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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die
Diskussion in diesem Abschnitt ist nicht auf Inhalte beschränkt, die
sich als "Stand
der Technik" gegen
die vorliegende Erfindung eignen. Daher soll durch die Einbeziehung
bestimmter Inhalte in diese Diskussion keine Anerkennung eines solchen
Status als Stand der Technik unterstellt oder abgeleitet werden
und keine Erklärung
gegen die Belange der Erfinder der vorliegenden Erfindung soll durch
eine solche Einbeziehung unterstellt werden.
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Diabetes mellitus
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Diabetes
mellitus ist die am meisten verbreitete endokrine Erkrankung und
ist durch Störungen
im Glukosemetabolismus gekennzeichnet. Der gestörte Glukosemetabolismus, der
mit dieser Erkrankung zusammenhängt,
verursacht Hyperglykämie
(hohe Blutglukosespiegel) und verursacht schließlich Komplikationen mehrerer
Organsysteme, einschließlich
Augen, Nieren, Nerven und Blutgefäßen. Bei Patienten mit andauernder
Hyperglykämie
oder abnormaler Glukosetoleranz wird im allgemeinen die Erkrankung
diagnostiziert, obwohl Patienten anfänglich am häufigsten übermäßiges Wasserlassen (Polyurie)
und regelmäßiges Trinken aufgrund
extremen Durstes (Polydipsie) aufzeigen. Diese typischen anfänglichen
Symptome ergeben sich aus den osmotischen Effekten der Hyperglykämie.
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Die
Pathogenese von Diabetes mellitus wird üblicherweise mit pankreatischer
Fehlfunktion, insbesondere der Beta-Zellen der Langerhans-Inseln
des Pankreas, in Verbindung gebracht. Diese Fehlfunktion kann zur
Zerstörung
der Beta-Zellen der Inseln führen,
die Insulin, ein Glukose regulierendes Peptidhormon, herstellen.
Diabetes mellitus wurde allgemein als insulinabhängig oder Typ 1 im Gegensatz
zu nicht insulinabhängig
oder Typ 2 eingestuft. Diese Terminologie hat sich jedoch entwickelt,
als die Erkrankung besser verstanden wurde. Zum Beispiel wurde herausgefunden,
daß in
manchen Patienten, die an nicht insulinabhängigem Diabetes leiden, die
Erkrankung in eine insulinabhängige
Form abgleitet, während
sich diese Abhängigkeit
in anderen Patienten nicht entwickelt.
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Patienten
werden daher häufig
hinsichtlich des Mechanismus der Pathogenese der Zerstörung der
Inseln eingestuft und die Bezeichnung Typ 1 wird jetzt in Bezug
auf eine autoimmune Pathogenese der Inseln verwendet, d.h. für Diabetes,
der durch einen für
die Inseln spezifischen autoimmunen Angriff verursacht wird, und
wird hierin so verwendet. Der Begriff insulinabhängiger Diabetes mellitus (IDDM)
bezieht sich auf Diabetes-Typ 1, der zu einem Stadium fortgeschritten
ist, bei welchem ausreichend autoimmune Zerstörung der pankreatischen Beta-Zellen
für das
Aufweisen offenkundiger Symptome aufgetreten ist. Der Begriff Prä-IDDM bezieht
sich auf einen autoimmunen Zustand, der durch Biopsie oder Analyse
der autoimmunen Antworten nachgewiesen werden kann, bei welchem
pankreatische Beta-Zellen der Inseln einem spezifischen autoimmunen Angriff
dermaßen
ausgesetzt sind, daß einige
Zellen der Zerstörung
unterliegen können.
Bei Prä-IDDM
ist die Zerstörung
(sofern vorhanden) jedoch nicht ausreichend weit fortgeschritten,
daß die
Verabreichung von Insulin benötigt
wird. Da es einen Zeitpunkt in den frühen Stadien von Diabetes-Typ
1 geben kann, an welchem offenkundige Symptome beobachtet werden,
aber eine gewisse Funktion der Insel verbleibt (bekannt als die "Honeymoon-Periode", wird nicht jeder
Diabetes-Typ 1 als IDDM eingestuft und nicht jeder Prä-IDDM stellt
sich ohne offenkundige Symptome dar.
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Komplikationen des Diabetes-Typ
1
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Die
metabolischen Komplikationen, die mit dem durch Insulinmangel verursachten
abnormalen Metabolismus einhergehen, können zahlreiche Organsysteme
beeinflussen. Die häufigste
akute metabolische Komplikation ist die der diabetischen Ketoazidose,
die durch schwere Hypoglykämie
gekennzeichnet ist (und eine daraus entstehende Hypovolämie, die
durch osmotische Diurese verursacht wird) sowie eine metabolische
Azidose, die durch Freisetzen überschüssiger freier
Fettsäuren
und die Produktion von Ketonkörpern
verursacht wird.
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Über die
akuten metabolischen Komplikationen der Ketoazidose hinaus ist der
diabetische Patient anfällig
für eine
Serie später
Komplikationen, die eine beträchtliche
Erkrankungshäufigkeit
und vorzeitige Sterblichkeit verursachen. Atherosklerose tritt bei
Diabetikern aufgrund von Störungen
in sowohl dem Glukose- als auch dem Lipidmetabolismus in größerem Umfang
und früher
als in der Allgemeinbevölkerung
auf. Diese Gefäßpathologie
kann u.a. zu Koronararterienerkrankung, Schlaganfall und peripherer
Gefäßerkrankung
mit Gangrän
führen.
Retinopathie ist eine weitere Gefäßkomplikation von Diabetes.
Diabetische Retinopathie ist eine Hauptursache von Erblindung und
wird durch gesteigerte Permeabilität der Netzhautkapillaren ausgelöst, welche
zu Verschluß,
Hämorrhagie,
Aneurismenbildung und Neuvaskularisierung, bekannt als proliferierende Retinopathie,
abgleiten kann.
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Über die
Gefäßkomplikationen
hinaus sind Nieren- und neurologische Erkrankungen (Nephropathien und
Neuropathien) übliche
Komplikationen bei Diabetes. Diabetische Nephropathien verursachen
ungefähr die
Hälfte
der Nierenerkrankungen im Endstadium in den Vereinigten Staaten.
Histologisch ist die Nephropathie durch Aufweiten der glomerulären Basalmembran
und mesangliale Verdickung gekennzeichnet. Anfängliche Anzeichen umfassen
zunehmende Proteinurie mit Azotämie,
die schließlich
zu Nierenversagen führt.
Diabetische Neuropathie kann jeden Teil des Nervensystems befallen,
wobei das Gehirn eventuell eine Ausnahme bildet. Die Neuropathie
wird am häufigsten
als periphere Polyneuropathie gesehen, mit Symptomen, die Taubheit,
Fehlempfindungen, schwere Überempfindlichkeiten
und Schmerzen umfassen. Autonome Neuropathien können gastrointestinale Fehlfunktionen,
orthostatische Hypotonie, Blasenfehlfunktion oder -lähmung und
Impotenz verursachen. Diabetische Fußgeschwüre stellen ein spezielles Problem
von Diabetikern dar und scheinen in erster Linie durch abnormale
Druckverteilung und in zweiter Linie durch diabetische Neuropathie verursacht
zu werden. Die ulzerösen
Wunden werden häufig
durch eine begleitende periphere Gefäßerkrankung und Infektion verschlimmert.
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Wie
oben erwähnt,
wird eine äußerst genaue
Kontrolle der Blutglukose mit einer Verbesserung der späten Komplikationen
von Diabetes-Typ 1 in Verbindung gebracht, was nahelegt, daß die Erhaltung
oder Wiederherstellung der Funktion der Beta-Zellen die Mehrzahl
der pathologischen Komplikationen der Erkrankung verringern oder
beseitigen könnte.
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Pathogenese von Diabetes-Typ
1
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Diabetes-Typ
1 entwickelt sich nur in genetisch empfänglichen Individuen und Symptome
erscheinen im allgemeinen vor dem 40. Lebensjahr, wobei die Häufigkeitsspitze
des Ausbruchs von offenkundigen Symptomen, im zweiten Lebensjahrzehnt
erscheint. Die Pathogenese von Diabetes-Typ 1 wird durch eine anfängliche
Phase der Einwanderung von Leukozyten in die Inseln gekennzeichnet,
die als Insulitis bezeichnet wird, gefolgt von einem Zeitraum, während dem
die eigentliche Zerstörung
der Beta-Zellen der Inseln durch autoimmunen Angriff erfolgt. Die
Insulitis-Phase wird durch Unterwanderung von pankreatischen Inseln
durch sowohl Lymphozyten als auch Zellen der Monozyten-/Makrophagen-Zellinie
gekennzeichnet und zieht sowohl zellvermittelte Entzündung als
auch Angriff durch für
Inseln spezifische, zytotoxische Antikörper nach sich. Offenkundige
klinische Symptome von Diabetes mellitus werden im allgemeinen offenbar,
wenn über
90% der Beta-Zellen der Inseln zerstört sind, jedoch ist es nun,
wie ausführlicher
unten erörtert, möglich, Individuen,
die frühere Stadien
der Typ 1-Pathogenese durchleben, genau zu erkennen, d.h. bevor
genügend
Beta-Zellen der Inseln zur Erzeugung offenkundiger klinischer Symptome
verlorengegangen sind.
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Es
wird allgemein davon ausgegangen, daß der autoimmune Vorgang durch
einen Umweltanreiz ausgelöst
wird. Ein Grund für
diese Überzeugung
ist, daß ein
eineiiger Zwilling nur eine Chance von fünfzig zu fünfzig zur Entwicklung von IDDM
hat, wenn sein eineiiges Geschwisterteil die Erkrankung hat.
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T-Zellen
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Es
wird angenommen, daß die
autoimmune Zerstörung
der Beta-Zellen der pankreatischen Inseln bei Diabetes-Typ 1 durch
weiße
Blutzellen (Leukozyten), am wichtigsten T-Zellen, ausgelöst wird.
T-Zellen oder T-Lymphozyten sind einkernige weiße Blutzellen, die viele unentbehrliche
Immunfunktionen zur Verfügung stellen.
Die Bedeutung von T-Zellen bei humanen Autoimmunerkrankungen wurde
in den vergangenen zwei Jahrzehnten zunehmend anerkannt. Studien
unter Verwendung von Behandlungen, die zu einer allgemeinen Immunsuppression
führen,
haben eine entscheidende Rolle für
eine Untergruppe an T-Zellen definiert, die als CD4+-
oder T-Helferzellen bekannt sind, als primäre Regulatoren aller Immunantworten
(sowohl zelluläre
als auch humoraler) auf Protein- oder Peptidantigene.
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T-Zellen
vermitteln Gewebeverletzung durch indirekte und direkte Mittel.
T-Zellen sowohl der CD8+ (zytotoxischen)
als auch der CD4+ (Helfer)-Untergruppen
schütten
eine Vielzahl an entzündungsauslösenden Zytokinen
aus, die Gewebe indirekt durch Aktivierung verschiedener anderer
Arten an weißen
Blutzellen schädigen
können.
Beispiele solcher Wirkungen von T-Zellen umfassen Aktivierung der
Antikörper
der antikörperausschüttenden
B-Zellen (Stimulierung der humoralen Immunaktivität) und Aktivierung
von Makrophagen, die eine akute Gewebeschädigung und Entzündung durch
Ausschüttung
hydrolytischer Enzyme, reaktiver Sauerstoffspezies und zusätzlicher
entzündungsfördernder
Zytokine verursachen können.
Zu diesen indirekten Effekten der Aktivität der T-Zellen kann eine direkte
Gewebeschädigung
durch CD8+-zytotoxische T-Zellen vermittelt
werden, die Zielantigene aufweisende Zellen angreifen.
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Ein
einzigartiger Gesichtspunkt der Physiologie von T-Zellen ist die
Anwesenheit von membrangebundenen, antikörperähnlichen Bindestrukturen, die
T-Zellrezeptoren (TCRs) genannt werden, auf ihren Zelloberflächen. Wie
Antikörper
binden TCRs mit hoher Spezifität an
bestimmte Antigene. Wie antikörperherstellende Zellen,
die sich als unzählige
Klone von Zellen entwickeln, wobei jeder Klon Antikörper mit
einzigartiger Spezifität
herstellt, entwickeln sich T-Zellen als eine enorme Anzahl bestimmter
Klone und jeder einzelne T-Zellklon exprimiert einen einzelnen Typ
an TCR mit einer festgelegten Bindespezifität. T-Zellklone mit TCRs, die
spezifisch an eigene Antigene binden, sind für die Entwicklung von Autoimmunerkrankungen
verantwortlich.
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Studien
der Interaktion von Antikörpern
und TCRs mit ihren spezifischen Antigenen haben gezeigt, daß ein bestimmtes
Polypeptid-Antigen üblicherweise
zahlreiche submolekulare Charakteristiken als Epitope bekannt umfaßt, von
denen jedes als eine einzelne Bindestelle für einen bestimmten Antikörper oder
TCR dienen kann.
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T-Zellen und
Autoimmunerkrankungen
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Bei
Autoimmunerkrankungen wird nur eine begrenzte Anzahl an T-Zellklonen,
die mit verschiedenen Epitopen einer kleinen Anzahl an Autoantigenen
reaktiv sind, aktiviert und sind an der Pathogenese beteiligt. Selbst
in Individuen, die an einer Autoimmunerkrankung leiden, ist nur
von einem kleinen Prozentsatz an T-Zellklonen (0,1-1%) für die Erkennung
von Autoantigenen bekannt.
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Von
verschiedenen Mechanismen wurde postuliert, eine Rolle bei der Pathogenaktivierung
von krankheitsverursachenden autoreaktiven T-Zellen zu spielen.
Eine anfängliche
Aktivierung von antigenpräsentierenden
Zellen (APCs) durch Infektion oder lokale Entzündung ist in einen solchen
Mechanismus einbezogen. APCs, die auf diesem Weg aktiviert wurden,
können
dann eine gewaltige Costimulation für die bis dahin unreaktiven
T-Zellen zur Verfügung
stellen.
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Andere
vorgeschlagene Mechanismen umfassen die polyklonale Aktivierung
von zuvor ruhenden, autoreaktiven T-Zellen durch Superantigene,
wie Bakterientoxine oder eine zufällige molekulare Mimikri zwischen fremden
und eigenen Antigenen (Abbas et al. 1994). Im letzten Fall stellt
das Immunsystem des Wirtes eine Antwort auf ein Epitop eines durch
ein Pathogen exprimierten Proteins auf, wie ein Virus, das einem
homologen Epitop an einem Wirtsprotein ähnelt. Ein autoimmuner Angriff
ergibt sich dann aus der kreuzreaktiven Immunantwort, die folgt.
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Zusätzlich zu
externen Faktoren liegt dem Erscheinen aller durch T-Zellen vermittelten
Autoimmunerkrankungen ein komplexes Muster vererbter Empfänglichkeit,
die durch multigene Faktoren bestimmt ist, zugrunde. Für weitere
Erörterungen
dieser verschiedenen Faktoren bespricht Steinmann, 1995, derzeitige
Theorien der Autoimmunität.
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Veränderungen
im Repertoire der T-Zellen erscheinen natürlicherweise während der
Entwicklung der T-Zellen. Nur ein kleiner Teil an Thymozyten (ungereifte
T-Zellen) überlebt
die Entwicklung im Thymus und die Auswahlvorgänge, die zur Auswanderung der
sich entwickelnden T-Zellen in den peripheren Kreislauf und der Fertigstellung
ihrer Reifung führen
(von Boehmer, 1988; Marrack und Kappler, 1987). Experimentelle Belege deuten
stark darauf hin, daß eine
große
Anzahl an Thymozyten, die Rezeptoren für Autoantigene tragen, anfänglich im
Thymus vorhanden ist. Neuere Studien haben Belege ergeben, die darauf
hindeuten, daß ein
Vorgang mit der Bezeichnung programmierter Zelltod oder Apoptose
diese autoreaktiven Thymozyten im Thymus zerstört, während nicht autoreaktive Thymozyten
verschont werden. Apoptose spielt daher eine große Rolle bei der Formung und
dem Erhalt des Repertoires an T-Zellen und trägt zu der Festlegung der Eigentoleranz durch
aktives Eliminieren von Zellen, die autoreaktive TCRs exprimieren,
bei.
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Es
wurde kürzlich
entdeckt, daß T-Zellen
empfindlich gegenüber
apoptotischem Zelltod sind, der durch eine Vielzahl an Stimuli an
mehreren Punkten in ihrer Lebensspanne induziert wird (siehe z.B.
Lenardo 1991; Boehme und Lenardo 1993; Critchfield et al. 1994).
Es wird angenommen, daß positive
Selektionsfaktoren auch eine Rolle bei der Regulierung des Überlebens
spezifischer T-Zellklone spielen. Die Abnahme oder Erweiterung der
Anzahl an einzelnen T-Zellen eines bestimmten Klons in einem Organismus
durch diese und andere Mechanismen dient der Anpassung der Empfindlichkeit
des Immunsystems des Organismus an ein bestimmtes Antigen. In etlichen
Modellen zur Autoimmunerkrankung sowie bei bestimmten viralen Infektionen
ist es nun fest eingeführt,
daß Apoptose
in gereiften, peripheren, antigenspezifischen T-Lymphozyten sowie
in nicht gereiften Thymozyten induziert werden kann (nachdem sie
einem Antigen unter bestimmten definierten Bedingungen ausgesetzt
waren).
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Apoptose
tritt in vielen biologischen Systemen auf (siehe z.B. Kerr et al.
1991; Lockshin und Zakeri, 1991; Cohen et al. 1992; Duvall und Wyllie,
1986; Cotter et al. 1990). Eine Apoptose durchführende Zelle durchlebt ein
spezifisches Programm an Ereignissen – zelluläre und biochemische Vorgänge, die
von aktivem Metabolismus abhängen
und zu der Selbstzerstörung
der Zelle beitragen. In apoptotischen T-Zellen schrumpft der Kern,
das Chromatin kondensiert, das genetische Material (DNA) zersetzt
sich fortschreitend in kleine Fragmente (der Größe eines nukleosomalen Repeats),
es findet Verdichtung des Zellplasma statt, die Zellmembran formt
Blasen und die Zelle fällt
schließlich
zusammen (Kawabe und Ochi, 1991; Smith et al. 1989). Zellen können sich
nicht von Apoptose erholen, sie führt zu einem irreversiblen
Zelltod (Kawabe und Ochi, 1991; Smith et al. 1989).
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Neuere
Berichte haben eine Rolle der mit TNF verwandten Zytokine, bekannt
als der FAS-Ligand und sein Rezeptor, CD95 (der FAS-Rezeptor) bei
der Induktion von Apoptose in T-Zellen angedeutet (Crispe et al. 1994;
Nagata und Suda, 1995; Strasser, 1995; Dhein et al., 1995; Brunner
et al., 1995 und Ju et al., 1995).
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Autoantigene
von Beta-Zellen der Inseln
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Wie
oben besprochen wird angenommen, daß das Ausbrechen von Diabetes-Typ
1 durch T-Zellen vermittelt wird. Es wird angenommen, daß die Erkrankung
eine Folge unangemessener, für
bestimmte Proteine der Beta-Zellen der Inseln, die als Autoantigene
wirken, spezifische T-Zellantworten ist. Zusätzlich zu autoreaktiven T-Zellen
wurde auch von Autoantikörpern
gegen verschiedene Eigenantigene bei IDDM-Patienten berichtet. Die
Antigene, von denen berichtet wurde, von diesen Autoantikörpern gebunden
zu sein, umfassen viele solche, von denen berichtet wurde, daß sie von
autoreaktiven T-Zellen erkannt werden.
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Autoantigene,
die Autoimmunantworten in Typ 1-Patienten unterliegen, umfassen
das 64-65 kDa GAD (Glutamatdecarboxylase) und die 67 kDa GAD Autoantigene,
Insulin, Sialyglycolipid, ein 38 kDa Antigen aus den sekretorischen
Körnchen
von Beta-Zellen, ein mit Antikörpern
gegen Rinderalbumin kreuzreaktives Antigen, das als das p69-Protein
aus Beta-Zellen bekannt ist, PM-1 oder krankheitsveränderndes
Antigen, ein als Peripherin bekanntes cytoskeletales Protein aus
Beta-Zellen, Glukosetransporterproteine, einschließlich GLUT-2,
Hitzeschockprotein 65 (HSP 65), einschließlich des p277-Peptids, Carboxypeptidase
H, ein 52 kD großer
molekularer Imitator des Rubella-Virus-Antigens, ein membranassoziiertes
Protein aus Beta-Zellen von 150 kDa, ein Proteinantigen, das am
sekretorischen Pol der Ratteninsulinom-Zellinie RINm38 lokalisiert
ist, das das RIN-polare Antigen genannt wird, und (am Anfang) wenig
charakterisierte Antigene, die durch Immunsuchtests einer Insel-cDNA-Expressionsbibliothek
isoliert wurden, die ICA12 und ICA512 genannt werden. ICA512, jetzt
auch als IA-2 bekannt, ist immunologisch mit Phogrin verwandt, welches
ebenfalls den Autoimmunantworten in Typ 1-Patienten unterliegt (Hatfield
et al., 1997).
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Die
Bedeutung dieser verschiedenen Autoantigene in Bezug auf die Autoimmunpathogenese
sowie die Zeitsteuerung, mit welcher jedes eine Rolle während des Ablaufs
von Krankheitsausbruch und -entwicklung spielt, unterliegen einer
beträchtlichen
Unsicherheit und einem daraus folgenden Meinungsstreit in dem Gebiet.
Weitere Unsicherheit entstammt der Tatsache, daß jedes vermutete Autoantigen
zahlreiche Epitope umfaßt,
von denen einige vielleicht krankheitsbegünstigende Auswirkungen haben,
während
andere krankheitsunterdrückende
Auswirkungen haben können.
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Während es
nicht gewünscht
ist, an eine bestimmte Theorie des Ablaufs gebunden zu sein, wird
gemäß bestimmter
Gesichtspunkte der Erfindung angenommen, daß Insulin und GAD die wirksamsten
therapeutischen Auswirkungen auf die Entwicklung von Diabetes-Typ 1 von allen Autoantigenen
haben, die damit in Verbindung gebracht werden, eine Rolle in der
Pathogenese der Erkrankung zu spielen.
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Autoantikörper zu
64-65 kD GAD (nachfolgend GAD 65) werden normalerweise vor dem Ausbruch
des klinischen, insulinabhängigen
Diabetes mellitus Typ 1 und unter Verwandten von Patienten mit IDDM
ohne Diabetes sowie anderen Gefährdeten
nachgewiesen. Von diesen Autoantikörpern wurde angenommen, sie
seien die besten voraussagenden Antikörpermarker für bevorstehenden
Diabetes-Typ 1.
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GAD
65 und GAD 67 sind durch unterschiedliche Gene auf unterschiedlichen
Chromosomen codiert, wobei die Gene zu ungefähr 70% homolog sind. Humane
Inseln exprimieren nur GAD 65, obwohl beide Proteinformen im Gehirn
gefunden werden. Ein Hinweis auf lymphozytenspezifische Immunität gegen
GAD 65 wurde gezeigt und es wurde herausgefunden, daß diese
eng mit IDDM verbunden ist. Neuere Studien in dem NOD-Mausmodell von Diabetes
haben darauf hingedeutet, daß Antworten
von T-Zellen auf GAD 65 denen auf andere mutmaßliche Autoantigene vorausgehen
und daß eine
frühe Induktion
der Toleranz von T-Zellen gegenüber
GAD 65 den Ausbruch der Erkrankung verhindern kann.
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Kaufmann
et al. (1993) und Tisch et al. (1993) haben Daten vorgelegt, die
nahelegen, daß GAD-Antworten
die Bedeutendsten bei der Entwicklung der Erkrankung sind, da von
diesen berichtet wurde, als erstes während der Entwicklung von Diabetes-Typ
1 zu erscheinen, wobei Antworten auf andere Autoantigene von Beta-Zellen
nur sehr viel später
im Verlauf der Erkrankung erscheinen, wobei Insulinreaktivität unter
den Letzten ist, die erscheinen. Diese Erkenntnisse wurden so interpretiert,
daß sie
darauf hindeuten, daß GAD
65 das entscheidende Autoantigen bei Diabetes-Typ 1 ist und daß eine Modulation
der Autoimmunreaktivität
mit GAD das geeignetste Ziel für
das Herabsetzen der Erkrankungspathologie wäre. In Einklang mit diesem
theoretischen Verständnis
des Fortschreitens der Erkrankung würde das Modulieren der insulinreaktiven
T-Zellen das Schließen
des Scheunentors nachdem die Pferde gegangen sind sein, da die Anti-Insulinreaktionen
so spät beim
Fortschreiten der Erkrankung beobachtet werden, daß nicht
erwartet würde,
daß ihre
Modulation den Ausbruch oder die Schwere der Erkrankung beeinflussen
würde.
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Autoantikörper gegen
Insulin (IAA) können
bei ungefähr
50% der Patienten mit neuem Ausbruch nachgewiesen werden und stehen
stark im Zusammenhang mit Autoantikörpern gegen Inselzellen (ICA)
und dem HLA-DR4-Phänotyp.
Andere Studien legen nahe, daß Individuen
mit sowohl ICA als auch IAA ein sehr viel höheres Risiko haben, offenkundigen
Diabetes-Typ 1 zu entwickeln, als diejenigen, die einen der Marker
alleine haben. Antworten der T-Zellen auf Insulin als ein Autoantigen
wurden auch beschrieben. In einer Studie waren zelluläre Antworten
auf humanes Insulin bei fast 90% von ICA-positiven Verwandten ersten
Grades von IDDM-Patienten vorhanden. Auch können, wie unten in den Beispielen
beschrieben, insulinreaktive T-Zellen von diabetischen NOD-Mäusen Diabetes
auf nicht diabetische NOD-Mäuse übertragen.
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Antworten
von T-Zellen von Patienten mit Diabetes-Typ 1 oder von gefährdeten
Individuen auf undefinierte Inselzellpräparate haben nahegelegt, daß T-Zellen
auch auf andere Antigene der Inselzellen reagieren. Diese umschließen ein
38 kD Antigen aus den sekretorischen Körnchen der Beta-Zellen und
Serumalbumin. Zusätzlich
wurde Hitzeschockprotein (HSP) 65 als ein Autoantigen von T-Zellen
einbezogen, basierend auf der Erkenntnis, daß HSP spezifische T-Zellen
die Krankheit in NOD-Mäuse übertragen.
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Carboxypeptidase
H ist ein Molekül,
welches in sekretorischen Körnchen
der Inseln gefunden wird und mit der Herstellung von Peptidhormonen
und Neurotransmittern in Zusammenhang gebracht wird. Es wurde als
ein mögliches
Autoantigen von Inseln durch Durchsuchen von cDNA-Expressionsbibliotheken
mit Seren von IDDM- oder Prä-IDDM-Patienten identifiziert.
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Mehrere
andere mutmaßliche
Antigene von Inselzellen, wie ICA12 und ICA512 wurden auch durch Durchsuchen
von cDNA-Expressionsbibliotheken identifiziert.
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Intraantigene
und interantigene Verbreitung von Autoreaktivität ("Epitopausbreitung") sind verwandte Erscheinungen, die
mit Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht werden, bei welchen
zusätzliche
Epitope innerhalb eines Antigens oder zusätzliche Antigene innerhalb
eines Zielgewebes durch autoreaktive T-Zellen während des Fortschreitens der Erkrankung
als Ziel gesetzt werden. Eine solche Antigenausbreitung wurde während des
Ablaufs des inflammatorischen Autoimmunvorgangs bei den Mausmodellen
für experimentelle
allergische Encephalomyelitis (EAE) und insulinabhängigen Diabetes
beobachtet (Lehmann et al. 1992, McCarron et al. 1990, Kaufmann
et al. 1993, Tisch et al. 1993).
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Diese
Erkenntnisse der Antigen-/Epitopausbreitung legt nahe, daß um bei
einer therapeutischen Behandlung Autoantigenen von Beta-Zellen von
Inseln eine wirksame Immuntoleranz zur Verfügung zu stellen, die Behandlung
auf eine heterogene Population spezifischer autoreaktiver T-Zellen
zielen muß.
Damit die Antigenverabreichung bei der Prävention und Behandlung von
Diabetes-Typ 1 maximal wirksam ist, ist es daher wünschenswert,
daß eine
Vielzahl der immundominanten Epitope von sowohl Insulin als auch
GAD 65 den krankheitshervorbringenden, autoreaktiven T-Lymphozyten
vorgelegt wird.
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Vorhersage und Diagnose
von Typ 1-Erkrankung
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Wie
oben erörtert,
gibt es einen genetischen Gesichtspunkt zu dem Auftreten von Diabetes-Typ
1. Dementsprechend können
genetische Tests bestimmte Individuen mit erhöhtem Risiko für das Entwickeln
der Krankheit identifizieren (siehe z.B. Walston et al. 1995). Weiterhin
können
Individuen mit einer bekannten Familiengeschichte der Erkrankung
in Bezug auf frühe
vorklinische Anzeichen der Entwicklung der Erkrankung überwacht
werden, d.h. durch Überwachen
der Mengen an Autoantikörpern
und hierin erörterten
autoreaktiven T-Zellen.
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Autoantikörper
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Unter
den Autoantikörpern,
von denen bekannt ist, daß sie
mit Diabetes-Typ 1 in Zusammenhang gebracht werden, sind die gegen
GAD 65 gerichteten diejenigen, die am frühesten erscheinen und in der
größten Anzahl
an Patienten vorhanden sind. Insgesamt haben neuere Studien gezeigt,
daß über 80%
der Individuen mit präklinischem
Diabetes für
GAD spezifische Autoantikörper
haben. In diesem Fall ist ein Individuum mit präklinischer Erkrankung als ein
Verwandter ersten Grades eines Patienten mit Diabetes-Typ 1 mit
ICA definiert. Die durch ICA identifizierten Antigene sind schlecht
bestimmt, ergeben aber zusammen mit IAA und für GAD spezifischen Autoantikörpern einen
hohen Vorhersagewert für
den Ausbruch von Diabetes bei präklinischen
Individuen. Interessanterweise nimmt die Häufigkeit von für GAD spezifischen
Antikörpern
bei tatsächlicher
Erkrankung mit frühem Ausbruch
ab. Dies könnte
aufgrund der Tatsache sein, daß eine
GAD 65-Reaktivität
mit der Zerstörung
der Beta-Zellen abnimmt.
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Eine
Vorhersage von Diabetes-Typ 1 kann auch durch Überwachen des Blutzuckerspiegels
des Subjekts, bevorzugt in Verbindung mit der Verabreichung eines
Glukosetoleranztestes an das Subjekt, vereinfacht werden. Solche
Verfahren werden bevorzugt im Zusammenhang mit der Überwachung
der Titer an zirkulierenden IAA-, ICA- und GAD-Autoantikörpern des Subjekts ausgeführt.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung sind die chimären
Proteine der Erfindung Fusionsproteine, welche als antigene Substrate
für den
Nachweis von zirkulierenden Autoantikörpern, insbesondere IAA- und/oder GAD
65-Autoantikörpern,
in Diagnoseuntersuchungen wie Western Blot, ELISA, RIA, ELISPOT
und ähnlichen verwendet
werden können.
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T-Zellen
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Untersuchungen
für den
Nachweis von T-Zellen mit spezifischen Reaktivitäten sind im Stand der Technik
gut bekannt und umfassen die gemischte Lymphozytenreaktion (MLR)
und die ELISPOT-Untersuchung. ELISPOT-Untersuchungen werden z.B.
in Taguchi et al., J. Immunol. Meth. 1990, 128:65 und Sun et al.,
J. Immunol. 1991, 146:1490 beschrieben. Gemäß der Erfindung können die
chimären
Fusionsproteine der Erfindung als Substrate in solchen Untersuchungen
für die
Detektion und Quantifizierung von insulinreaktiven T-Zellen und/oder
GAD 65-reaktiven T-Zellen und/oder IA-2-reaktiven T-Zellen verwendet
werden.
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Derzeitige Verfahren zur
Vorbeugung und Behandlung von Diabetes-Typ 1
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Während Diabetes
seit Jahrhunderten untersucht wurde, sind nur wenige wirksame Behandlungen
für die
Typ 1-Erkrankung verfügbar.
Die unterste Ebene der Behandlung ist eine Diät mit geeigneter, auf dem idealen
Körpergewicht
basierender Kalorienaufnahme und einer festgelegten Verteilung zwischen
Protein, Glukose und Fett. Bei IDDM-Patienten ist jedoch der bedeutendste
Bestandteil der Therapie die Verabreichung von Insulin, mit dem
Ziel, die Glukosespiegel während
des gesamten Tages so nahe wie möglich
an dem normalen Bereich zu halten. Insulin ist in schnell, mittel
und lang wirkenden Formulierungen, die in Beginn, Spitze und Andauern
der Wirkung variieren und nach veränderlichen Verabreichungsschemen
in der Bestrebung der optimalen Regulation der Plasmaglukosespiegel
verwendet werden können.
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Intensive
Insulintherapie bezieht sich auf ein strenges Behandlungsschema
der Verabreichung hormonell wirksamen Insulins und Überwachung
der Blutzuckerspiegel. Dieses Behandlungsschema ist für eine so präzise wie
mögliche
Kontrolle der Blutglukose gestaltet. Die Ergebnisse der multizentrischen
Diabetes Kontroll- und Komplikationsstudie stellten fest, daß Komplikationen
bei Diabetes signifikant durch bessere Kontrolle der Blutglukosespiegel
herabgesetzt werden und haben so die Erwünschtheit einer intensiven
Insulintherapie gezeigt. Ein Problem dieses Ansatzes ist, daß intensive
Insulintherapie ein hohes Maß an
Patientenbewußtsein
und -folgsamkeit sowie ein hochbegabtes Betreuungsteam an Ärzten, Krankenschwestern
und Diätspezialisten
erfordert. Die Ziele der intensiven Insulintherapie sind daher selbst
mit motivierten und gebildeten Patienten extrem schwierig zu erreichen.
Ein weiteres Problem ist, daß ein
höherer
Anteil an Hypoglykämie bei
solchen streng behandelten Patienten gesehen wird als bei Patienten,
die übliche,
weniger strenge Insulinbehandlungen erhalten.
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Die
Diabetes Kontroll- und Komplikationsstudie hob nicht nur den Vorteil
des Haltens von normalen Blutglukosespiegeln für die gesamte metabolische
Gesundheit heraus, sondern auch ein grundsätzliches Problem, das mit der
Behandlung von Diabetes-Typ 1 in Zusammenhang gebracht wird, nämlich, daß offenkundige
Symptome der Krankheit nur dann manifestieren, wenn tatsächlich alle
Inselzellen des Patienten zerstört sind.
Orale Mittel für
Diabetes, wie die Sulfunylharnstoffe, wirken in erster Linie durch
Stimulieren der Freisetzung von Insulin aus Beta-Zellen mit Fehlfunktion
und sind daher für
die meisten Patienten mit Typ 1-Erkrankung nicht geeignet, d.h.
für jene
Patienten mit IDDM.
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Ein
hauptsächliches
Ziel bei der Behandlung von Diabetes war die Entwicklung von Therapien,
die in der Lage sind, den Autoimmunangriff auf die Beta-Zellen der
Inseln vor deren kompletter Zerstörung abzubrechen, wobei genug
endogene Funktionen zur Erhaltung einer metabolischen Kontrolle
bewahrt wird.
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Induktion
von Toleranz
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In
dem NOD-Mausmodell (nicht adipös
diabetisch) für
Diabetes wurde gezeigt, daß orale
Zuführung von
Insulin den Ausbruch der Erkrankung verzögerte und die Schwere reduzierte.
Der zur Erklärung
der oralen Toleranz vorgeschlagene Mechanismus ist, daß orale
Verabreichung von Antigen Populationen antigenspezifischer Th2 T-Zellen
induziert, die antiinflammatorische Zytokine, wie IL-4, IL-10 und
TGF-Beta, ausschütten. Diese
T-Zellen zirkulieren
und werden nur in der Anwesenheit ihres spezifischen Antigens für die Sekretion von
Zytokinen aktiviert. Daher würden
insulinspezifische Th2 T-Zellen nur im Pankreas aktiviert, wo sie
unterdrückende
Zytokine zur Modulation des Autoimmunvorgangs herstellen würden. Dieser
Mechanismus erfordert daher nicht, daß das orale Antigen tatsächlich ein
erkrankungsspezifisches Autoantigen darstellt, sondern vielmehr
nur, daß es
in einer gewebespezifischen Art exprimiert wird.
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Im
Gegensatz dazu erfordern Verfahren, die für die Erzeugung von Toleranz
von T-Zellen gestaltet sind
(z.B. durch Anergie oder Apoptose), die Identifizierung der eigentlichen,
für die
Erkrankung spezifischen Autoantigene, auf die der Autoimmunangriff
abzielt. Solche Antigene werden dann dem Patienten in geeigneter
verträglicher
Art verabreicht (welche auch nicht antigenspezifische verträgliche Auswirkungen
induzieren kann). Vorausgesetzt, daß Diabetes-Typ 1 in signifikantem
Maß eine
durch inselspezifische autoreaktive T-Zellen vermittelte Erkrankung
ist, sollte eine Therapie dieser Art im Prinzip durchführbar sein.
Daher hat die Induktion neonataler Toleranz für GAD 65, wie oben genannt,
den Ausbruch der Erkrankung in NOD-Mäusen verhindert. Zusätzlich hat
auch eine Injektion unbehandelter Inselextrakte in den Thymus, wo
die Tolerierung der sich entwickelnden T-Zellen stattfindet, sowohl
NOD-Mäuse
als auch prädiabetische
BB-Ratten vor der sich entwickelnden klinischen Erkrankung geschützt.
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Ein
Ansatz, der für
die Induktion von Insulintoleranz verfolgt wurde, umfaßt die parenterale
Verabreichung von Insulin in Kombination mit einem üblichen
Hilfsstoff (z.B. Freund Adjuvans). Typischerweise umfaßt dieser
Ansatz die Verabreichung von Insulindosen, die nicht groß genug
wären,
daß man
das Auslösen
eines Insulinschocks in dem Patienten erwarten würde. Bemerkenswerterweise sind
die Insulinreste der chimären Fusionsproteine
der vorliegenden Erfindung hormonell unwirksam und daher für eine Verwendung
gemäß der Verfahren
der PCT-Anmeldung WO 97/09061, eingereicht im Namen von Yi Wang,
geeignet.
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Apoptose
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Apoptose
ist eine Form des programmierten Zelltodes, die in vielen biologischen
Systemen auftritt (Kerr et al., 1991, Lockshin und Zakeri, 1991,
Cohen et al., 1992, Duvall und Wyllie, 1986, Cotter et al., 1990). Wie
oben erörtert,
durchläuft
eine apoptotische Zelle ein spezifisches Programm an Ereignissen,
die von aktivem Metabolismus abhängen
und zu ihrer eigenen Selbstzerstörung
beitragen. T-Zellen, die nicht Apoptose durchlaufen, sondern aktiviert
werden, werden ihre "Effektor"-Funktionen durch
Verursachung von Zytolyse oder durch Ausschüttung von Lymphokinen, die
Antworten von B-Zellen oder andere Immunauswirkungen verursachen,
ausführen
(Paul, 1989, Seiten 3-38). Diese "Effektor"-Funktionen
sind die Ursache von Gewebeschaden bei Autoimmun- und anderen Erkrankungen.
Ein leistungsfähiger
Ansatz zur Vermeidung der Erkrankung ist daher durch Apoptose nur
jene T-Zellen ständig
zu beseitigen, die mit autoimmunerkrankungsanregenden Antigenen
reaktiv sind, während
die Mehrzahl des Vorrats an T-Zellen intakt gelassen wird. Die Verwendung
von Autoantigenen zur Ausführung
dieses Ansatzes wird beschrieben in der PCT Patentveröffentlichung
Nr. 94/28926, eingereicht im Namen von Michael J. Lenardo und betitelt
mit Interleukin-2 Stimulated T Lymphocyte Cell Death for the Treatment
of Autoimmune Diseases, Allergic Disorders and Graft Rejection,
und PCT Patentveröffentlichung
Nr. 94/03202, eingereicht im Namen von Michael J. Lenardo, Stefen
A. Boehme und Jeffrey Critchfield und betitelt mit Interleukin-4
Stimulated T Lymphocyte Cell Death.
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Transplantation
-
Transplantation
von gesunden Bauchspeicheldrüsen,
Pankreasgewebe oder isolierten Pankreasinseln in Patienten, die
an Diabetes-Typ 1 leiden, stellt eine effektive Behandlungsmodalität zur Verfügung. Unglücklicherweise
wird die Andauer des therapeutischen Nutzens solcher Transplantate
derzeit durch die gleichen Autoimmunerscheinungen begrenzt, die
Typ 1-Erkrankungen in erster Linie verursachen. Dementsprechend
wird eine Behandlung eines diabetischen Patienten unter Verwendung
der chimären
Fusionsproteine nach der Erfindung gemäß den Verfahren nach der Erfindung,
wenn sie vor, gleichzeitig mit und/oder kurz nach solch einem Transplantat
ausgeführt
wird, die Langlebigkeit solcher Transplantate erhöhen und
dabei den therapeutischen Nutzen solcher Transplantationsmaßnahmen
verstärken.
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Die
beigefügten
Figuren, die in die Schrift mit aufgenommen sind und einen Teil
davon darstellen, erläutern
bestimmte Gesichtspunkte der Erfindung und dienen zusammen mit der
Beschreibung der Erklärung der
Prinzipien der Erfindung. Selbstverständlich versteht es sich, daß sowohl
die Figuren als auch die Beschreibung nur erklärend sind und nicht beschränkend für die Erfindung.
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WO
96/26218 offenbart Peptide, welche Pro-Insulin und ein Epitop aus
GAD 65 umfassen, und ihre mögliche
Verwendung bei der Behandlung von IDDM und Prä-IDDM.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ABBILDUNGEN
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1a zeigt
eine schematische Darstellung des Fusionsproteins IG1 (SEQ ID NO:
1). Die den umgekehrten Schrägstrichen
folgenden Zahlen in der Legende geben den GAD 65-Peptidteil an,
welchem die Region entspricht. Für
hGAD 65/473 - 5 --, gibt 5 -- 555 an.
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1b zeigt
eine schematische Darstellung des Fusionsproteins IG2 (SEQ ID NO:
2). Die den umgekehrten Schrägstrichen
folgenden Zahlen in der Legende geben den GAD 65-Peptidteil an,
welchem die Region entspricht. Für
hGAD 65/473 - 5 --, gibt 5 -- 555 an.
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1c zeigt
eine schematische Darstellung des Fusionsproteins IG3 (SEQ ID NO:
3). Die den umgekehrten Schrägstrichen
folgenden Zahlen in der Legende geben den GAD 65-Peptidteil an,
welchem die Region entspricht. Für
hGAD 65/473 - 5 --, gibt 5 -- 519 an.
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2 zeigt
die Ergebnisse von CYTOXAN-induzierten IDDM-Experimenten, bei welchen
NOD-Mäuse mit
Rinderserumalbumin (BSA als Kontrolle), Insulinkette B (ICB), humanem
GAD 65-Peptid 250-273 oder humanem GAD 65-Peptid 520-555 (ein Peptid
mit einer Sequenz, die den Aminosäureresten 139-173 von SEQ ID
NO: 2 entspricht) behandelt wurden.
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3 zeigt
die Ergebnisse von CYTOXAN-induzierten IDDM-Experimenten, bei welchen
NOD-Mäuse mit
Rinderserumalbumin (BSA als Kontrolle) oder den folgenden Mischungen
an B-Kette von Insulin (ICB) und humanen GAD 65-Peptiden behandelt
wurden: 1) jeweils 100 μg
von ICB und humanem GAD 65-Peptid 250-273, 2) jeweils 250 μg von ICB
und humanem GAD 65-Peptid 250-273, 3) jeweils 100 μg von ICB,
humanem GAD 65-Peptid
250-273 und humanem GAD 65-Peptid 520-555 und 4) jeweils 250 μg von ICB,
humanem GAD 65-Peptid 250-273 und humanem GAD 65-Peptid 520-555.
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4 zeigt
die Ergebnisse von CYTOXAN-induzierten IDDM-Experimenten, bei welchen
NOD-Mäuse mit
Rinderserumalbumin (BSA als Kontrolle) oder 100 μg des chimären Proteins IG1, 250 μg des chimären Proteins
IG1, 100 μg
des chimären
Proteins IG2 oder 250 μg
des chimären
Proteins IG2 behandelt wurden.
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5 zeigt
die Ergebnisse der passiven Immunisierung des IDDM-Experiments.
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6 zeigt
eine schematische Darstellung des Fusionsproteins IG4 (SEQ ID NO:
4). Die den umgekehrten Schrägstrichen
folgenden Zahlen in der Legende geben die Position der angezeigten
Peptidrestkomponente in nativem humanem GAD 65 an, von welchem die
Sequenz erhalten wurde, während
die aa-Zahlen in Klammern die entsprechenden Aminosäurenummern
in SEQ ID NO: 4 angeben und die Schreibweise GGG an dieser Stelle
den Einbau eines helixbrechenden Verbindungsstücks aus drei Glycinen angibt.
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7 zeigt
eine schematische Darstellung des Fusionsproteins IG5 (SEQ ID NO:
5). Die den umgekehrten Schrägstrichen
folgenden Zahlen in der Legende geben die Position der angezeigten
Peptidrestkomponente in nativem humanem GAD 65 an, von welchem seine
Sequenz erhalten wurde, während
die aa-Zahlen in Klammern die entsprechenden Aminosäurenummern
in SEQ ID NO: 5 angeben, und die Schreibweise GGG an dieser Stelle
den Einbau eines helixbrechenden Verbindungsstücks aus drei Glycinen angibt.
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8 zeigt
eine schematische Darstellung des Fusionsproteins IG6 (SEQ ID NO:
6). Die den umgekehrten Schrägstrichen
folgenden Zahlen in der Legende geben die Position der Peptidkomponente
des nativen humanen Proteins an, von welchem seine Sequenz erhalten
wurde, während
die aa-Zahlen in Klammern die entsprechenden Aminosäurenummern
in SEQ ID NO: 6 angeben, und die Schreibweise GGG an dieser Stelle
den Einbau eines helixbrechenden Verbindungsstücks aus drei Glycinen angibt.
Wie in der Legende angegeben, umfaßt IG6 zusätzlich zu den angegebenen Teilen
des humanen Insulins und humanen GAD 65 (hGAD 65) einen C-terminalen
Teil von humanem IA-2 (hIA2), der die Aminosäuren 771-979 des nativen humanen
Proteins (Aminosäuren
176-387 der SEQ ID NO: 6) überspannt,
mit einem helixbrechenden Verbindungsstück aus drei Glycinen, welches
am N-Terminus dieses Teils von IA-2 eingebaut ist.
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9 zeigt
eine schematische Darstellung des Fusionsproteins IG7 (SEQ ID NO:
7). Die den umgekehrten Schrägstrichen
folgenden Zahlen in der Legende geben die Position der Peptidkomponente
des nativen humanen Proteins an, von welchem seine Sequenz erhalten
wurde, während
die aa-Zahlen in Klammern die entsprechenden Aminosäurenummern
in SEQ ID NO: 7 angeben, und die Schreibweise GGG an dieser Stelle
den Einbau eines helixbrechenden Verbindungsstücks aus drei Glycinen angibt.
Wie in der Legende angegeben, umfaßt IG7 zusätzlich zu den angegebenen Teilen
des humanen Insulins und humanen GAD 65 (hGAD 65) einen C-terminalen
Teil von humanem IA-2 (hIA2), der die Aminosäuren 771-979 des nativen humanen
Proteins (Aminosäuren
228-439 der SEQ ID NO: 7) überspannt,
mit einem helixbrechenden Verbindungsstück aus drei Glycinen, welches
am N-Terminus dieses Teils von IA-2 eingebaut ist.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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In
Anbetracht des Vorhergehenden umfassen die Ziele dieser Erfindung
das Bereitstellen neuer chimärer
Fusionsproteine, die als einzelne molekulare Gebilde wirken, die
1) die Diagnose und prognostische Bewertung von Individuen erleichtern,
die in Verdacht stehen, eine Veranlagung für die Entwicklung von IDDM
zu haben, sowie solchen, die an IDDM und/oder Stiff-Man-Syndrom
leiden, und 2) verstärkte
günstige
Auswirkungen zur Verfügung
stellen, wenn sie Tieren verabreicht werden (einschließlich humanen
Patienten), die an autoimmunem (Typ 1) Diabetes leiden oder gefährdet sind,
diesen zu entwickeln. Zu diesen Zwecken stellt die Erfindung chimäre Fusionsproteine
zur Verfügung,
die Epitope von sowohl GAD (Glutamatdecarboxylase) 65 und Insulin
umfassen. Bevorzugt sind das GAD und das Insulin humanes GAD und
Insulin.
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Gemäß der Erfindung
stellt die Kombination von GAD 65- und Insulinpeptiden in einem
einzigen Fusionsprotein ein praktischeres diagnostisches Reagens
für die
Detektion und prognostische Bewertung von Diabetes oder Stiff-Man-Syndrom
zur Verfügung.
Eine Besprechung von Stiff-Man-Syndrom kann z.B. in US-Patent Nr.
5,691,448 gefunden werden.
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Gemäß der Erfindung
(und wie sie in den Beispielen unten dargelegt wird) stellt die
Kombination von GAD 65- und Insulinketten und/oder -peptiden in
einem einzigen chimären
Fusionsprotein weiter eine Verbindung zur Verfügung, die zur Bereitstellung
einer besseren immunmodulatorischen therapeutischen Behandlung als
die Kombination derselben Peptide und/oder Insulinketten als eigenständige einzelne
Peptidreste und Insulinketten liefern, verabreicht werden kann.
Ganz besonders stellen bevorzugte chimäre Fusionsproteine nach der
Erfindung, wenn sie in einem Versuch in einem Mausmodell von IDDM
getestet werden, einen größeren Rückgang bei
der Häufigkeit
des Ausbruchs von Diabetes zur Verfügung als eine Kontrollmischung,
die äquimolare
Mengen von jedem der verschiedenen eigenständigen einzelnen Peptidreste
und Insulinketten enthält,
die von dem chimären
Fusionsprotein umfaßt
werden, wobei keiner der einzelnen Peptidreste und Insulinketten
kovalent mit irgendeinem anderen der einzelnen Peptidreste und Insulinketten
in der Mischung verbunden ist, wobei die Untersuchung durch wiederholte
parenterale Verabreichung einer Anzahl von abgemessenen Dosen durchgeführt wird,
wobei jede Dosis aus einer vorbestimmten molaren Menge des chimären Fusionsproteins
in einem pharmazeutisch wirksamen Träger oder der Kontrollmischung
in dem pharmazeutisch wirksamen Träger besteht und die Verabreichung
in Abständen
von nicht weniger als zwölf
Stunden und nicht mehr als 72 Stunden zwischen den einzelnen Dosen
stattfindet.
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Der
Ausdruck "dieselben
Peptide und Insulinketten als eigenständige einzelne Peptidreste", wie hierin verwendet,
im Vergleich zu einem bestimmten chimären Fusionsprotein nach der
Erfindung verwendet, gibt eine Kombination von isolierten Peptiden
und Insulinketten an, die nicht kovalent aneinander gebunden sind (z.B.
durch Peptidbindungen), wobei ein Verbinden (durch Peptidbindungen)
der Peptide und Insulinketten in der richtigen Reihenfolge (z.B.
denselben relativen Positionen in den aminoterminalen bis carboxyterminalen Sequenzen,
wie sie in unfragmentiertem GAD 65 und unfragmentierten Insulinketten
gefunden werden) das bestimmte chimäre Fusionsprotein der Erfindung
erzeugen würde.
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Während es
nicht gewünscht
ist, durch irgendeine bestimmte Theorie des Ablaufs gebunden zu
sein, wird angenommen, daß komplexe
in vivo Antigen-Prozessierung und Präsentationseffekte für die unerwarteten
synergistischen Auswirkungen verantwortlich sind, die sich aus der
Kombination von GAD 65- und Insulinpeptiden und/oder -polypeptiden
in einem einzelnen chimären
Fusionsprotein ergeben.
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Die
chimären
Fusionsproteine der Erfindung kombinieren jeweils in einzelnen molekularen
Gebilden die entscheidenden (immundominanten) autoantigenen Epitope
von sowohl Insulin als auch GAD 65. Dadurch stellen sie aus einer
einzelnen Verbindung bestehende diagnostische und therapeutische
Verbindungen zur Verfügung.
Die chimären
Fusionsproteine der Erfindung stellen verbesserte günstige Auswirkungen
nach der Verabreichung an Tiere (einschließlich humanen Patienten) zur
Verfügung,
wenn sie mit der Verabreichung von Kombinationen der einzelnen Peptide,
die dieselben immundominanten Epitope darstellen, wie sie in den chimären Fusionsproteinen
umfaßt
sind, verglichen werden.
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Die
chimären
Fusionsproteine der Erfindung umfassen die B-Kette von Insulin (z.B.
Aminosäuren
1-31 von humanem Insulin) und bevorzugt umfassen sie weiter die
C-Kette von Insulin (das "C-Fragment", z.B. Aminosäuren 32-38
von humanem Insulin). Aminosäuresequenzen
der Insulinketten sind bekannt. Siehe z.B. US-Patent Nr. 4,431,740,
für die
Beschreibung der Insulinketten und den Gehalt der Insulinsequenzen
darin. Siehe auch US-Patent Nr. 5,008,241.
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Die
chimären
Fusionsproteine der Erfindung umfassen weiterhin wenigstens ein
GAD-Peptid.
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Gemäß der Erfindung
ist das wenigstens eine GAD-Peptid ein GAD 65-Peptid, welches aus
der Gruppe ausgewählt
ist, bestehend aus humanen GAD 65-Peptiden 115-127 (ein Peptid,
das den Aminosäureresten 39-50
von SEQ ID NO: 2 entspricht), 247-286 (ein Peptid, das den Aminosäureresten
51-90 von SEQ ID NO: 2 entspricht) und 473-519 (ein Peptid, das
den Aminosäureresten
92-144 von SEQ ID NO: 2 entspricht). Vollständige Aminosäuresequenzen
von GAD 65-Polypeptiden sind bekannt. Siehe z.B. US-Patent Nr. 5,691,448.
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Ergebnisse
der unten beschriebenen Studien legen nahe, daß die Aufnahme von humanem
GAD 65-Peptid 520-555 (ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz,
die den Aminosäureresten
139-173 von SEQ ID NO: 2 entspricht) eine schädliche Wirkung auf das immunmodulatorische
Ergebnis der Verabreichung von Insulin- und GAD-Proteinen oder -peptiden
hat. Dementsprechend werden chimäre
Fusionsproteine, die humanes GAD 65-Peptid 520-555 enthalten, obwohl sie
innerhalb des Bereichs der Erfindung liegen, mißbilligt. Die chimären Fusionsproteine
der Erfindung umfassen keine Peptidsequenzen, die den humanen GAD
65-Peptiden entsprechen (insbesondere jenen aminoterminalen GAD
65-Peptiden), die
in US-Patent 5,691,448 als die GAD-Löslichkeit verhindernd identifiziert
wurden, und enthalten keine Peptidbereiche von GAD 65, die mit der Pathogenese
von Stiff-Man-Syndrom
in Verbindung gebracht werden. Daher umfassen die chimären Fusionsproteine
der Erfindung gemäß den Lehren
von Butler et al., 1993, in Bezug auf dominante, durch Autoantikörper in
Stiff-Man-Syndrom erkannte Epitope von GAD keine Peptidbereiche,
die die Aminosäuren
1-95 von GAD 65 umfassen, zusätzlich
umfassen sie nicht Peptidbereiche, die entweder eine oder beide
der Aminosäuren 465-484
oder 571-585 von GAD 65 umfassen.
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Bevorzugt
werden die GAD-Peptide nebeneinander (d.h. ohne mehr als ungefähr drei
dazwischenliegende Aminosäuren
zwischen ihnen), in derselben Reihenfolge angeordnet, wie sie in
GAD 65 gefunden werden, und die Insulinketten sind nebeneinander
angeordnet in derselben Reihenfolge, wie sie in Präproinsulin gefunden
werden. Eine Anordnung, bei welcher die Insulinketten aminoterminal
gegebenüber
den GAD-Peptiden sind, ist auch bevorzugt in bestimmten Ausführungsformen
der Erfindung.
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In
bestimmten bevorzugten Ausführungsformen
ist wenigstens einer (bevorzugt jeder) der Cysteinreste in den Aminosäuresequenzen
der verschiedenen Antigene und antigenen Peptide, die zur Bildung
der chimären
Fusionsproteine der Erfindung kombiniert werden, durch eine ungeladene
Aminosäure
ersetzt (d.h. eine Aminosäure,
die bei einem pH von zwischen 6 und 7 ungeladen ist), die ein Molekulargewicht
von weniger als ungefähr
150 hat. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird keiner der
Cysteinreste ersetzt, d.h. es werden keine Ersetzungen für irgendeinen
der Cysteinreste durchgeführt,
die in irgendeinem der verschiedenen Antigene oder Antigenpeptide
vorhanden sind, die zur Bildung des chimären Fusionsproteins kombiniert werden.
Werden Cysteinreste ersetzt, ist die ungeladene Aminosäure bevorzugt
eine Standardaminosäure. Bevorzugt
ist die Standardaminosäure
Alanin oder Serin. Bevorzugt ist das Ersetzen von Cystein durch
eine andere neutrale Aminosäure
ein epitopneutrales Ersetzen, d.h. es führt nicht zu einer Epitopumwandlung
in irgendeiner der bekannten immundominanten Epitope des chimären Fusionsproteins,
insbesondere solcher von GAD oder Insulin.
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Eine
ausführliche
Besprechung der epitopneutralen Ersetzungen und Epitopumwandlung
kann in WO 9634622 (US-Anmeldung Seriennr. 08/431,644, eingereicht
am 2. Mai 1995 im Namen von Steven H. Nye et al.) gefunden werden,
z.B. auf Seiten 34-36 der Schrift der eingereichten Anmeldung. Der
Fachmann wird einfach die Anwendung der darin enthaltenen Lehren
für die
chimären
Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung nachvollziehen.
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Es
ist ein weiteres Ziel der Erfindung, immunmodulatorische Verfahren
sowohl zur Vorbeugung als auch zur Behandlung von Diabetes mellitus
Typ 1 und die Verbesserung der Autoimmundefekte, die diese Krankheit
stützen,
zur Verfügung
zu stellen. Dementsprechend ist es ein weiteres Ziel der Erfindung,
die Verwendung der chimären
Fusionsproteine der Erfindung bei der Herstellung von immunmodulatorischen
Medikamenten vorzusehen.
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Um
diese und andere Ziele zu erreichen, stellt die Erfindung Verfahren
zur Behandlung eines Patienten, der eine solche Behandlung benötigt, zur
Verfügung,
z.B. ein Patient, der aus der Gruppe von Patienten ausgewählt ist,
bestehend aus von der Entwicklung von Diabetes-Typ 1 gefährdeten
Patienten und an Diabetes-Typ 1 leidenden Patienten, um den Ausbruch
zu verzögern
oder die Symptome von Diabetes in dem Patienten zu verringern und/oder
die autoimmune Zerstörung
der Beta-Zellen des Pankreas in den behandelten Patienten zu verbessern.
Eine solche Behandlung ist insbesondere vorteilhaft und wird bevorzugt
während
der "Honeymoon-Periode", früh bei der
Erkrankungsfortschreitung, durchgeführt, bevor alle Beta-Zellen
des Patienten durch die Erkrankung zerstört wurden, oder später in der
Erkrankungsfortschreitung, wenn ein Patient ein Kandidat für die Transplantation
von Inselzellen oder solche Zellen enthaltendem Gewebe ist.
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Diese
Verfahren umfassen die Verabreichung von wenigstens einem Polypeptid
gemäß der Erfindung an
den Patienten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine solche
Verabreichung basierend auf einem therapeutischen Zeitplan zur Modulation
von T-Zellen durchgeführt,
d.h. ein Zeitplan, der zur Induktion von Apoptose, Anergie oder
anderen Modulationen der Autoimmunaktivität von mit wenigstens einem
Epitop des wenigstens einen Polypeptids reaktiven T-Zellen gestaltet
ist. Einzelheiten eines solchen therapeutischen Zeitplans zur Modulation
von T-Zellen werden unten erörtert.
Andere bevorzugte Verfahren der Behandlung nach der Erfindung umfassen
Verabreichung von wenigstens einem Polypeptid der Erfindung an den
Patienten über orale,
intravenöse
oder bevorzugt subkutane Wege oder durch parenterale Verabreichung,
mit oder bevorzugt ohne ein Hilfsmittel, wie Freund unvollständiges Adjuvans,
Freund vollständiges
Adjuvans, Alaun-Adjuvans oder
andere immunogene, jetzt bekannte oder anschließend entwickelte Hilfsmittel.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Chimäre Fusionsproteine
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Alle
in biologischen Systemen synthetisierten Polypeptide werden ursprünglich mit
einem N-terminalen Methioninrest hergestellt. Die äußersten
N-terminalen und C-terminalen Aminosäurereste werden als nicht wesentlich
für die
funktionelle Verwendung der Polypeptide der Erfindung angesehen,
welche, obwohl dies nicht besonders bevorzugt ist, ohne solche Reste
hergestellt werden können.
Zum Beispiel können
die Polypeptide ohne N-terminale
Methionine chemisch synthetisiert werden. Chimäre Proteine nach der Erfindung umfassen
daher IG1 (welches Aminosäurereste
von ungefähr
bei Rest 2 anfangend bis ungefähr
bei Rest 153 endend von SEQ ID NO: 1 umfaßt) und IG2 (welches Aminosäurereste
von ungefähr
bei Rest 2 anfangend bis ungefähr
bei Rest 173 endend von SEQ ID NO: 2 umfaßt). Bevorzugt umfaßt IG1 Aminosäurereste
1-154 von SEQ ID NO: 1 und IG2 umfaßt Aminosäurereste 1-174 von SEQ ID NO:
2.
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In
bestimmten bevorzugten Ausführungsformen
können
diese chimären
Proteine weiterhin eine Histidinmarkierung beinhalten (d.h. ein
Stück von
wenigstens fünf
und bevorzugt sechs benachbarten Histidinresten, welches die Aufreinigung
des chimären Fusionsproteins
durch Metallchelatbildungschromatographie vereinfacht). Bevorzugt
befindet sich die Histidinmarkierung an dem äußersten C-Ende des chimären Fusionsproteins.
Histidinmarkierungen werden in größerem Detail in WO 9634622
(US-Patentanmeldungen Seriennummern 08/431,644 und 08/482,144) erörtert.
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Dementsprechend
umfaßt
IG1 in bestimmten dieser bevorzugten Ausführungsformen Aminosäurereste
1-160 von SEQ ID NO: 1 und hat ein vorausberechnetes Molekulargewicht
von etwa 18,8 kDa, IG2 umfaßt Aminosäurereste
1-180 von SEQ ID NO: 2 und hat ein vorausberechnetes Molekulargewicht
von etwa 21,2 kDa.
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Sekundärstrukturüberlegungen
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Beim
Entwerfen von IG4 (SEQ ID NO: 4), IG5 (SEQ ID NO: 5) und IG6 (SEQ
ID NO: 6) wurde besonders auf die vorhergesagten Sekundärstrukturen
der Polypeptide der Erfindung geachtet. IG4 wurde anfänglich durch
hypothetisches Verbinden von interessierenden Peptidepitopen zur
Erzeugung einer einzigen hypothetischen Sequenz IG4NHB (SEQ ID NO:
8) entworfen.
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Eine
Sekundärstrukturvorhersage
von IG4NHB (SEQ ID NO: 8) gemäß Chou und
Fasman, 1978, Chou 1990 und Garnier et al., 1978 wurden unter Verwendung
der LASERGENE-Sequenzanalysesoftware (DNASTAR, Madison WI) durchgeführt. Dieser
Algorithmus berechnet eine Sekundärstruktur von Proteinen aus
ihren Aminosäuresequenzen
voraus. Andere Sequenzanalysesoftware kann auch für diesen
Zweck verwendet werden, einschließlich anderer im Handel erhältlicher
Software, wie GCG oder MACVECTOR.
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Die
gesamte Sequenz von Aminosäure
77 (Phe 77) bis Aminosäure
134 (Thr 134) von IG4NHB (SEQ ID NO: 8) wurde als helixbildende
Eigenschaften aufweisend vorausberechnet. Die Neigung zur tatsächlichen Bildung
langer Helices nimmt sehr stark ab für Sequenzen mit mehr als 20
Aminosäuren,
wobei die längsten ununterbrochenen
Helices üblicherweise
nicht mehr als 26 Aminosäuren
enthalten. Von der 57 Aminosäuren langen
helixbildenden Sequenz von Aminosäure 77 bis 134 von IG4NHB (SEQ
ID NO: 8) würde
daher erwartet, an unvorhersehbaren, wenn nicht zufälligen Stellen
unter Bildung einer Vielzahl von unterschiedlichen Strukturen zu
brechen. Solche Strukturen sind bei den chimären Fusionsproteinen unerwünscht, da
sie voraussichtlich zu unkontrollierbarer Aggregation neigen würden und
es würde
erwartet, daß sie
in Bezug auf die nativen Sekundärstrukturen
der Epitope in den isolierten Peptiden, welche von den chimären Fusionsproteinen umfaßt sind,
und in den nativen Proteinen, von welchen die Peptide stammen (z.B.
Insulin, GAD 65 oder IA-2), deren natives Sekundärstrukturen für die in
den chimären
Fusionsproteinen enthaltenen Epitope bevorzugt sind, abweichen.
Daher sind in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen Helixbrecher (siehe
nächster
Abschnitt) zwischen den Epitopen eingeführt, um 1) die Bildung von
sehr langen Helices zu unterbinden und 2) die Epitope vorausberechenbar
in bestimmte strukturelle Gebilde mit eindeutigen Sekundärstrukturen
aufzuteilen.
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Helixbrecher
sind Aminosäuren
oder Gruppen von hintereinander angeordneten Aminosäuren, die
zur Unterbindung der Fortführung
von helikalen Sekundärstrukturen
in entstehenden Polypeptidketten wirken. Gly und Pro sind als starke
Helixbrecher bekannt, Asn und Tyr sind schwache Helixbrecher. Das
Einfügen
von einer dieser Aminosäuren
oder Kombinationen davon in ein Polypeptid wird darauf abzielen,
eine Helix einer entstehenden Polypeptidsekundärstruktur an der Stelle der
Einfügung
zu beenden. Um die Beendigung der Helix und die Trennung der gewünschten
Epitope sicherzustellen, ist ein Helixbrecher, der wenigstens zwei
Aminosäuren
lang ist (wobei jede der Aminosäuren
gleich oder unterschiedlich von der anderen ist und ausgewählt ist
aus der Gruppe, bestehend aus Gly, Pro, Asn und Tyr), bevorzugt,
bevorzugter ist ein solcher Helixbrecher wenigstens drei Aminosäuren lang.
Am meisten bevorzugt ist der Helixbrecher genau drei Aminosäuren lang. Besonders
bevorzugte Helixbrecher sind Pro-Pro-Pro (SEQ ID NO: 9) und Gly-Gly-Gly
(SEQ ID NO: 10), wobei der letztere der am meisten bevorzugte von
diesen ist.
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Dosierung
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden die chimären
Proteine, wenn sie als therapeutisches Mittel verwendet werden,
an Patienten, die einer solchen Behandlung bedürfen, in Mengen verabreicht,
die von ungefähr
6,9 pM/kg/Patient bis ungefähr
8,6 μM/kg/Patient
reichen. Bevorzugt reichen die Mengen von ungefähr 34,5 pM/kg/Patient bis ungefähr 5,2 μM/kg/Patient.
Bevorzugter reichen die Mengen von ungefähr 170 pM/kg/Patient bis ungefähr 3,5 μM/kg/Patient.
Am meisten bevorzugt reichen die Mengen von etwa 0,5 μM/kg/Patient
bis etwa 3,5 μM/kg/Patient.
-
In
einigen ihrer Gesichtspunkte stellt die vorliegende Erfindung auch
die wiederholte Verabreichung von Dosen, die geringere Mengen der
chimären
Fusionsproteine der Erfindung enthalten, an einen eine solche Behandlung
benötigenden
Patienten zur Verfügung.
Obwohl es weniger bevorzugt ist, können Dosen, die Mengen von
weniger als ungefähr
6,9 pM/kg/Patient enthalten und so wenig wie ungefähr 1 pM/kg/Patient
enthalten, bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung verwendet
werden.
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Bevorzugt
werden die chimären
Proteine ohne die begleitende Verabreichung eines Hilfsmittels verabreicht,
jedoch wird eine anfängliche
Verabreichung an Versuchstiere bei der Verwendung bei der Durchführung von
Versuchen zu T-Zellen (z.B. in transgenen Mäusen, wie in Wong et al., 1998,
beschrieben) bevorzugt mit Hilfsmittel durchgeführt.
-
Verabreichung
nach einem therapeutischen Zeitplan zur Modulation von T-Zellen
-
Gemäß der Erfindung
umfaßt
ein therapeutischer Zeitplan zur Modulation von T-Zellen die Verabreichung
von die chimären
Proteine der Erfindung enthaltenden Dosen, bevorzugt in einem pharmazeutisch
wirksamen Träger,
wiederholt an den Patienten, wenigstens zweimal mit einem Abstand
von wenigstens sechs und bevorzugt wenigstens zwölf Stunden, mit einem Abstand
von weniger als sieben Tagen, bevorzugt nicht mehr als 72 Stunden,
bevorzugter nicht mehr als 48 Stunden und am meisten bevorzugt nicht
mehr als 24 Stunden zwischen den Dosen.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden die chimären
Fusionsproteine bevorzugt parenteral ohne die begleitende Verabreichung
eines Hilfsmittels verabreicht. Die Verabreichung mittels eines
parenteralen Weges wird üblicherweise über eine
Injektion, wie eine intravaskuläre
Injektion (z.B. intravenöse
Infusion), subkutane Injektion oder intramuskuläre Injektion durchgeführt. Andere
nicht orale Wege der Verabreichung, z.B. über die Schleimhaut, Inhalation,
transdermal mit Ultraschall und ähnliches
können
sofern sie gewünscht
und realisierbar sind für
das bestimmte zu verabreichende Polypeptid verwendet werden.
-
Auch
wenn es weniger bevorzugt ist, können
chimäre
Fusionsproteine nach der Erfindung auch oral verabreicht werden,
wobei die Dosen für
die orale Verabreichung typischerweise ein oder zwei Größenordnungen
größer sein
werden, als die oben unter der Zwischenunterschrift "Dosierung" erörterten.
-
Für die Injektion
und andere Verabreichungswege geeignete Formulierungen sind im Stand
der Technik gut bekannt und können
z.B. in Remington's
Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia,
PA, 17. Ausgabe (1985) gefunden werden. Bevorzugte Formulierungen
für die
parenterale Verabreichung der Proteine der Erfindung sind solche,
die für
Insulin in der USP 23/NF18 (1995) beschrieben werden.
-
Parenterale
Formulierungen müssen
steril und nicht fiebererzeugend sein und werden im allgemeinen einen
pharmazeutisch wirksamen Träger,
wie Kochsalzlösung,
gepufferte (z.B. phosphatgepufferte) Kochsalzlösung, Hank Lösung, Ringer
Lösung,
Glukose/Kochsalzlösung,
Glukoselösungen
und ähnliches
umfassen. Formulierungen können
sofern benötigt
auch pharmazeutisch geeignete Hilfssubstanzen enthalten, wie tonusanpassende
Mittel, benetzende Mittel, bakterizide Mittel, Konservierungsmittel,
Stabilisierungsmittel und ähnliches.
-
Weitere
Erörterungen
zur Dosierung und Verabreichung von Polypeptiden unter Verwendung
von therapeutischen Zeitplänen
zur Modulation von T-Zellen können
in WO 9634622 (US-Patentanmeldungen Seriennummern 08/431,644 und
08/482,114) (oben erörtert)
und WO 9709061 (US-Patentanmeldungen Seriennummer 08/565,769, eingereicht
am 1. Dezember 1995 in Namen von Yi Wang) zur vollständigeren
Beschreibung des Standes der Technik, zu welchem die vorliegende
Erfindung gehört,
gefunden werden.
-
Ohne
sie in irgendeiner Art beschränken
zu wollen, wird die vorliegende Erfindung vollständiger durch die folgenden
Beispiele beschrieben werden.
-
Experimentelle
Verfahren
-
Nicht
fettleibige diabetische (NOD-) Mäuse
sind eine Mauslinie, die zur Entwicklung von Diabetes neigt und
ein geeignetes Modellsystem für
die Untersuchung von Diabetes mellitus darstellt. Diese Mäuse, mit
der Bezeichnung NOD/MrkTacfBR wurden von Taconic Farms (Germantown,
NY) erworben. NOD SCID-Mäuse mit
der Bezeichnung NOD/SCID sind von den Jackson Laborstories, Bar
Harbor, ME, erhältlich.
Die Häufigkeit von
Diabetes bei einem Alter von 200 Tagen bei diesen Mäusen ist
80% in weiblichen und 50% in männlichen. Im
Alter von 110 Tagen wurden weniger als 15% der männlichen NOD-Mäuse diabetisch.
-
CYTOXAN-induzierte Experimente:
-
Eine
Behandlung mit CYTOXAN (Cyclophosphamid) kann die Häufigkeit
von Diabetes in nicht diabetischen NOD-Mäusen erhöhen und den Ausbruch beschleunigen.
Zufällig
ausgewählten,
nicht diabetischen, männlichen
NOD-Mäusen
mit einem Alter von 100 bis 110 Tagen wurde an Tag 0 Cyclophosphamid
(250 mg/kg) injiziert (ip). Alle Mäuse wurden 2-3 mal pro Woche
für einen
Zeitraum von 21 Tagen nach Injektion von Cyclophosphamid einer Uringlukosemessung
unterzogen. Der Ausbruch von Diabetes wurde als der erste Zeitpunkt
festgehalten, an dem an zwei aufeinanderfolgenden Tagen positive
Uringlukoseergebnisse erhalten wurden. Blutglukose wurde ebenfalls
zur Bestätigung
der Uringlukoseergebnisse gemessen. (ExacTech MediSense Inc., Cambridge,
MA). Bei allen Mäusen,
bei denen positive Uringlukose festgestellt wurde, waren die Blutglukosespiegel
höher als
150 mg/dl. Am 21. Tag wurden diese Mäuse getötet und histologisch untersucht.
-
Experimente in dem NOD-SCID-Modell
zur passiven Immunisierung:
-
Einzellige
Milzzellen wurden von diabetischen NOD-Mäusen mit kürzlichem Erkrankungsausbruch (nicht
mehr als drei Wochen diabetisch) geerntet und ungefähr 35 x
106 dieser Milzzellen in 0,2 ml PBS wurden intravenös in 6-8
Wochen alte NOD/SCID-Mäuse
injiziert. Ein Ausbruch von Diabetes wurde zweimal wöchentlich
durch Uringlukoseuntersuchung überwacht
und durch Blutglukoseuntersuchung am 28. Tag in Bezug auf den Zeitpunkt
der Milzzellenübertragung
bestätigt.
Am 28. Tag wurden diese Mäuse
getötet
und histologisch untersucht.
-
Reagenzien:
-
CYTOXAN
(Cyclophosphamid, Mead Johnson oncology products) wurde in destilliertem
Wasser (25 mg/ml) gelöst.
Die oxidierte B-Kette von Rinderinsulin wurde von Sigma bezogen
(Katalognummer 1-6383). Sowohl die B-Kette von Insulin als auch
das BSA-Kontrollprotein
(Miles Inc., #81-001) wurden in PBS/1 M HCl, pH 2 gelöst, vor
einer Dialyse gegen PBS, pH 7,2, sterilen Filtration und Lagerung
von gefrorenen Teilproben.
-
BEISPIELE
-
Gene zur
Expression von chimären
Proteinen nach der Erfindung
-
IG1.
-
Ein
künstliches,
das chimäre
Protein IG1 codierendes, chimäres
Gen (SEQ ID NO: 1) wurde durch zwei Durchgänge überlappender PCR konstruiert
(Ho et al., 1989). Jede Unterdomäne
des Gens wurde in einer PCR-Standardreaktion mit 100 μl unter Verwendung
von 10 pmol von jedem der geeigneten Oligonukleotidprimer, wie unten
beschrieben, synthetisiert. Der 5'-Genabschnitt wurde unter Verwendung
der überlappenden
Primer vervielfältigt:
prIG1 (SEQ ID NO: 11) und prIG2 (SEQ ID NO: 12). Der 3'-Genabschnitt wurde
unter Verwendung der überlappenden
Primer prIG3 (SEQ ID NO: 13) und prIG4 (SEQ ID NO: 14) vervielfältigt. Das Oligonukleotid
prIG1 (SEQ ID NO: 11) wurde zur Ermöglichung der Schaffung einer
einzelnen NdeI-Restriktionsstelle am 5'-Ende entworfen. Der Primer prIG4 (SEQ
ID NO: 14) umfaßte
eine einzelne BamHI-Stelle, ein Stopcodon (TAA) und 18 eine Histidinmarkierungssequenz
codierende Nukleotide zur Aufreinigung des rekombinanten chimären Proteins
durch Metallaffinitätschromatographie.
Die zwei Unterdomänen
wurden unter Verwendung der angrenzenden Oligonukleotide prIG5 (SEQ
ID NO: 15) und prIG6 (SEQ ID NO: 16) in einer zweiten PCR-Reaktion
unter Erhalt eines 492 bp Genprodukts kombiniert. Das PCR-Produkt
wurde in einen Expressionsplasmidvektor pCR2.1, wie von dem Hersteller
beschrieben, kloniert (Invitrogen, San Diego, CA). Kanamycinresistente
DH10B-Transformanden wurden selektiert und die richtigen Klone und
Orientierungen durch Restriktion und Sequenzanalyse bestimmt. Restriktionsfragmente
von zwei Klonen (#6 und #18) wurden zum Entfernen ungewünschter
Mutationen kombiniert. Im Anschluß an eine Nukleotidsequenzanalyse
wurde ein unabhängiges
Plasmid pCR2.1-IG1 mit NdeI und BamHI verdaut und das 492 bp Fragment
in passende Stellen des MP4-Expressionsplasmids
pET22b-MP4 (Elliott et al., 1996) unter Erhalt von Plasmid pIG1
eingefügt.
Das Insert aus pCR2.1-IG1 wurde auch in einen Plasmidvektor pBLUSCRIPT®SK+
(STRATAGENE CLONING SYSTEMS, La Jolla, CA) unter Erhalt von Plasmid
pSK+IG1 unterkloniert. Das künstliche
Gen IG1 (SEQ ID NO: 17) codiert ein chimäres Fusionsprotein mit einem
vorausberechneten Gewicht von ungefähr 18,8 kDa.
-
IG2.
-
Ein
künstliches,
das chimäre
Protein IG2 (SEQ ID NO: 2) codierendes, chimäres Gen wurde durch PCR-Vervielfältigung
eines inneren Genfragmentes IG1 unter Verwendung von pIG1 als Matrize
zusammen mit dem Vorwärtsprimer
prIG7 (5'-AGATCTGATG
AACATTCTGC TGCAGTATGT TGTTAAAAGC TTCGATAACA TGTATGCCAT GATG-3' – SEQ ID NO: 18; die BglII-Stelle
ist unterstrichen) in Kombination mit dem Rückwärts-Oligonukleotidprimer prIG8 (5'-TGTACAGATA TTCCGCCAGT
TCCAGACATT TTTTCAGAGA AAAATGGCTA TGTTCAGAGG TAAAGGCAAT CAGACGCG-3' – SEQ ID NO: 19; die BsrGI-Stelle
ist unterstrichen) erstellt. Das BglII-BsrGI PCR-Fragment mit 197
bp wurde in pCR2.1 unterkloniert. Eine Sequenzanalyse zeigte eine
C>G-Substitution an
Position 183 in dem codierenden Strang des BglII-BsrGI PCR-Fragments
mit 197 bp bei allen analysierten Subklonen und das Plasmid wurde
pCR2.1-IG7/8C183G genannt. Eine anschließende Analyse zeigte einen
Fehler bei der ursprünglichen
prIG8-Primersequenz (SEQ ID NO: 19). Ein Reparaturprimer prIG12
(SEQ ID NO: 20) wurde zur Korrektur der C>G-Substitution
in pCR2.1-IG7/8C183G synthetisiert. Der interne BglII-BsrGI DNA-Abschnitt
mit 197 bp wurde durch PCR korrigiert, unter Verwendung von pCR2.1-IG7/8C183G
als Matrize, neben den Primern prIG7 (SEQ ID NO: 18) und prIG12
(SEQ ID NO: 20). Die PCR-Fragmente wurden in pCR2.1 unterkloniert,
ihre Sequenz wurde unter Verwendung der normalen Didesoxy-Sequenzierung
zur Bestätigung,
daß die
gewünschte
Sequenz erhalten wurde, bestimmt und ein einzelner mit pCR2.1-IG7/12
bezeichneter Klon wurde isoliert und vervielfältigt.
-
Das
BglII-BsrGI-Restriktionsfragment mit 137 bp in pSK+IG1 wurde durch
das BglII-BsrGI
Fragment mit 197 bp aus pCR2.1-1G7/12 zur Erzeugung von pSK+/IG7/12
ausgetauscht. Das NdeI-BamHI-Fragment mit 552 bp aus pSK+/IG7/12
wurde in die passenden Stellen von pIG1 zur Erzeugung von Plasmid
pIG2 unterkloniert. Das künstliche
Gen IG2 (SEQ ID NO: 21) codiert ein chimäres Fusionsprotein mit einem
vorausberechneten Gewicht von ungefähr 21,2 kDa.
-
IG3.
-
Ein
künstliches,
das chimäre
Protein IG3 (SEQ ID NO: 3) codierendes, chimäres Gen wurde durch Entfernen
eines NdeI-BamHI-Restriktionsfragmentes mit 552 bp aus dem Plasmid
pET22b-IG2 und Ersetzen durch ein mit NdeI-BamHI verdautes PCR-Produkt
mit 444 Basenpaaren konstruiert. Dieses PCR-Produkt mit 444 Basenpaaren
wurde unter Verwendung der Primer prIG5 (SEQ ID NO: 15) und prIG13
(SEQ ID NO: 22) mit dem künstlichen
Gen IG2 als Matrize hergestellt. Das künstliche Gen IG3 (SEQ ID NO:
23) codiert ein chimäres
Fusionsprotein mit einem vorausberechneten Gewicht von ungefähr 17,1
kDa.
-
IG4.
-
Eine
das chimäre
Protein IG4 (SEQ ID NO: 4) codierende Gensequenz ist unten als SEQ
ID NO: 24 dargelegt und codiert ein chimäres Fusionsprotein mit einem
vorausberechneten Gewicht von ungefähr 19,8 kDa.
-
IG5.
-
Ein
künstliches,
das chimäre
Protein IG5 (SEQ ID NO: 5) codierendes, chimäres Gen wurde durch Ligieren
von PCR-Produkten unter Verwendung von Primern prIG14 (SEQ ID NO:
25), prIG15 (SEQ ID NO: 26), prIG16 (SEQ ID NO: 27), prIG17 (SEQ
ID NO: 28), prIG18 (SEQ ID NO: 29), prIG19 (SEQ ID NO: 30), prIG20 (SEQ
ID NO: 31), prIG21 (SEQ ID NO: 32), prIG22 (SEQ ID NO: 33) und prIG23
(SEQ ID NO: 34) konstruiert. Das künstliche Gen IG5 (SEQ ID NO:
35) codiert ein chimäres
Fusionsprotein mit einem vorausberechneten Gewicht von ungefähr 25,3
kDa.
-
IG6.
-
Eine
das chimäre
Protein IG6 (SEQ ID NO: 6) codierende Gensequenz ist unten als SEQ
ID NO: 36 dargelegt und codiert ein chimäres Fusionsprotein mit einem
vorausberechneten Gewicht von ungefähr 43,7 kDa.
-
IG7.
-
Eine
das chimäre
Protein IG7 (SEQ ID NO: 7) codierende Gensequenz ist unten als SEQ
ID NO: 37 dargelegt und codiert ein chimäres Fusionsprotein mit einem
vorausberechneten Gewicht von ungefähr 49,2 kDa.
-
Expression
und Aufreinigung von rekombinanten IG-Fusionsproteinen
-
Für die Herstellung
des Expressionsplasmids für
jedes bakteriell exprimierte IG-Fusionsprotein
wurden elektrokompetente E. coli-Stamme BL21 (DE3) mit dem Expressionsplasmid
transformiert und ampizillinresistente Kolonien für die Flüssigkultur
ausgewählt.
Das IDE3-Lysogen in Stamm BL21 (DE3) enthält das Gen für T7-Polymerase
hinter dem E. coli lacUV5-Promotor zur wirksamen Expression von
Zielgenen unter der Kontrolle des starken Bakteriophagen T7-Transkriptions-
und Translationssignals (Studier et al., 1990).
-
Das
rekombinante chimäre
Fusionsprotein wurde aus den in Lösung gebrachten Pellets von
ganzen Zellen durch Affinitätschromatographie
mit gebundenem Metall gereinigt und durch SDS-PAGE/Coomassie-Blau-Färbung analysiert.
Kulturen mit vier Litern wurden bis zu einer OD600 von
0,8 in Terrific Broth(TB)-Medium (Sambrook et al., 1992) gezogen.
Die Proteinexpression wurde für
5 Stunden mit 1 mM isopropylthiogalaktosid (IPTG) induziert. Die
induzierten Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und über Nacht
bei –20°C eingefroren.
Die Zellpellets wurden bei Raumtemperatur aufgetaut und in 10 ml/g
Puffer A (6 M Guanidin-HCl/10% Glycerin/20 mM Tris-Cl pH 7,8/500
mM NaCl/200 mg Natriumsulfit/280 mg Natriumtetrathionat) unter Verwendung
eines TEKMAR Homogenisators (The Tekmar Co., Cincinnati, OH) homogenisiert.
Die Zellen wurden bei –70°C für eine Stunde
eingefroren und zur Unterstützung
der Zellyse bei Raumtemperatur aufgetaut. Die Zellsuspension wurde
für 30
min bei Raumtemperatur sachte unter Verwendung eines magnetischen
Rührers
gemischt. Der lösliche
IG-Protein enthaltende Anteil wurde als der Überstand im Anschluß an eine
Zentrifugation des Zellysats bei 10.000 × g für 30 min bei 4°C in einem
Beckman JA-10-Rotor abgenommen. Der Überstand wurde auf eine Ni-NTA-Säule (QIAGEN
Inc., Chadsworth, CR), die zuvor mit Puffer A equilibriert wurde,
bei einer Durchflußrate
von 8 ml/min geladen. Die Säule
wurde unter Verwendung von Puffer A gewaschen, bis die Absorption
der Basislinie entsprach. Die Säule
wurde weiter mit Puffer B gewaschen (6 M Harnstoff/10% Glycerin/
20 mM Tris-Cl/500 mM NaCl pH 7,8) und verunreinigende E. coli-Proteine
wurden mit Puffer C entfernt (6 M Harnstoff/10% Glycerin/20 mM Tris-Cl/500
mM NaCl pH 5,0). Das IG-Protein wurde mit Puffer D eluiert (6 M
Harnstoff/10% Glycerin/20 mM Tris-Cl/500 mM NaCl pH 4,0). Alle Fraktionen
wurden chargenweise gesammelt und auf einem 4-20% SDS-Polyacrylamid-Gradientengel
in Anwesenheit eines Reduktionsmittels analysiert. Die IG-enthaltenden
Fraktionen (Waschen mit Puffer D) wurden 10-fach unter Verwendung
einer AMICON STIRCELL unter Verwendung einer PM10-Membran aufkonzentriert.
Die Proben wurden gegen MILLI-Q Wasser, welches zweimal gewechselt
wurde, bei 4 °C
dialysiert. Die IG-Präparate
wurden filtersterilisiert und die Konzentration spektrophotometrisch
unter Verwendung eines Konversionsfaktors von 1,06 mg/ml/OD280 bestimmt. Fünf Mikrogramm wurden unter
reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen durch SDS-PAGE
zum Erhalt eines anfänglichen
Hinweises zu Reinheit und Intaktheit der Proteinpräparate analysiert.
-
Behandlung mit chimärem Fusionsprotein – CYTOXAN-Modell:
-
Gruppen
von zufällig
ausgewählten
NOD-Mäusen
wurden zweimal täglich
intravenös
mit entweder BSA als eine Kontrolle oder GAD-Peptiden, B-Kette von
Insulin (ICB) oder verschiedenen Kombinationen von GAD-Peptiden
und/oder B-Kette von Insulin injiziert, mit den in den Figuren an
den Tagen 1,3 und 5 im Anschluß an
die CYTOXAN-Behandlung (Tag 0) angegebenen Dosen. Tiere, die Injektionen
von BSA erhielten (Kontrollen), manifestierten ein Auftreten von
Diabetes von mehr als 80% nach 21 Tagen auf die CYTOXAN-Induktion
folgend (2). Im Gegensatz dazu erfuhren
Tiere, die entweder mit ICB oder einem der GAD 65-Peptide 250-273
oder 520-555 behandelt wurden, Abnahmen bis weniger als 50% Auftreten
von Diabetes. Die therapeutischen Wirkungen der Behandlung mit Kombinationen
von ICB und den zwei GAD-Peptiden wurden dann untersucht (3).
Eine Abnahme im Auftreten von Diabetes auf 25% oder weniger wurde
durch die Kombination von GAD 250-273 und ICB bei Dosen von 100 μg oder 250 μg pro Injektion
erreicht.
-
Überraschenderweise
schien die Zugabe von GAD-Peptid 520-555 (Aminosäurereste 139-173 in SEQ ID
NO: 2) die therapeutische Wirksamkeit der Kombination des ICB mit
GAD 65 250-273 zu hemmen. Eine Auswertung in dem CYTOXAN-Modell
der chimären
Fusionsproteine IG1 und IG2 der Erfindung zeigte, daß eine Behandlung
mit einem dieser beiden Polypeptide eine dosisabhängige Abnahme
des Auftretens von Diabetes im Vergleich zu den mit BSA behandelten
Kontrolltieren vermittelte (4). In diesem
Experiment waren Dosen von 300 μg
wirksamer als Dosen von 100 μg
und IG2 verringerte das Auftreten von Diabetes in größerem Maße als IG1.
Eine Behandlung mit Dosen von 300 μg IG2 verringerte das Erkrankungsauftreten
auf weniger als 12% im Vergleich zu mehr als 80% Erkrankungsauftreten
bei den mit BSA behandelten Kontrolltieren.
-
Behandlung mit chimärem Fusionsprotein – Modell
zur passiven Immunisierung:
-
Diabetogene
einkernige Zellen aus der Milz wurden von neuerdings diabetischen
NOD-Mäusen
(Ausbruch weniger als 3 Wochen zuvor) geerntet. Zur Auslösung der
Zerstörung
der Beta-Zellen der Inseln und der Entwicklung von Diabetes wurden
8-12 Wochen alte NOD-/SCID-Mäuse
intravenös
mit 35 × 106 diabetogenen Milzzellen injiziert. Die
Häufigkeit
und der Ausbruch von Diabetes wurde zweimal wöchentlich durch Untersuchung
der Uringlukose überwacht
und durch Untersuchen der Blutglukose am Ende des Experimentes bestätigt. Die
durchschnittliche Zeit des Ausbruchs von Diabetes nach der Induktion
der Erkrankung war ungefähr 25
Tage. IV-Behandlung mit IG2, IG3 oder Antigenen der Beta-Zellen
der Inseln wurde an Tag 3 begonnen. Die Tiere wurden mit 300 μg des Antigens
zweimal täglich,
jeden zweiten Tag für
einen Zeitraum von sechs Tagen (von Tag 3 bis Tag 9, wenn der Zeitpunkt
der Übertragung
der Milzzellen an Tag 0 war) behandelt.
-
Die
Ergebnisse dieser Experimente sind in 5 dargelegt.
Sie zeigen überraschenderweise,
daß nur das
chimäre
Fusionsprotein IG2 den Ausbruch der Erkrankung in den NOD-/SCID-Empfängern verhinderte. Im
Gegensatz dazu wurde in diesem Modell nur eine leichte Verzögerung beim
Ausbruch der Erkrankung bei Empfängern
von IG1, B-Kette von Insulin (ICB) oder der Kombination von ICB
und GAD-Peptid 250-273 beobachtet. Diese starken Unterschiede in
den Wirkungen der Behandlungen mit IG2 im Vergleich zu den anderen Behandlungstherapien
war unerwartet. Ohne es zu wünschen,
an eine bestimmte Theorie des Ablaufs gebunden zu sein, wird angenommen,
daß dieser
unerwartete Befund ein Ergebnis der in vivo-Reifung von IG2 in einzelne
antigene Peptide ist, die besonders wirksam beim Hervorrufen eines
Stadiums der Immuntoleranz sind, welches gegen autoimmunen Diabetes
selbst unter den anspruchsvollen Bedingungen, die sich aus der Anregung
mit heterogenen, aus den Milzzellen von vollständig diabetischen NOD-Mausen
erhaltenen Populationen an T-Zellen ergeben.
-
QUELLENANGABEN
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