KR101110386B1

KR101110386B1 - 시켐 골드 아가로스를 포함하는 분비 세포-함유 매크로비드및 그의 용도

Info

Publication number: KR101110386B1
Application number: KR1020087007337A
Authority: KR
Inventors: 로렌스 가즈다; 배리 스미스
Original assignee: 더 로고신 인스티튜트, 인크.
Priority date: 2005-09-26
Filing date: 2006-09-14
Publication date: 2012-03-08
Also published as: CN101272690B; PL1928249T3; US20070071732A1; CA2622529A1; RU2417090C2; IL190028A0; KR20080071122A; DK1928249T3; NZ566621A; ES2379008T3; PT1928249E; AU2006295114A1; EP1928249B1; IL190028A; EP1928249A4; US8518394B2; JP2009509507A; WO2007038029A3; EP1928249A2; RU2008114920A

Abstract

본 발명은 아가로스로 코팅된 분비 세포 함유 비드 구조의 제조 및 용도를 기재한다. 바람직하게는 직경이 4 mm 내지 12 mm이고, 바람직하게는 아일릿을 함유하는 상기 비드는 특정한 아가로스, 즉, 시켐 골드 아가로스로 제조된다.

매크로 비드, 분비 세포, 아가로스, 아일릿

Description

시켐 골드 아가로스를 포함하는 분비 세포-함유 매크로비드 및 그의 용도 {SECRETORY CELL-CONTAINING MACROBEADS COMPRISING SEAKEM GOLD AGAROSE, AND USES THEREOF}

관련 출원

본 출원은 전체로서 본 명세서에 포함되는, 가출원 제60/629,227호(2004년 11월 17일 출원) 및 제60/720,917호(2005년 9월 26일 출원)에 대하여 우선권을 주장한다.

본 발명은 아가로스로 코팅된 분비 세포 함유 아가로스 매크로비드의 질과 양을 개선시키는 방법에 관한 것이다. 이는 이하에 기술된 시켐 골드(Seakem Gold) 아가로스를 사용함으로써 달성된다.

아일릿 대체 요법(islet replacement therapy)은 현재 다양한 질환을 앓는 환자들의 치료에 대한 실용적인 접근법으로 확립되었다. 이들 환자에는 흉부 기관의 적출술을 받아야 하는 암 환자 [참조: Tzakis, et al., Lancet, 336: 402-405 (1990)]; 췌장염 [참조: Clayton, et al., Transplantation, 76: 92-98 (2003); Farney, et al., Surgery, 110: 427-437 (1991); Fontes, et al., Transplant Proc., 24: 2809 (1992); Obenholzer, et al., Transplantation, 69: 1115-1123 (2000); Robertson, et al., Diabetes, 50: 47-50 (2001)], 및 인슐린-의존 환자들이 포함되며, 아일릿 이식은 치료상의 선택사항이다 [참조: Goss, et al., Transplantation, 74: 1761-1766 (2002); Ricordi, et al., Transplantation, 75: 1524--1527 (2003); Ryan, et al., Diabetes, 50: 710-719 (2001); Shapiro, et al, N. Engl. J. Med, 343: 230-238 (2000)].

전술한 바와 같이, 치료에 있어서 아일릿의 유용성으로 인해, 그것들을 단리시키는 방법을 개발하는 데에 관심이 집중되고 있다. 자동화 방법을 이용하는 아일릿의 단리에 관한 많은 보고들이 있지만 [참조: Brandhorst, et al., Exp. Clin. Endocrinol Diabetes, 103 Suppl. 2: 3-14 (1995); Cui, et al., Cell Transplant, 6: 48-54 (2001); Marchetti, et al., Transplantation, 52: 209-213 (1991); Miyamoto, et, al., Cell Transplant, 7: 397-402 (1998); Nielsen, et al., Comp. Med., 52: 127-135 (2002); Swanson, et al., Hum. Immunnol, 62: 739-749 (2001); Toomey, et al., Brit. J. Surg., 80: 240-243 (1993); Toso, et al. Cell Transplant, 9: 297-305 (2000), Wennberg, et al., Transplant. Proc., 33: 2537 (2001)], 아일릿의 분리는 상당히 어려운 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[ Bosta, et al., J. Investig Med, 43: 555-566 (1995); Krickhahn, et al., Cell Transplant, 11: 827-838 (2002); Krickhahn, et al., Ann Transplant, 6: 48-54 (2001), O'Neil, et al., Cell Transplant, 10: 235-246 (2001), 및 White, et al., Horm. Metab. Res, 31: 579-524 (1999)] 모두에서 이와 관련된 문제를 논의하고 있다.

분비 세포 및/또는 소기관, 예컨대, 암세포, 아일릿 등을 함유하는 매크로비드의 제조가 공지되어 있다[참조: 예를 들어, 개시 내용이 본 명세서에 포함되는, 미국 특허 제6,818,230호; 6,808,705호; RE 38,027호; 6,303,151호; 6,224,912호; 5,888,497호 및 5,643,569호, 및 공개된 미국 특허출원 제2005/0096561호].

이들 특허 문헌에서, 아가로스는 생물학적 물질을 캡슐화하는데 사용되고, 이후, 생성된 구조는 아가로스 제2 층으로 추가로 캡술화된다.

아가로스에 정통한 이들은 다양한 종류 및 변종의 상기 물질이 이용가능하다는 것을 인식할 것이다. 이러한 아가로스의 일종인 시켐 골드는 미국 특허 제4,983,268호 (문헌의 개시내용이 본 명세서에 포함됨)에 기재되어 있다. 상기한 특허 및 출원에 최초로 기재된 물질의 버전을 개선하는 것에 대한 요구가 계속되어 왔다. 본 발명에 이르러, 시켐 골드 아가로스를 사용함으로써 기존의 것보다 예상외로 우수한 생성물이 얻어진다는 것이 밝혀졌다.

본 발명의 상세한 사항을 이하에 설명한다.

도 1은 시험군 및 대조군 동물의 평균 일별 글루코스 수준에 대한 정보를 나타낸 것이다.

바람직한 실시태양의 상세한 설명

실시예 1

전체로서 본 명세서에 포함되는, 공개된 특허 출원 제2006/0121445호 (Gazda, et al., 2006년 6월 8일 공개, 일련번호 11/273,737)에 기재된 방법론에 따라 아일릿(islet)을 단리시켰다. 그러나, 본 발명은 특정 단리 방법에 의존하는 것이 아니므로, 아일릿을 단리시키기 위한 그 밖의 방법도 가능하며, 사용될 수 있다는 것을 염두에 두어야 한다.

단리 및 평가한 후, 적절한 췌장을 추가로 처리하였다. 선(gland)의 지방 및 결합조직을 제거하여 정리한 다음, 주 췌장관에 16g 스테인레스 강의 끝이 무딘 바늘을 사용하여 캐뉼러를 삽입하였다. 1.5 내지 2.0 g/l의 농도로 콜라게나제 P를 함유하는 HBSS 용액을 3O℃에서 50 ml/mm 속도로 관류시켜 췌장 무게의 그램 당 2 ml의 용액을 공급하였다.

그 다음, 췌장에 200 ml의 콜라게나제 용액과 함께 500 ml HBSS 및 2% PS을30℃에서 도포하였다. 물을 39℃로 외부 순환시켜 기관을 서서히 37℃로 가온하고, 소화산물(digestate) 온도를 36 내지 37℃로 유지시켰다. 기관이 해리된 것으로 나타나고, 수동 압력에 대해 거의 저항성을 나타내지 않을 때 (총 약 10 내지 20 분 후, 및 37℃에 도달한 후 5 내지 10 분), 소화가 중지되었다.

그 후, 합한 소화산물을 원심분리하여 상등액을 흡인하고, 생성된 펠렛을 10% PS 및 기관 보존용액 중에 현탁시켰다. 그 다음, 아일릿을 50 ml 튜브에서, 1.105, 1.095, 1.085 및 1.05 g/cm³의 밀도 구배, HBSS 플러스 2% PS로 불연속 피콜(Ficoll) 상에서 정제하였다. 튜브를 4℃에서 650 g으로 원심분리한 후, 아일릿 함유 층을 합하고, HBSS 플러스 10% PS로 3회 세척한 후, 해부 현미경을 이용하여 비-아일릿 조직이 없도록 수동으로 정제하였다. 아일릿을 재현탁시키고, 2개의 0.5 ml 샘플을 아일릿 수득량을 계산하는데 사용하였다.

시험된 10개의 췌장의 평균 수득량은 130,000 EIN이었고, 소화된 조직의 그램 당 평균 1,101 EIN이었다. 모든 경우에서 순도는 90% 초과이었다. 9개의 기관에 있어서, 아일릿 생존율(viability)은 89% 초과이었다.

실시예 2

아일릿의 단리에 이어서, 상기 언급한 바와 같이, 순도 및 생존율을 비롯한 다양한 파라미터를 측정하였다.

순도는 10분 동안 약 500 EIN을 DTZ로 염색시켜 평가하였고, 그 후 해부 현미경 및 디지털 카메라를 사용하여 표준 화상 분석을 수행하였다.

생존율은 샘플을 플루오레세인 디아세테이트 (FDA) 및 에티듐 브로마이드 (EB)로 염색시켜 측정하였다. 상세하게 설명하면, 약 500 EIN을 1 ml의 RPMl, 10% PS, 및 1% 항생제/항축동제 ("A/A")에 가하였다. 그 다음, 10 mg의 FDA 및 1 ml의 아세톤으로 만들어진 FDA 염료 20 ㎕, 및 30 ㎕의 EB 및 1 ml의 PBS로 만들어진 EB 200 ㎕를 가하였다. 아일릿을 어두운 곳에서 7분 동안 염색시킨 다음, 아일릿의 임의의 샘플 10 내지 50개를 형광 현미경으로 관찰하고 촬영하여, 표준 화상 분석을 이용하여 생존율을 판단하였다.

또한, 아일릿의 인슐린 함량은 약 500 EIN을 산성 알코올 추출 용액 (7.2 ml의 1N HCl, 400 ml의 100% 변성 에탄올)에 넣음으로써 측정하였다. 샘플을 -20℃에 저장하였으며, 인슐린 RIA를 수행하였다.

실시예 3

본 실시예를 비롯한 하기 실시예는 상기한 바와 같이 유용한 것으로 인정되고 단리된 아일릿이 매크로비드에 사용될 수 있는지 여부의 문제를 검토하는 것이다.

정제된 아일릿을 RPMI 1640 + 10% PS + 1% A/A 중에 2000 EIN/ml의 부피로 재현탁시켰다. 아일릿을 튜브에 고르게 분배하여, 각 튜브가 2000 EIN으로 1 ml의 현탁액을 함유하도록 하였다.

중력에 의해 침강시킨 후, 상등액을 제거하고, 50℃에서 2.5% HEPES 완충액이 더해진 최소 필수 매질에서 제조된 1.5%의 시켐 골드 아가로스 0.5 ml를 각 샘플에 가하고, 고르게 혼합하였다. 그 다음, 현탁액을 멸균 광유 아래로 방출시켜, 매끄러운 표면 및 동등한 아일릿 분포를 갖는 4개의 비드를 만들었다.

매크로비드를 회수하고, 2회 세척(RPMI + 5% PS + 1% A/A) 하였다. 이들 매크로비드를 습한 5% CO₂ 분위기 하에 5 내지 7일 동안 동일한 용액에서 배양시킨 후, 이들을 RPMI + 1% A/A로 3회 세척한 다음, 아가로스 제2 코트를 도포하였다. 이를 위해, 60℃에서 MEM 중 5% 아가로스 0.5 ml에 HEPES 완충액을 더한 것을 파이펫을 통해 멸균 플라스틱 스푼으로 옮기고, 각각의 매크로비드를 3 내지 5회 굴려 균일한 제2 아가로스 코팅을 형성하였다. 멸균 광유로 전달시켜 매끄러운 표면을 형성시킨 후, 매크로비드를 회수하여, RPMI + 2.5% PS + 1% A/A로 2회 세척하고, 공기가 더해진 습한 5% CO₂에서 37℃로 인큐베이션하였다. 물론, 비드를 제조하기 위한 다른 방법들이 사용될 수 있다.

캡술화된 아일릿을 함유하는 매크로비드는 6 개월 이상 동안 생존할 수 있는 것으로 판단되었으며, 그 기간에 걸쳐 양호한 수준의 인슐린을 계속 생성한다는 것이 방사선면역분석법을 통해 밝혀졌다.

실시예 4

본 실시예는 돼지(porcine) 아일릿이 생체내에서 기능할 수 있는지를 입증하는 시험에 대해 설명한다.

수컷이고 비만 당뇨병이 아닌, 7 내지 9주령의 CB17-PrKdc <scid>/J 마우스를 사용하였다. 1주일의 새 환경 순응 기간이 경과한 후에, 동물에 당뇨병을 유발하는 스트렙토조토신(streptozotocin) 275 mg/kg을 투여하였다. 9일 후, 이들의 혈중 글루코스 수준이 평균 480 mg/dl을 초과하였을 때, 인슐린 요법을 시작하였다.

스트렙토조토신 투여 후 34 내지 35일째 되는 날, 동물에 약 1000 EIN의 돼지 아일릿을 투여하였으며, 그것은 혈병에 이식되었다[참조: 본 명세서에 포함되는, Bo wen et al., Aust. J. Exp. Biol. Med. Sd. 58:441-447 (1980)]. 간단히 말해서, 아일릿을 현탁액으로부터 펠렛화하고, 매질을 흡인하였다. 그 다음, 약 5 내지 10 ㎕의 혈액을 동물로부터 채취하여, 아일릿에 가하고, 응괴가 되게 하였다. 수용체인 동물을 동일한 부피의 케타민 (167 mg/dl), 자일라진(xylazine) (33 mg/ml) 및 식염수로 마취시켰다. 혼합물을 0.5 ml/100 g의 용량으로 피하에 투여하였다. 왼쪽 옆구리를 작게 절개하여 신장을 노출시키고, 해부 현미경을 사용하여 신장의 피막을 작게 절개하였다. 그 다음, 피막을 신장으로부터 분리하고, 아일릿/응괴를 피막하에 넣은 후, 절개 부위를 봉합하여, 동물을 회복시켰다.

이식 후, 38 내지 39일 경과한 후에, 동물에 신장 적출술을 실시하였다. 간단히 말해서, 마취 후에 이식편-보유(graft-bearing) 신장을 노출시키고, 신장 혈관을 결찰하고, 각 동물의 신장을 제거하였다. 5일 후, 동물들을 안락사시키고, 완전한 아일릿 베타 세포 파괴의 조직학적 확인을 위해 췌장을 회수하였다.

조직 샘플을 10% 중성의 완충된 형성물 중에 24시간 동안 두고, 그 후 70% 에틸 알코올로 옮겼다.

그 후, 조직을 파라핀에 묻고, 5 μm 절편을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 췌장 및 이식된 신장 절편을 인슐린 및 글루카곤 함유 세포에 대해 표준 방법을 사용하여 염색시키고, 이를 연구하였다.

아일릿 이식 후에 모든 마우스들은 정상혈당이 되었다. 신장 적출 이후, 4일 이내에 마우스 모두 고혈당이 되었다.

실시예 5

본 실시예는 상이한 아가로스로 제조된, 아가로스-아가로스 코팅된 비드가 수용체인 동물에서 어느 정도 조직 반응, 즉, 염증을 유발하는지를 측정하기 위해 설계된 시험을 설명한다.

두 품종의 래트, 즉, 위스타(Wistar) 및 스프라귀 다우레이(Sprague Dawley) 래트를 사용하였다. 총 29마리의 래트로 시험하였다(위스타 14마리, 스프라귀 다우레이 15마리). 각 품종의 래트 3마리를 본 발명의 시켐 골드 아가로스-아가로스 코팅된 비드를 시험하는데 사용하였다. 각 품종의 래트 3마리를 아가로스 종류인 FMC HGT(P) 및 암레스코(Amresco)를 시험하는데 사용하였다. 2마리의 위스타 래트를 4마리의 스프라귀 다우레이 래트와 같이 시그마(Sigma) HV 아가로스를 시험하는데 사용하였다. 마지막으로, 3마리의 위스타 래트를 2마리의 스프라귀 다우레이 래트와 같이 시그마(Sigma) LV 아가로스 비드를 시험하는데 사용하였다.

총 60마리에 대해서는, 2마리를 제외하고는 각 종류의 빈 비드를 래트의 복강내에 이식하였다. 2마리의 스프라귀 다우레이 래트에 54 또는 59 시그마 HV 아가로스 비드를 이식하였다. 래트들을 3개월 동안 관찰한 다음, 안락사시켰다. 다양한 기관(비장, 간, 신장, 골격근, 췌장 및 장간막)을 회수하여 염증에 대해 연구하였다.

미국 수의 병리학회(American College of Veterinary Pathology)에 의해 승인된 표준법을 사용하여, 조직을 염증에 의해 평가하였다. 평가시에 본질적으로 다음과 같은 6개의 점수 척도를 사용하여 염증을 평가하였다.

0 = 정상

1 = 최소 (10% 미만 염증)

2 = 경증 (10 내지 25% 염증)

3 = 중등도 (25 내지 50% 염증)

4 = 현저함 (50 내지 75% 염증)

5 = 중증 (75% 초과 염증)

각 동물에 대한 조직을 평가한 후, 평균을 구하였다. 그 결과를 하기 표에 나타내었다.

조직에 대한 평균 중증도 점수

조직에 대한 평균 중증도 점수

각 품종에 대한 평균 중증도 점수의 총합

본 발명의 아가로스-아가로스 코팅된 비드가 명확하게 염증성이 가장 낮았다.

추가의 염증 연구를 개에 대해 수행하였으며, 이 연구에서 본 발명의 비드와 FMC HGT(P) 아가로스 (FMC HGTP 아가로스)로 제조하고 코팅한 비드를 비교하였다. 다시, 본 발명의 아가로스-아가로스 코팅된 비드가 보다 덜 염증성이었다.

추가 연구에서, 개에게 돼지 아일릿에 함유된, 본 발명의 아가로스-아가로스 코팅된 비드를 이식하였다. 2.5년 후, 동물을 안락사시켰으며, 최소의 염증만이 관찰되었다. 비-이식시킨 대조군 동물에 비해서, 복막 및 장간막이 현저하게 정상으로 보였다.

실시예 6

본 실험들에서는, 시험관 내에서 배양된 아일릿 함유 시켐 골드 아가로스 매크로비드를 대조군인 (빈) 매크로비드와 비교하였다.

시켐 아가로스에 캡슐화된 아일릿을 상기 실시예 3에서와 같이 제조하였다.

12마리 수컷의 자연발생 당뇨병 BB 래트를 동물 피험체로 사용하였다. 모든 동물은 10 내지 15주령이었고, 3 내지 16일 동안 당뇨병의 임상적 근거를 나타냈다.

도착 후 20 내지 21일째에, BB 래트에 케타민/자일라진/NaCl을 체중의 2.2 내지 2.3 ml/kg의 용량으로 피하에 투여하여 마취시켰다. 마취 후, 동물에 1일 인슐린 요구량 1.0배에 해당하는 용량으로 아일릿을 함유하는 매크로비드를 이식하거나 비교가능한 수의 빈 매크로비드를 이식하였다.

이식 후, 동물을 일반적인 조건 (양호, 보통 또는 불량), 체중, 혈중 글루코스, 뇨중 글루코스 및 뇨중 케톤을 비롯한 일별 기록되는 임상적 관찰과 함께 관찰하였다. 연구 전반에 걸쳐 혈청 샘플을 수집하여, 인슐린, 글루카곤 및 돼지 C 펩티드를 측정하는데 사용하였다. 방사선면역분석법을 사용하여 이들 파라미터를 결정하였다. 복강내 당부하 검사 또한 수행하였다.

이식 후 97일째에, 동물에 대해 완전한 부검을 실시하였다. 동물을 마취시킨 후, 피를 뽑고(exsanguinate), 복강을 노출시켰다.

97일간의 연구 전반에 걸쳐, 아일릿 함유 시켐 아가로스 비드를 이식한 6마리의 동물은 인슐린의 투여를 필요로 하지 않았다. 이는 빈 매크로비드를 이식한 동물과는 대조적이었다. 이들 동물은 혈중 글루코스 수준이 300 내지 500 mg/dl로 증가했기 때문에, 연구를 시작한 후 2일부터 외인성 인슐린을 투여하였다. 이들 대조군 동물 중 2마리는 연구 3일째에 죽어있었으며, 인슐린 결핍에 기인한 것으로 추정되었다.

평균 1일 혈중 글루코스 수준은 대조군에 비해서 아일릿 함유 시켐 아가로스 비드를 이식한 동물에서 현저히 낮았다. 또한, 6마리의 시험군 동물은 인슐린 요법 없이도, 매우 좁은 범위의 일별 혈중 글루코스 편차를 나타냈다.

한달 후, 아일릿을 투여받은 이들 동물은 중등도의 고혈당이 되었으나, 제한된 혈당 변동(glycemic excursions) (약 100 mg/dl)을 나타내었다. 이는 2 내지 3 U/일의 외인성 인슐린 투여에도 불구하고 약 400 내지 500 mg/dl의 극도의 변동을 나타내는 대조군과 대조적이다.

제1형 당뇨병의 임상 진단을 확인하기 위하여, 초기에 모든 동물에 대해 복강내 당부하 검사를 시행하였다. 이 검사는 또한 이식 후 8 및 90일에 시행하였다. 이식하기 5일 전, 글루코스 부하에 대한 반응은 분명히 나타나지 않았으나, 이식 후 8일째에 아일릿 함유 매크로비드의 수용체는 글루코스 부하, 즉, 혈중 글루코스의 초기 상승에 대해 현저한 반응을 나타낸 후, 정상혈당으로 돌아왔다. 고혈당증은 상기한 바와 같이 동시의 인슐린 요법에도 불구하고 빈 매크로비드를 이식한 동물에서는 마찬가지로 억제되지 않았다.

이식 후 90일째, 다른 복강내 당부하 검사를 수행하였다. 기저(baseline) 혈당은 아일릿 매크로비드를 이식한 래트에 대해 다시 회복되었으나, 출발 혈중 글루코스 수준은 상당히 더 높았다, 즉, 약 400 mg/dl이었다. 빈 매크로비드를 이식한 래트는 기저 혈당을 회복할 수 없었다.

이식 전 연구 동물에서 또는 빈 매크로비드 수용체로부터 돼지 C-펩티드에 대한 분석 결과, 펩티드가 검출되지 않았다. 이와 대조적으로, 아일릿 매크로비드를 이식한 래트의 혈청에서 펩티드는 이식 후 21일에 평균 수준의 0.880, 0.249 ng/ml에서 연구 종료시 0.662, 0.160 ng/dl로 통상적으로 검출되었다.

또한, 연구 동물에 대해 당뇨, 케톤뇨증, 및 중탄산염 투여에 대한 필요를 시험하였다. 이식 전엔 유의한 차이가 없었으나, 이식 후 아일릿 매크로비드 수용체는 당뇨 (56개 샘플 중 37개 대 81개 샘플 중 67개), 및 케톤뇨증 (64개 샘플 중 20개 대 54개 샘플 중 32개)의 에피소드를 유의하게 더 적게 겪었다. 중탄산염 요법에 대한 필요 또한 유의하게 감소하였다(2개 치료 대 26 개).

실시예 7

하기의 실험은 아일릿을 봉입한 시켐 아가로스 매크로비드가 시험관 내에서 장기간에 걸쳐 배양될 수 있고, 여전히 기능성이 있음을 증명한다.

이들 실험에서, 상기 실시예 6에서의 래트와 같이 동일한 기준을 충족하는 한 세트의 12마리 당뇨병 BB 래트를 23마리의 7 주령 위스타-퍼쓰 (Wistar-Furth) 래트와 같이 사용하였다. 이 제2 그룹의 래트는 정상 대조군으로 사용되었다.

5마리의 이들 위스타-퍼쓰 래트에 당뇨병을 유발하는 스트렙토조토신 65 mg/kg을 꼬리 정맥을 통해 주입하였다. 두 연속 혈중 글루코스 판독값 > 500 mg/dl이 관찰되었을 때, 하기한 바와 같이 래트에 인슐린 요법을 시작하였다.

도착 후 20 내지 21일째에, 동물에 0.1 ml/100g의 용량의 케타민(60 mg/ml)/ 자일라진(6 mg/ml)/ 부타페놀(3 mg/ml)을 사용하여 근육내에 투여하여 마취시켰다.

마취 후, 모든 BB 래트에 아일릿을 함유하는 시켐 아가로스 비드를 상기한 바와 같이 투여하였다. 래트를 4마리씩 세 그룹으로 나누고, 시험관 내에서 9주, 40주 또는 67주 동안 배양한 매크로비드를 투여하였다. 투여된 매크로비드의 양은 동물의 1일 인슐린 요구량에 1.O x에 해당한다.

5마리의 위스타-퍼쓰 래트에 시험관 내에서 7.8 내지 11.5주 동안 BB 래트에서와 같이 동일한 용량으로 배양한 매크로비드를 투여하였다. 이것은 위스타-퍼쓰 래트 당 약 45 내지 49개 매크로비드 및 BB 래트 당 56 내지 60개 매크로비드이다.

실험 전반에 걸쳐, 래트들은 평균하여 약 75g이 늘었다. 결과적으로, 첫번째 이식 후 97일째, BB 래트에 보충 이식을 수행하였다. 평균, 래트에 대한 이식전 인슐린 요구량은 체중의 0.0083 U 인슐린/g이었다. 이 수치는 24시간 당 39.19 mU의 인슐린을 생산하는데 추가의 17개 아일릿 함유 매크로비드가 필요하다는 계산을 이끈다. 이하에 설명된 바와 같이, 제2 이식 전에 각 래트로부터 4개의 비드를 제거하였기 때문에, 19주 동안 배양한 21개의 매크로비드를 투여하였다. 위스타-퍼쓰 래트에는 제2 이식을 수행하지 않았다.

실시예 7에서 수행되는 각종 분석은 동일한 방법을 사용하여 본 발명에서와 마찬가지로 수행하였다.

이식 후 201 내지 202일째, 상기한 바와 같이 완전한 부검을 수행하였다.

평균 일별 혈중 글루코스 수준을 도 1에 나타내었다. 이식 후, 모든 BB 래트에서 정상혈당 (100 내지 200 mg/dl)이 약 1달 동안 회복되었다. 그 후, BB 래트에서 중등도 고혈당증 (200 내지 400 mg/dl)이 발병하였으며, 이는 남은 연구 기간 내내 지속되었다. 중등도 고혈당증의 발병과 최대 체중의 달성이 동시에 일어났다. 남은 연구 기간 내내 혈중 글루코스 수준이 300 내지 400 mg/dl 사이에서 오르내리면서 체중은 일정하게 유지되었다. 비드의 시험관 내 배양 기간의 길이와 무관하게, 아일릿 함유 시켐 골드 매크로비드를 투여한 세 그룹의 래트 사이에서 평균 1일 혈중 글루코스 수준에 있어서 아무런 차이도 관찰되지 않았다.

당뇨병이 유발된 위스타-퍼쓰 래트 또한 약 1달 동안 정상혈당을 나타내었으며, 그 후 중등도 고혈당증이 관찰되었다.

상기한 바와 같이 97일째 BB 래트에 제2 이식을 수행하여 연구하였다. 이 제2 이식은 1일 혈중 글루코스 수치에 강한 영향을 주지 않았다.

돼지 C 펩티드 또한 분석하였으며, 모든 3 그룹의 BB 래트에서 검출되었다. 실험의 처음 88일 동안, 평균 돼지 C 펩티드 수준은 0.6 내지 0.9 ng/ml에서 0.2 내지 0.4 ng/ml로 감소하였다. 116일째, 제2 이식 후, 펩티드 수준은 평균 0.3 내지 0.7 ng/ml로 증가하였고, 이는 부검시 복수에서 관찰된 것의 40 배 증가이다.

글루코스 부하 절차는 아일릿 매크로비드 이식을 받은 모든 래트에 대해 연구 기간 전반에 걸쳐 수행하였다. 이식 후 글루코스 부하에 대한 반응에 대해, 상이한 기간에 걸쳐 배양한 매크로비드의 능력에 있어서 아무런 차이도 관찰되지 않았다. 상세하게 설명하면, 모든 BB 래트의 혈중 글루코스 수준은 초기 수치 100 내지 200 mg/dl로부터 약 두배이다. 12마리의 동물 중 10마리는 120 분 내에 발생한 기저 혈당으로 되돌아갔다. 이 반응은 정상 위스타-퍼쓰 동물에서 관찰된 것과 유사하다.

모든 연구 동물은 결국 중등도 고혈당이 되었으나, 105일째 이식 후에 글루코스 부하는 혈중 글루코스에서 초기 상승을 나타낸 다음, 기저 혈당으로 돌아갔다. 200일째, 이식 후, 글루코스 투여 후 기저 혈당이 약간 증가한 다음, 기저 혈당으로 되돌아 왔다.

상기 이식에 있어서, 자인(Jain) 등의 연구와 비교할 때, 이들 연구에서 결과는, 아가로스가 시켐 골드인, 아일릿을 함유하는 아가로스 비드가 자인(Jain) 등에 의해 보고된 것보다 예상 밖으로 보다 우수하다는 것을 보여준다. 예를 들어, 자인(Jain) 등의 보고에서 200일까지 40%의 동물 피험체가 사망한 반면, 본 발명의 매크로비드를 투여한 래트의 사망률은 0이었다. 또한, 본 발명에서 달성된 결과는 자인(Jain) 등에 의해 보고된 매크로비드의 반을 사용하여 달성되었다. 또한, 본 명세서에 상세하게 설명되지 않은 결과에서, 부검 후 회수된 매크로비드의 인슐린 생산 수준을 측정하였고, 이는 자인(Jain) 등에 의해 보고된, 부검 후 회수된 매크로비드의 것보다 실질적으로 높았다.

실시예 8

본 발명의 비드의 강도를 FMC HGT(P) 아가로스로 제조 및 코팅된 비드의 것과 비교하기 위한 실험을 수행하였다.

이들 시험에서, 비드를 상부판 및 하부판을 갖는 압축기 내에 개별적으로 두었다. 상부판을 분당 12인치의 속도로 끌어내리고, 비드가 파열될 때까지 비드를 압축시켰다. 압축력 (최대 압축력)을 lbf 단위로 측정하였다.

HGT(P)에 대해, 최대 압축력은 0.714 lbf 내지 3.183 lbf 범위였으며, 평균 1.958 및 표준 편차 0.5444이었다. 본 발명의 제품에 있어서, 압축력 범위는 2.322 lbf 내지 6.418 lbf이었으며, 평균 4.282 및 표준 편차 1.096이었다.

분명히, 본 발명의 비드가 다른 아가로스-아가로스 코팅된 비드보다 더 강했다.

앞서 말한 실시예는 사용된 아가로스가 시켐 골드 아가로스인, 아가로스로 코팅된 분비 세포-함유 아가로스 매크로비드와 관련하여 본 발명의 다양한 특징을 기술하고 있다.

본 명세서에 기재된 것으로서, 용어 "매크로비드"는 직경이 약 4 내지 약 10-12 mm, 가장 바람직하게는 약 6 내지 약 8 mm인, 본질적으로 구형인 구조를 지칭한다. 제2 아가로스 층은 바람직하게는 두께가 약 0.05 내지 약 5 mm이고, 보다 바람직하게는 두께가 약 0.5 mm 내지 약 5 mm이며, 보다 더 바람직하게는 약 1.0 내지 약 3 mm, 가장 바람직하게는 두께가 약 1.0 내지 약 2.0 mm이다. 제2 아가로스 층은 시켐 골드 아가로스일 수 있으나, 반드시 그럴 필요는 없다.

"매크로비드"가 바람직한 구조로서 사용되나, 분비 세포를 캡슐화하고, 제2 아가로스 층으로 바람직하게 코팅된 임의의 고형 아가로스 구조도 본 발명의 특징이다.

분비 세포는 다양할 수 있다. 바람직한 분비 생성물을 산출하는 임의의 세포 또는 소기관이 캡슐화될 수 있다. 아일릿, 암세포 및 줄기세포가 이와 같이 사용될 수 있는 물질의 대표적인 종류이다. 각각의 비드는 다양한 수의 세포소기관, 아일릿에 대해, 예를 들어, 약 50 내지 약 5000개의 아일릿, 보다 바람직하게는 약 100 내지 약 2500개의 아일릿, 보다 더 바람직하게는 약 250 내지 약 1000개, 가장 바람직하게는 475 내지 약 550개의 아일릿을 함유할 수 있다. 약 500개의 아일릿이 특히 바람직하다.

본 발명의 다른 측면이 당업자에게 분명할 것이며, 추가로 상술할 필요가 없다.

본 명세서에 사용된 용어 및 표현은 본 발명을 제한하는 것이 아닌, 설명하기 위하여 사용된 것이며, 본 명세서에 나타내거나 기술한 특징들의 임의의 균등물 또는 그들의 일부를 배제시키는 용어 및 표현으로 사용하려는 의도가 없으며, 다양한 변형들도 본 발명의 범주내에 속할 수 있는 것으로 인정된다.

Claims

(a) 술페이트 함량이 0 초과 0.2 wt% 미만이고, 피루베이트 함량이 0-0.1 wt%이고, 킬달(Kjeldahl) 질소 함량이 0-0.04 wt%이며, 겔 강도(1.0 wt% 농도)가 1200 g/cm² 이상인 겔을 형성하고, 0.07 M 이하의 트리스 아세테이트 완충액 중에서 DNA와 실질적으로 결합하지 않으며, 1.0 wt% 아가로스 농도에서 0.05 이하의 전기삼투압(electroendosmosis)을 보이는 시켐 골드 아가로스 중에 분비 세포를 현탁시키는 단계,

(b) 단계 (a)의 상기 현탁된 분비 세포로부터 비드를 형성시키는 단계,

(c) 단계 (b)의 상기 비드를 습한 공기 중에서 인큐베이션하는 단계,

(d) 단계 (c)의 상기 비드를 아가로스로 코팅하여 아가로스 코팅된 시켐 골드 아가로스 분비 세포 비드를 형성시키는 단계

를 포함하는, 아가로스 코팅된 시켐 골드 아가로스 분비 세포 비드의 제조 방법.
제1항에 있어서, 단계 (c)의 상기 비드를 5% 아가로스 중에서 굴리고, 상기 굴린 비드를 광유와 접촉시키고, 상기 굴린 비드를 세척하여 상기 아가로스 코팅된 시켐 골드 아가로스 분비 세포 매크로비드를 형성시키는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 분비 세포가 아일릿(islet)인 제조 방법.
제3항에 있어서, 상기 아일릿이 인간 아일릿인 제조 방법.
제3항에 있어서, 상기 아일릿이 소(bovine) 아일릿인 제조 방법.
제3항에 있어서, 상기 아일릿이 돼지(porcine) 아일릿인 제조 방법.
제3항에 있어서, 상기 비드가 50 내지 5000개의 아일릿을 함유하는 것인 제조 방법.
제3항에 있어서, 상기 비드가 100 내지 2500개의 아일릿을 함유하는 것인 제조 방법.
제3항에 있어서, 상기 비드가 475 내지 550개의 아일릿을 함유하는 것인 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 비드가 직경 4 mm 내지 12 mm의 매크로비드인 제조 방법.
제10항에 있어서, 상기 매크로비드의 직경이 4 mm 내지 10 mm인 제조 방법.
제10항에 있어서, 상기 매크로비드의 직경이 4 mm 내지 8 mm인 제조 방법.
제10항에 있어서, 상기 매크로비드의 직경이 6 mm 내지 8 mm인 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 비드를 0.05 mm 내지 5.0 mm의 아가로스 층으로 코팅하는 단계를 포함하는 제조 방법.
제14항에 있어서, 상기 비드를 1.0 mm 내지 3.0 mm의 아가로스 층으로 코팅하는 단계를 포함하는 제조 방법.
제14항에 있어서, 상기 비드를 1.00 mm 내지 2.0 mm의 아가로스 층으로 코팅하는 단계를 포함하는 제조 방법.
아가로스 코팅된 아가로스 분비 세포 비드로서,

상기 아가로스 분비 세포 비드의 아가로스가 술페이트 함량이 0 초과 0.2 wt% 미만이고, 피루베이트 함량이 0-0.1 wt%이고, 킬달(Kjeldahl) 질소 함량이 0-0.04 wt%이며, 겔 강도(1.0 wt% 농도)가 1200 g/cm² 이상인 겔을 형성하고, 0.07 M 이하의 트리스 아세테이트 완충액 중에서 DNA와 실질적으로 결합하지 않으며, 1.0 wt% 아가로스 농도에서 0.05 이하의 전기삼투압(electroendosmosis)을 보이는 시켐 골드 아가로스인, 아가로스 코팅된 시켐 골드 아가로스 분비 세포 비드.
제17항에 있어서, 상기 비드가 아일릿을 함유하는 것인, 아가로스 코팅된 시켐 골드 아가로스 분비 세포 비드.
제18항에 있어서, 상기 아일릿이 인간 아일릿인, 아가로스 코팅된 시켐 골드 아가로스 분비 세포 비드.
제18항에 있어서, 상기 아일릿이 소 아일릿인, 아가로스 코팅된 시켐 골드 아가로스 분비 세포 비드.
제18항에 있어서, 상기 아일릿이 돼지 아일릿인, 아가로스 코팅된 시켐 골드 아가로스 분비 세포 비드.
제18항에 있어서, 50 내지 5000개의 아일릿을 함유하는, 아가로스 코팅된 시켐 골드 아가로스 분비 세포 비드.
제18항에 있어서, 100 내지 2500개의 아일릿을 함유하는, 아가로스 코팅된 시켐 골드 아가로스 분비 세포 비드.
제18항에 있어서, 475 내지 550개의 아일릿을 함유하는, 아가로스 코팅된 시켐 골드 아가로스 분비 세포 비드.
제18항에 있어서, 직경이 4 mm 내지 12 mm인, 아가로스 코팅된 시켐 골드 아가로스 분비 세포 비드.
제18항에 있어서, 직경이 4 mm 내지 10 mm인, 아가로스 코팅된 시켐 골드 아가로스 분비 세포 비드.
제18항에 있어서, 직경이 4 mm 내지 8 mm인, 아가로스 코팅된 시켐 골드 아가로스 분비 세포 비드.
제18항에 있어서, 직경이 6 mm 내지 8 mm인, 아가로스 코팅된 시켐 골드 아가로스 분비 세포 비드.
제17항에 있어서, 상기 비드가 0.05 mm 내지 5.0 mm의 아가로스 층으로 코팅된 것인, 아가로스 코팅된 시켐 골드 아가로스 분비 세포 비드.
제17항에 있어서, 상기 비드가 1.0 mm 내지 3.0 mm의 아가로스 층으로 코팅된 것인, 아가로스 코팅된 시켐 골드 아가로스 분비 세포 비드.
제17항에 있어서, 상기 비드가 1.0 mm 내지 2.0 mm의 아가로스 층으로 코팅된 것인, 아가로스 코팅된 시켐 골드 아가로스 분비 세포 비드.
제17항의 아가로스 코팅된 시켐 골드 아가로스 분비 세포 비드를 포함하는, 분비 세포의 기능 부전으로 인한 질병을 갖는 개체를 치료하기 위한 치료제.
제32항에 있어서, 상기 질병이 인슐린 의존성 당뇨병인 치료제.
제32항에 있어서, 상기 비드가 아일릿을 함유하는 것인 치료제.
제34항에 있어서, 상기 아일릿이 인간 아일릿인 치료제.
제34항에 있어서, 상기 아일릿이 돼지 아일릿인 치료제.
제34항에 있어서, 상기 아일릿이 소 아일릿인 치료제.
제32항에 있어서, 상기 비드가 상기 개체의 복강내에 위치되는 것인 치료제.