KR101289023B1 - 오목 마이크로 웰을 이용하는 내분비세포 배양방법 - Google Patents

오목 마이크로 웰을 이용하는 내분비세포 배양방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 U타입 오목 마이크로 웰을 이용하는 것을 특징으로 하는, 내분비세포의 클러스터 형성방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는, 직경 250 ~ 350 ㎛인U타입 오목 마이크로 웰 상에서 내분비세포, 바람직하게는 췌장 소도세포를 미세중력 노출 하에 배양함으로써, 이식 효율이 우수한 크기의 클러스터를 형성할 수 있다.

Description

오목 마이크로 웰을 이용하는 내분비세포 배양방법{A Method for culturing endocrine cells Using Concave Microwell}
본 발명은 U타입 오목 마이크로 웰을 이용하는 것을 특징으로 하는, 내분비세포의 클러스터 형성방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는, 직경 250 ~ 350 ㎛인U타입 오목 마이크로 웰 상에서 내분비세포, 바람직하게는 췌장 소도세포를 미세중력 노출 하에 배양함으로써, 이식 효율이 우수한 크기의 클러스터를 형성하는 방법에 관한 것이다.
당뇨병(Diabetes Mellitus)은 췌장 β-세포의 인슐린 분비 이상이나 인슐린 작용기관 또는 장기의 수용체 이상 등으로 인한 고혈당 증상과 이에 따른 합병증을 특징으로 하는 질병이다. 당뇨병 치료를 위해 주로 인슐린 주사요법과 함께 운동요법, 식이요법이 시행되고 있으나, 완치가 불가능하고 합병증 위험이 여전히 존재하는 등 한계가 있다
최근에는 췌장이식 및 췌도세포이식을 통한 당뇨병 치료가 시행되고 있는데, 췌장이식의 경우 공여자의 절대 부족, 높은 수술 합병증, 지속적인 면역억제제의 투여를 비롯한 이식 후 관리의 어려움 등의 문제점이 있다.
이에 비해, 췌도세포이식은 췌장이식과 달리 비교적 간편한 수술로 합병증 없이 쉽게 이식이 가능하며, 췌도세포에 대한 수술 전 면역조절 등을 통해 면역관용(immune tolerance)을 유발하여 면역억제제 사용에 따른 부작용의 감소를 기대할 수 있으며, 또한 분리된 췌도세포를 체외에서 배양 유지함으로써 가장 적절한 이식수술을 수행할 수 있는 장점이 있다.
특히, 인슐린을 투여하지 않으면 생명을 유지할 수 없는 이른바 인슐린 의존 상태에 있는 1형 당뇨병의 환자에 대해서, 췌장 소도 이식이라는 기술이 사회적으로 큰 주목을 끌고 있으며, 주로 유럽 및 미국에서 임상 치료법으로서 확립되고 있다
췌장 소도 이식이란, 생체에서의 혈당 조절에 중심적 역할을 하고 있는 세포 집단의 췌장 소도를 문맥(門脈,portal vein) 내에 주입하는 세포 조직 이식을 의미한다. 소도 이식은 이식 수증자에게 침해가 적으므로, 1형 당뇨병 환자에게 있어 가장 이상적인 치료법으로 간주되고 있다.
2000년에 캐나다 에드몬톤(Admonton)에 있는 앨버트(Alberta) 대학에서 임상 소도 이식 치료의 성공이 보고되었다. 상기 보고 이래로 4년 동안 약 300 건의 소도 이식이 유럽 및 미국을 중심으로 행해져 왔다. 이러한 소도 이식은 앨버트 대학에서 확립된 이른바 「에드몬톤 프로토콜」을 기본으로 하여 실시되고 있다.
그러나, 뇌사 기증자보다 조건이 더욱 좋지 않은 심장정지 기증자로부터의 소도 이식은 세계적으로도 거의 성공한 예가 없고, 심장정지 기증자로부터의 소도 이식은 지금까지 사실상 불가능하였다. 지금까지, 췌장 소도 이식에 대해서 안정된 소도 수량을 얻는 기술개발이 어려웠고, 소정의 경우에서는 이식된 소도가 효과적으로 기능을 하지 않았다. 특히, 췌장 소도 세포는 형성하는 클러스터의 크기에 따라 인슐린 분비능이 현저히 상이한 바, 이러한 인슐린 분비능이 우수한 크기의 클러스터 제작이 중요하다.
그러나, 췌장 소도 이식을 위한 최적 수단, 특히 이식용으로 적합한 크기의 췌장 소도 클러스터의 제작에 관한 최적 수단은 아직 밝혀지지 않았다.
이에 본 발명자들은 내분비세포의 일종인 췌장소도를 특정 직경의 오목 마이크로웰에 배양하면서 미세중력에 노출시켰을 때, 이식의 효과가 우수한, 즉 인슐린 분비능이 우수한 크기의 췌장 소도 클러스터를 형성할 수 있음을 발견하였고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 췌도 소도 세포와 같은 내분비세포를 오목 마이크로웰 상에서 배양하여 클러스터를 형성시키는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법을 이용하여 수득되고, 직경이 50 ~ 100 ㎛ 인 췌도 소도 세포 클러스터(islet cell cluster, ICC)를 함유하는 당뇨병 치료용 세포치료제를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 내분비세포 클러스터 형성용의, 직경 250 ~ 350 ㎛의 U타입 오목 마이크로 웰을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 U타입 오목 마이크로 웰을 이용하는 것을 특징으로 하는, 내분비세포의 클러스터 형성방법을 제공한다.
이 때, 상기 U타입 오목 마이크로 웰의 직경은 250 ~ 350 ㎛인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 280 ~ 320 ㎛, 가장 바람직하게는 약 300 ㎛이다.
상기 이식에 적합한 내분비세포의 클러스터는 U타입 오목 마이크로 웰 상에서 10~15일 동안 배양함으로써 형성되는데, 약 2주 (14일) 동안 배양하는 것이 바람직하다.
이와 같이, 상기 U타입 오목 마이크로 웰 상에서의 내분비세포를 배양하는 것은 U 형태로 인해 생기는 미세중력에 상기 세포들을 노출시키는 것을 의미하는 데, 이러한 환경에서 배양시킴으로써 더욱 효과적으로 클러스터를 형성시킬 수 있는 것이다. 특히, 이러한 방법은 다른 첨가인자를 사용하지 않고 내분비세포만의 배양으로도 효과적으로 클러스터를 형성시킬 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 형성된 내분비세포 클러스터는 50 ~ 100 ㎛, 바람직하게는 80 ~ 100 ㎛의 직경을 가지게 되는데, 이러한 크기가 내분비세포의 이식에 가장 효과적인 바, 본 발명의 방법이 이식용 내분비세포의 배양에 적합한 것인 것이다.
사용할 수 있는 내분비세포는 췌장 소도 세포(panceratic islet), 갑상선 여포 세포(thyroid gland follicle cell), 뇌하수체(pituiraty gland), 부신(adrenal gland), 장내분비 세포(Enteroendocrine cell) 중 선택되는 1종의 세포일 수 있다. 본 발명의 일 실시에서는 췌도소도세포(panceratic islet)를 사용하였다.
따라서, 본 발명은 일 태양으로 상기와 같은 방법에 의해 수득되고, 직경이 50 ~ 100 ㎛ 인 췌도 소도세포 클러스터(islet cell cluster, ICC)를 함유하는 당뇨병 치료용 세포치료제도 제공한다.
한편, 본 발명은 내분비세포 클러스터 형성용 직경 250 ~ 350 ㎛의 U타입 오목 마이크로 웰을 제공한다.
상기 U타입 오목 마이크로 웰은 제한은 없으나, 폴리우레탄, 폴리디메틸실록산(polydimethlsiloxane, PDMS) 등으로 이루어질 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서는 PDMS를 사용하였다.
이처럼, 본 발명은 이식용 내분비세포의 클러스터의 형성에 있어서, 가장 효과적인 크기의 클러스트를 제조하는 방법에 관한 것으로, 미세중력에 노출시킬 수 있는 U타입 오목 마이크로 웰, 특히, 250 ~ 350 ㎛의 직경을 가진 U타입 오목 마이크로 웰을 이용하여 내분비세포를 배양함으로써 이식용 내분비세포의 클러스터를 형성시킬 수 있다.
본 발명에서는 내분비세포를 U타입 오목 마이크로 웰 상에서 배양함으로써 이식에 효과적인 크기의 클러스터를 제조할 수 있기 때문에, 이러한 내분비세포의 이식이 필요한 치료에 효과적이다. 특히, 인슐린 분비능이 우수한 크기의 췌도 소도 세포 클러스터 제조가 가능하므로 당뇨병 치료에 유용하다.
도 1은 본 발명의 U타입 오목 마이크로 웰을 제작하는 공정에 관한 도식도이다.
도 2는 췌도 소도 세포 배양에 사용할 편평한 웰 및 본 발명의 오목 마이크로 웰을 직경 크기별로 제작한 사진이다.
도 3는 300㎛, 500㎛, 700㎛ 직경을 가진 오목 마이크로 웰 상에서 췌장 소도 세포를 2주 동안 배양한 후 형성된 클러스터(ICC)의 사진이다.
도 4는 300㎛, 500㎛, 700㎛ 직경을 가진 오목 마이크로 웰 상에서 형성된 ICC의 수율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 300㎛, 500㎛, 700㎛ 직경을 가진 오목 마이크로 웰 상에서 형성된 ICC 별로 크기 분포를 나타낸 그래프이다.
도 6는 300㎛, 500㎛, 700㎛ 직경을 가진 오목 마이크로 웰 상에서 형성된 ICC의 생존능(Cell viability)을 나타낸 그래프이다.
도 7은 300㎛, 500㎛, 700㎛ 직경을 가진 오목 마이크로 웰 상에서 형성된 ICC의 인슐린 분비능을 나타낸 그래프이다.
도 8은 300㎛, 500㎛, 700㎛ 직경을 가진 오목 마이크로 웰 상에서 형성된 ICC 내부의 투과전자 현미경(TEM) 사진이다.
도 9 및 도 10은 300㎛, 500㎛, 700㎛ 직경을 가진 오목 마이크로 웰 상에서 형성된 ICC에 대한 면역조직염색 결과 사진이다.
도 11은 소도 클러스터 크기에 따른 인슐린 분비능을 비교한 그래프이다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"내분비세포(endocrine cells)"는 인간의 신체 내부에서 순환계로 직접 방출되어 대사 및 신체과정을 조절하는 내분비물질(호르몬 등)을 생산하는 조직계통을 이루는 세포로, 인간의 내분비기관은 외부의 자극에 대해 인체 내부의 반응을 유도하는 중요한 역할을 담당한다. 사람의 정상적인 발달과 성장, 에너지의 소비나 축적, 성숙한 여자의 월경주기, 남녀의 생식과정, 수유 등도 모두 내분비계에 의해 조절되고 있다. 또한 내분비계는 신경계 및 면역계와 함께 작용하여 균형있는 생명체로서의 생활을 영위할 수 있게 한다. 내분비샘은 해부학적 특징에 의해 두 종류로 분류할 수 있는데, 갑상선과 같이 다른 조직과 뚜렷한 경계를 이루어 독립된 기관으로 존재하는 종류와 췌장의 랑게르한스섬처럼 다른 조직 속에 포함되어 있는 종류가 있다. 호르몬은 인체의 모든 부위로 혈류를 따라 돌고 다양한 기관과 계통의 작용을 조절하여 인체의 건강을 유지시킨다.
"췌장 소도 세포(Pancreatic islet cell)" 또는 "췌장 베타 도세포(Pancreatic beta islet cell)"는 바람직하게는 조정된 방식으로, 더욱 바람직하게는 글루코스 농도 의존적 방식으로 인슐린, 인슐린 유사체, 인슐린 전구체 또는 인슐인 유사 인자를 분비할 수 있는 세포를 의미한다.
"인슐린"은 공지된 다양한 인슐린, 인슐린 유사체 또는 인슐린 유사 인자를 의미한다. 이는 프로호르몬 또는 인슐린 전구체 단백질, 완전하게 프로세싱된 단백질, 또는 이들 전체중 임의의 대사물을 포함한다.
"당뇨병"은 췌장 베타 랑게르한스섬 세포가 기능 장애를 일으켜서 글루코스 수준 순환에 대한 반응성이 손실된 질환을 의미한다. 이러한 질환 상태는 선척적 대사 오류, 외상 손상, 화학적 손상, 전염성 질환, 만성 알코올 섭취, 내분비병증, 유전자 질환 예컨대, 다운증후군으로 인해 초래될 수 있거나, 기타 내분비 췌장에 직접적으로 또는 간접적으로 손상을 초래하는 기타 병인으로 초래될 수 있다.
"비성인의 성인발증형 당뇨병(Mature onset diabetes of the young)"은 타입 1 또는 타입 2 당뇨 표현형에 분명하게 해당되지 않은 낮은 비율의 당뇨병 환자를 포함하는 것을 뜻한다. 이는 일반적으로 25세 이전에 초기에 발병되는 베타-세포 기능의 유전적 결점을 특징으로 한다. 본 발명에 있어서 "당뇨병"은 이와 같은 비성인의 성인발증형 당뇨병도 포함한다.
"배양"은 생물체나 생물체의 일부(기관 ·조직 ·세포 등)를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일로써, 이 경우 외적 조건으로 온도 ·습도 ·빛 ·기체상의 조성(이산화탄소나 산소의 분압) 등이 중요하며, 그 밖에 배양되는 생물체에 가장 중요한 직접적인 영향을 주는 것은 배지(배양기)로, 그 생물체의 직접적인 환경인 동시에 생존이나 증식에 필요한 각종 영양소의 공급장이다. 특히, 체외 배양이란 세포를 체외로 분리하여 배양시키는 것을 말한다.
"중력"이란 지구의 만유인력과 자전에 의한 원심력을 합한 힘으로, 지표 근처의 물체를 연직 아래 방향으로 당기는 힘이다. 만유인력을 중력이라고 할 때도 있다. 질량이 있는 모든 물체 사이에는 서로 끌어당기는 만유인력이 작용한다. 본 발명의 "미세 중력"이란 오목 마이크로웰의 U자 형상에 의해 발생하는 작은 크기의 중력으로 세포 간 밀착 결합(tight junction)을 도와주는 기능을 한다.
"밀착 결합(tight junction)"은 세포 사이의 상호작용에 의한 세포 결합의 한 종류로, 특징적으로 장내 점막, 신장의 세뇨관 벽과 같은 상피세포에서 세포의 apical margins를 둘러싸면서 인접세포들을 결합하고 있다. 밀착 결합(tight junction)은 세포를 서로 강하게 묶는 기능 외에 상피세포의 한 쪽에서 다른 쪽으로의 물질 투과의 장벽 (permeability barrier) 역할도 한다. 그리고, 밀착 결합(tight junction)의 또 다른 기능은 세포 극성의 유지이다. 상피세포의 세포막은 밀착 결합을 중심으로 점막 쪽의 세포막(apical side)과 기저막 쪽의 세포막(basolateral side)이 구조적으로나 기능적으로 확연히 구분되며 이는 각각의 세포막에 존재하는 물질이동 단백질들의 분포가 차이가 나기 때문이다.
"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 특정 형상의 배양기 즉, U타입 오목 마이크로 웰을 이용하여 췌도 소도 세포를 배양했을 때, 특정 인자의 첨가 없이도 상기 췌도 소도 세포가 효과적으로 이식에 적절한 크기의 클러스터를 형성한다는 것을 발견하였고, 본 발명은 이를 기초로 한, 췌도 소도 세포를 포함하는 내분비세포의 새로운 클러스터 형성방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 U타입 오목 마이크로 웰을 이용하는 것을 특징으로 하는, 내분비세포의 클러스터 형성방법에 관한 것이다.
본 발명은 내분비세포의 클러스터 형성방법에 관한 것이다.
내분비물질(호르몬 등)을 생산하는 내분비세포는 뇌하수체, 갑상선, 부신(adrenal gland), 시상하부, 췌장, 난소, 고환 등을 구성하고 있는 조직을 이루는 세포로, 특히 내분비샘을 지닌 조직을 구성하고 있다.
따라서, 본 발명에서 사용할 수 있는 내분비세포의 종류로는 췌장 소도 세포(panceratic islet), 갑상선 여포 세포(thyroid gland follicle cell), 뇌하수체(pituiraty gland), 부신(adrenal gland), 장내분비 세포(Enteroendocrine cell)등을 예로 들 수 있다. 사용에 제한은 없으나, 그 중에서도 췌장 소도 세포(pancreatic islet)를 사용하는 것이 가장 바람직하다.
췌장은 상복부에 수평으로 위치하면서 십이지장과 비장에 면해 있고, 길고 부드러운 엽상의 형태를 띠며 성인에서 약 75g 정도의 중량을 가지는 분비선이다. 췌장의 대부분은 위장 내에 하루 약 1 리터 이상 분비되는 소화체액을 통해 단백분해효소나 지방분해효소를 분비하는 외분비선이고, 외분비선 조직사이로 드문드문 분산되어 마치 섬모양의 형태를 이루며 혈관이 풍부하고 각각 신경으로 연결된 세포집단이 췌장 내에 약 100만개 정도 있는데 이것이 랑게르한스 소도(langerhans islet)도는 췌장 소도라 불리는 내분비선이다.
인간의 췌장 소도는 평균 직격이 150㎛이고 소도의 주변부에는 주로 전체 소도 질량의 15%를 차지하며 글루카곤을 분비하는 α-세포, 중심부에는 전체 소도 질량의 80%를 차지하며 인슐린을 분비하는 β-세포가 자리잡고 있다.
특히, 상기 췌장 소도 세포는 응집하여 클러스터를 형성하고 있는데, 이러한 클러스터의 크기에 따라 인슐린 분비능이 달라지는 특징이 있다. 이러한 특징은 공지문헌 Diabetes 56; 594~603(Lehmann R et al., 2007)에서도 확인할 수 있다.
Figure 112010081470915-pat00001
상기 표 1에서 확인할 수 있는 것처럼, 췌장 소도 세포 클러스터는 저산소(hypoxia) 조건에서 세포사멸이 증가하는데 이러한 저산소 상태는 클러스터 크기와 관련이 있다. 크기가 클수록 클러스터 내부는 저산소 상태로 되어서 세포사멸이 증가하게 되는 것이다.
또한 도 11에서 확인할 수 있는 것처럼, 50~100㎛의 작은 크기의 클러스터가 100㎛ 이상의 큰 크기의 클러스터보다 인슐린 분비능이 우수함을 알 수 있다. 특히, 글루코스의 농도가 높을 수록(20mM vs 2.8mM) 인슐린 분비능의 차이는 더욱 현저하다.
즉, 이처럼, 췌도 소도 세포 등을 포함하는 내분비세포의 클러스터는 호르몬 분비능이 우수한 크기의 직경을 가지는 것이 무엇보다도 중요하고, 특히, 이식 효과를 극대화 하기 위해서는 이에 적합한 크기의 클러스터를 제조하여 이식하는 것이 필요하다. 따라서, 이러한 최적 크기의 클러스터를 제조할 수 있는 방법의 고안이 매우 중요하다고 할 수 있고, 본 발명은 이를 위한 것이다.
본 발명의 방법은 내분비세포의 클러스터 형성에 U타입 오목 마이크로 웰을 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 'U타입 오목 마이크로 웰(concave microwell)'란 U자 형상으로 오목하게 파인 반구 구조를 가지는 것을 의미하고, 상기 내분비세포(예를 들어 췌장 소도 세포)를 미세 중력에 노출시키는 효과가 있다. 이는 웰의 U자 형상에 의해 세포들이 편평한 웰의 경우와 비교하여 좀 더 중력에 의한 효과를 받게되는 것을 의미한다. 즉, 이러한 미세 중력에의 노출이 내분비세포가 클러스터를 효과적으로 형성시키는 데 도움을 주게 되는 것이다. 반 구 형태의 오목 마이크로 웰은 내분비세포가 클러스터를 형성하는데 있어 가장 적합한 물리적 환경을 조성해 준다는 사실을 추측할 수 있다.
특히, 췌도 세포는 다른 단일세포와는 달리, 인슐린을 분비하는 β세포 이외의 다른 세포를 포함하는 단일세포의 집합체로 이루어져 있다는 점에서, 클러스터의 형성에 있어 이러한 미세 중력에 의한 영향이 크다 할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 U타입 오목 마이크로 웰은 최적 크기의 클러스터를 제조하기 위하여, 특히, 직경의 크기가 중요하다.
즉, 이식에 적합한 크기로 클러스터를 형성시키기 위해서 웰의 직경은 250 ~ 350㎛ 크기가 바람직하고, 280 ~ 320㎛의 크기가 더욱 바람직하며, 약 300㎛의 크기가 가장 바람직하다.
이러한 직경의 크기는 췌장 소도 세포를 포함하는 내분비세포의 클러스터를 이식에 적합한 크기로 형성시키는 것에 결정적인 영향을 미치는 일 요소로서, 필요한 크기의 미세중력에 노출될 수 있도록 한다.
본 발명에 따른 크기의 직경을 가지는 U타입 오목 마이크로 웰을 이용하는 경우, 내분비세포, 특히 췌장 소도 세포는 직경이 50 ~ 100 ㎛ 정도의 클러스터를 형성하고, 이는 종래의 편평한 배양기(웰)에서 배양한 경우에 비해 크고 균일하여 이식된 후 치료 효과가 훨씬 우수하다.
따라서 췌장 소도 세포를 포함하는 내분비세포의 클러스터를 형성함에 있어서, 상기 오목 마이크로 웰의 직경의 크기가 상기 범위를 벗어나면, 즉 마이크로 웰의 직경이 더 큰 경우나 더 작은 경우에는 이식에 적합한 크기로 클러스터를 형성시키기 어렵다.
또한, 본 발명의 방법에 있어서, 상기 내분비세포의 클러스터는 U타입 오목 마이크로 웰 상에서 10~15일 동안 배양함으로써 형성시킬 수 있다. 바람직하게는 약 2주(14일) 정도 배양하는 것이 바람직하다. 이는 결국 상기 미세중력에의 노출 기간을 의미한다고 하겠다. 따라서, 이러한 배양 기간도 췌장 소도 세포를 포함하는 내분비세포의 클러스터를 이식에 적합한 크기로 형성시키는 것에 중요한 영향을 미치는 다른 일 요소가 될 수 있다.
본 발명의 내분비세포 클러스터 형성에 있어서, 별도의 가용성 인자 및 성장 인자와 같은 생화학적 물질은 필수적인 구성이 아니지만, 필요에 따라 임의로 첨가하여도 배양하여도 무방하다.
또한, 내분비세포 배양용 배지로는 공지된 모든 내분비세포 배양용 배지를 사용할 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서는, 클러스터 형성에 사용한 배지로, RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640을 사용했으며, FBS(Fetal Bovine Serum)와 항생제 (Penicillin-Streptomycin)를 첨가하여 사용하였다. 이 외에도, 췌장 소도 세포의 특성, 배양법, 및 생체내/시험관내 생존 능력에 관한 참고서적 등을 참조할 수 있다.
한편, 본 발명은 다른 관점에서 내분비세포 클러스터 형성용 직경 250 ~ 350 ㎛의 U타입 오목 마이크로 웰 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 도 1에 본 발명의 U타입 오목 마이크로 웰을 제작하는 공정의 일례를 도식화하였다.
본 발명은 일 구체예로서, 다음의 단계를 포함하는 내분비세포 클러스터 형성하는 방법을 제공한다.
(a) 원하는 직경을 가진 구멍을 가진 기질(substrate)에 PDMS 막을 코팅하는 단계;
(b) 포토레지스트(photoresist) 용액을 처리하는 단계;
(c) 자외선으로 경화시킨 후 벗겨내어 볼록형 금형을 수득하는 단계;
(d) PDMS 용액 처리 후 자외선으로 경화시키는 단계; 및
(e) 시트를 벗겨내는 단계.
본 발명에서 웰의 주요 성분으로 사용할 수 있는 물질은 원칙적으로, 원하는 모양이나 패턴을 쉽게 제작할 수 있으며, 세포 배양에 있어서 적합한 물질이면 어느 것이나 무방하다. 예를 들어, 폴리우레탄 아크릴레이트(polyurethane acrylate, PUA), 폴리디메틸실록산(polydimethlsiloxane, PDMS), 폴리에킬렌글리콜 (Polyethylene glycol ,PEG), 키토산 (Chitosan) 등을 사용할 수 있고, 본 발명의 일 구체예에서는 폴리디메틸실록산(polydimethlsiloxane, PDMS)를 사용하였다.
"디메틸실록산중합체(PDMS, polydimethylsiloxane)"는 산화규소 고분자로서 흔히 실리콘(silicone)이라고 부르며, 분자량에 따라 그 성질을 다양하게 변화시킬 수 있다. 즉 분자량 1만이하의 겔(gel)상태로부터 30만이상의 고무(rubber)상 까지 변하며, 흔히 카테터, 배뇨/ 배농관 등 다양한 용도로 현재까지 가장 널리 사용되고 있다
PDMS 는 망막 색소 상피세포(retinal pigment epithelial) 세포의 증식을 위해 기질(substrate) (Krishna Y et al, J Biomed Mater Res A. 2006 Oct 20)로 하이드로겔(hydorgel)과 함께 많이 쓰이고 있다. 하지만 하이드로겔은 매트릭스(matrix) 타입으로 많이 쓰이는 반면에 PDMS는 원하는 모양이나 패턴을 쉽게 제작할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에서는 상기 PDMS를 이용하여 250 ~ 350㎛의 직경을 가지는 오목 마이크로 웰 어레이를 제작할 수 있다.
우선, 오목형의 구조를 만들기 위해 볼록형 금형을 제작하는데, 포토레지스트의 광경화를 이용하여 원하는 직경을 가진 볼록형 금형을 만들고, 이에 PDMS 용액을 처리한 후 다시 자외선으로 경화시켜 오목형 마이크로 웰이 패턴화된 시트를 수득한다.
상기 웰 제작 방법에 있어서, PDMS를 경화시키는 방법으로 광경화, 특히 자외선에 의한 광경화 방법을 사용할 수 있다. 자외선(UV, ultraviolet)이나 가시광선(visible ray) 또는 전자 빔(EB, electron beam) 등을 이용하는 광경화란 일반적으로 광의 조사에 의해서 광개시제(photoinitiaor)로부터 생성된 자유 라디칼(free radical)이나 양이온(cation)에 의해 개시반응이 시작되어 반응성을 가진 단량체(monomer)나 올리고머(oligomer)가 연속 반응을 통해 경화되는 과정이라 할 수 있다. 광경화 중 산업적으로는 대부분 자외선을 이용한 경화가 가장 널리 사용되고 있는데 이러한 자외선 경화의 장점으로는 가격 대비 성능이 우수하고 에너지 소모량이 적으며 VOCs의 방출이 매우 적고 경화설비가 간단하며 대상물질에 가하는 열의 양이 적으며 경화 후에는 내화학성이나 기계적 물성이 우수한 재료들을 만드는 것이 가능하다.
또한, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법으로 형성된 직경 50 ~ 100 ㎛의 내분비세포 클러스터의 용도를 제공한다. 특히, 췌장 소도세포 클러스터(islet cell cluster, ICC)를 함유하는 당뇨병 치료적 용도를 제공한다.
즉, 일 태양으로 상기 설명한 방법에 의해 수득되고, 직경 50 ~ 100 ㎛ 인 췌장 소도세포 클러스터(islet cell cluster, ICC)를 함유하는 당뇨병 치료용 세포치료제에 관한 것이다.
본 발명의 세포 치료제는 췌장 β 세포의 신생 또는 재생 작용을 가지고 있어, 췌장 β 세포에서의 인슐린 양성 세포수를 현저하게 증가시킬 수 있다. 즉, 췌장 β 세포를 신생 또는 재생하는 작용을 가지는 본 발명의 세포치료제를 이용하여, 개체의 췌장 β 세포 쇠약, 사멸 또는 피폐를 억제할 수 있으며, 췌장 β 세포를 보호할 수 있다.
개체에서 분리한 췌장 소도 세포를 본 발명의 웰에서 배양시켜 췌장 β 세포의 재생을 촉진시킴으로써 해당 세포를 증폭시키고, 해당 세포를 개체의 췌장 β 세포가 쇠약 또는 사멸된 부위나, 또는 췌장 β 세포가 쇠약 또는 사멸될 것으로 예상되는 부위에 이식함으로써, 췌장 β 세포에 대한 재생 의료를 수행할 수 있다.
"재생(regeneration)"이란 형성된 기관 또는 개체의 일부가 상실되었을 때 그부분이 보충되는 현상으로, 이는 본 발명의 직경 50 ~ 100 ㎛ 인 췌장 소도세포 클러스터(islet cell cluster, ICC)를 함유하는 조성물(세포치료제)의 형태로 병변 부위에 직접 이식함으로써 유리하게 수행될 수 있다. 이식 방법은 당업자에게 널리 알려진 공지의 방법을 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 직경 50 ~ 100 ㎛ 인 췌장 소도세포 클러스터(islet cell cluster, ICC)를 함유하는 세포치료제는 인슐린 관련된 질환, 예컨대, 당뇨병, 특히 타입 I 당뇨병, 타입 II 당뇨병 및 비성인의 성인발증형 당뇨병(Maturity-Onset Diabetes of the Young: MODY)을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 세포가 사용되어 치료될 수 있는 당뇨병 증상은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 유전적 원인, 감염, 외상, 또는 화학적 원인을 포함한 어떠한 병인으로 야기될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은, 한정하는 것은 아니지만, 사람, 영장류 및 가축, 사육,애완용 또는 스포츠 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 양, 돼지, 소 등을 비롯한 치료가 필요한 임의의 포유동물을 치료하는 데 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 세포의 "치료학적 유효량"은 췌장 소도세포(β 세포의 손실, 손상 또는 변성에 의해 유발되는 환자의 생리학적 효과를 중지 또는 경감시키기에 충분한 양이다.
사용된 세포의 치료학적 유효량은 환자의 필요성, 환자의 연령, 생리학적 상태 및 건강, 소정의 치료 효과, 치료에 표적하고자 하는 조직의 크기 및 면적, 병변의 정도 및 선택된 전달 경로에 의존할 것이다.
치료학적으로 유효하게 달성하도록 투여할 수 있는 세포의 적당한 범위는 당업자의 통상의 지식 내에서 환자에 맞추어 적절히 사용할 수 있다.
그러나, 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 오목 마이크로 웰 어레이 제작
원하는 직경을 가진 구멍을 가진 아크릴 챔버 위에 PDMS membrane을 올려놓고, 아크릴 챔버 하단을 진공상태로 만들어서 PDMS membrane이 아크릴 챔버 구멍 밑으로 들어가게 하였다.
그리고, 아크릴 챔버 밑으로 들어간 PDMS memebrane 위에 SU-8 Solution(포토레지스트(photoresist) 용액)을 부어준 후 자외선에 노출시켜 SU-8 Solution을 경화시켰다. 경화 후 이를 벗겨내어 SU-8 볼록형 금형을 얻었다
상기 SU-8 볼록형 금형에서 볼록한 모양이 위를 향하게 한 다음, 그 위에 PDMS soultion을 붓고 열로 경화시켰다. 마지막으로 경화된 PDMS 시트를 벗겨내어 오목 마이크로 웰 어레이를 수득하였다.
실시예 2 : 췌장 소도세포 분리
SD rat(male 7주령)으로부터 과정: 콜라겐에이즈(collagenase)를 SD rat 췌장관(pancrease duct)를 주입 한 후 췌장 장기를 부풀린 후 빠르게 적출한 후 37도에서 15분간 반응 시켰다. 반응된 췌장 장기를 M199 media(Sigma, U.S.A) 용액 15ml에 담은 후 기계적 힘으로 천천히 수 회 흔든 후, 500㎛ 직경을 가진 필터로 콜라겐에이즈에 반응된 췌장조직을 걸렀다. 필터로 걸러진 췌장조직을 histopaque(Sigma, U.S.A)을 사용하여 밀도차를 이용한 층 분리를 통해서 췌장 조직에서 췌장소도 세포만을 분리하였다. 분리된 췌장소도 세포는 콜라겐에이즈의 활성을 중단시키기 위해 FBS가 첨가된 RPMI 1640의 배지로 1회 세척하였다.
이후, 췌장 소도세포 단일세포를 제조하였다.
췌장 소도세포 1000개와 소화효소인 0.25% 트립신 3 ml를 15ml tube에 담은 후 각각 3회씩 37도 항온기에서 5분 반응시켰으며, voltex에서 10초간 3회 반복하여 분리된 단일세포를 얻을 수 있었다. 그 후 소화효소인 트립신의 반응을 중단시키기 위해 FBS가 첨가된 RPMI 1640 배지로 1회 세척해 주었다.
실시예 3 : 오목 마이크로 웰에서 췌장 소도 세포 배양 및 클러스터 형성
상기 수득한 췌장 소도 단일 세포를 이하와 같이 2 x 105 cells/mold 로 씨딩하였다
- 300㎛ 직경을 가진 각각의 오목 마이크로 웰 :12 x 12(144 wells)
- 500㎛ 직경을 가진 각각의 오목 마이크로 웰 : 12 x 8(96 wells)
- 700㎛ 직경을 가진 각각의 오목 마이크로 웰 상 : 8 x 8(64 wells)
그리고 이들을 2주간 배양하였다. 대조군으로 편평한 마이크로 웰 상에서 동일한 조건으로 췌장 소도세포를 배양하였다.
즉, 실시예 2에서 췌장소도 단일세포 제조방법을 통해서 준비된 단일세포를 ultra-low attached dish (Corning Inc., U.S.A)의 편평한 웰에 FBS와 항생제가 첨가된 RPMI 1640 배지를 3ml 씩 분주 한 후 세포를 2 x 105 cells/well을 넣어서 2 주간 배양하였다. 이러한 실험 공정을 도 2에 도식화하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 편평한 웰에서 배양시킨 경우에 비해, 오목 마이크로 웰에서 배양시킨 경우에 균일한 모양의 췌장 소도세포 클러스터(ICC)가 형성되었다. 특히, 300㎛의 오목 마이크로 웰 상에서 형성된 클러스터의 경우가 가장 intact islet의 경우와 유사하였다.
도 4는 ICC의 수율을 나타낸 것으로, 편평한 웰에서 배양시킨 경우가 오목 마이크로 웰에서 배양시킨 경우보다 더 많은 수의 ICC를 형성시켰다.
이하, 다양한 관점에서 형성된 췌장 소도 세포 클러스터를 분석하였다.
(1) 오목 마이크로 웰 직경에 따른 ICC 크기
우선, 편평한 웰 및 상기 300㎛, 500㎛, 700㎛ 직경을 가진 각각의 오목 마이크로 웰 상에서 췌장 소도 세포를 2주 동안 배양한 후, 형성된 클러스터(ICC)의 크기를 알아보았다.
그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5의 A 및 도 5에 도시한 바와 같이, 300㎛의 오목 마이크로 웰 상에서 형성된 클러스터의 경우, 평균적으로 50~100㎛의 직경을 가졌고, 500㎛의 오목 마이크로 웰 상에서 형성된 클러스터는 150~200㎛, 500㎛의 오목 마이크로 웰 상에서 형성된 클러스터는 200~250㎛ 크기의 직경을 가졌다. 그 분포에 대한 결과 그래프를 도 5의 B에 나타내었다.
이러한 결과를 통해, 인슐린 분비 효율이 우수한 50~100㎛ 직경의 클러스터는 300㎛의 오목 마이크로 웰 상에서 형성됨을 알 수 있었다.
(2) 오목 마이크로 웰 직경에 따른 ICC 생존능( cell ciability )
편평한 웰 및 상기 300㎛, 500㎛, 700㎛ 직경을 가진 각각의 오목 마이크로 웰 상에서 췌장 소도 세포를 2주 동안 배양한 후, 형성된 클러스터(ICC)의 생존능을 알아보았다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 300㎛의 오목 마이크로 웰 상에서 형성된 클러스터의 경우 가장 intact islet의 경우와 유사한 결과를 나타냈고, 500㎛, 700㎛로 오목 마이크로 웰의 직경이 커질수록 다소 ICC의 생존능은 감소하였다.
(3) 오목 마이크로 웰 직경에 따른 ICC 인슐린 분비능
편평한 웰 및 상기 300㎛, 500㎛, 700㎛ 직경을 가진 각각의 오목 마이크로 웰 상에서 췌장 소도 세포를 2주 동안 배양한 후, 형성된 클러스터(ICC)의 인슐린 분비능을 알아보았다. 이하와 같은 방법으로 GSIS(glucose-stimulated insulin secretion) 테스트를 수행하였다
① 전처리 배양과정 : 2주 동안 배양 된 정상췌장 소도 세포와 ICC를 low glucse (2.8 mM)의 글루코스가 들어있는 KRBH (Krebs-Ringer bufferd HEPES)에 1시간 동안 전처리 배양을 하였다.
② 배양과정 : 정상 췌장 소도 세포 30개와 여러 크기의 몰드에서 생산된 ICC 30개를 각각 0.4 ㎛ 직경의 트렌스웰(transwell; Millipore, U.S.A)에 옮겨 담은 후 트렌스웰을 24-well plate의 각 웰에 넣는다. 그 후 이들 정상 췌장 소도 세포와 ICC가 들어있는 웰에 low glucose (2.8 mM)가 들어있는 KRBH 1ml을 각 웰에 넣은 후, 1시간 동안 세포배양기에서 배양을 통해 인슐린 분비를 유도한다. 그 후, 각 정상 췌장소도 세포 및 ICC가 들어 있는 트렌스웰을 high glucose(16.8 mM)가 들어있는 KRBH 1ml씩 들어있는 새로운 24-well plate에 옮긴 후, 다시 1시간 동안 배양을 한다. 그 후 인슐린 정량화를 위해 고농도의 글루코즈가 들어있는 KRBH와 저농도의 글루코즈가 들어있는 KRBH 용액을 모두 회수 하고, DNA 정량화를 위하여 실험에 사용한 정상 췌장소도 세포와 ICC를 모두 회수하였다.
③ 인슐린 정량화 : 각 KRBH 용액에서 정상 췌장 소도 세포와 ICC에서 분비된 인슐린 농도는 상용화된 insulin ELISA kit (Alpco diagnostics, U.S.A)로 정량화 하였다. 정량화하는 방법은 상용화된 키드 내에 매뉴얼을 따랐으므로 생략한다. 정량된 인슐린 량은 하기의 DNA 정량값으로 나눠서, 정상 췌장 소도세포 및 ICC의 크기에 따른 인슐린 분비량의 차이를 정규화하였다.
④ DNA 정량화 : 실험에 사용된 정상 췌장 소도 세포와 ICC를 Ultra sonication을 10초씩 15초 간격으로 3회 실시하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA 정량은 상용화된 CyQUANT kit (Invitrogen Inc., U.S.A)로 측정하였다. 정량화 방법은 상용화된 키드의 매뉴얼을 따랐다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 300㎛의 오목 마이크로 웰 상에서 형성된 클러스터의 경우가 가장 인슐린 분비능이 가까운 결과를 나타냈고, 500㎛, 700㎛로 오목 마이크로 웰의 직경이 커질수록 인슐린 분비능은 감소하였다. 이는 ICC의 직경이 클수록 저산소증(hypoxia) 및 소도 세포간의 밀착결합(tight junction) 차이에 의해 인슐린 분비능이 감소되는 것으로 생각된다.
특히, 고농도의 글루코스 자극이 가해졌을 때, 인슐린 분비능의 차이는 더욱 크게 나타났다. 저농도의 글루코스 자극이 가해졌을 때도 오목 마이크로 웰의 직경이 커질수록 인슐린 분비능은 감소하였는데, 300㎛의 오목 마이크로 웰 상에서 형성된 클러스터의 경우, intact islet의 경우와 거의 동일한 인슐린 분비능을 나타내었다.
실시예 4: 투과 전자 현미경 분석
편평한 웰 및 상기 300㎛, 500㎛, 700㎛ 직경을 가진 각각의 오목 마이크로 웰 상에서 췌장 소도 세포를 2주 동안 배양한 후, 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy, TEM)을 이용하여 형성된 ICC 단면 구조를 관찰하였다(x60,000).
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 소도 세포(islet cell) 사이의 밀착결합(tight junction) 이 일어나고 있음을 확인할 수 있었는데, 300㎛, 500㎛, 700㎛ 의 오목 마이크로 웰 상에서 형성된 클러스터 별로 그 차이를 명확히 구별하기는 어려웠다.
따라서, 면역염색을 통해 소도 세포간의 밀착결합(tight junction) 정도를 비교해보기로 하였다.
실시예 5: 면역조직화학분석( Immunocytochemistry )
편평한 웰 및 상기 300㎛, 500㎛, 700㎛ 직경을 가진 각각의 오목 마이크로 웰 상에서 췌장 소도 세포를 2주 동안 배양한 후 형성된 ICC에 대하여, DAPI, Phalloidin, insulin에 대해 면역염색하였다. 나아가, HIF-1α, VEGF에 대한 면역염색도 수행하였다.
2 주 동안 배양한 ICC를 4% (w/v) 파라포름알데히드로 30분 동안 고정한 후 2% 아가로즈로 ICC를 포매하였다. 아가로즈로 포매된 ICC를 탈수 작업 한 후 파라핀으로 포매하였다. 파라핀으로 포매된 ICC를 박편기(Leica TP1020, Leica Microsystems)로 4 μm 두께로 절편하였다. 절편된 ICC에 5분 동안 0.1% (v/v) Triton X-100를 투과시켰다.
10% (v/v) 염소 혈청의 블로킹 용액을 30분 동안 처리한 후, 상기 세포들을 일차 항체로 4℃에서 밤새 인큐베이션 시켰다. 상용 항체를 면역조직화학 분석을 위해 사용된 일차 항체는 다음과 같다: anti-HIF-1α(Abcam, Cambridge, MA), anti-VEGF(Abcam), anti-insulin (Abcam), FITC-phalloidin(Invirogen)
PBS로 세척한 후, 염색된 세포들을 FITC 및 로다민-결합 이차 항체(Molecular Probe, U.S.A)와 DAPI 염색을(Genetics, Invirtogen) 하였으며 공초점 현미경(LSM 510; Zeiss)으로 가시화 하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, FITC-phalloidin을 사용한 사이토졸에서의 F-action filament의 면역염색 결과, 소도 세포간의 밀착결합(tight junction) 정도가 ICC 크기가 증가할 수록 약해짐을 알 수 있었다.
또한, 도 10에 나타난 바와 같이, 저산소증 마커 HIF-1α, VEGF에 대한 면역염색 결과, 700㎛ 의 오목 마이크로 웰 상에서 형성된 클러스터에서는 저산소상태가 확인 되었다.
이러한 결과는 편평한 웰상에서 형성된 클러스터 및 직경이 큰 오목 마이크로 웰에서 형성된 클러스터에서는 소도 세포간 상호작용이 약하지만, 작은 직경을 가지는 U자 형상의 오목 마이크로 웰 상에서 형성된 클러스터에서는 적합한 직경에 따른 오목 마이크로 웰이 가지는 미세중력의 영향에 의해 소도 세포간 상호작용이 강하게 나타남을 보여준다.
상기 설명에 제시된 기법의 이점을 갖는 본 발명의 변형 및 기타 구체예는 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 본 발명은 본원에 기술된 특정 구체예에 한정되는 것이 아니며, 기타 구체예가 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되는 것으로 여겨진다. 특정 용어가 사용되었지만, 이들은 한정을 위해서가 아니라 일반적이고 기술적으로 사용된 것이다.

Claims (13)

  1. 250 ~ 350 ㎛ 직경을 가지는 U타입 오목 마이크로 웰을 이용하는 것을 특징으로 하는, 췌장 소도 세포의 클러스터 형성방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 U타입 오목 마이크로 웰의 직경은 300 ㎛인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 방법은 FBS 및 항생제가 첨가된 RPMI 1640 배지를 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 췌장 소도 세포의 클러스터는 U타입 오목 마이크로 웰 상에서 10~15일 동안 배양함으로써 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 췌장 소도 세포의 클러스터는 U타입 오목 마이크로 웰 상에서 14일 동안 배양함으로써 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 U타입 오목 마이크로 웰 상에서의 배양은
    250 ~ 350 ㎛ 직경을 가지는 U타입 오목 마이크로 웰의 U 형태로 인해 생기는 미세중력에 췌장 소도 세포를 노출시키는 것을 의미하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 형성된 췌장 소도 세포 클러스터는 직경이 50 ~ 100 ㎛ 인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제1항에 있어서, 상기 U타입 오목 마이크로 웰은 폴리디메틸실록산(polydimethlsiloxane, PDMS)으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
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KR101823205B1 (ko) 2015-09-04 2018-03-08 영남대학교 산학협력단 약물을 봉입한 이식 치료용 세포 클러스터 및 이의 제조방법
KR102051525B1 (ko) * 2017-04-25 2019-12-05 한양대학교 산학협력단 고생존율 및 고기능성 내분비 세포클러스터의 제조방법
WO2018199617A1 (ko) * 2017-04-25 2018-11-01 한양대학교 산학협력단 고생존율 및 고기능성 내분비 세포클러스터의 제조방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lechner, A. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, vol.327, pp.581-588 (2005) *

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