CN103237885B - 用于细胞归巢和脂肪形成的组合物和方法 - Google Patents

用于细胞归巢和脂肪形成的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

提供一种引起细胞迁移到支架并在该处分化以形成脂肪细胞或组织或者脂肪样细胞或组织的方法。还提供一种治疗患有组织缺陷的哺乳动物的方法。进一步提供的是包括细胞归巢组合物和脂肪形成组合物的组织支架。此外，提供一种制备组织支架的方法，所述组织支架能够募集细胞并分化所募集的细胞以形成脂肪细胞或组织或者脂肪样细胞或组织。

Description

用于细胞归巢和脂肪形成的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求享有2010年10月1日提交的美国临时申请系列号61/388,922的权益，该申请在此完整引入作为参考。
关于联邦政府资助研究或开发的声明
本发明是在国立卫生研究院资助的R01EB06362和RC2DE020767的政府支持下完成的。政府对本发明享有一些权利。
通过参考引入的材料
不适用。
发明领域
本发明一般涉及脂肪组织的产生和再生。
发明背景
对于软组织损伤、乳腺癌缺陷、面部缺陷、脂肪萎缩的重建以及对于软组织增大，脂肪组织是关键的需求。临床上，一般实践是自体脂肪转移。从患者身体的一部分收集自体组织移植物，用于另一部分的重建。该技术的关键缺点包括供体部位受损以及随着时间的体积损失。自体脂肪转移后的体积减小可以高达70%。实验上，已将脂肪和骨髓干细胞或前脂肪细胞移植入天然或合成材料用于脂肪组织再生(参见例如，Gomillion和Burg2006Biomaterials6052-6063)。但是，通常需要大量干/祖细胞，但其在患者中是缺乏的。
发明概述
本文所公开的内容的教导包括形成脂肪组织的方法。
一方面提供形成脂肪组织的方法。在一些实施方案中，所述方法包括提供支架。在一些实施方案中，所述支架与祖细胞(progenitorcell)液体联通。在一些实施方案中，诱导祖细胞迁移至支架内或支架上。在一些实施方案中，当祖细胞在支架内或支架上时，诱导其形成脂肪细胞或脂肪样细胞。
在一些实施方案中，所述支架包括有效量的细胞归巢组合物(cellhomingcomposition)。在一些实施方案中，所述支架包括脂肪形成组合物。在一些实施方案中，所述支架不包括移植的细胞。
另一个方面提供治疗患有软组织缺陷的对象的方法。在一些实施方案中，治疗患有软组织缺陷的对象的方法包括将支架植入有需要的对象。在一些实施方案中，所述支架包括有效量的细胞归巢组合物。在一些实施方案中，细胞归巢组合物的有效量是诱导祖细胞迁移至支架内或支架上的量。在一些实施方案中，所述支架包括脂肪形成组合物。在一些实施方案中，脂肪形成组合物诱导从祖细胞形成脂肪细胞或脂肪样细胞。在一些实施方案中，所述支架在植入对象前不包括移植的细胞。
另一个方面提供一种软组织构建体。在一些实施方案中，所述构建体包括具有有效量细胞归巢组合物的支架。在一些实施方案中，细胞归巢组合物的有效量是诱导祖细胞迁移至支架内或支架上的量。在一些实施方案中，所述构建体包括具有有效量脂肪形成组合物的支架。在一些实施方案中，有效量的脂肪形成组合物诱导从祖细胞形成脂肪细胞或脂肪样细胞。在一些实施方案中，所述支架在植入对象前不包括移植的细胞。在一些实施方案中，所述支架与祖细胞液体联通。在一些配置中，当支架与祖细胞液体联通时，有效量的细胞归巢组合物可以诱导祖细胞迁移至支架内或支架上。
在一些实施方案中，细胞归巢组合物可以包括胰岛素样生长因子1(IGF1)。在一些配置中，IGF1可以是约0.1/250至约250/250(μgIGF1每mg支架)的比例。在一些实施方案中，细胞归巢组合物可以包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。在一些配置中，bFGF可以是约0.1/250至约250/250(μgbFGF每mg支架)的比例。在一些实施方案中，细胞归巢组合物可以包括IGF1和bFGF两者。在一些配置中，IGF1可以是约0.1/250至约250/250(μgIGF1每mg支架)，bFGF可以是约0.1/250至约250/250(μgbFGF每mg支架)的比例。
在一些实施方案中，包括γ分泌酶抑制剂。在一些实施方案中，支架包括γ分泌酶抑制剂。在一些实施方案中，细胞归巢组合物包括γ分泌酶抑制剂。在一些实施方案中，脂肪形成组合物包括γ分泌酶抑制剂。在一些配置中，按照有效减轻、实质上减轻、或消除脂肪形成的抑制(由祖细胞包含的EGF受体所引起)的量提供γ分泌酶抑制剂。在一些配置中，γ分泌酶抑制剂可以具有约1.0μM至约100μM的浓度。在一些配置中，γ分泌酶抑制剂可以具有约0.1/250至约250/250(μgγ分泌酶抑制剂每mg支架)的比例。
在一些实施方案中，包括Notchγ分泌酶抑制剂。在一些实施方案中，支架包括Notchγ分泌酶抑制剂。在一些实施方案中，细胞归巢组合物包括Notchγ分泌酶抑制剂。在一些实施方案中，脂肪形成组合物包括Notchγ分泌酶抑制剂。在一些配置中，按照有效减轻、实质上减轻、或消除脂肪形成的抑制(由祖细胞包含的EGF受体所引起)的量提供Notchγ分泌酶抑制剂。在一些配置中，Notchγ分泌酶抑制剂可以具有约1.0μM至约100μM的浓度。在一些配置中，Notchγ分泌酶抑制剂可以具有约0.1/250至约250/250(μg抑制剂每mg支架)的比例。
在一些实施方案中，包括MAPk抑制剂。在一些实施方案中，支架包括MAPk抑制剂。在一些实施方案中，细胞归巢组合物包括MAPk抑制剂。在一些实施方案中，脂肪形成组合物包括MAPk抑制剂。在一些配置中，按照有效减轻、实质上减轻、或消除脂肪形成的抑制(由祖细胞包含的EGF受体引起)的量提供MAPk抑制剂。在一些配置中，MAPk抑制剂可以具有约1.0μM至约100μM的浓度。在一些配置中，MAPk抑制剂可以具有约0.1/250至约250/250(μg抑制剂每mg支架)的比例。
在一些实施方案中，脂肪形成组合物包括吲哚美辛、胰岛素、异丁基-甲基黄嘌呤(IBMX)、地塞米松、或Pyrintegrin中的一种或多种。在一些配置中，吲哚美辛以约0.1/250至约250/250(mg吲哚美辛每mg支架)的比例存在。在一些配置中，胰岛素以约0.1/250至约250/250(mg胰岛素每mg支架)的比例存在。在一些配置中，IBMX以约0.1/250至约250/250(mgIBMX每mg支架)的比例存在。在一些配置中，地塞米松以约0.1/250至约250/250(mg地塞米松每mg支架)的比例存在。在一些配置中，Pyrintegrin以约0.1/250至约250/250(mgPyrintegrin每mg支架)的比例存在。
在一些实施方案中，祖细胞是脂肪组织来源的细胞、前脂肪细胞、间充质干细胞(MSC)、MSC-来源的细胞、或脂肪细胞。在一些实施方案中，祖细胞包括脂肪组织来源的细胞、前脂肪细胞、间充质干细胞(MSC)、MSC-来源的细胞、或脂肪细胞中的一种或多种。
在一些实施方案中，支架包括生物相容性(biocompatible)基质材料。在一些配置中，支架包括聚(乳酸-共-羟基乙酸)(poly(lactic-co-glycolicacid),PLGA)。在一些配置中，支架包括至少一个物理通道。
在一些实施方案中，祖细胞以约0.0001百万细胞(M)ml-1至约1000Mml-1的密度存在于支架中。在一些实施方案中，脂肪细胞或脂肪样细胞以约0.0001百万细胞(M)ml-1至约1000Mml-1的密度存在于支架中。
下文中将部分显现以及部分指出其它的目的和特征。
附图说明
本领域技术人员将理解如下所述的附图只是为了说明目的。任何情况下所述附图都不是用于限制本教导的范围。
图1是一系列图像和柱状图，显示利用微球包裹的脂肪形成混合物培养10天的C3H10T1/2细胞的脂肪形成，所述脂肪形成混合物包括吲哚美辛、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和地塞米松。图1A显示阴性对照(AI)、5mg(AII)、10mg(AIII)、15mg(AIV)、20mg(AV)微球和阳性对照(AVI)的H&E和油红-O染色。图1B显示分化为脂肪细胞的细胞百分比。图1C显示利用油红-O检测到的脂质积聚。*p<0.05**p<0.01***p<0.005。关于方法学的更多细节在实施例1中提供。
图2是一系列图像，显示来自具有C3H10T1/2细胞和微球的不同组合的支架的组织切片，所述支架被置于肥胖C57BL/6NHsd小鼠的下腹部皮下脂肪垫中两周。图2A显示空支架。图2B显示具有500KC3H10T1/2细胞的支架。图2C显示具有5mg脂肪形成微球的支架。图2D显示具有5mg脂肪形成微球和500KC3H10T1/2细胞的支架。图2E显示具有2.5mgIGF1微球的支架。图2F显示具有2.5mgIGF-1微球和500KC3H10T1/2细胞的支架。×20放大率。关于方法学的更多细节在实施例1中提供。
图3是一系列图像，显示具有C3H10T1/2细胞和微球的不同组合的支架，所述支架被置于肥胖C57BL/6NHsd小鼠的下腹部皮下脂肪垫中两周。图3A显示空支架。图3B显示具有500KC3H10T1/2细胞的支架。图3C显示具有5mg脂肪形成微球的支架。图3D显示具有5mg脂肪形成微球和500KC3H10T1/2细胞的支架。图3E显示具有2.5mgIGF1微球的支架。图3F显示具有2.5mgIGF1微球和500KC3H10T1/2细胞的支架。×40放大率。关于方法学的更多细节在实施例1中提供。
图4是线图和散布图，显示用下述物质处理的hADSCs的PPARγ表达在28天期间的变化：对照培养基；脂肪形成分化培养基(ADM);ADM加10μMNotchγ分泌酶抑制剂(Inh1)(ADM+Inh1);ADM加10μMMAPK抑制剂(Inh2)(ADM+Inh2);和ADM加10μMInh1和Inh2(ADM+Inh1、2)。
图5是线图和散布图，显示用下述物质处理的hADSCs的C/EBPα表达在28天期间的变化：对照培养基；脂肪形成分化培养基(ADM);ADM加10μMNotchγ分泌酶抑制剂(Inh1)(ADM+Inh1);ADM加10μMMAPK抑制剂(Inh2)(ADM+Inh2);和ADM加10μMInh1和Inh2(ADM+Inh1、2)。
图6是一系列用下述物质处理hDSCs后四周产生的亮视野图像：(图6A)ADM;(图6B)ADM+Inh1;(图6C)ADM+Inh2;和(图6D)ADM+Inh1、2。
图7是柱状图，显示在处理后两和四周，用下述物质处理的hADSCs中测量的脂联素含量：对照培养基；脂肪形成分化培养基(ADM);ADM加10μMNotchγ分泌酶抑制剂(Inh1)(ADM+Inh1);ADM加10μMMAPK抑制剂(Inh2)(ADM+Inh2)，以及ADM加10μMInh1和Inh2(ADM+Inh1、2)。
图8是柱状图，显示在处理后两和四周，用下述物质处理的hADSCs中测量的瘦素含量：对照培养基；脂肪形成分化培养基(ADM);ADM加10μMNotchγ分泌酶抑制剂(Inh1)(ADM+Inh1);ADM加10μMMAPK抑制剂(Inh2)(ADM+Inh2)，以及ADM加10μMInh1和Inh2(ADM+Inh1、2)。
图9是用下述物质处理的hADSCs中28天期间测量的PPARγ表达的线图和散布图：对照培养基；脂肪形成分化培养基(ADM);和ADM加2μMPyrintegrin(ADM+Pyrintegrin)。
图10是用下述物质处理的hADSCs中28天期间测量的C/EBPα表达的线图和散布图：对照培养基；脂肪形成分化培养基(ADM);和ADM加2μMPyrintegrin(ADM+Pyrintegrin)。
图11是一对图像，显示用下述物质处理hDSCs四周后进行的脂质染色：(图11A)ADM；和(图11B)ADM加Pyrintegrin(ADM+Pyrintegrin)。
图12是柱状图，显示在处理后两周和四周，用下述物质处理的hADSCs中测量的脂联素含量：对照培养基；脂肪形成分化培养基(ADM)；以及ADM加2μMPyrintegrin(ADM+药物)。
图13是柱状图，显示在处理后两周和四周，用下述物质处理的hADSCs中测量的脂联素含量：对照培养基；脂肪形成分化培养基(ADM)；以及ADM加2μMPyrintegrin(ADM+药物)。
图14是柱状图，显示在处理后两周和四周，用下述物质处理的hADSCs中测量的瘦素含量：对照培养基；脂肪形成分化培养基(ADM)；以及ADM加2μMPyrintegrin(ADM+药物)。
图15是柱状图，显示在处理后两周和四周，用下述物质处理的hADSCs中测量的甘油含量：对照培养基；脂肪形成分化培养基(ADM)；以及ADM加2μMPyrintegrin(ADM+药物)。
图16是一系列图像，显示在用下述物质处理1小时后hADSCs中进行的Western印迹分析：对照培养基(对照)；脂肪形成分化培养基(ADM)；ADM加2μMPyrintegrin(ADM+药物)；和单独的Pyrintegrin(药物)。
图17是一系列图像，显示在用下述物质处理1小时后hADSCs中进行的Western印迹分析：对照培养基(对照)；脂肪形成分化培养基(ADM)；ADM加2μMPyrintegrin(ADM+药物)；和单独的Pyrintegrin(药物)。
发明详述
本文内容至少部分基于以下观察，宿主内源细胞的归巢可以用作体内脂肪组织再生的细胞来源。如本文所示，体外和体内实验显示充满各种脂肪形成因子混合物的PLGA支架可以促进脂肪形成。此外，具有生长/归巢因子的支架能够将细胞归巢入支架。因此，脂肪形成混合物和各种归巢或血管生成因子的组合可在相同支架内提供脂肪形成和细胞归巢。本文描述的结果支持通过细胞归巢引起的脂肪再生效果，这是一种与细胞移植相比至少同样有效，并且在许多方面更有益的方法。
通过细胞归巢引起的脂肪组织再生可以用作软组织重建或增大的替代或辅助方法。与自体组织移植相比，基于细胞归巢的疗法的关键优点之一是将供体部位发病率降到最低。
对于软组织重建和/或增大来说，细胞归巢相对细胞移植提供大量优势(一般参见Maoetal.2010TissueEngineeringPartB:Reviews16(2),257-262)。
宿主内源细胞的诱导归巢可以克服与细胞移植相关的关键科学、技术、商业化和行政问题，诸如潜在的污染、成本超支、免疫排斥、病原体传播、以及当前临床医生缺乏对处理细胞的训练。用于细胞归巢的生物活性物质(cues)，诸如细胞因子或趋化因子，可以容易地被包装和输送用于单次步骤，这与细胞移植相关的频繁多次步骤相反。对于用于细胞因子和趋化因子输送此前存在管理许可。细胞归巢方法受益于包装和保存的分子输送产品的更方便的临床输送。细胞归巢方法将机体自身的再生能力最大化。
细胞归巢涉及将内源细胞(包括干/祖细胞)主动募集入解剖小室(anatomiccompartment)。可以使用生物材料支架(采用感兴趣组织的形状，并包含各种化学引诱剂以将特定细胞募集入生物材料形成组织)来进行通过细胞归巢的组织再生。
提供一种将细胞归巢入支架并结合脂肪形成促进的方法。在各种实施方案中，将控释的脂肪形成组合物和控释的细胞归巢组合物导入支架或基质材料。可以在体外、离体(exvivo)、或体内将支架温育。细胞归巢组合物可以增加细胞(包括祖细胞)迁移入支架或基质材料。脂肪形成组合物可以促进细胞诸如祖细胞分化为脂肪细胞或组织或者脂肪样细胞或组织。
细胞归巢组合物
本文描述的各种实施方案使用促进细胞迁移的细胞归巢组合物。例如，可以在支架中包括控释细胞归巢组合物，以便促进细胞迁移至支架内或支架上。作为另一个实例，可以在支架中包括控释细胞归巢组合物，以便促进细胞迁移至支架内或支架上，然后通过脂肪形成组合物诱导所述支架分化脂肪或脂肪样细胞。
细胞归巢组合物可以包括一种或更多种胰岛素样生长因子1(IGF1)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。例如，细胞归巢组合物可以包括IGF1。作为另一个实例，细胞归巢组合物可以包括bFGF。作为另一个实例，脂肪形成组合物可以包括IGF1和bFGF。
细胞归巢组合物中可以包括IGF1。在一些实施方案中，IGF1可以包裹在微球中。例如，IGF1可以按照约0.1/250至约250/250(μgIGF1每mg微球材料)的比例包裹在微球中。例如，IGF1可以按照约0.1/250;约0.5/250;约1/250;约2/250;约3/250;约4/250;约5/250;约6/250;约7/250;约8/250;约9/250;约10/250;约11/250;约12/250;约13/250;约14/250;约15/250;约16/250;约17/250;约18/250;约19/250;约20/250;约25/250;约30/250;约35/250;约40/250;约45/250;约50/250;约60/250;约70/250;约80/250;约90/250;约100/250;约150/250;约200/250;或约250/250(μgIGF1每mg微球材料)的比例包裹在微球中。作为另一个实例，IGF1可以按照约10μg/250mg微球材料的比例包裹在微球中(参见实施例1)。
细胞归巢组合物中可以包括bFGF。在一些实施方案中，bFGF可以包裹在微球中。例如，bFGF可以按照约0.1/250至约250/250(μgbFGF每mg微球材料)的比例包裹在微球中。例如，bFGF可以按照约0.1/250;约0.5/250;约1/250;约2/250;约3/250;约4/250;约5/250;约6/250;约7/250;约8/250;约9/250;约10/250;约11/250;约12/250;约13/250;约14/250;约15/250;约16/250;约17/250;约18/250;约19/250;约20/250;约25/250;约30/250;约35/250;约40/250;约45/250;约50/250;约60/250;约70/250;约80/250;约90/250;约100/250;约150/250;约200/250;或约250/250(μgbFGF每mg微球材料)的比例包裹在微球中。作为另一个实例，bFGF可以按照约10μg/250mg微球材料的比例包裹在微球中(参见实施例1)。
如下文进一步所述，细胞归巢组合物中可以包括γ分泌酶抑制剂。
祖细胞
本文描述的各种组合物和方法提供祖细胞的募集，祖细胞的诱导迁移，或祖细胞的诱导分化。一些实施方案促进祖细胞迁移入一种支架或基质材料，诱导从祖细胞形成脂肪或脂肪样细胞，或者两者。
祖细胞是未分化或部分未分化的细胞，可以分裂和增殖以产生未分化或部分未分化的细胞，或可以分化以产生至少一种分化或专化的细胞。祖细胞可以是多潜能(pluripotent)细胞，这表示所述细胞在分化时能够自更新和反分化为多种组织类型。多潜能祖细胞包括干细胞，诸如胚胎干细胞和成人干细胞。祖细胞可以是多能(multipotent)细胞。祖细胞可以自更新。例如，祖细胞可以是干细胞。作为另一个实例，祖细胞可以是成人干细胞。在一些实施方案中，祖细胞可以分化为，或另外形成，脂肪细胞或脂肪细胞样细胞。在一些实施方案中，祖细胞可以分化为、或另外形成脂肪细胞或脂肪样细胞。例如，祖细胞可以是脂肪组织来源的细胞、前脂肪细胞、间充质干细胞(MSC)、MSC-来源的细胞、或脂肪细胞。
祖细胞可以通过各种方法分离，纯化，或培养。用于分离和培养祖细胞的方法描述于，例如，Vunjak-Novakovic和Freshney(2006)CultureofCellsforTissueEngineering,Wiley-Liss,ISBN-100471629359。祖细胞可以包含于，或来源于，动物，包括但不限于，哺乳动物、爬行动物，和鸟类，更优选马、牛、狗、猫、绵羊、猪、和鸡，最优选人。
在一些实施方案中，祖细胞以约0.0001百万细胞(M)ml-1到约1000Mml-1的密度迁移入支架或基质材料中。例如，祖细胞可以按照以下密度迁移入支架或基质材料中：1Mml-1、5Mml-1、10Mml-1、15Mml-1、20Mml-1、25Mml-1、30Mml-1、35Mml-1、40Mml-1、45Mml-1、50Mml-1、55Mml-1、60Mml-1、65Mml-1、70Mml-1、75Mml-1、80Mml-1、85Mml-1、90Mml-1、95Mml-1、或100Mml-1。
脂肪形成组合物
本文描述的各种实施方案使用促进脂肪形成的脂肪形成组合物。例如，支架可以包括控释脂肪形成组合物，以便促进支架内或支架上的细胞分化为脂肪或脂肪样细胞。作为另一个实例，支架可以包括控释脂肪形成组合物，以便促进细胞(针对支架中还包括的细胞归巢组合物的响应，所述细胞迁移至支架内或支架上)的脂肪形成分化。各种脂肪形成组合物是本领域已知的(参见例如,GomillionandBurg2006Biomaterials6052-6063;Poulousetal.2010ExpBiolMed235,1185-1193)。
脂肪形成组合物包括吲哚美辛、胰岛素、异丁基-甲基黄嘌呤(IBMX)、或地塞米松中的一种或多种。例如，脂肪形成组合物可以包括吲哚美辛。作为另一个实例，脂肪形成组合物可以包括胰岛素。作为另一个实例，脂肪形成组合物可以包括IBMX。作为另一个实例，脂肪形成组合物可以包括地塞米松。作为另一个实例，脂肪形成组合物可以包括吲哚美辛、胰岛素、IBMX、和地塞米松。
脂肪形成组合物中可以包括吲哚美辛。在一些实施方案中，吲哚美辛可以包裹在微球中。例如，吲哚美辛可以按照约0.1/250至约250/250(mg吲哚美辛每mg微球材料)的比例包裹在微球中。例如，吲哚美辛可以按照以下比例包裹在微球中：约0.1/250;约0.5/250;约1/250;约2/250;约3/250;约4/250;约5/250;约6/250;约7/250;约8/250;约9/250;约10/250;约11/250;约12/250;约13/250;约14/250;约15/250;约16/250;约17/250;约18/250;约19/250;约20/250;约25/250;约30/250;约35/250;约40/250;约45/250;约50/250;约60/250;约70/250;约80/250;约90/250;约100/250;约150/250;约200/250;或约250/250(mg吲哚美辛每mg微球材料)。作为另一个实例，吲哚美辛可以按照约5.15mg/250mg微球材料的比例包裹在微球中(参见实施例1)。
脂肪形成组合物中可以包括胰岛素。在一些实施方案中，胰岛素可以包裹在微球中。例如，胰岛素可以按照约0.1/250至约250/250(mg胰岛素每mg微球材料)的比例包裹在微球中。例如，吲哚美辛可以按照以下比例包裹在微球中：约0.1/250;0.2/250;0.3/250;0.4/250;0.5/250;0.6/250;0.7/250;0.8/250;0.9/250;约1/250;约2/250;约3/250;约4/250;约5/250;约6/250;约7/250;约8/250;约9/250;约10/250;约15/250;约20/250;约25/250;约30/250;约35/250;约40/250;约45/250;约50/250;约60/250;约70/250;约80/250;约90/250;约100/250;约150/250;约200/250;或约250/250(mg胰岛素每mg微球材料)。作为另一个实例，胰岛素可以按照约1mg/250mg微球材料的比例包裹在微球中(参见实施例1)。
脂肪形成组合物中可以包括IBMX。在一些实施方案中，IBMX可以包裹在微球中。例如，IBMX可以按照约0.1/250至约250/250(mgIBMX每mg微球材料)的比例包裹在微球中。例如，IBMX可以按照以下比例包裹在微球中：约0.1/250;约0.5/250;约1/250;约2/250;约3/250;约4/250;约5/250;约6/250;约7/250;约8/250;约9/250;约10/250;约11/250;约12/250;约13/250;约14/250;约15/250;约16/250;约17/250;约18/250;约19/250;约20/250;约25/250;约30/250;约35/250;约40/250;约45/250;约50/250;约60/250;约70/250;约80/250;约90/250;约100/250;约150/250;约200/250;或约250/250(mgIBMX每mg微球材料)。作为另一个实例，IBMX可以按照约11.1mg/250mg微球材料的比例包裹在微球中(参见实施例1)。
脂肪形成组合物中可以包括地塞米松。在一些实施方案中，地塞米松可以包裹在微球中。例如，地塞米松可以按照约0.1/250至约250/250(mg地塞米松每mg微球材料)的比例包裹在微球中。例如，地塞米松可以按照以下比例包裹在微球中：约0.1/250;约0.5/250;约1/250;约5/250;约10/250;约15/250;约20/250;约25/250;约30/250;约31/250;约32/250;约33/250;约34/250;约35/250;约36/250;约37/250;约38/250;约39/250;约40/250;约41/250;约42/250;约43/250;约44/250;约45/250;约46/250;约47/250;约48/250;约49/250;约50/250;约60/250;约70/250;约80/250;约90/250;约100/250;约150/250;约200/250;或约250/250(mg地塞米松每mg微球材料)。作为另一个实例，地塞米松可以按照约39.2mg/250mg微球材料的比例包裹在微球中(参见实施例1)。
脂肪形成组合物可以包含促进祖细胞存活的物质。例如，脂肪形成组合物可以包括Pyrintegrin(N-(环丙基甲基)-4-(4-(6-羟基-3,4-二氢喹啉-1-(2H)-基)嘧啶-2-基氨基)苯磺酰氨)。通过保护细胞表面蛋白e-钙粘蛋白免遭破坏，Pyrintegrin可以促进干细胞(例如,hESC)存活。在一些实施方案中，Pyrintegrin可以包裹在微球中。例如，Pyrintegrin可以按照约0.1/250至约250/250(mgPyrintegrin每mg微球材料)的比例包裹在微球中。例如，Pyrintegrin可以按照以下比例包裹在微球中：约0.1/250;约0.5/250;约1/250;约5/250;约10/250;约15/250;约20/250;约25/250;约30/250;约31/250;约32/250;约33/250;约34/250;约35/250;约36/250;约37/250;约38/250;约39/250;约40/250;约41/250;约42/250;约43/250;约44/250;约45/250;约46/250;约47/250;约48/250;约49/250;约50/250;约60/250;约70/250;约80/250;约90/250;约100/250;约150/250;约200/250;或约250/250(mgPyrintegrin每mg微球材料)。如本文所示，Pyrintegrin可以有效诱导hADSCs的PPARγ表达(参见例如，实施例8)；诱导hADSCs的C/EBPα表达(参见例如，实施例9)；诱导脂质积聚(参见例如，实施例10)；诱导脂肪形成分化(参见例如，实施例11)；增强hADSCs的脂联素细胞因子分泌(参见例如，实施例12)；增强瘦素细胞因子的分泌；(参见例如，实施例13)；增强甘油的分泌(参见例如，实施例14)；抑制BMP途径(参见，实施例15)；和/或不抑制TGFβ/活化素。
可以按照不同组合将吲哚美辛、胰岛素、异丁基-甲基黄嘌呤(IBMX)、地塞米松、和Pyrintegrin中的一种或多种组合在脂肪形成组合物中，例如，根据上文所列的单独挑选的浓度。
如下文进一步所述，脂肪形成组合物中可以包括γ分泌酶抑制、Notchγ分泌酶抑制剂、或MAPk抑制剂。
脂肪细胞
本文描述的各种实施方案诱导从祖细胞形成脂肪或脂肪样细胞。脂肪细胞可以由祖细胞形成。脂肪细胞可以由前脂肪细胞或干细胞(诸如间充质干细胞)形成。在各种实施方案中，脂肪或脂肪样细胞由祖细胞分化而成。
通过检测脂肪特异性标记物可以鉴定脂肪或脂肪样细胞，或包含上述细胞的组织(参见例如,Poulousetal.2010ExpBiolMed235,1185-1193)。例如，通过检测一种或更多种早期脂肪特异性标记物可以鉴定脂肪或脂肪样细胞，或包含上述细胞的组织，所述标记物诸如ADFP(脂肪分化相关蛋白,亦称adipophilin)、pOb24、脂蛋白脂肪酶、或pGH3。作为另一个实例，通过检测一种或更多种晚期脂肪特异性标记物可以鉴定脂肪或脂肪样细胞，或包含上述细胞的组织，所述标记物诸如脂肪生成酶(通常包括磷酸甘油脱氢酶，具体的是甘油-3-磷酸脱氢酶)、aP2、和脂肪酶。作为另一个实例，利用CD34标记物通过检测脂肪干细胞，可以鉴定脂肪或脂肪样细胞，或包含上述细胞的组织。作为另一个实例，通过检测三酰基甘油的积聚，可以鉴定脂肪或脂肪样细胞，或包含上述细胞的组织。作为另一个实例，利用油红-O通过检测脂质积聚，可以鉴定脂肪或脂肪样细胞，或包含上述细胞的组织(参见实施例1)。脂肪样细胞是展示一种或更多种脂肪细胞相关标记物(诸如上述那些脂肪标记物中的任一种)的细胞。
在一些实施方案中，脂肪细胞或脂肪样细胞以约0.0001百万细胞(M)ml-1至约1000Mml-1的密度在支架或基质材料中形成。例如，脂肪或脂肪样细胞可以按照以下密度在支架或基质材料中形成：约1Mml-1、5Mml-1、10Mml-1、15Mml-1、20Mml-1、25Mml-1、30Mml-1、35Mml-1、40Mml-1、45Mml-1、50Mml-1、55Mml-1、60Mml-1、65Mml-1、70Mml-1、75Mml-1、80Mml-1、85Mml-1、90Mml-1、95Mml-1、或100Mml-1。
脂肪形成抑制的衰减子(attenuator)
本文内容提供用于减轻或消除脂肪形成抑制的组合物和方法。在各种实施方案中，可以使用蛋白激酶激动剂或抑制剂，诸如表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂来增加脂肪形成。
可以在本文描述的组合物和方法中使用γ(gamma)分泌酶抑制剂，以便增加脂肪形成。γ分泌酶是膜内在蛋白质，其切割单通道(single-pass)跨膜蛋白。可以从各种来源商购获得γ分泌酶抑制剂(例如,TocrisBioscience,MO;SantaCruzBiotechnology,Inc.,CA;AxonMedchem,TheNetherlands)。γ分泌酶抑制剂包括但不限于DAPT、JLK6、化合物W、化合物Esc-222308、和DBZ。
如本文所示，γ分泌酶抑制剂导致三天后脂肪形成特异性标记物最高10倍的增加；并且在4周后，导致甘油和瘦素的水平增加(参见例如，实施例2)。因此，通过减弱EGF受体(其在祖细胞诸如造血干细胞中是富集的)的功效，可以增强脂肪形成。此外，如本文所示，Notchγ分泌酶抑制剂(Inh1)上调PPARγ表达(参见例如，实施例3)；上调C/EBPα表达(参见例如，实施例4)；诱导脂质积聚(参见例如，实施例5)；或起始脂联素细胞因子的分泌(参见例如，实施例6)。
可以在本文描述的组合物和方法中使用丝裂原活化的蛋白激酶(MAPk)抑制剂，以便增加脂肪形成。如本文所示，MAPk抑制剂(Inh2)上调PPARγ表达(参见例如，实施例3)；上调C/EBPα表达(参见例如，实施例4)；诱导脂质积聚(参见例如，实施例5)；或起始脂联素细胞因子的分泌(参见例如，实施例6)。
可以在支架或基质材料中包括上述减弱脂肪形成抑制剂的物质(包括但不限于γ分泌酶抑制剂、Notchγ分泌酶抑制剂、或MAPk抑制剂)。可以在细胞归巢组合物中包括上述减弱脂肪形成抑制剂的物质(包括但不限于γ分泌酶抑制剂、Notchγ分泌酶抑制剂、或MAPk抑制剂)。可以在脂肪形成组合物中包括上述减弱脂肪形成抑制剂的物质(包括但不限于γ分泌酶抑制剂、Notchγ分泌酶抑制剂、或MAPk抑制剂)。
减弱脂肪形成抑制剂的物质(包括但不限于γ分泌酶抑制剂、Notchγ分泌酶抑制剂、或MAPk抑制剂)可以按照约0.1μM至约1,000μM的浓度存在。
例如，γ分泌酶抑制剂可以按照约1.0μM至约100μM的浓度存在。作为另一个实例，γ分泌酶抑制剂可以按照以下浓度存在：约0.1、约0.5、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、或约20μM、约50μM、或约100μM。作为另一个实例，γ分泌酶抑制剂可以按照约10μM的浓度存在(参见实施例2)。
作为另一个实例，Notchγ分泌酶抑制剂可以按照约1.0μM至约100μM的浓度存在。作为另一个实例，Notchγ分泌酶抑制剂可以按照以下浓度存在：约0.1、约0.5、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、或约20μM、约50μM、或约100μM。作为另一个实例，Notchγ分泌酶抑制剂可以按照约10μM的浓度存在。
作为另一个实例，MAPk抑制剂可以按照约1.0μM至约100μM的浓度存在。作为另一个实例，MAPk抑制剂可以按照以下浓度存在：约0.1、约0.5、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、或约20μM、约50μM、或约100μM。作为另一个实例，MAPk抑制剂可以按照约10μM的浓度存在。
在一些实施方案中，可以将减弱脂肪形成抑制剂的物质(包括但不限于γ分泌酶抑制剂、Notchγ分泌酶抑制剂、或MAPk抑制剂)包裹在微球中。
例如，γ分泌酶抑制剂可以按照约0.1/250至约250/250(μg抑制剂每mg微球材料)的比例包裹在微球中。例如，γ分泌酶抑制剂可以按照以下比例包裹在微球中：约0.1/250;约0.5/250;约1/250;约2/250;约3/250;约4/250;约5/250;约6/250;约7/250;约8/250;约9/250;约10/250;约11/250;约12/250;约13/250;约14/250;约15/250;约16/250;约17/250;约18/250;约19/250;约20/250;约25/250;约30/250;约35/250;约40/250;约45/250;约50/250;约60/250;约70/250;约80/250;约90/250;约100/250;约150/250;约200/250;或约250/250μg抑制剂每mg微球材料。
作为另一个实例，Notchγ分泌酶抑制剂可以按照约0.1/250至约250/250(μg抑制剂每mg微球材料)的比例包裹在微球中。例如，Notchγ分泌酶抑制剂可以按照以下比例包裹在微球中：约0.1/250;约0.5/250;约1/250;约2/250;约3/250;约4/250;约5/250;约6/250;约7/250;约8/250;约9/250;约10/250;约11/250;约12/250;约13/250;约14/250;约15/250;约16/250;约17/250;约18/250;约19/250;约20/250;约25/250;约30/250;约35/250;约40/250;约45/250;约50/250;约60/250;约70/250;约80/250;约90/250;约100/250;约150/250;约200/250;或约250/250μg抑制剂每mg微球材料。
作为另一个实例，MAPk分泌酶抑制剂可以按照约0.1/250至约250/250(μg抑制剂每mg微球材料)的比例包裹在微球中。例如，MAPk抑制剂可以按照以下比例包裹在微球中：约0.1/250;约0.5/250;约1/250;约2/250;约3/250;约4/250;约5/250;约6/250;约7/250;约8/250;约9/250;约10/250;约11/250;约12/250;约13/250;约14/250;约15/250;约16/250;约17/250;约18/250;约19/250;约20/250;约25/250;约30/250;约35/250;约40/250;约45/250;约50/250;约60/250;约70/250;约80/250;约90/250;约100/250;约150/250;约200/250;或约250/250μg抑制剂每mg微球材料。
在一些实施方案中，可以在本文所述的组合物或方法中顺序或同时使用减弱脂肪形成抑制剂的一种或更多种物质(包括但不限于γ分泌酶抑制剂、Notchγ分泌酶抑制剂、或MAPk抑制剂)。例如，Notchγ分泌酶抑制剂和MAPk抑制剂的联合治疗显示提供叠加或协同效果，上调PPARγ表达(参见例如，实施例3)；上调C/EBPα表达(参见例如，实施例4)；诱导脂质积聚(参见例如，实施例5)；或起始脂联素细胞因子的分泌(参见例如，实施例6)。
制剂
本文描述的物质和组合物可以使用一种或更多种药学上可接受的载体或赋形剂通过任意常规方式进行配制，描述于例如，Remington'sPharmaceuticalSciences(A.R.Gennaro,Ed.),21版,ISBN:0781746736(2005)，完整引入本文作为参考。这类制剂将包含治疗有效量的本文所述生物活性剂(优选的以纯化形式)，以及合适量的载体以便提供用于给对象合适施用的形式。
所述制剂应当适合施用的方式。可以通过已知的方法配制用于本发明的物质，用于使用数种途径给对象施用，所述途径包括但不限于，肠胃外、肺、口服、局部、皮内、肌内、腹腔内、静脉、皮下、鼻内、硬膜外、眼、口腔、和直肠。单个物质还可以与一种或更多种其他物质联合施用，或与其他生物活性或生物无活性物质共同施用。这类生物活性剂或无活性物质可以与所述物质处于流体或机械相连，或通过离子、共价、范德华、疏水、亲水或其他物理力与所述物质连接。
可以配制控释(或持续释放)制剂以延长物质活性和降低给药频率。还可以使用控释制剂来影响作用发生的时间或其他特征，诸如物质的血液水平，从而影响副作用的发生。可以将控释制剂设计为最初释放产生所需治疗功效的量的物质，并逐渐和连续释放其它量的物质以在较长时间段内维持治疗功效的水平。为了维持物质在体内接近恒定的水平，可以按照取代被代谢或从身体排泄的物质量的速率从所述剂型释放物质。物质的控释可以受到各种诱导物的刺激，例如，pH的改变、温度的改变、酶、水、或其他生理条件或分子。
微球
本文描述的各种实施方案使用控释组合物。例如，可以将控释脂肪形成组合物导入支架或基质材料。作为另一个实例，可以将控释细胞归巢组合物导入支架或基质材料。本文描述的控释系统允许单独的化学试剂或组合物以相似或不同的速率控制释放。例如，控释系统允许单独的化学试剂或组合物以不同的速率释放，以便提供，例如，与脂肪形成组合物不同速率(包括更快或更慢)的细胞归巢组合物。作为另一个实例，本文描述的控释系统提供比第二化合物或组合物更早的一种化合物或组合物的输送。作为具体实施例，本文描述的控释系统可以在脂肪形成组合物之前释放部分或基本上部分的细胞归巢组合物。例如，可以在脂肪形成组合物之前约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、或约10天或更多天释放细胞归巢组合物。作为另一个具体实施例，本文描述的控释系统可以在细胞归巢组合物之前释放部分或基本上部分的脂肪形成组合物。例如，可以在细胞归巢组合物之前约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、或约10天或更多天释放脂肪形成组合物。
通过基于载体的系统(诸如包裹赋形剂)，可以将本文描述的组合物(例如，脂肪形成组合物，细胞归巢组合物)导入到支架或基质材料内或导入到支架或基质材料上。例如，可以将脂肪形成组合物或细胞归巢组合物包裹在聚合输送系统内，以便提供这种组合物从支架或基质材料的控释。这种赋形剂可用做缓释组合物。例如，各种组合物可以是微囊密封的以提供增强的稳定性或延长的输送。包裹赋形剂包括，但不限于，微粒，脂质体，微球，等等，或任意上述的组合，以提供不同比例的所需释放模式。物质控释输送的其他方法是技术人员已知的。此外，这些和其他系统可以组合或改造以优化支架或基质材料内的物质整合/释放。
例如，聚合递送系统可以是聚合微球，优选的PLGA聚合微球。各种聚合输送系统，以及包裹分子诸如生长因子的方法，是本领域已知的(参见例如,VardeandPack(2004)ExpertOpinBiolTher4,35-51)。可以使用天然存在或合成的多聚体来产生聚合微球，它们是大小范围为0.1到500μm的颗粒体系。聚合微胶粒和聚合物体(polymerome)是具有与微球类似特征的聚合载体，还可以促进本文所述化合物的包裹和基质整合。用于各种负载的微球的制造、包裹和稳定都在本领域技术范围内(参见例如,Varde&Pack(2004)ExpertOpin.Biol.4(1)35-51)。可以根据多聚体的类型，聚合物分子量，共聚物组合物，添加到微球制剂的赋形剂，以及微球大小，定制微球的释放率。可用于形成微球的聚合材料包括PLA、PLGA、DPPC包被的PLGA、DPPC、DSPC、EVAc、明胶、白蛋白、壳聚糖、葡聚糖、DL-PLG、SDLMs、PEG(例如，ProMaxx)、透明质酸钠、环缩二氨酸衍生物(例如，Technosphere)、磷酸钙-PEG颗粒、和/或寡糖衍生物DPPG(例如，Solidose)。例如，使用水/油单乳化方法、水-油-水双乳化方法、或冻干，可以实现包裹。已有数种商品化包裹技术(例如,,Alkerme)。
还可以使用脂质体将本文所述组合物与支架或基质材料整合。脂质体的物质运载能力和释放率取决于脂质组合物，大小，荷电情况，药品/脂质比例，和输送方法。常规脂质体由中性或阴离子型脂质(天然或合成的)组成。常用的脂质是卵磷脂诸如磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，鞘磷脂，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰甘油，和磷脂酰肌醇。脂质体包裹法是本领域公知的(Galovicetal.(2002)Eur.J.Pharm.Sci.15,441-448;Wagneretal.(2002)J.LiposomeRes.12,259-270)。靶向脂质体和活性脂质体还可以与物质和基质联用。靶向脂质体具有靶向配体，诸如单克隆抗体或外源凝集素，粘附到它们的表面，允许与特定受体和/或细胞类型相互作用。活性或多态性脂质体包括各种各样的脂质体，它们的共性是在特定相互作用时倾向于改变它们的相和结构(例如,pH敏感性脂质体)(参见例如,Lasic(1997)LiposomesinGeneDelivery,CRCPress,FL)。
支架
本文描述的各种实施方案使用支架或基质材料。例如，支架内或支架上可以包括细胞归巢组合物或脂肪形成组合物。
支架任选的不包括移植的哺乳动物细胞，即，没有细胞被用于支架；存在于支架的任何细胞是迁移入支架内的。
支架可以由技术人员利用公认有用的任意基质材料来制备。基质材料可以是通常形成多孔、微孔(microcellular)支架的生物相容性材料，其为细胞迁移提供物理支持物。这种基质材料可以∶允许细胞连接和迁移；输送和保留细胞和生化因子；启动细胞营养物和表达产物的扩散；或发挥一些机械和生物影响以改变细胞时相的特性。基质材料通常形成生物相容性材料的多孔、微孔支架，其在体外或体内培养期间为细胞的募集和生长提供物理支持物和粘附基质。
合适支架和基质材料描述于，例如，MaandElisseeff,ed.(2005)ScaffoldingInTissueEngineering,CRC,ISBN1574445219;Saltzman(2004)TissueEngineering:EngineeringPrinciplesfortheDesignofReplacementOrgansandTissues,OxfordISBN019514130X。例如，基质材料可以是，至少部分的，固体异体的(例如，羟基磷灰石)(Kubokietal.1995ConnectTissueRes32,219-226;Murataetal.1998IntJOralMaxillofacSurg27,391-396)，固体异质的(聚乙烯多聚体)材料(SaitoandTakaoka2003Biomaterials242287–93;Isobeetal.1999JOralMaxillofacSurg57,695-8)，或自体的凝胶(Sweeneyetal.1995.JNeurosurg83,710-715)，异体的(Baxetal.1999CalcifTissueInt65,83-89;Viljanenetal.1997IntJOralMaxillofacSurg26,389-393)，或异质来源的(Santosetal.1998.JBiomedMaterRes41,87-94)，以及上述的组合(Alpaslanetal.1996BrJofOralMaxillofacSurg34,414-418)。
包括支架的基质具有足够的孔隙和足够的孔径以便于在细胞和营养物整体结构中的细胞募集和扩散。基质可以是可生物降解的，以便周围组织可以吸收基质，这可以消除手术取出的必要性。降解发生的速率尽可能符合组织或器官形成的速率。因此，当细胞围绕自身构造它们自己的天然结构时，基质能够提供结构完整性，并最终分解，留下新生组织，新形成的组织或器官，其可以承担机械负载。在一些配置中，所述基质可以是注射用基质。可以使用侵袭性最小的内窥镜方法，将基质输送到组织。
支架可以包括具有不同粘性相的基质材料。例如，基质可以为基本上液相或基本上胶体相。相之间的转换可以通过各种因素来刺激，包括但限于，光、化学、磁、电、和机械刺激。例如，基质可以是热敏基质，在大约室温下基本上液相，在大约体温下基本上胶体相。基质的液相具有较低的粘性，其提供生长因子或其他添加剂的最佳分布以及注射能力，而基质的固相具有升高的粘性，其可用于基质保留在靶组织上或靶组织内。
支架可以包括由合成多聚体形成的基质材料。这种合成多聚体包括，但不限于，聚氨基甲酸酯、聚正酯、聚乙烯醇、聚酰胺、聚碳酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、海洋胶粘剂蛋白、氰基丙烯酸酯，上述物质的类似物，混合物、组合和衍生物。可选的，基质可以由天然存在的生物聚合物形成。这种天然存在的生物聚合物包括，但不限于，纤维蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、胶原、和其他合适的生物聚合物。此外，基质可以由天然存在的生物聚合物和合成多聚体的混合物形成。
支架可以包括一种或更多种基质材料，包括但不限于，胶原凝胶、聚乙烯醇海绵、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)纤维基质、丙交酯乙交酯聚合物(polyglactin)纤维、海藻酸钙凝胶、聚乙醇酸网丝、聚酯(例如，聚(L-乳酸)或聚酐)、多糖(例如藻酸盐)、聚磷腈、聚丙烯酸酯、或聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物。可以从蛋白(例如细胞外基质蛋白诸如纤维蛋白、胶原、和纤连蛋白)、多聚体(例如，聚乙烯吡咯烷酮)、或透明质酸来产生基质。还可以使用合成的多聚体，包括可生物蚀解的多聚体(例如，聚(丙交酯)、聚(羟基乙酸)、聚(丙交酯-共乙交酯)、聚(己内酯)、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酐、聚氨基酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚腈基丙烯酸酯)、可降解的聚氨基甲酸酯、非蚀解的多聚体(例如，聚丙烯酸酯、亚乙基-醋酸乙烯酯多聚体和其他酰基替代的醋酸纤维素及其衍生物)、非蚀解的聚氨基甲酸酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯基咪唑)、氯磺化聚烯烃、聚环氧乙烷、聚乙烯醇，或尼龙。
支架还可以包括任意其他生物活性分子，例如抗生素或另外的趋化性生长因子或另一种骨生成、牙质生成、釉质生成或牙骨质生成生长因子。在一些实施方案中，通过添加例如，人血清白蛋白(HSA)、羟乙基淀粉、葡聚糖、或其组合来增强支架。用于施用组合物的这些化合物的合适浓度是本领域技术人员已知的，或无需过度实验就可以轻易确定。
支架中化合物或组合物的浓度将随化合物或组合物的性质，其生理作用，以及所需的治疗或诊断效果而改变。治疗有效量通常是显示预期效果而无过度毒性的治疗剂的足够浓度。例如，基质可以包括采用上述浓度的脂肪形成组合物。作为另一个实例，基质可以包括采用上述浓度的细胞归巢组合物。可以通过任意已知的方法将化合物掺入支架或基质材料。在一些实施方案中，将化合物包埋入凝胶，例如，胶原凝胶掺入支架或基质材料的孔。
可选的，可以使用化学修饰法将化合物或组合物共价连接到基质材料。使用本领域公知的偶联剂诸如醛化合物、碳二亚胺等等，基质的表面功能团可以与化合物或组合物的活性功能团偶联，以形成共价键。此外，可以使用间隔物分子在表面反应基和生物分子的反应基之间制造间隙以允许这种分子在基质表面的柔性更高。将生物分子粘附到基质内部或外部的其他类似方法将是本领域技术人员已知的。
可以将支架的孔和通道构建为具有各种直径。例如，支架的孔可以具有微米到毫米的直径范围。在一些实施方案中，基质材料的孔包括微通道。微通道通常具有约0.1μM至约1,000μM，例如，约50μM至约500μM(例如约100μM、150μM、约200μM、约250μM、约300μM、约350μM、约400μM、约450μM、约500μM、或约550μM)的平均直径。本领域技术人员将理解，微通道直径的分布可具有任意分布，包括正态分布或非正态分布。在一些实施方案中，微通道是基质材料天然存在的特征。在其他实施方案中，微通道是经工程化出现在基质材料中。
可以使用数种方法来构建多孔支架，包括微粒浸出，气体发泡，电旋转，冷冻干燥，从浆液的陶瓷发泡，以及聚合海绵的形成(参见，实施例1)。可以使用其他方法来构建多孔支架，包括计算机辅助设计(CAD)，以及利用Bioplotter合成支架(例如，固体形式自由的构建)(例如，BioplotterTM,EnvisionTec，德国)。
可以添加到本发明组合物的生物药物包括免疫调节剂和其他生物应答调节剂。生物应答调节剂通常包括生物分子(例如，肽，肽片段，多糖，脂质，抗体)，它们参与调节生物应答，诸如免疫应答或组织或器官生长和修复，以增强具体所需治疗功效的方式，例如，细菌细胞的细胞溶解或组织-或器官-特异性细胞的生长或血管生成。还可以将生物药物直接掺入基质组分。本领域技术人员将知道，或轻易的确定，可以用做合适的非生物和生物药物的其他物质。
还可以将本文描述的组合物改造以掺入诊断剂，诸如不透射线的物质。这种物质的存在允许医生监测内部发生的创伤愈合的进展。这种化合物包括硫酸钡以及包含碘的各种有机化合物。上述后者化合物的实例包括碘酸胺酸，胆影酸，碘氧胺酸甲基葡胺，碘番酸，以及泛影葡胺衍生物，诸如泛影葡胺钠。本领域技术人员可以轻易地确定可在组合物中使用的其他造影剂，包括，例如，放射性标记的脂肪酸或其类似物的使用。
组合物中物质的浓度将随化合物的性质，其生理作用，以及所需的治疗或诊断效果而改变。治疗有效量通常是显示预期效果而无过度毒性的治疗剂的足够浓度。诊断有效量通常是有效监测组织移植物的整合并且将潜在毒性最小化的诊断剂的浓度。无论如何，本领域技术人员能够轻易确定特定情况下具体化合物的所需浓度。
植入
各种实施方案提供组合物和方法，通过使用细胞归巢组合物来募集、归巢或诱导祖细胞的分化，随后使用脂肪形成组合物来促进或诱导募集的祖细胞分化形成脂肪或脂肪样细胞。可以将细胞归巢组合物，脂肪形成组合物，和支架或基质植入对象，以便募集内源祖细胞进入支架或基质材料，并将募集的祖细胞分化为脂肪或脂肪样细胞。
在一些实施方案中，提供引起祖细胞迁移到支架并在支架上分化形成脂肪或脂肪样细胞的方法。所述方法包括放置包含细胞归巢组合物和脂肪形成组合物(与细胞液体联通)的支架。如本文使用的，如果细胞没有阻止细胞迁移到支架的物理屏障(例如，基膜、网形结缔组织、脂肪结缔组织等等)，则支架处于与细胞“液体联通”。不受任何具体机制的束缚，普遍认为响应细胞归巢组合物的存在(形成到细胞的浓度梯度，从而影响细胞向着支架上细胞归巢组合物的更高浓度迁移)，细胞从其来源沿着湿润途径迁移到支架。
支架任选的不包括移植的哺乳动物细胞，即，没有细胞被用于支架；存在于支架的任何细胞是迁移入支架内的。通常理解支架是三维结构，当支架置于组织部位时，细胞、组织、血管等等可以在其中生长、定殖和繁殖。方法的支架可以如本文所讨论。
本文描述的组合物和方法具有重要的临床价值，这是因为它们募集内源祖细胞的能力，从而可选的避免给对象移植细胞。治疗需要的确定一般通过处于争论中的(atissue)符合组织或器官缺陷的病史和身体检查来评价。需要本文所述治疗方法和组合物的对象可以是患有、诊断患有、疑似患有组织或器官缺陷(诸如软组织缺陷)的对象或具有患上述缺陷的风险的对象。软组织缺陷通常理解为皮肤皮下脂肪层内的空隙，这经常导致“正常”组织轮廓的改变。软组织缺陷包括，但不限于，外伤性损伤(例如，显著烧伤)，肿瘤切除术(例如，乳房切除术和癌切除)，和先天性缺陷。
可通过本文所述方法治疗的各种病症的诊断在本领域的技术范围内。对象可以是动物对象，包括但不限于，哺乳动物、爬行动物、和鸟类，更优选马、牛、狗、猫、绵羊、猪、小鼠、大鼠、猴、豚鼠、和鸡，和最优选人。
细胞归巢组合物的有效量是可以诱导祖细胞募集或祖细胞迁移的量。脂肪形成组合物的有效量是可以诱导祖细胞分化为脂肪或脂肪样细胞的量。包含细胞归巢组合物和脂肪形成组合物的支架或基质材料的有效量是可以诱导祖细胞募集或祖细胞迁移并诱导募集的祖细胞分化为脂肪或脂肪样细胞的量。包含细胞归巢组合物和脂肪形成组合物的支架或基质材料的有效量是可以募集和诱导足够数量的祖细胞迁移，并诱导至少一部分募集的祖细胞形成脂肪或脂肪样细胞以便增加组织或器官的生物功能的量。包含细胞归巢组合物和脂肪形成组合物的支架或基质材料的有效量是恢复软组织功能或外观的量。
作为一个实例，有需求的对象可以具有至少约5%、约10%、约25%、约50%、约75%、约90%或更高的脂肪细胞或组织缺陷，本文描述的组合物和方法可以提供脂肪细胞或组织的数目或功能的增加。作为另一个实例，有需求的对象具有组织或器官的损伤，所述方法提供组织或器官生物功能的增加至少约5%、约10%、约25%、约50%、约75%、约90%、约100%、或约200%，或甚至差不多约300%、约400%、或约500%。仍作为另一个实例，有需求的对象可能患有脂肪相关疾病，失常，或病症，所述方法提供工程化的支架，其足以募集祖细胞并形成脂肪细胞或组织，足以改善或稳定疾病、失常或病症。例如，对象可能患有导致脂肪细胞损失、萎缩、功能异常和/或死亡的疾病，失常或病症。在另一个实例中，有需求的对象可能具有增加的患上疾病、失常或病症(可以通过所述方法延迟或预防)的风险。仍作为另一个实例，有需求的对象可能经历脂肪细胞的死亡或功能异常，这是因为用于治疗另一疾病或病症的药物的副作用，例如作为治疗多发性硬化的Copaxone(醋酸格拉替雷)的使用；或HIV阳性个体中抗逆转录病毒疗法的使用。
组织或器官可以选自脂肪、膀胱、脑、神经组织、神经胶质、食管、输卵管、心脏、胰、肠、胆囊、肾、肝、肺、卵巢、前列腺、脊髓、脾、胃、精巢、胸腺、甲状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道、子宫、乳腺、骨骼肌、皮肤、牙齿、骨、和软骨。祖细胞可以来自在其中移植支架和/或基质的同一对象。可选的，祖细胞可以来自于相同种属，或甚至不同的种属。
工程化构建体的植入属于本领域的技术范围内。支架或基质材料可以完全或部分植入对象的组织或器官以成为其的功能部分。优选的，植入物最初通过细胞单层与宿主连接和相通。随时间推移，内源细胞可以迁移入支架以形成组织。围绕工程化组织的细胞可以被生物活性物质所吸引，包括生物应答调节剂，诸如多糖、蛋白、肽、基因、抗原，和抗体，其可以选择性掺入基质以提供所需的选择性，例如，将细胞受体连接到基质，刺激细胞迁移入基质，或上述两者。基质可以包括胶体相和互连通道，以允许通过生物和物理-化学梯度增强细胞迁移。例如，围绕植入基质的细胞可以被生物活性物质(包括IGF1和bFGF)所吸引。本领域技术人员将清楚并知道如何使用适合于将细胞吸引到基质的其他生物活性物质。
本文描述的方法，组合物，和装置可以包括利用一种或更多种酶，离子，生长因子，和生物药剂(诸如凝血酶和钙)，或其组合的同时或连续治疗。本文描述的方法，组合物，和装置可以包括利用非生物和/或生物药物的同时或连续治疗。
当用于本文描述的治疗时，治疗有效量的脂肪形成组合物或细胞归巢组合物可以使用纯化形式(当存在这种形式时)，或采用药学上可接受的盐形式并且包含或不包含药学上可接受的赋形剂。例如，可以采用能够增加组织或器官的生物功能的足够量，按照适合于任意医学治疗的合理受益/风险比施用本文描述的化合物，。
与药学上可接受的载体组合产生单剂型的本文所述组合物的量将根据接受治疗的宿主和具体的施用方式而改变。本领域技术人员将理解，每种剂型的单独计量包含的药剂单位含量无需自身构成治疗有效量，因为可以通过施用大量单独剂量达到必需的治疗有效量。
可以通过在细胞培养物和/或实验动物中测定LD50（导致50%群体死亡的剂量）和ED50（在50%群体中治疗有效的剂量）的标准药学步骤来确定本文所述组合物的毒性和治疗效果，毒性和治疗效果的剂量比值是疗效指数，其可以表示为LD50/ED50的比值，其中优选高的疗效指数。
针对任意特定患者的具体治疗有效剂量水平取决于各种因素，包括待治疗的病症和病症的严重程度；治疗部位的位置和大小；使用的具体化合物的活性；使用的具体组合物；患者的年龄，体重，全身健康状况，性别和饮食；施用时间；施用途径；所用组合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所用具体化合物联合或者同时使用的药物；以及医药领域公知的类似因素。(参见例如,Koda-Kimbleetal.(2004)AppliedTherapeutics:TheClinicalUseofDrugs,LippincottWilliams&Wilkins,ISBN0781748453;Winter(2003)BasicClinicalPharmacokinetics,4thed.,LippincottWilliams&Wilkins,ISBN0781741475;Sharqel(2004)AppliedBiopharmaceutics&Pharmacokinetics,McGraw-Hill/Appleton&Lange,ISBN0071375503)。例如，本领域普通技术人员都清楚组合物的起始剂量水平低于要求实现所需治疗效果的水平，逐渐增加剂量直到实现所需治疗效果。如果需要，为了施用，有效的每日剂量可以分成多个剂量。因此，单次剂量的组合物可以包含这种量或者其小部分(submultiples)以构成每日剂量。但是应该理解，本发明化合物和组合物的总体每日使用将由主治医师在合理医学判断范围内来决定。
组合物或包括本文所述组合物的支架的施用可以作为单个事件发生，或在治疗的时程内发生。例如，施用可以是每天，每周，每两周，或每月的。
可以在用于组织或器官缺陷的常规治疗方式之前、同时或之后进行根据本文所述方法的治疗。组合物或包括本文所述组合物的支架可以与另一药剂(诸如抗生素、抗炎药)，或另一药剂同时或顺序施用。例如，施用可以与另一药剂(诸如抗生素或抗炎药)同时进行。
试剂盒
还提供试剂盒。这种试剂盒可以包括本文描述的药剂或组合物和，在一些实施方案中，施用说明。这种试剂盒便于实施本文描述的方法。当作为试剂盒提供时，组合物的不同组分可以包装在分开的容器中，并在使用前立即混合。组分包括，但不限于支架，基质材料，细胞归巢组合物，脂肪形成组合物，和控释系统，诸如微球，任选的包裹其他组分。如果需要，组分单独的这种包装可以存在于包装或分配装置中，其包括一个或更多个含有组合物的单位剂型。包装可以，例如，包括金属或塑料薄膜诸如泡状包装。在一些情况下，组分单独的这种包装还可以允许长期保存，并且不损失组分的活性。
试剂盒也可以在分开的容器中包括试剂，诸如例如，待添加到冻干活性成分的无菌水或盐水单独包装。例如，密封的玻璃安瓿可以包含冻干组分，并且在分开的安瓿中，无菌水、无菌盐水或无菌，它们中每种均在中性非反应气体(诸如氮气)中包装。安瓿可以由任意合适材料组成，诸如玻璃，有机聚合物，诸如聚碳酸酯，聚苯乙烯，陶瓷，金属或通常用于保存试剂的任意其他材料。合适容器的其他实例包括瓶子(可以由安瓿的类似物质制备)，和封套(可以由箔衬里内面诸如铝或合金组成)。其他的容器包括试管，小瓶，长颈瓶，瓶子，注射器等等。容器可以具有无菌进入孔，诸如具有塞子(可以通过皮下注射针头刺入)的瓶子。其他容器可以具有可被轻易去除的膜分隔的两个小室，所述膜在去除时允许组分混合。可除去的膜可以是玻璃，塑料，橡胶，等等。
在一些实施方案中，试剂盒提供说明材料。说明书可以打印在纸或其他基质上，和/或作为电子可读的介质提供，诸如软盘，迷你CD-ROM，CD-ROM，DVD-ROM，Zip盘，录像带，录音带，等等。详细的说明书可以不与试剂盒实际上在一起；反之，可以将用户导向由试剂盒的制造商或批发商指定的因特网站点。
本文描述的利用分子生物学方案的组合物和方法是依照本领域已知的各种标准技术(参见,例如,SambrookandRussel(2006)CondensedProtocolsfromMolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN-10:0879697717;Ausubeletal.(2002)ShortProtocolsinMolecularBiology,5thed.,CurrentProtocols,ISBN-10:0471250929;SambrookandRussel(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual,3ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN-10:0879695773;Elhai,J.andWolk,C.P.1988.MethodsinEnzymology167,747-754;Studier(2005)ProteinExprPurif.41(1),207–234;Gellissen,ed.(2005)ProductionofRecombinantProteins:NovelMicrobialandEukaryoticExpressionSystems,Wiley-VCH,ISBN-10:3527310363;Baneyx(2004)ProteinExpressionTechnologies,Taylor&Francis,ISBN-10:0954523253)。
本文描述的定义和方法是提供用于更好的限定本发明并指导本领域普通技术人员实施本发明。除非另作说明，术语应由相关领域的普通技术人员根据常规用法来理解。
在一些实施方案中，表示成分数量、特性诸如分子量，反应条件等等的数字(用于描述和要求本文描述的一些实施方案)，应被理解为在一些情况下被术语“约”修饰。在一些实施方案中，术语“约”用于表示，数值包括用于确定该数值的装置或方法的平均值的标准偏差。在一些实施方案中，在所写说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是近似值，其取决于通过具体实施方案设法获得的所需特性可以不同。在一些实施方案中，应当根据报道的有效数字的数目并通过应用常规舍入技术来解释数值参数。尽管阐述本文描述的一些实施方案的宽范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实施例中阐述的数值应尽可能精确的报告。在本文所述一些实施方案中存在的数值必然的包含某些误差，这是由它们各自的试验测量中发现的标准差产生的。本文数值范围的描述仅仅旨在用做分别涉及范围内每个单独值的简写方法。除非本文另外指出，每个单独值都被引入说明书中，就像它是分别在本文中叙述的一样。
在一些实施方案中，当用于描述具体实施方案的情况下(特别是在某些下列权利要求的情况下)，术语“一个(a)”和“一个(an)”和“the”以及类似的参考应被解释为包括单数和复数，除非其他地方特别作注明。在一些实施方案中，如本文使用的术语“或”，包括权利要求在内，用于表示“和/或”，除非明确地表示只涉及二个中的一个或备选物是互相排斥的。
术语“包括”、“具有”和“包含”是开放式的联系动词。一种或更多种这些动词的任意形式或时态，诸如“包括(comprises),”“包括(comprising),”“具有(has),”“具有(having),”“包含(includes)”和“包含(including),”也是开放式的。例如，“包括(comprises),”“具有(has)”或“包含(includes)”一个或更多个步骤的任意方法不限于只具有一个或更多个步骤，还可以包括其他没有列出的步骤。类似地，“包括(comprises),”“具有(has)”或“包含(includes)”一个或更多个特征的任意组合物或装置不限于只具有一个或更多个特征，可以包括其他没有列出的特征。
本文描述的所有方法可以按照任何合适的顺序进行，除非本文另外指出，或另外根据背景明显抵触。根据本文一些实施方案提供的任意和所有实施例或示例性语言（例如，“诸如”）的使用仅仅是为了更好的说明本发明，不是为了给本文描述的范围做出限制，除非另有要求。说明书中没有语言应理解为指示任意未要求的要素是实施本文内容必需的。
本文公开的替代性元件或实施方案的分组不应理解为限制。每组成员可以单独提及和要求，或与组内的其他成员或本文发现的其他元件任意组合。为了方便或可专利性，组内的一个或更多个成员可以包括在组中或从组内去除。当存在任意这种包括或去除时，说明书在此处应认为包含修改的组，从而满足用于所附权利要求的所有Markush分组的文字说明。
本文参考文献的引用不应被理解为承认这类参考文献对于本发明来说是现有技术。
已经详细的描述了本发明，显而易见的是，在不脱离所附权利要求限定的本文内容的范围的情况下，改变、变化和等同实施方案是可能的。此外，应当理解，本文内容的所有实施例作为非限制性的实施例提供。
实施例
提供下列非限制性的实施例以进一步说明本发明。本领域技术人员应当理解，下列实施例公开的技术代表本发明人发现的在实施本文内容时作用良好的方法，因此可以被认为构成其实施方式的实施例。但是，在本文内容的引导下，本领域技术人员应当理解，在公开的具体实施方案中可以进行许多变化，仍然获得相同或相似的结果，并且不脱离本文内容的精神和范围。
实施例1
本实施例显示在体外和体内的细胞归巢入支架和脂肪形成。
制备多孔聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)支架。将两克85:15PLGA溶于30ml的双氯甲烷(DCM)。为了产生多孔支架，使用盐析(salt-leaching)方法。筛选NaCl晶体以产生130μM到600μM范围的晶体。将PLGA溶液轻轻的浇注到18克筛选的NaCl晶体，允许DCM在通风橱中蒸发过夜。次日，将5μM直径的圆盘从PLGA穿孔。将盘置于蒸馏水中48小时，在前8个小时每小时换水，在剩余时间每天换两次水。然后将支架冻干48小时以去除剩余溶剂，并在-20℃保存。使用前，将支架在70%乙醇中灭菌30分钟，然后用PBS洗涤2*30分钟，然后在BME培养基中浸泡两小时。
制备两种类型的微球，一种用胰岛素样生长因子1(IGF1)包裹，另一种用来自脂肪形成诱导培养基的补充剂包裹，标注为脂肪形成微球。对于这两种类型，将250mg的50:50PLGA溶于1mlDCM。然后，向PLGA溶液中添加10μgIGF-1，或5.15mg吲哚美辛、1mg胰岛素、11.1mg3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和39.2μg地塞米松的组合。然后将微球冻干48小时以去除溶剂，并在-20℃保存。使用前，微球用环氧乙烷灭菌。
在BME培养基中扩增小鼠间充质细胞系C3H10T1/2(ATCC,Manassas,VA)。用绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白(Invitrogen,Carlsbad,CA)双转染细胞。当获得足够细胞时，收集细胞，并重悬于BDPuramatrix水凝胶溶液(BDBiosciences,SanJose,CA)。将PLGA微球添加到悬液，将溶液添加到PLGA支架以允许固化。
设计总共6组：(i)空支架；(ii)种有5×105个细胞的小鼠间充质细胞系C3H10T1/2的支架；(iii)具有包裹在微球中的脂肪形成因子IBMX、吲哚美辛、地塞米松和胰岛素的混合物的支架；(iv)具有脂肪形成微球和5×105C3H10T1/2细胞的支架；(v)具有包裹在微球中的胰岛素样生长因子1(IGF1)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的支架；和(vi)具有bFGF&IGF1微球和5×105C3H10T1/2细胞的支架。
将支架移植入肥胖C57BL/6N小鼠的腹部脂肪垫两周。C57BL/6NHsd购自HarlanLaboratories(Indianapolis,IN)，并喂食含有60%Kcal脂肪的高热量膳食TD.06414(Harlanlaboratories)，以产生具有大的脂肪垫的肥胖小鼠。出于外科手术目的，使用14-15周龄小鼠。使用1-5%的异氟烷镇静小鼠，在下腹部区域造成1.5-2cm切口。在皮下脂肪垫造成更小的切口0.5-1cm，将支架放置在那里。使用细胞和微球的6种不同组合：空支架，具有500KC3H10T1/2细胞的支架，具有5mg脂肪形成微球的支架，具有5mg脂肪形成微球和500KC3H10T1/2细胞的支架，具有2.5mgIGF-1微球的支架，具有2.5mgIGF-1微球和500KC3H10T1/2细胞的支架。两周后收集全部支架。
通过在体外微包裹的脂肪形成因子从微球的释放来鉴定培养时C3H10T1/2细胞的脂肪形成和增殖。体内移植后两周，收集组织移植物并切片。
结果显示脂肪形成的剂量依赖性增加(参见例如，图1)。
与空支架(即，组(i))或只添加脂肪形成混合物微球的支架(即，组(iii))(参见例如,图2A和图3A;图2C和3C)相比，种有5x105个细胞的支架(即，组(ii))以及具有微包裹bFGF和IGF1的支架(即，组(v))具有有效的脂肪组织形成(参见例如,图2B和图3B;图2D和图3D)。与种有5x105ASCs或添加bFGF和IGF1微球的支架(参见例如,图2F和图3F)相比，添加bFGF和IGF1微球的支架(参见例如,图2E和图3E)具有实质的脂肪组织形成。因此，包括胰岛素，吲哚美辛，IBMX和地塞米松的混合物的控释在体内和体外均诱导脂肪形成。这种混合物可用于分化来自宿主组织的脂肪前细胞和脂肪干细胞。
如上所示，脂肪形成混合物微球在体内和体外均促进脂肪形成。bFGF和IGF1的组合导致宿主细胞的归巢。预期脂肪形成混合物微球以及bFGF和IGF1的组合将导致宿主细胞的归巢，并在体外和体内促进脂肪形成。
实施例2
本实施例显示γ分泌酶抑制剂增强脂肪形成。
在3天内按照10μM的优化浓度输送EGFR拮抗剂(γ分泌酶抑制剂)导致脂肪干细胞(ASCs)的有效脂肪形成，脂肪形成特异性标记物诸如PPARβ2，Glut4表达增加最高10倍，以及LEPR加速表达。定量来说，4周后，用EGFR拮抗剂处理的ASCs的甘油和瘦素含量显著高于无EGFR拮抗剂的。总之，ASCs的脂肪形成分化能力恢复到无HSC共培养的类似水平。所以，向脂肪形成培养基中添加50ng/mL浓度的内源EGF进一步抑制脂肪形成。
上述结果显示，通过减弱抑制剂诸如在造血干细胞(其共培养被发现抑制脂肪形成)中富集的EGF受体可以增强脂肪形成。
实施例3
本实施例显示，当与脂肪形成分化培养基(ADM)比较时，用γ分泌酶抑制剂处理hADSCs是PPARγ表达的有效上调因素。
hADSCs中PPARγ表达的改变持续28天。用下述物质处理hADSCs：对照培养基；脂肪形成分化培养基(ADM);ADM加10μMNotchγ分泌酶抑制剂(Inh1)(ADM+Inh1);ADM加10μMMAPK抑制剂(Inh2)(ADM+Inh2);以及ADM加10μMInh1和Inh2(ADM+Inh1,2)。
结果显示，与单独的ADM相比，所述两类抑制剂处理，分别的，更有效上调PPARγ表达。此外，Inh1和Inh2的组合处理(ADM+Inh1,2)比ADM和单独的抑制剂1或2更有效的诱导体外hADSCs的PPARγ表达(参见例如，图4)。
实施例4
本实施例显示，与ADM相比，用抑制剂处理hADCs是C/EBPα表达的有效上调因素。
hADSCs的C/EBPα表达改变持续28天。用下述物质处理hADSCs：对照培养基；脂肪形成分化培养基(ADM);ADM加10μMNotchγ分泌酶抑制剂(Inh1)(ADM+Inh1);ADM加10μMMAPK抑制剂(Inh2)(ADM+Inh2);以及ADM加10μMInh1和Inh2(ADM+Inh1,2)。
结果显示，与单独的ADM相比，所述两类抑制剂处理更有效的上调C/EBPα表达。此外，Inh1和Inh2的组合处理(ADM+Inh1,2)比ADM和单独的抑制剂1或2更有效的诱导体外hASCs的C/EBPα表达(参见例如,图5)。
实施例5
本实施例显示，Inh1和Inh2(ADM+Inh1,1)以及Inh1(ADM+Inh1)的组合处理比单独的ADM或ADM+Inh2更有效的诱导hASCs中的脂质积聚。
用下述物质处理hADSCs后四周产生亮视野图像：(A)ADM;(B)ADM+Inh1;(C)ADM+Inh2;和(D)ADM+Inh1,2(参见例如,图6A-D)。
上述hADSCs脂质染色的图像在亮视野图像上重叠，表明Inh1和Inh2(ADM+Inh1,2)以及Inh1(ADM+Inh1)的组合处理更有效的诱导体外hADSCs中的脂质积聚(参见例如,图6A1-D1)。
实施例6
本实施例显示，组合的Inh1和Inh2处理更有效的起始体外脂联素细胞因子的分泌。
在处理后两和四周，测量用下述物质处理的hADSCs中的脂联素含量：对照培养基；脂肪形成分化培养基(ADM);ADM加10μMNotchγ分泌酶抑制剂(Inh1)(ADM+Inh1);ADM加10μMMAPK抑制剂(Inh2)(ADM+Inh2),以及ADM加10μMInh1和Inh2(ADM+Inh1,2)。
结果显示，Inh1和Inh2的组合处理(ADM+Inh1,2组)在第二和四周更有效的起始体外脂联素细胞因子的分泌(参见例如,图7)。
实施例7
本实施例显示抑制剂处理没有成功的上调瘦素。
在处理后两和四周，测量用下述物质处理的hADSCs中的瘦素含量：对照培养基；脂肪形成分化培养基(ADM);ADM加10μMNotchγ分泌酶抑制剂(Inh1)(ADM+Inh1);ADM加10μMMAPK抑制剂(Inh2)(ADM+Inh2),以及ADM加10μMInh1和Inh2(ADM+Inh1,2)。
结果显示，没有抑制剂在体外有效上调瘦素细胞因子的分泌。实际上，Inh2处理(ADM+Inh2和ADM+Inh1,2组)在体外进一步下调瘦素细胞因子的分泌(参见例如,图8)。
实施例8
本实施例显示，与单独的ADM相比，与ADM一起的Pyrintegrin处理更有效的在体外诱导hADSCs的PPARγ表达。
测量用下述物质处理的hADSCs中的PPARγ表达共28天：对照培养基；脂肪形成分化培养基(ADM)；以及ADM加2μMPyrintegrin(ADM+Pyrintegrin)。
结果显示，与脂肪形成培养基一起的Pyrintegrin处理更有效的在体外诱导hADSCs的PPARγ表达(参见例如,图9)。
实施例9
本实施例显示，与单独的ADM相比，与ADM一起的Pyrintegrin处理更有效的在体外诱导hADSCs的C/EBPα表达。
测量用下述物质处理的hADSCs中的C/EBPα表达共28天：对照培养基；脂肪形成分化培养基(ADM);以及ADM加2μMPyrintegrin(ADM+Pyrintegrin)。
结果显示，与脂肪形成培养基一起的Pyrintegrin处理更有效的在体外诱导hADSCs的C/EBPα表达(参见例如,图10)。
实施例10
本实施例显示，与单独的ADM处理相比，除了ADM之外用Pyrintegrin处理hADSCs更有效的诱导脂质积聚。
用下述物质处理hADSCs四周后进行脂质染色：(A)ADM；和(B)ADM加Pyrintegrin(ADM+Pyrintegrin)。
结果显示与脂肪形成培养基一起的Pyrintegrin处理更有效的在体外诱导hADSCs的脂质积聚(参见例如,图11A-B)。
实施例11
本实施例显示不含ADM的Pyrintegrin体外诱导hADSCs的脂肪形成分化。
在用下述物质处理hADSCs的处理后第四天，测量PPARγ和C/EBPα基因表达：对照培养基(对照)；对照培养基加2μMPyrintegrin(对照+药物2μM)；对照培养基加10μMPyrintegrin(对照+药物10μM)和脂肪形成培养基(ADM)。
结果显示单独的Pyrintegrin可以在体外诱导hADSCs朝向脂肪形成分化途径(参见例如,图12)。
实施例12
本实施例显示，与ADM一起的Pyrintegrin处理增强hADSCs的脂联素细胞因子分泌。
在处理后两周和四周，测量用下述物质处理的hADSCs中的脂联素含量：对照培养基；脂肪形成分化培养基(ADM)；以及ADM加2μMPyrintegrin(ADM+药物)。
结果显示，与脂肪形成培养基一起的Pyrintegrin处理增强体外脂联素细胞因子的分泌(参见例如，图13)。
实施例13
本实施例显示，利用Pyrintegrin和ADM的hADSCs处理显示体外瘦素细胞因子的增强分泌。
在处理后两周和四周，测量用下述物质处理的hADSCs中的瘦素含量：对照培养基；脂肪形成分化培养基(ADM)；以及ADM加2μMPyrintegrin(ADM+药物)。
结果显示，与脂肪形成培养基一起的Pyrintegrin处理增强体外瘦素细胞因子的分泌(参见例如,图14)。
实施例14
本实施例显示，利用Pyrintegrin和ADM的hADSCs处理显示体外甘油的增强分泌。
在处理后两周和四周，测量用下述物质处理的hADSCs中的甘油含量：对照培养基；脂肪形成分化培养基(ADM)；以及ADM加2μMPyrintegrin(ADM+药物)。
结果显示，与脂肪形成培养基一起的Pyrintegrin处理增强体外甘油的分泌(参见例如，图15)。
实施例15
本实施例显示，通过hADSCs的Western印迹分析证明Pyrintegrin是BMP途径抑制剂。
在用下述物质处理的hADSCs中，处理后1小时进行Western印迹分析：对照培养基(对照)；脂肪形成分化培养基(ADM)；ADM加2μMPyrintegrin(ADM+药物)；和单独的Pyrintegrin(药物)。
结果显示，Pyrintegrin是BMP途径抑制剂，因为它阻止Smad1/5/8的磷酸化(参见例如，图16)。
实施例16
本实施例显示Pyrintegrin不是TGFβ/活化素途径抑制剂。
在用下述物质处理的hADSCs中，处理后1小时进行Western印迹分析：对照培养基(对照)；脂肪形成分化培养基(ADM)；ADM加2μMPyrintegrin(ADM+药物)；和单独的Pyrintegrin(药物)。
结果显示，Pyrintegrin不靶向TGFβ/活化素途径(参见例如，图17)。

Claims (30)

1.形成脂肪组织的方法，包括∶
提供支架，其包括有效量的
(i)细胞归巢组合物，其包括IGF-1和bFGF，
(ii)脂肪形成组合物，其包括Pyrintegrin，和
(iii)γ分泌酶抑制剂或MAPk抑制剂；
将支架置于与祖细胞液体连通；
诱导祖细胞迁移至支架内或支架上；和
诱导从祖细胞形成脂肪细胞或脂肪样细胞，其中所述支架不包括移植的细胞。
2.用于治疗对象中软组织缺陷的组织构建体，所述构建体包括∶
(i)有效量的细胞归巢组合物，所述细胞归巢组合物包括IGF-1；
(ii)有效量的脂肪形成组合物，其包括Pyrintegrin；
(iii)有效量的γ分泌酶抑制剂或MAPk抑制剂；和
(iv)支架，
其中，
所述细胞归巢组合物、所述脂肪形成组合物和所述γ分泌酶抑制剂或MAPk抑制剂包括在所述支架内或支架上；
所述支架在植入对象前不包括移植的细胞；
当支架与祖细胞液体连通时有效量的细胞归巢组合物能诱导祖细胞迁移至支架内或支架上；
有效量的脂肪形成组合物能诱导从祖细胞形成脂肪细胞或脂肪样细胞；并且
有效量的γ分泌酶抑制剂或MAPk抑制剂能减轻或消除祖细胞含有的EGF受体所引起的脂肪形成抑制。
3.权利要求1的方法，其中所述细胞归巢组合物包括∶0.1/250μgIGF1每mg支架至250/250μgIGF1每mg支架比例的IGF1；或
0.1/250μgbFGF每mg支架至250/250μgbFGF每mg支架比例的bFGF。
4.权利要求1的方法，其中所述脂肪形成组合物包括吲哚美辛、胰岛素、异丁基-甲基黄嘌呤(IBMX)、或地塞米松中的一种或多种。
5.权利要求4的方法，其中所述脂肪形成组合物包括∶
0.1/250mg吲哚美辛每mg支架至250/250mg吲哚美辛每mg支架比例的吲哚美辛；
0.1/250mg胰岛素每mg支架至250/250mg胰岛素每mg支架比例的胰岛素；
0.1/250mgIBMX每mg支架至250/250mgIBMX每mg支架比例的IBMX；
0.1/250mg地塞米松每mg支架至250/250mg地塞米松每mg支架比例的地塞米松；或
0.1/250mgPyrintegrin每mg支架至250/250mgPyrintegrin每mg支架比例的Pyrintegrin。
6.权利要求1的方法，其中所述祖细胞选自前脂肪细胞、间充质干细胞(MSC)、MSC来源的细胞、和脂肪细胞。
7.权利要求1的方法，其中所述支架包括生物相容性基质材料。
8.权利要求1的方法，其中所述支架包括聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)。
9.权利要求1的方法，其中所述支架包括至少一个物理通道。
10.权利要求1的方法，其中所述祖细胞以0.0001百万细胞ml-1至1000百万细胞ml-1的密度存在于支架中。
11.权利要求1的方法，其中所述脂肪细胞或脂肪样细胞以0.0001百万细胞ml-1至1000百万细胞ml-1的密度存在于支架中。
12.权利要求1的方法，其中所述γ分泌酶抑制剂是Notchγ分泌酶抑制剂。
13.权利要求1的方法，其中所述支架包括(a)所述γ分泌酶抑制剂和(b)所述MAPk抑制剂。
14.权利要求13的方法，其中所述γ分泌酶抑制剂是Notchγ分泌酶抑制剂。
15.权利要求13的方法，其中所述γ分泌酶抑制剂或所述MAPk抑制剂以1.0μM至100μM的浓度、或0.1/250μg抑制剂每mg支架至250/250μg抑制剂每mg支架的比例存在。
16.权利要求1的方法，其中所述祖细胞是脂肪组织来源的细胞。
17.权利要求2的构建体，其中所述细胞归巢组合物包括∶
0.1/250μgIGF1每mg支架至250/250μgIGF1每mg支架比例的IGF1；或
0.1/250μgbFGF每mg支架至250/250μgbFGF每mg支架比例的bFGF。
18.权利要求2的构建体，其中所述脂肪形成组合物包括吲哚美辛、胰岛素、异丁基-甲基黄嘌呤(IBMX)、或地塞米松中的一种或多种。
19.权利要求18的构建体，其中所述脂肪形成组合物包括∶
0.1/250mg吲哚美辛每mg支架至250/250mg吲哚美辛每mg支架比例的吲哚美辛；
0.1/250mg胰岛素每mg支架至250/250mg胰岛素每mg支架比例的胰岛素；
0.1/250mgIBMX每mg支架至250/250mgIBMX每mg支架比例的IBMX；
0.1/250mg地塞米松每mg支架至250/250mg地塞米松每mg支架比例的地塞米松；或
0.1/250mgPyrintegrin每mg支架至250/250mgPyrintegrin每mg支架比例的Pyrintegrin。
20.权利要求2的构建体，其中所述祖细胞选自前脂肪细胞、间充质干细胞(MSC)、MSC来源的细胞、和脂肪细胞。
21.权利要求2的构建体，其中所述祖细胞是脂肪组织来源的细胞。
22.权利要求2的构建体，其中所述支架包括生物相容性基质材料。
23.权利要求2的构建体，其中所述支架包括聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)。
24.权利要求2的构建体，其中所述支架包括至少一个物理通道。
25.权利要求2的构建体，其中所述祖细胞以0.0001百万细胞ml-1至1000百万细胞ml-1的密度存在于支架中。
26.权利要求2的构建体，其中所述脂肪细胞或脂肪样细胞以0.0001百万细胞ml-1至1000百万细胞ml-1的密度存在于支架中。
27.权利要求2的构建体，其中所述γ分泌酶抑制剂是Notchγ分泌酶抑制剂。
28.权利要求2的构建体，其中所述构建体包括(a)所述γ分泌酶抑制剂和(b)所述MAPk抑制剂。
29.权利要求28的构建体，其中所述γ分泌酶抑制剂是Notchγ分泌酶抑制剂。
30.权利要求28的构建体，其中所述γ分泌酶抑制剂或所述MAPk抑制剂以1.0μM至100μM的浓度、或0.1/250μg抑制剂每mg支架至250/250μg抑制剂每mg支架的比例存在。
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