la glucemia para confirmar los
resultados de la glucosuria. (ExacTech, MediSense Inc., Cambridge,
MA). En todos los ratones ensayados con glucosuria positiva, los
niveles de glucemia fueron mayores que 150 mg/dl. En el día 21,
estos ratones se sacrificaron y se examinaron histológicamente.
Experimentos en el modelo de transferencia
adoptiva de NOD/SCID: Se cosecharon células mononucleares del
bazo procedentes de ratones NOD diabéticos de comienzo reciente de
la enfermedad (diabéticos desde hace no más de 3 semanas), y
aproximadamente 35 x 10^{6} de estas células del bazo en 0,2 ml de
PBS se inyectaron intravenosamente en ratones NOD/SCID de
6-8 semanas. El comienzo de la diabetes se
monitorizó bisemanalmente mediante el ensayo de glucosuria, y se
confirmó mediante ensayo de la glucemia en el día 28 con relación al
tiempo de la transferencia de las células del bazo. En el día 28,
estos ratones se sacrificaron y se examinaron histológicamente.
Se disolvió CYTOXAN (ciclofosfamida, Mead
Johnson Oncology Products) en agua destilada (25 mg/ml). La cadena
B de insulina bovina oxidada se adquirió de Sigma (número de
catálogo I-6383). Tanto la cadena B de insulina
como la proteína de control de BSA (Miles Inc.,
#81-001) se disolvieron en PBS/HCl 1 M, pH 2, antes
de la diálisis contra PBS, pH 7,2, la filtración estéril y el
almacenamiento de alícuotas congeladas.
IG1. Se construyó un gen quimérico sintético,
que codifica la proteína quimérica IG1 (SEC ID nº:1), en dos rondas
de PCR que solapan (HO et al., 1989). Cada subdominio génico
se sintetizó en una reacción de PCR estándar de 100 \mul usando
10 pmoles de cada uno de los cebadores oligonucleotídicos
apropiados, como se describe más abajo. El segmento génico 5' se
amplificó usando los cebadores que solapan: prIG1 (SEC ID nº:11) y
prIG2 (SEC ID nº:12). El segmento génico 3' se amplificó usando los
cebadores que solapan prIG3 (SEC ID nº:13) y prIG4 (SEC ID nº:14).
El oligonucleótido prIG1 (SEC ID nº:11) se diseñó para permitir la
creación de un único sitio de restricción NdeI en el extremo
5'. El cebador de prIG4 (SEC ID nº:14) incluyó un único sitio
BamHI, un codón de parada (TAA) y 18 nucleótidos que
codificaron una secuencia de etiqueta de histidina para la
purificación de la proteína quimérica recombinante mediante
cromatografía de afinidad metálica. Los dos subdominios se
combinaron usando oligonucleótidos de flanqueo prIG5 (SEC ID nº:15)
y prIG6 (SEC ID nº:16) en una segunda reacción de PCR, para
producir un producto génico de 492 pb. El producto de la PCR se
clonó en el vector plasmídico de expresión pCR2.1 como se describe
por el proveedor (Invitrogen, San Diego, CA). Se seleccionaron
transformantes DH10B resistentes a canamicina, y los clones
correctos y las orientaciones se determinaron mediante restricción
y análisis de la secuencia. Se combinaron fragmentos de restricción
procedentes de dos clones (nº 6 y nº 18), para eliminar las
mutaciones indeseadas. Tras el análisis de la secuencia
nucleotídica, se digirió un plásmido independiente
pCR2.1-IG1 con NdeI y BamHI, y el fragmento de 492
pb se insertó en los sitios compatibles del plásmido de expresión
MP4 pET22b-MP4 (Elliott et al., 1996),
produciendo el plásmido pIG1. El inserto procedente de
pCR2.1-IG1 también se subclonó en el vector
plasmídico pBLUSCRIPTSK+ (STRATAGENE CLONING SYSTEMS, La Jolla; CA)
para producir el plásmido pSK+IG1. El gen IG1 sintético (SEC ID
nº:17) codifica una proteína de fusión quimérica con una masa
predicha de aproximadamente 18,8 kDa.
IG2. Se construyó un gen quimérico sintético,
que codifica la proteína quimérica IG2 (SEC ID nº:2), mediante
amplificación por PCR de un fragmento génico IG1 interno usando pIG1
como molde junto con el cebador de sentido prIG7
(5'-AGATCTGATG AACATTCTGC TGCAGTATGT TGTTAAAAGC TTCGATAACA
TGTATGCCAT GATG-3' - SEC ID nº:18; se subraya el
sitio de BglII) en combinación con el cebador
oligonucleotídico antisentido prIG8 (5'-TGTACAGATA TTCCGCCAGT
TCCAGACATT TTTTCAGAGA AAAATGGCTA TGTTCAGAGG TAAAGGCAAT
CAGACGCG-3' - SEC ID nº:19; se subraya el sitio de
BsrG1). El fragmento de PCR de BglII-BsrG1 de
197 pb se subclonó en pCR2.1. El análisis de secuencias reveló una
sustitución C > G en la posición 183 en la hebra codificante del
fragmento de PCR de BglII-BsrG1 de 197 pb para
todos los subclones analizados, y el plásmido se denominó
pCR2.1-IG7/8C183G. El análisis subsiguiente reveló
un error en la secuencia del cebador prIG8 original (SEC ID nº:19).
Se sintetizó un cebador de reparación, prIG12 (SEC ID nº:20), para
corregir la sustitución C > G en
pCR2.1-IG7/8C183G. El segmento de ADN de
BglII-BsrG1 de 197 pb interno se corrigió mediante
PCR usando pCR2.1-IG7/8C183G como molde junto con
los cebadores prIG7 (SEC ID nº:18) y prIG12 (SEC ID nº:20). Los
fragmentos de la PCR se subclonaron en pCR2.1, su secuencia se
determinó usando una secuenciación didesoxi estándar, para confirmar
que se había obtenido la secuencia deseada, y se aisló y se
amplificó un único clon denominado
pCR2.1-IG7/12.
El fragmento de restricción de
BglII-BsrG1 de 137 pb en pSK+IG1 se intercambió con
el fragmento de BglII-BsrG1 de 197 pb procedente de
pCR2.1-IG7/12, para crear pSK+/IG7/12. El fragmento
de NdeI-BamHI de 552 pb procedente de pSK+/IG7/12
se subclonó en los sitios compatibles de pIG1, para crear el
plásmido pIG2. El gen de IG2 sintético (SEC ID nº:21) codifica una
proteína de fusión quimérica con una masa predicha de
aproximadamente 21,2 kDa.
IG3. Se construyó un gen quimérico sintético,
que codifica la proteína quimérica IG3 (SEC ID nº:3), eliminando un
fragmento de restricción de NdeI-BamHI de 552 pb a
partir del plásmido pET22b-IG2 y sustituyéndolo por
un producto de PCR de 444 pares de bases digerido mediante
NdeI-BamHI. Este producto de PCR de 444 pares de
bases se obtuvo usando los cebadores prIG5 (SEC ID nº:15) y prIG13
(SEC ID nº:22), con el gen IG2 sintético como molde. El gen IG3
sintético (SEC ID nº:23) codifica una proteína de fusión quimérica
con una masa predicha de aproximadamente 17,1 kDa.
IG4. Se presenta más abajo, como SEC ID nº:24,
una secuencia génica que codifica la proteína quimérica IG4 (SEC ID
nº:4), y codifica una proteína de fusión quimérica con una masa
predicha de aproximadamente 19,8 kDa.
IG5. Se construyó un gen quimérico sintético,
que codifica la proteína quimérica IG5 (SEC ID nº:5), vía ligación
de productos de PCR usando cebadores prIG14 (SEC ID nº:25), prIG15
(SEC ID nº:26), prIG16 (SEC ID nº:27), prIG17 (SEC ID nº:28),
prIG18 (SEC ID nº:29), prIG19 (SEC ID nº:30), prIG20 (SEC ID nº:31),
prIG21 (SEC ID nº:32), prIG22 (SEC ID nº:33), y prIG23 (SEC ID
nº:34). El gen sintético de IG5 (SEC ID nº:35) codifica una
proteína de fusión quimérica con una masa predicha de
aproximadamente 25,3 kDa.
IG6. Se presenta más abajo, como SEC ID nº:36,
una secuencia génica que codifica una proteína quimérica IG6 (SEC
ID nº:6), y codifica una proteína de fusión quimérica con una masa
predicha de aproximadamente 43,7 kDa.
IG7. Se presenta más abajo, como SEC ID nº:37,
una secuencia génica que codifica la proteína quimérica IG7 (SEC ID
nº:7), y codifica una proteína de fusión quimérica con una masa
predicha de aproximadamente 49,2 kDa.
Expresión y purificación de proteínas de
fusión IG recombinantes. Para cada construcción plasmídica de
expresión de la proteína de fusión IG que se expresó
bacterianamente, se transformó la cepa BL21(DE3)
electrocompetente de E. coli con el plásmido de expresión, y
se seleccionaron colonias resistentes a ampicilina para cultivo
líquido. El lisógeno 1DE3 en la cepa BL21(DE3) contiene el
gen para T7 polimerasa detrás del promotor lacUV5 de E. coli
para la expresión eficiente de genes diana bajo el control de las
fuertes señales transcripcionales y de traducción del bacteriófago
T7 (Studier et al., 1990).
La proteína de fusión quimérica recombinante se
purificó a partir de peletes solubilizados de células completas
mediante cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados,
y se analizó mediante SDS-PAGE/tinción con azul de
Coomassie. Se hicieron crecer cuatro litros de cultivos hasta una
OD_{600} de 0,8 en medio Terrific Broth (TB) (Sambrook et
al., 1992). La expresión de la proteína se indujo durante 5
horas con 1 mM de isopropiltiogalactósido (IPTG). Las células
inducidas se cosecharon mediante centrifugación, y se congelaron
toda la noche a -20ºC. Los peletes celulares se descongelaron a
temperatura ambiente y se homogeneizaron en 10 ml/g de Tampón A (6
M de guanidina-HCl/glicerina al 10%/20 mM de
Tris-Cl pH 7,8/500 mM de NaCl/200 mg de sulfito de
sodio/280 mg de tetrationato de sodio), usando un homogeneizador
TEKMAR (The Tekmar Co., Cincinnati, OH). Las células se congelaron
a -70ºC durante 1 hora, y se descongelaron a temperatura ambiente
para promover la lisis celular. La suspensión celular se mezcló
suavemente durante 30 minutos a temperatura ambiente usando un
agitador magnético. La fracción soluble que contiene la proteína IG
se recogió como el sobrenadante tras la centrifugación del lisado
celular a 10.000 x g durante 30 min. a 4ºC en un rotor Beckman
JA-10. El sobrenadante se cargó en una columna de
Ni-NTA (QIAGEN Inc., Chadsworth, CA) equilibrada
previamente en Tampón A a un caudal de 8 ml/min. La columna se lavó
hasta una absorbancia inicial usando Tampón A. La columna se lavó
posteriormente con Tampón B (6 M de urea/glicerina al 10%/20 mM de
Tris-Cl/500 mM de NaCl, pH 7,8), y las proteínas de
E. coli contaminantes se eliminaron con Tampón C (6 M de
urea/glicerina al 10%/20 mM de Tris-Cl/500 mM de
NaCl, pH 5,0). La proteína IG se eluyó con Tampón D (6 M de
urea/glicerina al 10%/20 mM de Tris-Cl/500 mM de
NaCl, pH 4,0). Todas las fracciones se recogieron en un lote y se
analizaron en un gradiente de SDS-gel de
poliacrilamida al 4-20%, en presencia de un agente
reductor. Las fracciones que contienen IG (lavado con Tampón D) se
concentraron 10 veces usando AMICON STIRCELL que usa una membrana
PM10. La muestra se dializó contra dos cambios de agua
MILLI-Q a 4ºC. Las preparaciones de IG se
esterilizaron por filtración, y la concentración se determinó
espectrofotométricamente usando un factor de conversión de 1,06
mg/ml/OD_{280}. Se analizaron cinco microgramos en condiciones
reductoras y no reductoras mediante SDS-PAGE, para
obtener una indicación inicial de pureza e integridad de las
preparaciones proteínicas.
Tratamiento con proteínas de fusión
quiméricas - modelo de CYTOXAN: Se inyectaron intravenosamente,
dos veces al día, grupos de ratones NOD seleccionados al azar ya
sea con BSA como control, o con péptidos de GAD, con cadena B de
insulina (ICB) o con diversas combinaciones de péptidos de GAD y/o
cadena B de insulina, a las dosis indicadas en las figuras en los
días 1, 3 y 5 tras el tratamiento con CYTOXAN (día 0). Los animales
que recibieron inyecciones de BSA (controles) manifestaron una
incidencia mayor que el 80% de diabetes a los 21 días tras la
inducción con CYTOXAN (Fig. 2). Por el contrario, los animales
tratados con ICB o con los péptidos 250-273 ó
520-555 de GAD 65 experimentaron reducciones hasta
una incidencia de menos del 50% de la diabetes. Se examinaron
entonces (Fig. 3) los efectos terapéuticos del tratamiento con
combinaciones de ICB y los dos péptidos de GAD. La reducción en la
incidencia de la diabetes hasta un 25% menos se logró mediante la
combinación de GAD 250-273 e ICB a dosis de 100
\mug ó 250 \mug por inyección.
Sorprendentemente, la adición del péptido
520-555 de GAD (residuos de aminoácidos
139-173 de SEC ID nº:2) parece inhibir la eficacia
terapéutica de la ICB con la combinación con GAD 65
250-273. La evaluación en el modelo de CYTOXAN de
las proteínas de fusión quiméricas IG1 e IG2 de la invención mostró
que el tratamiento con cualquiera de estos polipéptidos medió una
reducción dependiente de la dosis en la incidencia de la diabetes,
en comparación con los animales del control tratados con BSA (Fig.
4). En este experimento, las dosis de 300 \mug fueron más
eficaces que las dosis de 100 \mug, e IG2 redujo la incidencia de
diabetes hasta un grado mayor que IG1. El tratamiento con dosis de
300 \mug de IG2 redujo la incidencia de la enfermedad a menos del
12%, en comparación con una incidencia de la enfermedad mayor que
ele 80% en los animales del control tratados con BSA.
Tratamiento con proteínas de fusión
quiméricas - modelo de transferencia adoptiva: Se cosecharon
células mononucleares del bazo diabetogénicas a partir de ratones
NOD recientemente diabéticos (comienzo desde hace menos de 3 semanas
previas). Para iniciar la destrucción de las células beta de los
islotes y el desarrollo de diabetes, se inyectaron intravenosamente
ratones NOD/SCID de 8-12 semanas con 35 x 10^{6}
células de bazo diabetogénicas. La incidencia y el comienzo de
diabetes se monitorizó bisemanalmente mediante ensayo de glucosuria,
y se confirmó mediante ensayo de glucemia al final del experimento.
El tiempo medio de comienzo de la diabetes después de la inducción
de la enfermedad fue aproximadamente 25 días. El tratamiento IV con
IG2, IG3 o con antígenos de células beta de los islotes se inició
en el día 3º. Los animales se trataron con 300 \mug de antígeno
dos veces al día cada dos días, durante un período de seis días
(desde el día 3 hasta el día 9, en el que el tiempo de la
transferencia de las células del bazo fue el día 0).
Los resultados de estos experimentos se
presentan en la Figura 5. Sorprendentemente, demuestran que sólo la
proteína de fusión quimérica IG2 evitó el comienzo de la enfermedad
en los receptores NOD/SCID. Por el contrario, en este modelo sólo
se observó un ligero retraso en el comienzo de la enfermedad en
receptores de IG1, de la cadena B de insulina (ICB) o de la
combinación de ICB y del péptido 250-273 de GAD.
Estas profundas diferencias en los efectos del tratamiento con IG2
en comparación con los otros regímenes de tratamiento fueron
inesperadas. Sin desear estar atados por ninguna teoría particular
de operación, se cree que este hallazgo inesperado es un resultado
del procesamiento in vivo de IG2 en péptidos antigénicos
únicos que son particularmente eficaces provocando un estado de
tolerancia inmunitaria que protege contra la diabetes
autoinmunitaria, incluso en las condiciones exigentes que resultan
de la exposición con poblaciones de células T heterogéneas derivadas
de los bazos de ratones NOD completamente diabéticos.
Abbas et. al. 1991.
Cellular and Molecular Immunology W.B. Saunders Company,
Philadelphia.
Ammerer, 1983. Meth Enzymol
101:192 y sig.
Atkinson y Maclaren, 1993.
J Clin Invest 92:1608-1616.
Atkinson et al., 1990.
Lancet 335:1357-1360.
Atkinson et al., 1990.
Diabetes, 39:933-937.
Atkinson et al., 1992.
Lancet 339:458-459.
Atkinson et al., 1993. J
Clin Invest 91:350-356.
Ausubel et al., 1994.
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &
Sons, Nueva York.
Baekkeskov et al., 1982.
Nature 298:167-169.
Baekkeskov et al., 1987.
J Clin Invest 79:926-934.
Baekkeskov et al., 1990.
Nature 347:151-156.
Bock et al., 1992.
Lancet 339:1504-1506.
Boehme y Lenardo 1993.
Eur J Immunol 23:1552-1560.
Bonifacio et al., 1990.
Lancet 335:147-149.
Bowman et al., 1994.
Immunol Today 15(3):115-120.
Brunner et al., 1995.
Nature 373:441-444.
Butler et al., 1993. J
Exp Med 178:2097-2106.
Chang et al., 1978.
Nature 275:615 et seq.
Chen et al., 1994.
Science 265:1237-1240.
Chou, 1990. Prediction of
protein structure and the principles of protein Conformation,
Plenum Press 549-586.
Chou y Fasman 1978. Adv.
Enzymol. 47:45-147.
Cohen et al., 1992. Ann
Rev Immunol 10:267 et seq.
Coligan et al., 1995.
Current Protocols in Immunology John Wiley & Sons, Nueva
York.
Conrad et al., 1994.
Nature 371:351-355.
Cotter et al., 1990.
Anticancer Research 10:1153 et seq.
Crispe 1994. Immunity
1:347-349.
Daniel et al,. 1996.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:956-960.
Davis et al. Basic Methods in
Molecular Biology, 2ª ed. Appleton and Lange, Norwalk, CT.
De Aizpurua et al., 1992.
Proc Natl Acad Sci, USA 89:9841-9845.
Dhein et al., 1995.
Nature 373:438-441.
Duvall y Wyllie, 1986.
Immunol Today 7:115 et seq.
Elliott et al., 1996. J
Clin Invest 98:1-11.
Evans y Scarpulla, 1989.
Gene 84:135 y sig.
Farrell, Jr., 1993. RNA
Methodologies: A Laboratory Guide For Isolation And
Characterization. Academic Press Inc., San Diego,
CA.
Foster 1994. en Harrison's
Principles of Int Med, 3ª ed., McGraw-Hill,
Nueva York, p. 1979-2000.
Garnier et al., 1978. J.
Mol. Biol 120:97-120
Goeddel et al., 1980.
Nucl Acids Res 8:4057 y sig.
Griffin y Griffin, Eds., 1994. PCR
Technology, Current Innovations. CRC Press, Boca Raton,
FL.
Griffin et al, 1995. Am.
J. Pathol 147:845-857.
Grosjean y Fiers, 1982.
Gene 18:199 y sig.
Hanninen et al., 1992. J
Clin Invest 90:1901-1910.
Harrison, 1992. Immunol
Today 13:348-352.
Harwood, Ed., 1994. Protocols For Gene
Analysis: Methods In Molecular Biology, Vol. 31. The Humana
Press, Totowa, NJ.
Hatfield et al., 1997.
Diabetologia 40:1327-1333
Hernan et al. 1992 Biochemistry 31:8619 et seq.
Herold et al., 1992. J
Exp Med 176:1107-1114.
Ho et al. 1989. Gene
77:51-59.
Honeyman et al., 1993. J
Exp Med 177:535-540.
Huang y Gorman, 1990.
Mol Cell Biol 10:1805 y sig.
Ju et al., 1995.
Nature 373:444-448.
Karjalainen et al., 1992.
New Eng J Med 327:302-307.
Karounos y Thomas, 1990.
Nature 39:1085-1090.
Kaufman et al., 1992. J
Clin Invest 89:283-292.
Kaufman et al., 1993.
Nature 366:69-72.
Kaufman et al., 1993.
Nature 366:69-71.
Kawabe y Ochi, 1991.
Nature 349:245-248.
Kawasaki et al., 1997.
J. Clin. Endocrinol. Metab. 82:375-380.
Kerr et al., 1991.
Apoptosis: The Molecular Basis Of Cell Death, Tomei y Cope
(eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview,
Nueva York, p. 5 y sig.
Kim et al., 1993.
Immunol Invest 22 (3):219-227.
Klaus, ed., 1987. Lymphocytes: A
Practical Approach. IRL Press, Oxford, Inglaterra.
Lenardo, 1991. Nature
353:858-860.
Lockshin y Zakeri, 1991.
Apoptosis: The Molecular Basis Of Cell Death, Tomei y Cope
(eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview,
Nueva York, p. 47 y sig.
Lohman et al., 1994.
Lancet 343:1607-1608.
Lohman et al., 1996. J
of Autoimmunity 9:385-389.
Lohmann et al., 1996.
Hormone & Metabolic Res. 28:357-360.
Luckow, et al., 1988.
Bio/Technology 6:47 y sig.
Maclaren, et al., Pub. de Sol.
Int. de patente PCT nº. WO 94/23737.
MacLaren, N y K. Lafferty.
1993. Diabetes. 42:1099-1104.
Maniatis, 1982. Molecular
Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Marrack y Kappler, 1987.
Science 238:1073 et seq.
Moir, et al., 1991. Meth
Enzymol 194:491-507.
Morgenstern y Land, 1990.
Nucl Acids Res 18:3587 et seq.
Mueller et al., Sol. U.S. Ser. nº
08/482.114, presentada 6/7/95.
Muir, et al., 1995. J
Clin Invest 95, p.628-634.
Mullis et al., Eds., 1994. The
Polymerase Chain Reaction Springer-Verlag, Nueva
York, NY.
Nagata y Suda, 1995.
Immunol Today 16:39 y sig.
Naquet et al., 1988. J.
Immunol. 140:2569-2578.
Nossal et al., 1992.
Diabetologia, p. 549-559.
Ormerod, Ed., 1994. Flow cytometry: A
Practical Approach, 2ª ed. IRL Press at Oxford University
Press, Oxford, Inglaterra.
Paul, 1989. Fundamental
Immunology, 2ª Ed. Paul (ed.), Raven Press, Nueva
York.
Quinn, A y E.E. Sercarz.
1996. J. Autoimmunity 9:365-370.
Ramiya et al., 1996. J.
Autoimmunity 9:349-356.
Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack
Publishing Co., Philadelphia, PA, 17ª ed. (1985).
Richter et al., 1992.
Proc Natl Acad Sci. USA 89:8467-8471.
Rudy et al., 1995. Mol.
Medicine 1:625-633.
Russell et. al. 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90:4409-4413.
Sambrook et al. 1990.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor
Press, Cold Spring Harbor, NY.
Sato et al. 1994. J Biol
Chem 269:17267 et seq.
Schena, et al., 1991.
Meth Enzymol 194:389-398.
Schwartz, 1993. Schwartz,
RS, "Autoimmunity and Autoimmune Diseases" en Paul,
Fundamental Immunology, 3ª Ed. Raven Press, Nueva
York, 1993, p. 1033-1097.
Sercarz et. al. 1959.
Nature 184:1080-1082.
Singer et. al. 1994.
Immunity 1:365-371.
Smith et al., 1989.
Nature 337:181-184.
Solimena y De Camilli,
1993. Nature 366:15-17.
Steinman, 1995. Cell
80:7-10.
Strasser, 1995. Nature.
373:385-386.
Studier et al. 1990.
Meth Enzymol 185:60-89.
Sun et al. 1991. Eur J
Immunol 21:1461-1468.
Taguchi et al., 1990. J
Immunol Meth 128:65-73.
Talib, et al., 1991.
Gene 98:289-293.
Tisch et al, 1993.
Nature. 366:72-75.
Tisch et al., 1993.
Nature. 366:72-75.
USP 23/NF 18, 1995 The United States
Pharmacopeia/The National Formulary; United States Pharmacopeial
Convention, Inc., Rockville, MD.
Von Boehmer, 1988. Ann Rev
Immunol 6:309 et seq.
Walston, et al., 1995.
N. Eng J Med 333:343-347.
Walter et al., 1994. J.
Clin. Invest. 8:163-166.
Weiner et al., 1997.
patente US No. 5,643,868.
Weir, 1978. Handbook of
Experimental Immunology, 3ª ed. Volumen 2, Cellular
immunology, Blackwell Scientific Publications, Oxford,
Inglaterra.
Wicker et al., 1996. J.
Clin. Invest. 98:2597-2603.
Williams et al. 1988.
Nucl Acids Res 16:10453 y sig.
Wong et al., 1998. J.
Clin Invest 102:947-957.
Xie et al., 1997. J.
Immunol. 159:3662-3667.
Zhang et al., 1997.
Diabetes 46:40-43.
Zhang et al., 1991. Proc
Natl Acad Sci, USA 88:10252-10256.
\vskip1.000000\baselineskip
<110> Wang, Yi
\hskip1cmMueller, John P.
\hskip1cmMatis, Louis A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteínas quiméricas y sus usos para
el diagnóstico, prevención y tratamiento de diabetes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ALX-156 PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> No asignado todavía
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\vskip0.400000\baselineskip
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artificial: proteína de fusión IG3
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artificial: proteína de fusión IG5
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artificial: proteína de fusión IG6
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artificial: rompedor de hélice
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artificial: cebador prIG2
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artificial: cebador prIG5
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artificial: cebador prIG6
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artificial: cebador prIG8
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artificial: cebador prIG12
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia codificante de la proteína de fusión IG2
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<211> 46
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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artificial: cebador prIG13
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\hfill46
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<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 444
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia codificante de la proteína de fusión IG3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 555
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia codificante de la proteína de fusión IG4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador prIG14
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipcatatgttcg ttaaccagca tctg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador prIG15
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<400> 26
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<210> 27
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<211> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador prIG16
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<400> 27
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<210> 28
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<211> 69
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador prIG17
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<400> 28
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<210> 29
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<211> 69
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador prIG18
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<400> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador prIG19
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<400> 30
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<210> 31
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<211> 68
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador prIG20
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<400> 31
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<210> 32
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<211> 69
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador prIG21
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<400> 32
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<210> 33
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<211> 60
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador prIG22
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<400> 33
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\hskip-.1em\dddseqskipttagggattg gaacagacag cgtgattgga ggcggttaca tcccgccgag cctgcgtacc
\hfill60
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<210> 34
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador prIG23
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<400> 34
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\hskip-.1em\dddseqskipggatccttaa tggtgatggt gatg
\hfill24
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<210> 35
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<211> 708
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia codificante de la proteína de fusión IG5
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 35
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<210> 36
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<211> 1191
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia codificante de la proteína de fusión IG6
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<400> 36
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<210> 37
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<211> 1344
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia codificante de la proteína de fusión IG7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
Claims (10)
1. Proteína de fusión quimérica que comprende
un extremo amino y un extremo carboxilo, en la que la proteína
comprende la cadena B de insulina y fragmentos peptídicos
individuales que consisten en al menos un péptido(s) de GAD
65 capaz de provocar una respuesta de células T humanas, en la que
la cadena B de insulina y el al menos un péptido(s) de GAD
65 humana están enlazados covalentemente y la proteína de fusión
quimérica es capaz de provocar una respuesta de células T humanas a
la cadena B de insulina y a cada uno del al menos un
péptido(s) de GAD 65, en la que la proteína de fusión
quimérica se denomina IG1 que comprende los residuos de aminoácidos
2 a 154 de SEC ID nº:1.
2. Proteína de fusión quimérica que comprende
un extremo amino y un extremo carboxilo, en la que la proteína
comprende la cadena B de insulina y fragmentos peptídicos
individuales que consisten en al menos un péptido(s) de GAD
65 capaz de provocar una respuesta de células T humanas, en la que
la cadena B de insulina y el al menos un péptido(s) de GAD
65 humana están enlazados covalentemente y la proteína de fusión
quimérica es capaz de provocar una respuesta de células T humanas a
la cadena B de insulina y a cada uno del al menos un
péptido(s) de GAD 65, en la que la proteína de fusión
quimérica se denomina IG2 que comprende los residuos de aminoácidos
2 a 174 de SEC ID nº:2.
3. Proteína de fusión quimérica según la
reivindicación 1 ó 2, en la que, cuando se ensaya en un ensayo en
un modelo de ratón de IDDM, la proteína de fusión quimérica
proporciona una reducción en la frecuencia del comienzo de diabetes
mayor que una mezcla de control que contiene cantidades equimolares
de cada uno de los diversos fragmentos peptídicos individuales
comprendidos por la proteína de fusión quimérica, no estando cada
uno de dichos fragmentos peptídicos individuales y las cadenas de
insulina enlazados covalentemente a ningún otro de dichos
fragmentos peptídicos individuales y cadenas de insulina en dicha
mezcla, en la que el ensayo se lleva a cabo mediante la
administración parenteral repetida de un número de dosis medidas,
teniendo cada dosis una cantidad molar predeterminada de dicha
proteína de fusión quimérica en un vehículo farmacéuticamente
eficaz o de dicha mezcla de control en el vehículo farmacéuticamente
eficaz, realizándose la administración a intervalos no menores de
doce horas y no mayor de 72 horas entre cada una de las dosis.
4. Proteína de fusión quimérica según la
reivindicación 3, en la que el modelo de ratón de IDDM es el modelo
de diabetes inducida por CYTOXAN del ratón NOD.
5. Proteína de fusión quimérica según la
reivindicación 3, en la que el modelo de ratón de IDDM es el modelo
de diabetes de transferencia adoptiva del ratón NOD/SCID.
6. Uso de un polipéptido según cualquiera de
las reivindicaciones 1 y 2 en la preparación de un medicamento para
tratar un paciente seleccionado de entre el grupo que consiste en:
pacientes que se predice que tienen riesgo de desarrollar diabetes
de tipo 1 y pacientes que sufren diabetes de tipo 1, en el que el
uso comprende la administración repetida de una dosis de una
cantidad medida del polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 2.
7. Uso según la reivindicación 6, en el que
la administración repetida comprende la administración de al menos
dos dosis en un intervalo no menor de doce horas y no mayor de 72
horas.
8. Proteína de fusión quimérica que comprende
un extremo amino y un extremo carboxilo, en la que la proteína
comprende la cadena B de insulina y fragmentos peptídicos
individuales que consisten en uno o más péptidos de GAD 65 capaces
de provocar una respuesta de células T humanas, en la que la cadena
B de insulina y el uno o más péptidos de GAD 65 humana están
enlazados covalentemente y la proteína de fusión quimérica es capaz
de provocar una respuesta de células T humanas a la cadena B de
insulina y a uno o más de los péptidos de GAD 65, en la que el
péptido de GAD 65 se selecciona del grupo que consiste en GAD 65
115-127 (residuos de aminoácidos
39-51 de SEC ID nº:2), GAD 65
247-286 (residuos de aminoácidos
52-91 de SEC ID nº:2), y GAD 65
473-519 (residuos de aminoácidos
92-138 de SEC ID nº:2), y en la que la proteína de
fusión no comprende los péptidos de GAD seleccionados de cualquiera
de los siguientes: los residuos 1-95 de GAD 65; los
residuos 475-484 de GAD 65; los residuos
520-554 de GAD 65 y los residuos
571-585 de GAD 65.
9. Proteína de fusión quimérica según la
reivindicación 8, en la que la proteína comprende por orden,
partiendo desde el extremo amino, los péptidos
115-127, 247-286 y
473-519 de GAD 65 humana.
10. Proteína de fusión quimérica según la
reivindicación 9, en la que la proteína comprende por orden,
partiendo desde el extremo amino, la cadena B de insulina, la
cadena C de insulina y los péptidos 115-127,
247-286 y 473-519 de GAD 65
humana.
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