CN101242851A

CN101242851A - 使用连蛋白的拮抗剂防止胰细胞丢失或再生胰细胞的方法

Info

Publication number: CN101242851A
Application number: CNA2006800295444A
Authority: CN
Inventors: A·法萨诺; B·佩特森; A·萨博恩
Original assignee: University of Maryland at Baltimore; Alba Therapeutics Corp
Current assignee: University of Maryland at Baltimore; 9 Meters Biopharma Inc
Priority date: 2005-06-09
Filing date: 2006-06-09
Publication date: 2008-08-13
Also published as: AU2006257940A1; BRPI0611813A2; IL188005A0; RU2007148521A; JP2008543779A; WO2006135811A2; WO2006135811A3; TW200716159A; KR20080027824A; EP1901760A2; AR057058A1; US20060287233A1

Abstract

本发明提供用于治疗糖尿病的材料和方法。使用本发明的材料和方法，可以减缓和/或防止胰β－细胞的丢失。而且，可以将本发明的材料和方法用于再生胰β－细胞。

Description

使用连蛋白的拮抗剂防止胰细胞丢失或再生胰细胞的方法

本发明的开发由马里兰巴尔的摩的马里兰大学支持。这里所描述的发明由来自国立卫生研究院(National Institutes of Health)的基金(DK 66630和DK 48373)支持。政府拥有某些权利。

发明领域

本发明提供防止或减缓胰腺β-细胞丢失的材料和方法。进一步地，本发明还提供再生细胞特别是胰腺β-细胞的材料和方法。在某些方面，连蛋白(zonulin)的拮抗剂(例如：肽拮抗剂)可用于本发明的实施。

发明背景

I.肠紧密连接的功能和调节

肠上皮代表了在外环境和内环境之间的最大界面(大于2,000,000cm²)。细胞间紧密连接(“紧密连接”)功能的保持会防止潜在有害的环境因素如细菌、病毒、毒素、食物变应原和大分子穿越肠屏障。在许多影响胃肠道的临床病症包括：食物变态反应、肠道感染、吸收不良综合征和炎症性肠病中，此功能都受到显著破坏。

紧密连接(tj)或闭锁小带(下文中称为“ZO”)是吸收和分泌上皮细胞的标志之一(Madara，J.Clin.Invest.，83：1089-1094(1989)和Madara，Textbook of Secretory Diarrhea，Eds.Lebenthal等人，第11章，第125-138页(1990))。作为顶部和基底外侧隔室之间的屏障，它们选择性地调节离子和水溶性溶质通过细胞旁路途径的被动扩散(Gumbiner，Am.J.Physiol.，253(CellPhysiol.22)：C749-C758(1987))。此屏障保持所有的由与细胞间通路相关的途径的活动而产生的梯度(Diamond，Physiologist，20：10-18(1977))。

上皮间传导性的变化通常可归结于细胞间通路(paracellular pathway)的通透性的改变，因为肠细胞质膜的阻力相对较高(Mardara(1989，1990)，supra)。ZO代表了该细胞旁路途径中的主要屏障，并且通过冷冻蚀刻电子显微镜观察，上皮组织的阻力似乎取决于跨膜蛋白链的数目及其在ZO中的复杂性(Madara等人，J.Cell Bol.101：2124-2133(1985))。

有充分的证据表明，曾被认为是静止结构的ZO实际上是动态的且易于适应各种发育环境(Magnuson等人，Dev.Biol.，67：214-224(1978)；Revel等人，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，40：443-455(1976)；和Schneeberger等人，J.Cell.Sci.32：307-324(1978))、生理学环境(GiMa等人，Dev.Biol.，50：142-168(1976)；Madara等人，J.Membr.Biol，100：149-164(1987)；Mazariegos等人，J.Cell Biol.，98：1865-1877(1984)；和Sardet等人，J.Cell Biol.，80：96-117(1979)和病理学环境(Milks等人，J.CellBiol.，103：2729-2738(1986)，Nash等人，Lab.Invest.，59：531-537(1988)；和Shasby等人，Am.J.Physiol，255(Cell Physiol，24：C781-C788(1988))。作为此适应性的基础的调节机理目前仍然不完全清楚。然而，很明显，ZO的组装是在Ca²⁺的存在下的细胞相互作用的结果，所述相互作用引发最终导致ZO成分的有组织的网络的形成和调节的生化事件的复杂级联，该网络的组成仅被部分表征(Diamond，Physiologist，20：10-18(1977))。最近鉴定了用于跨膜蛋白链的一个候选物——闭合蛋白(occluden)(Furuse等人，J.Membr.Biol，87：141-150(1985))。

在膜接触下的细胞质膜下噬斑中，鉴定了6种蛋白质，但是它们的功能仍然有待确定(Diamond，supra)。ZO-1和ZO-2与未表征的130kD的蛋白(ZO-3)作为异源二聚体(Gumbiner等人，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，88：3460-3464(1991))存在于对去污剂稳定的复合物中。

大部分免疫电镜研究都精确地将ZO-1定位于膜接触之下(Stevenson等人，Molec.Cell Biochem.，83：129-145(1988))。另外两个蛋白，扣带蛋白(cingulin)(Citi等人，Nature(London)，333：272-275(1988))和7H6抗原(7H6 antigen)(Zhong等人，J.Cell Biol.，120：477-483(1993))被定位于离膜更远的地方并且尚未被克隆。Rab 13，一个小的GTP结合蛋白最近也被定位于连接区(Zahraoui等人，J Cell Biol.，124：101-115(1994))。已知其它的小的GTP结合蛋白用于调控皮层细胞骨架，即，rho调控粘着斑中的肌动蛋白-膜黏附(Ridley等人，Cell，70：389-399(1992))，且rac调控生长因子诱导的膜变皱运动(Ridley等人，Cell，70：401-410(1992))。基于与在被更好地表征的细胞连接、粘着斑(Guan等人，Nature，358：690-692(1992))和粘着连接(Tsukita等人，J.CellBiol.，123：1049-1053(1993))中的斑块蛋白的已知功能的类比，已经假定紧密连接相关性的斑块蛋白涉及跨细胞膜指导的信号传导和调控与皮层肌动蛋白细胞骨架连接的信号传导。

为应付上皮细胞所受到的许多不同的生理学和病理学的挑战，ZO必须能够快速、协调地做出应答，这需要复杂调控系统的参与。ZO的组装及调控涉及的机制的准确表征是目前积极研究的领域。

目前有大量证据表明，紧密连接的结构性和功能性的连接存在于肌动蛋白细胞骨架和吸收性细胞的紧密连接复合物之间(Gumbiner等人，supra；Madara等人，supra；以及Drenchahn等人，J.Cell Biol.，107：1037-1048(1988))。肌动蛋白细胞骨架由复杂的微丝网状结构组成，该网状结构的精密几何结构由肌动蛋白结合蛋白的大型骨架来调控。肌动蛋白结合蛋白的磷酸化状态如何调控细胞骨架与细胞质膜连接的一个例子是豆蔻酰化的富含丙氨酸C激酶底物(下文中称为“MARCKS”)。MARCKS是一种具体的蛋白激酶C(下文中称为“PKC”)底物，其与质膜的胞质面结合(Aderem，Elsevier Sci.Pub.(UK)，第438-443页(1992))。在其未被磷酸化的形式中，MARCKS交联于膜肌动蛋白。所以，经由MARCKS连接于膜的肌动蛋白网络结构有可能是相对坚固的(Hartwig等人，Nature，356：618-622(1992))。活化的PKC使得从膜上释放的MARCKS磷酸化(Rosen等人，J.Exp.Med.，172：1211-1215(1990)；和Thelen等人，Nature，351：320-322(1991))。结合于MARCKS的肌动蛋白有可能在空间上与膜分开且更具可塑性。当MARCKS被去磷酸化时，它返回膜上重新与肌动蛋白进行交联(Hartwig等人，supra；和Thelen等人，supra)。这些数据提示，F-肌动蛋白网络可能由一种涉及肌动蛋白结合蛋白(MARCKS为其中之一)的PCK依赖性的磷酸化过程来重排。

已经有多种细胞内调控因子显示出改变tj的功能和/或结构。两栖类动物胆囊(Duffey等人，Nature，204：451-452(1981))以及金鱼(Bakker等人，Am.J.Physiol.，246：G213-G217(1984))和鲽(Krasney等人，Fed.Proc.，42：1100(1983))的肠的紧密连接在细胞内cAMp升高时都显示出增强的对被动离子流的阻力。而且，将两栖类动物的胆囊暴露在Ca²⁺离子载体下显示出可增强tj的阻力并诱导在tj结构中的变化(Palant等人，Am.J.Physiol.，245：C203-C212(1983))。另外，由佛波酯(phorbol ester)导致的PKC活化同时增加了肾(Ellis等人，C.Am.J.Physiol，263(Renal Fluid Electrolyte Physiol.32)：F293-F3OO(1992))和肠(Stenson等人，C.Am.J.Physiol，265(Gastrointest.Liver Physiol.，28)：G955-G962(1993))上皮细胞系的细胞间通透性(paracelluar permeability)。

II.紧密连接毒素(Zonula Occludens Toxin)

大多数通过缺失编码霍乱毒素(CT)的ctxA基因来构建的霍乱疫苗候选物都能引发抗体的高应答，但是超过半数的该疫苗仍会产生轻度腹泻(Levine等人，Infect.Immun.，56(1)：161-167(1988))。考虑到在CT缺失的情况下诱发腹泻的程度，假设霍乱菌(V.chlerae)产生其它产肠毒素因子，该产肠毒素因子仍然存在于缺失ctxA序列的菌株中(Levine et al，supra)。因此，发现了另一种由霍乱菌产生的可导致残留腹泻(residual diarrhea)的毒素：紧密连接毒素(下文中称为“ZOT”)(Fasano等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，88：5242-5246(1991))。该zot基因被定位于紧挨着ctx基因。该zot基因与ctx基因在霍乱菌株中高百分比的同时存在(Johnson等人，J.Clin.Microb.，31(3)：732-733(1993)；和Karasawa等人，FEBS Microbiology Letters.，106：143-146(1993))提示，在引发霍乱的典型急性脱水性腹泻中ZOT可能起协同作用。最近，在其它的肠道病原体中也已经鉴定到了ZOT基因(Tschape，2nd Asian-Pacific Symposium on Typhoid fever and otherSalomellosis，47(Abstr.)(1994))。

先前已经发现，当在兔回肠粘膜上测试时，ZOT通过调节细胞间tj的结构来增加肠通透性(Fasano等人，supra)。已经发现，作为修饰细胞旁路途径的一个结果，肠粘膜的通透性增加。还发现ZOT不影响Na⁺-葡萄糖耦联的主动转运，无细胞毒性，且不能完全消除穿越上皮层的阻力(transepithelial resistance)(Fasano等人，supra)。

更近期，发现了ZOT能够在肠粘膜中可逆地开放tj，并且因此，当将ZOT与治疗试剂如胰岛素联合给药时，在用于肠药物递送如在糖尿病的治疗中的口服剂量的组合物中，会实现所述治疗试剂的肠递送(WO 96/37196；美国专利5,827,534；美国专利5,665,389；和Fasano等人，J.Clin.Invest.，99：1158-1164(1997)：每一文献的全部内容均引入本文作为参考)。还发现ZOT能够在鼻粘膜中可逆地开放tj，并且因此，当将ZOT与治疗试剂联合给药时，能够增强治疗试剂的鼻吸收(美国专利5,908,825，该文献的全部内容引入本文作为参考)。

在以其全部内容引入本文作为参考的美国专利5,864,014中，已经从肠细胞系即CaCo2细胞中鉴定和纯化得到了ZOT受体。进一步地，在以其全部内容引入本文作为参考的美国专利5,912,323中，已经从人的肠、心和脑组织中鉴定和纯化得到了ZOT受体。该ZOT受体代表了涉及肠和鼻的通透性调节的细胞旁路途径的第一步。

III.连蛋白(Zonulin)

在以其全部内容引入本文作为参考的美国专利5,945,510和5,948,629中，已经鉴定和提纯得到了在免疫上和功能上与ZOT相关的哺乳动物蛋白以及起到哺乳动物的紧密连接生理调节剂作用的哺乳动物蛋白。这些被称为“连蛋白”的哺乳动物蛋白对于增强治疗试剂通过肠粘膜和鼻粘膜以及穿过血脑屏障的紧密连接的吸收上是有用的。

IV.连蛋白的肽拮抗剂

连蛋白的肽拮抗剂在1998年8月3日提交的未决美国专利申请No.09/127,815中被首次鉴定和描述，该申请以其全部内容引入本文作为参考，其对应于WO 00/07609。连蛋白的肽拮抗剂可与ZOT受体结合，但并不起到在生理上调节哺乳动物紧密连接的开放的作用。所述肽拮抗剂竞争性地抑制ZOT和连蛋白与ZOT受体的结合，从而抑制ZOT和连蛋白在生理上调节哺乳动物紧密连接的开放的能力。

V.糖尿病

I型糖尿病(TIDM)通常称为胰岛素依赖性糖尿病或青少年性糖尿病，其是胰腺的自身免疫障碍。患者对负责产生胰岛素的胰腺β细胞产生免疫应答。因为β细胞的损伤，胰腺不再能产生激素胰岛素。

与糖尿病相关的发病率和死亡率是破坏性的。美国糖尿病个体的总数为1570万人。其中，100％的I型糖尿病患者和40％的II型糖尿病患者依赖于胰岛素的肠胃外给药。按年计，与糖尿病直接相关的医疗费用超过400亿美元。另外有140亿美元与劳动能力丧失、失业和早夭相关。

尽管口服胰岛素药物的递送策略是许多研究工作的焦点，但是，因为小肠的生理特性妨碍大分子如胰岛素的吸收，其中的大部分都不成功。

最近，美国专利公开说明书2005/0067074 A1公开了使用连蛋白的肽拮抗剂来防止或延迟糖尿病的发作。该公开说明书提示，疾病发展的关键和早期阶段在于细胞间通透性的改变，以及细胞间通透性的增加对于向糖尿病的发展是必需的。阻断该内源性途径的连蛋白的肽拮抗剂显示出可防止糖尿病的发展。尽管存在该公开说明书的公开内容，本领域中仍然有逆转该疾病病程的需要，例如：通过再生所述的产生胰岛素的β细胞。本发明满足了该需要以及其它需要。

发明概述

在某些实施方案中，本发明提供了一种在有需要的受试者中减缓胰β细胞丢失的方法。这样的方法可以包括给予所述受试者包含连蛋白拮抗剂的组合物。连蛋白的拮抗剂可以是肽，例如包含Gly Gly Val Leu Val Gln ProGly(SEQ ID NO：15)序列的肽。在减缓胰β细胞丢失的方法中使用的组合物可以包含除连蛋白拮抗剂外的一种或更多种成分。例如，组合物可以含有一种或更多种增强细胞生长的因子。适宜的因子包括但不限于生长因子。适合的生长因子的例子包括但不限于表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子-2(BFGF-2)、角质细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子/扩散因子(HGF/SF)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽的抑制剂(exendin-4)、胰岛/十二指肠同源框-1(IDX-I)、β-动物纤维素、激活蛋白A、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、胃泌素及其组合。

在某些实施方案中，本发明提供了在有需要的受试者中再生胰β细胞的方法。这样的方法可以包括给予所述受试者连蛋白拮抗剂和细胞。连蛋白的拮抗剂可以是肽，例如包含序列Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly(SEQID NO：15)的肽。能够促进β细胞再生的任何类型的细胞均可使用。在某些实施方案中，该细胞可以是分泌生长因子的细胞。在某些实施方案中，该细胞可以是胰岛细胞例如β细胞。在某些实施方案中，该细胞可以是祖细胞例如干细胞。拮抗剂和细胞的给予时间可以使用本领域技术人员所公知的方法来优化。在某些实施方案中，所述拮抗剂和所述细胞可以同时给予，而在其它实施方案中，所述拮抗剂和所述细胞不同时给予，即所述拮抗剂可以在给予所述细胞之前或之后给予。在一个实施方案中，将所述拮抗剂在给予所述细胞之前及之后均进行给予。

在有需要的受试者中再生胰β细胞的方法包括向受试者给予连蛋白拮抗剂和细胞，该方法可以进一步包括给药增强细胞生长的因子。适宜的因子包含但不限于生长因子。适宜的生长因子的例子包含但不限于表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子-2(BFGF-2)、角质细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子/扩散因子(HGF/SF)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、毒蜥外泌肽-4(exendin-4)、胰岛/十二指肠同源框-1(IDX-1)、β-动物纤维素、激活蛋白A、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、胃泌素及其组合。

在某些实施方案中，本发明提供在有需要的受试者中再生胰β细胞的方法，该方法包括在允许β细胞复制的条件下向受试者给药连蛋白的拮抗剂。连蛋白的拮抗剂可以是肽例如包含序列Gly Gly Val Leu Val Gln ProGly(SEQ ID NO：15)的肽。这样的方法可以进一步包括给予增强细胞生长的因子。适宜的因子包含但不限于生长因子。适宜的生长因子的例子包括但不限于表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子-2(BFGF-2)、角质细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子/扩散因子(HGF/SF)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、毒蜥外泌肽-4(exendin-4)、胰岛/十二指肠同源框-1(IDX-1)、β-动物纤维素、激活蛋白A、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、胃泌素及其组合。

在某些实施方案中，本发明提供在有需要的受试者中再生胰β细胞的方法，该方法包括向受试者给予连蛋白拮抗剂并向受试者植入细胞。连蛋白拮抗剂可以是肽，例如包含序列Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly(SEQ IDNO：15)的肽。能够被植入且促进β细胞再生的任何类型的细胞均可使用。在某些实施方案中，这些细胞可以包含分泌生长因子的细胞。在某些实施方案中，所述细胞可以是胰岛细胞，例如所述细胞可以包括β细胞。在某些实施方案中，所述细胞可以包括祖细胞例如干细胞。给予拮抗剂和植入细胞的时间可以使用本领域技术人员所熟知的方法进行优化。在某些实施方案中，可在同一时间给予拮抗剂并植入细胞，而在其它实施例中，给予拮抗剂和植入细胞不同时进行，即所述拮抗剂可以在所述细胞植入之前或之后给予。在一个实施方案中，将所述拮抗剂在细胞植入之前和之后均给予。

在某些实施方案中，在有需要的受试者中再生胰β细胞的方法包括向受试者给予连蛋白拮抗剂并在所述受试者中植入细胞，该方法可以进一步包括给予增强细胞生长的因子。适宜的因子包含但不限于生长因子。适宜的生长因子的例子包括但不限于表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子-2(BFGF-2)、角质细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子/扩散因子(HGF/SF)、胰高血糖素样肽-1(GLP-I)、毒蜥外泌肽-4(exendin-4)、胰岛/十二指肠同源框-1(IDX-I)、β-动物纤维素、激活蛋白A、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、胃泌素及其组合。在某些实施方案中，可给予因子并同时植入细胞，而在其它实施方案中，给予因子和植入细胞不同时进行，即所述因子可以在所述细胞植入之前或之后给予。在一个实施方案中，将所述因子在细胞植入之前和之后均给予。

本发明提供通过给药化合物来治疗自身免疫疾病的方法，所述化合物防止解剖学屏障通透性的增加。防止解剖学屏障通透性增加的化合物可以是增加解剖学屏障通透性的常规生理化合物的拮抗剂。用于治疗自身免疫疾病的适宜化合物的一个例子为连蛋白拮抗剂。可以用一种防止解剖学屏障通透性增加的化合物来治疗的自身免疫疾病的例子包括但不限于乳糜泻、原发生胆汁性肝硬化、IgA肾病、韦格纳肉芽肿病、多发性硬化症、I型糖尿病、类风湿性关节炎、克罗恩病(Crohn’s disease)、红斑狼疮、桥本甲状腺炎(甲状腺功能减退)、格雷夫斯氏病(Graves’disease，甲状腺功能亢进)、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、大疱性类天疱疮、视神经脊髓炎(德维奇综合征，Devic′s syndrome)、古德帕斯丘综合征、兰-伊肌无力综合征症(LEMS)、自身免疫性淋巴增生性综合征(ALPS)、副癌综合征、多腺体自身免疫综合征(polyglandular autoimmune syndromes，PGA)和斑秃。

从下文提供的本发明的详细描述来看，本发明的这些目的以及其它目的将是明显的。

附图的简要说明

图1显示从多种人体组织和IgM重链中纯化得到的连蛋白的N端序列与ZOT的生物活性片段(氨基酸288-399)的N端序列的比较。

图2显示与阴性对照相比，将ZOT、连蛋白_i、连蛋白_h单独使用(以填充柱(closed bars)表示)或者与肽拮抗剂FZI/O联合使用(以无遮盖的柱(open bars)表示)联合或者与FZI/1联合使用(以阴影柱(shaded bars)表示)，对安放于尤斯室(Ussing chamber)中的兔回肠组织阻力(tissueresistance)(Rt)的作用。N等于3-5；*表示p＜0.01。

图3显示在糖尿病易感性和糖尿病抗性的大鼠腔内连蛋白的浓度(ng/ml)，该浓度是使用夹心ELISA分析来测定的。样本是通过使用生理盐水灌洗肠道来得到的。每一情形中的第一个柱表示糖尿病抗性大鼠(DR)，第二个柱表示糖尿病易感性动物(DP)，第三个柱表示慢性糖尿病大鼠(CD)。＜9％的糖尿病易感性大鼠未患糖尿病，且大约9％的糖尿病抗性的大鼠发展成糖尿病。

图4显示了用于本研究的发展为糖尿病的大鼠的百分数。

图5显示了使用夹心ELISA分析测定的在患糖尿病大鼠中的腔内连蛋白的浓度(ng/ml)。

图6显示了糖尿病抗性(DR)大鼠、在尤斯室中测定的未经治疗的糖尿病易感性大鼠(DR-未治疗，第二个柱)和以连蛋白肽拮抗剂治疗的糖尿病易感性大鼠(DR-治疗，第三个柱)的体外肠通透性。*表示p＜0.05，**表示p＜0.05且与DR-治疗相比p＜0.0001。

图7显示已发展为糖尿病或未发展为糖尿病的未经治疗的糖尿病易感性大鼠的小肠的体外肠通透性。*表示p＜0.4。

图8是显示异常的紧密连接的通透性如何在I型糖尿病的发生和发展中起作用的示意图。

图9显示了未使用连蛋白抑制剂AT1001治疗或使用连蛋白抑制剂AT1001治疗的BBDP大鼠的经苏木精和曙红染色的胰腺切片。对于从未经治疗的发生I型糖尿病(T1D)的大鼠(上方组)和经AT1001治疗的未发生T1D的大鼠(下方组)分离的胰腺均进行组织学分析。在左方组(10倍放大)中由箭头指示的胰岛细胞在右方组中被显示为更高的放大倍数(40倍)。未经治疗的动物显示出I型糖尿病(T1D)的典型末期胰岛损伤，而经过治疗的动物显示出无胰岛炎的血管周围炎症迹象。

图10显示了未使用连蛋白抑制剂AT1001治疗和使用连蛋白抑制剂AT1001治疗的BBDP大鼠的胰岛染色。对于从未经治疗的发生T1D的BBDP大鼠(上方组)和以AT1001治疗的未发生T1D的大鼠(下方组)分离的胰腺进行免疫组织学分析。发生T1D的大鼠的胰岛显示出典型的无胰岛素染色的塌陷面(collapsed aspect)(A)以及被保存的产生胰高血糖素的δ细胞群(B)。与之相反，经AT1001治疗的动物显示出被保存的胰岛，在该胰岛的核心处有可检测到的产生胰岛素的β细胞(C)，且在其边缘处有产生胰高血糖素的δ细胞(D)。然而，δ细胞的染色未显示出一致性，偶尔会出现多细胞层(见箭头)。10倍放大。

图11显示了分离自未经治疗的发生了T1D的BBDP大鼠(A组和B组)以及经AT1001治疗的未发生T1D的大鼠(C-F组)的胰腺的免疫组织化学信息。来自于发生了T1D的大鼠的胰岛显示出典型的无胰岛素染色的塌陷面(collapsed aspect)(A)以及被保存的产生胰高血糖素的δ细胞群(B)。与之相反，经AT1001治疗的动物显示出其胰岛或者未受损伤(C和D)或是从特征在于产生胰岛素的细胞和产生胰高血糖素的细胞(E和F)之间边界不规则性的胰岛炎损伤中恢复的现象。这些发现与正在发生的胰岛炎的异常终止是相一致的。10倍放大。

图12显示了分离自经AT1001治疗的未发生T1D的大鼠的胰腺的免疫组织化学信息。该胰岛出现了由显示出不规则轮廓的胰岛内和胰岛周围的疤痕造成的扭曲。可以看到从胰岛炎损伤中恢复的迹象，且所述迹象的特征在于，在胰岛素(A和C)与胰高血糖素(B和D)产生性细胞(E和F)之间边界的不规则性。这些发现与正在发生的胰岛炎的异常终止相一致。

图13显示了以AT-1001治疗自身免疫性糖尿病的研究结果。图13是将未经治疗的动物(●)相对于经治疗的动物(■)进行比较的以非糖尿病动物的百分比相对于时间的函数来描绘的无糖尿病存活率图。使用BB/wor DP大鼠，在血清转化后开始治疗。60％的未经治疗的大鼠发生了T1D，而仅有35％的经AT1001治疗的动物发展为T1D。安慰剂组的T1D平均发病年龄为85.4±10.4天，而治疗组为86.0±10.3天。起始研究阶段用T0表示，从第120天起用T1表示。

图14A和14B显示了以AT-1001治疗自身免疫性糖尿病的研究结果。图14A和14B是显示在治疗期间内自身抗体变化的柱形图。图14A显示发生了T1D的动物中的抗谷氨酸脱羧酶(GAD)抗体。图14B显示发生了T1D的动物中的抗GAD抗体。

图15A和15B显示以AT-1001治疗自身免疫性糖尿病的研究结果。图15A和15B是显示在治疗期间内血清连蛋白水平变化的柱形图。图15A显示发生了T1D的动物中的连蛋白水平。图15B显示发生了T1D的动物中的连蛋白水平。

发明详述

如上面所讨论的，在各种实施方案中，本发明提供在有需要的受试者中减缓胰β-细胞的丢失、防止胰β-细胞的丢失和/或再生胰β-细胞的材料和方法，所述材料和方法是通过，尤其是，向需要减缓胰β-细胞的丢失、防止胰β-细胞的丢失和/或再生胰β-细胞的受试者给予药学有效量的连蛋白拮抗剂。一般地，适合用于本发明的拮抗剂能与紧密连接毒素(ZOT)受体结合，但是并不能在生理上调节哺乳动物紧密连接的开放。在某些实施方案中，所述连蛋白拮抗剂可以是肽。将术语“拮抗剂”定义为一种防止、抑制、减少或逆转由激动剂(即连蛋白)引起的应答的化合物。在一个实施方案中，本发明提供在有需要的受试者中减缓胰β-细胞的丢失、防止胰β-细胞的丢失和/或再生胰β-细胞的材料和方法，所述材料和方法是通过，尤其是，给予需要减缓胰β-细胞的丢失、防止胰β-细胞的丢失和/或再生胰β-细胞的受试者以药学有效量的连蛋白拮抗剂，其中，所述拮抗剂能与紧密连接毒素(ZOT)受体结合，但是不能在生理上调节哺乳动物紧密连接的开放。

这里使用的再生胰β-细胞是指增加胰β-细胞的数目。再生可能需要将一种或多种细胞引入(如植入)受试者中。细胞(如β-细胞、干细胞等)的移植在本领域中是已知的。例如，美国专利No.6,703,017(在此具体地将该专利引入本文作为参考，尤其是实施例1-3)公开了移植胰岛生成性干细胞、胰岛祖细胞和胰岛样结构。Soon-Shiong等人(Proc Natl Acad SciUSA.90(12)：5843-7，(1993))描述了通过注射经免疫保护的胰岛来长期逆转糖尿病。干细胞的分离在本领域中是已知的。例如，在美国专利申请20030082155(在此具体地将该文献引入本文作为参考，尤其是实施例1-4)公开了朗格汉斯(langerhans)胰岛干细胞的分离及其在治疗糖尿病中的用途。再生胰β-细胞还可以包括提供使得已存在于胰腺中的β-细胞可以复制的条件。例如，已经证明，成人胰β-细胞保留了明显的在体内增殖的能力，因此，通过提供促进增殖的条件，可以使胰β-细胞再生(Dor等人，Nature，429：41-46(2002))。

在本文中使用的受试者是接受本发明拮抗剂的任何动物如哺乳动物。受试者包括但不限于人。

本实验已经证明，自身免疫疾病例如I型糖尿病的发生是基于3个因素：1)遗传易感性；2)渗漏的解剖学屏障；和3)反复的环境损害。使用本发明的材料和方法有可能通过给予一种或更多种降低一种或更多种解剖学屏障通透性的化合物来治疗自身免疫性疾病。如下所示，拮抗能增强解剖学屏障通透性的常规生理学化合物活性的化合物的给药可以用于治疗自身免疫性疾病。例如连蛋白是增强解剖学屏障肠上皮的通透性的常规生理学化合物。通过给予连蛋白拮抗剂，可以维持或降低解剖学屏障的通透性，从而防止或治疗自身免疫性疾病I型糖尿病。

渗漏的解剖学屏障导致疾病发生的自身免疫性疾病的例子是I型糖尿病。不希望束缚于理论，相信异常的肠通透性在I型糖尿病的发病机理中起重要作用。参考图8，非自身抗原(正方形和三角形)存在于连蛋白系统(圆圈＝连蛋白，细胞上的T形结构为连蛋白受体)失调的受试者的肠腔(1)中并穿过tj屏障(2-3)。抗原肽结合到存在于APC表面上的HLA受体(4)。这些肽又被呈递到T淋巴细胞(5)。在遗传易感性的个体中，异常的免疫应答(包括体液免疫应答和细胞介导的免疫应答)(6)导致主要标靶于带有I型糖尿病典型的后续性胰岛素缺乏的朗格汉斯(Langherans)胰岛(7)的自身免疫过程。下文提出的证据证明了通过控制解剖学屏障的通透性，有可能逆转疾病进程和再生受损害的胰岛。

因此，本发明提供了通过给予防止解剖学屏障通透性增加的化合物来治疗自身免疫性疾病的方法。防止解剖学屏障通透性增加的化合物可以是增加解剖学屏障通透性的正常生理化合物的拮抗剂。适宜的用于治疗自身免疫性疾病的化合物的一个例子是连蛋白拮抗剂。

可将连蛋白的任何拮抗剂用于本发明的实施。这里使用的连蛋白拮抗剂是可与连蛋白受体结合并且防止、抑制、减少或逆转由连蛋白引发的应答的任何化合物。例如，本发明的拮抗剂可以包括连蛋白的肽拮抗剂。肽拮抗剂的例子包括但不限于包含选自如下的氨基酸序列的肽：

Gly Arg Val Cys Val Gln Pro Gly(SEQ ID NO：1)，

Gly Arg Val Cys Val Gln Asp Gly(SEQ ID NO：2)，

Gly Arg Val Leu Val Gln Pro Gly(SEQ ID NO：3)，

Gly Arg Val Leu Val Gln Asp Gly(SEQ ID NO：4)，

Gly Arg Leu Cys Val Gln Pro Gly(SEQ ID NO：5)，

Gly Arg Leu Cys Val Gln Asp Gly(SEQ ID NO：6)，

Gly Arg Leu Leu Val Gln Pro Gly(SEQ ID NO：7)，

Gly Arg Leu Leu Val Gln Asp Gly(SEQ ID NO：8)，

Gly Arg Gly Cys Val Gln Pro Gly(SEQ ID NO：9)，

Gly Arg Gly Cys Val Gln Asp Gly(SEQ ID NO：10)，

Gly Arg Gly Leu Val Gln Pro Gly(SEQ ID NO：11)，

Gly Arg Gly Leu Val Gln Asp Gly(SEQ ID NO：12)，

Gly Gly Val Cys Val Gln Pro Gly(SEQ ID NO：13)，

Gly Gly Val Cys Val Gln Asp Gly(SEQ ID NO：14)，

Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly(SEQ ID NO：15)，

Gly Gly Val Leu Val Gln Asp Gly(SEQ ID NO：16)，

Gly Gly Leu Cys Val Gln Pro Gly(SEQ ID NO：17)，

Gly Gly Leu Cys Val Gln Asp Gly(SEQ ID NO：18)，

Gly Gly Leu Leu Val Gln Pro Gly(SEQ ID NO：19)，

Gly Gly Leu Leu Val Gln Asp Gly(SEQ ID NO：20)，

Gly Gly Gly Cys Val Gln Pro Gly(SEQ ID NO：21)，

Gly Gly Gly Cys Val Gln Asp Gly(SEQ ID NO：22)，

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly(SEQ ID NO：23)，和

Gly Gly Gly Leu Val Gln Asp Gly(SEQ ID NO：24)

当拮抗剂为肽时，可使用任何长度的肽。通常，肽拮抗剂的氨基酸长度的大小范围可以是：约6到约100、约6到约90、约6到约80、约6到约70、约6到约60、约6到约50、约6到约40、约6到约30、约6到约25、约6到约20、约6到约15、约6到约14、约6到约13、约6到约12、约6到约11、约6到约10、约6到约9或约6到约8。本发明的肽拮抗剂的大小可以是氨基酸长度为约8到约100、约8到约90、约8到约80、约8到约70、约8到约60、约8到约50、约8到约40、约8到约30、约8到约25、约8到约20、约8到约15、约8到约14、约8到约13、约8到约12、约8到约11个或约8到约10个氨基酸。本发明的肽拮抗剂的氨基酸长度可以是：约10到约100、约10到约90、约10到约80、约10到约70、约10到约60、约10到约50、约10到约40、约10到约30、约10到约25、约10到约20、约10到约15、约10到14、约10到约13或约10到约12。本发明的肽拮抗剂的氨基酸长度可以是约12到约100、约12到约90、约12到约80、约12到约70、约12到约60、约12到约50、约12到约40、约12到约30、约12到约25、约12到约20、约12到约15或约10到约14。本发明的肽拮抗剂的氨基酸长度可以是：约15到约100、约15到约90、约15到约80、约15到约70、约15到约60、约15到约50、约15到约40、约15到约30、约15到约25、约15到约20、约19到约15、约15到约18或约17到约15个氨基酸。

可以使用公知的技术和肽合成仪来化学合成及纯化所述的肽拮抗剂，该公知的技术例如描述于High Performance Liquid Chromatography ofPeptides and Proteins：Separation Analysis and Conformation，Eds.Mant等人，C.R.C.Press(1991)中的技术，所述的肽合成仪例如Symphony(ProteinTechnologies，Inc)，或通过使用DNA重组体技术获得所述的肽拮抗剂，即：将编码所述肽的核苷酸序列插入到适宜的表达载体如大肠杆菌或酵母表达载体中，在各自的宿主细胞中表达并且使用公知的技术从其中纯化。

可以将所述拮抗剂(如肽拮抗剂)以用于小肠递送的口服剂型组合物进行给药。这样的用于小肠递送的口服剂型组合物在本领域中是公知的，并且通常包括胃耐受性的(gastroresistent)片剂或胶囊(Remington′sPharmaceutical Sciences，第16版，Eds.Osol，Mack Publishing Co.，第89章(1980)；Digenis等人，J.Pharm.Sci.，83：915-921(1994)；Vantini等人，Clinica Terapeutica，145：445-451(1993)；Yoshitomi等人，Chem.Pharm.Bull.，40：1902-1905(1992)；Thoma等人，Pharmazie，46：331-336(1991)；Morishita等人，Drug Design and Delivery，7：309-319(1991)；以及Lin等人，Pharmaceutical Res.，8：919-924(1991)，每一文献均全文引入本文作为参考)。本发明的胃耐受性的片剂或胶囊优选在肠液中溶解。

通过添加如醋酸邻苯二甲酸纤维素或醋酸对苯二甲酸纤维素，可制成胃耐受性的片剂。术语“胃耐受性的”是指一种组合物，其在pH小于5的胃液或者pH小于5的模拟胃液中于60分钟内释放的连蛋白效应物小于该组合物中连蛋白效应物总重的30％。

胶囊是固体剂型，其中所述拮抗剂(如肽拮抗剂)被包封于硬的或软的可溶性容器或明胶外壳中。用于制造胶囊的明胶是从胶原材料通过水解获得的。有两种类型的明胶：A型，通过酸处理来源于猪皮；和B型，通过碱处理获得自骨头和动物皮肤。硬明胶胶囊的使用允许在认为对个体受试者最佳的精确剂量水平下，在使用单独的拮抗剂(例如肽拮抗剂)或其组合间进行选择。硬明胶胶囊由两个部分组成，其中一部分套在(slippingover)另一部分上，因此完全包围着所述的拮抗剂(例如肽拮抗剂)。这些胶囊是通过下述方法填充的：将所述拮抗剂(如肽拮抗剂)或含有所述拮抗剂(如肽拮抗剂)的胃耐受性的珠粒引入所述胶囊的较长端，而后盖上盖子。硬明胶胶囊大部分由明胶、FD&C着色剂制成，有时会加入不透明剂如二氧化钛。美国药典(USP)允许用于此目的的明胶含有0.15％(w/v)的二氧化硫从而防止在制造过程中的分解。

在本发明的上下文中，用于小肠递送的口服剂型组合物还包括液体组合物，该液体组合物中含有防止所述拮抗剂(如肽拮抗剂)在胃中被胃液严重失活的水性缓冲试剂，从而使拮抗剂(如肽拮抗剂)以活性形式到达小肠。可以用于本发明的这种水性缓冲试剂的例子包括碳酸氢盐缓冲剂(pH为5.5-8.7，优选约pH7.4)。

当所述口服剂型组合物为液体组合物时，优选将所述组合物刚好在给药前制备从而将稳定性问题最小化。在此情况下，可以通过将冻干的拮抗剂(如肽拮抗剂)溶解于水性的缓冲剂中来制备所述液体组合物。

一般地，这里使用的含有连蛋白拮抗剂(如肽拮抗剂)的组合物包含药学上有效量的拮抗剂。拮抗剂(如肽拮抗剂)的药学有效量可以根据例如个体的病况、年龄、性别和体重的因素而变化。可以调整给药方案以提供最佳的治疗反应。例如，可以单个丸剂给药，可以若干分开的剂量按时间给药或将所述剂量根据治疗状况的紧急需要的指示来按比例地减少或增加。特别有利的是，以剂量单位形式来配制肠胃外组合物，从而使给药简化及剂量均一。这里使用的剂量单位形式是指适合作为用于被治疗的哺乳动物受试者的均一剂量的物理上离散的单位，每个单位均含有与所需要的药物载体相结合的经计算以产生所期望的治疗效果的预定量的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格取决于且直接依赖于：(a)所述活性化合物的独特性质及所要取得的特定的治疗效果，和(b)在配合这样的活性化合物的技术领域中对于个体中的敏感性治疗的固有局限性。

通常，本发明中使用的拮抗剂化合物的量(例如用于减缓胰β-细胞的丢失、用于防止胰β-细胞的丢失和/或用于再生胰β-细胞)是在约7.5μM到7.5mM范围内，优选为约7.5μM到0.75mM。为了在例如肠道或血液中获得这样的最终浓度，在本发明的单一剂量组合物中拮抗剂(例如肽拮抗剂)的量一般为按每千克受试者体重计约50ng到约10μg、约250ng到约10μg、约500ng到约10μg、约1μg到约10μg、约2μg到约10μg、约3μg到约10μg、约4μg到约10μg、约5μg到约10μg、约50ng到约5μg、约250ng到约5μg、约500ng到约5μg、约1μg到约5μg、约2μg到约5μg、约3μg到约5μg、约4μg到约5μg、约50ng到约3μg、约250ng到约3μg、约500ng到约3μg、约1μg到约3μg或约2μg到约3μg。

本发明的组合物可以包含一种或更多种药学上可接受的载体。这里使用的“药学上可接受的载体”包含任何及所有生理相容性的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌试、等渗和吸收延迟剂等。在一个实施方案中，所述载体适合用于肠胃外给药。载体可以适合给药至中枢神经系统(例如脊柱内或脑内)。可选择地，所述载体可以适合静脉内、腹腔内或肌肉内给药。在另一个实施方案中，所述载体适合口服给药。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于临时配制无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。这种用于药学上活性物质的介质和试剂的使用在本领域中是众所周知的。除非任何常规介质或试剂与所述活性化合物不相容，其在本发明药物组合物中的使用是被期待的。补充的活性化合物也可以掺入组合物中。

以下的实施例仅仅为说明的目的而提供，并且不以任何方式意在限制本发明的范围。

实施例1

连蛋白的肽拮抗剂

考虑到ZOT、人肠内连蛋白(连蛋白_i)和人心脏连蛋白(连蛋白_h)均作用于肠(Fasano等人，Gastroenterology，112：839(1997)；Fasano等人，J.Clin.Invest.96：710(1995)和内皮tj，并且所有这三者都具有相似的局部作用(Fasano等人，(1997)，这符合ZOT受体在肠内的分布(Fasano等人，(1997)，supra；和Fasano等人，(1995)，supra)，在1998年8月3日提交的序列号为09/127,815的美国专利申请中假设这三种分子与相同的受体结合位点相互作用。因此，对ZOT和人连蛋白的一级氨基酸结构进行了比较从而提供对涉及肠tj调节的受体-配体相互作用对绝对结构要求的认识。这些分子N端的分析显示存在如下共同基序(图1中框出的氨基酸残基8-15)：非极性的(肠中为Gly，脑中为Val)、可变的、非极性的、可变的、非极性的、极性的、可变的、极性的(Gly)。8位的Gly、12位的Val及13位的Gln，所有这些在ZOT、连蛋白和连蛋白_h中是高度保守的(见图1)，这被认为对于在肠中受体结合功能是关键性的。为了证实上述结论，化学合成了合成八肽Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly(SEQ ID NO：15)(将其命名为FZI/O，对应于人胎儿连蛋白的第8-15位氨基酸残基)。

接下来，如下所述，将安放于尤斯室中的兔回肠单独地暴露于100μg的FZI/O(SEQ ID NO：15)、100μg的FZI/1(SEQ ID NO：29)、1.0μg的6xHis-ZOT(如在1998年8月3日提交的序列号为09/127,815的美国专利申请的实施例1中所述的那样获得)、1.0μg的连蛋白_i(如在1998年8月3日提交的序列号为09/127,815的美国专利申请的实施例3中所述的那样获得)或1.0μg的连蛋白_h(如在1998年8月3日提交的序列号为09/127,815的美国专利申请的实施例3中所述的那样获得)；或者预先将其暴露于100μg的FZI/O或FZI/1中20分钟，此时加入1.0μg的6xHis-ZOT、1.0μg的连蛋白_i或1.0μg的连蛋白_h。由Rt＝PD/I_SC计算得出ΔRt，其中PD＝电位差，I_SC＝短路电流。结果在图2中示出。

如图2所示，FZI/O未诱发Rt的任何显著变化(与阴性对照相比为0.5％)(见填充柱)。与此相反，以FZI/O预先处理20分钟分别使得ZOT、连蛋白_i、连蛋白_h对Rt的作用降低了75％、97％和100％(见未遮盖柱)。同样如图2所示，当使用第二种合成肽(FZI/1，SEQ ID NO：29)时，这种抑制作用被完全消除(见阴影柱)，所述第二种合成肽是通过将8位的Gly、12位的Val和13位Gln(参照连蛋白_i)用连蛋白_b的相应氨基酸残基(分别为Val、Gly和Arg，见SEQ ID NO：30)改变来化学合成的。以上结果证明，在ZOT与连蛋白家族的N末端的8位和15位残基间存在一种区域跨越(region spanning)，此种区域跨越对于与靶受体的结合是关键性的，并且在8、12和13位上的氨基酸残基决定了这种结合的组织特异性。

实施例2

糖尿病大鼠模型

肠通透性的改变已经显示出是与糖尿病的发病相关的前期生理变化之一(Meddings，Am.J.Physiol，276：G951-957(1999))。细胞间转运和肠通透性是由细胞内tj经由尚未完全阐明的机制来调节的。

连蛋白及其原核细胞类似物ZOT二者均通过调节tj改变肠通透性。在此实施例中，首次证实了连蛋白相关的tj损伤涉及糖尿病的发病机理；以及通过给予连蛋白的肽拮抗剂来预防糖尿病或延缓糖尿病的发病。

最初，评估了两种遗传品种，即BB/Wor糖尿病易感性(DP)大鼠和糖尿病抗性(DR)大鼠(Haber等人，J.Clin.Invest.，95：832-837(1993))，以确定它们是否呈现出连蛋白腔内分泌和肠通透性的显著改变。

更具体地，处死年龄匹配的DP和DR大鼠(年龄为20，50，75，和＞100天)。将所述大鼠处死后，将25G的针置于回肠腔内，使用林格溶液来进行灌洗肠道以确定腔内连蛋白的存在。连蛋白浓度是使用如下的夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)来评估的：

将塑料微量滴定板(Costar，Cambridge，MA)以多克隆兔抗ZOT抗体(如在1998年8月3日提交的序列号为09/127,815的美国专利申请的实施例2中所述的那样获得)(稀释度1∶100)包被，于4℃过夜，用含有0.05％(v/v)吐温20的PBS洗涤3次，然后在室温下用300μl含有0.1％(v/v)吐温20的PBS孵育15分钟来阻断。接下来，将纯化的人肠连蛋白(如在1998年8月3日提交的序列号为09/127,815的美国专利申请的实施例3中所述的那样获得)包被于平板上。

通过将连蛋白在含有0.05％(v/v)吐温20的PBS中稀释至不同浓度来得到标准曲线，所述的不同浓度为0.78ng/ml，1.56ng/ml，3.125ng/ml，6.25ng/ml，12.5ng/ml，25ng/ml和50ng/ml。

将每一标准浓度的样本各100μl或100μl肠道灌洗样本用吸量管转移至孔中，使用平板摇床在室温下孵育1小时。使用PBS洗去未被结合的连蛋白，将所述孔于室温下与100μl用碱性磷酸酯偶联的抗ZOT抗体孵育1小时。用PBS洗掉未结合的偶联物，并通过下述方法进行显色反应：首先加入在0.1M Tris-HCl(pH7.3)、1.0mM MgCl₂、1.0％(w/v)BSA中1/20000稀释的Extra-Avidin(SIGMA，St.Louis，MO)100μl经过15分钟，然后将每一孔用100μl含有1.0mg/ml对硝基苯基磷酸酯底物(SIGMA，St Louis，MO)的溶液于37℃下孵育30分钟。使用酶免疫分析读出器(enzymeimmunoassay reader)在405nm处读取吸光度。

为了评估ELISA夹心法的批内和批间的精确性，使用来自于含有不同浓度连蛋白的两个样本的连续三天的三个重复数据来计算出变异系数(CV)。ELISA夹心法的批间测试得到的CV值为9.8％。批内测试的CV值为：第一天4.2％，第二天3.3％和第三天2.9％。

将在肠道灌洗中检测的连蛋白浓度以ng/mg蛋白表示，并通过暴露表面积(mm²)来标准化。结果显示于图3。

如图3所示，首先观察到在糖尿病易感性大鼠(年龄为50天)中腔内连蛋白的4倍增长(第二个柱)。发现腔内连蛋白的增加与肠通透性的增加相关。这种腔内连蛋白的增加在糖尿病易感大鼠中保持在高水平，且发现其与向完全的糖尿病的发展相关。值得注意的是，糖尿病易感性大鼠(年龄为100天)的腔内连蛋白没有增加。这是值得注意的，因为该大鼠未发展为糖尿病。该大鼠的血糖水平正常。因此，连蛋白与I型糖尿病的发病机理相关的通透性变化有关。该连蛋白分泌的增加是年龄相关性的，并可引致糖尿病的发病。

接下来，为了证实糖尿病可以通过给药连蛋白的肽拮抗剂来预防，将获得自Biomedical Research Models，Inc.(Rutland，MA)的BB/Wor大鼠(年龄21-26天)随机分为两组(每组n＝5)，即治疗组和对照组。两组都维持使用大鼠饲料的标准食谱(standard diet of rat chow)(Harlan Teklab Diet#7012)。所有的食物和水都预先进行高压灭菌。每天供给100ml清水，并测量日饮水量。治疗组接受添加在饮水中的10μg/ml连蛋白肽拮抗剂(SEQ ID NO：15)。将大鼠装在高效空气过滤器(hepa-filter)笼里。

对所述大鼠中的糖尿病诊断如下：将大鼠每周称重两次。每周使用OneTouch

葡萄糖监测系统(Johnson&Johnson)来测定血糖。每周使用验尿试纸条来监测葡萄糖(Diastix

)和酮类(Ketositx

)(Bayer)。将血糖＞250mg/dl的大鼠禁食过夜，并且将血糖水平＞200mg/dl的大鼠认为是糖尿病患者。这些规范与由Biomedical Research Models Inc.提供的数据一致。结果示于图4。

如图4所示，80％的对照组大鼠(4/5)和40％的经连蛋白肽拮抗剂治疗的大鼠(2/5)在年龄为80天时发生了糖尿病。连蛋白分泌的变化与糖尿病的发病平行。

在糖尿病临床症状出现后，将大鼠如下处死：用盐酸氯苯胺麻醉大鼠，并切割能够进入心脏的正中切口。将18G针置于心脏，并通过放血来致死。然后，如上所述进行连蛋白分析。至于未出现糖尿病的大鼠，所述研究在年龄为80天时截止。根据生物医学研究模型公司(Biomedical ResearchModels，Inc.)，80％的糖尿病易感性大鼠在年龄为80天时出现糖尿病。连蛋白分析的结果示于图5。

如图5所示，观察到未用连蛋白肽拮抗剂治疗的患糖尿病大鼠的腔内连蛋白增加，这与图3中示出的结果一致。进而，与未发生糖尿病的糖尿病易感性大鼠(DP-treated)和对照(DP-untreated)大鼠相比，发生糖尿病的大鼠(DR)的腔内连蛋白增加了2到4倍。未发生糖尿病的非糖尿病对照大鼠的连蛋白水平可以忽略，与图3中示出的连蛋白水平一致。此外，两只尽管经过连蛋白肽拮抗剂治疗却发生糖尿病的糖尿病易感性大鼠显示出明显高于被成功治疗的大鼠和未经治疗的对照大鼠的腔内连蛋白水平。该连蛋白水平已足以引发发展为糖尿病所需的通透性变化，但是ZOT/连蛋白受体已被肽拮抗剂有效地阻断。

在糖尿病临床症状出现后，还将处死大鼠的肠组织安放于尤斯室中以评价体外通透性的变化。

更具体地，从处死的大鼠中分离得到空肠和回肠的切片(sections)，并将肠内容物清洗干净。制备每一肠段的6个切片，并置入有机玻璃尤斯室(0.33cm²开口)中，连接至电压钳装置(EVC4000；World PrecisionInstruments，Saratosa，FL)，以新鲜配制的含有53mM NaCl、5.0mM KCl、30.5mM Na₂SO₄、30.5mM甘露醇、1.69mM Na₂PO₄、0.3mM NaHPO₄、1.25mM CaCl₂、1.1mM MgCl₂和25mM NaHCO₃(pH7.4)的缓冲液浴洗。使用连接于恒温循环泵的水夹套储器(water-jacketed reservoir)将浴洗溶液保持在37℃，并向其中通入含95％O₂和5％CO₂的气体。测量电位差，使用如Fasano等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，88：5242-5246(1991)所描述的方法来计算短路电流和组织阻力。结果显示于图6-7。

如体外尤斯室通透性研究所证实的以及图6所显示的，所有发展为糖尿病的大鼠都有肠通透性的增加。糖尿病抗性(DR)大鼠在细胞间通透性上没有可察觉到的变化(第一个柱)。未经治疗的糖尿病易感性大鼠(DP-未治疗的；第二个柱)具有空肠和回肠的细胞间通透性的显著增加。更重要的是，使用连蛋白肽拮抗剂治疗的糖尿病易感性大鼠(DP-经治疗的；第三个柱)在小肠仅限于空肠的部分，细胞间通透性显著增加。然而，如图6所示，用连蛋白肽拮抗剂预先处理防止了在回肠末端发生这些变化。因此，与发病机理相关的细胞间通透性的变化限于回肠。而且，如图6所示，结肠的通透性无显著变化，这与连蛋白受体分布的区域性分布一致。

通过发生了(DP-D)或未发生(DP-N)糖尿病的未经治疗的糖尿病易感性大鼠的小肠体外肠通透性的比较，进一步确认了这些结果(图7)。尽管未观察到在DP-D和DP-N大鼠之间的空肠Rt的显著变化，但是与DP-N大鼠相比，观察到DP-D大鼠的回肠粘膜的Rt明显更低(图7)。

因此，可以得出如下结论：(1)所述肽拮抗剂能够有效地阻断糖尿病发生所需的通透性变化；且(2)在那些用所述肽拮抗剂治疗的大鼠中，腔内连蛋白水平比经过治疗而未患糖尿病的大鼠高3倍。在经过治疗却发生了糖尿病的大鼠当中，肽拮抗剂的量可能不足以阻断足够数目的、防止糖尿病必需的ZOT/连蛋白受体。

60％的经治疗的大鼠未发生糖尿病。在这些大鼠中，所述连蛋白肽拮抗剂有效地防止了糖尿病发病必需的肠通透性的增加。如图5所示，经治疗的大鼠的肠连蛋白水平与未治疗的对照大鼠是相当的，但是因为连蛋白肽拮抗剂的存在，其小肠的整体通透性不足以改变至引发发展为糖尿病必需的病理生理变化。有趣的是，如图5所示，一只未发生糖尿病的对照动物具有可以忽略不计的连蛋白水平，进一步支持了连蛋白在糖尿病发病机理中的作用。

因此，BB/Wor大鼠糖尿病发病机理的早期事件涉及连蛋白介导的肠细胞间通透性的改变。此外，使用连蛋白的肽拮抗剂来抑制连蛋白信号系统防止了或至少延缓了糖尿病的发病。

实施例3

β-细胞的再生

使用连蛋白肽拮抗剂AT1001(SEQ ID NO：15)来治疗52-54日龄的糖尿病易感性大鼠试验组，同时对与其年龄相当的对照组不予治疗。在此时给予所述拮抗剂，因为这些大鼠在40天时显示出连蛋白水平的升高且在50天时可检测到自身免疫性抗体。这样，治疗开始于糖尿病发病之后。

将日龄为52-54的BBDP动物分为两组。组1(n＝20)每天在饮用水+HCO₃中摄入AT-1001。组2(n＝10)摄入饮用水+HCO₃。在治疗阶段T0期内以盲选方式(in a blinded fashion)随机地选择动物，使其或接受安慰剂或在饮水供应中以合成的连蛋白肽抑制剂AT-1001(SEQ ID NO：15)进行治疗。在此疾病的末期(空腹血糖＞250mg/dl)，将发生了T1D的BBDP大鼠(安慰剂组中的发病率为60％，平均日龄110天)处死，收集其血液和组织样本。将未发生T1D的经AT-1001治疗的大鼠在日龄为120天时重新随机分为两组：a)停药阶段(drug withdrawal arm)，b)继续用AT-1001治疗；在治疗阶段T1(during treatment arm T1)中另外的100天里对其继续观察。在研究的开始和结束时检测血清连蛋白和自身抗体的水平。每天监测水的摄入，同时每周检查体重增加和血清葡萄糖水平。空腹血糖＞250mg/dl的大鼠被认为患糖尿病并且将其在达到糖尿病患病状态的24小时内处死。

在未经治疗的对照组中，10只大鼠中的6只发生了糖尿病而治疗组中的20只大鼠中只有7只发生了糖尿病(图13)。120天后，对一半未发生糖尿病的治疗组大鼠停止治疗。有1/3的停止治疗动物发生了糖尿病，而继续治疗的动物则无一发生糖尿病。

胰腺样品取自在第52-54天开始治疗的动物并进行检验。在图9中示出了组织学检验的结果，并且在图10中示出了免疫组织学检验的结果。在发生了糖尿病的动物中，组织学检验显示β-细胞已经被破坏(图9，上方图片)。相反，来自于未发生糖尿病的动物的样本中含有β-细胞，且观察到β-细胞再生的迹象(图9，下方图片)。

为了证实在组织学分析中观察到的所述细胞的一致性，进行了免疫组织学检验。用特异于胰高血糖素产生性(glucon-producing)δ细胞的抗胰高血糖素抗体或用特异于胰岛素产生性β细胞的抗胰岛素抗体对胰腺进行顺序染色。该分析的结果示于图10。当使用抗胰岛素抗体来染色未经治疗的胰腺时，未检测到信号。这与T1D中β-细胞的损伤一致。这些细胞用抗胰高血糖素抗体染色，鉴定了胰高血糖素产生性的δ细胞。正常胰岛为条形结构，具有包含δ细胞的胰岛外侧和含有β-细胞的胰岛内侧。δ细胞的染色图像表明胰岛因为β-细胞的损伤而发生塌陷(图10A和B)。相反，来自于经治疗动物的胰腺显示出胰岛素产生性细胞的存在(图10C)。图10D的抗胰高血糖素抗体染色图像表明该胰岛的结构更为正常。

图11和12提供了β-细胞再生的证据。图11示出了对分离自发生了T1D的未经治疗的BBDP大鼠(图片A和B)和未发生T1D的经AT-1001治疗的大鼠(图片C-F)的胰腺进行免疫组织化学分析的结果。来自于发生了T1D的大鼠的胰岛显示出典型的无胰岛素染色的塌陷面(A)和保留下来的胰高血糖素产生性δ细胞群(B)。相反，经AT1001治疗的动物显示出其胰岛或者未被损伤(C和D)或是显示出从特征在于在胰岛素和胰高血糖素产生性细胞之间的边界不规则性的胰岛炎损伤中恢复的迹象(E和F)。图12显示了更高放大倍数的图11E和11F。由于损伤后β-细胞的再生，发生δ细胞对胰岛的渗入(图12D)。

在临床前自身免疫阶段，对BBDP大鼠连蛋白途径的阻断显著降低了T1D的发展，最长至日龄205天(治疗后150天)。T1D发病率的这种降低是与经AT1001治疗后抗谷氨酸脱羧酶(GAD)抗体的显著降低相关的(图14)。在研究期间，AT1001治疗不影响血清连蛋白水平(图15)。停止AT1001治疗后，33％的动物T1D发病。与显示出T1D典型的末期胰岛损伤的未经治疗的大鼠相比，经AT1001治疗的BBDP大鼠显示出正常的胰岛组织学或者其胰岛显示出从胰岛炎中恢复的迹象。总之，这些数据提示，即使自身免疫过程已经开始，AT1001仍然能够中止和恢复BBDP大鼠中的胰岛损伤。

虽然已经参照具体的实施方式详细地描述了本发明，但对于本领域的普通技术人员而言显而易见的是，可对本发明做出各种变化和修改而不背离本发明的精神和范围。

序列表

<110>Fasano，Alessio

Sapone，Ana

Paterson，Blake

<120>使用连蛋白的拮抗剂防止胰细胞丢失或再生胰细胞的方法

<130>22298.00009

<150>60/688,693

<151>2005-06-09

<160>33

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>1

Gly Arg Val Cys Val Gln Pro Gly

1 5

<210>2

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>2

Gly Arg Val Cys Val Gln Asp Gly

1 5

<210>3

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>3

Gly Arg Val Leu Val Gln Pro Gly

1 5

<210>4

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>4

Gly Arg Val Leu Val Gln Asp Gly

1 5

<210>5

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>5

Gly Arg Leu Cys Val Gln Pro Gly

1 5

<210>6

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>6

Gly Arg Leu Cys Val Gln Asp Gly

1 5

<210>7

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>7

Gly Arg Leu Leu Val Gln Pro Gly

1 5

<210>8

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>8

Gly Arg Leu Leu Val Gln Asp Gly

1 5

<210>9

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>9

Gly Arg Gly Cys Val Gln Pro Gly

1 5

<210>10

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>10

Gly Arg Gly Cys Val Gln Asp Gly

1 5

<210>11

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>11

Gly Arg Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5

<210>12

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>12

Gly Arg Gly Leu Val Gln Asp Gly

1 5

<210>13

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>13

Gly Gly Val Cys Val Gln Pro Gly

1 5

<210>14

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>14

Gly Gly Val Cys Val Gln Asp Gly

1 5

<210>15

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>15

Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly

1 5

<210>16

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>16

Gly Gly Val Leu Val Gln Asp Gly

1 5

<210>17

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>17

Gly Gly Leu Cys Val Gln Pro Gly

1 5

<210>18

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>18

Gly Gly Leu Cys Val Gln Asp Gly

1 5

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<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>19

Gly Gly Leu Leu Val Gln Pro Gly

1 5

<210>20

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>20

Gly Gly Leu Leu Val Gln Asp Gly

1 5

<210>21

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>21

Gly Gly Gly Cys Val Gln Pro Gly

1 5

<210>22

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>22

Gly Gly Gly Cys Val Gln Asp Gly

1 5

<210>23

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>23

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5

<210>24

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>24

Gly Gly Gly Leu Val Gln Asp Gly

1 5

<210>25

<211>20

<212>PRT

<213>智人

<400>25

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu

20

<210>26

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>26

Val Thr Phe Tyr Thr Asp Ala Val Ser

1 5

<210>27

<211>20

<212>PRT

<213>智人

<220>

<221>misc_特征

<222>(16)..(16)

<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>27

Met Leu Gln Lys Ala Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly Xaa

1 5 10 15

Ser Asn Arg Leu

20

<210>28

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<220>

<221>misc_特征

<222>(10)..(10)

<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>28

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Xaa Leu

1 5 10

<210>29

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>29

Val Gly Val Leu Gly Arg Pro Gly

1 5

<210>30

<211>8

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>合成肽

<400>3O

Val Asp Gly Phe Gly Arg Ile Gly

1 5

<210>31

<211>22

<212>PRT

<213>智人

<220>

<221>misc_特征

<222>(1)..(1)

<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>31

Xaa Gly Lys Val Lys Val Gly Val Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg

1 5 10 15

Ile Gly Arg Leu Val Ile

20

<210>32

<211>20

<212>PRT

<213>智人

<400>32

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu

20

<210>33

<211>13

<212>PRT

<213>霍乱弧菌

<400>33

Phe Cys Ile Gly Arg Leu Cys Val Gln Asp Gly Phe Val

1 5 10

Claims

1. 一种在有需要的受试者中减缓胰β-细胞的丢失的方法，该方法包括：向所述受试者给予含有连蛋白拮抗剂的组合物。

2. 根据权利要求1的方法，其中所述组合物进一步含有增强细胞生长的因子。

3. 根据权利要求2的方法，其中所述因子为生长因子。

4. 根据权利要求2的方法，其中所述因子选自表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子-2(BFGF-2)、角质细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子/扩散因子(HGF/SF)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、毒蜥外泌肽-4、胰岛/十二指肠同源框-1(IDX-1)、β-动物纤维素、激活蛋白A、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、胃泌素及其组合。

5. 一种在有需要的受试者中再生胰β-细胞的方法，该方法包括：向所述受试者给予连蛋白拮抗剂和细胞。

6. 根据权利要求5的方法，其中所述细胞为胰岛细胞。

7. 根据权利要求5的方法，其中所述细胞为β-细胞。

8. 根据权利要求5的方法，其中所述细胞为干细胞。

9. 根据权利要求5的方法，其中将所述拮抗剂和所述细胞同时给予。

10. 根据权利要求5的方法，其中将所述拮抗剂和所述细胞不同时给予。

11. 根据权利要求5的方法，该方法进一步包括给予增强细胞生长的因子。

12. 根据权利要求11的方法，其中所述因子为生长因子。

13. 根据权利要求12的方法，其中所述因子选自表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子-2(BFGF-2)、角质细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子/扩散因子(HGF/SF)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、毒蜥外泌肽-4、胰岛/十二指肠同源框-1(IDX-1)、β-动物纤维素、激活蛋白A、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、胃泌素及其组合。

14. 一种在有需要的受试者中再生胰β-细胞的方法，该方法包括：在允许β-细胞复制的条件下，给予所述受试者连蛋白拮抗剂。

15. 根据权利要求14的方法，该方法进一步包括给予增强细胞生长的因子。

16. 根据权利要求14的方法，其中所述因子为生长因子。

17. 根据权利要求14的方法，其中所述因子选自表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子-2(BFGF-2)、角质细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子/扩散因子(HGF/SF)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、毒蜥外泌肽-4、胰岛/十二指肠同源框-1(IDX-1)、β-动物纤维素、激活蛋白A、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、胃泌素及其组合。

18. 一种在有需要的受试者中再生胰β-细胞的方法，该方法包括：向所述受试者给予连蛋白拮抗剂和向所述受试者中植入细胞。

19. 根据权利要求18的方法，其中所述细胞为胰岛细胞。

20. 根据权利要求18的方法，其中所述细胞为β-细胞。

21. 根据权利要求18的方法，其中所述细胞为干细胞。

22. 根据权利要求18的方法，其中将所述拮抗剂在植入所述细胞之前给予所述受试者。

23. 根据权利要求18的方法，其中将所述拮抗剂在植入所述细胞之后给予所述受试者。

24. 根据权利要求18的方法，其中将所述拮抗剂在植入所述细胞之前和之后均给予所述受试者。

25. 根据权利要求18的方法，该方法进一步包括给予增强细胞生长的因子。

26. 根据权利要求18的方法，其中所述因子为生长因子。

27. 根据权利要求18的方法，其中所述因子选自表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子-2(BFGF-2)、角质细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子/扩散因子(HGF/SF)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、毒蜥外泌肽-4、胰岛/十二指肠同源框-1(IDX-1)、β-动物纤维素、激活蛋白A、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、胃泌素及其组合。

28. 根据权利要求25的方法，其中将所述因子在植入所述细胞之前给予所述受试者。

29. 根据权利要求25的方法，其中将所述因子在植入所述细胞之后给予所述受试者。

30. 根据权利要求25的方法，其中将所述因子在植入所述细胞之前和之后均给予所述受试者。

31. 一种治疗自身免疫性疾病的方法，该方法包括：给予防止解剖学屏障的通透性增加的化合物。

32. 根据权利要求31的方法，其中所述防止解剖学屏障的通透性增加的化合物是增加解剖学屏障通透性的正常的生理学化合物的拮抗剂。

33. 根据权利要求31的方法，其中所述化合物是连蛋白拮抗剂。

34. 根据权利要求33的方法，其中所述连蛋白拮抗剂包括SEQ IDNO：15。

35. 根据权利要求31的方法，其中所述化合物选自SEQ IDs 1-24。