DE69837148T2 - Chimäre proteine zur behandlung von diabetes - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Diskussion in diesem Abschnitt ist nicht auf Inhalte beschränkt, die sich als "Stand der Technik" gegen die vorliegende Erfindung eignen. Daher soll durch die Einbeziehung bestimmter Inhalte in diese Diskussion keine Anerkennung eines solchen Status als Stand der Technik unterstellt oder abgeleitet werden und keine Erklärung gegen die Belange der Erfinder der vorliegenden Erfindung soll durch eine solche Einbeziehung unterstellt werden.
  • Diabetes mellitus
  • Diabetes mellitus ist die am meisten verbreitete endokrine Erkrankung und ist durch Störungen im Glukosemetabolismus gekennzeichnet. Der gestörte Glukosemetabolismus, der mit dieser Erkrankung zusammenhängt, verursacht Hyperglykämie (hohe Blutglukosespiegel) und verursacht schließlich Komplikationen mehrerer Organsysteme, einschließlich Augen, Nieren, Nerven und Blutgefäßen. Bei Patienten mit andauernder Hyperglykämie oder abnormaler Glukosetoleranz wird im allgemeinen die Erkrankung diagnostiziert, obwohl Patienten anfänglich am häufigsten übermäßiges Wasserlassen (Polyurie) und regelmäßiges Trinken aufgrund extremen Durstes (Polydipsie) aufzeigen. Diese typischen anfänglichen Symptome ergeben sich aus den osmotischen Effekten der Hyperglykämie.
  • Die Pathogenese von Diabetes mellitus wird üblicherweise mit pankreatischer Fehlfunktion, insbesondere der Beta-Zellen der Langerhans-Inseln des Pankreas, in Verbindung gebracht. Diese Fehlfunktion kann zur Zerstörung der Beta-Zellen der Inseln führen, die Insulin, ein Glukose regulierendes Peptidhormon, herstellen. Diabetes mellitus wurde allgemein als insulinabhängig oder Typ 1 im Gegensatz zu nicht insulinabhängig oder Typ 2 eingestuft. Diese Terminologie hat sich jedoch entwickelt, als die Erkrankung besser verstanden wurde. Zum Beispiel wurde herausgefunden, daß in manchen Patienten, die an nicht insulinabhängigem Diabetes leiden, die Erkrankung in eine insulinabhängige Form abgleitet, während sich diese Abhängigkeit in anderen Patienten nicht entwickelt.
  • Patienten werden daher häufig hinsichtlich des Mechanismus der Pathogenese der Zerstörung der Inseln eingestuft und die Bezeichnung Typ 1 wird jetzt in Bezug auf eine autoimmune Pathogenese der Inseln verwendet, d.h. für Diabetes, der durch einen für die Inseln spezifischen autoimmunen Angriff verursacht wird, und wird hierin so verwendet. Der Begriff insulinabhängiger Diabetes mellitus (IDDM) bezieht sich auf Diabetes-Typ 1, der zu einem Stadium fortgeschritten ist, bei welchem ausreichend autoimmune Zerstörung der pankreatischen Beta-Zellen für das Aufweisen offenkundiger Symptome aufgetreten ist. Der Begriff Prä-IDDM bezieht sich auf einen autoimmunen Zustand, der durch Biopsie oder Analyse der autoimmunen Antworten nachgewiesen werden kann, bei welchem pankreatische Beta-Zellen der Inseln einem spezifischen autoimmunen Angriff dermaßen ausgesetzt sind, daß einige Zellen der Zerstörung unterliegen können. Bei Prä-IDDM ist die Zerstörung (sofern vorhanden) jedoch nicht ausreichend weit fortgeschritten, daß die Verabreichung von Insulin benötigt wird. Da es einen Zeitpunkt in den frühen Stadien von Diabetes-Typ 1 geben kann, an welchem offenkundige Symptome beobachtet werden, aber eine gewisse Funktion der Insel verbleibt (bekannt als die "Honeymoon-Periode", wird nicht jeder Diabetes-Typ 1 als IDDM eingestuft und nicht jeder Prä-IDDM stellt sich ohne offenkundige Symptome dar.
  • Komplikationen des Diabetes-Typ 1
  • Die metabolischen Komplikationen, die mit dem durch Insulinmangel verursachten abnormalen Metabolismus einhergehen, können zahlreiche Organsysteme beeinflussen. Die häufigste akute metabolische Komplikation ist die der diabetischen Ketoazidose, die durch schwere Hypoglykämie gekennzeichnet ist (und eine daraus entstehende Hypovolämie, die durch osmotische Diurese verursacht wird) sowie eine metabolische Azidose, die durch Freisetzen überschüssiger freier Fettsäuren und die Produktion von Ketonkörpern verursacht wird.
  • Über die akuten metabolischen Komplikationen der Ketoazidose hinaus ist der diabetische Patient anfällig für eine Serie später Komplikationen, die eine beträchtliche Erkrankungshäufigkeit und vorzeitige Sterblichkeit verursachen. Atherosklerose tritt bei Diabetikern aufgrund von Störungen in sowohl dem Glukose- als auch dem Lipidmetabolismus in größerem Umfang und früher als in der Allgemeinbevölkerung auf. Diese Gefäßpathologie kann u.a. zu Koronararterienerkrankung, Schlaganfall und peripherer Gefäßerkrankung mit Gangrän führen. Retinopathie ist eine weitere Gefäßkomplikation von Diabetes. Diabetische Retinopathie ist eine Hauptursache von Erblindung und wird durch gesteigerte Permeabilität der Netzhautkapillaren ausgelöst, welche zu Verschluß, Hämorrhagie, Aneurismenbildung und Neuvaskularisierung, bekannt als proliferierende Retinopathie, abgleiten kann.
  • Über die Gefäßkomplikationen hinaus sind Nieren- und neurologische Erkrankungen (Nephropathien und Neuropathien) übliche Komplikationen bei Diabetes. Diabetische Nephropathien verursachen ungefähr die Hälfte der Nierenerkrankungen im Endstadium in den Vereinigten Staaten. Histologisch ist die Nephropathie durch Aufweiten der glomerulären Basalmembran und mesangliale Verdickung gekennzeichnet. Anfängliche Anzeichen umfassen zunehmende Proteinurie mit Azotämie, die schließlich zu Nierenversagen führt. Diabetische Neuropathie kann jeden Teil des Nervensystems befallen, wobei das Gehirn eventuell eine Ausnahme bildet. Die Neuropathie wird am häufigsten als periphere Polyneuropathie gesehen, mit Symptomen, die Taubheit, Fehlempfindungen, schwere Überempfindlichkeiten und Schmerzen umfassen. Autonome Neuropathien können gastrointestinale Fehlfunktionen, orthostatische Hypotonie, Blasenfehlfunktion oder -lähmung und Impotenz verursachen. Diabetische Fußgeschwüre stellen ein spezielles Problem von Diabetikern dar und scheinen in erster Linie durch abnormale Druckverteilung und in zweiter Linie durch diabetische Neuropathie verursacht zu werden. Die ulzerösen Wunden werden häufig durch eine begleitende periphere Gefäßerkrankung und Infektion verschlimmert.
  • Wie oben erwähnt, wird eine äußerst genaue Kontrolle der Blutglukose mit einer Verbesserung der späten Komplikationen von Diabetes-Typ 1 in Verbindung gebracht, was nahelegt, daß die Erhaltung oder Wiederherstellung der Funktion der Beta-Zellen die Mehrzahl der pathologischen Komplikationen der Erkrankung verringern oder beseitigen könnte.
  • Pathogenese von Diabetes-Typ 1
  • Diabetes-Typ 1 entwickelt sich nur in genetisch empfänglichen Individuen und Symptome erscheinen im allgemeinen vor dem 40. Lebensjahr, wobei die Häufigkeitsspitze des Ausbruchs von offenkundigen Symptomen, im zweiten Lebensjahrzehnt erscheint. Die Pathogenese von Diabetes-Typ 1 wird durch eine anfängliche Phase der Einwanderung von Leukozyten in die Inseln gekennzeichnet, die als Insulitis bezeichnet wird, gefolgt von einem Zeitraum, während dem die eigentliche Zerstörung der Beta-Zellen der Inseln durch autoimmunen Angriff erfolgt. Die Insulitis-Phase wird durch Unterwanderung von pankreatischen Inseln durch sowohl Lymphozyten als auch Zellen der Monozyten-/Makrophagen-Zellinie gekennzeichnet und zieht sowohl zellvermittelte Entzündung als auch Angriff durch für Inseln spezifische, zytotoxische Antikörper nach sich. Offenkundige klinische Symptome von Diabetes mellitus werden im allgemeinen offenbar, wenn über 90% der Beta-Zellen der Inseln zerstört sind, jedoch ist es nun, wie ausführlicher unten erörtert, möglich, Individuen, die frühere Stadien der Typ 1-Pathogenese durchleben, genau zu erkennen, d.h. bevor genügend Beta-Zellen der Inseln zur Erzeugung offenkundiger klinischer Symptome verlorengegangen sind.
  • Es wird allgemein davon ausgegangen, daß der autoimmune Vorgang durch einen Umweltanreiz ausgelöst wird. Ein Grund für diese Überzeugung ist, daß ein eineiiger Zwilling nur eine Chance von fünfzig zu fünfzig zur Entwicklung von IDDM hat, wenn sein eineiiges Geschwisterteil die Erkrankung hat.
  • T-Zellen
  • Es wird angenommen, daß die autoimmune Zerstörung der Beta-Zellen der pankreatischen Inseln bei Diabetes-Typ 1 durch weiße Blutzellen (Leukozyten), am wichtigsten T-Zellen, ausgelöst wird. T-Zellen oder T-Lymphozyten sind einkernige weiße Blutzellen, die viele unentbehrliche Immunfunktionen zur Verfügung stellen. Die Bedeutung von T-Zellen bei humanen Autoimmunerkrankungen wurde in den vergangenen zwei Jahrzehnten zunehmend anerkannt. Studien unter Verwendung von Behandlungen, die zu einer allgemeinen Immunsuppression führen, haben eine entscheidende Rolle für eine Untergruppe an T-Zellen definiert, die als CD4+- oder T-Helferzellen bekannt sind, als primäre Regulatoren aller Immunantworten (sowohl zelluläre als auch humoraler) auf Protein- oder Peptidantigene.
  • T-Zellen vermitteln Gewebeverletzung durch indirekte und direkte Mittel. T-Zellen sowohl der CD8+ (zytotoxischen) als auch der CD4+ (Helfer)-Untergruppen schütten eine Vielzahl an entzündungsauslösenden Zytokinen aus, die Gewebe indirekt durch Aktivierung verschiedener anderer Arten an weißen Blutzellen schädigen können. Beispiele solcher Wirkungen von T-Zellen umfassen Aktivierung der Antikörper der antikörperausschüttenden B-Zellen (Stimulierung der humoralen Immunaktivität) und Aktivierung von Makrophagen, die eine akute Gewebeschädigung und Entzündung durch Ausschüttung hydrolytischer Enzyme, reaktiver Sauerstoffspezies und zusätzlicher entzündungsfördernder Zytokine verursachen können. Zu diesen indirekten Effekten der Aktivität der T-Zellen kann eine direkte Gewebeschädigung durch CD8+-zytotoxische T-Zellen vermittelt werden, die Zielantigene aufweisende Zellen angreifen.
  • Ein einzigartiger Gesichtspunkt der Physiologie von T-Zellen ist die Anwesenheit von membrangebundenen, antikörperähnlichen Bindestrukturen, die T-Zellrezeptoren (TCRs) genannt werden, auf ihren Zelloberflächen. Wie Antikörper binden TCRs mit hoher Spezifität an bestimmte Antigene. Wie antikörperherstellende Zellen, die sich als unzählige Klone von Zellen entwickeln, wobei jeder Klon Antikörper mit einzigartiger Spezifität herstellt, entwickeln sich T-Zellen als eine enorme Anzahl bestimmter Klone und jeder einzelne T-Zellklon exprimiert einen einzelnen Typ an TCR mit einer festgelegten Bindespezifität. T-Zellklone mit TCRs, die spezifisch an eigene Antigene binden, sind für die Entwicklung von Autoimmunerkrankungen verantwortlich.
  • Studien der Interaktion von Antikörpern und TCRs mit ihren spezifischen Antigenen haben gezeigt, daß ein bestimmtes Polypeptid-Antigen üblicherweise zahlreiche submolekulare Charakteristiken als Epitope bekannt umfaßt, von denen jedes als eine einzelne Bindestelle für einen bestimmten Antikörper oder TCR dienen kann.
  • T-Zellen und Autoimmunerkrankungen
  • Bei Autoimmunerkrankungen wird nur eine begrenzte Anzahl an T-Zellklonen, die mit verschiedenen Epitopen einer kleinen Anzahl an Autoantigenen reaktiv sind, aktiviert und sind an der Pathogenese beteiligt. Selbst in Individuen, die an einer Autoimmunerkrankung leiden, ist nur von einem kleinen Prozentsatz an T-Zellklonen (0,1-1%) für die Erkennung von Autoantigenen bekannt.
  • Von verschiedenen Mechanismen wurde postuliert, eine Rolle bei der Pathogenaktivierung von krankheitsverursachenden autoreaktiven T-Zellen zu spielen. Eine anfängliche Aktivierung von antigenpräsentierenden Zellen (APCs) durch Infektion oder lokale Entzündung ist in einen solchen Mechanismus einbezogen. APCs, die auf diesem Weg aktiviert wurden, können dann eine gewaltige Costimulation für die bis dahin unreaktiven T-Zellen zur Verfügung stellen.
  • Andere vorgeschlagene Mechanismen umfassen die polyklonale Aktivierung von zuvor ruhenden, autoreaktiven T-Zellen durch Superantigene, wie Bakterientoxine oder eine zufällige molekulare Mimikri zwischen fremden und eigenen Antigenen (Abbas et al. 1994). Im letzten Fall stellt das Immunsystem des Wirtes eine Antwort auf ein Epitop eines durch ein Pathogen exprimierten Proteins auf, wie ein Virus, das einem homologen Epitop an einem Wirtsprotein ähnelt. Ein autoimmuner Angriff ergibt sich dann aus der kreuzreaktiven Immunantwort, die folgt.
  • Zusätzlich zu externen Faktoren liegt dem Erscheinen aller durch T-Zellen vermittelten Autoimmunerkrankungen ein komplexes Muster vererbter Empfänglichkeit, die durch multigene Faktoren bestimmt ist, zugrunde. Für weitere Erörterungen dieser verschiedenen Faktoren bespricht Steinmann, 1995, derzeitige Theorien der Autoimmunität.
  • Veränderungen im Repertoire der T-Zellen erscheinen natürlicherweise während der Entwicklung der T-Zellen. Nur ein kleiner Teil an Thymozyten (ungereifte T-Zellen) überlebt die Entwicklung im Thymus und die Auswahlvorgänge, die zur Auswanderung der sich entwickelnden T-Zellen in den peripheren Kreislauf und der Fertigstellung ihrer Reifung führen (von Boehmer, 1988; Marrack und Kappler, 1987). Experimentelle Belege deuten stark darauf hin, daß eine große Anzahl an Thymozyten, die Rezeptoren für Autoantigene tragen, anfänglich im Thymus vorhanden ist. Neuere Studien haben Belege ergeben, die darauf hindeuten, daß ein Vorgang mit der Bezeichnung programmierter Zelltod oder Apoptose diese autoreaktiven Thymozyten im Thymus zerstört, während nicht autoreaktive Thymozyten verschont werden. Apoptose spielt daher eine große Rolle bei der Formung und dem Erhalt des Repertoires an T-Zellen und trägt zu der Festlegung der Eigentoleranz durch aktives Eliminieren von Zellen, die autoreaktive TCRs exprimieren, bei.
  • Es wurde kürzlich entdeckt, daß T-Zellen empfindlich gegenüber apoptotischem Zelltod sind, der durch eine Vielzahl an Stimuli an mehreren Punkten in ihrer Lebensspanne induziert wird (siehe z.B. Lenardo 1991; Boehme und Lenardo 1993; Critchfield et al. 1994). Es wird angenommen, daß positive Selektionsfaktoren auch eine Rolle bei der Regulierung des Überlebens spezifischer T-Zellklone spielen. Die Abnahme oder Erweiterung der Anzahl an einzelnen T-Zellen eines bestimmten Klons in einem Organismus durch diese und andere Mechanismen dient der Anpassung der Empfindlichkeit des Immunsystems des Organismus an ein bestimmtes Antigen. In etlichen Modellen zur Autoimmunerkrankung sowie bei bestimmten viralen Infektionen ist es nun fest eingeführt, daß Apoptose in gereiften, peripheren, antigenspezifischen T-Lymphozyten sowie in nicht gereiften Thymozyten induziert werden kann (nachdem sie einem Antigen unter bestimmten definierten Bedingungen ausgesetzt waren).
  • Apoptose tritt in vielen biologischen Systemen auf (siehe z.B. Kerr et al. 1991; Lockshin und Zakeri, 1991; Cohen et al. 1992; Duvall und Wyllie, 1986; Cotter et al. 1990). Eine Apoptose durchführende Zelle durchlebt ein spezifisches Programm an Ereignissen – zelluläre und biochemische Vorgänge, die von aktivem Metabolismus abhängen und zu der Selbstzerstörung der Zelle beitragen. In apoptotischen T-Zellen schrumpft der Kern, das Chromatin kondensiert, das genetische Material (DNA) zersetzt sich fortschreitend in kleine Fragmente (der Größe eines nukleosomalen Repeats), es findet Verdichtung des Zellplasma statt, die Zellmembran formt Blasen und die Zelle fällt schließlich zusammen (Kawabe und Ochi, 1991; Smith et al. 1989). Zellen können sich nicht von Apoptose erholen, sie führt zu einem irreversiblen Zelltod (Kawabe und Ochi, 1991; Smith et al. 1989).
  • Neuere Berichte haben eine Rolle der mit TNF verwandten Zytokine, bekannt als der FAS-Ligand und sein Rezeptor, CD95 (der FAS-Rezeptor) bei der Induktion von Apoptose in T-Zellen angedeutet (Crispe et al. 1994; Nagata und Suda, 1995; Strasser, 1995; Dhein et al., 1995; Brunner et al., 1995 und Ju et al., 1995).
  • Autoantigene von Beta-Zellen der Inseln
  • Wie oben besprochen wird angenommen, daß das Ausbrechen von Diabetes-Typ 1 durch T-Zellen vermittelt wird. Es wird angenommen, daß die Erkrankung eine Folge unangemessener, für bestimmte Proteine der Beta-Zellen der Inseln, die als Autoantigene wirken, spezifische T-Zellantworten ist. Zusätzlich zu autoreaktiven T-Zellen wurde auch von Autoantikörpern gegen verschiedene Eigenantigene bei IDDM-Patienten berichtet. Die Antigene, von denen berichtet wurde, von diesen Autoantikörpern gebunden zu sein, umfassen viele solche, von denen berichtet wurde, daß sie von autoreaktiven T-Zellen erkannt werden.
  • Autoantigene, die Autoimmunantworten in Typ 1-Patienten unterliegen, umfassen das 64-65 kDa GAD (Glutamatdecarboxylase) und die 67 kDa GAD Autoantigene, Insulin, Sialyglycolipid, ein 38 kDa Antigen aus den sekretorischen Körnchen von Beta-Zellen, ein mit Antikörpern gegen Rinderalbumin kreuzreaktives Antigen, das als das p69-Protein aus Beta-Zellen bekannt ist, PM-1 oder krankheitsveränderndes Antigen, ein als Peripherin bekanntes cytoskeletales Protein aus Beta-Zellen, Glukosetransporterproteine, einschließlich GLUT-2, Hitzeschockprotein 65 (HSP 65), einschließlich des p277-Peptids, Carboxypeptidase H, ein 52 kD großer molekularer Imitator des Rubella-Virus-Antigens, ein membranassoziiertes Protein aus Beta-Zellen von 150 kDa, ein Proteinantigen, das am sekretorischen Pol der Ratteninsulinom-Zellinie RINm38 lokalisiert ist, das das RIN-polare Antigen genannt wird, und (am Anfang) wenig charakterisierte Antigene, die durch Immunsuchtests einer Insel-cDNA-Expressionsbibliothek isoliert wurden, die ICA12 und ICA512 genannt werden. ICA512, jetzt auch als IA-2 bekannt, ist immunologisch mit Phogrin verwandt, welches ebenfalls den Autoimmunantworten in Typ 1-Patienten unterliegt (Hatfield et al., 1997).
  • Die Bedeutung dieser verschiedenen Autoantigene in Bezug auf die Autoimmunpathogenese sowie die Zeitsteuerung, mit welcher jedes eine Rolle während des Ablaufs von Krankheitsausbruch und -entwicklung spielt, unterliegen einer beträchtlichen Unsicherheit und einem daraus folgenden Meinungsstreit in dem Gebiet. Weitere Unsicherheit entstammt der Tatsache, daß jedes vermutete Autoantigen zahlreiche Epitope umfaßt, von denen einige vielleicht krankheitsbegünstigende Auswirkungen haben, während andere krankheitsunterdrückende Auswirkungen haben können.
  • Während es nicht gewünscht ist, an eine bestimmte Theorie des Ablaufs gebunden zu sein, wird gemäß bestimmter Gesichtspunkte der Erfindung angenommen, daß Insulin und GAD die wirksamsten therapeutischen Auswirkungen auf die Entwicklung von Diabetes-Typ 1 von allen Autoantigenen haben, die damit in Verbindung gebracht werden, eine Rolle in der Pathogenese der Erkrankung zu spielen.
  • Autoantikörper zu 64-65 kD GAD (nachfolgend GAD 65) werden normalerweise vor dem Ausbruch des klinischen, insulinabhängigen Diabetes mellitus Typ 1 und unter Verwandten von Patienten mit IDDM ohne Diabetes sowie anderen Gefährdeten nachgewiesen. Von diesen Autoantikörpern wurde angenommen, sie seien die besten voraussagenden Antikörpermarker für bevorstehenden Diabetes-Typ 1.
  • GAD 65 und GAD 67 sind durch unterschiedliche Gene auf unterschiedlichen Chromosomen codiert, wobei die Gene zu ungefähr 70% homolog sind. Humane Inseln exprimieren nur GAD 65, obwohl beide Proteinformen im Gehirn gefunden werden. Ein Hinweis auf lymphozytenspezifische Immunität gegen GAD 65 wurde gezeigt und es wurde herausgefunden, daß diese eng mit IDDM verbunden ist. Neuere Studien in dem NOD-Mausmodell von Diabetes haben darauf hingedeutet, daß Antworten von T-Zellen auf GAD 65 denen auf andere mutmaßliche Autoantigene vorausgehen und daß eine frühe Induktion der Toleranz von T-Zellen gegenüber GAD 65 den Ausbruch der Erkrankung verhindern kann.
  • Kaufmann et al. (1993) und Tisch et al. (1993) haben Daten vorgelegt, die nahelegen, daß GAD-Antworten die Bedeutendsten bei der Entwicklung der Erkrankung sind, da von diesen berichtet wurde, als erstes während der Entwicklung von Diabetes-Typ 1 zu erscheinen, wobei Antworten auf andere Autoantigene von Beta-Zellen nur sehr viel später im Verlauf der Erkrankung erscheinen, wobei Insulinreaktivität unter den Letzten ist, die erscheinen. Diese Erkenntnisse wurden so interpretiert, daß sie darauf hindeuten, daß GAD 65 das entscheidende Autoantigen bei Diabetes-Typ 1 ist und daß eine Modulation der Autoimmunreaktivität mit GAD das geeignetste Ziel für das Herabsetzen der Erkrankungspathologie wäre. In Einklang mit diesem theoretischen Verständnis des Fortschreitens der Erkrankung würde das Modulieren der insulinreaktiven T-Zellen das Schließen des Scheunentors nachdem die Pferde gegangen sind sein, da die Anti-Insulinreaktionen so spät beim Fortschreiten der Erkrankung beobachtet werden, daß nicht erwartet würde, daß ihre Modulation den Ausbruch oder die Schwere der Erkrankung beeinflussen würde.
  • Autoantikörper gegen Insulin (IAA) können bei ungefähr 50% der Patienten mit neuem Ausbruch nachgewiesen werden und stehen stark im Zusammenhang mit Autoantikörpern gegen Inselzellen (ICA) und dem HLA-DR4-Phänotyp. Andere Studien legen nahe, daß Individuen mit sowohl ICA als auch IAA ein sehr viel höheres Risiko haben, offenkundigen Diabetes-Typ 1 zu entwickeln, als diejenigen, die einen der Marker alleine haben. Antworten der T-Zellen auf Insulin als ein Autoantigen wurden auch beschrieben. In einer Studie waren zelluläre Antworten auf humanes Insulin bei fast 90% von ICA-positiven Verwandten ersten Grades von IDDM-Patienten vorhanden. Auch können, wie unten in den Beispielen beschrieben, insulinreaktive T-Zellen von diabetischen NOD-Mäusen Diabetes auf nicht diabetische NOD-Mäuse übertragen.
  • Antworten von T-Zellen von Patienten mit Diabetes-Typ 1 oder von gefährdeten Individuen auf undefinierte Inselzellpräparate haben nahegelegt, daß T-Zellen auch auf andere Antigene der Inselzellen reagieren. Diese umschließen ein 38 kD Antigen aus den sekretorischen Körnchen der Beta-Zellen und Serumalbumin. Zusätzlich wurde Hitzeschockprotein (HSP) 65 als ein Autoantigen von T-Zellen einbezogen, basierend auf der Erkenntnis, daß HSP spezifische T-Zellen die Krankheit in NOD-Mäuse übertragen.
  • Carboxypeptidase H ist ein Molekül, welches in sekretorischen Körnchen der Inseln gefunden wird und mit der Herstellung von Peptidhormonen und Neurotransmittern in Zusammenhang gebracht wird. Es wurde als ein mögliches Autoantigen von Inseln durch Durchsuchen von cDNA-Expressionsbibliotheken mit Seren von IDDM- oder Prä-IDDM-Patienten identifiziert.
  • Mehrere andere mutmaßliche Antigene von Inselzellen, wie ICA12 und ICA512 wurden auch durch Durchsuchen von cDNA-Expressionsbibliotheken identifiziert.
  • Intraantigene und interantigene Verbreitung von Autoreaktivität ("Epitopausbreitung") sind verwandte Erscheinungen, die mit Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht werden, bei welchen zusätzliche Epitope innerhalb eines Antigens oder zusätzliche Antigene innerhalb eines Zielgewebes durch autoreaktive T-Zellen während des Fortschreitens der Erkrankung als Ziel gesetzt werden. Eine solche Antigenausbreitung wurde während des Ablaufs des inflammatorischen Autoimmunvorgangs bei den Mausmodellen für experimentelle allergische Encephalomyelitis (EAE) und insulinabhängigen Diabetes beobachtet (Lehmann et al. 1992, McCarron et al. 1990, Kaufmann et al. 1993, Tisch et al. 1993).
  • Diese Erkenntnisse der Antigen-/Epitopausbreitung legt nahe, daß um bei einer therapeutischen Behandlung Autoantigenen von Beta-Zellen von Inseln eine wirksame Immuntoleranz zur Verfügung zu stellen, die Behandlung auf eine heterogene Population spezifischer autoreaktiver T-Zellen zielen muß. Damit die Antigenverabreichung bei der Prävention und Behandlung von Diabetes-Typ 1 maximal wirksam ist, ist es daher wünschenswert, daß eine Vielzahl der immundominanten Epitope von sowohl Insulin als auch GAD 65 den krankheitshervorbringenden, autoreaktiven T-Lymphozyten vorgelegt wird.
  • Vorhersage und Diagnose von Typ 1-Erkrankung
  • Wie oben erörtert, gibt es einen genetischen Gesichtspunkt zu dem Auftreten von Diabetes-Typ 1. Dementsprechend können genetische Tests bestimmte Individuen mit erhöhtem Risiko für das Entwickeln der Krankheit identifizieren (siehe z.B. Walston et al. 1995). Weiterhin können Individuen mit einer bekannten Familiengeschichte der Erkrankung in Bezug auf frühe vorklinische Anzeichen der Entwicklung der Erkrankung überwacht werden, d.h. durch Überwachen der Mengen an Autoantikörpern und hierin erörterten autoreaktiven T-Zellen.
  • Autoantikörper
  • Unter den Autoantikörpern, von denen bekannt ist, daß sie mit Diabetes-Typ 1 in Zusammenhang gebracht werden, sind die gegen GAD 65 gerichteten diejenigen, die am frühesten erscheinen und in der größten Anzahl an Patienten vorhanden sind. Insgesamt haben neuere Studien gezeigt, daß über 80% der Individuen mit präklinischem Diabetes für GAD spezifische Autoantikörper haben. In diesem Fall ist ein Individuum mit präklinischer Erkrankung als ein Verwandter ersten Grades eines Patienten mit Diabetes-Typ 1 mit ICA definiert. Die durch ICA identifizierten Antigene sind schlecht bestimmt, ergeben aber zusammen mit IAA und für GAD spezifischen Autoantikörpern einen hohen Vorhersagewert für den Ausbruch von Diabetes bei präklinischen Individuen. Interessanterweise nimmt die Häufigkeit von für GAD spezifischen Antikörpern bei tatsächlicher Erkrankung mit frühem Ausbruch ab. Dies könnte aufgrund der Tatsache sein, daß eine GAD 65-Reaktivität mit der Zerstörung der Beta-Zellen abnimmt.
  • Eine Vorhersage von Diabetes-Typ 1 kann auch durch Überwachen des Blutzuckerspiegels des Subjekts, bevorzugt in Verbindung mit der Verabreichung eines Glukosetoleranztestes an das Subjekt, vereinfacht werden. Solche Verfahren werden bevorzugt im Zusammenhang mit der Überwachung der Titer an zirkulierenden IAA-, ICA- und GAD-Autoantikörpern des Subjekts ausgeführt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die chimären Proteine der Erfindung Fusionsproteine, welche als antigene Substrate für den Nachweis von zirkulierenden Autoantikörpern, insbesondere IAA- und/oder GAD 65-Autoantikörpern, in Diagnoseuntersuchungen wie Western Blot, ELISA, RIA, ELISPOT und ähnlichen verwendet werden können.
  • T-Zellen
  • Untersuchungen für den Nachweis von T-Zellen mit spezifischen Reaktivitäten sind im Stand der Technik gut bekannt und umfassen die gemischte Lymphozytenreaktion (MLR) und die ELISPOT-Untersuchung. ELISPOT-Untersuchungen werden z.B. in Taguchi et al., J. Immunol. Meth. 1990, 128:65 und Sun et al., J. Immunol. 1991, 146:1490 beschrieben. Gemäß der Erfindung können die chimären Fusionsproteine der Erfindung als Substrate in solchen Untersuchungen für die Detektion und Quantifizierung von insulinreaktiven T-Zellen und/oder GAD 65-reaktiven T-Zellen und/oder IA-2-reaktiven T-Zellen verwendet werden.
  • Derzeitige Verfahren zur Vorbeugung und Behandlung von Diabetes-Typ 1
  • Während Diabetes seit Jahrhunderten untersucht wurde, sind nur wenige wirksame Behandlungen für die Typ 1-Erkrankung verfügbar. Die unterste Ebene der Behandlung ist eine Diät mit geeigneter, auf dem idealen Körpergewicht basierender Kalorienaufnahme und einer festgelegten Verteilung zwischen Protein, Glukose und Fett. Bei IDDM-Patienten ist jedoch der bedeutendste Bestandteil der Therapie die Verabreichung von Insulin, mit dem Ziel, die Glukosespiegel während des gesamten Tages so nahe wie möglich an dem normalen Bereich zu halten. Insulin ist in schnell, mittel und lang wirkenden Formulierungen, die in Beginn, Spitze und Andauern der Wirkung variieren und nach veränderlichen Verabreichungsschemen in der Bestrebung der optimalen Regulation der Plasmaglukosespiegel verwendet werden können.
  • Intensive Insulintherapie bezieht sich auf ein strenges Behandlungsschema der Verabreichung hormonell wirksamen Insulins und Überwachung der Blutzuckerspiegel. Dieses Behandlungsschema ist für eine so präzise wie mögliche Kontrolle der Blutglukose gestaltet. Die Ergebnisse der multizentrischen Diabetes Kontroll- und Komplikationsstudie stellten fest, daß Komplikationen bei Diabetes signifikant durch bessere Kontrolle der Blutglukosespiegel herabgesetzt werden und haben so die Erwünschtheit einer intensiven Insulintherapie gezeigt. Ein Problem dieses Ansatzes ist, daß intensive Insulintherapie ein hohes Maß an Patientenbewußtsein und -folgsamkeit sowie ein hochbegabtes Betreuungsteam an Ärzten, Krankenschwestern und Diätspezialisten erfordert. Die Ziele der intensiven Insulintherapie sind daher selbst mit motivierten und gebildeten Patienten extrem schwierig zu erreichen. Ein weiteres Problem ist, daß ein höherer Anteil an Hypoglykämie bei solchen streng behandelten Patienten gesehen wird als bei Patienten, die übliche, weniger strenge Insulinbehandlungen erhalten.
  • Die Diabetes Kontroll- und Komplikationsstudie hob nicht nur den Vorteil des Haltens von normalen Blutglukosespiegeln für die gesamte metabolische Gesundheit heraus, sondern auch ein grundsätzliches Problem, das mit der Behandlung von Diabetes-Typ 1 in Zusammenhang gebracht wird, nämlich, daß offenkundige Symptome der Krankheit nur dann manifestieren, wenn tatsächlich alle Inselzellen des Patienten zerstört sind. Orale Mittel für Diabetes, wie die Sulfunylharnstoffe, wirken in erster Linie durch Stimulieren der Freisetzung von Insulin aus Beta-Zellen mit Fehlfunktion und sind daher für die meisten Patienten mit Typ 1-Erkrankung nicht geeignet, d.h. für jene Patienten mit IDDM.
  • Ein hauptsächliches Ziel bei der Behandlung von Diabetes war die Entwicklung von Therapien, die in der Lage sind, den Autoimmunangriff auf die Beta-Zellen der Inseln vor deren kompletter Zerstörung abzubrechen, wobei genug endogene Funktionen zur Erhaltung einer metabolischen Kontrolle bewahrt wird.
  • Induktion von Toleranz
  • In dem NOD-Mausmodell (nicht adipös diabetisch) für Diabetes wurde gezeigt, daß orale Zuführung von Insulin den Ausbruch der Erkrankung verzögerte und die Schwere reduzierte. Der zur Erklärung der oralen Toleranz vorgeschlagene Mechanismus ist, daß orale Verabreichung von Antigen Populationen antigenspezifischer Th2 T-Zellen induziert, die antiinflammatorische Zytokine, wie IL-4, IL-10 und TGF-Beta, ausschütten. Diese T-Zellen zirkulieren und werden nur in der Anwesenheit ihres spezifischen Antigens für die Sekretion von Zytokinen aktiviert. Daher würden insulinspezifische Th2 T-Zellen nur im Pankreas aktiviert, wo sie unterdrückende Zytokine zur Modulation des Autoimmunvorgangs herstellen würden. Dieser Mechanismus erfordert daher nicht, daß das orale Antigen tatsächlich ein erkrankungsspezifisches Autoantigen darstellt, sondern vielmehr nur, daß es in einer gewebespezifischen Art exprimiert wird.
  • Im Gegensatz dazu erfordern Verfahren, die für die Erzeugung von Toleranz von T-Zellen gestaltet sind (z.B. durch Anergie oder Apoptose), die Identifizierung der eigentlichen, für die Erkrankung spezifischen Autoantigene, auf die der Autoimmunangriff abzielt. Solche Antigene werden dann dem Patienten in geeigneter verträglicher Art verabreicht (welche auch nicht antigenspezifische verträgliche Auswirkungen induzieren kann). Vorausgesetzt, daß Diabetes-Typ 1 in signifikantem Maß eine durch inselspezifische autoreaktive T-Zellen vermittelte Erkrankung ist, sollte eine Therapie dieser Art im Prinzip durchführbar sein. Daher hat die Induktion neonataler Toleranz für GAD 65, wie oben genannt, den Ausbruch der Erkrankung in NOD-Mäusen verhindert. Zusätzlich hat auch eine Injektion unbehandelter Inselextrakte in den Thymus, wo die Tolerierung der sich entwickelnden T-Zellen stattfindet, sowohl NOD-Mäuse als auch prädiabetische BB-Ratten vor der sich entwickelnden klinischen Erkrankung geschützt.
  • Ein Ansatz, der für die Induktion von Insulintoleranz verfolgt wurde, umfaßt die parenterale Verabreichung von Insulin in Kombination mit einem üblichen Hilfsstoff (z.B. Freund Adjuvans). Typischerweise umfaßt dieser Ansatz die Verabreichung von Insulindosen, die nicht groß genug wären, daß man das Auslösen eines Insulinschocks in dem Patienten erwarten würde. Bemerkenswerterweise sind die Insulinreste der chimären Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung hormonell unwirksam und daher für eine Verwendung gemäß der Verfahren der PCT-Anmeldung WO 97/09061, eingereicht im Namen von Yi Wang, geeignet.
  • Apoptose
  • Apoptose ist eine Form des programmierten Zelltodes, die in vielen biologischen Systemen auftritt (Kerr et al., 1991, Lockshin und Zakeri, 1991, Cohen et al., 1992, Duvall und Wyllie, 1986, Cotter et al., 1990). Wie oben erörtert, durchläuft eine apoptotische Zelle ein spezifisches Programm an Ereignissen, die von aktivem Metabolismus abhängen und zu ihrer eigenen Selbstzerstörung beitragen. T-Zellen, die nicht Apoptose durchlaufen, sondern aktiviert werden, werden ihre "Effektor"-Funktionen durch Verursachung von Zytolyse oder durch Ausschüttung von Lymphokinen, die Antworten von B-Zellen oder andere Immunauswirkungen verursachen, ausführen (Paul, 1989, Seiten 3-38). Diese "Effektor"-Funktionen sind die Ursache von Gewebeschaden bei Autoimmun- und anderen Erkrankungen. Ein leistungsfähiger Ansatz zur Vermeidung der Erkrankung ist daher durch Apoptose nur jene T-Zellen ständig zu beseitigen, die mit autoimmunerkrankungsanregenden Antigenen reaktiv sind, während die Mehrzahl des Vorrats an T-Zellen intakt gelassen wird. Die Verwendung von Autoantigenen zur Ausführung dieses Ansatzes wird beschrieben in der PCT Patentveröffentlichung Nr. 94/28926, eingereicht im Namen von Michael J. Lenardo und betitelt mit Interleukin-2 Stimulated T Lymphocyte Cell Death for the Treatment of Autoimmune Diseases, Allergic Disorders and Graft Rejection, und PCT Patentveröffentlichung Nr. 94/03202, eingereicht im Namen von Michael J. Lenardo, Stefen A. Boehme und Jeffrey Critchfield und betitelt mit Interleukin-4 Stimulated T Lymphocyte Cell Death.
  • Transplantation
  • Transplantation von gesunden Bauchspeicheldrüsen, Pankreasgewebe oder isolierten Pankreasinseln in Patienten, die an Diabetes-Typ 1 leiden, stellt eine effektive Behandlungsmodalität zur Verfügung. Unglücklicherweise wird die Andauer des therapeutischen Nutzens solcher Transplantate derzeit durch die gleichen Autoimmunerscheinungen begrenzt, die Typ 1-Erkrankungen in erster Linie verursachen. Dementsprechend wird eine Behandlung eines diabetischen Patienten unter Verwendung der chimären Fusionsproteine nach der Erfindung gemäß den Verfahren nach der Erfindung, wenn sie vor, gleichzeitig mit und/oder kurz nach solch einem Transplantat ausgeführt wird, die Langlebigkeit solcher Transplantate erhöhen und dabei den therapeutischen Nutzen solcher Transplantationsmaßnahmen verstärken.
  • Die beigefügten Figuren, die in die Schrift mit aufgenommen sind und einen Teil davon darstellen, erläutern bestimmte Gesichtspunkte der Erfindung und dienen zusammen mit der Beschreibung der Erklärung der Prinzipien der Erfindung. Selbstverständlich versteht es sich, daß sowohl die Figuren als auch die Beschreibung nur erklärend sind und nicht beschränkend für die Erfindung.
  • WO 96/26218 offenbart Peptide, welche Pro-Insulin und ein Epitop aus GAD 65 umfassen, und ihre mögliche Verwendung bei der Behandlung von IDDM und Prä-IDDM.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
  • 1a zeigt eine schematische Darstellung des Fusionsproteins IG1 (SEQ ID NO: 1). Die den umgekehrten Schrägstrichen folgenden Zahlen in der Legende geben den GAD 65-Peptidteil an, welchem die Region entspricht. Für hGAD 65/473 - 5 --, gibt 5 -- 555 an.
  • 1b zeigt eine schematische Darstellung des Fusionsproteins IG2 (SEQ ID NO: 2). Die den umgekehrten Schrägstrichen folgenden Zahlen in der Legende geben den GAD 65-Peptidteil an, welchem die Region entspricht. Für hGAD 65/473 - 5 --, gibt 5 -- 555 an.
  • 1c zeigt eine schematische Darstellung des Fusionsproteins IG3 (SEQ ID NO: 3). Die den umgekehrten Schrägstrichen folgenden Zahlen in der Legende geben den GAD 65-Peptidteil an, welchem die Region entspricht. Für hGAD 65/473 - 5 --, gibt 5 -- 519 an.
  • 2 zeigt die Ergebnisse von CYTOXAN-induzierten IDDM-Experimenten, bei welchen NOD-Mäuse mit Rinderserumalbumin (BSA als Kontrolle), Insulinkette B (ICB), humanem GAD 65-Peptid 250-273 oder humanem GAD 65-Peptid 520-555 (ein Peptid mit einer Sequenz, die den Aminosäureresten 139-173 von SEQ ID NO: 2 entspricht) behandelt wurden.
  • 3 zeigt die Ergebnisse von CYTOXAN-induzierten IDDM-Experimenten, bei welchen NOD-Mäuse mit Rinderserumalbumin (BSA als Kontrolle) oder den folgenden Mischungen an B-Kette von Insulin (ICB) und humanen GAD 65-Peptiden behandelt wurden: 1) jeweils 100 μg von ICB und humanem GAD 65-Peptid 250-273, 2) jeweils 250 μg von ICB und humanem GAD 65-Peptid 250-273, 3) jeweils 100 μg von ICB, humanem GAD 65-Peptid 250-273 und humanem GAD 65-Peptid 520-555 und 4) jeweils 250 μg von ICB, humanem GAD 65-Peptid 250-273 und humanem GAD 65-Peptid 520-555.
  • 4 zeigt die Ergebnisse von CYTOXAN-induzierten IDDM-Experimenten, bei welchen NOD-Mäuse mit Rinderserumalbumin (BSA als Kontrolle) oder 100 μg des chimären Proteins IG1, 250 μg des chimären Proteins IG1, 100 μg des chimären Proteins IG2 oder 250 μg des chimären Proteins IG2 behandelt wurden.
  • 5 zeigt die Ergebnisse der passiven Immunisierung des IDDM-Experiments.
  • 6 zeigt eine schematische Darstellung des Fusionsproteins IG4 (SEQ ID NO: 4). Die den umgekehrten Schrägstrichen folgenden Zahlen in der Legende geben die Position der angezeigten Peptidrestkomponente in nativem humanem GAD 65 an, von welchem die Sequenz erhalten wurde, während die aa-Zahlen in Klammern die entsprechenden Aminosäurenummern in SEQ ID NO: 4 angeben und die Schreibweise GGG an dieser Stelle den Einbau eines helixbrechenden Verbindungsstücks aus drei Glycinen angibt.
  • 7 zeigt eine schematische Darstellung des Fusionsproteins IG5 (SEQ ID NO: 5). Die den umgekehrten Schrägstrichen folgenden Zahlen in der Legende geben die Position der angezeigten Peptidrestkomponente in nativem humanem GAD 65 an, von welchem seine Sequenz erhalten wurde, während die aa-Zahlen in Klammern die entsprechenden Aminosäurenummern in SEQ ID NO: 5 angeben, und die Schreibweise GGG an dieser Stelle den Einbau eines helixbrechenden Verbindungsstücks aus drei Glycinen angibt.
  • 8 zeigt eine schematische Darstellung des Fusionsproteins IG6 (SEQ ID NO: 6). Die den umgekehrten Schrägstrichen folgenden Zahlen in der Legende geben die Position der Peptidkomponente des nativen humanen Proteins an, von welchem seine Sequenz erhalten wurde, während die aa-Zahlen in Klammern die entsprechenden Aminosäurenummern in SEQ ID NO: 6 angeben, und die Schreibweise GGG an dieser Stelle den Einbau eines helixbrechenden Verbindungsstücks aus drei Glycinen angibt. Wie in der Legende angegeben, umfaßt IG6 zusätzlich zu den angegebenen Teilen des humanen Insulins und humanen GAD 65 (hGAD 65) einen C-terminalen Teil von humanem IA-2 (hIA2), der die Aminosäuren 771-979 des nativen humanen Proteins (Aminosäuren 176-387 der SEQ ID NO: 6) überspannt, mit einem helixbrechenden Verbindungsstück aus drei Glycinen, welches am N-Terminus dieses Teils von IA-2 eingebaut ist.
  • 9 zeigt eine schematische Darstellung des Fusionsproteins IG7 (SEQ ID NO: 7). Die den umgekehrten Schrägstrichen folgenden Zahlen in der Legende geben die Position der Peptidkomponente des nativen humanen Proteins an, von welchem seine Sequenz erhalten wurde, während die aa-Zahlen in Klammern die entsprechenden Aminosäurenummern in SEQ ID NO: 7 angeben, und die Schreibweise GGG an dieser Stelle den Einbau eines helixbrechenden Verbindungsstücks aus drei Glycinen angibt. Wie in der Legende angegeben, umfaßt IG7 zusätzlich zu den angegebenen Teilen des humanen Insulins und humanen GAD 65 (hGAD 65) einen C-terminalen Teil von humanem IA-2 (hIA2), der die Aminosäuren 771-979 des nativen humanen Proteins (Aminosäuren 228-439 der SEQ ID NO: 7) überspannt, mit einem helixbrechenden Verbindungsstück aus drei Glycinen, welches am N-Terminus dieses Teils von IA-2 eingebaut ist.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • In Anbetracht des Vorhergehenden umfassen die Ziele dieser Erfindung das Bereitstellen neuer chimärer Fusionsproteine, die als einzelne molekulare Gebilde wirken, die 1) die Diagnose und prognostische Bewertung von Individuen erleichtern, die in Verdacht stehen, eine Veranlagung für die Entwicklung von IDDM zu haben, sowie solchen, die an IDDM und/oder Stiff-Man-Syndrom leiden, und 2) verstärkte günstige Auswirkungen zur Verfügung stellen, wenn sie Tieren verabreicht werden (einschließlich humanen Patienten), die an autoimmunem (Typ 1) Diabetes leiden oder gefährdet sind, diesen zu entwickeln. Zu diesen Zwecken stellt die Erfindung chimäre Fusionsproteine zur Verfügung, die Epitope von sowohl GAD (Glutamatdecarboxylase) 65 und Insulin umfassen. Bevorzugt sind das GAD und das Insulin humanes GAD und Insulin.
  • Gemäß der Erfindung stellt die Kombination von GAD 65- und Insulinpeptiden in einem einzigen Fusionsprotein ein praktischeres diagnostisches Reagens für die Detektion und prognostische Bewertung von Diabetes oder Stiff-Man-Syndrom zur Verfügung. Eine Besprechung von Stiff-Man-Syndrom kann z.B. in US-Patent Nr. 5,691,448 gefunden werden.
  • Gemäß der Erfindung (und wie sie in den Beispielen unten dargelegt wird) stellt die Kombination von GAD 65- und Insulinketten und/oder -peptiden in einem einzigen chimären Fusionsprotein weiter eine Verbindung zur Verfügung, die zur Bereitstellung einer besseren immunmodulatorischen therapeutischen Behandlung als die Kombination derselben Peptide und/oder Insulinketten als eigenständige einzelne Peptidreste und Insulinketten liefern, verabreicht werden kann. Ganz besonders stellen bevorzugte chimäre Fusionsproteine nach der Erfindung, wenn sie in einem Versuch in einem Mausmodell von IDDM getestet werden, einen größeren Rückgang bei der Häufigkeit des Ausbruchs von Diabetes zur Verfügung als eine Kontrollmischung, die äquimolare Mengen von jedem der verschiedenen eigenständigen einzelnen Peptidreste und Insulinketten enthält, die von dem chimären Fusionsprotein umfaßt werden, wobei keiner der einzelnen Peptidreste und Insulinketten kovalent mit irgendeinem anderen der einzelnen Peptidreste und Insulinketten in der Mischung verbunden ist, wobei die Untersuchung durch wiederholte parenterale Verabreichung einer Anzahl von abgemessenen Dosen durchgeführt wird, wobei jede Dosis aus einer vorbestimmten molaren Menge des chimären Fusionsproteins in einem pharmazeutisch wirksamen Träger oder der Kontrollmischung in dem pharmazeutisch wirksamen Träger besteht und die Verabreichung in Abständen von nicht weniger als zwölf Stunden und nicht mehr als 72 Stunden zwischen den einzelnen Dosen stattfindet.
  • Der Ausdruck "dieselben Peptide und Insulinketten als eigenständige einzelne Peptidreste", wie hierin verwendet, im Vergleich zu einem bestimmten chimären Fusionsprotein nach der Erfindung verwendet, gibt eine Kombination von isolierten Peptiden und Insulinketten an, die nicht kovalent aneinander gebunden sind (z.B. durch Peptidbindungen), wobei ein Verbinden (durch Peptidbindungen) der Peptide und Insulinketten in der richtigen Reihenfolge (z.B. denselben relativen Positionen in den aminoterminalen bis carboxyterminalen Sequenzen, wie sie in unfragmentiertem GAD 65 und unfragmentierten Insulinketten gefunden werden) das bestimmte chimäre Fusionsprotein der Erfindung erzeugen würde.
  • Während es nicht gewünscht ist, durch irgendeine bestimmte Theorie des Ablaufs gebunden zu sein, wird angenommen, daß komplexe in vivo Antigen-Prozessierung und Präsentationseffekte für die unerwarteten synergistischen Auswirkungen verantwortlich sind, die sich aus der Kombination von GAD 65- und Insulinpeptiden und/oder -polypeptiden in einem einzelnen chimären Fusionsprotein ergeben.
  • Die chimären Fusionsproteine der Erfindung kombinieren jeweils in einzelnen molekularen Gebilden die entscheidenden (immundominanten) autoantigenen Epitope von sowohl Insulin als auch GAD 65. Dadurch stellen sie aus einer einzelnen Verbindung bestehende diagnostische und therapeutische Verbindungen zur Verfügung. Die chimären Fusionsproteine der Erfindung stellen verbesserte günstige Auswirkungen nach der Verabreichung an Tiere (einschließlich humanen Patienten) zur Verfügung, wenn sie mit der Verabreichung von Kombinationen der einzelnen Peptide, die dieselben immundominanten Epitope darstellen, wie sie in den chimären Fusionsproteinen umfaßt sind, verglichen werden.
  • Die chimären Fusionsproteine der Erfindung umfassen die B-Kette von Insulin (z.B. Aminosäuren 1-31 von humanem Insulin) und bevorzugt umfassen sie weiter die C-Kette von Insulin (das "C-Fragment", z.B. Aminosäuren 32-38 von humanem Insulin). Aminosäuresequenzen der Insulinketten sind bekannt. Siehe z.B. US-Patent Nr. 4,431,740, für die Beschreibung der Insulinketten und den Gehalt der Insulinsequenzen darin. Siehe auch US-Patent Nr. 5,008,241.
  • Die chimären Fusionsproteine der Erfindung umfassen weiterhin wenigstens ein GAD-Peptid.
  • Gemäß der Erfindung ist das wenigstens eine GAD-Peptid ein GAD 65-Peptid, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus humanen GAD 65-Peptiden 115-127 (ein Peptid, das den Aminosäureresten 39-50 von SEQ ID NO: 2 entspricht), 247-286 (ein Peptid, das den Aminosäureresten 51-90 von SEQ ID NO: 2 entspricht) und 473-519 (ein Peptid, das den Aminosäureresten 92-144 von SEQ ID NO: 2 entspricht). Vollständige Aminosäuresequenzen von GAD 65-Polypeptiden sind bekannt. Siehe z.B. US-Patent Nr. 5,691,448.
  • Ergebnisse der unten beschriebenen Studien legen nahe, daß die Aufnahme von humanem GAD 65-Peptid 520-555 (ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die den Aminosäureresten 139-173 von SEQ ID NO: 2 entspricht) eine schädliche Wirkung auf das immunmodulatorische Ergebnis der Verabreichung von Insulin- und GAD-Proteinen oder -peptiden hat. Dementsprechend werden chimäre Fusionsproteine, die humanes GAD 65-Peptid 520-555 enthalten, obwohl sie innerhalb des Bereichs der Erfindung liegen, mißbilligt. Die chimären Fusionsproteine der Erfindung umfassen keine Peptidsequenzen, die den humanen GAD 65-Peptiden entsprechen (insbesondere jenen aminoterminalen GAD 65-Peptiden), die in US-Patent 5,691,448 als die GAD-Löslichkeit verhindernd identifiziert wurden, und enthalten keine Peptidbereiche von GAD 65, die mit der Pathogenese von Stiff-Man-Syndrom in Verbindung gebracht werden. Daher umfassen die chimären Fusionsproteine der Erfindung gemäß den Lehren von Butler et al., 1993, in Bezug auf dominante, durch Autoantikörper in Stiff-Man-Syndrom erkannte Epitope von GAD keine Peptidbereiche, die die Aminosäuren 1-95 von GAD 65 umfassen, zusätzlich umfassen sie nicht Peptidbereiche, die entweder eine oder beide der Aminosäuren 465-484 oder 571-585 von GAD 65 umfassen.
  • Bevorzugt werden die GAD-Peptide nebeneinander (d.h. ohne mehr als ungefähr drei dazwischenliegende Aminosäuren zwischen ihnen), in derselben Reihenfolge angeordnet, wie sie in GAD 65 gefunden werden, und die Insulinketten sind nebeneinander angeordnet in derselben Reihenfolge, wie sie in Präproinsulin gefunden werden. Eine Anordnung, bei welcher die Insulinketten aminoterminal gegebenüber den GAD-Peptiden sind, ist auch bevorzugt in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung.
  • In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist wenigstens einer (bevorzugt jeder) der Cysteinreste in den Aminosäuresequenzen der verschiedenen Antigene und antigenen Peptide, die zur Bildung der chimären Fusionsproteine der Erfindung kombiniert werden, durch eine ungeladene Aminosäure ersetzt (d.h. eine Aminosäure, die bei einem pH von zwischen 6 und 7 ungeladen ist), die ein Molekulargewicht von weniger als ungefähr 150 hat. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird keiner der Cysteinreste ersetzt, d.h. es werden keine Ersetzungen für irgendeinen der Cysteinreste durchgeführt, die in irgendeinem der verschiedenen Antigene oder Antigenpeptide vorhanden sind, die zur Bildung des chimären Fusionsproteins kombiniert werden. Werden Cysteinreste ersetzt, ist die ungeladene Aminosäure bevorzugt eine Standardaminosäure. Bevorzugt ist die Standardaminosäure Alanin oder Serin. Bevorzugt ist das Ersetzen von Cystein durch eine andere neutrale Aminosäure ein epitopneutrales Ersetzen, d.h. es führt nicht zu einer Epitopumwandlung in irgendeiner der bekannten immundominanten Epitope des chimären Fusionsproteins, insbesondere solcher von GAD oder Insulin.
  • Eine ausführliche Besprechung der epitopneutralen Ersetzungen und Epitopumwandlung kann in WO 9634622 (US-Anmeldung Seriennr. 08/431,644, eingereicht am 2. Mai 1995 im Namen von Steven H. Nye et al.) gefunden werden, z.B. auf Seiten 34-36 der Schrift der eingereichten Anmeldung. Der Fachmann wird einfach die Anwendung der darin enthaltenen Lehren für die chimären Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung nachvollziehen.
  • Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, immunmodulatorische Verfahren sowohl zur Vorbeugung als auch zur Behandlung von Diabetes mellitus Typ 1 und die Verbesserung der Autoimmundefekte, die diese Krankheit stützen, zur Verfügung zu stellen. Dementsprechend ist es ein weiteres Ziel der Erfindung, die Verwendung der chimären Fusionsproteine der Erfindung bei der Herstellung von immunmodulatorischen Medikamenten vorzusehen.
  • Um diese und andere Ziele zu erreichen, stellt die Erfindung Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der eine solche Behandlung benötigt, zur Verfügung, z.B. ein Patient, der aus der Gruppe von Patienten ausgewählt ist, bestehend aus von der Entwicklung von Diabetes-Typ 1 gefährdeten Patienten und an Diabetes-Typ 1 leidenden Patienten, um den Ausbruch zu verzögern oder die Symptome von Diabetes in dem Patienten zu verringern und/oder die autoimmune Zerstörung der Beta-Zellen des Pankreas in den behandelten Patienten zu verbessern. Eine solche Behandlung ist insbesondere vorteilhaft und wird bevorzugt während der "Honeymoon-Periode", früh bei der Erkrankungsfortschreitung, durchgeführt, bevor alle Beta-Zellen des Patienten durch die Erkrankung zerstört wurden, oder später in der Erkrankungsfortschreitung, wenn ein Patient ein Kandidat für die Transplantation von Inselzellen oder solche Zellen enthaltendem Gewebe ist.
  • Diese Verfahren umfassen die Verabreichung von wenigstens einem Polypeptid gemäß der Erfindung an den Patienten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine solche Verabreichung basierend auf einem therapeutischen Zeitplan zur Modulation von T-Zellen durchgeführt, d.h. ein Zeitplan, der zur Induktion von Apoptose, Anergie oder anderen Modulationen der Autoimmunaktivität von mit wenigstens einem Epitop des wenigstens einen Polypeptids reaktiven T-Zellen gestaltet ist. Einzelheiten eines solchen therapeutischen Zeitplans zur Modulation von T-Zellen werden unten erörtert. Andere bevorzugte Verfahren der Behandlung nach der Erfindung umfassen Verabreichung von wenigstens einem Polypeptid der Erfindung an den Patienten über orale, intravenöse oder bevorzugt subkutane Wege oder durch parenterale Verabreichung, mit oder bevorzugt ohne ein Hilfsmittel, wie Freund unvollständiges Adjuvans, Freund vollständiges Adjuvans, Alaun-Adjuvans oder andere immunogene, jetzt bekannte oder anschließend entwickelte Hilfsmittel.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Chimäre Fusionsproteine
  • Alle in biologischen Systemen synthetisierten Polypeptide werden ursprünglich mit einem N-terminalen Methioninrest hergestellt. Die äußersten N-terminalen und C-terminalen Aminosäurereste werden als nicht wesentlich für die funktionelle Verwendung der Polypeptide der Erfindung angesehen, welche, obwohl dies nicht besonders bevorzugt ist, ohne solche Reste hergestellt werden können. Zum Beispiel können die Polypeptide ohne N-terminale Methionine chemisch synthetisiert werden. Chimäre Proteine nach der Erfindung umfassen daher IG1 (welches Aminosäurereste von ungefähr bei Rest 2 anfangend bis ungefähr bei Rest 153 endend von SEQ ID NO: 1 umfaßt) und IG2 (welches Aminosäurereste von ungefähr bei Rest 2 anfangend bis ungefähr bei Rest 173 endend von SEQ ID NO: 2 umfaßt). Bevorzugt umfaßt IG1 Aminosäurereste 1-154 von SEQ ID NO: 1 und IG2 umfaßt Aminosäurereste 1-174 von SEQ ID NO: 2.
  • In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen können diese chimären Proteine weiterhin eine Histidinmarkierung beinhalten (d.h. ein Stück von wenigstens fünf und bevorzugt sechs benachbarten Histidinresten, welches die Aufreinigung des chimären Fusionsproteins durch Metallchelatbildungschromatographie vereinfacht). Bevorzugt befindet sich die Histidinmarkierung an dem äußersten C-Ende des chimären Fusionsproteins. Histidinmarkierungen werden in größerem Detail in WO 9634622 (US-Patentanmeldungen Seriennummern 08/431,644 und 08/482,144) erörtert.
  • Dementsprechend umfaßt IG1 in bestimmten dieser bevorzugten Ausführungsformen Aminosäurereste 1-160 von SEQ ID NO: 1 und hat ein vorausberechnetes Molekulargewicht von etwa 18,8 kDa, IG2 umfaßt Aminosäurereste 1-180 von SEQ ID NO: 2 und hat ein vorausberechnetes Molekulargewicht von etwa 21,2 kDa.
  • Sekundärstrukturüberlegungen
  • Beim Entwerfen von IG4 (SEQ ID NO: 4), IG5 (SEQ ID NO: 5) und IG6 (SEQ ID NO: 6) wurde besonders auf die vorhergesagten Sekundärstrukturen der Polypeptide der Erfindung geachtet. IG4 wurde anfänglich durch hypothetisches Verbinden von interessierenden Peptidepitopen zur Erzeugung einer einzigen hypothetischen Sequenz IG4NHB (SEQ ID NO: 8) entworfen.
  • Eine Sekundärstrukturvorhersage von IG4NHB (SEQ ID NO: 8) gemäß Chou und Fasman, 1978, Chou 1990 und Garnier et al., 1978 wurden unter Verwendung der LASERGENE-Sequenzanalysesoftware (DNASTAR, Madison WI) durchgeführt. Dieser Algorithmus berechnet eine Sekundärstruktur von Proteinen aus ihren Aminosäuresequenzen voraus. Andere Sequenzanalysesoftware kann auch für diesen Zweck verwendet werden, einschließlich anderer im Handel erhältlicher Software, wie GCG oder MACVECTOR.
  • Die gesamte Sequenz von Aminosäure 77 (Phe 77) bis Aminosäure 134 (Thr 134) von IG4NHB (SEQ ID NO: 8) wurde als helixbildende Eigenschaften aufweisend vorausberechnet. Die Neigung zur tatsächlichen Bildung langer Helices nimmt sehr stark ab für Sequenzen mit mehr als 20 Aminosäuren, wobei die längsten ununterbrochenen Helices üblicherweise nicht mehr als 26 Aminosäuren enthalten. Von der 57 Aminosäuren langen helixbildenden Sequenz von Aminosäure 77 bis 134 von IG4NHB (SEQ ID NO: 8) würde daher erwartet, an unvorhersehbaren, wenn nicht zufälligen Stellen unter Bildung einer Vielzahl von unterschiedlichen Strukturen zu brechen. Solche Strukturen sind bei den chimären Fusionsproteinen unerwünscht, da sie voraussichtlich zu unkontrollierbarer Aggregation neigen würden und es würde erwartet, daß sie in Bezug auf die nativen Sekundärstrukturen der Epitope in den isolierten Peptiden, welche von den chimären Fusionsproteinen umfaßt sind, und in den nativen Proteinen, von welchen die Peptide stammen (z.B. Insulin, GAD 65 oder IA-2), deren natives Sekundärstrukturen für die in den chimären Fusionsproteinen enthaltenen Epitope bevorzugt sind, abweichen. Daher sind in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen Helixbrecher (siehe nächster Abschnitt) zwischen den Epitopen eingeführt, um 1) die Bildung von sehr langen Helices zu unterbinden und 2) die Epitope vorausberechenbar in bestimmte strukturelle Gebilde mit eindeutigen Sekundärstrukturen aufzuteilen.
  • Helixbrecher sind Aminosäuren oder Gruppen von hintereinander angeordneten Aminosäuren, die zur Unterbindung der Fortführung von helikalen Sekundärstrukturen in entstehenden Polypeptidketten wirken. Gly und Pro sind als starke Helixbrecher bekannt, Asn und Tyr sind schwache Helixbrecher. Das Einfügen von einer dieser Aminosäuren oder Kombinationen davon in ein Polypeptid wird darauf abzielen, eine Helix einer entstehenden Polypeptidsekundärstruktur an der Stelle der Einfügung zu beenden. Um die Beendigung der Helix und die Trennung der gewünschten Epitope sicherzustellen, ist ein Helixbrecher, der wenigstens zwei Aminosäuren lang ist (wobei jede der Aminosäuren gleich oder unterschiedlich von der anderen ist und ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Gly, Pro, Asn und Tyr), bevorzugt, bevorzugter ist ein solcher Helixbrecher wenigstens drei Aminosäuren lang. Am meisten bevorzugt ist der Helixbrecher genau drei Aminosäuren lang. Besonders bevorzugte Helixbrecher sind Pro-Pro-Pro (SEQ ID NO: 9) und Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 10), wobei der letztere der am meisten bevorzugte von diesen ist.
  • Dosierung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die chimären Proteine, wenn sie als therapeutisches Mittel verwendet werden, an Patienten, die einer solchen Behandlung bedürfen, in Mengen verabreicht, die von ungefähr 6,9 pM/kg/Patient bis ungefähr 8,6 μM/kg/Patient reichen. Bevorzugt reichen die Mengen von ungefähr 34,5 pM/kg/Patient bis ungefähr 5,2 μM/kg/Patient. Bevorzugter reichen die Mengen von ungefähr 170 pM/kg/Patient bis ungefähr 3,5 μM/kg/Patient. Am meisten bevorzugt reichen die Mengen von etwa 0,5 μM/kg/Patient bis etwa 3,5 μM/kg/Patient.
  • In einigen ihrer Gesichtspunkte stellt die vorliegende Erfindung auch die wiederholte Verabreichung von Dosen, die geringere Mengen der chimären Fusionsproteine der Erfindung enthalten, an einen eine solche Behandlung benötigenden Patienten zur Verfügung. Obwohl es weniger bevorzugt ist, können Dosen, die Mengen von weniger als ungefähr 6,9 pM/kg/Patient enthalten und so wenig wie ungefähr 1 pM/kg/Patient enthalten, bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Bevorzugt werden die chimären Proteine ohne die begleitende Verabreichung eines Hilfsmittels verabreicht, jedoch wird eine anfängliche Verabreichung an Versuchstiere bei der Verwendung bei der Durchführung von Versuchen zu T-Zellen (z.B. in transgenen Mäusen, wie in Wong et al., 1998, beschrieben) bevorzugt mit Hilfsmittel durchgeführt.
  • Verabreichung nach einem therapeutischen Zeitplan zur Modulation von T-Zellen
  • Gemäß der Erfindung umfaßt ein therapeutischer Zeitplan zur Modulation von T-Zellen die Verabreichung von die chimären Proteine der Erfindung enthaltenden Dosen, bevorzugt in einem pharmazeutisch wirksamen Träger, wiederholt an den Patienten, wenigstens zweimal mit einem Abstand von wenigstens sechs und bevorzugt wenigstens zwölf Stunden, mit einem Abstand von weniger als sieben Tagen, bevorzugt nicht mehr als 72 Stunden, bevorzugter nicht mehr als 48 Stunden und am meisten bevorzugt nicht mehr als 24 Stunden zwischen den Dosen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die chimären Fusionsproteine bevorzugt parenteral ohne die begleitende Verabreichung eines Hilfsmittels verabreicht. Die Verabreichung mittels eines parenteralen Weges wird üblicherweise über eine Injektion, wie eine intravaskuläre Injektion (z.B. intravenöse Infusion), subkutane Injektion oder intramuskuläre Injektion durchgeführt. Andere nicht orale Wege der Verabreichung, z.B. über die Schleimhaut, Inhalation, transdermal mit Ultraschall und ähnliches können sofern sie gewünscht und realisierbar sind für das bestimmte zu verabreichende Polypeptid verwendet werden.
  • Auch wenn es weniger bevorzugt ist, können chimäre Fusionsproteine nach der Erfindung auch oral verabreicht werden, wobei die Dosen für die orale Verabreichung typischerweise ein oder zwei Größenordnungen größer sein werden, als die oben unter der Zwischenunterschrift "Dosierung" erörterten.
  • Für die Injektion und andere Verabreichungswege geeignete Formulierungen sind im Stand der Technik gut bekannt und können z.B. in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17. Ausgabe (1985) gefunden werden. Bevorzugte Formulierungen für die parenterale Verabreichung der Proteine der Erfindung sind solche, die für Insulin in der USP 23/NF18 (1995) beschrieben werden.
  • Parenterale Formulierungen müssen steril und nicht fiebererzeugend sein und werden im allgemeinen einen pharmazeutisch wirksamen Träger, wie Kochsalzlösung, gepufferte (z.B. phosphatgepufferte) Kochsalzlösung, Hank Lösung, Ringer Lösung, Glukose/Kochsalzlösung, Glukoselösungen und ähnliches umfassen. Formulierungen können sofern benötigt auch pharmazeutisch geeignete Hilfssubstanzen enthalten, wie tonusanpassende Mittel, benetzende Mittel, bakterizide Mittel, Konservierungsmittel, Stabilisierungsmittel und ähnliches.
  • Weitere Erörterungen zur Dosierung und Verabreichung von Polypeptiden unter Verwendung von therapeutischen Zeitplänen zur Modulation von T-Zellen können in WO 9634622 (US-Patentanmeldungen Seriennummern 08/431,644 und 08/482,114) (oben erörtert) und WO 9709061 (US-Patentanmeldungen Seriennummer 08/565,769, eingereicht am 1. Dezember 1995 in Namen von Yi Wang) zur vollständigeren Beschreibung des Standes der Technik, zu welchem die vorliegende Erfindung gehört, gefunden werden.
  • Ohne sie in irgendeiner Art beschränken zu wollen, wird die vorliegende Erfindung vollständiger durch die folgenden Beispiele beschrieben werden.
  • Experimentelle Verfahren
  • Nicht fettleibige diabetische (NOD-) Mäuse sind eine Mauslinie, die zur Entwicklung von Diabetes neigt und ein geeignetes Modellsystem für die Untersuchung von Diabetes mellitus darstellt. Diese Mäuse, mit der Bezeichnung NOD/MrkTacfBR wurden von Taconic Farms (Germantown, NY) erworben. NOD SCID-Mäuse mit der Bezeichnung NOD/SCID sind von den Jackson Laborstories, Bar Harbor, ME, erhältlich. Die Häufigkeit von Diabetes bei einem Alter von 200 Tagen bei diesen Mäusen ist 80% in weiblichen und 50% in männlichen. Im Alter von 110 Tagen wurden weniger als 15% der männlichen NOD-Mäuse diabetisch.
  • CYTOXAN-induzierte Experimente:
  • Eine Behandlung mit CYTOXAN (Cyclophosphamid) kann die Häufigkeit von Diabetes in nicht diabetischen NOD-Mäusen erhöhen und den Ausbruch beschleunigen. Zufällig ausgewählten, nicht diabetischen, männlichen NOD-Mäusen mit einem Alter von 100 bis 110 Tagen wurde an Tag 0 Cyclophosphamid (250 mg/kg) injiziert (ip). Alle Mäuse wurden 2-3 mal pro Woche für einen Zeitraum von 21 Tagen nach Injektion von Cyclophosphamid einer Uringlukosemessung unterzogen. Der Ausbruch von Diabetes wurde als der erste Zeitpunkt festgehalten, an dem an zwei aufeinanderfolgenden Tagen positive Uringlukoseergebnisse erhalten wurden. Blutglukose wurde ebenfalls zur Bestätigung der Uringlukoseergebnisse gemessen. (ExacTech MediSense Inc., Cambridge, MA). Bei allen Mäusen, bei denen positive Uringlukose festgestellt wurde, waren die Blutglukosespiegel höher als 150 mg/dl. Am 21. Tag wurden diese Mäuse getötet und histologisch untersucht.
  • Experimente in dem NOD-SCID-Modell zur passiven Immunisierung:
  • Einzellige Milzzellen wurden von diabetischen NOD-Mäusen mit kürzlichem Erkrankungsausbruch (nicht mehr als drei Wochen diabetisch) geerntet und ungefähr 35 x 106 dieser Milzzellen in 0,2 ml PBS wurden intravenös in 6-8 Wochen alte NOD/SCID-Mäuse injiziert. Ein Ausbruch von Diabetes wurde zweimal wöchentlich durch Uringlukoseuntersuchung überwacht und durch Blutglukoseuntersuchung am 28. Tag in Bezug auf den Zeitpunkt der Milzzellenübertragung bestätigt. Am 28. Tag wurden diese Mäuse getötet und histologisch untersucht.
  • Reagenzien:
  • CYTOXAN (Cyclophosphamid, Mead Johnson oncology products) wurde in destilliertem Wasser (25 mg/ml) gelöst. Die oxidierte B-Kette von Rinderinsulin wurde von Sigma bezogen (Katalognummer 1-6383). Sowohl die B-Kette von Insulin als auch das BSA-Kontrollprotein (Miles Inc., #81-001) wurden in PBS/1 M HCl, pH 2 gelöst, vor einer Dialyse gegen PBS, pH 7,2, sterilen Filtration und Lagerung von gefrorenen Teilproben.
  • BEISPIELE
  • Gene zur Expression von chimären Proteinen nach der Erfindung
  • IG1.
  • Ein künstliches, das chimäre Protein IG1 codierendes, chimäres Gen (SEQ ID NO: 1) wurde durch zwei Durchgänge überlappender PCR konstruiert (Ho et al., 1989). Jede Unterdomäne des Gens wurde in einer PCR-Standardreaktion mit 100 μl unter Verwendung von 10 pmol von jedem der geeigneten Oligonukleotidprimer, wie unten beschrieben, synthetisiert. Der 5'-Genabschnitt wurde unter Verwendung der überlappenden Primer vervielfältigt: prIG1 (SEQ ID NO: 11) und prIG2 (SEQ ID NO: 12). Der 3'-Genabschnitt wurde unter Verwendung der überlappenden Primer prIG3 (SEQ ID NO: 13) und prIG4 (SEQ ID NO: 14) vervielfältigt. Das Oligonukleotid prIG1 (SEQ ID NO: 11) wurde zur Ermöglichung der Schaffung einer einzelnen NdeI-Restriktionsstelle am 5'-Ende entworfen. Der Primer prIG4 (SEQ ID NO: 14) umfaßte eine einzelne BamHI-Stelle, ein Stopcodon (TAA) und 18 eine Histidinmarkierungssequenz codierende Nukleotide zur Aufreinigung des rekombinanten chimären Proteins durch Metallaffinitätschromatographie. Die zwei Unterdomänen wurden unter Verwendung der angrenzenden Oligonukleotide prIG5 (SEQ ID NO: 15) und prIG6 (SEQ ID NO: 16) in einer zweiten PCR-Reaktion unter Erhalt eines 492 bp Genprodukts kombiniert. Das PCR-Produkt wurde in einen Expressionsplasmidvektor pCR2.1, wie von dem Hersteller beschrieben, kloniert (Invitrogen, San Diego, CA). Kanamycinresistente DH10B-Transformanden wurden selektiert und die richtigen Klone und Orientierungen durch Restriktion und Sequenzanalyse bestimmt. Restriktionsfragmente von zwei Klonen (#6 und #18) wurden zum Entfernen ungewünschter Mutationen kombiniert. Im Anschluß an eine Nukleotidsequenzanalyse wurde ein unabhängiges Plasmid pCR2.1-IG1 mit NdeI und BamHI verdaut und das 492 bp Fragment in passende Stellen des MP4-Expressionsplasmids pET22b-MP4 (Elliott et al., 1996) unter Erhalt von Plasmid pIG1 eingefügt. Das Insert aus pCR2.1-IG1 wurde auch in einen Plasmidvektor pBLUSCRIPT®SK+ (STRATAGENE CLONING SYSTEMS, La Jolla, CA) unter Erhalt von Plasmid pSK+IG1 unterkloniert. Das künstliche Gen IG1 (SEQ ID NO: 17) codiert ein chimäres Fusionsprotein mit einem vorausberechneten Gewicht von ungefähr 18,8 kDa.
  • IG2.
  • Ein künstliches, das chimäre Protein IG2 (SEQ ID NO: 2) codierendes, chimäres Gen wurde durch PCR-Vervielfältigung eines inneren Genfragmentes IG1 unter Verwendung von pIG1 als Matrize zusammen mit dem Vorwärtsprimer prIG7 (5'-AGATCTGATG AACATTCTGC TGCAGTATGT TGTTAAAAGC TTCGATAACA TGTATGCCAT GATG-3' – SEQ ID NO: 18; die BglII-Stelle ist unterstrichen) in Kombination mit dem Rückwärts-Oligonukleotidprimer prIG8 (5'-TGTACAGATA TTCCGCCAGT TCCAGACATT TTTTCAGAGA AAAATGGCTA TGTTCAGAGG TAAAGGCAAT CAGACGCG-3' – SEQ ID NO: 19; die BsrGI-Stelle ist unterstrichen) erstellt. Das BglII-BsrGI PCR-Fragment mit 197 bp wurde in pCR2.1 unterkloniert. Eine Sequenzanalyse zeigte eine C>G-Substitution an Position 183 in dem codierenden Strang des BglII-BsrGI PCR-Fragments mit 197 bp bei allen analysierten Subklonen und das Plasmid wurde pCR2.1-IG7/8C183G genannt. Eine anschließende Analyse zeigte einen Fehler bei der ursprünglichen prIG8-Primersequenz (SEQ ID NO: 19). Ein Reparaturprimer prIG12 (SEQ ID NO: 20) wurde zur Korrektur der C>G-Substitution in pCR2.1-IG7/8C183G synthetisiert. Der interne BglII-BsrGI DNA-Abschnitt mit 197 bp wurde durch PCR korrigiert, unter Verwendung von pCR2.1-IG7/8C183G als Matrize, neben den Primern prIG7 (SEQ ID NO: 18) und prIG12 (SEQ ID NO: 20). Die PCR-Fragmente wurden in pCR2.1 unterkloniert, ihre Sequenz wurde unter Verwendung der normalen Didesoxy-Sequenzierung zur Bestätigung, daß die gewünschte Sequenz erhalten wurde, bestimmt und ein einzelner mit pCR2.1-IG7/12 bezeichneter Klon wurde isoliert und vervielfältigt.
  • Das BglII-BsrGI-Restriktionsfragment mit 137 bp in pSK+IG1 wurde durch das BglII-BsrGI Fragment mit 197 bp aus pCR2.1-1G7/12 zur Erzeugung von pSK+/IG7/12 ausgetauscht. Das NdeI-BamHI-Fragment mit 552 bp aus pSK+/IG7/12 wurde in die passenden Stellen von pIG1 zur Erzeugung von Plasmid pIG2 unterkloniert. Das künstliche Gen IG2 (SEQ ID NO: 21) codiert ein chimäres Fusionsprotein mit einem vorausberechneten Gewicht von ungefähr 21,2 kDa.
  • IG3.
  • Ein künstliches, das chimäre Protein IG3 (SEQ ID NO: 3) codierendes, chimäres Gen wurde durch Entfernen eines NdeI-BamHI-Restriktionsfragmentes mit 552 bp aus dem Plasmid pET22b-IG2 und Ersetzen durch ein mit NdeI-BamHI verdautes PCR-Produkt mit 444 Basenpaaren konstruiert. Dieses PCR-Produkt mit 444 Basenpaaren wurde unter Verwendung der Primer prIG5 (SEQ ID NO: 15) und prIG13 (SEQ ID NO: 22) mit dem künstlichen Gen IG2 als Matrize hergestellt. Das künstliche Gen IG3 (SEQ ID NO: 23) codiert ein chimäres Fusionsprotein mit einem vorausberechneten Gewicht von ungefähr 17,1 kDa.
  • IG4.
  • Eine das chimäre Protein IG4 (SEQ ID NO: 4) codierende Gensequenz ist unten als SEQ ID NO: 24 dargelegt und codiert ein chimäres Fusionsprotein mit einem vorausberechneten Gewicht von ungefähr 19,8 kDa.
  • IG5.
  • Ein künstliches, das chimäre Protein IG5 (SEQ ID NO: 5) codierendes, chimäres Gen wurde durch Ligieren von PCR-Produkten unter Verwendung von Primern prIG14 (SEQ ID NO: 25), prIG15 (SEQ ID NO: 26), prIG16 (SEQ ID NO: 27), prIG17 (SEQ ID NO: 28), prIG18 (SEQ ID NO: 29), prIG19 (SEQ ID NO: 30), prIG20 (SEQ ID NO: 31), prIG21 (SEQ ID NO: 32), prIG22 (SEQ ID NO: 33) und prIG23 (SEQ ID NO: 34) konstruiert. Das künstliche Gen IG5 (SEQ ID NO: 35) codiert ein chimäres Fusionsprotein mit einem vorausberechneten Gewicht von ungefähr 25,3 kDa.
  • IG6.
  • Eine das chimäre Protein IG6 (SEQ ID NO: 6) codierende Gensequenz ist unten als SEQ ID NO: 36 dargelegt und codiert ein chimäres Fusionsprotein mit einem vorausberechneten Gewicht von ungefähr 43,7 kDa.
  • IG7.
  • Eine das chimäre Protein IG7 (SEQ ID NO: 7) codierende Gensequenz ist unten als SEQ ID NO: 37 dargelegt und codiert ein chimäres Fusionsprotein mit einem vorausberechneten Gewicht von ungefähr 49,2 kDa.
  • Expression und Aufreinigung von rekombinanten IG-Fusionsproteinen
  • Für die Herstellung des Expressionsplasmids für jedes bakteriell exprimierte IG-Fusionsprotein wurden elektrokompetente E. coli-Stamme BL21 (DE3) mit dem Expressionsplasmid transformiert und ampizillinresistente Kolonien für die Flüssigkultur ausgewählt. Das IDE3-Lysogen in Stamm BL21 (DE3) enthält das Gen für T7-Polymerase hinter dem E. coli lacUV5-Promotor zur wirksamen Expression von Zielgenen unter der Kontrolle des starken Bakteriophagen T7-Transkriptions- und Translationssignals (Studier et al., 1990).
  • Das rekombinante chimäre Fusionsprotein wurde aus den in Lösung gebrachten Pellets von ganzen Zellen durch Affinitätschromatographie mit gebundenem Metall gereinigt und durch SDS-PAGE/Coomassie-Blau-Färbung analysiert. Kulturen mit vier Litern wurden bis zu einer OD600 von 0,8 in Terrific Broth(TB)-Medium (Sambrook et al., 1992) gezogen. Die Proteinexpression wurde für 5 Stunden mit 1 mM isopropylthiogalaktosid (IPTG) induziert. Die induzierten Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und über Nacht bei –20°C eingefroren. Die Zellpellets wurden bei Raumtemperatur aufgetaut und in 10 ml/g Puffer A (6 M Guanidin-HCl/10% Glycerin/20 mM Tris-Cl pH 7,8/500 mM NaCl/200 mg Natriumsulfit/280 mg Natriumtetrathionat) unter Verwendung eines TEKMAR Homogenisators (The Tekmar Co., Cincinnati, OH) homogenisiert. Die Zellen wurden bei –70°C für eine Stunde eingefroren und zur Unterstützung der Zellyse bei Raumtemperatur aufgetaut. Die Zellsuspension wurde für 30 min bei Raumtemperatur sachte unter Verwendung eines magnetischen Rührers gemischt. Der lösliche IG-Protein enthaltende Anteil wurde als der Überstand im Anschluß an eine Zentrifugation des Zellysats bei 10.000 × g für 30 min bei 4°C in einem Beckman JA-10-Rotor abgenommen. Der Überstand wurde auf eine Ni-NTA-Säule (QIAGEN Inc., Chadsworth, CR), die zuvor mit Puffer A equilibriert wurde, bei einer Durchflußrate von 8 ml/min geladen. Die Säule wurde unter Verwendung von Puffer A gewaschen, bis die Absorption der Basislinie entsprach. Die Säule wurde weiter mit Puffer B gewaschen (6 M Harnstoff/10% Glycerin/ 20 mM Tris-Cl/500 mM NaCl pH 7,8) und verunreinigende E. coli-Proteine wurden mit Puffer C entfernt (6 M Harnstoff/10% Glycerin/20 mM Tris-Cl/500 mM NaCl pH 5,0). Das IG-Protein wurde mit Puffer D eluiert (6 M Harnstoff/10% Glycerin/20 mM Tris-Cl/500 mM NaCl pH 4,0). Alle Fraktionen wurden chargenweise gesammelt und auf einem 4-20% SDS-Polyacrylamid-Gradientengel in Anwesenheit eines Reduktionsmittels analysiert. Die IG-enthaltenden Fraktionen (Waschen mit Puffer D) wurden 10-fach unter Verwendung einer AMICON STIRCELL unter Verwendung einer PM10-Membran aufkonzentriert. Die Proben wurden gegen MILLI-Q Wasser, welches zweimal gewechselt wurde, bei 4 °C dialysiert. Die IG-Präparate wurden filtersterilisiert und die Konzentration spektrophotometrisch unter Verwendung eines Konversionsfaktors von 1,06 mg/ml/OD280 bestimmt. Fünf Mikrogramm wurden unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen durch SDS-PAGE zum Erhalt eines anfänglichen Hinweises zu Reinheit und Intaktheit der Proteinpräparate analysiert.
  • Behandlung mit chimärem Fusionsprotein – CYTOXAN-Modell:
  • Gruppen von zufällig ausgewählten NOD-Mäusen wurden zweimal täglich intravenös mit entweder BSA als eine Kontrolle oder GAD-Peptiden, B-Kette von Insulin (ICB) oder verschiedenen Kombinationen von GAD-Peptiden und/oder B-Kette von Insulin injiziert, mit den in den Figuren an den Tagen 1,3 und 5 im Anschluß an die CYTOXAN-Behandlung (Tag 0) angegebenen Dosen. Tiere, die Injektionen von BSA erhielten (Kontrollen), manifestierten ein Auftreten von Diabetes von mehr als 80% nach 21 Tagen auf die CYTOXAN-Induktion folgend (2). Im Gegensatz dazu erfuhren Tiere, die entweder mit ICB oder einem der GAD 65-Peptide 250-273 oder 520-555 behandelt wurden, Abnahmen bis weniger als 50% Auftreten von Diabetes. Die therapeutischen Wirkungen der Behandlung mit Kombinationen von ICB und den zwei GAD-Peptiden wurden dann untersucht (3). Eine Abnahme im Auftreten von Diabetes auf 25% oder weniger wurde durch die Kombination von GAD 250-273 und ICB bei Dosen von 100 μg oder 250 μg pro Injektion erreicht.
  • Überraschenderweise schien die Zugabe von GAD-Peptid 520-555 (Aminosäurereste 139-173 in SEQ ID NO: 2) die therapeutische Wirksamkeit der Kombination des ICB mit GAD 65 250-273 zu hemmen. Eine Auswertung in dem CYTOXAN-Modell der chimären Fusionsproteine IG1 und IG2 der Erfindung zeigte, daß eine Behandlung mit einem dieser beiden Polypeptide eine dosisabhängige Abnahme des Auftretens von Diabetes im Vergleich zu den mit BSA behandelten Kontrolltieren vermittelte (4). In diesem Experiment waren Dosen von 300 μg wirksamer als Dosen von 100 μg und IG2 verringerte das Auftreten von Diabetes in größerem Maße als IG1. Eine Behandlung mit Dosen von 300 μg IG2 verringerte das Erkrankungsauftreten auf weniger als 12% im Vergleich zu mehr als 80% Erkrankungsauftreten bei den mit BSA behandelten Kontrolltieren.
  • Behandlung mit chimärem Fusionsprotein – Modell zur passiven Immunisierung:
  • Diabetogene einkernige Zellen aus der Milz wurden von neuerdings diabetischen NOD-Mäusen (Ausbruch weniger als 3 Wochen zuvor) geerntet. Zur Auslösung der Zerstörung der Beta-Zellen der Inseln und der Entwicklung von Diabetes wurden 8-12 Wochen alte NOD-/SCID-Mäuse intravenös mit 35 × 106 diabetogenen Milzzellen injiziert. Die Häufigkeit und der Ausbruch von Diabetes wurde zweimal wöchentlich durch Untersuchung der Uringlukose überwacht und durch Untersuchen der Blutglukose am Ende des Experimentes bestätigt. Die durchschnittliche Zeit des Ausbruchs von Diabetes nach der Induktion der Erkrankung war ungefähr 25 Tage. IV-Behandlung mit IG2, IG3 oder Antigenen der Beta-Zellen der Inseln wurde an Tag 3 begonnen. Die Tiere wurden mit 300 μg des Antigens zweimal täglich, jeden zweiten Tag für einen Zeitraum von sechs Tagen (von Tag 3 bis Tag 9, wenn der Zeitpunkt der Übertragung der Milzzellen an Tag 0 war) behandelt.
  • Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 5 dargelegt. Sie zeigen überraschenderweise, daß nur das chimäre Fusionsprotein IG2 den Ausbruch der Erkrankung in den NOD-/SCID-Empfängern verhinderte. Im Gegensatz dazu wurde in diesem Modell nur eine leichte Verzögerung beim Ausbruch der Erkrankung bei Empfängern von IG1, B-Kette von Insulin (ICB) oder der Kombination von ICB und GAD-Peptid 250-273 beobachtet. Diese starken Unterschiede in den Wirkungen der Behandlungen mit IG2 im Vergleich zu den anderen Behandlungstherapien war unerwartet. Ohne es zu wünschen, an eine bestimmte Theorie des Ablaufs gebunden zu sein, wird angenommen, daß dieser unerwartete Befund ein Ergebnis der in vivo-Reifung von IG2 in einzelne antigene Peptide ist, die besonders wirksam beim Hervorrufen eines Stadiums der Immuntoleranz sind, welches gegen autoimmunen Diabetes selbst unter den anspruchsvollen Bedingungen, die sich aus der Anregung mit heterogenen, aus den Milzzellen von vollständig diabetischen NOD-Mausen erhaltenen Populationen an T-Zellen ergeben.
  • QUELLENANGABEN
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  • Tabelle 1
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  • Sequenzprotokoll
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Claims (10)

  1. Chimäres Fusionsprotein, welches einen Aminoterminus und einen Carboxylterminus umfaßt, wobei das Protein die B-Kette von Insulin und einzelne Peptidreste, bestehend aus wenigstens einem GAD 65-Peptid, das in der Lage ist, eine Antwort von humanen T-Zellen auszulösen, umfaßt, wobei die B-Kette von Insulin und das wenigstens eine humane GAD 65-Peptid kovalent verknüpft sind und das chimäre Fusionsprotein in der Lage ist, eine Antwort von humanen T-Zellen auf die B-Kette von Insulin und auf jedes des wenigstens einen GAD 65-Peptids auszulösen, wobei das chimäre Fusionsprotein als IG1 bezeichnet wird und die Aminosäurereste 2 bis 154 von SEQ ID NO: 1 umfaßt.
  2. Chimäres Fusionsprotein, welches einen Aminoterminus und einen Carboxylterminus umfaßt, wobei das Protein die B-Kette von Insulin und einzelne Peptidreste, bestehend aus wenigstens einem GAD 65-Peptid, das in der Lage ist, eine Antwort von humanen T-Zellen auszulösen, umfaßt, wobei die B-Kette von Insulin und das wenigstens eine humane GAD 65-Peptid kovalent verknüpft sind und das chimäre Fusionsprotein in der Lage ist, eine Antwort von humanen T-Zellen auf die B-Kette von Insulin und auf jedes des wenigstens einen GAD 65-Peptids auszulösen, wobei das chimäre Fusionsprotein als IG2 bezeichnet wird und die Aminosäurereste 2 bis 174 von SEQ ID NO: 2 umfaßt.
  3. Chimäres Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei beim Testen in einem Assay in einem Maus-Modell von IDDM das chimäre Fusionsprotein eine stärkere Reduzierung der Häufigkeit des Beginns von Diabetes liefert als ein Kontrollgemisch, welches äquimolare Mengen von jedem der verschiedenen einzelnen Peptidreste, die das chimäre Fusionsprotein umfaßt, enthält, wobei keine(r) der einzelnen Peptidreste und Insulinketten mit irgendeinem (irgendeiner) anderen der einzelnen Peptidreste und Insulinketten in dem Gemisch kovalent verknüpft ist, wobei der Assay durch die wiederholte parenterale Verabreichung einer Anzahl bemessener Dosen durchgeführt wird, wobei jede Dosis aus einer vorbestimmten molaren Menge des chimären Fusionsproteins in einem pharmazeutisch wirksamen Träger oder des Kontrollgemischs in dem pharmazeutisch wirksamen Träger zusammengesetzt ist und die Verabreichung in Intervallen von nicht weniger als zwölf Stunden und nicht mehr als 72 Stunden zwischen den einzelnen Dosen erfolgt.
  4. Chimäres Fusionsprotein nach Anspruch 3, wobei das Maus-Modell von IDDM das CYTOXAN-induzierte Diabetesmodell der NOD-Maus ist.
  5. Chimäres Fusionsprotein nach Anspruch 3, wobei das Maus-Modell von IDDM das Diabetesmodell der passiven Immunisierung der NOD/SCID-Maus ist.
  6. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 und 2 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Patienten, bei denen ein Risiko zur Entwicklung von Diabetes-Typ I vorhergesagt wird, und an Diabetes-Typ 1 leidenden Patienten, wobei die Verwendung die wiederholte Verabreichung einer Dosis einer bemessenen Menge des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 und 2 umfaßt.
  7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die wiederholte Verabreichung die Verabreichung von wenigstens zwei Dosen in einem Intervall von nicht weniger als zwölf Stunden und nicht mehr als 72 Stunden umfaßt.
  8. Chimäres Fusionsprotein, welches einen Aminoterminus und einen Carboxylterminus umfaßt, wobei das Protein die B-Kette von insulin und einzelne Peptidreste, bestehend aus einem oder mehreren GAD 65-Peptiden, die in der Lage sind, eine Antwort humaner T-Zellen auszulösen, umfaßt, wobei die B-Kette von insulin und das eine oder die mehreren GAD 65-Peptid(e) kovalent verknüpft sind und das chimäre Fusionsprotein in der Lage ist, eine Antwort humaner T-Zellen auf die B-Kette von insulin und auf eines oder mehrere der GAD 65-Peptide auszulösen, wobei das GAD 65-Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus GAD 65 115-127 (Aminosäurereste 39-51 von SEQ ID NO: 2), GAD 65 247-286 (Aminosäurereste 52-91 von SEQ ID NO: 2) und GAD 65 473-519 (Aminosäurereste 92-138 von SEQ ID NO: 2), und wobei das Fusionsprotein nicht die GAD-Peptide umfaßt, die unter den folgenden ausgewählt sind: GAD 65 Reste 1-95, GAD 65 Reste 475-484, GAD 65 Reste 520-554 und GAD 65 Reste 571-585.
  9. Chimäres Fusionsprotein nach Anspruch 8, wobei das Protein in der Reihenfolge beginnend bei dem Aminoterminus die humanen GAD 65-Peptide 115-127, 247-286 und 473-519 umfaßt.
  10. Chimäres Fusionsprotein nach Anspruch 9, wobei das Protein in der Reihenfolge beginnend bei dem Aminoterminus die B-Kette von Insulin, die C-Kette von Insulin und die humanen GAD 65-Peptide 115-127, 247-286 und 473-519 umfaßt.
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