PT1928249E - Macrocontas contendo células secretoras compreendendo agarose seakem gold e utilizações destas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Macrocontas contendo células secretoras compreendendo agarose Seakem Gold e utilizações destas"

PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica prioridade dos pedidos provisórios com o N°. de Série 60/629227, apresentado a 17 de Novembro de 2004, e N°. de Série 60/720917, apresentado a 26 de Setembro de 2005.

CAMPO DO INVENTO

Este invento refere-se a métodos para melhorar a qualidade e quantidade de macrocontas de agarose contendo células secretoras revestidas com agarose. Isto é conseguido através da utilização de agarose Seakem Gold descrita abaixo.

ANTECEDENTES DA ARTE ANTERIOR

Está actualmente estabelecido que a terapia de substituição de ilhéus é uma abordagem viável para tratamento de pacientes com vários distúrbios. Estes incluem pacientes de cancro sujeitos a exenteração abdominal superior (Tzakis, et al., Lancet 336: 402-405 (1990))/ pancreatite (Clayton, et al., Transplantation 76: 92-98 (2003); Farney, et al.,

Surgery 110: 427-437 (1991); Fontes, et al., Transplant Proc. 24: 2809 (1992); Obenholzer, et al., Transplantation 69: 1115-1123 (2000); Robertson, et al., Diabetes 50: 47-50 (2001)), e pacientes insulinodependentes, onde o transplante de ilhéus é uma opção terapêutica (Goss, et al.,

Transplantation 74: 1761-1766 (2002); Ricordi, et al.,

Transplantation 75: 1524-1527 (2003); Ryan, et al., Diabetes 50: 710-719 (2001); Shapiro, et al., N. Engl. J. Med. 343: 230-238 (2000)) .

Devido à utilidade dos ilhéus em terapia, tal como é indicado, supra, existe, como é claro, interesse no desenvolvimento de modos de os isolar. Embora existam muitos relatos sobre o isolamento de ilhéus utilizando o método 2 1 928 249/ΡΤ automatizado (Brandhorst, et al., Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes 103 Supl. 2: 3-14 (1995); Cui, et al., Cell Transplant 6: 48-54 (2001); Marchetti, et al., Transplantation 52: 209-213 (1991); Miyamoto, et al., Cell Transplant 7: 397-402 (1998); Nielsen, et al., Comp. Med. 52: 127-135 (2002); Swanson, et al., Hum. Immunnol 62: 73 9-749 (2001); Toomey, et al., Brit. J. Surg. 80: 240-243 (1993); Toso, et al., Cell Transplant 9: 297-305 (2000); Wennberg, et al., Transpalnt. Proc. 33: 2537 (2001)), o isolamento de ilhéus permanece notoriamente dificil. Por exemplo, Bosta, et al., J. Investig. Med. 43: 555-566 (1995); Krickhahn, et al., Cell Transplant 11: 827-838 (2002); Krickhahn, et al., Ann. Transplant 6: 48-54 (2001), 0'Neil, et al., Cell Transplant 10: 235-246 (2001), e White, et al., Horm. Metab. Res. 31: 579-524 (1999), discutem todos problemas em relação a isto. O fabrico de macrocontas que contenham células secretoras e/ou organelos, tais como células de cancro, ilhéus, e ai por diante, é bem conhecido. Ver, p.ex., Patente U.S. Nos. 6818230, 6808705, RE 38027, 6303151, 6224912, 5888497 e 5643569, bem como o pedido de Patente U.S. publicado 2005/0096561, os quais são todos incorporados por referência. A agarose é para encapsular os materiais biológicos nestes documentos de patente após o que as estruturas resultantes são ainda encapsuladas com uma segunda camada de agarose.

Aqueles familiarizados com agarose reconhecerão que estão disponíveis muitos tipos e variedades deste material. Seakem Gold, um desses tipos de agarose, é descrito na Patente U.S. No. 4983268, cuja divulgação é aqui incorporada por referencia. Existe uma necessidade contínua de ter versões melhoradas dos materiais descritos pela primeira vez nas patentes e pedido expostos supra. Verificou-se agora que a agarose Seakem Gold resulta num produto que é inesperadamente superior aos produtos da técnica anterior.

Detalhes do invento são expostos na divulgação que se segue: 3 1 928 249/ΡΤ

BREVE DESCRIÇÃO DA FIGURA A Figura 1 expõe informações sobre os niveis diários médios de glicose para animais de teste e de controlo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS EXEMPLO 1

Ilhéus foram isolados de acordo com a metodologia exposta em Gazda, et al., Pedido de Patente publicado 2006/0121445, publicado a 8 de Junho de 2006, Número de série 11/273737, que é incorporado por referência na sua totalidade. Deve ser tido em mente, no entanto, que outras metodologias para isolamento de ilhéus são possíveis e podem ser utilizadas, uma vez que o invento não é dependente do método de isolamento particular.

Após o isolamento e a avaliação, pâncreas apropriados foram mais processados. Foi aparada a gordura e o tecido conjuntivo das glândulas e, em seguida, o canal pancreático principal foi canulado com uma agulha de aço inoxidável e ponta romba de 16g. Uma solução de HBSS contendo colagenase P, a uma concentração de 1,5-2,0 g/1, foi perfundida a um caudal de 50 ml/mm, a 30°C, para proporcionar 2 ml de solução por grama do peso do pâncreas. O pâncreas foi então coberto com 500 ml de HBSS e PS a 2%, juntamente com 200 ml de solução de colagenase, a 30°C. Circulação externa de água a 39°C aqueceu lentamente o órgão a 37°C, e manteve a temperatura do digerido a 36-37°C. Quando os órgãos pareciam dissociados, e ofereciam pouca resistência à pressão manual (após cerca de 10-20 minutos de tempo total, e 5-10 minutos após atingirem 37°C), a digestão era parada. O digerido colhido foi então centrifugado, os sobrenadantes aspirados e o sedimento resultante foi suspenso em PS a 10% e uma solução conservante de órgãos. Os ilhéus foram então purificados sobre Ficoll descontinuo, em gradientes de densidade de 1,105, 1,095, 1,085 e 1,05 g/cm3, HBSS mais PS a 2%, em tubos de 50 ml. Os tubos foram centrifugados a 650 g a 4°C, e as camadas contendo ilhéus 4 1 928 249/ΡΤ foram colhidas e lavadas três vezes em HBSS mais PS a 10%, após o que foram manualmente purificadas de tecido sem ser ilhéus com o auxilio de um microscópio de dissecação. Os ilhéus foram ressuspensos e duas amostras de 0,5 ml foram utilizadas para contagem do rendimento de ilhéus. O rendimento médio de dez pâncreas testados foi de 130000 EIN, com uma média de 1101 EIN por grama de tecido digerido. A pureza, em todos os casos, foi superior a 90%. Para 9 dos órgãos, a viabilidade dos ilhéus foi superior a 89%. EXEMPLO 2

Após o isolamento dos ilhéus, vários parâmetros foram determinados, incluindo pureza e viabilidade, tal como mencionado supra. A pureza foi avaliada através de coloração com cerca de 500 EIN com DTZ, durante dez minutos e foi depois realizada análise de imagem padrão utilizando um microscópio de dissecação e uma câmara digital. A viabilidade foi determinada através de coloração de uma amostra com diacetato de fluoresceina (FDA) e brometo de etidio (EB). Para desenvolver, cerca de 500 EIN foram adicionados a 1 ml de RPMI, PS a 10%, e antibiótico/antimicótico ("A/A") a 1%. Em seguida, foram adicionados 20 μΐ de corante FDA que tinha sido feito com 10 mg de FDA e 1 ml de acetona, e 200 μΐ de EB que tinha sido feito com 30 μΐ de EB e 1 ml de PBS. Os ilhéus foram corados, no escuro, durante sete minutos e, em seguida, amostras aleatórias de 10-50 ilhéus foram visualizadas com um microscópio de fluorescência e fotografadas, para determinar a viabilidade utilizando análise de imagem padrão. O teor de insulina dos ilhéus foi também medido, através da colocação de aproximadamente 500 EIN em solução de extracção de álcool ácido (7,2 ml de HC1 1 N, 400 ml de etanol a 100% desnaturado). As amostras foram armazenadas a -20°C, e foi realizado um RIA de insulina. 5 1 928 249/ΡΤ

Tabela 1

Lote # Teor de Insulina (mu/500EIN) W1561 338,66 02109 1288,69 Y8641 775,37 037360 402,59 0786 184,40 Y8587 669,92 W1102 590,05 W1524 ND 039820 ND R2027 474,55 EXEMPLO 3

Este, e os exemplos que se seguem, abordam a questão de saber se os ilhéus identificados como úteis e isolados tal como descrito, podem ser utilizados em macrocontas.

Os ilhéus purificados foram ressuspensos em meio RPMI 1640 + PS a 10% + A/A a 1%, até um volume de 2000 EIN/ml. Os ilhéus foram uniformemente distribuído em tubos, de modo que cada tubo contivesse 1 ml de suspensão a 2000 EIN.

Após assentamento por gravidade, os sobrenadantes foram removidos, e 0,5 ml de agarose Seakem Gold a 1,5%, a 50°C, preparada em meio essencial minimo mais tampão HEPES a 2,5%, foram adicionados a cada amostra, e misturou-se uniformemente. A suspensão foi então expelida por baixo de óleo mineral estéril, para fazer quatro contas com superfícies lisas e distribuições iguais de ilhéus.

As macrocontas foram removidas, e lavou-se duas vezes (RPMI + PS a 5% + A/A a 1%) . Estas macrocontas foram cultivadas na mesma solução, numa atmosfera húmida de CO2 a 5%, durante 5-7 dias, após o que foram lavadas, três vezes, em RPMI + A/A a 1%, seguido pela aplicação de um segundo revestimento de agarose. Para isso, 0,5 ml de agarose a 5% em MEM, mais tampão HEPES a 60°C, foram transferidos através de uma pipeta, para uma colher de plástico estéril, e cada macroconta foi rolada 3-5 vezes para produzir um segundo 6 1 928 249/ΡΤ revestimento de agarose uniforme. Após transferência para óleo mineral estéril para produzir uma superficie lisa, as macrocontas foram removidas, lavadas duas vezes em RPMI + PS a 2,5% + A/A a 1%, e incubadas a 37°C em ar húmido com CO2 a 5%. Outros métodos para produzir as contas podem, como é claro, ser utilizados.

Determinou-se que as macrocontas contendo ilhéus encapsulados permanecem viáveis por mais de 6 meses, tempo ao longo do qual os radioimunoensaios revelaram que continuavam a produzir bons niveis de insulina. EXEMPLO 4

Este exemplo descreve experiências que demonstram a capacidade dos ilhéus suinos para funcionar in vivo.

Foram utilizados ratinhos CB17-PrKdc <scid>/J diabéticos não-obesos machos, com 7-9 semanas de idade. Após uma semana de aclimatação, os animais receberam 275 mg/kg de estreptozotocina, que induz diabetes. Nove dias mais tarde, quando os seus niveis de glicose no sangue tinham uma média acima de 480 mg/dl, iniciaram uma terapia de insulina.

No dia 34-35 após a administração de estreptozotocina, os animais receberam aproximadamente 1000 BIN de ilhéus suinos, que foram transplantados num coágulo sanguíneo, seguindo Bowen et al., Aust. J. Exp. Biol. Med. Sei. 58: 441-447 (1980), incorporado por referência. Resumidamente, os ilhéus foram sedimentados a partir de suspensão e os meios foram aspirados. Depois, cerca de 5-10 μΐ de sangue foram retirados do animal, adicionados aos ilhéus, e deixados coagular. Os animais receptores foram anestesiados com volumes iguais de cetamina (167 mg/dl), xilazina (33 mg/ml), e solução salina. A mistura foi administrada por via subcutânea, a uma dose de 0,5 ml/100 g. Foi feita uma pequena incisão no flanco esquerdo para expor o rim, e foi utilizado um microscópio de dissecação para fazer uma pequena incisão na cápsula do rim. A cápsula foi então separada do rim, os ilhéus/coágulo foram colocados sob a cápsula, a incisão foi fechada, e foi permitido aos animais recuperar. 7 1 928 249/ΡΤ

Foram realizadas nefrectomias nos animais, 38-39 dias após o transplante. Resumidamente, após a anestesia, o rim possuindo o enxerto foi exposto, os vasos sanguíneos renais foram ligados e o rim de cada animal foi removido. Cinco dias depois, os animais foram sacrificados e os pâncreas foram recolhidos para confirmação histológica da destruição completa das células beta dos ilhéus.

Amostras de tecido foram colocadas em formação tamponada neutra a 10% durante 24 horas, e foram depois transferidas para álcool etilico a 70%.

Depois disso, os tecidos foram embebidos em parafina, e secções de 5 pm foram coradas com hematoxilina e eosina. Secções de pâncreas e de rins enxertados foram coradas para células contendo insulina e glucagon, utilizando métodos padrão, e foram então estudadas.

Todos os ratinhos se tornaram normoglicémicos após o enxerto dos ilhéus. Após nefrectomia, todos os ratinhos se tornaram hiperglicémicos em quatro dias. EXEMPLO 5

Este exemplo descreve experiências que foram desenhadas para determinar a extensão em que as contas revestidas com agarose-agarose, feitas de diferentes agaroses, causaram reacção dos tecidos, i.e., inflamação, em animais receptores.

Foram utilizadas duas estirpes de ratos, i.e., ratos Wistar e Sprague Dawley. Um total de 29 ratos foi testado (14 Wistar, 15 Sprague Dawley). Três ratos de cada estirpe foram utilizados para testar as contas revestidas com agarose-agarose Seakem Gold do invento. Três de cada estirpe foram utilizados para testar os tipos de agarose FMC HGT(P) e Amresco. Dois ratos Wistar foram utilizados para testar a agarose Sigma HV, assim como quatro ratos Sprague Dawley. Finalmente, três ratos Wistar foram utilizados para testar contas de agarose Sigma LV, assim como dois ratos Sprague Dawley. 8 1 928 249/ΡΤ

Um total de sessenta contas vazias de cada tipo foi implantado nas cavidades peritoneais dos ratos, com duas excepções. Dois ratos Sprague Dawley receberam 54 ou 59 contas de agarose Sigma HV. Os ratos foram observados durante 3 meses, e depois sacrificados. Vários órgãos foram removidos para estudar a inflamação (baço, figado, rim, músculo- esquelético, pâncreas e mesentério).

Os tecidos foram avaliados quanto a inflamação utilizando padrões aprovados pelo American College of Veterinary Pathology. A avaliação utilizou uma escala de 6 pontos para avaliar a inflamação, essencialmente como se segue: 0 = normal 1 = minima (inflamação inferior a 10%) 2 = suave (10-25% de inflamação) 3 = moderada (25-50% de inflamação) 4 = marcada (50-75% de inflamação) 5 = grave (inflamação superior a 75%)

Os tecidos para cada animal foram avaliados e depois foi calculada a média. Os resultados surgem abaixo:

Valores médios de gravidade por tecido

Wistar Invento FMC HGT(P) Sigma HV Amresco Sigma LV Baço 0 \—1 1,7 1,3 1,0 0,7 Fígado ° 1 o 0,3 0,3 1,0 0,7 Rim 0,3 0,7 PO o 0,5 0,7 Músculo- esquelético 0,5 1,3 1,7 0,0 2,5 Pâncreas 1,7 1,7 1,3 2,5 2,0 Mesentério 2,3 3, 0 2,0 2,5 3, 3 TOTAL 5,8 8,7 6,9 7,5 9,9 Valor Bruto 19 36 25 24 20 9 1 928 249/ΡΤ

Valores médios de gravidade por tecido

Sprague Dawley Invento FMC HGT(P) Sigma HV Amresco Sigma LV Baço 1,3 2,0 2,3 2,3 2,0 Figado 0,0 0,0 0,7 0,0 0,0 Rim 1,0 0,7 1,0 1,3 0,0 Músculo- esquelético 1,3 1,0 1,5 1,5 1,0 Pâncreas 1,7 1,3 1,7 2,3 1,0 Mesentério 2,3 3, 0 3, 0 2,3 1,5 TOTAL 7,6 8,0 10,2 9,7 5,5 Valor Bruto 15 24 29 22 27

Soma dos valores médios de gravidade para cada estirpe

Wistar + Sprague Dawley Invento FMC HGT(P) Sigma HV Amresco Sigma LV Baço 2,3 3,7 3,7 3,3 2,7 Figado 0,0 0,3 1,0 1,0 0,7 Rim 1,3 1,3 1,3 1,8 0,7 Músculo- esquelético 1,8 2,3 3,2 1,5 3,5 Pâncreas 3,3 3, 0 3, 0 4,8 3, 0 Mesentério 4,7 6, 0 5, 0 4,8 4,8 TOTAL 13,6 16,6 17,2 17,2 15,4 Valor Bruto 34 60 54 46 47

As contas revestidas a agarose-agarose do invento foram claramente as menos inflamatórias.

Estudos de inflamação adicionais foram realizados em cães, comparando as contas do invento com contas feitas de agarose FMC HGT (P) (agarose FMC HGTP), e revestidas com ela. Novamente, as contas revestidas a agarose-agarose do invento foram menos inflamatórias.

Num estudo adicional, os cães receberam as contas revestidas a agarose-agarose do invento, que continham ilhéus suinos. Os animais foram sacrificados após 2,5 anos, e apenas 10 1 928 249/ΡΤ foi observada inflamação mínima. Em comparação com animais de controlo não implantados, o peritoneu e o mesentério tinham uma aparência notavelmente normal. EXEMPLO 6

Nestas experiências, as macrocontas de agarose Seakem Gold contendo ilhéus que tinham sido cultivadas in vitro, foram comparadas com macrocontas de controlo (vazias).

Os ilhéus encapsulados em agarose Seakem foram preparados, tal como descrito no Exemplo 3, supra.

Doze ratos BB machos espontaneamente diabéticos foram utilizados como sujeitos animais. Todos os animais tinham 10-15 semanas de idade, e mostraram evidências de diabetes clínica, durante 3-16 dias.

Aos 20-21 dias após a chegada, os ratos BB foram anestesiados com cetamina/xilazina/NaCl, administrado subcutaneamente, numa dose de 2,2-2,3 ml/kg de peso corporal. Após anestesia, os animais receberam um implante de macrocontas contendo ilhéus a uma dose equivalente a 1,0 vezes as necessidades diárias de insulina ou um número comparável de macrocontas vazias.

Após a implantação, os animais foram observados, com observações clínicas registadas diariamente, incluindo o estado geral (bom, normal ou fraco), peso corporal, glicose no sangue, glicose na urina e cetona na urina. Amostras de soro foram colhidas ao longo do estudo, para utilizar para determinação da insulina, glucagon e péptido C suíno. Radioimunoensaios foram utilizados para medir estes parâmetros. Foram também realizados testes de tolerância à glicose intraperitoneais.

Noventa e sete dias após o implante, foram realizadas necroscopias completas nos animais. Os animais foram anestesiados e sangrados e as cavidades peritoneais foram expostas. 11 1 928 249/ΡΤ

Durante todo o período de 97 dias do estudo, os seis animais que tinham recebido as contas de agarose Seakem contendo ilhéus não requerem a administração de insulina. Isto está em contraste com os animais que receberam macrocontas vazias. A estes animais foi administrada insulina exógena começando dois dias após o início do estudo, porque os níveis de glicose no sangue subiram para 300-500 mg/dl. Dois destes animais de controlo foram encontrados mortos no terceiro dia do estudo, presumivelmente devido a deficiência de insulina.

Os níveis médios diários de glicose no sangue foram significativamente mais baixos nos animais que receberam as contas de agarose Seakem contendo ilhéus, em comparação com os controlos. Além disso, os seis animais de teste exibiram um intervalo muito estreito de desvios diários de glicose no sangue, mesmo sem terapêutica de insulina.

Após um mês, estes animais que tinham recebido os ilhéus tornaram-se moderadamente hiperglicémicos, mas exibiram excursões glicémicas limitadas (cerca de 100 mg/dl). Isto está em contraste com os controlos, os quais mostraram variação extrema, de aproximadamente 400-500 mg/dl, não obstante a administração de 2-3 U/dia de insulina exógena.

Foram realizados testes iniciais de tolerância à glicose intraperitoneais em todos os animais, para confirmar o diagnóstico clínico de diabetes de tipo I. Este teste foi também realizado 8 e 90 dias após o transplante. Cinco dias antes do transplante, uma resposta ao confronto com glicose não era evidente, mas no oitavo dia após o implante, os receptores das macrocontas contendo ilhéus mostraram uma resposta marcada ao confronto com glicose, i.e., uma subida inicial na glicose no sangue, seguida por um retorno à normoglicemia. A hiperglicemia não foi inibida também em animais que receberam as macrocontas vazias, não obstante a terapia de insulina simultânea, tal como descrito, supra.

Aos 90 dias após o implante, foi realizado outro teste de tolerância à glicose intraperitoneal. A glicemia basal foi novamente restabelecida para os ratos que tinham recebido as macrocontas de ilhéus, mas os níveis de glicose no sangue de 12 1 928 249/ΡΤ partida eram consideravelmente mais elevados, i.e., aproximadamente 400 mg/dl. Os ratos que tinham recebido macrocontas vazias não conseguiram restabelecer a glicemia basal.

Os ensaios para o péptido C de suino não detectaram o péptido nos animais do estudo antes da implantação, ou de receptores de macrocontas vazias. Em contraste, o péptido foi rotineiramente detectado no soro de ratos implantados com macrocontas de ilhéus, a um nivel médio de 0,880-0,249 ng/ml a 21 dias após o implante a 0, 662-0, 160 ng/dl no final do estudo.

Os animais de estudo foram também testados quanto à glicosúria, cetonúria, e à necessidade de administrar bicarbonato. Não houve diferenças significativas antes da implantação, no entanto, após esta os receptores de macrocontas de ilhéus experimentaram significativamente menos episódios de glicosúria (37 de 56 amostras, versus 67 de 81) , e cetonúria (20 de 64 amostras, versus 32 de 54). A necessidade de terapia de bicarbonato foi também significativamente diminuída (2 tratamentos, versus 26). EXEMPLO 7

As experiências que se seguem demonstram que as macrocontas de agarose Seakem que aprisionam ilhéus podem ser cultivadas, in vitro, durante longos períodos de tempo, e ainda permanecer funcionais.

Nestas experiências, foi utilizado um conjunto de 12 ratos BB diabéticos, que satisfizeram os mesmos critérios que os ratos no Exemplo 6, supra, tal como o foram 23 ratos Wistar-Furth com 7 semanas de idade. Este segundo grupo de ratos serviu como controlos normais.

Cinco destes ratos Wistar-Furth foram injectados, através da veia caudal, com 65 mg/kg de estreptozotocina, para induzir diabetes. Quando foram observadas duas leituras consecutivas de glicose no sangue >500 mg/dl, os ratos começaram a receber terapia de insulina, tal como descrito infra. 13 1 928 249/ΡΤ

Os animais foram anestesiados 20-21 dias após a chegada, utilizando uma dose de 0,1 ml/100 g de cetamina (60 mg/ml)/ xilazina (6 mg/ml)/butarfenol (3 mg/ml), administrada intramuscularmente.

Após anestesia, todos os ratos BB receberam contas de agarose Seakem contendo ilhéus, conforme descrito supra. Os ratos foram divididos em três grupos de 4, e receberam macrocontas que tinham sido cultivadas, in vitro, durante 9 semanas, 40 semanas ou 67 semanas. A quantidade de macrocontas administrada foi equivalente a 1,0* a necessidade diária de insulina do animal.

Cinco dos ratos Wistar-Furth receberam macrocontas que tinham sido cultivadas, in vitro, durante 7,8-11,5 semanas, à mesma dose que os ratos BB. Isto é, aproximadamente 45-4 9 macrocontas por rato Wistar-Furth e 56-60 por rato BB.

Ao longo do curso das experiências, os ratos ganharam, em média, aproximadamente 75 g. Como resultado, no dia 97 após o primeiro implante, foi realizado um implante suplementar em ratos BB. As necessidades de insulina médias pré-implante para os ratos foram de 0,0083 U de insulina/g de peso corporal. Este valor levou ao cálculo de que eram necessárias mais 17 macrocontas contendo ilhéus para produzir 39,19 mU de insulina por 24 horas. Tal como é explicado infra, como foram removidas 4 contas de cada rato antes do segundo implante, foram administradas 21 macrocontas, cultivadas durante 19 semanas. Os ratos Wistar-Furth não receberam um segundo implante.

Os vários ensaios realizados no Exemplo 7 foram também realizados aqui, utilizando os mesmos métodos.

Aos 201-202 dias após a implantação, foram realizadas necroscopias completas, também descritas supra.

Os niveis diários médios de glicose no sangue são mostrados na figura 1. Após a implantação, a normoglicemia (100-200 mg/dl) foi restaurada durante aproximadamente um mês em todos os ratos BB. Depois disso, desenvolveu-se uma hiperglicemia moderada (200-400 mg/dl) nos ratos BB, e esta 14 1 928 249/ΡΤ persistiu durante o resto do estudo. 0 desenvolvimento de hiperglicemia moderada e a obtenção de um peso corporal máximo ocorreu contemporaneamente. 0 peso corporal permaneceu consistente, enquanto os niveis de glicose no sangue flutuaram entre 300-400 mg/dl durante o resto do estudo. Não houve diferenças observadas nos niveis diários médios de glicose no sangue entre os três grupos de ratos que receberam macrocontas Seakem Gold contendo ilhéus, independentemente da duração do tempo de cultura in vitro para as contas.

Os ratos Wistar-Furth nos quais foi induzida diabetes também exibiram normoglicemia durante cerca de um mês, após o que foi observada hiperglicemia moderada.

Notou-se, supra, que ocorreu um segundo implante em ratos BB, aos 97 dias de estudo. Este segundo implante não teve impacto nos valores diários de glicose no sangue. O péptido C de suino foi também ensaiado, e foi detectado em todos os 3 grupos de ratos BB. Durante os primeiros 88 dias das experiências, o péptido C de suino médio diminuiu de 0,6-0,9 ng/ml para 0,2-0,4 ng/ml. No dia 116, após o segundo implante, os niveis de péptido aumentaram para uma média de 0,3-0,7 ng/ml, sendo observado um aumento de 40 vezes no fluido peritoneal na necropsia.

Os procedimentos de confronto com glicose foram realizados ao longo do final do estudo, em todos os ratos que tinham recebido implantes de macrocontas de ilhéus. Não foram observadas diferenças na capacidade das macrocontas, cultivadas ao longo diferentes durações de tempo, para responder ao confronto com glicose após o implante. Para desenvolver, os niveis de glicose no sangue de todos os ratos BB tinham aproximadamente duplicado desde o valor inicial de 100-200 mg/dl. O retorno à glicemia basal ocorreu em 120 minutos em 10 dos 12 animais. Esta resposta foi semelhante à observada em animais Wistar-Furth normais.

Eventualmente todos os animais se tornaram moderadamente hiperglicémicos, mas um confronto com glicose, no dia 105 pós-transplante, mostrou um aumento inicial de glicose no sangue e depois um retorno à glicemia basal. Aos 200 dias, 15 1 928 249/ΡΤ pós-transplante, houve apenas um ligeiro aumento na glicemia basal após a administração de glicose e depois um retorno à glicemia basal.

Os resultados nestes estudos, quando comparados com o trabalho de Jain, et al., em Transplantation, supra, mostram que as contas de agarose contendo ilhéus onde a agarose é Seakem Gold, foram inesperadamente melhores que as relatadas por Jain, et al. Por exemplo, 40% dos sujeitos animais morreram pelo dia 200, no relatório de Jain, et al., enquanto a taxa de mortalidade com as macrocontas do invento foi zero. Além disso, os resultados aqui alcançados foram obtidos utilizando metade das macrocontas tal como é relatado por Jain, et al. Além disso, em resultados não desenvolvidos aqui, após necroscopia, foram determinados os niveis de produção de insulina obtidos a partir de macrocontas recuperadas, e foram substancialmente maiores que os obtidos a partir das macrocontas recuperadas após necroscopia tal como relatado por Jain, et al. EXAMPLE 8

Foram realizadas experiências para comparar a força das contas do invento, com contas feitas e revestidas com agarose FMC HGT (P).

Nestes testes, as contas foram colocadas, individualmente, num dispositivo de compressão, possuindo uma placa superior e inferior. A placa superior desceu, a uma velocidade de 12 polegadas por minuto, e as contas foram comprimidas até romperem. A força da compressão (compressão máxima) em lbf foi determinada.

Para HGT(P), a compressão máxima variou de 0,714 lbf a 3,183 lbf, com uma média de 1,958, e desvio padrão de 0,5444. Para os produtos do invento, o intervalo foi de 2,322 lbf a 6,418 lbf, com uma média de 4,282, e desvio padrão de 1,096.

Claramente, as contas do invento foram mais fortes que as de outras contas revestidas a agarose-agarose. 16 1 928 249/ΡΤ

Os exemplos anteriores descrevem várias caracteristicas do invento, que se referem a macrocontas de agarose contendo células secretoras, revestidas com agarose, em que a agarose utilizada é agarose Seakem Gold.

Tal como exposto aqui, o termo "macroconta" refere-se a uma estrutura que é essencialmente esférica, com um diâmetro de cerca de 4 a cerca de 10-12 mm de diâmetro, de preferência de cerca de 6 a cerca de 8 mm de diâmetro. A segunda camada de agarose tem de preferência de cerca de 0,05 a cerca de 5 mm de espessura, de preferência de cerca de 0,5 mm a cerca de 5 mm de espessura, ainda de preferência de cerca de 1,0 a cerca de 3 mm, e ainda de maior preferência de cerca de 1,0 a cerca 2,0 mm de espessura. A segunda camada de agarose pode, mas não precisa de ser, agarose Seakem Gold.

As "macrocontas" são utilizadas como uma estrutura preferida, no entanto, qualquer estrutura de agarose sólida que encapsule células secretoras e seja, de preferência, revestida com uma segunda camada de agarose é caracteristica do invento.

As células secretoras podem variar. Qualquer célula ou organelo que produza um produto de secreção desejável pode ser encapsulada. Os ilhéus, células de cancro e células estaminais são exemplares dos tipos de materiais que podem ser assim utilizados. Cada conta pode conter um número variável de organelos celulares, para ilhéus, por exemplo, de cerca de 50 a cerca de 5000 ilhéus, de preferência, de cerca de 100 a cerca de 2500 ilhéus, ainda de preferência, de cerca de 250 a cerca de 1000, e de maior preferência, de cerca de 475 a cerca de 550 ilhéus. É especialmente preferido cerca de 500 ilhéus.

Outros aspectos do invento serão claros para o perito na técnica e não precisam de ser mais desenvolvidos.

Lisboa, 2012-05-15

Claims (18)

1 928 249/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Método de produção de um conta de agarose com células secretoras revestida a agarose, compreendendo: (a) suspensão de células secretoras numa primeira agarose, em que a referida primeira agarose tem um teor de sulfato de menos de 0,2% em peso mas maior que zero, um teor de piruvato de 0-0,1% em peso, um teor de azoto de 0-0,2% em peso, e forma um gel que tem uma força de gel a uma concentração de 1,0% em peso de pelo menos 1200 g/cm2, substancial ausência de ligação a ADN em 0,7 M ou menos de tampão tris-acetato e uma electroendosmose a uma concentração de 1,0% em peso de 0,05 ou menos, (b) formação de uma conta a partir das referidas células secretoras suspensas do passo (a), (c) incubação da referida conta do passo (b) em ar húmido, e (d) revestimento da referida conta do passo (c) com uma segunda agarose, para formar uma conta de agarose com células secretoras revestida a agarose.

2. Método da reivindicação 1, compreendendo ainda o rolamento da referida conta do passo (c) em agarose a 5%, a colocação da referida conta rolada em contacto com óleo mineral, e a lavagem da referida conta rolada para formar a referida conta de agarose com células secretoras revestida a agarose.

3. Método da reivindicação 1, em que as referidas células secretoras são ilhéus.

4. Método da reivindicação 3, em que os referidos ilhéus são ilhéus seleccionados a partir do grupo consistindo em ilhéus humanos, ilhéus bovinos e ilhéus suinos.

5. Método da reivindicação 3, em que a referida conta contém de cerca de 50 a cerca de 5000 ilhéus, de preferência de cerca de 100 a cerca de 2500 ilhéus, de maior preferência cerca de 475 a cerca de 550 ilhéus.

6. Método da reivindicação 1, em que a referida conta é uma macroconta com um diâmetro de cerca de 4 mm a cerca de 1 928 249/ΡΤ 2/3 12 mm, de preferência de cerca de 4 mm a cerca de 10 mm, ainda de preferência de cerca de 4 mm a cerca de 8 mm, de maior preferência de cerca de 6 mm a cerca de 8 mm.

7. Método da reivindicação 1, compreendendo o revestimento da referida conta com uma camada de agarose de cerca de 0,05 mm a cerca de 5,0 mm, de preferência de cerca de 1,00 mm a cerca de 3,0 mm, de maior preferência de cerca de 1,00 mm a cerca de 2,0 mm.

8. Uma conta de agarose com células secretoras revestida a agarose, em que a agarose da conta de agarose com células secretoras tem um teor de sulfato de menos de 0,2% em peso mas maior que zero, um teor de piruvato de 0-0,1% em peso, um teor de azoto de 0-0,2% em peso, e forma um gel que tem uma força de gel a uma concentração de 1,0% em peso de pelo menos 1200 g/cm2, substancial ausência de ligação a ADN em 0,7 M ou menos de tampão tris-acetato e uma electroendosmose a uma concentração de 1,0% em peso de 0,05 ou menos.

9. Conta de agarose com células secretoras revestida a agarose da reivindicação 8, em que a referida conta contém ilhéus.

10. Conta de agarose com células secretoras revestida a agarose da reivindicação 9, em que os referidos ilhéus são ilhéus seleccionados a partir do grupo consistindo em ilhéus humanos, ilhéus bovinos e ilhéus suínos.

11. Conta de agarose com células secretoras revestida a agarose da reivindicação 9, contendo de cerca de 50 a cerca de 5000 ilhéus, de preferência de cerca de 100 a cerca de 2500 ilhéus, de maior preferência de cerca de 475 a cerca de 550 ilhéus.

12. Conta de agarose com células secretoras revestida a agarose da reivindicação 9, possuindo um diâmetro de cerca de 4 mm a cerca de 12 mm, de preferência de cerca de 4 mm a cerca de 10 mm, ainda de preferência de cerca de 4 mm a cerca de 8 mm, de maior preferência de cerca de 6 mm a cerca de 8 mm. 1 928 249/ΡΤ 3/3

13. Conta de agarose com células secretoras revestida a agarose da reivindicação 8, em que a referida conta é revestida com uma camada de agarose de cerca de 0,05 mm a 5,0 mm, de preferência de cerca de 1,0 mm a 3,0 mm, de maior preferência de cerca de 1,0 mm a 2,0 mm.

14. Utilização das contas de agarose com células secretoras revestidas a agarose da reivindicação 8, para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma condição causada por um funcionamento deficiente de células secretoras.

15. Utilização de acordo com a reivindicação 14, em que a referida condição é diabetes dependente de insulina. 14, em que

16. Utilização de a referida conta contém acordo com a reivindicação ilhéus. em que grupo ilhéus

17. Utilização de acordo com a reivindicação 16, os ilhéus são ilhéus seleccionados a partir do consistindo em ilhéus humanos, ilhéus suinos e bovinos.

18. Utilização de acordo com reivindicação 14, em que as referidas contas são para colocação na cavidade intraperitoneal. Lisboa, 2012-05-15