NO341154B1 - Agarosebelagt, agarosesekretorisk cellekule, samt fremstilling og anvendelse derav - Google Patents

Description

OPPFINNELSESOMRÅDE

Oppfinnelsen vedrører agarosebelagt, agarosesekretorisk cellekule, samt fremstilling og anvendelse derav.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Det er nå fastslått at øycelle-erstatningsterapi er en mulig tilnærming til behandling av pasienter med forskjellige lidelser. Disse omfatter cancerpasienter som gjennomgår abdominal eksenterasjon" (Tzakis et al., Lancet 336:402-405

(1990)); pankreatitt (Clayton et al., Transplantation 76:92-98 (2003); Farney, et al., Surgery 110:427-437 (1991); Fontes, et al., Transplant Proe 24:2809 (1992); Obenholzer, et al., Transplantation 69:1115-1123 (2000); Robertson, et al., Diabetes 50:47-50 (2001)), og insulin-avhengige pasienter, hvor øycelletransplantasjon er en terapeutisk mulighet (Goss, et al., Transplantation 74:1761-1766 (2002); Ricordi, et al., Transplantation 75:1524-1527 (2003); Ryan, et al., Diabetes 50:710-719 (2001); Shapiro, et al., N. Engl. J. Med. 343:230-238 (2000)).

Som følge av anvendeligheten av øyceller innen terapien slik som antydet ovenfor, er det selvsagt av interesse å utvikle metoder for å isolere disse. Selv om det finnes mange rapporter angående isolering av øyceller ved å benytte den automatiserte metode (Brandhorst, et al., Exp. Clin. Endochnol Diabetes 103 Suppl. 2:3-14 (1995); Cui, et al., Cell Transplant 6:48-54 (2001); Marchetti, et al., Transplantation 52:209-213 (1991); Miyamoto, et al., Cell Transplant 7:397-402

(1998); Nielsen, et al., Comp. Med., 52:127-135 (2002); Swanson, et al., Hum. Immunol 62:739-749 (2001); Toomey, et al., Brit. J. Surg. 80:240-243 (1993); Toso, et al., Cell Transplant 9:297-305 (2000); Wennberg, et al., Transplant. Proe. 33:2537 (2001)) er isolering av øyceller fortsatt ansett åpenbart vanskelig. For eksempel diskuterer Bosta, et al., J. Investig Med. 43:555-566 (1995); Krickhahn, et al., Cell Transplant 11:827-838 (2002); Krickhahn, et al., Ann Transplant 6:48-54 (2001); 0'Neil, et al., Cell Transplant 10:235-246 (2001) og White, et al., Horm. Metab. Res. 31:579-524 (1999) alle problemer med hensyn til dette.

RE 380 27 beskriver kuler som er fremstilt fra agarose, eller agarose og kollagen, inneholdende levende celler og som er belagt med agarose. Det beskrives ikke agarose med egenskapene til agarosen heri. US 20050147594 beskriver semi-permeable mikrokapsler fremstilt fra materialer som ikke har noen felles egenskaper med materialet ifølge oppfinnelsen. US 4,983,268 beskriver agarose som blir anvendt i oppfinnelsen, men for elektroforeseformål istedenfor inkapsling av celler.

Fremstillingen av makrokuler som inneholder sekretoriske celler og/eller organeller, så som cancerceller, øyceller og lignende, er velkjent. Se f.eks. US-patent 6.818.230; 6.808.705; RE 38.027; 6.303.151; 6.224.912; 5.888.497 og 5.643.569; så vel som publisert US-patentsøknad 2005/0096561.

Agarose benyttes til å innkapsle de biologiske materialene i henhold til disse patentdokumentene, hvoretter de resulterende strukturer ytterligere innkapsles med et andre lag av agarose. Den som er kjent med agarose vil være klar over at mange typer og varianter av dette materialet er tilgjengelig. Seakem Gold, en slik agarosetype, er beskrevet i US-patent 4.983.268. Det er stadig behov for forbedrede versjoner av de materialer som først er beskrevet i de patenter og søknader som er angitt ovenfor. Det har nå vist seg at Seakem Gold agarose resulterer i et produkt som er uventet overlegent i forhold til tidligere kjente produkter.

Detaljer angående oppfinnelsen er angitt i den etterfølgende beskrivelse: Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for fremstilling av en agarosebelagt, agarosesekrtorisk cellekule, idet den omfatter: (a) suspendering av sekretoriske celler i en første agarose, idet nevnte første agarose har et sulfatinnhold på mindre enn 0,2 vekt%, men høyere enn 0, et pyruvatinnhold på 0-0,1 vekt%, et nitrogeninnhold på 0-0,2 vekt%, og danner en gel som har en gelstyrke ved 1,0 vekt% konsentrasjon på minst 1200 g/cm<2>, vesentlig fravær av DNA binding i 0,7 M eller mindre tris acetatbuffer og en elektroendosmose med 1,0 vekt% konsentrasjon på 0,05

eller mindre.

(b) utforming av en kule fra nevnte suspenderte sekretoriske celler ifølge trinn

(a),

(c) inkubering av nevnte kule ifølge trinn (b) i fuktig luft, og (d) belegging av nevnte kule ifølge trinn (c) med en andre agarose, for å danne et agarosebelegg, agarosesekretorisk cellekule.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre agarosebelagt, agarosesekretorisk cellekule, idet agarosen til agarosesekretorisk cellekule har et sulfatinnhold på mindre enn 0,2 vekt% men høyere enn 0, et pyrovatinnhold på 0-0,1 vekt%, et nitrogeninnhold på 0-0,2 vekt% og danner en gel som har en gelstyrke ved 1,0 vekt% konsentrasjon på minst en 1200 g/cm<2>, vesentlig i fravær av DNA binding i 0,7 mm eller mindre tris acetatbuffer og en elektroendosmose ved 1,0 vekt% konsentrasjon på 0,05 eller mindre.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse av agarosebelagte, agarosekretoriske cellekuler ifølge krav 8, for fremstilling av et medikament for behandling av en tilstand forårsaket av svekket funksjon til sekretoriske celler.

KORT BESKRIVELSE AV FIGUREN

Figur 1 angir informasjon angående gjennomsnittlige daglige glukosenivåer i test- og kontrolldyr.

DETALJERT BESKRIVELSE AV FORETRUKNE UTFØRELSESFORMER

EKSEMPEL 1

Øyceller ble isolert i henhold til metodikken angitt i Gazda, et al., publisert patentsøknad 2006/0121445, publisert 8. juni, 2006, serie nr. 11/273.737. Det skal imidlertid bemerkes at andre metodikker for isolering av øyceller er mulige og kan benyttes, idet oppfinnelsen ikke er avhengig av den bestemte isoleringsmetoden.

Etter isoleringen og evaluering ble egnede pankreas bearbeidet videre. Kjertlene ble befridd for fett og bindevev og hovedkanalen i pankreas kanylert med en 16 g, rustfri stålnål med butt ende. En løsning av HBSS-holdig kollagenase P, i en konsentrasjon på 1,5-2,0 g/L ble perfundert med en hastighet på 50 mL/mm ved 30°C for å gi 2 mL løsning per gram av pankreasvekten.

Pankreas ble deretter dekket med 500 mL HBSS og 2% PS, sammen med 200 mL kollagenaseløsning, ved 30°C. Ekstern sirkulasjon av 39°C vann opp-varmet organet langsomt til 37°C og holdt oppslutningstemperaturen på 36-37°C. Når organene syntes dissosiert og bød på liten motstand mot manuelt trykk (etter ca. 10-20 minutter totaltid og 5-10 minutter etter å ha nådd 37°C), ble opp-slutningen stanset.

Oppsamlet digestat ble deretter sentrifugert, supernatanten suget av og den resulterende pellet suspendert i 10% PS og en organkonserverende løsning.

Øyceller ble deretter renset på diskontinuerlig Ficoll ved tetthetsgradienter på 1,105, 1,095, 1,085 og 1,05 g/cm<3>, HBSS pluss 2% PS i 50 mL rør. Rør ble sentrifugert ved 650 g ved 4°C, og øycelle-holdige lag ble oppsamlet og vasket tre ganger i HBSS pluss 10% PS, hvorpå de manuelt ble renset for ikke-øycellevev ved hjelp av et disseksjonsmikroskop. Øycellene ble resuspendert og to 0,5 mL prøver ble benyttet for telling av øycelle utbytte.

Det gjennomsnittlige utbytte av ti testede pankreas var 130.000 EIN, med et middel på 1.101 EIN per gram oppsluttet vev. Renheten var i alle tilfellene over 90%. For 9 av organene var øycelle-viabiliteten større enn 89%.

EKSEMPEL 2

Etter isoleringen av øycellene ble forskjellige parametere inklusivt renhet og viabilitet, bestemt som nevnt ovenfor.

Renhet ble bestemt ved farging av ca. 500 EIN med DTZ i 10 minutter, hvorpå standard avbildningsanalyse ble foretatt ved bruk av et disseksjonsmikroskop og et digitalkamera.

Viabilitet ble bestemt ved farging av en prøve med fluorescein-diacetat og etidiumbromid (EB). Mer utføring ble ca. 500 EIN tilsatt til 1 mL RPMI, 10% PS og 1 % antibiotikum/antimyotikum ("A/A"). Deretter ble 20 nL FDA-farge som var blitt fremstilt med 10 mg FDA og 1 mL aceton, og 200 nL EB som var fremstilt med 30 nL EB og 1 mL PBS tilsatt. Øyceller ble farget, i mørke, i 7 minutter og tilfeldige prøver av 10-50 øyceller betraktet med et fluorescensmikroskop og fotografert, for å bestemme viabilitet, ved bruk av standard avbildningsanalyse.

Insulininnholdet i øycellene ble også målt ved å anbringe ca. 500 EIN i sur alkoholekstraksjonsløsning (7,2 mL 1N HCI, 400 mL 100% denaturert etanol). Prøver ble oppbevart ved -20°C og en insulin RIA ble foretatt.

EKSEMPEL 3

Dette og de etterfølgende eksempler tar opp spørsmålet om hvorvidt øyceller identifisert som egnede og isolert som beskrevet, kan benyttes i makrokuler.

Rensede øyceller ble resuspendert i RPMI 1640 + 10% PS + 1% A/A, til et volum på 2000 EIN/mL. Øycellene ble jevnt fordelt på rør, slik at hvert rør inneholdt 1 mL suspensjon på 2000 EIN. Etter sedimentering ved tyngdekraft ble supernatanter tatt ut og 0,5 mL 1,5% Seakem Gold agarose, ved 50°C, tilberedt i minimalt essensielt medium pluss 2,5% HEPES buffer, ble tilsatt til hver prøve og homogenisert. Suspensjonen ble deretter støtt ut under steril mineralolje for å danne fire kuler med glatte overflater og lik øycellefordeling. Makrokuler ble tatt ut og vasket to ganger (RPMI + 5% PS + 1% A/A). Disse makrokulene ble dyrket i den samme løsningen i fuktet 5% CO2atmosfære i 5-7 dager, hvorpå de ble vasket tre ganger i RPMI + 1% A/A etterfulgt av påføring av et andre agarosebelegg. For dette ble 0,5 mL 5% agarose i MEM, pluss HEPES buffer ved 60°C overført med pipette til en steril plastskje, og hver makrokule ble rullet 3-5 ganger for å produsere et jevnt, andre agarosebelegg. Etter overføring til steril mineralolje for å bevirke en glatt overflate, ble makrokulene uttatt, vasket to ganger i RPMI + 2,5% PS + 1% A/A og inkubert ved 37°C i fuktet 5% C02pluss luft. Andre metoder for fremstilling av kulene kan selvsagt benyttes.

Makrokulene inneholdende innkapslede øyceller, ble fastslått å være levedyktige i mer enn 6 måneder, et tidsrom over hvilket radioimmunoassay viste at de forsetter å produsere bra insulinnivåer.

EKSEMPEL 4

Dette eksempel beskriver forsøk som demonstrerer den evne svine-øyceller har til funksjon in vivo.

Ikke overvektige diabetiske CB17-PrKdc<scid>/J hannmus, 7-9 uker gamle, ble benyttet. Etter 1 ukes akklimatisering fikk dyrene 275 mg/kg streptozotocin, som induserer diabetes. 9 dager senere, idet blodglukosenivåer i gjennomsnitt utgjorde 480 mg/dL, ble de satt på en insulinterapi.

På dag 34-35 etter administrering av streptozotocin fikk dyrene ca. 100 EIN svine-øyceller som ble transplantert i en blodkoagel i henhold til Bowen et al., Aust. J. Exp. Biol. Med. Sei., 58:441-447 (1980). I korte trekk ble øyceller sentrifugert fra suspensjonen og mediet suget av. Deretter ble ca. 5-10 nL blod tatt fra dyret, tilsatt til øycellene og gitt anledning til koagulering. Mottakerdyret ble anestetisert med like volumer ketamin (167 mg/dL), xylazin (33 mg/mL) og saltvann. Blandingen ble administrert subkutant i en dose på 0,5 mL/100 g. Et lite snitt ble foretatt i venstre flanke for å eksponere nyren, og et disseksjonsmikroskop ble benyttet for å gjøre et lite snitt i nyrekapselen. Kapselen ble deretter skilt fra nyren, øycellene/koagelen anbrakt under kapselen, snittet lukket og dyrene gitt anledning til restituering.

Nefrektomier ble foretatt på dyrene 38-39 dager etter transplanteringen. I korte trekk ble den transplantatbærende nyre eksponert, etter anestesi, nyre-blodkar ble ligert og nyren fra hvert dyr fjernet. 5 dager senere ble dyrene avlivet og pankreas uttatt for histologisk bekreftelse av fullstendig beta-øycelledestruksjon.

Vevsprøver ble anbrakt i 10% nøytralbufret formiat-ion (formation) i 24 timer og deretter overført til 70% etylalkohol.

Etter dette ble vevene innleiret i parafin og 50 nm snitt ble farget med hematoxylin og eosin. Pankreas og transplanterte nyresnitt ble farget for insulin og glukagon-holdige celler ved å benytte standardmetoder, og ble deretter studert.

Alle musene ble normoglykemiske etter øycelletransplantasjon. Etter nefrektomi ble alle musene hyperglykemiske i løpet av 4 dager.

EKSEMPEL 5

Dette eksempel beskriver forsøk som ble lagt opp for å bestemme i hvilken grad agarose-agarosebelagte kuler, fremstilt av ulike agaroser, bevirket vevs-reaksjon, dvs. inflammasjon i mottakerdyr.

To rottestammer, dvs. Wistar og Sprague Dawley rotter ble benyttet. Totalt ble 29 rotter testet (14 Wistar, 15 Sprague Dawley). Tre rotter av hver stamme ble benyttet for å teste Seakem Gold agarose-agarose belagte kuler ifølge oppfinnelsen. Tre av hver stamme ble benyttet til å teste agarosetypene FMC HGT(P) og Amresco. To Wistar rotter ble benyttet for å teste Sigma HV agarose, i likhet med fire Sprague Dawley rotter. Endelig ble tre Wistar rotter benyttet til å teste Sigma LV agarosekuler, i likhet med to Sprague Dawley rotter.

Totalt 60 tomme kuler av hver type ble implantert i de peritoneale hulrom i rottene, med to unntak. To Sprague Dawley rotter fikk enten 54 eller 59 Sigma HV agarosekuler. Rottene ble observert i 3 måneder og deretter avlivet. Forskjellige organer ble uttatt for å studere inflammasjon (milt, lever, nyre, skjelettmuskulatur, pankreas og mesenterium).

Vev ble vurdert med henblikk på inflammasjon ved å benytte standarder godkjent av American College of Veterinary Pathology. Evalueringen benyttet en 6-punkts skala for å evaluere inflammasjon, i det vesentlige som følger:

0 = normal

1 = minimal (mindre enn 10% inflammasjon)

2 = mild (10-25% inflammasjon)

3 = moderat (25-50% inflammasjon)

4 = markant (50-75% inflammasjon)

5 = alvorlig (mer enn 75% inflammasjon)

Vevene fra hvert dyr ble evaluert og deretter gjennomsnittsberegnet. Resultatene er vist nedenfor:

De agarose-agarose belagte kulene ifølge oppfinnelsen var klart de minst inflammatoriske.

Ytterligere inflammasjonsstudier ble foretatt på hunder ved å sammenligne kulene ifølge oppfinnelsen med kuler fremstilt av FMC HGT(P) agarose (FMC HGTP agarose), og belagt med denne. Igjen var agarose-agarose belagte kuler ifølge oppfinnelsen mindre inflammatoriske.

I en ytterligere studie fikk hunder agarose-agarose belagte kuler ifølge oppfinnelsen og som inneholdt øyceller fra svin. Dyrene ble avlivet etter 2,5 år og det ble bare observert minimal inflammasjon. Sammenlignet med ikke implanterte kontrolldyr viste peritoneum og mesenterium bemerkelsesverdig normalt utseende.

EKSEMPEL 6

I disse forsøkene ble øyceller inneholdende Seakem Gold agarose-makrokuler som var dyrket in vitro, sammenlignet med kontroll (tomme) makrokuler.

Øyceller innkapslet i Seakem agarose ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 3 ovenfor. 12 spontant diabetiske BB hannrotter ble benyttet som forsøksdyr. Alle dyrene var 10-15 uker gamle og hadde vist indikasjon på klinisk diabetes i 3-16 dager.

20-21 dager etter ankomst ble BB-rottene anestetisert med ketamin/xylazin/NaCI, administrert subkutant, i en dose på 2,2-2,3 mL/kg kroppsvekt. Etter anestetisering fikk dyrene enten et implantat av makrokuler inneholdende øyceller i en dose tilsvarende 1,0 ganger det daglige insulinbehov, eller et sammenlignbart antall tomme makrokuler.

Etter implantering ble dyrene observert, hvorunder klinisk observasjon ble registrert daglig, herunder generell tilstand (god, middels eller dårlig), kroppsvekt, blodglukose, uringlukose og ketonuri. Serumprøver ble oppsamlet i løpet av studien for å benyttes til bestemmelse av insulin, glukagon og svine C-peptid. Radioimmunoassays ble benyttet for å måle disse parametere. Intraperitoneale glukosetoleransetester ble også foretatt. 97 dager etter implantering ble det foretatt en fullstendig disseksjon av dyrene. Dyrene ble anestetisert og utblødd og peritonealkaviteter eksponert.

I løpet av denne 97 dagers studieperioden fordret de 6 dyr som hadde fått Seakem agarosekuler inneholdende øyceller ikke administrering av insulin. Dette til forskjell fra dyr som fikk tomme makrokuler. Disse dyrene ble administrert eksogent insulin med start 2 dager etter påbegynt studium fordi blodglukosenivåene steg til 300-500 mg/dL. To av disse kontrolldyrene ble funnet døde på studiens tredje dag, antagelig som følge av insulinmangel.

Gjennomsnittlige daglige blodglukosenivåer var signifikant lavere hos de dyr som fikk Seakem agarosekuler inneholdende øyceller, sammenlignet med kontrollene. De 6 dyrene oppviste også et meget snevert område av avvik i daglig blodglukose selv uten insulinterapi.

Etter 1 måned ble disse dyrene som hadde fått øyceller moderat hyperglykemiske, men oppviste begrensede glykemiske svingninger (ca. 100 mg/dL). Dette til forskjell fra kontrollene som oppviste ekstrem variasjon på ca. 400-

500 mg/dL til tross for administrering av 2-3 U/dag eksogent insulin.

Innledningsvis ble det foretatt intraperitoneale glukosetoleransetester på alle dyr for å bekrefte den kliniske diagnose type I diabetes. Denne test ble også foretatt 8 og 90 dager etter transplantasjoner. 5 dager før transplantering var respons på glukoseutfordring ikke åpenbar, men på den 8. dag etter implantering oppviste mottakere av makrokuler inneholdende øyceller en markert respons på glukoseutfordring, dvs. en initial økning i blodglukose, etterfulgt av retur til normoglykemi. Hyperglykemi ble ikke inhibert, heller ikke hos dyr som hadde fått de tomme makrokulene, på tross av samtidig insulinbehandling som beskrevet ovenfor. 90 dager etter implantering ble det foretatt en annen intraperitoneal glukose-toleransetest. Glykemi-basislinjen ble igjen etablert for rotter som hadde fått øycelle-makrokulene, men utgangsnivåene for blodglukose var betydelig høyere, dvs. ca. 400 mg/dL. Rotter som hadde fått tomme makrokuler kunne ikke gjenopprette basal glykemi.

Testene for C-peptid fra svin påviste ikke peptidet i forsøksdyr før implantering eller fra mottakere av tomme makrokuler. Derimot ble peptidet rutinemessig påvist i serum fra rotter implantert makrokuler med øyceller, i et gjennomsnittlig nivå på 0,880 0,249 ng/mL 21 dager etter implantering til 0,662 0,160 ng/dL ved avslutningen av studien.

Forsøksdyr ble også testet for glukosuri, ketonuri og behovet for bikarbonat-administrering. Det var ingen signifikante forskjeller før implantering; deretter skjedde imidlertid signifikant færre episoder av glykosuri (37 av 56 prøver, versus 67 av 81) og ketonuri (20 av 64 prøver, versus 32 av 54) hos mottakere av øycelle-makrokuler. Behovet for bikarbonatterapi var også signifikant nedsatt (2 behandlinger, versus 26).

EKSEMPEL 7

De etterfølgende forsøk viser at Seakem agarose-makrokuler som omslutter øyceller, kan dyrkes in vitro over lengre tidsrom og likevel være funksjonelle.

I disse forsøkene ble det benyttet en gruppe på 12 diabetiske BB-rotter som tilfredstilte de samme kriterier som rottene i Eksempel 6, ovenfor, i likhet med 23 Wistar-Furth rotter, 7 uker gamle. Denne andre rottegruppen tjente som normale kontroller.

Fem av disse Wistar-Furth rottene ble gjennom halevenen injisert 65 mg/kg streptozotocin for å indusere diabetes. Når det ble observert to påfølgende blod- glukoseavlesninger >500 mg/dL, ble det innledet insulinterapi som beskrevet nedenfor.

Dyrene ble anestetisert 20-21 dager etter ankomst ved å benyttet en dose på 0,1 mL/100 g ketamin / (60 mg/mL), xylazin (6 mg/mL), / butarfenol (3 mg/mL), administrert intramuskulært.

Etter anestetisering fikk alle BB-rottene Seakem agarosekuler inneholdende øyceller, som beskrevet ovenfor. Rottene ble delt i tre grupper på 4 og fikk makrokuler som var blitt dyrket in vitro i 9 uker, 40 uker eller 67 uker. Mengden makrokuler administrert tilsvarte 1,0 x dyrenes daglige insulinbehov.

Fem av Wistar-Furth rottene fikk makrokuler som var blitt dyrket in vitro i 7,8-11,5 uker i den samme dose som BB-rottene. Dette er tilnærmet 45-49 makrokuler per Wistar-Furth rotte og 56-60 per BB-rotte.

I løpet av forsøkene tiltok rottenes vekt gjennomsnittlig ca. 75 g. Som resultat ble det på dag 97 etter den første implantering foretatt en supplerende implantering på BB-rotter. Rottenes gjennomsnittlige insulinbehov før implantering var 0,0083 U insulin/g kroppsvekt. Ut fra denne verdi ble det beregnet at ytterligere 17 øycelle-holdige makrokuler trengtes for å produsere 39,19 mU insulin per 24 timer. Som forklart nedenfor, ble det siden 4 kuler ble fjernet fra hver rotte før den andre implantering, administrert 21 makrokuler, dyrket i 19 uker. Wistar-Furth rotter fikk ikke det andre implantat.

De forskjelllige testene foretatt i Eksempel 7 ble likeledes foretatt her ved bruk av den samme metodikk.

201-202 dager etter implantering ble det foretatt en fullstendig disseksjon, også som beskrevet ovenfor.

Gjennomsnittlige daglige blodglukosenivåer er vist i Figur 1. Etter implantering ble normoglykemi (100-200 mg/dL) gjenopprettet i ca. 1 måned i alle BB-rotter. Deretter utviklet det seg moderat hyperglykemi (200-400 mg/dL) i BB-rottene, og denne vedvarte gjennom resten av studien. Utviklingen av moderat hyperglykemi og oppnåelse av maksimal kroppsvekt skjedde samtidig. Kropps-vekten forble konstant, mens blodglukosenivåene svingte mellom 300-400 mg/dL gjennom resten av studien. Det ble ikke observert forskjeller i de gjennomsnittlige daglige blodglukosenivåene blant de tre gruppene som hadde fått øyceller inne holdende Seakem Gold makrokuler, uansett lengden av in vitro dyrkningstiden for kulene.

De Wistar-Furth rotter hvor diabetes var blitt indusert oppviste også normoglykemi i ca. 1 måned, hvoretter det ble observert moderat hyperglykemi.

Det ble ovenfor angitt at en andre implantering fant sted i BB-rotter, 97 dager inn i studien. Denne andre implantering påvirket ikke daglige blodglukose-verdier. C-peptid fra svin ble også bestemt og ble påvist i alle tre gruppene av BB-rotter. I løpet av første 88 dagene av forsøkene avtok det gjennomsnittlige svine C-peptidnivå fra 0,6-0,9 ng/mL til 0,2-0,4 ng/mL. På dag 116, etter den andre implantering, økte peptidnivåene til et gjennomsnitt på 0,3-0,7 ng/mL, hvor en 40 gangers økning ble observert i peritonealvæske ved disseksjon.

Prosedyrer for glukoseutfordring ble foretatt gjennom hele studien på alle rotter som hadde fått implantater av makrokuler med øyceller. Det ble ikke observert forskjeller i den evne makrokuler, dyrket over forskjellige tidsrom, har til respons på glukoseutfordring etter implantering. Nærmere bestemt var blodglukosenivåene i alle BB-rottene omtrent doblet fra den opprinnelige verdi på 100-200 mg/dL. Retur til basislinje-glykemi fant sted i løpet av 120 minutter hos 10 av de 12 dyrene. Denne respons tilsvarte den som ble observert i normale Wistar-Furth dyr.

Alle forsøksdyr ble tilslutt moderat hyperglykemiske, men en glukoseutfordring på dag 105 etter transplantasjon, viste en initial økning i blodglukose og gikk deretter tilbake til glykemi-basislinjen. Etter 200 dager var det etter transplantasjon bare en svak økning i glykemi-basislinjen etter glukose-administrering som deretter gikk tilbake til glykemi-basislinjen.

Resultatene av disse studiene sammenlignet med arbeidet til Jain et al., i Transplantation, ovenfor, viste at agarosekuler inneholdende øyceller hvor agarosen er Seakem Gold, var uventet bedre enn de rapportert av Jain et al. For eksempel døde 40% av forsøksdyrene innen dag 200 i rapporten til Jain et al., mens mortalitetsraten med makrokulene ifølge oppfinnelsen var null. Dessuten ble de resultater som her er oppnådd funnet ved å benytte halvparten så mange makrokuler som de rapportert av Jain et al. I de resultater som det ikke skal gås nærmere inn på her, ble dessuten produksjonsnivåene av insulin i gjenvundne makrokuler etter disseksjon bestemt, og disse var betydelig høyere enn det for makrokuler gjenvunnet etter disseksjon rapportert av Jain et al.

EKSEMPEL 8

Forsøk ble foretatt for å sammenligne styrken av kulene ifølge oppfinnelsen med kuler fremstilt og belagt med FMC HGT(P) agarose.

I disse testene ble kuler individuelt anbrakt i en presse som hadde en øvre og nedre plate. Den øvre plate beveget seg nedover med en hastighet på 30,5 cm per minutt, og kulene ble presset til de sprakk. Kompresjonskraften (maksimal kompresjon) i kilo ble bestemt.

For HGT(P) varierte den maksimale kompresjon fra 0,324 kg til 1,444 kg med et gjennomsnitt på 0,888 og standardavvik på 0,247. For produktene ifølge oppfinnelsen var området 1,053 kg til 2,911 kg, med et gjennomsnitt på 1,942 og standardavvik på 0,497.

Kulene ifølge oppfinnelsen var klart sterkere enn de andre agarose-agarose belagte kulene.

Eksemplene ovenfor beskriver forskjellige trekk ved oppfinnelsen og som er relatert til agarose-makrokuler inneholdende sekretoriske øyceller, belagt med agarose, hvor den anvendte agarose er Seakem Gold agarose.

Som angitt her refererer betegnelsen "makrokule" seg til en struktur som i det vesentlige er kuleformet, med en diameter på fra ca. 4 til ca. 10-12 mm diameter, mest foretrukket fra ca. 6 til ca. 8 mm diameter. Det andre agaroselag er fortrinnsvis fra ca. 0,05 til ca. 5 mm tykt, mer foretrukket fra ca. 0,5 mm til ca. 5 mm tykt, enda mer foretrukket fra ca. 1,0 til ca. 3 mm, og mest foretrukket fra ca. 1,0 til ca. 2,0 mm tykt. Det andre agaroselag kan være, men behøver ikke være, Seakem Gold agarose.

"Makrokuler" benyttes som en foretrukket struktur. Enhver fast agarose-struktur som innkapsler sekretoriske celler og fortrinnsvis er belagt med et andre agaroselag, er trekk beskrevet heri.

De sekretoriske cellene kan variere. Enhver celle eller organelle som fører til et ønsket sekretorisk produkt kan innkapsles. Øyceller, cancerceller og stam-celler er eksempler på de typer materialer som kan benyttes på denne måte. Hver kule kan inneholde et varierende antall cellulære organeller, for eksempel øyceller, for eksempel fra ca. 50 til ca. 5000 øyceller, mer foretrukket fra ca. 100 til ca. 2500 øyceller, enda mer foretrukket fra ca. 250 til ca. 1000, og mest foretrukket fra ca. 475 til ca. 550 øyceller. Ca. 500 øyceller er mest spesielt foretrukket.

Claims (18)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en agarosebelagt, agarosesekrtorisk cellekule,karakterisert vedat den omfatter: (a) suspendering av sekretoriske celler i en første agarose, idet nevnte første agarose har et sulfatinnhold på mindre enn 0,2 vekt%, men høyere enn 0, et pyruvatinnhold på 0-0,1 vekt%, et nitrogeninnhold på 0-0,2 vekt%, og danner en gel som har en gelstyrke ved 1,0 vekt% konsentrasjon på minst 1200 g/cm<2>, vesentlig fravær av DNA binding i 0,7 M eller mindre tris acetatbuffer og en elektroendosmose med 1,0 vekt% konsentrasjon på 0,05 eller mindre. (b) utforming av en kule fra nevnte suspenderte sekretoriske celler ifølge trinn (a), (c) inkubering av nevnte kule ifølge trinn (b) i fuktig luft, og (d) belegging av nevnte kule ifølge trinn (c) med en andre agarose, for å danne et agarosebelegg, agarosesekretorisk cellekule.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den videre omfatter rulling av nevnte kule ifølge trinn (c) i 5% agarose, kontakting av nevnte rullede kule med mineralolje, og vasking av nevnte rullede kule for å danne nevnte agarosebelagte, agarosesekretoriske cellekule.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte sekretoriske celler er øyceller.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3,karakterisert vedat nevnte øyceller er øyceller valgt fra en gruppen bestående av humane øyceller, storfeøyceller og svin øyceller.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3,karakterisert vedat nevnte kule inneholder fra ca. 50 til ca. 5000 øyceller, fortrinnsvis fra ca. 100 til ca. 2500 øyceller, mest foretrukket ca. 475 til ca. 550 øyceller.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte kule er en makrokule med en diameter på fra ca. 4 mm til ca. 12 mm, fortrinnsvis fra ca.

4 mm til ca. 10 mm, mer foretrukket fra ca. 4 mm til ca. 8 mm, mest foretrukket fra ca. 6 mm til ca. 8 mm.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert veda t den omfatter belegging av nevnte kule med et agaroselag fra ca. 0,05 mm til ca. 5,0 mm, fortrinnsvis fra 1,00 mm til ca. 3,00 mm, mest foretrukket fra ca. 1,00 til ca. 2,00 mm.

8. Agarosebelagt, agarosesekretorisk cellekule,karakterisert veda t agarosen til agarosesekretorisk cellekule har et sulfatinnhold på mindre enn 0,2 vekt% men høyere enn 0, et pyrovatinnhold på 0-0,1 vekt%, et nitrogeninnhold på 0-0,2 vekt% og danner en gel som har en gelstyrke ved 1,0 vekt% konsentrasjon på minst en 1200 g/cm<2>, vesentlig i fravær av DNA binding i 0,7 mm eller mindre tris acetatbuffer og en elektroendosmose ved 1,0 vekt% konsentrasjon på 0,05 eller mindre.

9. Agarosebelagt, agarosesekretorisk cellekule ifølge krav 8, karakterise r t ved at nevnte kule inneholder øyceller.

10. Agarosebelagt, agarosesekretorisk cellekule ifølge krav 9, karakterise r t ved at nevnte øyceller er øyceller valgt fra en gruppe bestående av menneskeøyceller, storfeøyceller og svinøyceller.

11. Agarosebelagt, agarosesekretorisk cellekule ifølge krav 9,karakterisert vedat den inneholder fra ca. 50 til ca. 5000 øyceller, fortrinnsvis fra ca. 100 til ca. 2500 øyceller, mest foretrukket fra ca. 475 til ca. 550 øyceller.

12. Agarosebelagt, agarosesekretorisk cellekule ifølge krav 9,karakterisert vedat den haren diameter på fra ca. 4 mm til ca. 12 mm, fortrinnsvis fra ca. 4 mm til ca. 10 mm, mer foretrukket fra ca. 4 mm til ca. 8 mm, mest foretrukket fra ca. 6 mm til ca. 8 mm.

13. Agarosebelagt, agarosesekretorisk cellekule ifølge krav 8,karakterisert vedat nevnte kule er belagt med et lag av agarose fra ca. 0,05 mm til 5,0 mm, fortrinnsvis fra ca. 1,0 mm til 3,0 mm, mest foretrukket fra ca. 1,0 mm til 2,0 mm.

14. Anvendelse av agarosebelagte, agarosekretoriske cellekuler ifølge krav 8, for fremstilling av et medikament for behandling av en tilstand forårsaket av svekket funksjon til sekretoriske celler.

15. Anvendelse ifølge krav 14, idet nevnte tilstand er insulinavhengig diabetes.

16. Anvendelse ifølge krav 14, idet nevnte kule inneholder øyceller.

17. Anvendelse ifølge krav 16, idet øycellene er øyceller valgt fra en gruppe bestående av menneskeøyceller, svinøyceller og storfeøyceller.

18. Anvendelse ifølge krav 14, idet nevnte kuler er for plassering i den intraperitoneale kavitet.