PT2013332E

PT2013332E - Terapia celular: um método e uma composição para tratamento da diabetes

Info

Publication number: PT2013332E
Application number: PT07760776T
Authority: PT
Inventors: Vladislav Broytman; Nikanor Broytman; Nikolay Skaletskiy
Original assignee: Philadelphia Medical Scient Ct L L C
Priority date: 2006-04-17
Filing date: 2007-04-17
Publication date: 2012-02-20
Also published as: US20080267925A1; IL194796A; EP2013332A2; CA2649706A1; EP2013332A4; NZ572839A; WO2007121438A3; CA2649706C; ES2377464T3; AU2007237934A1; EP2013332B1; CY1112307T1; US9574180B2; WO2007121438A2; US20150284687A1; ZA200809767B; RU2008145053A; IL194796A0; HK1127086A1; AU2007237934B2

Description

ΕΡ 2 013 332/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Terapia celular: um método e uma composição para tratamento da diabetes"

ANTERIORIDADE DA INVENÇÃO

1. CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método de terapia celular e a uma composição para transplantação de células beta dos ilhéus isoladas e cultivadas a partir de pâncreas de animais para promover a produção natural de insulina entre pessoas com diabetes.

2. DESCRIÇÃO DO ESTADO DA TÉCNICA A diabetes tipo 1 afecta mais de um milhão de americanos. A diabetes tipo 1 é a forma mais grave da doença, em que o sistema imunitário do corpo ataca as células produtoras de insulina necessária para manter o açúcar no sangue em níveis normais. Sabe-se que um nível extremamente baixo de açúcar no sangue pode resultar em convulsões, deficiência cognitiva ou inconsciência. Nos casos mais graves, as complicações não são bem controladas pela insulina.

Idealmente, a substituição de células produtoras de insulina no pâncreas pode libertar os diabéticos de injecções

de insulina ao longo da vida e curar eficazmente a doença. A transplantação destas células dos "ilhéus" pode hoje ser realizada de duas maneiras, através do transplante do pâncreas completo ou através de um processo menos invasivo e menos dispendioso de injecção somente das células dos ilhéus. Foi demonstrado que a transplantação bem sucedida do pâncreas é eficaz para melhorar significativamente a qualidade de vida das pessoas com diabetes, principalmente eliminando a necessidade de insulina exógena e as frequentes medições diárias da glucose no sangue (Pancreas Transplantation for Patients with Type I Diabetes. Diabetes Care. 25 (Suplemento 1): Slll. January 2002). Contudo, os transplantes do pâncreas requerem uma terapia de imunossupressão para o resto da vida para evitar a rejeição do enxerto e a potencial recorrência do 2 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ processo auto-imune que pode destruir as células dos ilhéus pancreáticos.

Mostrou-se que a transplantação de células beta dos ilhéus a partir de pâncreas de dadores promove a produção natural de insulina entre pacientes com diabetes tipo 1 e tipo 2 (veja-se Sperling, M.A. Type 1 Diabetes: Etiology and Treatment. Totowa, NJ: Humana Press Inc. 2003. p. 529-552; Insulin Therapy. In: Edelman, S.V. e Henry, R.R.

Diagnosis and Management of Type 2 Diabetes. Caddo, OK: Professional Communications, Inc. 2002. p. 121-148). A transplantação de células dos ilhéus pode ser realizada na forma de um procedimento percutâneo minimamente invasivo, em que as células dos ilhéus são infundidas no fígado através da veia porta. Contudo, como outros pacientes de transplantes, os beneficiários de ilhéus têm que tomar fármacos imunossupressores para evitar a rejeição das células estranhas.

Xenoenxertos ou xenotransplantes de células dos ilhéus derivadas de porco ou de vaca têm sido estudados e mostrou-se que requerem imunossupressão. A capacidade de células beta pré-cultivadas de pâncreas de coelhos recém-nascidos sobreviverem e funcionarem activamente no organismo de beneficiários xenogénicos foi demonstrada por nós em experiências em ratos com diabetes mellitus induzida experimentalmente. (Skaletsky N.N. e outros. 1994 {4}). Há um efeito antidiabético expresso e de longa duração (8 semanas - tempo da experiência) da xenotransplantação de culturas de células dos ilhéus como em casos de administração na cavidade abdominal e no baço, e também em casos de administração no músculo abdominal transverso. Após as experiências, foram conduzidos testes histológicos que no local da introdução de xenotransplantes encontraram células dos ilhéus com estrutura preservada e sem sinais de imunorreacção celular. Ao mesmo tempo, foram detectados sinais claros de regeneração das células beta próprias nos pâncreas de animais beneficiários. Para além de um efeitos redutor dos açúcares bem definido, foi notado um efeito médico-profiláctico bem definido da xenotransplantação de culturas de células dos ilhéus na complicação tardia 3 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ distintiva da diabetes - Nefropatia, - durante as experiências (Skaletskaya G.N. e outros (2005 {4}).

Em RU 2135193 de Skaletsky et al. divulga-se a obtenção de células beta dos ilhéus de pâncreas de coelho recém-nascido e métodos de transplantação. As células beta são obtidas por migração a partir de fragmentos pancreáticos num método de cultura que requer a adição de soro a um meio de cultura. Rush et al. (2004 {18}) divulgam a conservação de ilhéus pancreáticos humanos em meio isento de soro durante até 6 meses. As células beta dos ilhéus obtidas pelo referido método eram funcionais em ratinhos imunocomprometidos.

Assim, apesar dos desenvolvimentos correntes, são necessárias células dos ilhéus de fontes diferentes que não requeiram imunossupressão.

Todas as referências aqui citadas são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Deste modo, um aspecto da invenção compreende um método de obtenção de células beta dos ilhéus dos pâncreas de coelhos, o método compreendendo: (a) colheita dos referidos pâncreas de coelhos recém-nascidos e colocação dos pâncreas numa solução salina compreendendo um antibiótico a uma temperatura de 4-10°C; (b) obtenção de microfragmentos pancreáticos picados a partir dos referidos pâncreas; e (c) incubação dos referidos microfragmentos pancreáticos picados num meio isento de soro a uma primeira temperatura de incubação de 36, 6°C a 37°C durante 6 a 10 dias com 0% a 5% de CO2 durante um primeiro período de incubação e substituindo periodicamente o meio isento de soro e removendo células indesejadas espontaneamente destruídas compreendendo células exócrinas e células sanguíneas e elementos de tecido conjuntivo até pelo menos 80% das células remanescentes serem células beta dos ilhéus; (d) e incubação dos referidos microfragmentos pancreáticos picados no referido meio isento de soro a uma segunda temperatura de incubação de 22°C a 29°C durante 4 a 5 dias durante um segundo período de incubação até pelo menos 78-90% das células remanescentes serem células beta dos ilhéus, em que o referido meio isento de soro é 4 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ opcionalmente substituído periodicamente, e desse modo obtendo células beta dos ilhéus.

Outro aspecto da invenção compreende uma composição compreendendo células beta dos ilhéus obtidas de pâncreas de coelho, em que células beta dos ilhéus são isoladas seguindo um regime seleccionado de temperaturas de incubação de microfragmentos pancreáticos picados obtidos a partir dos referidos pâncreas de coelho e cultivadas num meio isento de soro de acordo com o método da invenção descrito acima e em que as células beta dos ilhéus isoladas são obtidas numa quantidade de contagem de células de 1 500 000 ± 100 000 e têm uma viabilidade de pelo menos 80%, e um transportador farmaceuticamente aceitável. O transportador farmaceuticamente aceitável adequado na presente invenção pode incluir qualquer substância adequada tal como líquidos, géis e sólidos que possam ser combinados com a composição e sejam reconhecidos quanto à sua segurança na administração a mamíferos.

Em certas concretizações, a composição compreende pelo menos 50% de células beta dos ilhéus.

Em certas concretizações, a composição compreende pelo menos 78% de células beta dos ilhéus.

Outro aspecto da invenção compreende a utilização da composição acima descrita para promover a produção natural de insulina, o método compreendendo: preparação da composição da reivindicação 6 compreendendo as células beta dos ilhéus isoladas e cultivadas a partir de pâncreas de coelho; e administração da composição da reivindicação 6 a um indivíduo com necessidade de insulina e portanto promoção da produção natural de insulina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 0 método de cultura da invenção inclui a utilização de um regime seleccionado de temperaturas de incubação para microfragmentos pancreáticos picados obtidos de um coelho e cultivados num meio isento de soro. Seguindo o método da invenção, obtém-se uma preparação pura de células beta dos ilhéus viáveis e activas, que podem ser transplantadas com 5 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ sucesso em pacientes diabéticos sem utilização de nenhuma imunossupressão. 0 método de cultura da invenção proporciona condições favoráveis para as células beta pancreáticas e cria condições desfavoráveis para células balastro e imunogénicas (denominadas células passageiras) tais como, por exemplo, exócrinas, endoteliais, dendriticas e linfócitos. A eliminação de todas estas células passageiras proporciona uma redução significativa da imunogenicidade das células dos ilhéus cultivadas. Contrariamente à crença comum de que o cultivo de longo prazo de células requeria a adição de um suplemento de soro ao fluido de cultura, o inventor verificou que a utilização de meios isentos de soro no método da invenção favorece o crescimento de células beta dos ilhéus desejáveis e desfavorece o crescimento de células passageiras indesejadas e portanto proporciona células beta dos ilhéus viáveis e activas numa quantidade com valor comercial, em que essas células estão substancialmente isentas de células passageiras indesej adas.

Sem comprometimento com uma teoria particular, os inventores crêem que também ocorre perda de antigénios de superfície, uma vez que havia uma notável ausência de reacção imunitária apesar da ausência de qualquer tipo de terapia imunossupressora antes e após a xenotransplantação clínica de células dos ilhéus. Uma vez que a cultura altamente refinada de células beta preparada pelo método da invenção não contém células relacionadas com vasos de dadores, então não há rejeição de células beta xenotransplantadas.

Foi determinada pelos inventores uma combinação sinérgica de células, soluções e condições. Isto é realizado por alteração do ambiente, e.g., colocação da cultura numa incubadora com 02 vs. incubadora com 5% de C02, variação da temperatura e intervalos de tempo na incubadora ao longo de um período de 10 - 14 dias. Não se utilizaram quaisquer manipulações genéticas. A técnica de cultura e as técnicas de transplantação intramuscular da cultura de células dos ilhéus serão agora descritas em detalhe. Os coelhos são colhidos e submergidos em 6 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ etanol a 40-96%, preferivelmente etanol a 70% até ser registada a morte, e.g., durante até 10 min, preferivelmente 7-8 min. Em condições estéreis, o pâncreas é removido da cavidade abdominal de um coelho recém-nascido (o termo "recém-nascido" como aqui se utiliza, inclui coelhos desde o momento do nascimento até coelhos com 5 dias de idade que não foram expostos a leite materno, preferivelmente recém-nascidos são coelhos com até 12 h de idade) e imediatamente é colocado numa caixa de Petri com solução salina de Hank fria (e.g., 4-6°C) ou solução fisiológica (NaCl) e antibióticos (e.g., 1000 unidades/ml de penicilina e 10 000 mg/ml de estreptomicina). Com o auxilio de pinças oftálmicas, é removida a cápsula do pâncreas; são removidos vasos e duetos excretórios. Em seguida, o pâncreas é cortado com uma tesoura oftálmica em microfragmentos com tamanhos de cerca de 2-3 mm que depois se transferem para um vidro de relógio especial. Continua-se o processamento de 18-20 pâncreas da maneira acima descrita. Em seguida, os microfragmentos pancreáticos são cortados com a tesoura oftálmica (corneai) em pedaços mais pequenos, i.e., microfragmentos pancreáticos picados. Os microfragmentos pancreáticos picados obtidos são lavados com solução de Hank fria e colocados num balão ou num frasco de cultura (e.g., espaço de 75 cm2, Corning-Costar) distribuindo-os sobre a superfície do fundo do balão. 5-7 minutos mais tarde, durante os quais há uma fixação dos microfragmentos ao plástico, verte-se um meio de crescimento 199 isento de soro (Sigma Aldrich) sem suplemento sérico no balão (e.g., 10% do volume do balão) . O balão é depois colocado numa incubadora com submissão de 0-5% de C02 e o tecido pancreático é incubado a 36-37,5°C (a primeira temperatura de incubação), preferivelmente 36,6-37°C durante 6-10 dias, preferivelmente 7-8 dias (o primeiro período de incubação). A cada 1-2 dias, os balões com células cultivadas foram observados através do microscópio invertido e removeram-se as células exócrinas de pâncreas espontaneamente destruídas, células sanguíneas e elementos de tecido conjuntivo; o meio de crescimento 199 foi substituído por meio de crescimento fresco. Em resultado do primeiro período de incubação, formaram-se cachos de células dos ilhéus no fundo do balão e pelo menos 78% destas (de acordo com coloração específica) eram células beta pancreáticas. 7 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ

Para a depuração final de elementos celulares balastro que iniciam a resposta imunitária (e.g., leucócitos passageiros), os balões de cultura são colocados numa incubadora a uma temperatura variando de 22°C a 29°C (a segunda temperatura de incubação) durante 4-5 dias (o segundo período de incubação). Observou-se que à segunda temperatura de incubação, de 24°C, são conseguidos os melhores resultados e as células beta contêm a menor quantidade de células passageiras. Depois disso, a cultura que consiste apenas em células dos ilhéus, 78-90% de células beta, podem ser transplantadas para um paciente diabético. Em adição às células dos ilhéus, encontram-se fibroblastos singulares na cultura mas a sua proporção, usualmente, não excede 1-5%. As células de origem epitelial são usualmente células remanescentes na cultura e representam 5-17%, facto que é confirmado pela coloração imuno-histoquímica (com anticorpos monoclonais contra a proteína CytoKeratin 18); mas não são células beta, pois estas estruturas celulares não revelam a presença de insulina.

Uma dose de cultura de células dos ilhéus preferivelmente contendo 1 400 000-1 600 000 células numa suspensão estéril em solução salina de Hank (volume de 10-15 ml, não cranial, todas as células obtidas) pode ser colocada num tubo de plástico marcado de maneira apropriada. A cultura de células dos ilhéus efectuada de acordo com o método da invenção (também aqui referida Células beta de Philadelphia Medicai Scientific Center ou BCPMSC) tem a seguinte composição celular:

Contagem geral de células: 1 500 000 + 100 000 Células beta 82+8% (pelo menos 50%) Outras células dos ilhéus +30 9+2% Fibroblastos +30 2+1% Células Progenitoras (estaminais) dos ilhéus +30 7+3% 0 cultivo é realizado em meio de crescimento 199 isento de soro. Período de armazenagem das BCPMSC a 4-10°C durante 72 horas a 11-24°C durante 48 horas a 30-37°C durante 12 horas. 8 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ A dose de culturas de células dos ilhéus foi preparada a partir de pâncreas de 80 coelhos recém-nascidos de 1-2 dias de idade.

Tempo de cultivo - 14-21 dias.

Viabilidade celular - prefere-se 82% ou mais.

Na incubação de controlo das células dos ilhéus cultivadas, a produção basal de insulina perfez 840011200 pU/ml/h, e a estimulada - 16 50012700 pU/ml/h O método de cultura da invenção excluía contaminação da cultura por microorganismos (e.g., bactérias, fungos, micoplasmas e vírus).

Cada dose será acompanhada de um certificado que descreve a preparação possuindo toda a informação necessária sobre as BCPMSC. Os critérios para o isolamento ou eliminação de animais doentes; como afirmado, ao primeiro sinal de qualquer doença, um animal é colocado em quarentena e nunca volta da quarentena para a colónia. A cultura obtida pode ser transplantada num beneficiário, e.g., um paciente com Diabetes Mellitus (DM). O transplante (xenoenxerto) ou uma injecção, podem ser administrados de várias maneiras, por exemplo, por injecção no fígado (i.e. directamente no parênquima hepático ou através da veia porta), na polpa do baço, na artéria esplénica, em grandes bolsas do omento especialmente preparadas com utilização da técnica de laparoscopia, e intramuscularmente. O método preferido de introdução da cultura é no músculo rectus abdominis do beneficiário.

TÉCNICA DE TRANSPLANTAÇÃO

Com a agulha de injecção, preferivelmente não inferior a 7cm de comprimento e não menos de 1 mm de diâmetro, a suspensão de células dos ilhéus é recolhida numa seringa e injectada no músculo rectus abdominis após anestesia local.

Preferivelmente, o local da injecção deve ser tapado com um penso estéril. 9 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ

PROVA DA IMUNOGENICIDADE REDUZIDA DAS CULTURAS DE CÉLULAS DOS ILHÉUS

Evidência in vitro: várias experiências histológicas incluindo microscopia óptica e electrónica; imuno-histoquímica, mostrada acima, demonstraram que na cultura pura não existem os denominados leucócitos passageiros (linfócitos, macrófagos e etc.) capazes de iniciar uma reacção imunitária após o procedimento (9-12 meses). Evidência in vivo: xenotransplantação da cultura de células dos ilhéus em ratos com diabetes experimental conduz a remissão do estado diabético durante pelo menos 30 dias.

Com a finalidade de estudar a imunogenicidade de células contidas na cultura obtida através do método acima descrito a partir do pâncreas de coelhos recém-nascidos, conduziram-se experiências para determinar a fixação de imunoglobulinas de soro de sangue humano sobre elas. As células, incubadas com vários soros de sangue humano, foram coradas por anticorpos monoclonais contra imunoglobulinas humanas e analisadas no citómetro de fluxo. Pareceu que as células contidas na cultura eram capazes de fixar sobre a sua superfície imunoglobulinas M, mas não se encontrou fixação de imunoglobulina G. É recomendada uma preparação adequada da diabetes patente para a transplantação de uma cultura de células dos ilhéus. Antes do tratamento de transplante, um paciente diabético tem que atingir um estado glicémico tão bom quanto possível por terapia intensiva com insulina. Os pacientes não deverão ter vacinações nem terapia sérica durante as 4 semanas anteriores à transplantação das células. A pesquisa clínica deverá incluir consultas de oftalmologistas, nefrologistas, neurologistas, cirurgiões vasculares, dermatologistas, diabetologistas e consultas de outros especialistas relativamente a complicações diabéticas secundárias.

Um paciente pode ser preparado para xenotransplantação de células dos ilhéus da seguinte maneira: 1. Eliminação de cetoacidose, hipoglicemia frequente ou hiper-osmolaridade por hospitalização, de modo que a condição clínica do paciente seja compensada quanto possível; 10 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ 2. Compensação máxima do estado diabético, estabilização do açúcar no sangue em níveis normais ou próximos dos normais por terapia adequada com insulina sob estreito autocontrolo da glicemia; 3. Evitar vacinações ou terapia sérica nas 4 semanas anteriores à transplantação das células.

Serão seguidos os parâmetros seguintes nos pacientes antes e após a xenotransplantação das células dos ilhéus, com a frequência que se segue:

Gerais: 1. Nível de HBA-lc (hemoglobina glicosilada) a cada 3 meses; 2. Nível de péptido C (basal e estimulado) a cada 3 meses; 3. Detecção de auto-anticorpos; anti-GAD, anti-insulina, anti-ICA; 4. Colesterol e triglicéridos no soro a cada 3 meses; 5. Auto-monitoração em casa da glucose no sangue (diária) várias vezes ao dia; 6. Correcção das necessidades de insulina (diária).

Especial:

Retinopatia diabética: 1. Avaliação do campo do fundo ocular padrão por fotografia estereofundoscópica e técnica fluorescente a cada 3 meses; 2. Acuidade visual a cada 3 meses.

Nefropatia diabética: 1. Proteinúria /24 h uma vez por mês; 2. Microalbuminúria a cada 3 meses; 3. Creatinina sérica a cada 3 meses; 4. Depuração da creatinina a cada 3 (60 meses; 5. Pressão sanguínea uma vez por semana.

Neuropatia diabética: 1. EMG a cada 3 meses; 2. Estudos de condução nervosa do nervo tibial; nervo sural; nervo mediano - a cada 3 (6) meses 3. Escala analógica da dor uma vez por mês; 4. Alterações ortostáticas - uma vez por mês; 5. ECG - variação r-r a cada 3 meses. 11 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ

Vasculopatia diabética: 1. Ultrassonografia com Doppler a cada 3 (6) meses; 2. Sonda Doppler; 3. Pressão sanguínea com Doppler tornozelo/braço; 4. Pressão sanguínea segmentar com Doppler; 5. Alteração da forma da onda em pletismografia.

Como demonstrou a pesquisa bioquímica e morfológica, as culturas de células insulares pancreáticas produzida pelos métodos descritos possuem actividade secretória elevada e imunogenicidade muito reduzida (potência imunológica). Um certificado de qualidade é preferivelmente fixado a cada porção de células designadas para terapia celular.

INDICAÇÕES E CONTRA-INDICAÇÕES PARA XENOTRANSPLANTAÇÃO DE CULTURAS DE ILHÉUS

Indicações exemplificativas: (a) curso lábil de Diabetes

Mellitus Dependente de Insulina (DMDI) com inclinação para estado hipoglicémico e/ou cetoacidose, (b) incapacidade de atingir uma compensação satisfatória da DMDI por métodos usuais; resistência a insulina, (c) complicações secundárias de diabetes mellitus em pacientes com DMDI e DMNDI (neuropatia, nefropatia, retinopatia, angiopatia de extremidades inferiores, etc.), excluindo estudos terminais, e (d) DMDI (dependente de insulina) e DMNDI (não dependente de insulina) sem detecção de complicações secundárias - para fins de profilaxia. B. Contra-indicações: Infecções agudas & doenças inflamatórias, ou exacerbação de doenças crónicas; Doenças Oncológicas.

SUPERVISÃO DE PACIENTES APÓS A TRANSPLANTAÇÃO DE CULTURA DE CÉLULAS DOS ILHÉUS

No primeiro anos após a transplantação, recomenda-se a inspecção acima mencionada após 3, 6, 9 e 12 meses. a A maioria dos beneficiários, 1-3 meses após xenotransplantação, demonstram as seguintes alterações: 12 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ 1. Corrente/anterior à ΧΤ - diabetes tipo 1 lábil é estabilizada; 2. A tendência dos pacientes para cetose desaparece; 3. Os parâmetros de troca de hidratos de carbono melhoram (é reduzida a glicemia média diária - em 1-2 meses, a diminuição do teor de hemoglobina glicosilada - 3 meses); 4. Diminui (para 20-30%) a necessidade de insulina exógena; 5. Os parâmetros do metabolismo lipidico melhoram: 6. Em beneficiários com ausência de secreção residual de insulina pelas células beta próprias (é péptido C não determinado) surge a produção de insulina pelo paciente (péptido C). 7. Em pacientes com neuropatia sensório-motora, a dor e a parestesia desaparecem; os parâmetros de sensibilidade e condutividade de fibras de nervos periféricos melhoram. Em pacientes com neuropatia autonômica, que lutam com o controlo glicémico, hipotensão postural, gastroparese e enteropatia (diarreia), os parâmetros de pulsação e pressão sanguínea são normalizados, as funções do estômago e dos intestinos são também normalizadas. 8. Em pacientes de diabetes tipo 1 com um estádio expresso de nefropatia diabética (classificação de C. Morgensen) diminui e desaparece a proteinúria, a pressão sanguínea elevada é reduzida e normalizada. Em pacientes com um 3.° estádio de nefropatia diabética, a microalbuminúria diminui ou torna-se normal (inferior a 30 mg/dia). 9. Em pacientes com estádios não proliferados e pré- proliferados de retinopatia diabética, o quadro clínico do fundo do olho é estabilizado, a parte significativa dos beneficiários têm a sua melhoria: resolvem-se as hemorragias, a hipóstase da retina diminui. A estabilização do decurso da diabetes mellitus e a diminuição das necessidades de insulina exógena resultam do funcionamento adequado das células dos ilhéus transplantadas e de uma recuperação parcial ou função aumentada de células dos ilhéus do pâncreas do beneficiário.

Crê-se que o efeito curativo de culturas celulares transplantadas nas complicações diabéticas tardias é 13 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ aparentemente explicado pelo restabelecimento ou fortalecimento da secreção de péptido C tanto pelas células beta transplantadas como pelas células beta próprias do paciente, que é produzido juntamente com a insulina e tem um marcado efeito angioprotector.

De acordo com uma hipótese, o desenvolvimento de microangiopatia, que é a base de todas as complicações diabéticas, é devido à falta de péptido C e algumas outras substâncias semelhantes a hormonas produzidas pelas células beta, que estão ausentes na grande maioria dos pacientes de diabetes tipo 1. A injecção de péptido C em pacientes com complicações da diabetes mellitus tipo 1 resulta na regressão das complicações diabéticas secundárias, tais como nefropatia, retinopatia e neuropatia.

As células beta de coelho transplantadas produzem péptido C normal, que tem uma influência fisiológica sobre as complicações diabéticas tardias. A Tabela 1 demonstra o controlo glicémico melhorado e a queda das necessidades de insulina após CCI XT (112 casos bem documentados).

Tabela 1 índice Antes da XT 3 M depois 6 M depois 9 M depois 12 M depois Glicemia Média Diária, mg/dl 198+41 158+52 129+23 133+30 142+34 HbAlc,% 10,1+2,1 9,1+1,2 7,7+1,9 6,9+1,1 7,5+1,9 Dose de Insulina, IU 56 + 11 38 + 15 25 + 12 32 + 9 40 + 8 A Tabela 2 demonstra as necessidades de insulina (IU/dia) e o nível de microalbuminúria (mg/dia) após CCI XT repetido em paciente Ts.S (33 anos de idade, 18 anos de duração da DM tipo 1) 14 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ

Tabela 2 XT índice Antes da XT 3 M depois 6 M depois 9 M depois 12 M depois 1. a Dose de Insulina 64 33 38 40 48 Microalbuminúria 936 680 348 330 496 2. a Dose de Insulina 52 38 24 26 38 Microalbuminúria 660 377 189 199 167 3. a Dose de Insulina 42 38 25 32 40 Microalbuminúria 330 145 99 112 88 4. a Dose de Insulina 40 34 20 16 16 Microalbuminúria 66 45 34 40 39

As principais vantagens da transplantação de células dos ilhéus em comparação com a terapia usual da Diabetes Mellitus do tipo 1, são as seguintes:

Devido à transplantação realizada regularmente, todos os beneficiários apresentam diminuição da progressão da angiopatia diabética e reversão dos estádios iniciais de complicações diabéticas tardias (retinopatia, nefropatia, neuropatia e angiopatia) , o que é impossível de atingir com o auxílio da terapia usual (injecção de insulina após autocontrolo da glicemia e tratamento tradicional de angiopatia) .

Isto acontece principalmente porque as células beta transplantadas após a tomada do transplante (aceitação) começam a produzir no corpo do beneficiário uma matéria angioprotectora, o péptido C, de que o paciente estava privado devido ao colapso das suas próprias células beta (devido a insulto auto-imune). A capacidade de culturas de células insulares pancreáticas, recebidas através do método original a partir de pâncreas de coelhos recém-nascidos, sobreviverem e funcionarem no ambiente in vivo, foi demonstrada por nós em experiências de xenotransplantação destas culturas em animais com Diabetes Mellitus experimental. 15 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ

Foram utilizados como animais experimentais ratos machos da linha Wistar de massa corporal de 180-220 g, alimentados regularmente. A Diabetes mellitus experimental foi provocada por aplicação subdérmica de aloxana (dosagem de 200ml para 1 kg de peso corporal) ou por aplicação subdérmica de estreptozotocina (dosagem de 60 ml/kg).

Durante as experiências e sondagens de controlo utilizámos apenas ratos com Diabetes induzida por aloxana ou estreptozotocina cujo nivel de hipoglicemia com estômago vazio era 20 mmol/1 e superior. Testes conduzidos anteriormente indicaram que estes animais não tinham reversão espontânea da diabetes mellitus experimental.

Após transplantação de culturas de C.I.P., 88 dos 104 ratos com Diabetes Mellitus induzida por aloxana estável ou grave (quase 85%) apresentaram uma firme remissão do estado diabético até ao final do período experimental (20 semanas). Foi registada uma firme diminuição dos níveis de açúcar no sangue para níveis quase normais no sangue de animais beneficiários. Ao mesmo tempo, os sintomas clínicos característicos da diabetes também desapareceram (tais como perda de peso, polidipsia, poliúria). O efeito antidiabético da xenotransplantação foi claramente demonstrado tanto nos casos de aplicação de culturas no fígado (através da veia porta ou directamente no parênquima do fígado) como também no baço (as culturas foram aplicadas intra-polpa), e também através dos músculos abdominais. Mesmo após 8 semanas depois da xenotransplantação, foram detectadas C.I.P. com estrutura conservada e com sinais de actividade secretória em locais de implantação em ratos com remissão de diabetes experimental.

Durante séries especiais de experiências foi claramente demonstrado o papel do cultivo preliminar das C.I.P. in vitro na sobrevivência de células em organismos da xenogenia do beneficiário. Para este fim, realizámos análises comparativas de resultados de xenotransplantação de culturas de C.I.P. de pâncreas de fetos humanos e xenotransplantação de tecido de ilhéus fetal não cultivado em ratos com Diabetes Mellitus experimental. Detectou-se que o efeito redutor de açúcares é 16 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ mais expressivo e duradouro em casos de transplantação de C.I.P. pré-cultivadas em comparação com a transplantação de tecido de Pâncreas não cultivado, que resulta apenas em remissão de curta duração do estado Diabético. Assim, o resultado imunomodulador do cultivo in vitro foi experimentalmente provado como um aumento significativo do prazo de sobrevivência num organismo de um beneficiário estranho.

Os pâncreas de 18 ratos beneficiários, nos quais tinha sido realizada uma xenotransplantação bem sucedida de culturas de Pâncreas de coelhos recém-nascidos, foram sujeitos a exame histológico em 8 semanas após a transplantação. Para esse fim fixou-se um fragmento de pâncreas em solução Buena e mergulhou-se em parafina. Os cortes (5-7 pm de espessura) foram corados com hematoxilina e eosina, e também com aldeído-fucsina para revelação de células β. Ao mesmo tempo, os pâncreas de 6 animais de controlo que tinham Diabetes induzida por aloxana, não tratados, assim como os pâncreas de 6 ratos saudáveis (sem aplicação de aloxana) foram examinados de perto.

Quando se examinaram os pâncreas de ratos saudáveis intactos, cerca de 45 - 76% de células β, como esperado, foram encontradas em ilhéus de "Langerhans". Os ratos com Diabetes induzida por aloxana não tratados tinham uma quantidade muito diminuída de células β nos ilhéus - em média 8,3+-1,1%.

Encontrou-se uma quantidade significativamente superior de células β em ilhéus em ratos beneficiários. Em animais que tinham sido sujeitos a xenotransplantação de culturas de C.I.P., os seus próprios pâncreas apresentavam células β típicas e a sua proporção entre as células dos "ilhéus" era de 10 a 55% (algo entre de 7 e 21%) (média de 23,5+8,8).

Em relação a estas experiências, podemos assumir que o efeito antidiabético da xenotransplantação de culturas de Cl nos desenvolvimentos de diabetes experimental em ratos ocorre por 2 vias genéricas: a) Funcionamento de células β transplantadas, confirmado em adição ao efeito expressivo de redução de açúcares, também por revelação de grupos de C.I.P. transplantadas na polpa do baço de animais beneficiários; 17 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ b) Efeito estimulante da transplantação de culturas de C.I.P. sobre os aparelhos dos ilhéus do pâncreas de ratos beneficiários, possibilidade que é confirmada por dados de exames histológicos que revelam a existência significativamente frequente de ilhéus com células β normais e uma sua maior proporção em ilhéus de pâncreas de ratos beneficiários do que de ratos com diabetes induzida por aloxana não tratados. A pesquisa experimental bem sucedida tornou-se a base para a realização da transplantação clinica de culturas de pâncreas de coelhos recém-nascidos em pacientes de diabetes tipo 1. TRANSPLANTAÇÃO CLÍNICA DE CULTURAS DE C.I.P. PRODUZIDAS A PARTIR DE PÂNCREAS DE COELHOS RECÉM-NASCIDOS.

Um total de 112 pacientes com Diabetes Mellitus tipo 1 (DMDI) estiveram sob supervisão dinâmica bem documentada.

Do total dos 112 pacientes, 58 eram homens e 54 eram mulheres. A idade dos pacientes no momento da transplantação variava de 16 a 53 - média de 35 anos de idade.

Sabe-se que a gravidade da manifestação de complicações diabéticas secundárias depende significativamente da duração da doença DMDI. Supostamente, a destruição das células β próprias do paciente em resultado do processo auto-imune surge aproximadamente no 5o ano após a manifestação da doença. As complicações diabéticas secundárias manifestam-se usualmente em pacientes com uma duração da doença de mais de 10 anos. Devido a isso, todos os pacientes de DMDI foram divididos em 3 grupos com referência à duração da doença: a) 1 a 5 anos - 16 pessoas; b) 6 a 10 anos - 43 pessoas c) mais de 10 anos - 53 pacientes. Todos os pacientes tinham sido examinados com o objectivo de determinar o carácter do desenvolvimento de DMDI e estabelecer a presença de complicações diabéticas.

Usualmente utilizaram-se para a transplantação, para um paciente, culturas recebidas através dos métodos acima descritos provenientes de 50-60 pâncreas de coelhos recém-nascidos com 1-2 dias. A suspensão foi usualmente entregue no 18 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ músculo abdominal transverso sob anestesia local. Não se utilizou imunossupressão. O facto mais importante que confirma um efeito antidiabético na transplantação de células dos ilhéus só devido ao funcionamento de células beta transplantadas, é o facto de as encontrar no local da administração da transplantação. Se após a transplantação intraperitoneal é praticamente impossível localizar as células aplicadas na cavidade abdominal, já após a administração no baço é possível, embora muito difícil.

Obteve-se uma microfotografia de secção histológica corada da polpa do baço que demonstra claramente um transplante representado por um grupo de células epiteliais no centro da fotografia. A certeza de que estas células são de facto um transplante baseia-se parcialmente no facto de que estruturas epiteliais estão ausentes no tecido esplénico.

Deste modo, a presença de células epiteliais na polpa lineal é uma evidência de uma "entrada do exterior", neste caso - de um transplante.

Com base nos resultados da pesquisa científico-experimental, podem tirar-se várias conclusões básicas: 1. A estreptozotocina (Stz) tem um efeito de destruição geral nas células beta dos ilhéus do pâncreas, mas ao mesmo tempo, directamente ou indirectamente conduz a uma perda de outras células dos ilhéus. 2. Parece que acontece um processo de regeneração em ilhéus de Langerhans afectados principalmente por conta da recuperação de um conjunto de células beta. 3. As culturas de células dos ilhéus produzidas a partir de pâncreas de coelhos recém-nascidos através do método original consistem geralmente em células beta depuradas de elementos celulares balastro e têm uma actividade produtora de insulina muito elevada. 4. Uma xenotransplantação intraperitoneal, assim como intra- esplénica, de culturas de células dos ilhéus em ratos com Diabetes Mellitus experimental induzida por estreptozotocina, proporciona, na maioria dos casos, uma 19 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ remissão estável do estado diabético com uma duração de pelo menos um período de 8 semanas. 5. O efeito de diminuição de açúcares após a transplantação é assegurado pelo funcionamento de células beta transplantadas, e também por actividades produtoras de insulina, em algum grau, restabelecidas no conjunto de células beta em ilhéus dos pâncreas de ratos beneficiários. Isto é confirmado por observações de medições de concentrações de insulina exógena (do coelho) e própria (do rato) no sangue de animais experimentais. 6. Os exames histológicos de pâncreas de ratos experimentais confirmaram a estimulação expressiva de processos regenerativos em ilhéus de ratos com diabetes mellitus induzida por estreptozotocina após a administração de xenotransplantação de culturas de células dos ilhéus. É possível que a regeneração de células beta aconteça não apenas nas margens de localização dos ilhéus de Langerhans mas também em algumas estruturas fora do tecido dos ilhéus pancreáticos. A invenção será agora ilustrada com mais detalhes com referência aos Exemplos que se seguem, mas deve entender-se que a presente invenção não deve ser considerada a eles limitada. EXEMPLOS EXEMPLO 1

No estádio inicial de um trabalho científico de investigação real utilizámos, como animais experimentais, ratos da linhagem Wistar de massa corporal de 220-250 gramas recebidos de um biotério especial de animais laboratoriais. Para eliminar influências hormonais cíclicas sobre a alteração de parâmetros do metabolismo dos hidratos de carbono, decidimos realizar experiências com machos pubescentes adultos.

De modo a obter resultados objectivos na condução do tratamento antidiabético com ratos laboratoriais desenhou-se um modelo de uma diabetes mellitus estável. 20 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ A doença foi provocada nos animais por introdução de administração intraperitoneal fraccionada de solução extemporânea de estreptozotocina - dose total de 80 mg por 1 kg de peso corporal. Um total de 90 animais foram submetidos ao efeito da estreptozotocina. Mais tarde, a maioria dos animais desenvolveram sinais caracteristicos do estado diabético: sede, poliúria (glucose em excesso no sangue), polifagia (excessivo consumo de alimentos) , queda de pêlo, retardamento de ganho de massa corporal ou seu declínio. Como tal, foi registada uma hiperglicemia expressa em 58 ratos, i.e. outros 22 mantiveram uma glicemia normal ou a concentração de glucose aumentou insignificativamente. Ao fim de 4 semanas após a indução de diabetes, recolheram-se os 32 animais com o nível mais estável de hiperglicemia. A estabilidade foi confirmada pelo facto de que durante uma observação de quase um mês, a concentração de açúcar no sangue não diminuiu abaixo de 16 mmol/1. A escolha de uma glicemia inicial nesta gama não foi aleatória pois é explicada pelo seguinte. Como demonstraram experiências anteriores, na glicemia de nível de 16 mmol e superior, registada em não menos de 4 semanas após a administração de estreptozotocina, estes ratos não demonstraram uma remissão espontânea no futuro nem uma reversão do estado diabético. Ao mesmo tempo, mesmo uma glicemia muito elevada (ainda abaixo de 30 mmol/1) deixa a maioria dos animais experimentais com diabetes sobreviver por longos períodos (2 e mais meses), o que permite conduzir experiências bastante contínuas sem preocupações sérias quanto à morte não programada destes animais. Estes pressupostos foram confirmados pela observação no grupo de controlo (sem tratamento) de ratos diabéticos. Abaixo apresentam-se as verificações sobre o efeito da xenotransplantação intraperitoneal de culturas de células dos ilhéus de coelhos recém-nascidos sobre o decurso da diabetes induzida por estreptozotocina em 8 ratos com diabetes mellitus induzida por estreptozotocina consistente. A cada um dos animais beneficiários, com base na narcose intraperitoneal com Hexenal, foram administradas 700 000 - 800 000 células dos ilhéus de pâncreas de coelhos recém- 21 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ nascidos por administração através de punctura na parede abdominal através de uma agulha de grande diâmetro.

Apresentam-se abaixo as observações relativas à alteração da gravidade do estado diabético em cada um dos 8 animais experimentais deste grupo.

Os animais foram divididos em 3 grupos de 8 ratos cada. 1. ° grupo: 8 ratos com hiperglicemia, a que foi administrada xenotransplantação de culturas de células dos ilhéus na cavidade abdominal; 2. ° grupo: 8 ratos com hiperglicemia, a que foi administrada xenotransplantação de culturas de células dos ilhéus na polpa do baço; 3.° grupo: 8 ratos com hiperglicemia, que não foram sujeitos a qualquer tratamento (controlo).

Tabela 3. Alteração da glicemia e da massa corporal após aplicação de estreptozotocina (Stz) e subsequente transplantação (Tx) intraperitoneal de culturas de células dos ilhéus de pâncreas de coelhos recém-nascidos no rato n.° 1. índices Antes 4 semanas Antes Semanas de Stz após Stz da Tx 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 6,7 20,0 24, 1 12,2 12,0 12, 4 12,5 12,2 11, 9 14,8 14,9 Massa corporal, g 220 175 170 180 200 230 250 290 330 340

Tabela 4. Alteração da glicemia e da massa corporal após aplicação de estreptozotocina (Stz) e subsequente transplantação (Tx) intraperitoneal de culturas de células dos ilhéus de pâncreas de coelhos recém-nascidos no rato n.° 2. índice Antes 4 semanas Antes Semanas de Stz após Stz da Tx 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 6,4 18,7 16, 6 13,0 6, 8 6,7 7,4 6,4 5,5 7,0 6, 0 Massa corporal, g 200 180 170 180 210 230 240 250 270 290 320 22 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ

Tabela 5. Alteração da glicemia e da massa corporal após aplicação de estreptozotocina (Stz) e subsequente transplantação (Tx) intraperitoneal de culturas de células dos ilhéus de pâncreas de coelhos recém-nascidos no rato n.° 3. índice Antes 4 semanas Antes Semanas de Stz após Stz da Tx 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 5,4 26,8 29,0 16,1 22,2 16,5 12,5 14,1 17,7 16,5 15,9 Massa corporal, g 200 180 160 160 170 200 210 220 240 250 290

Tabela 6. Alteração da glicemia e da massa corporal após aplicação de estreptozotocina (Stz) e subsequente transplantação (Tx) intraperitoneal de culturas de células dos ilhéus de pâncreas de coelhos recém-nascidos no rato n.° 4. índice Antes 4 semanas Antes Semanas de Stz após Stz da Tx 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 6,0 19,7 21, 2 12,2 13,0 14,1 9,2 7,9 9,0 9,2 8,3 Massa corporal, g 240 210 200 190 210 250 260 270 310 320 350

Tabela 7. Alteração da glicemia e da massa corporal após aplicação de estreptozotocina (Stz) e subsequente transplantação (Tx) intraperitoneal de culturas de células dos ilhéus de pâncreas de coelhos recém-nascidos no rato n.° 5. índice Antes 4 semanas Antes Semanas de Stz após Stz da Tx 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 4,9 18, 9 17, 9 15,5 15,9 14,0 15,9 15,0 15,2 16,8 14,6 Massa corporal, g 200 180 170 180 200 220 240 250 270 280 300 23 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ

Tabela 8. Alteração da glicemia e da massa corporal após aplicação de estreptozotocina (Stz) e subsequente transplantação (Tx) intraperitoneal de culturas de células dos ilhéus de pâncreas de coelhos recém-nascidos no rato n.° 6. índice Antes 4 semanas Antes Semanas de Stz após Stz da Tx 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 5,9 22,3 21, 9 14,2 11,1 7,8 7,0 8,4 8,1 7,8 7,4 Massa corporal, g 240 210 210 200 240 240 260 290 320 350 360

Tabela 9. Alteração da glicemia e da massa corporal após aplicação de estreptozotocina (Stz) e subsequente transplantação (Tx) intraperitoneal de culturas de células dos ilhéus de pâncreas de coelhos recém-nascidos no rato n.° 7. índice Antes 4 semanas Antes Semanas de Stz após Stz da Tx 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 5,9 18,0 17, 1 11,5 7,9 8,1 6,4 5,4 6,1 5,1 6,4 Massa corporal, g 200 180 170 180 200 220 240 250 270 280 300

Tabela 10. Alteração da glicemia e da massa corporal após aplicação de estreptozotocina (Stz) e subsequente transplantação (Tx) intraperitoneal de culturas de células dos ilhéus de pâncreas de coelhos recém-nascidos no rato n.° 8. índice Antes 4 semanas Antes Semanas de Stz após Stz da Tx 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 6,3 24,0 25,6 17,7 18,8 20,0 21,8 18,6 17, 8 18,8 20,9 Massa corporal, g 250 190 170 190 200 220 250 260 270 290 300 EXEMPLO 2

Oito (8) ratos com diabetes mellitus estável induzida por estreptozotocina foram submetidos a xenotransplantação intra-esplénica de culturas de células dos ilhéus. A administração de culturas de células dos ilhéus de pâncreas de coelhos 24 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ recém-nascidos foi conduzida com base em narcose com Hexenal. Após abertura da parede abdominal e fazer uma ferida operatória no baço, introduziu-se a suspensão celular directamente na polpa do órgão através da seringa de 1,2 mm de diâmetro. O local da injecção foi comprimido com um penso de gaze, o que retarda o sangramento do parênquima, e selado com gotas de cola cirúrgica especial. A ferida na parede abdominal foi cosida camada por camada. Abaixo apresentam-se os resultados gerais destas transplantações, nomeadamente a dinâmica de índices de glicemia e massa corporal de animais beneficiários.

Tabela 11. Alteração da glicemia e da massa corporal após aplicação de estreptozotocina (Stz) e subsequente transplantação (Tx) intra-esplénica de culturas de células dos ilhéus de pâncreas de coelhos recém-nascidos no rato n.° 17. índice Antes 4 semanas Antes Semanas de Stz após Stz da Tx 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 5,3 16,7 17,1 16,8 12,2 10,2 10,0 11,2 9,9 8,1 6,6 Massa corporal, g 220 200 200 190 200 240 250 280 320 340 360

Tabela 12. Alteração da glicemia e da massa corporal após aplicação de estreptozotocina (Stz) e subsequente transplantação (Tx) intra-esplénica de culturas de células dos ilhéus de pâncreas de coelhos recém-nascidos no rato n.° 18. índice Antes 4 semanas Antes Semanas de Stz após Stz da Tx 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 6, 6 24,0 22,1 19,5 18,0 12,6 7:4 6,5 5,7 7,0 10,2 Massa corporal, g 220 180 170 170 180 200 240 290 320 330 360 25 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ

Tabela 13. Alteração da glicemia e da massa corporal após aplicação de estreptozotocina (Stz) e subsequente transplantação (Tx) intra-esplénica de culturas de células dos ilhéus de pâncreas de coelhos recém-nascidos no rato n.° 19. índice Antes 4 semanas Antes Semanas de Stz após Stz da Tx 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 5,3 21,2 21,2 17,6 14,4 10,5 11,2 11,4 9,1 10,5 7,4 Massa corporal, g 250 220 210 190 200 210 250 270 300 310 350

Tabela 14. Alteração da glicemia e da massa corporal após aplicação de estreptozotocina (Stz) e subsequente transplantação (Tx) intra-esplénica de culturas de células dos ilhéus de pâncreas de coelhos recém-nascidos no rato n.° 20. índice Antes de Stz 4 semanas após Stz Antes da Tx Semanas 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 6,7 24,5 26,9 14,2 12,8 13,0 8,8 8,4 9,0 7,4 9,8 Massa corporal, g 210 170 170 180 180 200 220 240 270 290 330

Tabela 15. Alteração da glicemia e da massa corporal após aplicação de estreptozotocina (Stz) e subsequente transplantação (Tx) intra-esplénica de culturas de células dos ilhéus de pâncreas de coelhos recém-nascidos no rato n.° 21. índice Antes de Stz 4 semanas após Stz Antes da Tx Semanas 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 6, 0 22,0 21, 9 15,5 15,9 14,0 13,5 15,1 13,8 17,0 15,5 Massa corporal, g 250 180 170 170 180 200 220 230 230 240 270 26 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ

Tabela 16. Alteração da glicemia e da massa corporal após aplicação de estreptozotocina (Stz) e subsequente transplantação (Tx) intra-esplénica de culturas de células dos ilhéus de pâncreas de coelhos recém-nascidos no rato n.° 22. índice Antes 4 semanas Antes Semanas de Stz após Stz da Tx 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 7,1 31,4 28, 8 24,2 25,9 22,7 17,0 17,9 18,1 16,7 15,8 Massa corporal, g 220 170 170 160 160 180 200 220 230 250 270

Tabela 17. Alteração da glicemia e da massa corporal após aplicação de estreptozotocina (Stz) e subsequente transplantação (Tx) intra-esplénica de culturas de células dos ilhéus de pâncreas de coelhos recém-nascidos no rato n.° 23. índice Antes de Stz 4 semanas após Stz Antes da Tx Semanas 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 5,6 16,0 15,5 11,5 9,7 6,6 7,5 5,6 6,6 5,9 5,7 Massa corporal, g 240 260 270 290 300 320 350 370 370 400 410

Tabela 18. Alteração da glicemia e da massa corporal após aplicação de estreptozotocina (Stz) e subsequente transplantação (Tx) intra-esplénica de culturas de células dos ilhéus de pâncreas de coelhos recém-nascidos no rato n.° 24. índice Antes de Stz 4 semanas após Stz Antes da Tx Semanas 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 6,4 21,0 22, 6 17,1 15,8 14,2 21,8 18,6 17,8 19,1 19,7 Massa corporal, g 250 230 220 210 200 220 230 240 270 280 360

Estes dados foram mais tarde confirmados por observações no grupo de controlo (diabetes sem tratamento) de ratos diabéticos. 27 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ EXEMPLO 3

Dividiram-se 26 animais em 3 grupos de 8 ratos cada: Primeiro grupo - 8 ratos com hiperglicemia submetidos a xenotransplantação de cultura de células dos ilhéus através de administração intraperitoneal. Segundo grupo - 8 ratos com hiperglicemia, que foram submetidos a xenotransplantação através de administração intra-esplénica. Terceiro grupo -10 ratos com hiperglicemia, que não foram tratados (controlo). Um maior número destes animais é explicado pela projecção da sua possível morte no decorrer da experiência.

Apresentam-se abaixo os dados relativos ao efeito da xenotransplantação intraperitoneal de cultura de células dos ilhéus de coelhos recém-nascidos no decurso de diabetes induzida por estreptozotocina em 8 ratos com diabetes mellitus expressa induzida por estreptozotocina.

Em cada animal beneficiário, com base em narcose intraperitoneal com Hexenal, foram introduzidas 700 000-800 000 células de ilhéus do pâncreas de coelhos recém-nascidos através de punctura do peritoneu e libertação na cavidade abdominal.

Apresentam-se abaixo as observações sobre alterações da gravidade do estado diabético em cada um dos 8 ratos deste grupo. Ao contrário dos ratos com diabetes induzida por estreptozotocina estável que receberam administração de transplantação intraperitoneal ou intra-esplénica de culturas de células dos ilhéus de coelhos recém-nascidos, nos ratos com a mesma gravidade de estado diabético que não foram submetidos a qualquer tratamento (controlo), o nível de glicemia permaneceu elevado e estável durante todo o período desta experiência. Em adição, nenhum rato beneficiário morreu, mas no grupo de controlo, com base num estado diabético grave, morreram 2 animais, o que perfaz 1/5 dos animais do grupo.

Apresentam-se abaixo as observações sobre as alterações do nível de glicemia e da massa corporal em ratos com diabetes mellitus experimental não tratados. 28 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ

Tabela 19. Alteração da glicemia e da massa corporal após aplicação de estreptozotocina no rato n.° 9 não submetido a transplantação (controlo). índice Antes de Stz 4 semanas após Stz Semanas 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 6,4 25,8 23,9 23, 4 2 6,6 24,7 23,3 24,4 22, 6 24,3 Massa corporal, g 250 230 210 200 200 180 170 170 180 180

Tabela 20. Alteração da glicemia e da massa corporal após administração de estreptozotocina no rato n.° 10 não submetido a transplantação: índice Antes de Stz 4 semanas após Stz Semanas 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 7,1 28,7 27,9 >33 29,9 28,4 >33 31,2 e. 1* Massa corporal, g 200 180 170 160 160 150 150 130 *e.l. - exitus letalis

Tabela 21. Alteração da glicemia e da massa corporal após administração de estreptozotocina ao rato n.° 11 não submetido a transplantação (controlo) índice Antes 4 semanas Semanas de Stz após Stz 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 6, 4 26,8 24,9 23, 4 26, 6 25,7 27,3 24,9 25,5 23,7 Massa corporal, g 220 220 210 200 190 180 170 180 180 180 29 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ

Tabela 22. Alteração na glicemia e na massa corporal após administração de estreptozotocina ao rato n.° 12 não submetido a transplantação (controlo) índice Antes 4 semanas Semanas de Stz após Stz 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 6,4 22,8 21,3 23, 4 27, 6 24,1 25,3 24,7 22,5 23,7 Massa corporal, g 220 200 210 210 190 180 190 200 210 210

Tabela 23. Alteração na glicemia e na massa corporal após administração de estreptozotocina ao rato n.° 13 não submetido a transplantação (controlo) índice Antes 4 semanas Semanas de Stz após Stz 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 6,4 21, 8 23,0 23,7 24, 6 23, 6 28,3 24,8 25,0 23,8 Massa corporal, g 220 240 230 220 210 200 190 180 190 200

Tabela 24. Alteração na glicemia e na massa corporal após administração de estreptozotocina ao rato n.° 14 não submetido a transplantação (controlo) índice Antes 4 semanas Semanas de Stz após Stz 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 4,9 26,6 24,5 25, 6 27,7 23, 6 25, 9 25,0 27,2 28,8 Massa corporal, g 200 200 210 200 180 170 180 170 160 160

Tabela 25. Alteração na glicemia e na massa corporal após administração de estreptozotocina ao rato n.° 15 não submetido a transplantação (controlo) índice Antes 4 semanas Semanas de Stz após Stz 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 6, 9 19, 4 19,5 19, 6 20, 0 18,7 18,7 19,7 19,7 20,3 Massa corporal, g 200 220 210 200 210 210 210 220 220 230 30 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ

Tabela 26. Alteração na glicemia e na massa corporal após administração de estreptozotocina ao rato n.° 16 não submetido a transplantação (controlo) índice Antes de Stz 4 semanas após Stz Semanas 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 6,7 25,1 25,5 27, 6 27, 6 25, 6 22, 9 25,0 22,2 24,1 Massa corporal g 230 220 210 200 190 200 190 180 180 180

Tabela 27. Alteração na glicemia e na massa corporal após administração de estreptozotocina ao rato n.° 25 não submetido a transplantação (controlo) índice Antes de Stz 4 semanas após Stz Semanas 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 6,4 27,3 24,5 22,6 27,7 26, 1 27,9 e. 1. Massa corporal, g 210 220 200 190 190 180 180

Tabela 28. Alteração na glicemia e na massa corporal após administração de estreptozotocina ao rato n.° 26 não submetido a transplantação (controlo) índice Antes 4 semanas Semanas de Stz após Stz 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicemia mM/1 5,8 17,7 17,3 18,3 22, 9 21,3 19, 9 18,3 19,7 17,7 Massa corporal, g 230 250 260 260 250 270 280 280 280 300 EXEMPLO 4

CULTURAS DE CÉLULAS DOS ILHÉUS

As culturas de células dos ilhéus foram obtidas de acordo com o desenho da nossa técnica a partir de pâncreas de coelhos recém-nascidos de 1-2 dias. Para cada transplantação, utilizou-se uma cultura contendo aproximadamente 200 000-300 000 células beta. Imediatamente antes da transplantação, limpou-se a cultura de soro embrionário do meio de crescimento previamente adicionado e recolheu-se em tubos de ensaio de 31 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ plástico estéreis, cada um com 5 ml de volume. A fracção fixada da cultura foi removida com o auxilio de um raspador celular especial (firma Corning-Costar). A fracção flutuante foi separada por centrifugação do caldo de cultura que cobria o fundo do frasco onde estava localizada a fracção fixada. 0 volume final da suspensão celular correspondia ao número de operações de xenotransplantação programadas para o dia, e cada mililitro de suspensão deverá conter aproximadamente 100 000 células dos ilhéus (geralmente células beta).

EXEMPLO 5 INSULINOTERAPIA

Para a injecção subcutânea utilizámos insulina de acção especifica Aktrapid HM que foi administrada duas vezes por dia: 9:00 e 19:00. A dose foi seleccionada individualmente. O critério de sucesso da insulinoterapia aplicada foi a diminuição da hiperglicemia para até 10 mmol/1 e inferior. EXEMPLO 6

ADMINISTRAÇÃO DE CULTURAS DE CÉLULAS DOS ILHÉUS A suspensão celular foi injectada por seringa através da agulha de injecção de grande diâmetro, fazendo uma punctura na parede abdominal sem anestesia. Para evitar lesões nos órgãos internos e nos vasos do rato, o rato foi virado de pernas para o ar, desse modo assegurando o anti-deslocamento dos órgãos abdominais e a formação de espaço livre. Após a punctura do peritoneu injectou-se o transplante celular neste espaço livre. É necessária uma operação da cavidade para a administração intra-esplénica, portanto, para narcose por meio de injecção intraperitoneal utilizámos solução de Hexenal preparada extemporaneamente com base numa razão de 50-60 mg por 1 kg de peso corporal. A transplantação na polpa do baço foi realizada como se segue: abriu-se a cavidade abdominal por incisão mediana ao longo da linha branca abdominal. Removeu-se o baço pela ferida operatória rodeando-o por toalhetes estéreis. A suspensão celular colhida no dia anterior foi tomada para uma seringa (volume de 2 ml) e através da agulha de injecção (0,5 mm de diâmetro) foi administrada na polpa do 32 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ baço e na zona subcapsular. Para evitar sangramento fechou-se a marca da injecção com cola medicinal MK-6. EXEMPLO 7

EXAME / INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL

Determinou-se a Glucose do Sangue Capilar em animais experimentais utilizando um Glucometr Smart Scan 2-3 vezes por semana. A insulina no soro foi detectada através de um método imunoenzimático, utilizando configurações para insulina de coelho (humana) e configurações preparados para o efeito para a detecção específica de insulina de rato. EXEMPLO 8

PESQUISA HISTOLÓGICA

Para estudar a dinâmica de alterações morfológicas que acontecem nos ilhéus sob influência de vários tipos de tratamento de diabetes mellitus experimental, os pâncreas de animais mortos nos tempos especificados durante a experiência foram fixados em mistura Buena preparada de fresco. Após procedimentos histológicos específicos (lavagem do fixador, desidratação, etc.) fragmentos de tecido pancreático foram selados em parafina. Depois, secções microscópicas feitas através de um micrótomo (5-7 pm de espessura) foram desenceradas e coradas com hematoxilina e eosina assim como com aldeído-fucsina, com o propósito de isolamento de células beta.

Para a detecção do destino das células beta transplantadas na polpa do baço de ratos diabéticos, nos tempos especificados após a transplantação, os baços dos animais mortos e seus fragmentos, que, a julgar pelo esquema da operação e alguns sinais externos, podiam, supostamente conter transplante, foram excisados e imediatamente fixados na mistura Buena. Em seguida, como descrito acima, prepararam-se secções em parafina e coraram-se da maneira especificada. EXEMPLO 9

RESULTADOS DA PESQUISA: CARACTERÍSTICAS DA CULTURA

As culturas de células dos ilhéus obtidas para subsequente transplantação estavam conforme os critérios 33 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ funcionais de aceitação. Como tal, os estudos ao microscópio invertido demonstraram que ao fim de 2 semanas de cultivo a cultura atingida não continha células de tecido exócrino de pâncreas, que estavam ausentes elementos celulares balastro incluindo leucócitos "passageiros" - iniciadores de rejeição de células dos ilhéus após a sua xenotransplantação. Estes dados, e a experiência prévia de tratamento por transplantação de diabetes mellitus experimental, asseguraram-nos que não havia necessidade de administração de qualquer tipo de imunossupressão. Testes de controlo do teor de insulina no caldo de cultura demonstraram que as células beta existentes possuem elevada actividade produtora de insulina (Tabela 29).

Tabela 29. índices de secreção de insulina basal e estimulada (25 mmol/1 de glucose) (concentração microUNIDADES/ml) em cultura de células dos ilhéus produzida a partir de pâncreas de coelhos recém-nascidos:

Amostra n.0 Basal Estimulada 1 2360 3330 2 11080 13450 3 7800 8760 4 5580 7650 5 7530 9900 6 8800 12300 7 5090 6850 EXEMPLO 10

RESULTADOS DA TERAPIA COM INSULINA

Como foi afirmado em trabalhos anteriores, a selecção de doses eficazes de insulina no tratamento de ratos com diabetes mellitus experimentalmente induzida com estreptozotocina é uma tarefa difícil, demorada (por vezes praticamente infindável) e ingrata. É frequentemente revelada resistência a insulina. Contudo, na maioria dos animais do Io grupo de teste (5 de 8) conseguimos, por meio de doses elevadas de insulina, baixar a hiperglicemia até níveis inferiores a 10 mmol/1 e manter esta 34 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ compensação de insuficiência do metabolismo dos hidratos de carbono durante o período de 8 semanas (tab.30).

Tabela 30. Alterações na glicemia em ratos com diabetes mellitus experimentalmente induzida (l.° grupo) sob a influência de terapia diária com insulina. RATO N.° Período da terapia com insulina (dias) 0 7 13 21 28 35 41 46 53 60 9 17,7 15,5 12,1 10,8 11,9 10,0 7,9 8,5 6,7 6,4 10 28,7 29,0 26,7 22,4 27,8 23,3 22,8 24,9 15,5 18,4 11 18,6 18,9 15,9 11,0 9,7 12,3 11,5 8,6 10,6 9,7 12 16, 1 12,0 11,1 8,7 6,7 5,4 6, 6 8,1 6, 3 6,3 13 29,7 26,7 22,8 13,4 14,5 16, 9 18,5 14,6 20,3 18,8 14 24,4 22,2 18,0 22,1 18,3 19,1 17,7 14,8 18,8 14,3 15 19, 0 18,7 14,3 11,2 8, 6 9, 9 10, 8 8,6 9,9 7,7 16 24,2 18,8 13,8 9, 9 12,0 10,2 9,7 6,7 8, 6 8,9 Dose média de insulina (unidades) 0 4 8 12 16 14,1 12, 8 17, 6 11, 9 13,3

Embora tenhamos tido sucesso a diminuir o nível de glicemia nos ratos n.° 10, 13 e 14, a falta de reacção adequada na resposta à introdução de doses imensas de insulina (até 20-30 unidades por dia) não nos permitiu revelar a tendência para normalização da glicemia e admitir a presença nesses animais de elevada resistência a insulina individual; e a possibilidade de regeneração significativa do próprio aparelho dos ilhéus seria improvável, tanto mais que após a paragem da administração de insulina todos os ratos do 1.0 grupo tiveram uma rápida recorrência de hiperglicemia próxima do nível inicial. EXEMPLO 11

RESULTADOS DE XENOTRANSPLANTAÇÃO DE CULTURAS DE CÉLULAS DOS ILHÉUS 0 efeito antidiabético expresso da xenotransplantação de culturas de células dos ilhéus foi notado tanto em casos de injecção do transplante no peritoneu (2.° grupo de ratos experimentais), como na sua introdução na polpa do baço 35 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ (3.° grupo). É observado efeito na diminuição da manifestação clinica do estado diabético e também na depleção expressa do nível de hiperglicemia. Como mostram os dados apresentados nas tabelas, o carácter de depleção da glicemia no decorrer de ambos os métodos de administração do xenotransplante é, em alguma extensão, diferente de caso para caso. Estas diferenças eram em termos de manifestação de efeito de diminuição de açúcar, sua gravidade, e na sua persistência (estabilidade).

Tabela 31. Alterações da glicemia em ratos com diabetes mellitus experimental após xenotransplantação intraperitoneal de culturas de células dos ilhéus (2.° grupo)

Rato N.° Antes da Dias após transplantação transplantação 2 7 10 13 15 17 20 22 1 24,1 18,7 12, 2 15,5 12,0 11, 9 14,5 12,4 14,8 2 16, 6 15,0 13, 0 8,8 6,8 9,0 7,7 6,7 9,1 3 29,0 27,9 16, 1 17,7 22,2 18,4 15,5 14,1 16,5 4 21,2 18,8 12, 2 13, 0 13, 0 11, 0 12,2 10,5 8,9 5 17,9 14,8 15, 5 16, 8 15, 9 16, 0 15,9 14,0 13,7 6 21,9 19,1 14, 2 12, 8 11, 1 8,5 9,0 7,8 7,1 7 17,1 16, 6 11, 4 9,8 7,0 7,9 6,4 8,1 8, 6 8 25,6 21,1 17, 7 17,1 18,8 20, 7 18,6 21,2 20,0 M 21,7 19,0 14, 1 13, 9 13,3 12, 9 12,3 11, 9 12,3

Tabela 32. Alterações da glicemia em ratos com diabetes mellitus experimental após xenotransplantação intraperitoneal de culturas de células dos ilhéus (2.° grupo) - continuação

Rato n. ° Dias após transplantação 24 26 28 30 32 35 37 40 42 1 13,2 13,9 12,5 14,4 16, 8 12,2 15,5 12,0 11, 9 2 7,8 7,0 7,4 6,7 5,5 6,4 6,4 5,9 5,5 3 17,2 14,8 12,5 14,7 15, 6 14,1 16, 5 16,1 17,7 4 10 10,1 9,2 10,5 8,4 7,9 11,1 8,7 9,0 5 13,9 14 15, 9 12,4 14,7 15,0 14,3 13,8 15,2 6 8,1 8, 0 7,0 6,7 7,1 8,4 9,0 7,8 8,1 7 8,7 7,4 6,4 5,1 6,5 5,6 4,9 5,8 6,1 8 18,8 20,6 21, 8 22,2 19, 2 18, 6 21,2 20,0 17, 8 M 11,9 12,0 11, 6 11, 6 11,7 11, 0 12,4 11,3 11, 4 36 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ

Tabela 33. Alterações da glicemia em ratos com diabetes mellitus experimental após xenotransplantação intraperitoneal de culturas de células dos ilhéus (2.° grupo)

Rato Dias após transplantação n. ° 44 46 49 51 53 55 57 60 1 12,5 14, 4 16, 8 18,2 17,5 16, 7 15, 6 14,9 2 6,7 5, 5 7,0 7,4 6,7 6, 8 6, 0 5,7 3 15, 5 14,1 16, 5 16, 8 15, 9 17,7 15, 9 16, 0 4 10, 0 11,0 9,2 10,5 8,9 7,9 8,3 9, 4 5 14, 8 15, 5 16, 8 15, 9 16, 0 14, 6 15, 7 17,0 6 8,5 8, 0 7,8 7,1 6,7 7,4 6, 4 5,1 7 7,1 6, 6 5,1 6, 8 7,0 7,9 6, 4 5,1 8 17,7 17,1 18,8 21,9 19, 1 21,0 20, 9 17,8 M 11, 6 11,5 12,3 13, 1 12,2 12,5 11,9 11,4

Após análise dos resultados obtidos da medição da glicemia em ratos com diabetes mellitus experimental em que foi realizada uma xenotransplantação intraperitoneal de culturas de células dos ilhéus, é possivel tirar a conclusão de que se conseguiu um efeito antidiabético expresso na maioria dos animais beneficiários.

Como tal, os ratos n.° 2, 4, 6, e 7 tiveram remissão da doença manifestada pela estabilização do açúcar no sangue num nível normal ou quase normal.

Os ratos n.° 1 e 3 não demonstraram uma diminuição tão intensiva do nivel de glicemia, embora os dados estatísticos sejam muito confiáveis. Nestes casos apenas podemos falar de remissão fraccionada do estado hipoglicémico, ainda para mais que o rato n.° 1 durante as últimas semanas de observação revelou uma tendência de crescimento da hiperglicemia previamente moderada.

Em outros animais (ratos n.° 5 e 8) o declínio da glicemia não foi significativo nem estável, facto que 37 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ evidencia uma falha destas duas transplantações de culturas de células dos ilhéus.

Tabela 34. Alterações da glicemia em ratos com diabetes mellitus experimental após xenotransplantação intra-esplénica de culturas de células dos ilhéus (3.° grupo)

Rato n.° Antes da transplantação Dias após transplantação 2 7 10 13 15 17 20 22 17 17,1 15,5 16,8 13,5 12,2 9,9 12,4 10,2 9,4 18 22,1 21, 0 19,5 17,8 18,0 15,6 17,1 12, 6 12,1 19 21,2 21, 9 17,6 18,7 16, 2 14,4 11, 8 12,2 10,5 20 26, 9 21, 8 14,2 13,0 12,8 11,8 12,2 10,5 13,0 21 21,9 14,8 15,5 14,1 15, 9 13,6 15,5 14,0 13,3 22 28,8 29, 1 24,2 30,8 25,9 21,8 25,2 27,1 22,7 23 15,5 13, 6 11,5 8, 8 9,0 9,7 7,4 8,0 6, 6 24 22,6 23, 1 17,1 14,7 15,8 12,2 15,5 12,0 14,2 M 19,3 20, 1 17,1 16,2 15,2 13,6 14,0 13,3 12,5

Tabela 35. Alterações de glicemia em ratos com diabetes mellitus experimental após xenotransplantação intra-esplénica de culturas de células de ilhéus (3.° grupo) - continuação

Rato n.° Dias após transplantação 24 26 28 30 32 35 37 40 42 17 10,2 10,9 10, 0 9,4 8,7 11,2 10,5 9,8 9,9 18 11,8 8,7 7,4 6,4 5,1 6,5 6, 6 7,9 5,7 19 17,7 16,8 11,2 14,0 10, 6 11, 4 10, 6 11,1 9,1 20 8,4 9,0 8,8 8,7 7,5 8,4 9, 0 9,7 9,0 21 15,9 12,4 13,5 12,4 14,0 15,1 13, 4 13,8 12,8 22 18,1 18,0 17,0 18,1 18,4 17, 9 18,1 17,8 18,1 23 9,7 7,4 7,5 6,5 5,4 5,6 5,4 5,8 6, 6 24 18,8 20,6 21, 8 22,2 19, 2 18, 6 21,2 20,0 17,8 M 13,8 12,1 12,2 12,2 11,1 11, 8 11,9 12,0 11, 1 38 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ

Tabela 35. Continuação

Rato n.° Dias após transplantação 44 46 49 51 53 55 57 60 17 11,5 10,4 8,1 8,2 8,7 6,7 6, 6 4,9 18 6,7 5, 5 7,0 7,4 9,2 10, 5 8,9 7,9 19 10,5 9,4 10,5 8,8 9,9 7,4 8,9 9,1 20 9,1 6,7 7,4 7,1 11, 0 7,8 9,8 7,5 21 14,8 15,7 17,0 15, 9 13, 6 14, 0 15,5 16,8 22 17,5 17,8 16, 7 16, 8 16, 0 15,7 14, 9 15,8 23 8,7 6, 0 5,9 8,3 7,6 6,7 4,6 5,7 24 21,5 21,1 19, 1 21, 0 18, 8 21, 0 18, 9 19,7 M 12,5 10,3 11,5 11,7 11, 9 11, 2 11,0 10,9

Após a xenotransplantação de cultura de células dos ilhéus na polpa do baço, notou-se uma digressão expressa da hiperglicemia na maioria dos animais (7 de 8). Como tal, a normalização prática da glicemia aconteceu em 5 ratos com diabetes mellitus experimental (n.° 17-20, 23). Também, num beneficiário adicional (rato n.° 21) o nivel de glucose no sangue diminuiu significativamente, mas o seu nivel permaneceu num nivel hiperglicémico médio, e na segunda metade do período de observação notou-se um aumento gradual da glicemia, o que pode ser mesmo avaliado como uma recorrência definitiva de hiperglicemia elevada. Em dois dos animais do grupo (n.° 22 e 24) não foi conseguido um amplo efeito antidiabético, embora o rato n.° 22 atingisse uma diminuição estatisticamente confiável da glicemia, mas que não pode ser classificada como uma remissão da diabetes.

Como foi anteriormente notado, esperávamos uma divergência nas alterações da glicemia entre os métodos de xenotransplantação intraperitoneal e intra-esplénica, mas pareceu não ser muito fundamental. Para fins de simplicidade de comparação, combinámos os indicadores de glicemia no 2.° e no 3.° grupos de animais em dinâmica numa só tabela (n.° 34). 39 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ

Tabela 36. Dinâmica de alterações na glicemia (média, M) em ratos do 2.° grupo (xenotransplantação intraperitoneal) e no 3.° grupo (transplantação intra-esplénica) em ratos beneficiários:

Grupo n. ° Antes da transplantação Dias após transplantação 2 7 10 13 15 17 20 22 2o 21,7 19, 0 14,1 13, 9 13,3 12,9 12,3 11, 9 12,3 3o 19, 3 20, 1 17,1 16, 2 15,2 13, 6 14, 0 13, 3 12,5

Grupo n. ° Dias após transplantação 24 26 28 30 32 35 37 40 42 2o 11, 9 12,0 11, 6 11, 6 1 11,7 11, 0 12, 4 11, 3 11, 4 3o 13, 8 12,1 12,2 12,2 11,1 11, 8 11, 9 12, 0 11,1

Grupo Dias após transplantação n. ° 44 46 49 51 53 55 57 60 2o 11,6 11,5 12,3 13, 1 12,2 12,5 11, 9 11,4 3o 12,5 10,3 11,5 11, 7 11,9 11,2 11,0 10,9

Subsequentemente à conclusão da porção fisiológica da pesquisa, os animais desta experiência foram mortos sem dor. Assim, tomaram-se amostras de sangue dos animais experimentais, e testaram-se os soros processados quanto a insulina (também de coelho e de rato). Apresentam-se abaixo os resultados da análise imunoenzimática (imunoensaio enzimático) de amostras de soro do sangue de ratos beneficiários, análises que foram realizadas utilizando várias configurações especiais. (Tabela 35). 40 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ

Tabela 37. Teor de insulina xenógena (coelho) e própria no soro do sangue de ratos submetidos a transplantação de culturas de células dos ilhéus de pâncreas de coelhos recém-nascidos :

Rato n.° Insulina de Coelho; Insulina de Rato Insulina Total 1 16 7 23 2 16 52 68 3 45 11 56 4 23 50 73 5* - - - 6 57 53 110 7 21 48 69 8 9 20 29 17 23 60 83 18* - - - 19 17 134 151 20* - - - 21 4 24 28 22 6 27 33 23 5 74 79 24 0 7 7 * sem resultado verificável devido a hemólise intensiva (lise de eritrócitos massiva) de soro.

Em adição, analisámos amostras de sangue obtidas após a conclusão das experiências de ratos com diabetes induzida por estreptozotocina, que tinham sido submetidos a terapia com insulina. Nestes, o soro foi examinado quanto ao teor de insulina humana e de rato (tab.36) com utilização de configurações correspondentes para análise imunoenzimática. 41 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ

Tabela 38. Teor de insulina humana e de rato no soro de sangue de ratos submetidos a terapia com insulina (l.° grupo).

Rato n.° Insulina Humana Insulina de Rato Insulina Total 9 194 17 211 10* - - - 11 258 24 282 12 79 23 102 13 144 0 144 14 331 4 335 15* - - - 16 261 0 261 * não foi obtido um resultado verificável devido a hemólise intensiva Não é simples interpretar os resultados obtidos. A complexidade da análise é condicionada, primeiro que tudo, pelo facto de que o que está demonstrado nos dados das tabelas reflecte, em particular, uma função de produção de insulina das células beta de coelho xenotransplantadas e das células beta próprias (de rato) (Tab.8), ou a insulina humana injectada e a insulina de rato própria (Tab.9) apenas no momento da conclusão de experiências de vários dias. Certamente, seria melhor ter dados acerca da dinâmica do teor dos vários tipos de insulina em vários tempos durante as experiências. Mas a extrema dificuldade de obter sangue não hemolisado de pequenos animais de laboratório em quantidades adequadas para a preparação do volume necessário de soro sem causar graves traumatismos nos animais, não permite a sua implementação sem risco de perda destes valiosos animais de laboratório. Assim, estaríamos a actuar com base nos dados que temos disponíveis.

Parece que na maioria dos casos (11 de 13) a insulina de coelho foi detectada no sangue de ratos beneficiários, o que é uma evidência incontestável da presença no sangue dos animais das células beta de coelho, i.e. xenotransplantadas, que segregam para o sangue do seu "novo dono" uma insulina relevante para o dador. A sua concentração flutua significativamente de 4 a 57 pmol/1. 42 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ Ο segmento de ratos beneficiários em que foi detectada insulina da sua própria espécie é ainda maior (12 de 13) . As flutuações do seu teor são muito grandes - de 7 a 134 pmol/1. Ao contrário da interpretação da presença de insulina xenogénica em animais submetidos a xenotransplantação de células dos ilhéus, é impossível estimar um único valor para a detecção de concentrações de uma ou outra da insulina segregada por células beta dos ratos de laboratório com diabetes experimental. É possível avaliar mais ou menos objectivamente os dados obtidos, quando considerando a proporção de vários dados quantitativos inter-relacionados, nomeadamente: inter-relação entre o nível de glicemia e o da insulinemia total, razão entre insulina de rato e de coelho (em ratos beneficiários) ou insulina humana (em ratos submetidos a injecção da sua preparação), e também tentar correlacionar a dinâmica da glicemia desde o início até ao final da observação com insulinemias diferentes (em termos de espécies de origem (específica)).

Foi conduzida uma análise selectiva, mas caracterizante de padrões comuns consistentes, ordem, várias correlações de indicadores de glicemia e concentração de insulina em soro do sangue de animais de laboratório foram revistas. De cada grupo seleccionaram-se 3 ratos com resultados mais representativos dos exames laboratoriais, e serão tabulados todos os dados numa só tabela (Tab. N.° 37). 43 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ

Tabela 39. Indicadores de glicemia e insulinemia em alguns ratos do 2.°, 3.° e l.° grupos de ratos experimentais com diabetes mellitus experimental.

Rato n. ° Glicemia inicial mmol/1 Glicemia final mmol/1 Insulina de coelho (humana) pmol/1 Insulina de rato pmol/1 Insulina total pmol/1 2 16, 6 5,7 16 52 68 4 21,2 9,4 23 50 73 8 25, 6 17,8 9 20 29 17 17,1 4,9 23 60 83 19 21,2 9,1 17 134 151 24 22, 6 19, 7 0 7 7 9 17,7 6, 4 194 17 211 14 24,4 14,3 331 4 335 16 24,2 8,9 261 0 261

Foi realizada a análise dos resultados retirados do 2.° grupo experimental (xenotransplantação de culturas de células dos ilhéus no peritoneu). Em ambos os casos de sucesso (ratos n.° 2 e n.° 4), a remissão do estado diabético foi acompanhada por diminuição significativa da glicemia - de 16,6 & 21,2 mmol/1 para 5,7 & 9,4 mmol/1 respectivamente. Como tal, no final dos 2 meses de observação houve normalização dos níveis de insulinemia (respectivamente até 68 e 73 pmol/1) principalmente por conta do restabelecimento das actividades produtoras de insulina das células beta próprias dos ratos beneficiários (52 & 50 pmol/1, respectivamente), embora a proporção de insulina segregada por células beta xenotransplantadas de coelhos recém-nascidos pareça ser relativamente suficiente (16 & 23 pmol/1, respectivamente). O terceiro animal deste grupo (rato n.° 8) com nível de hiperglicemia inicialmente superior (25,6 pmol/1), demonstrou funcionamento das células beta transplantadas (concentração de insulina de coelho de 9 pmol/1) juntamente com as células beta próprias (concentração de insulina de rato - 20 pmol/1). A produção de total de insulina (basicamente por conta dos esforços próprios dos ilhéus do pâncreas do beneficiário) assegurou uma queda estatisticamente significativa na hiperglicemia (até 17,8 pmol/1), contudo, não foi suficiente para conseguir a remissão do estado diabético. 44 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ Νο 3.° grupo experimental (xenotransplantação intra-esplénica de células dos ilhéus) os ratos n.° 17 e 19 foram escolhidos como exemplos, que tinham glicemias iniciais e finais muito similares à dos ratos n.° 2 e 4 do 2.° grupo. Contudo, se os dados da glicemia e da insulinemia nos ratos n.° 2 e 17 pareceram muito próximos (respectivamente: glicemia inicial 16,6 & 17,1 mmol/1, glicemia final - 5,7 & 4,9 mmol/1, insulina de rato - 52 & 60 p/mol/1) , já nos ratos n.° 4 e n.° 19 com identidade da glicemia inicial (21,2 & 21,2 mmol/1) e similaridade de glicemia final (9,4 & 9,1 mmol/1), a insulinemia total foi muito distinta (mais de 2 vezes respectivamente 73 e 151 pmol/1) . Como tal, esta distinção foi, em geral, devida a diferenças na concentração da insulina de rato (respectivamente 50 & 134 pmol/1).

Nos ratos do primeiro grupo, devido à insulinoterapia super-intensiva, foi possível atingir um teor normal ou próximo do normal de glucose no sangue. Aparentemente, devido ao restabelecimento do metabolismo insuficiente aplicável, emergiram as condições para o restabelecimento parcial do conjunto das células beta próprias dos animais experimentais. Contudo, o grau de regeneração conseguido pareceu ser deficiente para esta quantidade de células beta regeneradas produzirem quantidades de insulina suficientes para afectar significativamente o desenvolvimento da diabetes mellitus experimental.

Em alguns ratos que foram submetidos a xenotransplantação de culturas de células dos ilhéus e que demonstraram remissão do estado diabético, apenas foi notada uma regeneração parcial de células beta (figura 6). Contudo, o efeito antidiabético foi, provavelmente, proporcionado por actividade produtora de insulina de células beta de coelhos recém-nascidos transplantadas com sucesso em ratos beneficiários. Isto é indicado pelas observações na pesquisa do teor de insulina xenógena (de coelho) e própria (de rato) no sangue, (tabela 8). A pesquisa de pâncreas de ratos com Diabetes Mellitus experimental, em que foi notado efeito antidiabético significativo após a xenotransplantação da cultura de células dos ilhéus de coelhos recém-nascidos, revelou regeneração de 45 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ células beta. Como tal, foi notado o processo restaurador referido, como regra, nomeadamente nos ilhéus de Langerhans, precisamente nos lugares da sua localização. A coloração especial de tecido de pâncreas de ratos beneficiários submetidos a uma xenotransplantação bem sucedida de culturas de células dos ilhéus demonstrou que a regeneração de estruturas de ilhéus de Langerhans aconteceu, geralmente, por conta de células beta. Ao mesmo tempo, é notado o surgimento de células beta num único ponto (coradas por aldeido-fucsina) fora da localização dos ilhéus, o que pode indirectamente indicar uma possibilidade de geração de células beta fora das estruturas dos ilhéus, provavelmente, no epitélio do dueto.

Deste modo, com base nos resultados de experiências cientificas conduzidas, é possível tirar várias conclusões gerais: A estreptozotocina causa um efeito de destruição geral em células beta das células dos ilhéus pancreáticos, mas ao mesmo tempo, directamente ou indirectamente, conduz à perda de outras células.

Parece que o processo regenerativo nos ilhéus de Langerhans afectados acontece, principalmente, devido a restabelecimento do conjunto de células beta. A insulinoterapia intensiva não é capaz de, apenas pela normalização do estado glicémico, proporcionar um processo de reabilitação decentemente expresso em ilhéus pancreáticos de ratos com diabetes mellitus induzida por estreptozotocina.

As culturas de células dos ilhéus produzidas a partir de pâncreas de coelhos recém-nascidos utilizando um método original, consistem, principalmente, em células beta purificadas de elementos celulares balastro e têm uma actividade produtora de insulina muito elevada.

Ambas as xenotransplantações intraperitoneal e intra-esplénica, de culturas de células dos ilhéus em ratos com diabetes mellitus experimental induzida por estreptozotocina, 46 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ na maioria dos casos, asseguram uma remissão estável do estado diabético durante pelo menos 8 semanas. 0 efeito de redução de açúcar após a transplantação é assegurado tanto pelo funcionamento das células beta transplantadas como pela actividade de produção de insulina em algum grau restabelecida do conjunto de células beta em ilhéus do pâncreas de ratos beneficiários. Isto é suportado por observações nas flutuações das concentrações de insulina exógena (de coelhos) e própria (de ratos) no sangue de animais experimentais.

Os exames histológicos de pâncreas de ratos experimentais confirmaram um papel insignificante da terapia intensiva com insulina e expressaram estimulação de processos regenerativos em ilhéus de ratos com Diabetes mellitus induzida por estreptozotocina após xenotransplantação de culturas de células dos ilhéus.

Possivelmente, a regeneração de células beta acontece não apenas nas fronteiras da localização dos ilhéus de Langerhans, mas também em certas estruturas fora do tecido dos ilhéus pancreáticos. É difícil dar uma interpretação a estes resultados. Apenas uma versão de trabalho pode ser avançada - a presença de uma sensibilidade diminuída de receptores de insulina no rato n.° 19 no sentido da insulina própria. A insignificante diminuição da hiperglicemia no rato n.° 24 pode ser explicada pela falta, aparentemente, de células beta xenotransplantadas não estabelecidas (ou rejeitadas devido a incompatibilidade imunológica, ou despojadas da sua actividade de produção de insulina em resultado do fenómeno da apoptose) (insulina de coelho - 0) e fraca actividade hormonal das células beta próprias do animal (insulina de rato - 7 pmol/1).

Nomeadamente, a reduzida sensibilidade de receptores de insulina acima referida (mas nomeadamente no sentido de introduzida do exterior (insulina humana sintetizada) pode explicar os níveis de insulinemia muito elevados (respectivamente 194, 331 e 261 pmol/1) em ratos do l.° grupo (n.° 9, 14 & 16) que foram submetidos a terapia diária com 47 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ insulina. Como tal, a concentração de insulina própria nestes animais era baixa (nos ratos 9 e 14) ou não foi mesmo detectada de todo. (rato n.° 16). É uma possibilidade que a presença no sangue de grandes quantidades de insulina exógena impedisse uma actividade mais significativa das células beta próprias de ilhéus do pâncreas de ratos do l.° grupo. A elevada concentração de insulina exógena, devido à regra do feedback, facilitou a atrofia peculiar do aparelho dos ilhéus, "atrofia por desuso". Não excluindo que na base da terapia super-intensiva com insulina, regime que não pode competir com a secreção normal de insulina por um pâncreas endócrino saudável, os ratos demonstraram episódios hipoglicémicos expressos, que foram cerceados por ingestão excessiva de alimentos (a alimentação não estava limitada) , o que por si só aumentou as necessidades de administração de insulina. Iremos considerar, naturalmente, o impacto pro-diabético de todo o grupo de hormonas cuja concentração é muito aumentada no processo de desenvolvimento do estado hipoglicémico, e um impacto de uma variedade de situações indutoras de stress, tais como colheita de sangue, intervenções operatórias, e etc.

Em contraste com a terapia intensiva com insulina, mais exactamente - terapia hiperinsulinémica, o efeito antidiabético da xenotransplantação de culturas de células dos ilhéus actua por secreção para o sangue dos animais beneficiários de quantidades de insulina que são segregadas pelas células beta transplantadas mais ou menos adequadas ao nivel de glicemia. Em adição, a secreção de insulina acontece na cavidade abdominal ou no baço, resultando que a hormona entra no sistema da veia porta, podendo ser considerada como praticamente fisiológica, i.e. modo natural para o organismo.

As pesquisas experimentais bem sucedidas que demonstraram elevado efeito antidiabético do enxerto de células dos ilhéus obtidas a partir de pâncreas de coelhos recém-nascidos, permitiram a utilização destas culturas na prática clinica. 48 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ EXEMPLO 12

XENOTRANSPLANTAÇÕES INTRAMUSCULARES DE CULTURAS DE CÉLULAS DOS ILHÉUS

Um total de 112 pacientes com diabetes mellitus do tipo 1 estiveram sob observação dinâmica bem documentada. Dos 112 pacientes, 58 eram homens e 54 eram mulheres. A idade dos pacientes no momento da transplantação era de 16 a 53 - média de 33,5 anos de idade.

Sabe-se que a gravidade da manifestação de complicações diabéticas secundárias depende significativamente da longevidade da doença. Supostamente, a destruição de células beta próprias do paciente em resultado do processo auto-imune acontece aproximadamente no 5.° ano após a manifestação da doença. As complicações diabéticas secundárias manifestam-se usualmente em pacientes com longevidade de doença superior a 10 anos. Devido a isso, todos os pacientes foram divididos em 3 grupos com referência à longevidade da doença: a.) 1 a 5 anos - 16 pessoas; b.) 6 a 10 anos - 43 pessoas, c.) mais de 10 anos - 53 pacientes. Todos os pacientes tinham sido examinados para determinar o carácter do desenvolvimento da diabetes mellitus e estabelecer a presença de complicações diabéticas.

Usualmente, utilizaram-se culturas de células dos ilhéus recebidas através dos métodos descritos acima provenientes de 50-60 pâncreas de coelhos recém-nascidos de 1-2 dias para a dose de transplantação para 1 paciente.

Cada dose da cultura continha 1,5 - 2,0 milhões de células beta. Injectaram-se culturas de células dos ilhéus colhidas imediatamente antes da transplantação através da seringa nos músculos rectus abdominis sob anestesia local. Não se utilizou imunossupressão.

Apresenta-se abaixo a descrição da técnica de transplantação de culturas de células dos ilhéus.

Uma dose de culturas de células dos ilhéus representa uma suspensão estéril em solução salina de Hank (volume de 10-15 ml) colocada num tubo de plástico marcado de maneira apropriada. Utilizando uma agulha de injecção com não menos de 49 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ 7cm de comprimento e mais de 1 mm de diâmetro, recolhe-se a suspensão de células dos ilhéus para uma seringa de 20 ml de volume.

Do lado direito do umbigo dos pacientes na zona de projecção do músculo rectus abdominisr utilizando uma seringa separada e correspondente agulha de injecção, realiza-se a anestesia de infiltração local da parede abdominal frontal (com Novocaina ou outro anestésico).

Após a anestesia utilizámos uma agulha de injecção para realizar a punctura do espaço sub-aponeurose do músculo rectus abdominis, e injectar a suspensão de culturas de células dos ilhéus. O local da injecção deve ser fechado com um penso estéril.

Em adição à administração tradicional de culturas de células dos ilhéus no músculo abdominal transverso, verificou-se ser melhor a aplicação de um método de transplantação mais complexo mas mais fisiológico - a transplantação através da veia porta, cujo acesso é realizado através de algaliação da veia umbilical obliterada. Existem algumas bases para considerar (quase 20 destas transplantações foram completamente analisadas) que devido a este método de administração, é conseguida a acção mais rápida e mais expressa de redução de açúcares da transplantação, assim como uma redução significativa de necessidades de insulina exógena. (Shumakov et al., 1993 {16}.) Contudo, o grau de efeito terapêutico da transplantação intra-portal de culturas de células dos ilhéus de pâncreas de coelhos recém-nascidos em complicações diabéticas secundárias é praticamente indistinto dos efeitos da transplantação intramuscular. Devido às complexidades técnicas especificas e aos possíveis riscos cirúrgicos deste método, ele foi abandonado, e quase todas as transplantações são realizadas utilizando um método simples e seguro de injecção da suspensão celular sob o aponeurose do músculo abdominal transverso.

Ao mesmo tempo, enquanto se realizam séries de transplantações intraportais, examinámos a capacidade de células beta contidas em culturas de células dos ilhéus de coelhos recém-nascidos responderem a estímulos correspondentes 50 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ por secreção in vivo - i.e. num organismo de um paciente com diabetes tipo 1. Cinco pacientes masculinos foram sujeitos a esta pesquisa, variando as suas idades de 25 a 45 anos, e com historial de doença - de 12 a 25 anos. Ao longo do guia, controlo de aparelhos televisuais de X-ray, através da veia subclavicular esquerda foi colocado o cateter na veia hepática direita. A entrada de sangue (5ml) foi realizada instantaneamente pelas veias hepática e porta (através do cateter trans-umbilical que tinha sido colocado durante a anterior transplantação de cultura de células dos ilhéus. Depois disso, com a finalidade de estimulação local das culturas de células dos ilhéus de pâncreas de coelhos recém-nascidos transplantadas por via intraportal, injectaram-se cerca de 20 ml de solução de glucose a 20% na veia porta, em analogia com uma taxa de 1 grama de glucose por 1 quilograma de peso corporal do paciente, que tinha sido utilizada no teste de carga intravenosa. A retirada de sangue das veias porta e hepática foi realizada 1 min, 5 min, 15 min, 30 min e 60 minutos após a administração de glucose. Como mostrou o exame ao sangue quanto ao teor de insulina, antes da estimulação, já havia uma diferença entre as concentrações de insulina na veia porta e na veia hepática (respectivamente 4,9±0,6 e 6,111,0 microUNIDADES/ml). Em 1 minuto após a administração de glucose notou-se que a concentração de insulina aumentou 1,5 vezes na veia hepática (de 6,111,0 para 9,111,3 microUNIDADES/ml; p<0,05), que é duas vezes maior que a sua concentração na veia porta (4,210,5 microUNIDADES/ml). Ao 5.° minuto após a estimulação, a concentração de insulina na veia hepática estava a voltar ao nivel inicial, e a partir do 15.° minuto estava a diminuir significativamente, o que, presumivelmente, indica depleção pós-estimulação da função produtora de insulina de culturas de células dos ilhéus de coelhos recém-nascidos implantadas no sistema portal do fígado.

Estes resultados demonstram uma capacidade substancial de produção de insulina (em resposta a estimulação com glucose) de células beta de culturas de células dos ilhéus xenotransplantadas no fígado do beneficiário e a sua possível capacidade para funcionarem sob o princípio de "reacção de feedback ". 51 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ A prova do funcionamento das células beta de pâncreas de coelhos recém-nascidos transplantadas foi demonstrada através deste método original (único) pois é ainda impossível detectar produção de insulina pelo transplante com base na secreção de péptido C, devido à falta de existência no mundo de configurações para identificação imunorradiológica ou por imuno-fermento de péptido C de coelhos. EXEMPLO 13

RESULTADOS GERAIS DA XENOTRANSPLANTAÇÃO DE CULTURAS DE CÉLULAS INSULARES PANCREATICAS EXPERIMENTAL EM RATOS COM DIABETES MELLITUS A capacidade de culturas de células insulares pancreáticas, recebidas através do método original, provenientes de pâncreas de coelhos recém-nascidos, sobreviverem e funcionarem num ambiente in vivo, foi demonstrada por nós em experiências de xenotransplantação destas culturas em animais com diabetes mellitus experimental.

Utilizaram-se como animais experimentais ratos machos da linhagem Wistar de massa corporal de 180-220 g, alimentados regularmente. A diabetes mellitus experimental foi provocada por aplicação subdérmica de aloxana (dosagem de 200 ml para 1 kg de peso corporal) ou por aplicação subdérmica de estreptozotocina (dosagem de 60 ml/kg). Durante as experiências e sondagens de controlo utilizámos apenas ratos com diabetes induzida por aloxana ou estreptozotocina, cujo nível de hipoglicemia com estômago vazio era de 20 mmol/1 e superior. Testes conduzidos anteriormente indicaram que estes animais não têm reversão espontânea da diabetes mellitus experimental.

Após transplantação de culturas de células dos ilhéus pancreáticos, 88 dos 104 ratos com diabetes mellitus induzida por aloxana estável ou grave (quase 85%) apresentaram firme remissão do estado diabético até ao final do período experimental (20 semanas). Foi registada uma firme diminuição dos níveis de açúcar no sangue até níveis quase normais no sangue de animais beneficiários. Ao mesmo tempo, os sintomas clínicos característicos da diabetes também desapareceram (tais como perda de peso, polidipsia, poliúria). O efeito antidiabético da xenotransplantação foi claramente demonstrado 52 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ tanto nos casos de aplicação de culturas no fígado (através da veia porta ou directamente no parênquima do fígado) como também no baço (as culturas foram aplicadas intra-polpa), e também através dos músculos abdominais. Mesmo após 8 semanas após a xenotransplantação, foram detectadas células dos ilhéus pancreáticos com estrutura conservada e com sinais de actividade secretória nos locais da implantação em ratos com remissão da diabetes experimental.

Durante uma série especial de experiências demonstrou-se haver claramente um papel do cultivo preliminar de células dos ilhéus pancreáticos in vitro na sobrevivência de células em organismos dos beneficiários xenogénicos. Para esse fim, realizámos análises comparativas de resultados de xenotransplantação de culturas de células dos ilhéus pancreáticos de pâncreas de fetos humanos e xenotransplantação de tecido de ilhéus fetal não cultivado em ratos com diabetes mellitus experimental. Foi detectado que o efeito redutor de açúcares é mais expressivo e duradouro nos casos de transplantação de células dos ilhéus pancreáticos pré-cultivadas em comparação com a transplantação de tecido de pâncreas não cultivado, que resulta apenas numa remissão de curta duração do estado diabético. Assim, o resultado de imunomodulação do cultivo in vitro foi experimentalmente provado como aumentando significativamente o período de sobrevivência num organismo de beneficiário estranho.

Os pâncreas de 18 ratos beneficiários, nos quais tinha sido realizada com sucesso xenotransplantação de culturas de pâncreas de coelhos recém-nascidos, foram sujeitos a exame histológico 8 semanas após a transplantação. Para esse fim, um fragmento de pâncreas foi fixado em solução Buena e foi mergulhado em parafina. Coraram-se cortes (5-7 pm de espessura) com hematoxilina e eosina, e também com aldeído-fucsina para revelar as células β. Ao mesmo tempo, os pâncreas de 6 animais de controlo que tinham Diabetes induzida por aloxana não tratada assim como os pâncreas de 6 ratos saudáveis (sem aplicação de aloxana) foram examinados de perto.

Quando se examinaram os pâncreas de ratos saudáveis intactos, foram encontradas cerca de 45 de 76% de células 53 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ beta, como esperado, nos ilhéus de "Langerhans". Os ratos com Diabetes induzida por aloxana não tratados tinham uma quantidade muito diminuída de células β nos ilhéus - em média 8,3 +-1,1 %.

Encontraram-se quantidades de células beta significativamente superiores nos ilhéus nos ratos beneficiários. Em animais que tinham sido submetidos a xenotransplantação de culturas de células dos ilhéus pancreáticos, os seus próprios pâncreas apresentavam células β típicas e a sua proporção entre as células dos "ilhéus" era de 10 a 55% (algo entre 7 e 21%) (média de 23,5 ±8,8%).

Em relação a estas experiências, podemos assumir que o efeito antidiabético da xenotransplantação de culturas de Cl no desenvolvimento de diabetes experimental em ratos ocorre em 2 vias genéricas: a.) Funcionamento de células β transplantadas, confirmado, em adição ao efeito de redução de açúcares expresso, também por revelação de grupos de células dos ilhéus pancreáticos transplantadas na polpa do baço de animais beneficiários; b.) Efeito estimulante da transplantação de culturas de células dos ilhéus pancreáticos nos aparelhos dos ilhéus de pâncreas de ratos beneficiários, possibilidade que é confirmada por dados de exames histológicos que revelam a existência de frequência significativa de ilhéus com células β normais e maior proporção destas nos ilhéus do pâncreas de ratos beneficiários do que de ratos com Diabetes induzida por aloxana não tratados. O sucesso da pesquisa experimental tornou-se a base para a realização de transplantação clínica de células dos ilhéus de pâncreas de coelhos recém-nascidos em pacientes com Diabetes tipo 1. EXEMPLO 14 TRANSPLANTAÇÃO CLÍNICA DE CULTURAS DE CÉLULAS DOS ILHÉUS PANCREÁTICOS PRODUZIDAS A PARTIR DE PÂNCREAS DE COELHOS RECÉM-NASCIDOS .

Um total de 112 pacientes com Diabetes Mellitus Tipo 1 (diabetes mellitus dependente de insulina - DMDI) estiveram sob supervisão dinâmica bem documentada. Do total de 112 pacientes 58 eram homens e 54 eram mulheres. A idade dos 54 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ pacientes no momento da transplantação variava entre 16 e 53 -média de 35 anos de idade.

Sabe-se que a gravidade da manifestação de complicações diabéticas secundárias depende significativamente da duração da diabetes mellitus dependente de insulina. Supostamente, a destruição das células β próprias do paciente em resultado do processo auto-imune acontece aproximadamente ao 5.° ano após a manifestação da doença. As complicações diabéticas secundárias manifestam-se usualmente em pacientes com duração de doença de mais de 10 anos. Devido a isto, todos os pacientes com diabetes mellitus dependente de insulina foram divididos em 3 grupos com referência à duração da doença: a.) 1 a 5 anos -16 pessoas; b.) 6 a 10 anos - 43 pessoas, c.) mais de 10 anos - 53 pacientes. Todos os pacientes tinham sido examinados com o objectivo de determinar o carácter do desenvolvimento da diabetes mellitus dependente de insulina e estabelecer a presença de complicações diabéticas.

Usualmente utilizaram-se culturas de Cl recebidas através dos métodos acima descritos provenientes de 50-60 pâncreas de coelhos recém-nascidos de 1-2 dias para a transplantação para um paciente. A suspensão foi usualmente entregue no músculo abdominal transverso sob anestesia local. Não foi utilizada imunossupressão.

Apresentam-se abaixo os resultados da xenotransplantação de culturas de células dos ilhéus pancreáticos no decurso do desenvolvimento de diabetes mellitus dependente de insulina, na expressão das suas complicações em pacientes com diferentes durações da doença.

TRANSPLANTAÇÃO DE CULTURAS DE CÉLULAS DOS ILHÉUS PANCREÁTICOS DE COELHOS RECÉM-NASCIDOS EM PACIENTES COM DIABETES MELLITUS DEPENDENTE DE INSULINA DE 1 A 5 ANOS 5 dos 16 pacientes deste grupo tinham diabetes mellitus dependente de insulina com carácter muito lábil. 2 deles tinham condições hipoglicémicas frequentes (várias por semana) espontâneas (sem conhecimento das razões que as provocam), o que provocou numerosas tentativas de tratamento com internamento, mas todas as tentativas para estabilizar o decurso da doença ou de determinar a dosagem de insulina foram 55 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ em vão. 3 pacientes tinham diabetes mellitus dependente de insulina lábil com possibilidade de desenvolvimento de cetoses de difícil eliminação; tentativas de atingir uma compensação metabólica apenas originaram um efeito de curta duração.

Três pacientes (2 deles com diabetes mellitus lábil) revelaram sintomas de neuropatia sensório-motora - parestesia e dor nos músculos da barriga da perna. Após xenotransplantação intramuscular de culturas de células dos ilhéus pancreáticos, a maioria dos pacientes notou uma redução dos níveis de glicemia médios diários, usualmente elevados, durante 2-4 semanas. Foi adicionalmente notada uma retenção do seu valor dentro da gama correspondente a uma boa compensação do metabolismo dos hidratos de carbono (média de 7,8 a 9,9 mmol/kg) durante pelo menos os 12 meses de supervisão após a transplantação. Deste modo, em todos os 5 pacientes com DMDI lábil o decurso da doença adquiriu uma natureza estável: a predisposição para condições hipoglicémicas e cetose desapareceu. A melhoria do controlo glicogénico após a transplantação de culturas de células dos ilhéus pancreáticos de coelhos recém-nascidos confirma a informação da determinação da hemoglobina glicosilada no sangue de beneficiários (redução de 12,4% antes da transplantação para 9,6%, 8,3 e 10,1% relativamente a 6, 9 e 12 meses após a transplantação. A superior compensação da diabetes mellitus dependente de insulina e a clara tendência para redução do nível médio diário de glicemia permitiram-nos no final do l.° mês reduzir um pouco a dosagem de insulina administrada (em média 12%) , que permaneceu em algum grau reduzida nos 3, 6, 9 e 12 meses após a transplantação - respectivamente para 31,5%, 36,2%, 25,5% e 18,4%. Deste modo, as necessidades de 3 pacientes de insulina exógena diminuíram entre o 4.° e os meses após transplantação em mais de 50% (de 54% a 86%), ao mesmo tempo que para 2 pacientes a dose de insulina administrada a 1-3 meses do período após a transplantação foi temporariamente (durante um período de 2-4 semanas) algo diminuída para 13% e 12%.

Como em pacientes com historial da diabetes mellitus dependente de insulina com menos de 5 anos existe a possibilidade da presença de células β próprias, esperaríamos uma avaliação da secreção residual de péptido C antes da 56 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ transplantação (as análises foram realizadas automaticamente com o auxilio do método de imuno-fermento, cujos parâmetros usuais do teor de péptido C no soro do sangue são de 0,5-3,5 ng/ml). Verificou-se que antes da transplantação apenas 3 de 6 pacientes (19%) não tinham secreção de péptido C nem basal (com estômago vazio) nem estimulada (após pequeno-almoço padrão). A duração do seu historial de diabetes mellitus dependente de insulina era superior a 3 anos. O nível médio de péptido C basal e estimulado em pacientes com duração da doença de 1 a 5 anos (incluindo expoentes zero em 4 deles) era de, respectivamente, 0,12 e 0,36 ng/ml. Após a transplantação em 2 de 3 "beneficiários negativos para péptido C" a concentração foi registada - primeiro estimulada, depois (ao 3.° mês) - uma secreção basal de péptido C, o que indicou um restabelecimento da secreção de insulina pelas células β próprias do paciente. Os "beneficiários positivos para péptido C" demonstraram um aumento substancial do teor de péptido C no soro do sangue, que em 5 pacientes até atingiu o factor normal. É importante apontar que no final do l.° ano de observação não havia tendência expressa para depleção de péptido C no sangue dos beneficiários. Assim eram as alterações notadas durante os 12 meses após a primeira transplantação em pacientes com diabetes mellitus dependente de insulina com historial de doença de duração de 1 a 5 anos.

Nove pacientes deste grupo com um intervalo médio de 13,3 ± 1,8 meses foram submetidos a transplantações intramusculares repetidas de culturas de células dos ilhéus pancreáticos de coelhos recém-nascidos: 1 paciente três vezes, 3 pacientes -duas vezes, e 5 pacientes - uma vez. Nenhum destes pacientes apresentou sinais locais ou gerais de rejeição / deslocação de nenhum transplante, nem nenhumas reacções alérgicas.

Oito dos 9 pacientes que tinham sido submetidos a transplantação repetida revelaram efeito terapêutico com valor não inferior ao da transplantação inicial. Em 3 de 4 pacientes, que foram submetidos a xenotransplantação de culturas de células dos ilhéus pancreáticos três vezes (i.e. + repetição 2 vezes) notou-se um incremento do efeito clínico, tal como um aumento da massa muscular e significativa melhoria do tónus de vida. Deste modo, foi preservado o decurso estável da diabetes mellitus dependente de insulina, e estavam 57 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ ausentes sintomas de complicações diabéticas secundárias. O único paciente deste grupo que suportou 4 transplantações (no final desta experiência o historial da sua doença era superior a 9 anos) durante os 5,5 anos de observação não demonstrou sinais de desestabilização do decurso da doença (antes da l.a transplantação era muito lábil), e mesmo assim sem sinais de angiopatia diabética. Parece que o efeito acumulado de transplantações repetidas é governado pelo aumento da actividade secretória do aparelho dos ilhéus próprio do beneficiário confirmada pelo aumento de concentração de péptido C humano tanto basal como estimulado, com cada transplantação. TRANSPLANTAÇÃO DE CULTURAS DE CÉLULAS INSULARES PANCREÁTICAS DE COELHOS RECÉM-NASCIDOS EM PACIENTES COM HISTORIAL DE DOENÇA DE 6 A 10 ANOS.

Um total de 43 pacientes com diabetes mellitus dependente de insulina com duração da doença de 6 a 10 anos estiveram sob supervisão (duração média de 7,8 anos); 24 homens e 19 mulheres. A idade dos pacientes no momento da primeira transplantação estava na gama de 15 a 43 anos (média de 28,3). 12 pacientes tinham um carácter lábil muito expressivo da doença, que não tinha sido estabilizada durante várias tentativas de tratamento em internamento. 16 pacientes tinham sintomas de complicações secundárias de diabetes mellitus dependente de insulina; 9 deles tinham apenas neuropatia sensório-motora e desenvolvimento de nefropatia (estádio de Mogensen 3) , 2 pacientes - tinham neuropatia autónoma (predisposição para taquicardia), e 2 beneficiários desenvolveram retinopatia não proliferativa.

Em 1-2 meses após a xenotransplantação todos os 12 pacientes com estados de diabetes mellitus dependente de insulina lábil anterior mudaram para um estado mais controlado e de mais fácil gestão. Usualmente, ocorreu também uma estabilização dos índices do metabolismo dos hidratos de carbono. Como tal, antes da transplantação, a glucose média diária no sangue dos beneficiários flutuava entre 9,6 e 14,1 mmol/1, mas 1 mês após a transplantação a glicemia diária era de 6,6 a 11,2 (média de 8,6 mmol/1) . A redução máxima deste índice foi notada num período de 3 meses (7,8 mmol/1), 58 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ mas no final do período de 1 ano ainda permanecia satisfatória - a um nível de 8,8 mmol/1). A melhoria na compensação do metabolismo dos hidratos de carbono foi confirmada pela alteração da quantidade de hemoglobina glucosilada no sangue dos pacientes. De 12% antes da transplantação (média), o seu nível em 3 meses era já 10,8%, em 6 meses - 9,4%, em 9 meses - um pouco aumentado (para 10,9%), mas no final de um ano reduziu-se novamente para 9, 8%.

Também, na maioria dos pacientes deste grupo houve uma diminuição forçada da dose de insulina diariamente administrada em comparação com o nível pré-transplantação: em 3 meses após a transplantação diminuiu em média para 15,22%, em 6 meses - para 30,1%, em 9 meses - 27,0%, em 12 meses -25,1%.

Apesar do significativo historial da diabetes mellitus dependente de insulina neste grupo de pacientes (de 6 a 10 anos - em média 7,8), apenas aproximadamente 75% (32 pacientes) antes da transplantação não tinham tido secreção de insulina própria (péptido C completamente ausente). Como outros pacientes neste grupo tinham um nível basal de péptido C que variava de 0,05 a 0,2 ng/ml, e estimulado - de 0,1 a 0,3 ng/ml, a sua concentração média no grupo antes da transplantação era, de estômago vazio - 0,07 e após estimulação - 0,08 ng/ml. Após a transplantação, ocorreu um aumento estável da concentração de péptido C no sangue - em 3 meses o nível basal era em média o mesmo 0,07 e o nível estimulado - já 0,11 ng/ml; em 6 meses - aumento de mais de 3 vezes - respectivamente até 0,38 e 0,43 ng/ml, mas no 9.° mês - diminuição até 0,09 e 0,13 ng/ml.

Durante o período após a transplantação, houveram sinais de decursos mais positivos de complicações secundárias nos beneficiários deste grupo. Os sintomas tanto de neuropatia sensório-motora como da autónoma começaram a enfraquecer logo no final de 1-1,5 meses após a xenotransplantação, e quase deixaram de incomodar os pacientes no 3.° mês. Também, em ambos os pacientes com nefropatia diabética a proteína-ureia desapareceu completamente no 2-4.° mês após a transplantação, 59 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ e não reocorreu durante quase um ano após a transplantação. Os pacientes com retinopatia diabética não registaram aumento nas alterações patológicas no fundo do olho.

Foram realizadas transplantações repetidas (em 7-13 meses após a l.a transplantação) em 14 pacientes: 1 vez em 5 pacientes, duas vezes em 5 pacientes, três vezes em 4 pacientes, e 4 transplantações repetidas em 1 paciente. Na maioria dos casos a transplantações repetida de células insulares do pâncreas, no minimo, contribuiu para a preservação das alterações positivas no estado dos pacientes que tinham ocorrido após a l.a transplantação. Especificamente, foi notado o resultado de 5 transplantações sucessivas (intervalo de 7-9 meses) em pacientes com neuropatia sensório-motora grave, que tinham deixado homens de 48 anos de idade (com historial de diabetes mellitus dependente de insulina de 8 anos) com graves condicionamentos (incapacitação/incapacidade de trabalho) devido a graves dores nas extremidades e expressa atrofia muscular, especialmente nas extremidades inferiores. Após a l.a transplantação a dor nas extremidades diminuiu, e depois, após a 2.a transplantação, desapareceu completamente, e depois o tónus e o volume musculares começaram a regenerar-se. Como resultado da transplantação realizada, durante os 4,5 anos de observação, o volume muscular do paciente expandiu-se para 23 kg, o seu tónus muscular normalizou, assim como a condutância do impulso nervoso através dos nervos motores. Também, a diabetes adquiriu um decurso estável; a dose de insulina introduzida diminuiu para 50%. É possível que a redução de insulina exógena fosse significativamente estipulada pela revitalização significativa das células B próprias do paciente, pois o teor de péptido C humano no sangue do beneficiário - 0,1 ng/ml (estômago vazio) e 0,1 ng/ml (estimulado) antes disso tornou-se respectivamente 0,36 e 0,55 ng/ml no final do período de 4 anos de observação após a transplantação. TRANSPLANTAÇÃO DE CULTURAS DE CÉLULAS INSULARES PANCREÁTICAS DE COELHOS RECÉM-NASCIDOS EM PACIENTES COM HISTORIAL DE DOENÇA DE MAIS DE 10 ANOS.

Este grupo consistia em 53 pessoas - 32 mulheres e 21 homens. A idade dos pacientes no momento da primeira 60 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ transplantação variava de 21 a 53 - média de 33,4. A duração da doença variava de 11 a 27 anos (media de 14,8). 9 pacientes tinham verdadeira diabetes com decurso lábil: condições hipoglicémicas espontâneas frequentemente alternadas com episódios de cetona-acidose.

Houve complicações diabéticas secundárias encontradas em 38 pacientes: 11 tinham apenas neuropatia sensório-motora; 1 paciente tinha neuropatia sensório-motora e catarata diabética, 5 pacientes - neuropatia sensório-motora, nefropatia inicial (em Mogensen) e retinopatia diabética não proliferativa; 8 pacientes - nefropatia em surgimento e retinopatia não proliferativa; 6 pacientes - nefropatia expressa e retinopatia pré-proliferativa; 2 pacientes nefropatia em surgimento e retinopatia proliferativa; 2 pacientes - nefropatia expressa e retinopatia proliferativa; 2 pacientes - neuropatia sensório-motora e autónoma, nefropatia expressa e retinopatia pré-proliferativa, e 1 paciente - neuropatia sensório-motora e autónoma, estádio urémico de nefropatia diabética e retinopatia proliferativa.

Como tal, foi revelada neuropatia diabética em 23 pacientes, incluindo 20 com sensório-motora e 3 com autónoma. A nefropatia diabética foi revelada em 24 pacientes, incluindo nefropatia em surgimento em 15 pacientes, expressa em 8 pacientes, e em estádio urémico em 1 beneficiário. A retinopatia diabético foi revelada em 26 pacientes, incluindo estádio não proliferativo em 13 pacientes; estádio pré-proliferativo em 8 pacientes e estádio proliferativo em 5 beneficiários.

Com a finalidade de diminuir o perigo de desenvolvimento de condições hipoglicémicas, os pacientes com estádios expressos de retinopatia diabética e nefropatia foram transplantados com uma dose de culturas de células dos ilhéus pancreáticos recebidas de não mais de 40 pâncreas de coelhos recém-nascidos. Todos os beneficiários com decurso de DMDI inicialmente lábil tiveram uma estabilização relativamente rápida (durante 1-3 meses) do nível de glicemia, e foi escolhido um regime mais adequado de terapia com insulina. 61 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ

Houve uma redução substancial do nível médio de glicemia diária em pacientes deste grupo: de 12,8 mmol/1 antes da transplantação para 9,8 mmol/1 em 3 meses após a transplantação, e 10, 1 mmol/1 em 9 meses após a transplantação. Em correspondência com alterações na glicemia, a concentração de hemoglobina glicosilada também diminuiu no sangue dos beneficiários de 13,1 para 10,0%. O aumento significativo do grau de compensação da DMDI foi acompanhado pela diminuição das necessidades de insulina exógena do beneficiário. Ao 3.° mês após a xenotransplantação, a dose de insulina administrada foi reduzida para os pacientes deste grupo em média para 12,5%, em 6 meses - para 26,6%, em 9 meses - para 25,0%, em 12 meses - para apenas 9,8%, o que demonstrou que as necessidades de insulina exógena passaram para o nível pré-transplantação. A redução máxima foi notada no Paciente C. (feminino) (26 anos de idade, duração da DMDI -20 anos; complicações secundárias - neuropatia sensório-motora, nefropatia expressa, retinopatia pré-proliferativa). Logo em 2 semanas após a transplantação intramuscular de culturas de células dos ilhéus pancreáticos recebidos de 40 pâncreas de coelhos recém-nascidos, a redução da necessidade de insulina administrada era assim - desceu de 36 para 24 unidades/dia, em 6 semanas - para 16 unidades/dia, em 10 semanas para 4 unidades/dia (i.e. 90% de redução). Ao mesmo tempo, com base na condição estável, o nível de glicemia média diária não excedeu 9 mmol/1. 0 teor de HbAlc em 4 meses após a transplantação reduziu-se para 8,7% e não excedeu 9% durante o período de pelo menos 1,5 anos. Ao mesmo tempo, também ocorreu uma redução substancial de expressão de complicações diabéticas secundárias. 4 pacientes, apesar do seu longo historial de DMDI (de 10,2 a 13,5 anos, média de 11,1 anos), revelaram secreção residual de péptido C (em média 0,05 ng/ml de estômago vazio, não estimulada. Contudo, após a transplantação, ao 3o mês, a quantidade de pacientes positivos para péptido C duplicou e nestes 8 pacientes (duração média da diabetes - 12,6 anos) a concentração de péptido C com estômago vazio era em média de 0,09 ng/ml, e a estimulada - 0,12 ng/ml. 62 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ Ο efeito / influência da transplantação no grau de manifestação de complicações diabéticas dependia na maioria dos cases dos seus tipos e estádios clínicos (avanço) . Assim, enquanto todos os pacientes com neuropatia sensório-motora tiveram uma melhoria substancial do decurso desta complicação logo após a primeira transplantação de culturas de células dos ilhéus pancreáticos, já nos 2 dos 3 pacientes com neuropatia autónoma apenas a segunda transplantação teve um efeito positivo. 12 de 15 pacientes com estádio inicial de nefropatia diabética tiveram um firme desaparecimento de micro-proteína-ureia e eliminação da tendência para hipertensão arterial. Foi observado um efeito positivo após a transplantação em pacientes com nefropatia expressa quase em 63% dos casos - em 5 de 8 beneficiários. Ao mesmo tempo, a extracção de proteína com a urina foi significativamente reduzida: macro-proteína-ureia passou para micro-proteína-ureia (menos de 0,3 g/dia) e uma tendência para redução e normalização da pressão sanguínea elevada, o que permitiu reduzir significativamente as doses de medicações hipotensoras ou mesmo terminar a sua administração. Em 2 de 3 outros beneficiários durante o período de observação (respectivamente 2 e 2,5 anos) não houve sinais de nefropatia diabética progressiva.

Ao mesmo tempo um paciente com estádio final de nefropatia diabética teve apenas um efeito positivo de curta duração: durante 4-5 semanas após a xenotransplantação de culturas de células dos ilhéus pancreáticos o seu nível moderadamente elevado de creatinina e ureia no sangue aproximou-se do limite superior dos índices normais, após o que ocorreu uma progressão relativamente lenta mas firme de insuficiência renal crónica. 10 beneficiários com estádios iniciais e expressos de nefropatia diabética foram submetidos a transplantações repetidas de culturas de células dos ilhéus pancreáticos, e 4 dos pacientes com nefropatia expressa foram 3 vezes beneficiários durante o período de 3-4 anos. Em 9 de 10 pacientes submetidos a nova transplantação notou-se pelo menos ausência de nova progressão dos problemas na função renal. 63 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ

Um paciente com catarata diabética (idade de 22 anos, duração da DMDI - 11 anos) no 5.° mês após a transplantação foi examinado por oculistas que deixaram de notar pontos de opacificação do cristalino, tendo avaliado esta alteração no quadro clinico como «reabsorção da catarata".

Em 10 de 13 pacientes (i.e. com retinopatia não proliferativa) não houve progressão das alterações patológicas notada durante a totalidade do período de observação (de 1 a 6 anos), com melhoria do quadro do fundo do olho; em 5 beneficiários (ausência de deslocamento da retina, diminuição da quantidade de micro-aneurismas.) Contudo, em 3 pacientes com retinopatia não proliferativa houve aumento nas quantidades de aneurismas e ocorreram hemorragias regionais.

De 8 pacientes observados com retinopatia pré-proliferativa, em 3 casos, após 2-4 anos após a única xenotransplantação de culturas de células dos ilhéus pancreáticos, notou-se um processo proliferativo. Ao mesmo tempo, 3 pacientes do mesmo grupo (63%), que antes da transplantação tinham sido submetidos a um procedimento de coagulação com laser, não necessitaram de repetir o tratamento com laser durante todo o período da observação após a transplantação - de 1 a 6 anos. Como tal, 3 pacientes deste grupo tiveram respectivamente 1, 2 e 3 transplantações repetidas com intervalos de 9 meses a 1,5 anos.

Após a xenotransplantação de culturas de C.I.P., 2 de 5 pacientes com estádios proliferativos de retinopatia diabética tiveram uma estabilização relativamente longa (duração 1 e 1,5 anos) do quadro clínico do fundo do olho com aumento moderado das funções visuais (provavelmente, devido a reabsorção activa das hemorragias) , e notou-se uma progressão adicional do processo proliferativo, pelo que 1 paciente (feminino) repetiu a hemorragia no corpo vítreo com substancial agravamento das funções visuais. A utilização de transplantação de células dos ilhéus cultivadas produzidas a partir de pâncreas de coelhos recém-nascidos pareceu ser muito eficaz na prática diabética em crianças. Resultados tardios da xenotransplantação de culturas de células dos ilhéus em crianças com diabetes mellitus tipo 1 64 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ foram pesquisados através da observação de 20 pacientes antes da transplantação e em 5 anos após a primeira transplantação (Volkov, 2005 {1}). Um grupo comparativo (controlo sem transplantação) consistiu em 20 crianças seleccionadas pelo principio de "controlo da ocorrência" com tolerância para idade, sexo, longevidade da doença, nível de compensação, necessidade de insulina e desenvolvimento de complicações. A análise de catamnese demonstrou que a xenotransplantação de culturas de células dos ilhéus tem um efeito positivo sobre as necessidades de insulina. Assim, logo no 3o mês após a transplantação a dose de insulina administrada diminuiu em metade dos beneficiários, em comparação com o nível inicial, e no final do Io ano - 43% dos pacientes tinham menor necessidade de insulina. Não houve alterações no grupo de comparação. Foi notado um efeito de resposta à dose: a maior diminuição das necessidades de insulina foi notada após administração da cultura contendo aproximadamente 5 milhões de células beta. Como tal, no período após a transplantação houve uma compensação mais persistente e expressa do metabolismo dos hidratos de carbono, o que é confirmado pela dinâmica da glicemia média diária em comparação com o grupo de controlo. Logo 3 meses após a xenotransplantação, o nível de glicemia diária foi reduzido de 10,7810,55 mmol/1 para 8,6 ±0,4 mmol/m contra 9,1510,72 mmol/1 (inicialmente 10,6510,79 mmol/1). No período de 1 ano após a transplantação estas distinções tornaram-se mais significativas: no grupo de observação a glicemia média diária é de 8,510,39 mmol/1 contra 10,1410,6 mmol/1 no grupo de controlo. Permaneceram tendências similares nos casos de transplantações repetidas. O efeito terapêutico da transplantação de culturas de células dos ilhéus no decurso de complicações diabéticas provou ser extremamente importante. Observações clínicas de longo prazo demonstraram que, em comparação com o grupo de controlo, houve ocorrências menos frequentes de nefropatia diabética, retinopatia e desordens de crescimento (como manifestação de síndrome de Moriak) em crianças com diabetes mellitus tipo 1 após o tratamento de transplantação. Assim, houve uma diminuição na ocorrência de retinopatia de 25% para 11% (aumento neste indicador de 23% para 25% no grupo de 65 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ controlo). A perda de albumina com a urina diminuiu significativamente - de 207,4 para 78,7 mg/dia em pacientes com nefropatia diabética após xenotransplantação, enquanto no grupo de comparação este indicador manteve-se crescente - de 220,67 para 273,1 mg/dia.

Uma complicação como a Sindrome de Moriak é uma das caracteristicas da diabetologia das crianças e adolescentes, estando incluídas na sua estrutura desordens de crescimento. A utilização de preparações anabólicas para o tratamento da patologia referida conduz a um efeito de curta duração, ao avanço do fecho de zonas de crescimento e redução da altura corporal final (crescimento). No decurso da transplantação xenogénica de culturas de células dos ilhéus, foi revelada uma rapidez do crescimento mas sem alteração da velocidade de fecho das zonas de crescimento. Como tal, a proporção de pacientes possuindo uma altura inferior a 5% (nanismo autêntico) , diminuiu de 18% para 14% durante o Io ano de observação. Na catamnese de 5 anos, não foi observado nenhum paciente com altura inferior ao percentil 5 entre as crianças do grupo de observação. No grupo de comparação a proporção de crianças com altura inferior ao normal aumentou de 20% para 22% durante o Io ano de observação. Na observação de 5 anos, a proporção de pacientes com altura abaixo do percentil 5 diminuiu para 10% devido à aplicação de insulinoterapia intensificada. A pesquisa imunológica demonstrou que a transplantação xenogénica de culturas de células dos ilhéus não causa activação substancial e de longa duração do processo auto-imune, o que é muito importante na aplicação deste tipo de terapia em pacientes com a função produtora de insulina parcialmente preservada. A cuidadosa observação de pacientes do grupo de observação (com exame anual com internamento) não revelou nem uma única contaminação de infecções zoonosal. EFEITO DE XENOTRANSPLANTAÇÃO DE CULTURAS DE CÉLULAS DOS ILHÉUS DE PÂNCREAS DE COELHOS RECÉM-NASCIDOS SOBRE INDICADORES DE IMUNIDADE EM PACIENTES COM DIABETES MELLITUS TIPO 1.

Realizou-se uma pesquisa imunológica complexa em 20 pacientes com diabetes tipo 1 após a conclusão de transplantação intramuscular primária de culturas de células 66 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ dos ilhéus de pâncreas de coelhos recém-nascidos, e em 12 pacientes com diabetes tipo 1 após xenotransplantações repetidas de culturas de células dos ilhéus. Utilizaram-se 17 testes padrão de imunidade celular e humoral na pesquisa imunológica, sistemas de fagócitos e complemento, incluindo titulo de anticorpos fixadores do complemento contra células dos ilhéus de pâncreas de coelhos recém-nascidos.

Está provado que em pacientes com diabetes tipo 1 antes da transplantação de culturas de células dos ilhéus foi observada activação de nexo de imunidade de células T, assim como a presença de desequilíbrio da subpopulação imunorreguladora de linfócitos T, e a activação de factores de protecção não específicos. Após a transplantação, 8 beneficiários (í.e. 40%) após a transplantação primária de culturas de Cl, apresentaram baixo título KFA de anticorpos contra o antigénio total de Cl e insulina, e 10 pacientes (50%) apresentaram aumento moderado de contagens de linfócitos B no 2-3° meses, com a sua redução sucessiva.

Na determinação de subpopulações de linfócitos T em dinâmica após a xenotransplantação, houve uma tendência para normalização do teor de linfócitos T ao 7-10.° dia. A quantidade de células CD4 continuou a diminuir, a quantidade de células CD3 continua a aumentar. Ao 14-20.° dia o número de células T auxiliares subiu até ao normal. Ao 2-3° mês após a transplantação, a normalização decorrente dos índices de imunidade celular foi conjugada com o atingir de uma boa compensação da doença.

Os exames do estado imunitário em pacientes submetidos a transplantações repetidas de culturas de células dos ilhéus de coelhos recém-nascidos não revelou quaisquer sinais de resposta imunitária ao xenotransplante. Os índices quantitativos e funcionais de imunidade eram comparáveis aos das xenotransplantações primárias. XENOTRANSPLANTAÇÃO DE CULTURAS DE CÉLULAS IDOS ILHÉUS DE PÂNCREAS DE COELHOS RECÉM-NASCIDOS EM PACIENTES COM DIABETES MELLITUS DEPENDENTE DE INSULINA RECENTEMENTE DIAGNOSTICADA.

Os pacientes com diabetes mellitus tipo 1 com historial de doença superior a 5 anos usualmente tornam-se beneficiários 67 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ de culturas de Cl; praticamente não têm actividade produtora de insulina do aparelho próprio de ilhéus do pâncreas, e na maioria dos casos complicações diabéticas secundárias estão avançadas em diferentes estádios.

Contudo, foram conseguidos resultados promissores também após a transplantação intramuscular de culturas de células dos ilhéus de pâncreas de coelhos recém-nascidos em pacientes com diabetes mellitus tipo 1 recentemente diagnosticada. 10 pessoas jovens (média de idades de 18102 anos) com historial médio de diabetes diagnosticada (610,2 mês). Notaram-se resultados positivos no controlo da glicemia em todos os pacientes durante os 6-8 meses após a transplantação xenógena (glicemia em jejum de 5,2 10,2 mmol/1, após ingestão de alimentos - 7,010,15 mmol/1, glucosúria diária 0, 2510, 03 gramas, HbA 1 - 5,810,2 mmol/1. A dose diária de insulina exógena foi reduzida de 0,6210,11 para 0,28 100,2 unidades para 1 quilograma de peso corporal. 7 pacientes (i.e. 70% dos casos) durante o período após a transplantação tiveram remissão parcial e 2 beneficiários (i.e. 20% dos casos) remissão completa do estado diabético (induzido por transplantação "lua-de-mel" de diabetes mellitus tipo 1), que continuou durante 4-8 meses. Como tal, os níveis de glucagon e hormona de crescimento aumentados no período pré-transplantação no sangue de beneficiários normalizaram (concentração de glucagons diminuiu de 112,012,1 para 69,711,2 ng/ml, p<0,05; hormona de crescimento - de 8,910,04 para 5,610,02 ng/ml, p<0,05) com normalização sucessiva do perfil diário de hormona de crescimento. A concentração de péptido C humano no soro dos pacientes aumentou de 0,310,01 para 1,2610,02 ng/ml; p<5; o que atesta diminuição significativa de secreção de insulina própria em beneficiários sob a influência de transplantação realizada de células dos ilhéus xenógenas. Como tal, os pacientes apresentaram normalização dos índices de imunidade celular e humoral, que tinham sido patologicamente alterados antes da transplantação (tabela 40) 68 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ

Tabela 40. índices do estado imunitário em pacientes com DMDI recentemente diagnosticada após xenotransplantação de culturas de células dos ilhéus

Meses de Tx OKT3 ΟΚΤ4 ΟΚΤ8 OKB7 OKla IgA IgM IgG % O o O o % O O Mg % Mg % mg% Rec n=10 0 8015* 5013* 3013 1812* 1412* 250113** 221118** 15008122* 1 8013* 5112* 2914 1613 1212 2t2i9* 212110* 1472114** 3 66±2 3614 3014 1113 813 174112 169110 937113 8 7 614* 4812* 2613 1413 1212* 217113 224119 1461112** Con trolo Sau dável 68±4 3815 3014 1012 712 162116 15118 910112 ΟΚΤ3 - células T; OKT4 - T auxiliares; OKT8 - T supressoras; ΟΚΒ7 -linfócitos B, OKla - anti-HLA-DR; Ig - imunoglobulinas; *p<0,05; **p<0,001 - em comparação com o controlo

Em seguida observam-se as alterações gerais após a xenotransplantação de culturas de células dos ilhéus em pacientes com diabetes mellítus tipo 1:

Estabilização do decurso de formas lábeis da doença, o que resulta na selecção bem sucedida da insulinoterapia adequada, e aumenta significativamente o grau de compensação do metabolismo dos hidratos de carbono danificado;

Diminuição das necessidades de insulina exógena para 20-30% em 2/3 dos beneficiários;

Progressão de complicações diabéticas tardias suspensa (neuropatia, nefropatia, retinopatia); involução de estádios iniciais em mais de 80% dos casos. É racional dar explicações relativamente a possíveis mecanismos do efeito antidiabético da transplantação de culturas de células dos ilhéus de coelhos recém-nascidos. Apesar de uma ampla adaptação à prática de educação de pacientes com diabetes mellítus tipo 1 na metodologia de autocontrolo da glicemia e na técnica de selecção de doses adequadas de insulina administrada, nota-se um decurso lábil grave da doença em alguns pacientes. Um início de condições hipoglicémicos frequentes espontâneas (í.e. que ocorrem sem razões visíveis) frequentemente alterna-se com desenvolvimento de cetose; e todas as tentativas para atingir a compensação metabólica nestes pacientes internados apenas originou alívio 69 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ de curta duração. Contudo, em 2-3 meses após a xenotransplantação de culturas de células dos ilhéus, praticamente em todos os casos o decurso de diabetes mellitus lábil adquire um carácter mais controlável e de mais fácil gestão. Ao mesmo tempo, usualmente acontece a estabilização de índices do metabolismo dos hidratos de carbono e a erradicação da predisposição para cetose.

Aparentemente, a estabilização de formas lábeis de diabetes mellitus e a realização da compensação do metabolismo dos hidratos de carbono são condicionadas, primeiro que tudo, por secreção de insulina pelas células beta transplantadas. Durante o período após a transplantação, a dose administrada de insulina exógena (usualmente reduzida em comparação com o nível pré-transplantação), praticamente assegura as necessidades básicas desta hormona. Por sua vez, a insulina segregada por células beta transplantadas vai para o sangue do beneficiário muito provavelmente em correlação com flutuações do nível de glicemia, deste modo facilitando um decurso mais estável da doença. Como uma concentração significativa de péptido C humano está a ser localizada a 1-2 meses após a xenotransplantação em parte dos beneficiários com ausência de sinais de funcionamento de células beta próprias (negativos para péptido C) , podemos assumir que o aparelho dos ilhéus parcialmente restabelecido do paciente avança para o processo de regulação do metabolismo dos hidratos de carbono. Devido a isso, em pacientes com decurso prévio lábil de diabetes o estado hipoglicémico torna-se menos expressivo, e mais frequentemente - desaparece completamente pois as células beta transplantadas e restauradas param de extrair insulina em situações em que a glicemia se aproxima de um nível próximo do normal. Parece que a estabilização do nível de glicemia após a transplantação de culturas de células dos ilhéus é condicionada pelo restabelecimento, em alguma extensão, do mecanismo de feedback entre o nível de glicemia e a secreção de insulina, feedback que estava ausente em pacientes com diabetes mellitus tipo 1 devido à morte celular causada pelo processo auto-imune em ilhéus do pâncreas. É também possível, que algum papel na estabilização da DMDI e na diminuição das necessidades de insulina exógena do beneficiário possa ser atribuído à normalização de receptores 70 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ de insulina em tecidos periféricos após a transplantação da cultura de células dos ilhéus.

Como não houve redução significativa das necessidades de insulina exógena numa proporção considerável de beneficiários com efeito positivo da transplantação de células dos ilhéus na angiopatia diabética, parece que a redução da dose de insulina administrada não pode ser considerada como um sinal principal, e especialmente, como único sinal da eficácia do tratamento de transplantação. Se colocarmos o propósito de conseguir uma completa independência da insulina como objectivo final, esta abordagem pode acarretar o risco de desenvolvimento de situações clinicas perigosas para o paciente. Como demonstra a nossa experiência, uma administração numa única etapa de porções significativamente alargadas de culturas xenógenas de células dos ilhéus consistindo praticamente em apenas células beta, pode provocar o desenvolvimento de grave estado hipoglicémico; mas transplantações repetidas frequentes (a cada 1-1,5 meses) de porções "regulares" no fígado (através de um cateter permanente na veia porta) dificilmente poderão, no final, conduzir a uma sobredosagem da quantidade de células beta transplantadas.

Nenhuma produção adequada de insulina pelas células beta que aconteça, provavelmente, devido à sua incapacidade de segregar insulina segundo o princípio estrito do feedback, pode conduzir ao desenvolvimento de condições hipoglicémicas graves, mesmo após retirada das injecções de insulina. Em resultado, a emaciação de depósitos glicogénicos em beneficiários e a génese de glucose pela via da neo-génese de glucose conduzem a acumulação de corpos cetónicos e ceto-acidose. A paragem e regressão de complicações diabéticas tardias deverão ser consideradas como praticamente mais significativas, de maior importância em prognóstico, e como mais atingíveis na realidade como resultado da transplantação de culturas de células dos ilhéus.

Tem especial importância um efeito de xenotransplantação de culturas de células dos ilhéus em insuficiências de vasos específicas da diabetes mellitus - angiopatia - pois estas são 71 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ nomeadamente a principal razão da perda de visão (retinopatia diabética). MECANISMO DO EFEITO DA TRANSPLANTAÇÃO DE CÉLULAS DOS ILHÉUS EM COMPLICAÇÕES DIABÉTICAS TARDIAS.

Sabe-se que a formação de angiopatias diabéticas é muito possível mesmo em casos de compensação ideal do metabolismo dos hidratos de carbono (normoglicemia, a-glucosúria, concentração normal de hemoglobina glicosilada) conseguida com o auxílio de insulinoterapia intensificada. Ao mesmo tempo, após a transplantação de culturas de células dos ilhéus, apesar da retenção de uma concentração elevada de hemoglobina glicosilada no sangue de números significativos de pacientes, na maioria dos casos observamos um retardamento da progressão e uma regressão parcial das complicações diabéticas tardias. É por isso que o efeito positivo da transplantação de células dos ilhéus não pode ser explicada, nomeadamente, pela melhoria dos índices do metabolismo dos hidratos de carbono.

Em pacientes com diabetes mellitus dependente de insulina complicada por retinopatia a gravidade das alterações no fundo do olho aumenta à medida que a secreção de insulina pelo próprio pâncreas do paciente diminui. A excreção de insulina endógena foi avaliada, certamente, pela concentração de péptido C segregado para o sangue do paciente em quantidades equimolares relativamente à insulina. Sugerimos que a progressão da retinopatia era governada não apenas pela redução da secreção de insulina, mas também pela diminuição da concentração de péptido C. Após transplantação de culturas de células dos ilhéus alogénicas ou xenogénicas no beneficiário com dependência de insulina causada pela morte de células beta do próprio pâncreas, as células beta transplantadas começaram a emitir para o sangue do paciente péptido C (seguramente, em simultâneo com insulina) de que tinha sido privado durante vários anos, quando, na capacidade da denominada terapia de substituição tomava injecções de preparações de insulina apenas. Em adição, na maioria dos pacientes no período após a transplantação ocorre uma regeneração parcial do conjunto das células beta próprias do beneficiário (Skaletskyy N.N., e outros, 1994 {6}.), que, naturalmente, começam a segregar insulina e péptido C. Em resultado, o défice de péptido C no corpo que durou anos é corrigido, e esse défice pode ter sido 72 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ responsável pelo desenvolvimento de insuficiência especifica tardia de vasos e nervos. O pressuposto de um papel fisiológico do péptido C é contrário à opinião amplamente aceite de que o principal papel do péptido C é puramente estrutural, ligando, e apresentado na facilitação da dobragem de moléculas de pro-insulina de uma maneira que as ligações de dissulfureto entre aminoácidos permaneçam das cadeias A e B de moléculas de insulina formadas; e que o péptido C não possui um potencial biológico, e como tal é uma molécula balastro no contexto fisiológico. 0 nosso pressuposto é suportado pelos investigadores suecos (Wahren J et al., 1991 {15]) . Eles demonstraram que o péptido C tem um efeito estimulante na utilização de glucose pelo organismo de pacientes com diabetes dependente de insulina, embora não seja excluída a inibição da influência sobre a produção de glucose pelo fígado. A administração prolongada (4 semanas) de péptido C a pacientes com diabetes mellitus tipo 1 assegurou melhor controlo glicémico (julgando pela concentração de glucose no sangue em jejum e pelo teor de hemoglobina glicosilada) , em comparação com pacientes tratados apenas com insulina. São muito importantes os dados que mostram que a administração de péptido C humano tem uma influência positiva em complicações tardias da diabetes mellitus dependente de insulina. Como tal, em pacientes com nefropatia diabética a sua função renal é melhorada, melhoria esta que é demonstrada pela redução da excreção de albumina e pela redução da filtração glomerular; em pacientes com retinopatia diabética a penetrabilidade da barreira hemato-retinal move-se no sentido ascendente; em pacientes com

neuropatia autónoma retarda o ritmo cardíaco na inspiração e expiração. Em adição, sob a influência da administração de péptido C, o fluxo sanguíneo em músculos esqueléticos de trabalho de pacientes com diabetes mellitus melhora. O mecanismo deste efeito angio- e neuro-protector do péptido C não é claro. Como o efeito fisiológico do péptido C é realizado através da promoção da função da membrana celular, então, aparentemente, pertence à activação de Na+K+-ATF (adenosina-ácido trifosfórico) - ligado a membranas de diferentes células. 73 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ

Em conclusão, vale a pena apontar que a transplantação de células dos ilhéus na diabetes mellitus tipo 1 é um método muito importante, mas auxiliar, de terapia da diabetes mellitus tipo 1. 0 tratamento antidiabético deverá ser integrado. Para haver sucesso, é necessária a correcta combinação de uma dieta razoável, exercício físico graduado, adequada terapia de redução de açúcares. A aplicação de transplantação de órgãos do pâncreas ou o enxerto de ilhéus detalhados do pâncreas, são completamente justificados para proporcionar auxílio médico a pacientes com nefropatia diabética no seu estádio terminal quando existe uma necessidade de transplantação de um rim alogénico. Nos estádios mais iniciais de insuficiência renal, e também em casos de nefropatia diabética, retinopatia (excepto estádios terminais), a utilização de xenotransplantação de células dos ilhéus cultivadas geradas a partir de pâncreas de coelhos recém-nascidos pode ser muito eficaz. A aplicação correcta da transplantação de células dos ilhéus cultivadas no tratamento complexo (integrado) da diabetes mellitus tipo 1 pode substancialmente afectar o prognóstico da doença crítica. A profilaxia e a desaceleração de complicações diabéticas secundárias, conseguida com o auxílio de transplantação repetida regular, podem ter não apenas um efeito médico como também um efeito socioeconómico significativo por prevenção ou eliminação de incapacidades em pacientes diabéticos e por aumento da sua esperança de vida e longevidade.

Utilizou-se o método clássico da coloração de células de Mallori e com aldeído-fucsina para revelar as células beta. Para uma detecção mais específica das células contendo insulina (células beta) utilizamos ultimamente um método imunofluorescente de análise morfológica. Apresenta-se abaixo a descrição dos componentes e fases básicos deste método. COLORAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE CULTURAS DE CÉLULAS DOS ILHÉUS DE PÂNCREAS DE COELHOS RECÉM-NASCIDOS.

Para a identificação das células beta utilizamos culturas recebidas durante a incubação de microfragmentos pancreáticos em caixas de Petri de cultura de plástico (Corning-Costar) . Lava-se a suspensão de células cultivadas e cachos celulares 74 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ três vezes com meio de crescimento com o auxilio de solução quente de tampão de fosfato (PBS). Depois, as culturas são fixadas com solução de Formalina a 0,5% durante 20 minutos à temperatura ambiente. Depois, as culturas são perfundidas com solução de PBS com soro fetal (vaca) adicionado até a concentração atingir 1%, e incuba-se durante 60 minutos à temperatura ambiente para bloqueio de absorção não especifica de anticorpos. Após lavagem 3 vezes com solução de PBS, adicionam-se às culturas anticorpos monoclonais de ratinho contra insulina (Sigma) diluídos em solução de PBS com 5% de soro fetal de vaca. Depois incubam-se as caixas de Petri com culturas estudadas durante 120 minutos à temperatura ambiente. Depois de lavagem 3 vezes com PBS e adição dos 2o anticorpos às culturas (anticorpos anti-ratinhos marcados com FITC), sustenta-se uma exposição de 45 minutos. Depois disso, as culturas são lavadas três vezes com PBS. Depois, adiciona-se às culturas solução a 60% de glicerina e PBS, e colocam-se sob uma cobertura de vidro. Preparações prontas são examinadas com microscópio de fluorescência e são fotografadas com uma câmara digital. Séries de análises imuno-histoquímicas realizadas de células dos ilhéus cultivadas a partir de pâncreas de coelhos recém-nascidos demonstraram que a proporção de células contendo insulina em culturas compreende de 78% a 90% (média-82,2%). A percentagem foi calculada por contagem das células na sua análise em contraste de fases e depois por análise comparativa em microscópio luminescente. Em adição às células dos ilhéus, encontram-se fibroblastos singulares na cultura mas a sua proporção usualmente não excede 1-5%. As células de origem epitelial são usualmente células remanescentes em cultura e perfazem 5-17%, facto que a coloração imuno-histoquímica (com anticorpos monoclonais contra proteína CytoKeratin 18) confirma; mas não são células beta, pois estas estruturas celulares não revelam a presença de insulina. Provavelmente, são apenas outros tipos de células dos ilhéus cuja presença na cultura deverá ser considerada altamente fisiológica pois são (células alfa, células delta, células pp) vizinhanças naturais das células beta, que em condições normais constituem em alguma extensão, uma estrutura morfo-fisiológica autónoma - ilhéus de Langerhans. 75 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ

Em adição ao estudo da composição celular da cultura, determinámos a quantidade total de células na cultura. Por meio de contagem metódica de mais de 20 culturas, cálculo que foi realizado no momento da análise ao microscópio invertido (Nikon, Japão) conseguimos determinar que a cultura recebida dos 20 pâncreas de coelhos com 1-2 dias de idade continha de 451 600 a 568 900 células dos ilhéus (média - 521 500) . Uma dose de cultura de células dos ilhéus representa uma fusão de 4 culturas de células dos ilhéus recebidas de 80 pâncreas de coelhos de 1-2 dias de idade. A quantidade de células dos ilhéus contidas nesta dose é, em média, não inferior a 2 000 000, pelo menos 80% das quais são células beta.

As culturas, produzidas através do método acima descrito, não são uma preparação celular com características quantitativas estritamente determinadas, tais como uma percentagem precisa de células beta em cada cultura. Esta não é uma preparação no sentido do resultado de uma síntese química estritamente regulada ou manipulações de engenharia genética. A preparação celular utilizada para a transplantação representa uma fusão de culturas crescidas em paralelo de células dos ilhéus, que, naturalmente, são distintas umas das outras em algum grau. A análise da composição celular, que dá principalmente uma ideia da proporção de células beta na cultura, demonstrou que perfaz 80-94% enquanto a viabilidade destas células é de 77% a 85%. Para uma preparação biológica esta variação de números não é, na nossa opinião, significativa. Por aumento da quantidade de culturas utilizada para 1 transplantação, esta variação pode ser reduzida.

Imediatamente antes de uma transplantação clínica planeada (transporte) de cultura de células dos ilhéus, há uma selecção de culturas com ênfase na longevidade do seu cultivo, resultados de observação microscópica, e análise expressa quanto a esterilidade e viabilidade. A obtenção de culturas para transplantação é conduzida em condições de câmara laminar que assegura o fornecimento de ar estéril em circulação constante. As culturas seleccionadas - 4 culturas para uma dose de transplantação, são obtidas com o auxílio de um raspador celular especial (raspador celular Corning-Costar). A suspensão celular obtida é centrifugada em tubos de ensaio especiais de plástico de 50 mililitros (800 rotações por 76 ΕΡ 2 013 332/ΡΤ minuto durante 10 minutos). Depois o sedimento celular é transferido para um tubo de ensaio de plástico de 15 mm estéril e é suspendo numa solução salina de Hank. 0 tubo de ensaio marcado com preparação celular é então colocado num tubo de ensaio de 50 mililitros e fechado hermeticamente com uma tampa fixando-a adicionalmente com um filme especial (Parafilm).

Embora a invenção tenha sido descrita com detalhes e com referências a seus exemplos específicos, será evidente para um perito na especialidade que podem ser feitas várias alterações e modificações sem afastamento ao seu espírito e âmbito.

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Lisboa, 2012-02-09

Claims

ΕΡ 2 013 332/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Método de obtenção de células beta dos ilhéus a partir de pâncreas de coelhos, o método compreendendo: colheita dos referidos pâncreas de coelhos recém-nascidos e colocação dos pâncreas numa solução salina compreendendo um antibiótico a uma temperatura de 4 - 10°C; remoção de vasos e duetos excretórios dos pâncreas colhidos; obtenção de microfragmentos pancreáticos picados a partir dos referidos pâncreas; e incubação dos referidos microfragmentos pancreáticos picados num meio isento de soro a uma primeira temperatura de incubação de 36, 6°C a 37°C durante 6 a 10 dias a 0% a 5% de CO2 durante um primeiro período de incubação e substituindo periodicamente o meio isento de soro e removendo células indesejadas espontaneamente destruídas compreendendo células exócrinas e células sanguíneas e elementos de tecido conjuntivo até pelo menos 80% das células remanescentes serem células beta dos ilhéus; e incubação dos referidos microfragmentos pancreáticos picados no referido meio isento de soro a uma segunda temperatura de incubação de 22°C a 29°C durante 4 a 5 dias durante um segundo período de incubação até pelo menos 78-90% das células remanescentes serem células beta dos ilhéus, em que o referido meio isento de soro é opcionalmente periodicamente substituído, e desse modo obtendo células beta dos ilhéus.
2. Método da reivindicação 1, em que a segunda temperatura de incubação é 24°C.
3. Composição obtidas a partir reivindicação 1 aceitável. compreendendo células beta dos ilhéus de pâncreas de coelhos pelo método da e um transportador farmaceuticamente
4. Composição da reivindicação 3, em que a composição compreende pelo menos 50% de células beta dos ilhéus.
5. Composição da reivindicação 3, em que a composição compreende pelo menos 78% de células beta dos ilhéus. ΕΡ 2 013 332/ΡΤ 2/2
6. Composição de acordo com a reivindicação 3 para o tratamento de diabetes, para promover a produção natural de insulina.
7. Composição de acordo com a reivindicação 6 para injecção intramuscular.
8. Composição de acordo com a reivindicação 7 para injecção intramuscular no músculo rectus abdominis.
9. Composição de acordo com a reivindicação 6 para utilização sem qualquer imunossupressão. Lisboa, 2012-02-09