JP6791854B2 - 組織適用におけるｌｇｒ４、ｌｇｒ５およびｌｇｒ６発現上皮幹細胞を用いた最小限分極機能性細胞微細凝集塊単位の開発および使用のための方法 - Google Patents

Description

優先権の主張
本ＰＣＴ国際特許出願は、２０１４年１２月２日に出願された米国特許仮出願第６２／０８６，５２６号の恩典を主張する２０１５年１１月３０日に出願された米国特許第１４／９５４３３５号の優先権を主張する。これらは参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、創傷治療適用、組織工学、細胞療法適用、再生医療適用、医療／治療適用、組織治癒適用、免疫療法適用および組織移植治療適用のためのロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体（ＬＧＲ）発現細胞を含む微細凝集塊多細胞移植片の構築物に関する。より詳しくは、本発明により、直接適用のための送達媒体／基材／支持体／スカフォールディング上の送達可能な微細凝集塊多細胞ＬＧＲ構築物を提供する。

長年にわたり、臨床医および研究者は、創傷の微生物量を低減させるだけでなく、有する細胞毒性副作用が少ない抗菌剤について探し求めてきた。熱傷から急性および慢性の両方の創傷に至るまで、天然に存在する自己由来抗菌ペプチドを操作するという可能性が存在する。これは、このような因子が、典型的には、微生物の耐性をもたらしにくい機構である膜透過によって機能を果たすという理由による。創傷における継続的な感染のリスクおよび現在使用されている抗生物質療法に対する耐性菌の進行的蔓延に伴い、皮膚の熱傷および創傷における使用のための新しい類型の経表面抗菌剤の開発に対する真の必要性が存在している。

創傷治癒には、前世紀において報告されてきた本質的に４つの期：（１）止血、（２）炎症、（３）増殖および（４）リモデリングがある。これらの連続する期は、最初は、創傷内に遊走した細胞型によって規定され、その後、後に、該組織内で発現されたサイトカインおよび増殖因子の型によって規定された。

最近の間葉および脂肪由来幹細胞の単離および移植の進歩に伴い、研究者らは、どのようにしてこの細胞が各段階において、特に、広範の炎症からリモデリング期において治癒を改善し、発現を改変するのかを研究し始めた。深部のコンパートメントの間葉および脂肪由来幹細胞とそっくりに、上皮幹細胞は始原外胚葉から発生し、これは後に、より表層の上皮コンパートメントを発達させ、従って、皮膚の創傷治癒において役割を有する可能性も有する。現時点では、単離されたＬＧＲ４、ＬＧＲ５およびＬＧＲ６発現上皮幹細胞の移植および適用によってどのように創傷治癒の遺伝子発現が改変されるのかに関する研究の存在は限定的である。

ＬＧＲ４、ＬＧＲ５およびＬＧＲ６発現上皮幹細胞集団は、多くの場合、皮膚に対する重度の全層性損傷後に破壊され、組織は、バイアブルで自立的な上皮コンパートメントを生成させることができなくなることが知られている。局所炎症によって駆動される肉芽性および線維性の作用力およびその後の一連の細胞性実体の走化性の併発にもかかわらず、適所での上皮幹細胞増殖巣はなく、残った組織は、機能性の上皮、毛包、汗腺などを形成するための再生能がないままである。

ヒトおよび哺乳動物の組織に対する複雑な全層性外傷および／または多種類の組織要素（皮膚、筋肉、脂肪、血管、神経および骨）が関与している複雑な外傷は、本質的に治癒が困難である。かかる外傷およびその後に生じる創傷もまた、現在使用されている創傷ケア方法である細胞、組織、デバイス、生物製剤、薬物および／または増殖因子を用いた現在承認されている技術での外科的介入による処置が困難である。かかる困難性の一般的な理由は、創傷組織床または損傷組織床の内部または周囲に残った組織が、典型的には、相互依存性の必要成分：１）前駆細胞および／または幹細胞集団；２）細胞外マトリックス／スカフォールディング要素および基材；ならびに３）細胞性実体同士および基材同士ならびに細胞性実体と基材間の相互作用の併存を欠くことである。細胞微小環境、ＥＣＭ（細胞外マトリックス）スカフォールディングおよび関連する相互作用性境界面におけるかかる欠損により、続いて、細胞の遊走、分化および組織分極に必要とされる必須の多次元構造体の再生または生成ができなくなる。このような細胞同士および細胞−マトリックス間の相互作用がないと、創傷床内の残った細胞性実体は、増殖能または分化（ｌｉｎｅａｇｅ）能を問わず、認識可能に「機能」し得るより複雑な多組織構築物に発達するのではなく、主に、バリア有用性をもたらすものになってしまう。従って、創傷は、皮膚、筋肉、脂肪、腱、骨のいずれが関与するものであれ、その後、瘢痕化し、組織秩序が乱れ、機能不全になる。

培養された皮膚、軟骨、骨、筋肉、血管、神経、リンパ系および関連する代替材料の組織工学の分野における現在の応用は、主として、３部ストラテジー：１）組織供給源を取得し、かかる組織から細胞懸濁液を収集すること；２）この細胞をマトリックスまたはスカフォールドに適用すること；および３）構築物をヒトまたは動物の標的部位上または標的部位内に移植することに基づいている。しかしながら、確認された上記の相互依存性の必要成分がない場合、組織工学適用、細胞療法適用、再生医療適用、組織治癒適用および組織移植治療適用は、機能性の分極組織が適格にアセンブルされるために必要とされる天然の細胞微細凝集塊構造体を有しない。従って、適正な相互依存、前駆細胞塊および適正なスカフォールディングがないことにより、かかる構築物が、治療的適用、例えば、マルチコンパートメント組織の再生および／または骨や筋肉の再構築において有用となることが妨げられている。

従って、一部において前述のことのため、相当な取り組みおよび資金が業界および学術面の両方から、合成組織代替材料、自己移植片構築物ならびに患者由来表皮拡大培養自己移植片（即ち、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ．のＶｅｒｉｃｅｌ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによるＥＰＩＣＥＬ（登録商標））を開発するために投じられている。このような製品は有益ではあるが、多くの場合、高価であり、患者に真のマルチコンパートメント組織構築物をもたらすものではない。例えば、培養上皮自己移植片（ＣＥＡ）は、天然皮膚に見えられる上皮コンパートメントと真皮コンパートメントの両方を回復させることは依然としてできない。しかしながら、相互依存性の機能性コンパートメントがないことに鑑みると、培養細胞は、真に皮膚を画定する外皮（表皮、真皮、腺および毛）の発達に必要とされる増殖性局所幹細胞集団および組織分極の発生がないままである。この不全性により、さらに、単層脆弱性、上皮不安定性、バリア崩壊および瘢痕がもたらされる。

択一的に、より堅牢な非細胞マトリックス、例えば、ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）（ＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）、ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）およびＤｅｒｍａＭａｔｒｉｘ（登録商標）（Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの製品）は、優れた再度構築選択肢であるが、機能性天然組織を発達させるために必要な適正に配置された系統特異的幹細胞集団がない。

本明細書における発明者は、既に、ＬＧＲ５およびＬＧＲ６が哺乳動物において腸幹細胞および表皮幹細胞の両方のマーカーとして比較的最近、認識されたことについて記載している。Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ Ｂｕｌｇｅ ＬＧＲ５＋ ａｎｄ ＬＧＲ６＋ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｇｕｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｈｕｍａｎ Ａｌｐｈａ Ｄｅｆｅｎｓｉｎ ５ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｅｓｅｎｃｅ，Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ，ａｎｄ Ｈａｉｒ Ｇｒｏｗｔｈ ｆｒｏｍ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｄｅｖｏｉｄ ｏｆ Ａｄｎｅｘａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．１３２：１１５９，２０１３において、ロイシンリッチリピート含有Ｇ−タンパク質共役受容体（ＬＧＲ）は、卵胞刺激ホルモン受容体ファミリー、甲状腺刺激ホルモン受容体ファミリーおよび黄体形成ホルモン受容体ファミリーと有意な配列相同性および構造的相同性を有する７回膜貫通型タンパク質受容体である。

この研究において、ヒトαデフェンシン５ペプチドが、ヒトβデフェンシン１およびスルファジアジンと比べて創傷治癒を有意に増進させ、基底細菌量を低減させることが認められた。ヒトαデフェンシン５は、創傷床へのＬＧＲ幹細胞遊走を誘導するための唯一の治療薬であった。また、遺伝子ヒートマップ解析により、鍵となる創傷治癒およびＷｎｔ経路の転写物、例えば、Ｗｎｔ１およびＷｉｓｐｌのｍＲＮＡの有意な上方調節が示された。このため、ヒトαデフェンシン５は、創傷床へのＬＧＲ幹細胞遊走の増大および付随する細菌の低減および鍵となるＷｎｔおよび創傷治癒転写物の増進による発毛が観察されたため、創傷治癒増進のために使用され得ると結論付けた。簡単には、この研究および他の研究により、ＬＧＲ４＋、ＬＧＲ５＋およびＬＧＲ６＋発現上皮幹細胞が直接的に生体医用工学的軟部組織構築物に使用される可能性の認識がもたらされた。

Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ Ｂｕｌｇｅ ＬＧＲ５＋ ａｎｄ ＬＧＲ６＋ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｇｕｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｈｕｍａｎ Ａｌｐｈａ Ｄｅｆｅｎｓｉｎ ５ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｅｓｅｎｃｅ，Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ，ａｎｄ Ｈａｉｒ Ｇｒｏｗｔｈ ｆｒｏｍ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｄｅｖｏｉｄ ｏｆ Ａｄｎｅｘａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．１３２：１１５９，２０１３

本発明により、第１の実施形態において、単離されたＬＧＲ発現生細胞と、スカフォールディング、コラーゲン、マトリックス、粒子および繊維からなる群より選択される多次元支持体とを含むものである最小限分極（ｍｉｎｉｍａｌｌｙ ｐｏｌａｒｉｚｅｄ）微細凝集塊多細胞組成物を提供する。

本発明により、先の実施形態に対するさらなる一実施形態において、単離されたＬＧＲ発現生細胞と、スカフォールディング、コラーゲン、マトリックス、粒子および繊維からなる群より選択される多次元支持体とを含むものであり、該ＬＧＲ発現細胞に増殖因子が補給され、該ＬＧＲ発現細胞がＬＧＲ４、ＬＧＲ５およびＬＧＲ６からなる群より選択される最小限分極微細凝集塊多細胞組成物を提供する。

本発明により、先のいずれかの実施形態に対するさらなる一実施形態において、単離されたＬＧＲ発現生細胞と、スカフォールディング、コラーゲン、マトリックス、粒子および繊維からなる群より選択される多次元支持体とを含むものであり、該ＬＧＲ発現細胞に遊走性／動員性の被検物が補給され、該ＬＧＲ発現細胞が、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５およびＬＧＲ６からなる群より選択される最小限分極微細凝集塊多細胞組成物を提供する。

本発明により、先のいずれかの実施形態に対するさらなる一実施形態において、単離されたＬＧＲ発現生細胞と、スカフォールディング、コラーゲン、マトリックス、粒子および繊維からなる群より選択される多次元支持体とを含むものであり、該ＬＧＲ発現細胞に、リガンドファミリー、Ｒ−スポンジン、ＥＤＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｗｎｔ、ＶＥＧＦおよび抗菌ペプチドからなる群より選択されるＬＧＲ特異的結合要素が補給され、該ＬＧＲ発現細胞がＬＧＲ４、ＬＧＲ５およびＬＧＲ６からなる群より選択される最小限分極微細凝集塊多細胞組成物を提供する。

本発明により、先のいずれかの実施形態に対するさらなる一実施形態において、単離されたＬＧＲ発現生細胞と、スカフォールディング、コラーゲン、マトリックス、粒子および繊維からなる群より選択される多次元支持体とを含むものであり、組織領域、創傷、空隙、欠損組織または血液からなる選択された標的の周囲のいずれかの隣接組織の改変のための治療用構築物として使用される最小限分極微細凝集塊多細胞組成物を提供する。

本発明により、先のいずれかの実施形態に対するさらなる一実施形態において、単離されたＬＧＲ発現生細胞が損傷組織に治癒を加速させるために移植されることを特徴とする最小限分極微細凝集塊多細胞組成物を提供する。

本発明により、先のいずれかの実施形態に対するさらなる一実施形態において、単離されたＬＧＲ含有細胞が固定された支持体スカフォールディングを含むものである、全身の組織系の修復または回復のための最小限分極微細凝集塊多細胞組成物を提供する。

本発明により、先のいずれかの実施形態に対するさらなる一実施形態において、哺乳動物の全身の外胚葉由来の組織系、中胚葉由来の組織系または内胚葉由来の組織系に適用するための組織移植片を提供する。

本発明の別の実施形態は、哺乳動物の選択された標的組織への移植のためのＬＧＲ発現生細胞を増殖させ、単離する工程を特徴とする、最小限分極微細凝集塊多細胞組成物を得るための方法を特徴とするものである。

本発明により、前述の方法に対するさらなる一実施形態において、哺乳動物の選択された標的組織への移植のためのＬＧＲ発現生細胞を増殖させ、単離する工程を特徴とし、さらに、単離されたＬＧＲ発現生細胞を、スカフォールディング、コラーゲン、マトリックス、粒子および繊維からなる群より選択される多次元支持体に固定化する工程を特徴とする、最小限分極微細凝集塊多細胞組成物を得るための方法を提供する。

本発明は、さらに別の実施形態において、哺乳動物の選択された標的組織への移植のためのＬＧＲ発現生細胞を増殖させ、単離する工程を特徴とし、さらに、ＬＧＲ発現細胞を、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５およびＬＧＲ６からなる群より選択する工程を特徴とする、最小限分極微細凝集塊多細胞組成物を得るための方法を特徴とするものである。

本発明により、先のいずれかの方法の実施形態に対するさらなる一実施形態において、最小限分極微細凝集塊多細胞組成物を、上皮系、腺、毛、神経、骨、筋肉、脂肪、腱、血管、筋膜、眼組織およびペプチド分泌細胞要素からなる群のうちの１つに、塗布、移植、インプラント法、指向型播種、指向型遊走、指向型追跡、インセッティング（ｉｎ ｓｅｔｔｉｎｇ）、積層化および／または発生、再生、増進および治癒用の細胞要素の注射からなる群より選択される手法による送達を用いて適用する工程を提供する。

本発明により、先のいずれかの方法の実施形態に対するさらなる一実施形態において、哺乳動物の選択された標的組織への移植のためのＬＧＲ発現生細胞を増殖させ、単離する工程を特徴とし、さらに、最小限分極微細凝集塊多細胞組成物を、組織回復のために組織に直接インビボで適用する工程を特徴とする、最小限分極微細凝集塊多細胞組成物を得るための方法を提供する。

本発明により、先のいずれかの方法の実施形態に対するさらなる一実施形態において、哺乳動物の選択された標的組織への移植のためのＬＧＲ発現生細胞を増殖させ、単離する工程を特徴とし、さらに、最小限分極微細凝集塊多細胞組成物を、体内の組織回復のために血流によって間接的に適用する工程を特徴とする、最小限分極微細凝集塊多細胞組成物を得るための方法を提供する。

本発明は、また別の実施形態において：
ａ）組織検体を得る工程；
ｂ）該検体から最小限分極機能性単位含有ＬＧＲ発現細胞を抽出する工程；
ｃ）適切な供給源由来の皮下組織および皮下脂肪の細胞成分の加工処理を行う工程；
ｄ）加工処理された皮下組織および皮下脂肪の該成分を、抽出された該最小限分極機能性単位に添加し、上皮幹細胞単一性（ｓｉｎｇｕｌａｒｉｔｙ）単位を作出する工程；
ｅ）該上皮幹細胞単一性単位を富化させる工程；
ｆ）該上皮幹細胞単一性単位を構築物のスカフォールドに添加する工程；ならびに
ｇ）得られた組成物の最小限分極の維持を検証する工程
を特徴とする、最小限分極微細凝集塊多細胞組成物を作製するための方法を特徴とするものである。

本発明により、先のいずれかの実施形態に対するさらなる一実施形態において：ａ）上皮細胞とケラチノサイトの混合物；ｂ）ペニシリン、ストレプトマイシンおよびアムホテリシンＢからなる群より選択される少なくとも１種類の薬剤；ならびにｃ）フィブリノゲンを特徴とする、組織の輸送および加工処理中の微生物のバイアビリティを低下させるための細胞支持培地組成物を用いて、最小限分極微細凝集塊多細胞組成物を得るのに使用される培地配合物を提供する。

本発明により、先の実施形態に対するさらなる一実施形態において：ａ）上皮細胞とケラチノサイトの混合物；ｂ）ペニシリン、ストレプトマイシンおよびアムホテリシンＢからなる群より選択される少なくとも１種類の薬剤；ならびにｃ）フィブリノゲンを特徴とし、該フィブリノゲンがヒト由来であり、該薬剤が、ヒト組織を安定化させるために抗生物質と抗かび薬の両方を含む、組織の輸送および加工処理中の微生物のバイアビリティを低下させるための細胞支持培地組成物を提供する。

本発明の第１の態様との関連において、これは、ＬＧＲ発現細胞をスカフォールディングマトリックスおよび／または繊維に適用し、これにより、組織工学適用、細胞療法適用、再生医療適用、医療／治療適用のための微細凝集塊多細胞移植片を確立させ、該移植片は、全身の上皮系の改善およびまたは改変のために組織または血液に直接適用されることを特徴とするものである。

本発明の第２の態様は、ＬＧＲ発現細胞をスカフォールディング、マトリックスおよび／または繊維に、さらなる増強因子または被検物ありまたはなしで、インビボ上皮系の改善およびまたは改変のために組織または血液に適用する前または適用した後のいずれかで適用することを特徴とするものである。

本発明のさらなる一態様は、増強因子または被検物によって改変されており、上皮系の改善およびまたは改変のために体内、組織中または血液中の標的として全身への局所遊走もしくは遠位遊走によって適用される、および／または腺および発毛を回復させるために適用されるＬＧＲ発現細胞を特徴とするものである。

本発明の第４の態様は、組織、血液または培養物由来のＬＧＲ発現細胞を、例えば、周囲の隣接組織または遠位組織（スカフォールディング、マトリックスおよび繊維に適用されたＬＧＲ発現細胞は含まない。）の改変のために、全身の外胚葉由来の組織系、中胚葉由来の組織系または内胚葉由来の組織系の改善およびまたは改変のために組織または血液に適用する前または適用した後のいずれかで移植することを特徴とするものである。

本発明の第５の態様は、ＬＧＲ発現細胞を、スカフォールディング、マトリックスおよび繊維からなる群より選択される送達基材媒体に、さらなる増強因子または被検物ありまたはなしで、全身の外胚葉由来の組織系、中胚葉由来の組織系または内胚葉由来の組織系の改善およびまたは改変のために組織または血液に適用する前または適用した後のいずれかで、直接適用することを特徴とするものである。

本発明のさらに別の態様は、増強因子または被検物によって改変したＬＧＲ発現細胞を、全身への局所遊走もしくは遠位遊走によって全身の外胚葉由来の組織系、中胚葉由来の組織系または内胚葉由来の組織系の改善およびまたは改変のために体内、組織中または血液中の標的として送達支持体基材と組み合わせることを特徴とするものである。

本発明のさらなる一態様は、ＬＧＲ発現細胞を支持体基材に、上皮系、腺、毛、神経、骨、筋肉、脂肪、腱、血管、筋膜、眼組織およびペプチド分泌細胞要素を発生、再生、増進および／または治癒させる細胞要素の送達、塗布、移植、インプラント法、指向型播種、指向型遊走、指向型追跡、インセッティング、積層化および／または注射のために付着させることを特徴とするものである。

最後に記載する本発明の一態様は、組織の発生、再生、増進および／または治癒を増進および加速させるために哺乳動物の体内、組織中または血液中の標的に移植および直接適用されるための最小限の分極を示す微細凝集塊多細胞機能性単位としてのＬＧＲ発現幹細胞を作製することである。

ほとんどの一般用語において、本明細書における発明では、上皮系、毛、腺 骨の発生、再生、動員または増進のための単離されたＬＧＲ発現細胞（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体）の移植および／または送達を想定している。また、本発明では、スカフォールディング、マトリックスまたは繊維の形態の送達媒体が使用され、遊走性増殖因子／動員性被検物またはＬＧＲ特異的結合要素、例えば限定されないが、リガンドファミリー：Ｒ−スポンジン、ＥＤＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｗｎｔ、ＶＥＧＦ、抗菌ペプチドの補給ありまたはなしでの臨床医学、バイオエンジニアリングおよび／または研究用構築物における局所／近接組織および遠位／遠隔組織の両方に対する適用を想定している。

ＬＧＲ上皮幹細胞を、特に、成形されたスカフォールディング基材とともに使用することにより、上皮系内の全層性創傷およびまたは空隙に幹細胞を多く含む組織代替材料が提供される。さらに、この最小限分極機能性細胞単位（ＭＰＦＵ）を上皮系に添加すると、上皮および局所周囲組織要素の健常性およびバイアビリティを維持および促進するために一般的に必要とされる上皮の状態（毛、腺、分泌抗菌ペプチド、増殖因子および被検物の成長、発生または再生が挙げられる。）が増進／改善される。

ＬＧＲ４＋、ＬＧＲ５＋およびＬＧＲ６＋幹細胞ならびに前駆細胞の増殖速度論は、特に、基材スカフォールディングと接触している場合は高い状態が維持されることが認識されており、完全な上皮のターンオーバー速度は典型的には１２日未満である（１ｃｍの集団間距離空間）。充分な二層組織を再生させ、続いてバリア機能を再生させるこの能力は、このような細胞の複雑な全層性多組織創傷に対する一種の生物学的ドレッシング材の発生としての役割を示唆している。

皮膚、筋肉および骨を速やかに再生させる能力の他に、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５およびＬＧＲ６幹細胞の前駆細胞はまた、天然抗菌ペプチドを生成させる能力も有し、この天然抗菌ペプチドは、創傷床における微生物の基底レベルを低下させるだけでなく、前駆細胞の増幅と分化を増大させ、創傷および創周囲の感染の低減、高速創傷閉鎖および毛包発達をもたらす。

本明細書における発明において、幹細胞コロニー増殖巣を付随するコンピテントな子孫とともに維持し得る直に送達可能なバイアブル組織バリアの提供におけるＬＧＲ発現上皮幹細胞播種スカフォールドの変換的（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）利用可能性を記載する。このような幹細胞増殖巣から、子孫は、上皮組織要素、治癒および移植片の一体化を刺激するために遊走性の増殖性分化を行い得る。ＬＧＲ上皮幹細胞は、単独、スカフォールディング、可溶性増殖因子および／またはスカフォールド結合集団の分極を促進するさらなる細胞系統ならびに上皮の治癒と細胞再生の労力に必要とされる内在性組織構造とともに適用され得ることがわかった。

広義では、本発明のプロトコルは：ａ）ヒト／哺乳動物の生体組織を収集すること；ｂ）組織要素を加工処理し、ＬＧＲ発現細胞を含む微細凝集塊多細胞機能性単位を作製すること；ｃ）このＬＧＲ発現細胞の微細凝集塊多細胞機能性単位を、スカフォールディング、マトリックス、粒子、細胞（１つまたは複数）および繊維からなる群より選択される送達媒体基材に適用し、構築物を作出すること；ｄ）場合により、選択されたさらなる増強因子を含めること；ならびにｅ）この構築物を組織に、組織系、例えば、外胚葉、中胚葉および／または内胚葉が起源の組織に関連するもの、例えば限定されないが、皮膚、腺、毛、神経、骨、筋肉、脂肪、腱、血管、筋膜、眼組織、骨髄、肺、心臓、爪、胃腸組織、口腔組織、歯、味蕾、泌尿生殖器組織、腎組織、生殖組織、リンパ系組織、免疫系組織／要素ならびにかかるものの関連付属器およびタンパク質細胞要素を発生、再生、増進および／または治癒させるために適用することを伴うものである。

本発明は、治療、デバイス、生物学、薬物およびバイオエンジニアリングにおいて哺乳動物組織（１種類または複数種）を改変するために支持体を有するＬＧＲ発現上皮幹細胞を、該細胞要素の塗布、移植、インプラント法、指向型播種、指向型遊走、指向型追跡、インセッティング、積層化および／または注射によって直接送達することを想定している。

定義
本詳細説明において、「一実施形態（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ，ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「実施形態において（ｉｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）」に対する言及は、言及されている特色が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれていることを意味する。さらに、「一実施形態（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ，ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「実施形態（ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）」に対する個々の言及は、必ずしも同じ実施形態に言及しているのではない；しかしながら、その旨の記載がない限り、および当業者に容易に自明である場合を除き、これらはいずれも、互いに排他的な実施形態ではない。従って、本発明には、本明細書に記載の実施形態の任意のさまざまな組合せおよび／または統合が包含され得る。本明細書で用いている専門用語は、具体的な実施形態を説明する目的のためのものにすぎず、本発明の限定を意図するものではない。

本明細書で用いる場合、単数形「１つの（ａ、ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、本文中で、特に断らない限り、複数形も同様に含むものとする。さらに、語根「ｉｎｃｌｕｄｅ（含む）」および／または「ｈａｖｅ（有する）」は、本明細書において用いる場合、記載の特色、工程、操作、要素および／または成分の存在を指定しているが、少なくとも１つの他の特色、工程、操作、要素、成分および／またはこの群の存在または追加を除外するものではないことは理解されよう。

本明細書で用いる場合、骨は、ミネラル地の物質とコラーゲン繊維のマトリックス中に包埋された細胞からなる硬い結合組織を意味する。この繊維に無機成分、例えばリン酸カルシウムの結晶が、Ｘ線回折を使用すると、ヒドロキシアパタイトパターン（リン酸カルシウムが８５重量％である。）ならびに炭酸カルシウム（１０％）とマグネシウム中に組織化されて見えるように含浸されている；重量基準で、骨は６５から７５％の無機物と２５から３５％の有機物で構成されている；明確な形状とサイズの一部の骨組織は動物の骨格の一部を構成している；ヒトでは、骨格内におよそ２００の相違する骨がある（鼓室の耳小骨または２つの膝蓋骨以外の種子骨は含まない。）。骨は線維性の膜である骨膜に覆われており、骨膜は、関節の軟骨を除く骨の全表面を覆っている。骨膜の下には緻密層である緻密骨が存在し、この下には海綿状の層である海綿質骨が存在する。長骨の芯部は髄で満たされている。

本明細書で用いる場合、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、「ｈａｓ（有する）」、「ｈａｖｉｎｇ（有する）」または任意の他の変化形は、非排他的含有を含むものとする。例えば、列挙された特色を含む工程、方法、物品または装置は、必ずしも該特色のみに限定されず、かかる工程、方法、物品または装置に対して明示されていないか、または固有の他の特色を含むものであってもよい。

本明細書で用いる場合、上皮は、皮膚、粘膜および漿液のあらゆる自由表面、例えば、腺ならびにこれらに由来する他の構造部を覆っている細胞の層を意味する。

本明細書で用いる場合、ＧＭＰは適正製造基準を意味する。

本明細書で用いる場合、外皮は、身体の包囲（ｅｎｖｅｌｏｐｉｎｇ）膜を意味し；表皮および真皮に加えて、表皮、毛、爪、汗腺および皮脂腺および乳腺ならびに皮下組織のあらゆる派生部が包含される。

本明細書で用いる場合、ＬＧＲ４は、さまざまな生理学的機能において鍵となる役割を果たすＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）であるロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体４を意味する。ロイシンリッチＧＰＣＲ（ＬＧＲ）ファミリーの構成員（ＧＰＲ４８など）は、複数のＮ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）と７回膜貫通ドメインを有する。ＬＧＲ４（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体４）はタンパク質コード遺伝子である。ＬＧＲ４と関連している疾患としては、低骨密度が挙げられる。関連経路にはＷｎｔシグナル伝達経路（ＫＥＧＧ）がある。この遺伝子に関連するＧＯアノテーションとしては、Ｇタンパク質共役受容体活性および膜貫通シグナル伝達受容体活性が挙げられる。この遺伝子の重要なパラログはＬＧＲ６である。古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路を増強し、種々の器官の形成に関与しているＲ−スポンジンの受容体。Ｒ−スポンジン（ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３またはＲＳＰＯ４）に結合するとリン酸化ＬＲＰ６およびフリズルド受容体（細胞外Ｗｎｔ受容体によって活性化される。）と会合し、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路を誘発して標的遺伝子の発現を増大させる。

従来のＧタンパク質共役受容体とは対照的に、ＬＧＲ４は、シグナルを伝達するためにヘテロ三量体Ｇタンパク質を活性化するものではない。Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化因子としての機能は、種々の器官、例えば、肝臓、腎臓、腸、骨、生殖管および目の発達に必要とされる。また、ＬＧＲ４はノリン（ｎｏｒｒｉｎ）（ＮＤＰ）の受容体としての機能も果たし得、精子形成の際に、管周筋様細胞においてＷｎｔシグナル伝達経路を活性化させるために必要とされる。同様に、ＬＧＲ４は、出生後の腸陰窩における腸幹細胞の維持およびパネート細胞の分化にも必要とされる。また、ＬＧＲ４は、腎臓の発達に関与していることに加えて、骨の形成とリモデリングの調節因子としても機能も果たし；尿管芽を未分化の状態に維持するのに必要とされる。ＬＧＲ４は、目の前部の発達に関与しており、赤血球生成の際に必要とされ、また、ＴＬＲ２／ＴＬＲ４関連パターン認識および炎症促進性サイトカイン産生を阻害することによって自然免疫の負の調節因子としての機能も果たす。ＬＧＲは、血漿脂質の概日リズムの調節において、一部、ＭＴＴＰの律動性発現を調節することによって（類似性により）重要な役割を果たす。ＬＧＲ４の一般的に知られた別名としては：ＧＰＲ４８；Ｇタンパク質共役受容体４８；ＢＮＭＤ１７；ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体４；ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体４；およびＧタンパク質共役受容体４８が挙げられる。ＬＧＲ４の外部データベースの識別表示としては：ＨＧＮＣ：１３２９９ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：５５３６６ Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２０５２１３ ＯＭＩＭ：６０６６６６およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＢＸＢが挙げられる。

本明細書で用いる場合、ＬＧＲ５は、タンパク質コード遺伝子であるロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５を意味する。関連経路にはＷｎｔシグナル伝達経路（ＫＥＧＧ）がある。この遺伝子に関連するＧＯアノテーションとしては、Ｇタンパク質共役受容体活性および膜貫通シグナル伝達受容体活性が挙げられる。この遺伝子の重要なパラログはＬＧＲ６である。ＬＧＲ５受容体は、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路を増強し、腸上皮および毛包の幹細胞マーカーとしての機能を果たすＲ−スポンジンに対するものである。Ｒ−スポンジン（ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３またはＲＳＰＯ４）に結合するとリン酸化ＬＲＰ６およびフリズルド受容体（細胞外Ｗｎｔ受容体によって活性化される。）と会合し、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路を誘発して標的遺伝子の発現を増大させる。従来のＧタンパク質共役受容体とは対照的に、ＬＧＲ５は、シグナルを伝達するためにヘテロ三量体Ｇタンパク質を活性化するものではない。後胚発生時の成体腸幹細胞の発生および／または維持に関与している。ＬＧＲ５の一般的に知られた別名としては：Ｇタンパク質共役受容体ＨＧ３８；Ｇタンパク質共役受容体４９；Ｇタンパク質共役受容体６７；ＧＰＲ６７；ＧＰＲ４９およびロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５が挙げられる。ＬＧＲ５の外部データベースの識別表示としてはＨＧＮＣ：４５０４ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：８５４９ ＥｎｓｅｍｂＩ：ＥＮＳＧ０００００１３９２９２ ＯＭＩＭ：６０６６６７ ａｎｄ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０７５４７３が挙げられる。

本明細書で用いる場合、ＬＧＲ６は、タンパク質コード遺伝子（Ｇタンパク質共役７回膜貫通タンパク質スーパーファミリーのロイシンリッチリピート含有サブグループの構成員をコードしている遺伝子）であるロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体６を意味する。コードされたタンパク質は、リガンド結合のための馬蹄形相互作用モチーフの形成に重要なロイシンリッチリピートを含む大きなＮ末端細胞外ドメインを有する糖タンパク質ホルモン受容体である。この遺伝子の選択的スプライシングにより、複数種の転写物バリアントがもたらされる。ＬＧＲ６と関連している疾患としては粘液水腫および卵巣嚢胞腺腫が挙げられる。関連経路にはＷｎｔシグナル伝達経路（ＫＥＧＧ）およびＧＰＣＲがある。この遺伝子に関連する他のアノテーションとしては、Ｇタンパク質共役受容体活性および膜貫通シグナル伝達受容体活性が挙げられる。この遺伝子の重要なパラログはＴＳＨＲである。古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路を増強し、表皮の多能性幹細胞のマーカーとしての機能を果たすＲ−スポンジンの受容体。Ｒ−スポンジン（ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３またはＲＳＰＯ４）に結合するとリン酸化ＬＲＰ６およびフリズルド受容体（細胞外Ｗｎｔ受容体によって活性化される。）と会合し、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路を誘発して標的遺伝子の発現を増大させる。従来のＧタンパク質共役受容体とは対照的に、ＬＧＲ６は、シグナルを伝達するためにヘテロ三量体Ｇタンパク質を活性化するものではなく、腫瘍抑制因子としての機能を果たし得る。ＬＧＲ６の一般的な別名としては：ゴナドトロピン受容体；ＶＴＳ２０６３１およびＧＰＣＲが挙げられる。ＬＧＲ６の外部データベースの識別表示としてはＨＧＮＣ：１９７１９ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：５９３５２ ＥｎｓｅｍｂＩ：ＥＮＳＧ０００００１３３０６７ ＯＭ ＩＭ：６０６６５３およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＨＢＸ８が挙げられる。

本明細書で用いる場合、間葉は、間葉細胞の集合体を意味する。通常、星形の形態で、層間ゼリーに支持された間葉細胞からなる始原胚性結合組織。

本明細書で用いる場合、筋肉は、主として非常に特殊な収縮性細胞からなる一次組織を意味し、これは、骨格筋、心筋または平滑筋に分類され得；微視的には、後者には、その他の２つの型に特徴的な横紋構造がなく；種々の器官および部分の運動を行う身体の収縮性器官の１つ；典型的な筋肉は、両端が腱によって骨または他の構造部に結合された筋繊維塊（筋腹（「ｖｅｎｔｅｒ」または「ｂｅｌｌｙ」）であり；より近位またはより固定的な結合部は起始（ｑ．ｖ．）と称され、より遠位またはより可動的な結合部は付着点（ｑ．ｖ．）であり；起始腱に結合している筋腹の細くなっている部分は筋頭（「ｃａｐｕｔ」または「ｈｅａｄ」）と称される。

本明細書で用いる場合、神経（の）は、神経細胞またはこの突起で構成された任意の構造またはさらに発達して神経細胞に進化する任意の構造を含むものとする。椎体またはこの前駆体の背面は、血管側（ｈｅｍａｌ）に対して脊髄が存在する箇所をいう。

本明細書で用いる場合、特に断らない限り、「ｏｒ（または／もしくは）」は包含的論理和を示し、排他的論理和を示すのではない。例えば、状態Ａまたは（もしくは）Ｂは、以下：Ａが真であり（または存在し）、Ｂが偽である（または存在しない）、Ａが偽であり（または存在せず）、Ｂが真である（または存在する）、およびＡとＢの両方が真である（または存在する）、のいずれか１つを満足するものである。

本明細書における粒子の意味は、最大ドメインが１０ミクロン以下であることを暗に示しており、限定されないが、細胞微細凝集塊の好適なアンカーとして使用できるナノ粒子、巨大分子の集合体、ミセル、細胞形骸、デンドリマーなどが包含される。

本明細書で用いる場合、極性は、細胞、組織（１種類もしくは複数種）および／または生物体が軸に沿って差別的に発達する傾向を意味する。

本明細書で用いる場合、Ｐｕｌｓｅ Ｒｅｓｃｕｅ Ｍｅｄｉａ（ＰＲＭ）は、ケラチノサイト−ＳＦＭ（１Ｘ）、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびアムホテリシンＢからなる群より選択される抗生物質−抗かび薬ならびにフィブリノゲンを含む細胞支持培地混合物の配合物であり、ここで、ケラチノサイト−ＳＦＭは上皮細胞とケラチノサイトの混合物で構成されている。試薬は、一次組織を安定化させ、輸送中および加工処理中の微生物のバイアビリティを低減させるために使用される。

本明細書で用いる場合、皮膚は、表皮と真皮（ｄｅｒｍｉｓ，ｃｏｒｉｕｍ）からなる身体の膜性保護被覆を意味する。

本明細書で用いる場合、幹細胞は、任意の前駆細胞；他の細胞型に分化し得る娘細胞を有する細胞；子孫を１つ以上の細胞系統に移行させつつ、自身の数を維持し得る細胞を意味する。

本明細書で用いる場合、「実質的に」、「一般的に」および程度を示す他の語は、この語で修飾された特徴の許容可能な差異を示すことが意図された相対修飾語である。これは、修飾された絶対的な値または特性に限定することを意図するものではなく、逆に、むしろ物理的または機能的特性の幅を有すること、好ましくは、かかる物理的または機能的特性に近いことまたは近接していることを意図する。

本明細書で用いる場合、組織は、類似した細胞とこの周囲の細胞間物質の集合体を意味する。身体には基本的に４種類の組織：上皮；結合組織、例えば、脂肪組織、血液、骨および軟骨；筋肉組織；ならびに神経組織がある。外皮、被膜または任意の身体もしくはこの一部の被層。

以下の説明において、説明の目的のために提供される添付の図面に言及する。以下の実例の実施形態は、当業者が本発明を実施できるのに充分に詳細に説明している。他の実施形態が使用され得ること、ならびに現在知られている構造的および／または機能的等価物に基づいて、本発明の範囲から逸脱することなく、構造的変更がなされ得ることは理解されよう。

皮膚起源の前記ＬＧＲ発現細胞の位置の一例を示す。 蛍光標示式細胞分取のグラフである。 本発明との関連における使用に想定される一連の種々の非細胞支持体の写真である。 播種に使用可能な巨視的細胞性構築物／脱細胞化コラーゲンスカフォールドの写真である。 部分的に消化された細胞凝集塊を播種した後のコラーゲン構築物の免疫蛍光顕微鏡写真である。 異なる手法による、一連の異なるＬＧＲ６＋上皮幹細胞が播種された基材の種々の画像を示す。 異なる手法による、一連の異なるＬＧＲ６＋上皮幹細胞が播種された基材の種々の画像を示す。 異なる手法による、一連の異なるＬＧＲ６＋上皮幹細胞が播種された基材の種々の画像を示す。 異なる手法による、一連の異なるＬＧＲ６＋上皮幹細胞が播種された基材の種々の画像を示す。 異なる手法による、一連の異なるＬＧＲ６＋上皮幹細胞が播種された基材の種々の画像を示す。 異なる手法による、一連の異なるＬＧＲ６＋上皮幹細胞が播種された基材の種々の画像を示す。 対照およびＬＧＲを播種されたマトリックスの例の経時的なインビボ治癒の進行を示す。 １０日目におけるサイトケラチン−１７転写物の発現のグラフ表示である。 生物発光イメージングおよび走査型電子顕微鏡検査による、対照およびＬＧＲ ＥＳＣを播種されたマトリックスを示す。 生物発光イメージングおよび走査型電子顕微鏡検査による、対照およびＬＧＲ ＥＳＣを播種されたマトリックスを示す。 生物発光イメージングおよび走査型電子顕微鏡検査による、対照およびＬＧＲ ＥＳＣを播種されたマトリックスを示す。 最初の分極の形成を示す、ＬＧＲ ＥＳＣを有する構築物の例と、間質血管群細胞単離集団を、グラフによる比較とともに示す。 最初の分極の形成を示す、ＬＧＲ ＥＳＣを有する構築物の例と、間質血管群細胞単離集団を、グラフによる比較とともに示す。 最初の分極の形成を示す、ＬＧＲ ＥＳＣを有する構築物の例と、間質血管群細胞単離集団を、グラフによる比較とともに示す。 最初の分極の形成を示す、ＬＧＲ ＥＳＣを有する構築物の例と、間質血管群細胞単離集団を、グラフによる比較とともに示す。 最初の分極の形成を示す、ＬＧＲ ＥＳＣを有する構築物の例と、間質血管群細胞単離集団を、グラフによる比較とともに示す。 間質血管群の細胞性実体ありおよびなしのＬＧＲ細胞含有構築物ならびに増殖因子の相対的産生の一例を示す。 間質血管群の細胞性実体ありおよびなしのＬＧＲ細胞含有構築物ならびに増殖因子の相対的産生の一例を示す。 第三度の創傷床の誘導並びにＬＧＲ幹細胞毛包隆起および付属構造の除去の確認を示す。 第三度の創傷床の誘導並びにＬＧＲ幹細胞毛包隆起および付属構造の除去の確認を示す。 第三度の創傷床の誘導並びにＬＧＲ幹細胞毛包隆起および付属構造の除去の確認を示す。 第三度の創傷床の誘導並びにＬＧＲ幹細胞毛包隆起および付属構造の除去の確認を示す。 第三度の創傷床の誘導並びにＬＧＲ幹細胞毛包隆起および付属構造の除去の確認を示す。 第三度の創傷床の誘導並びにＬＧＲ幹細胞毛包隆起および付属構造の除去の確認を示す。 第三度の創傷床の誘導並びにＬＧＲ幹細胞毛包隆起および付属構造の除去の確認を示す。 第三度の創傷床の誘導並びにＬＧＲ幹細胞毛包隆起および付属構造の除去の確認を示す。 細菌の付着に関する、ＤＥＦＡ５を有する創傷／傷害／空隙の時間推移を示す。 細菌の付着に関する、ＤＥＦＡ５を有する創傷／傷害／空隙の時間推移を示す。 細菌の付着に関する、ＤＥＦＡ５を有する創傷／傷害／空隙の時間推移を示す。 細菌の付着に関する、ＤＥＦＡ５を有する創傷／傷害／空隙の時間推移を示す。 細菌の付着に関する、ＤＥＦＡ５を有する創傷／傷害／空隙の時間推移を示す。 細菌の付着に関する、ＤＥＦＡ５を有する創傷／傷害／空隙の時間推移を示す。 細菌の付着に関する、ＤＥＦＡ５を有する創傷／傷害／空隙の時間推移を示す。 細菌の付着に関する、ＤＥＦＡ５を有する創傷／傷害／空隙の時間推移を示す。 細菌の付着に関する、ＤＥＦＡ５を有する創傷／傷害／空隙の時間推移を示す。 細菌の付着に関する、ＤＥＦＡ５を有する創傷／傷害／空隙の時間推移を示す。 細菌の付着に関する、ＤＥＦＡ５を有する創傷／傷害／空隙の時間推移を示す。 細菌の付着に関する、ＤＥＦＡ５を有する創傷／傷害／空隙の時間推移を示す。 細菌の付着に関する、ＤＥＦＡ５を有する創傷／傷害／空隙の時間推移を示す。 細菌の付着に関する、ＤＥＦＡ５を有する創傷／傷害／空隙の時間推移を示す。 細菌の付着に関する、ＤＥＦＡ５を有する創傷／傷害／空隙の時間推移を示す。 細菌の付着に関する、ＤＥＦＡ５を有する創傷／傷害／空隙の時間推移を示す。 細菌の付着に関する、ＤＥＦＡ５を有する創傷／傷害／空隙の時間推移を示す。 付属器構造部の処置された熱傷創欠損部における治癒の増進、組織および付属器再生ならびにその後の発毛に関する、創傷床内のＤＥＦＡ５発現細胞性実体の比較写真である。 付属器構造部の処置された熱傷創欠損部における治癒の増進、組織および付属器再生ならびにその後の発毛に関する、創傷床内のＤＥＦＡ５発現細胞性実体の比較写真である。 局所的病巣因子による治療後の、創傷床の治癒の動力学の定量化並びにＬＧＲ５およびＬＧＲ６幹細胞の熱傷組織への移動を示す。 局所的病巣因子による治療後の、創傷床の治癒の動力学の定量化並びにＬＧＲ５およびＬＧＲ６幹細胞の熱傷組織への移動を示す。 局所的病巣因子による治療後の、創傷床の治癒の動力学の定量化並びにＬＧＲ５およびＬＧＲ６幹細胞の熱傷組織への移動を示す。 局所的病巣因子による治療後の、創傷床の治癒の動力学の定量化並びにＬＧＲ５およびＬＧＲ６幹細胞の熱傷組織への移動を示す。 局所的病巣因子による治療後の、創傷床の治癒の動力学の定量化並びにＬＧＲ５およびＬＧＲ６幹細胞の熱傷組織への移動を示す。 局所的病巣因子による治療後の、創傷床の治癒の動力学の定量化並びにＬＧＲ５およびＬＧＲ６幹細胞の熱傷組織への移動を示す。 局所的病巣因子による治療後の、創傷床の治癒の動力学の定量化並びにＬＧＲ５およびＬＧＲ６幹細胞の熱傷組織への移動を示す。 局所的病巣因子による治療後の、創傷床の治癒の動力学の定量化並びにＬＧＲ５およびＬＧＲ６幹細胞の熱傷組織への移動を示す。 局所的病巣因子による治療後の、創傷床の治癒の動力学の定量化並びにＬＧＲ５およびＬＧＲ６幹細胞の熱傷組織への移動を示す。 局所的病巣因子による治療後の、創傷床の治癒の動力学の定量化並びにＬＧＲ５およびＬＧＲ６幹細胞の熱傷組織への移動を示す。 局所的病巣因子による治療後の、創傷床の治癒の動力学の定量化並びにＬＧＲ５およびＬＧＲ６幹細胞の熱傷組織への移動を示す。 局所的病巣因子による治療後の、創傷床の治癒の動力学の定量化並びにＬＧＲ５およびＬＧＲ６幹細胞の熱傷組織への移動を示す。 治癒促進経路の増進に関する、ＤＥＦＡ５からＳＤＺにより治療した創傷／傷害／組織の空隙の、ＲＴ−ＰＣＲ定量および遺伝子ヒートマップ比較を示す。 治癒促進経路の増進に関する、ＤＥＦＡ５からＳＤＺにより治療した創傷／傷害／組織の空隙の、ＲＴ−ＰＣＲ定量および遺伝子ヒートマップ比較を示す。 毛包の細胞のＬＧＲ６発現および培養の拡大について共発現しているＬＧＲ６＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ７３＋のＧＦＰ標識細胞の蛍光活性化細胞ソーティングを示す。 毛包の細胞のＬＧＲ６発現および培養の拡大について共発現しているＬＧＲ６＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ７３＋のＧＦＰ標識細胞の蛍光活性化細胞ソーティングを示す。 毛包の細胞のＬＧＲ６発現および培養の拡大について共発現しているＬＧＲ６＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ７３＋のＧＦＰ標識細胞の蛍光活性化細胞ソーティングを示す。 毛包の細胞のＬＧＲ６発現および培養の拡大について共発現しているＬＧＲ６＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ７３＋のＧＦＰ標識細胞の蛍光活性化細胞ソーティングを示す。 毛包の細胞のＬＧＲ６発現および培養の拡大について共発現しているＬＧＲ６＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ７３＋のＧＦＰ標識細胞の蛍光活性化細胞ソーティングを示す。 毛包の細胞のＬＧＲ６発現および培養の拡大について共発現しているＬＧＲ６＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ７３＋のＧＦＰ標識細胞の蛍光活性化細胞ソーティングを示す。 毛包の細胞のＬＧＲ６発現および培養の拡大について共発現しているＬＧＲ６＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ７３＋のＧＦＰ標識細胞の蛍光活性化細胞ソーティングを示す。 毛包の細胞のＬＧＲ６発現および培養の拡大について共発現しているＬＧＲ６＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ７３＋のＧＦＰ標識細胞の蛍光活性化細胞ソーティングを示す。 毛包の細胞のＬＧＲ６発現および培養の拡大について共発現しているＬＧＲ６＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ７３＋のＧＦＰ標識細胞の蛍光活性化細胞ソーティングを示す。 最初の播種時および１日後の機能性単一性単位（ａＦＳＵ）の共焦点顕微鏡検査および生物発光による顕微鏡写真である。 最初の播種時および１日後の機能性単一性単位（ａＦＳＵ）の共焦点顕微鏡検査および生物発光による顕微鏡写真である。 最初の播種時および１日後の機能性単一性単位（ａＦＳＵ）の共焦点顕微鏡検査および生物発光による顕微鏡写真である。 最初の播種時および１日後の機能性単一性単位（ａＦＳＵ）の共焦点顕微鏡検査および生物発光による顕微鏡写真である。 コラーゲンスカフォールドの顕微鏡写真である。 皮膚組織内の位置、表現型、境界面および極性に関する、多様なＬＧＲ細胞の位置の一例を示す。毛包隆起由来のＬＧＲ６＋ＥＳＣの単離および培養。 皮膚組織内の位置、表現型、境界面および極性に関する、多様なＬＧＲ細胞の位置の一例を示す。毛包隆起由来のＬＧＲ６＋ＥＳＣの単離および培養。 皮膚組織内の位置、表現型、境界面および極性に関する、多様なＬＧＲ細胞の位置の一例を示す。毛包隆起由来のＬＧＲ６＋ＥＳＣの単離および培養。 皮膚組織内の位置、表現型、境界面および極性に関する、多様なＬＧＲ細胞の位置の一例を示す。毛包隆起由来のＬＧＲ６＋ＥＳＣの単離および培養。 皮膚組織内の位置、表現型、境界面および極性に関する、多様なＬＧＲ細胞の位置の一例を示す。毛包隆起由来のＬＧＲ６＋ＥＳＣの単離および培養。 創傷／傷害／組織の空隙周囲および／またはこの内部への配置による送達方法に関する、ＬＧＲ発現細胞小増殖巣の一例を示す。 創傷／傷害／組織の空隙周囲および／またはこの内部への配置による送達方法に関する、ＬＧＲ発現細胞小増殖巣の一例を示す。 創傷／傷害／組織の空隙周囲および／またはこの内部への配置による送達方法に関する、ＬＧＲ発現細胞小増殖巣の一例を示す。 創傷／傷害／組織の空隙周囲および／またはこの内部への配置による送達方法に関する、ＬＧＲ発現細胞小増殖巣の一例を示す。 創傷／傷害／組織の空隙周囲および／またはこの内部への配置による送達方法に関する、ＬＧＲ発現細胞小増殖巣の一例を示す。 送達可能な媒体による創傷内および創傷周囲への送達ならびにその後の組織および支持構造体の治癒、再生に関する、ＬＧＲ含有幹細胞増殖巣の一例を示す。 送達可能な媒体による創傷内および創傷周囲への送達ならびにその後の組織および支持構造体の治癒、再生に関する、ＬＧＲ含有幹細胞増殖巣の一例を示す。 送達可能な媒体による創傷内および創傷周囲への送達ならびにその後の組織および支持構造体の治癒、再生に関する、ＬＧＲ含有幹細胞増殖巣の一例を示す。 送達可能な媒体による創傷内および創傷周囲への送達ならびにその後の組織および支持構造体の治癒、再生に関する、ＬＧＲ含有幹細胞増殖巣の一例を示す。 移植後１０日目の全層性創傷床におけるＬＧＲ６＋上皮幹細胞の遊走および分化を示す。 移植後１０日目の全層性創傷床におけるＬＧＲ６＋上皮幹細胞の遊走および分化を示す。 移植後１０日目の全層性創傷床におけるＬＧＲ６＋上皮幹細胞の遊走および分化を示す。 移植後１０日目の全層性創傷床におけるＬＧＲ６＋上皮幹細胞の遊走および分化を示す。 ＬＧＲ発現細胞小増殖巣を有する創傷／傷害／組織の空隙のＲＴ−ＰＣＲ定量およびインセットは遺伝子のヒートマップ解析の比較を示す。 創傷／傷害／組織の空隙内および／またはこの周囲への送達ならびに創傷治癒因子の増進に関する、前記ＬＧＲ発現細胞小増殖巣の一例を示す。 骨組織の再生に関する、ＬＧＲ発現細胞小増殖巣の一例を示す。単離されたＬＧＲ小増殖巣は播種された骨であり得、バイアブルなままであり得る。 骨組織の再生に関する、ＬＧＲ発現細胞小増殖巣の一例を示す。単離されたＬＧＲ小増殖巣は播種された骨であり得、バイアブルなままであり得る。 骨組織の再生に関する、ＬＧＲ発現細胞小増殖巣の一例を示す。単離されたＬＧＲ小増殖巣は播種された骨であり得、バイアブルなままであり得る。 骨組織の再生に関する、ＬＧＲ発現細胞小増殖巣の一例を示す。単離されたＬＧＲ小増殖巣は播種された骨であり得、バイアブルなままであり得る。 骨組織の再生に関する、ＬＧＲ発現細胞小増殖巣の一例を示す。単離されたＬＧＲ小増殖巣は播種された骨であり得、バイアブルなままであり得る。 骨組織の再生に関する、ＬＧＲ発現細胞小増殖巣の一例を示す。単離されたＬＧＲ小増殖巣は播種された骨であり得、バイアブルなままであり得る。

図１ＡからＣ 毛包周囲に存在している細胞集団および播種するとかかる細胞が容易に付着するスカフォールドのフローサイトメトリーの例。より具体的には、図１Ａは、皮膚起源の前記ＬＧＲ発現細胞の位置の一例を示す。４０倍の倍率での免疫蛍光共焦点顕微鏡検査は毛包隆起（白矢印）、ＬＧＲ６＋（緑）、ＤＮＡ（青）を示す。図１Ｂは、ゲート解析を伴い、例示的な細胞マーカーを示す蛍光標示式細胞分取のグラフである。図１Ｃは、一群の細胞型が、本発明による一連の非細胞マトリックス／基材／スカフォールド／材料に播種するために使用され得ることを示す。

図２Ａは、本発明によるＬＧＲ発現幹細胞増殖巣含有微細凝集塊多細胞機能性単位なしの巨視的構築物の一例の写真表示である。図２Ｂは、部分的に消化された細胞凝集塊を基材の播種した後の構築物を示す。

図３Ａは、縦欄形式での、異なる供給源に由来するＬＧＲ播種基材の微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）共焦点顕微鏡検査による一連の画像である。図３Ｂは、２０倍の倍率での免疫蛍光共焦点顕微鏡検査による、それぞれのＬＧＲ発現細胞含有構築物のＬＧＲ６＋ＥＳＣ播種マトリックスの対応する欄である。白い囲みの差し込み部は、図３Ｄの欄に示された増殖巣のズーム領域を表し、一方、図３Ｃは、マトリックスの輪郭と境界を示す図３Ａ（ＤＩＣ）および図３Ｂの免疫蛍光図のそれぞれの画像のデジタルマージを示す欄である。図３Ｅおよび３Ｆの欄は、それぞれ、播種後７２時間目の非細胞マトリックス対照の放射効率で測定された生物発光および対応するＬＧＲ６＋ＥＳＣ播種マトリックスを表す。

図４ＡからＥは、生きている哺乳動物の系内に配した前記ＬＧＲ含有構築物の例を示す。ＬＧＲ６＋ ＧＦＰ ＥＳＣ播種マトリックスの配置により毛包成長の治癒が増進される。図４Ａは、５日目、８日目および１０日目の、マトリックス無含有（熱傷対照）、マトリックス（マトリックス対照）およびＬＧＲ６＋ＧＦＰ ＥＳＣの３ｍｍのヒト脱細胞化真皮全層性熱傷創傷床の顕微鏡写真の３×３のマトリックスである。図４Ｂは、図４Ａに示した創傷床の１０日目のサイトケラチン−１７転写物の発現の相対発現をグラフにより示す。治癒した創傷床の割合を、ＩｍａｇｅＪ ＮＣＢＩアプリケーション内の面積割合の機能としての創傷床治癒速度の定量解析を用いて求めた。創傷対照は熱傷創傷床のみを含む。マトリックス対照はマトリックスのみを含み、ＬＧＲ６＋ＧＦＰは、ＬＧＲ６＋ＧＦＰ ＥＳＣが播種されたＡＤＭを含む。図４Ｃは、５日目のマウス全層性熱傷創傷床におけるインビボ生物発光イメージングの顕微鏡写真である。図４Ｄは、対照ならびにＥＳＣの播種後１２時間目および７２時間目のＬＧＲ６＋ＧＦＰ含有真皮の１００倍のヒト真皮の顕微鏡写真である。白矢印は、皮膚の毛穴の存在を示す。図４Ｅは、対照、および乾燥を防ぐためのシリコーン保護オーバーレイを有する、ＥＳＣが播種されたヒト真皮を含有する本発明の構築物の画像を示す。ＬＧＲ６＋ＧＦＰマトリックス画像は、全層性Ｎｕ／Ｎｕマウス創傷床の発生中の毛パッチを示す小さい二重黒矢印を含む。

図５ＡからＥは、間質血管細胞群（ＳＶＦ）をＬＧＲ６＋ＥＳＣ播種マトリックスに添加することの組織分極の促進および皮膚様二重コンパートメント（ｄｕａｌ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）系における効果による前記構築物の一例を示す。図５Ａは、代表的なアドレノメデュリン（ＡＤＭ）（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）の名称で入手可能なもの）に播種後２４時間目の５×１０^５個のＲＦＰ発現間質血管細胞群の単離細胞集団の共焦点２０倍イメージングである。図５Ｂは、代表的なＡＤＭ（ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標））に播種後２４時間目の５×１０^５個のＧＦＰ発現ＬＧＲ６^＋単離細胞集団の共焦点２０倍画像である。図５Ｃは、培養状態の共播種後２４時間目の５×１０^５個のＲＦＰ発現ＳＶＦおよび５×１０^５個のＧＦＰ発現ＬＧＲ６^＋単離集団を有する二重播種した代表的なＡＤＭ（ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標））の共焦点２０倍イメージングを示す。図５Ｄは、培養状態で５日間の増殖後の５×１０^５個のＲＦＰ発現ＳＶＦ^ＲＦＰおよび５×１０^５個のＧＦＰ発現ＬＧＲ６^＋を含む共播種マトリックスである。平行な点線は、ＡＤＭ基材の縁に蓄積された上皮ＬＧＲ６^＋ＧＦＰ系統を示す。小さい角括弧および大きい角括弧は、ＬＧＲ６^＋ＧＦＰおよびＳＶＦ^ＲＦＰの存在度と相関する２つのコンパートメントの相対的位置を示す。矢印で示した「Ｕ」字型の実線は、３２ゲージの滅菌した針で生成させた播種前の孔を含む領域を示す。図５Ｅは、緑色のＬＧＲ発現細胞と赤色のＳＶＦ発現細胞を共播種したコラーゲン基材の増殖速度論のグラフ表示である。

図６Ａおよび６Ｂは、細胞性支持実体ありおよびなしのＬＧＲ細胞含有構築物ならびに増殖因子の相対的産生の一例を示す。ＬＧＲ６^＋ＧＦＰ ＥＳＣおよびＳＶＦ^ＲＦＰ富化スカフォールディング培養構築物による血管形成促進性の転写物およびタンパク質被検物の相関的発現プロフィール。図６Ａは、それぞれのスカフォールド基材上における全ＲＮＡ由来の表示した遺伝子エレメントの転写物の発現の相対的倍数（ΔΔＣＴ）のグラフ表示である：ＬＧＲ６^＋ＧＦＰ ＥＳＣ（黒いバー）、ＳＶＦ^ＲＦＰ（灰色のバー）および共培養したＬＧＲ６^＋ＧＦＰ ＥＳＣ＋ＳＶＦ^ＲＦＰ（白四角）。ｘ軸（ＬＧＲ６＋ＳＶＦ）より上の有意性は、表示したスカフォールド材上で共培養されたＬＧＲ６^＋ＧＦＰ ＥＳＣ＋ＳＶＦ^ＲＦＰの発現と単独のＬＧＲ６^＋ＧＦＰ ＥＳＣおよびＳＶＦ^ＲＦＰの発現（対比）の相互比較を示す。例えば、共培養マトリックスでの平均ＦＧＦ−２遺伝子発現は、共培養ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）（ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）＋ＬＧＲ６^＋ＳＶＦ）を除いて、どちらの単独の系（Ｓｃａｆｆｏｌｄ＋ＬＧＲ６またはｓｃａｆｆｏｌｄ＋ＳＶＦ）の平均発現よりも高かった。ｘ軸（ＬＧＲ６）または（ＳＶＦ）より下の有意性は、細胞の実体は一定のままでの基材の同一物内（ｉｎｔｒａ−）比較を示す。例えば、ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）＋ＬＧＲ６^＋ＧＦＰ ＥＳＣのみとＤＥＲＭＡＭＡＴＲＩＸ（登録商標）＋ＬＧＲ６^＋ＧＦＰ ＥＳＣのみでのＶＥＧＦ−Ａ遺伝子発現は非有意性（ＮＳ）であった。図６Ｂは、それぞれのスカフォールド基材上における全タンパク質単離物由来の表示したタンパク質被検物の相対濃度測定単位（ＲＤＵ）をグラフにより示す：ＬＧＲ６^＋ＧＦＰ ＥＳＣ（黒いバー）、ＳＶＦ^ＲＦＰ（灰色のバー）および共培養したＬＧＲ６^＋ＧＦＰ ＥＳＣ＋ＳＶＦ^ＲＦＰ（白四角）。（＊）は（ｐ値＜０．０５）を示し、アッセイは三連で行い、ＧＡＰＤＨはハウスキーピング対照である。

図７ＡからＨは、創傷、即ち第三度の創傷床の誘導においてＬＧＲ細胞遊走、増殖およびバイアビリティが増強された治療を受けた創傷／傷害／空隙の一例ならびにＬＧＲ幹細胞毛包隆起および付属器構造部の消失の検証を示す。図７Ａは、３ｍｍ直径の創傷床テンプレートマークを示す。図７Ｂは、０日目の創傷床構造部を示す（白いスケールバーは１ｍｍである。）。図７Ｃは、２×３の３ｍｍ創傷床グリッドの一例を示す。図７Ｄは、創傷部位における再懸濁ペプチドの経表面適用を示す。図７Ｅは、毛包および付属器構造部を有する熱傷のない無傷の外皮／皮膚のＨ＆Ｅ染色の顕微鏡写真である。矢印は、拡大した毛包の位置を示し（差し込み画像）、ここで、白いスケールバーは５００μｍである。図７Ｆは、毛包隆起を含む表皮、真皮および皮下の組織の除去を示す高温焼灼後のマウス背面皮膚のＨ＆Ｅ染色である。図７Ｇは、毛包および付属器構造部を有する熱傷のない無傷の皮膚のＤＡＰＩ／ＤＮＡ染色（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）である。矢印は、拡大した毛包を示し、それぞれ緑色および赤色の免疫蛍光ＬＧＲ５およびＬＧＲ６抗体で共標識されている（差し込み画像）。図７Ｈ 毛包隆起を含む表皮、真皮および皮下の組織の除去を示す高温焼灼後のマウス背面皮膚のＤＡＰＩ／ＤＮＡ染色、ここで、白いスケールバーは１００μｍである。

図８ＡからＱは、５日間および１０日間にわたる抗菌挙動に関する、ＬＧＲを有する創傷／傷害／空隙を示す。１６Ｓ ｒＲＮＡ蛍光性オリゴヌクレオチドプローブを使用すると、インサイチュハイブリダイゼーションは、第三度の熱傷創傷床における細菌の付着の存在を示す。図８Ａは、ＳＤＺで毎日処置した熱傷誘導後５日目の第三度の熱傷床のＤＮＡ／ＤＡＰＩ標識を示す。図８Ｂに、ＳＤＺで毎日処置した熱傷誘導後５日目の第三度の熱傷床の細菌生物体（黄色の粒状体）の５’−Ｃｙ３−ＥＵＢ３３８標識１６ｓ ｒＲＮＡを示す。図８Ｃは、図８Ａと８Ｂのデジタルマージ画像である。図８Ｄは、ＳＤＺで毎日処置した１０日目の第三度の熱傷床のＤＮＡ ＤＡＰＩ標識であること以外、図８Ａに対応する。相応して、図８Ｅは、ＳＤＺで毎日処置した熱傷誘導後１０日目の第三度の熱傷床の細菌生物体（黄色の粒状体）の５’−Ｃｙ３−ＥＵＢ３３８標識１６ｓ ｒＲＮＡの顕微鏡写真である。図８Ｆは、図８ＤとＥのマージ画像である。図８Ｇから８Ｌは、それぞれ、熱傷後５日目および１０日目の図８ＡからＦに対応する画像であるが、ＳＤＺではなくデフェンシン，α５（ＤＥＦＡ５）を用いた毎日の処置に供したものである。Ｈにおける矢印は、線維性物質の重なりを伴う組織の境界面を表し、ここで、細菌の観察はＤＥＦＡ５処置の状況の方が少ない。図８Ｍは、差し込み図８Ｎとともに、ＳＤＺで処置し、単位面積あたりに含まれる１６ｓ ｒＲＮＡ標識が多い創傷床のＣｙ３の蛍光のグレースケール変換画像のホワイトピクセル強度の定量を示す。図８Ｏおよび差し込み図８Ｐは、相応して、ＤＥＦＡ５で処置し、単位面積あたりに含まれる１６ｓ ｒＲＮＡ標識が少ない（差し込み図の画像ｐ．）創傷床のＣｙ３の蛍光のグレースケール変換画像のホワイトピクセル強度の定量を示す。差し込み図のグラフは、ＳＤＺとＤＥＦＡ５の両方で処置された５日目の熱傷創傷床において発現された１６ｓ ｒＲＮＡの平均ホワイトピクセル強度を示す（グレースケールイメージングソフトウェアを使用）。最後に、図８Ｑは、ＳＤＺとＤＥＦＡ５の両方で処置された５日目の熱傷床において発現された１６ｓ ｒＲＮＡの平均赤色チャネル蛍光を示すグラフである。図８Ｈにおける白矢印は、ＤＥＦＡ５処置床における潜在的皮膜を示し、図８Ｍにおける黒矢印はホワイトピクセル強度を示す。スケールバー １００μｍ。（＊）は、ｐ値＜０．０５を示す。

図９ＡおよびＢは、付属器構造部の処置された熱傷創欠損部における治癒の増進、組織および付属器の再生ならびにその後の発毛、創傷治癒速度論および発生中の毛の成長に関する、創傷内のＬＧＲ発現細胞性実体の一例を示す経時的な一連の写真である。図９Ａを構成する一連の写真は、Ｌｅｉｃａ Ｗｉｌｄ Ｍ６８０外科用顕微鏡を使用し、表示した薬剤ＭＱＨ２０、ＤＥＦＡ５、ＤＥＦＢ１、ＳＤＺで処置している間の１０日間にわたる第三度の熱傷床の治癒をイメージングした巨視的イメージングである。白いスケールバーは１ｍｍを表す。図９Ｂの第２の一連の写真は、この場合も、Ｌｅｉｃａ Ｗｉｌｄ Ｍ６８０を使用し、第三度の熱傷床の発生中の毛の成長を１６日間にわたって追跡し、ＤＥＦＡ５および対照（対比）で処置した創傷床を並べて比較した巨視的イメージングを含む。白矢印は新たな発毛を示す。この場合も、スケールバーは１ｍｍである。

図１０ＡからＬは、治癒の増進、前記実体の増殖に関する、創傷／傷害／組織の空隙内の前記ＬＧＲ発現細胞性実体の一例を含む。図１０Ｋおよび１０Ｌを構成するグラフは、創傷床治癒速度論の定量のエビデンスならびに増殖巣因子での経表面処置後の熱傷組織内へのＬＧＲ５およびＬＧＲ６幹細胞の遊走を示す。簡単には、この試験は、ＬＧＲ５およびＬＧＲ６のイメージングにより、熱傷創組織における逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応に基づいて、共焦点顕微鏡による定量的強度パターンを確認するために使用した。グラフに示されるように、ヒトαデフェンシン５創傷床における平均ＬＧＲ５およびＬＧＲ６ ｍＲＮＡ発現は、それぞれ９５．８±１０．６および２５９．２±２０．２であるのに対して、５日目のスルファジアジン処置創傷ではＬＧＲ５およびＬＧＲ６は検出不可能なレベルである（図４，右）ことがわかった。ヒトαデフェンシン５処置組織およびスルファジアジンで処置した検体におけるこのようなレベル倍数の大きさの比較により、倍数値を規定するのは、創傷内に遊走するＬＧＲ５およびＬＧＲ６を発現する細胞の絶対的存在または空隙であることが示唆される。

具体的な図に戻ると、図１０Ａは、創傷領域の写真を示し、白いスケールバーは１ｍｍを表し、創傷面積の計算は黒い部分である。図１０Ｂは、１０日間にわたる表示した経表面増殖巣因子適用において、残存している創傷の面積パーセント％で表示した平均創傷治癒率をグラフにより示す。アスタリスク（＊）はｐ値＜０．０５を表す。図１０ＣからＪは、５日目のＤＥＦＡ５処置創傷床のＬＧＲ５およびＬＧＲ６の免疫蛍光抗体標識であり、ここで、図１０ＣはＤＮＡ／ＤＡＰＩ／青であり、図１０ＤはＬＧＲ５／ＦＩＴＣ／緑であり、図１０ＥはＬＧＲ６／ＴＲＩＴＣ／赤であり、図１０Ｆは１０Ｃから１０Ｅのマージ画像である。図１０ＧからＩは、５日目のＳＤＺ（スルファジアジン）処置創傷床の対応するＬＧＲ５およびＬＧＲ６の免疫蛍光抗体標識である（ＤＮＡ／ＤＡＰＩ／青、ＬＧＲ５／ＦＩＴＣ／緑およびＬＧＲ６／ＴＲＩＴＣ／赤）。図１０Ｊは、１０Ｇから１０Ｉのマージ画像であり、５日目の創傷床における緑および赤の蛍光強度を用いた平均ＬＧＲ５およびＬＧＲ６の発現を示す差し込み図を含む。逆転写酵素ＰＣＲ定量により得られた、ＤＥＦＡ５およびＳＤＺで処置した複製創傷床から抽出されたＲＮＡの増加倍数の比較値を示す。白いスケールバー ５０μｍおよびこの場合も、アスタリスク（＊）はｐ値＜０．０５を表す。

図１１ＡおよびＢは、治癒促進経路の増進に関する、創傷内に配されたＬＧＲ発現細胞性実体を有する創傷／傷害／組織の空隙を示す。これらの図は、それぞれ、ＤＥＦＡ５およびＳＤＺで処置した創傷床のＲＴ−ＰＣＲ定量および遺伝子のヒートマップ解析の比較を示す。これらの図は、創傷での鍵となる転写物の発現の増大におけるヒトαデフェンシン５およびスルファジアジン（対比）の役割を示す。結果は、ヒトαデフェンシン５を受けた創傷床ではスルファジアジン療法と比べて、幾つかの遺伝子サブセットが有意に上方調節されていること、ならびに腸および皮膚ではどちらも、Ｗｎｔリガンドに対するＬＧＲ幹細胞系の応答において特定のＷｎｔ経路遺伝子サブセットが有意に上方調節されていることを示す。

図１１Ａは、平均創傷治癒ＲＴ２−ＰＣＲアレイ経路のヒートマップおよび対応する遺伝子地図を、ＤＥＦＡ５処置系とＳＤＺ処置系で比較した創傷床の調節倍数とともに示す。図１１Ｂは、平均Ｗｎｔ ＲＴ２−ＰＣＲアレイ治癒経路のヒートマップおよび対応する遺伝子地図を、ＤＥＦＡ５処置系とＳＤＺ処置系で比較した創傷床の調節倍数とともに示す。ヒートマップの色は、ＤＥＦＡ５処置熱傷で多く発現されている場合は赤に対して、ＳＤＺ処置熱傷で多く発現されている場合は緑色として示す。

図１２ＡからＩは、位置、集団の具体名および創傷治癒能力に関する、ＬＧＲ発現幹細胞増殖巣を含有している微細凝集塊多細胞単位の一例を示す。単純なエキソビボ創傷治癒アッセイおよび蛍光標示式細胞分取を使用し、ＬＧＲ６＋、ＣＤ３４＋およびＣＤ７３＋Ｃ５７ＢＬ／６（ＵＢＣ−ＧＦＰ）マウス細胞を細胞拡大培養物から単離した。図１２Ａは、表皮の１０単位／μＬのディスパーゼでの部分的消化．（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，Ｎ．Ｊ．）低速ロッカーで３７℃にて３０分間の消化後の毛包の細胞のＬＧＲ６蛍光性抗体（緑色）発現を示す。図１２Ｂは、さらにＣＤ３４およびＣＤ７３マーカーを発現しているＬＧＲ６＋細胞のものである（矢印は、全細胞のおよそ１から３パーセントを含む単離された集団を示す。）。図１２ＣからＨは、インビトロ創傷アッセイのｅＦｌｕｏｒ４５０発現のヒストグラムであり、それぞれ、Ｃ５７ＢＬ／６（ＵＢＣ−ＧＦＰ）マウス細胞による周期的なＧＦＰ固有発現、ＣＤ３４＋ＰＥ／Ｃｙ７発現、ＬＧＲ６＋ＡＰＣ発現およびＣＤ７３＋を示す。点線は、細胞層の破壊後０、６および１２時間目の分離距離を示し、スケールバー＝５０μｍ。図１２Ｉのグラフは、蛍光ソーティング後の最初の距離に対するパーセンテージで表示した経時的な距離線の平均縮小を示し、ここで、アスタリスク（＊）はｐ値＜０．０５を表す。

図１３ＡからＤは、最初の播種時および１日後の活性化型機能性単一性単位（ａＦＳＵ）の共焦点顕微鏡検査および生物発光による顕微鏡写真であり、ＬＧＲ発現幹細胞増殖巣を含有している微細凝集塊多細胞単位の一例を示し、一方、図１３Ｅでは、コラーゲンマトリックスにおいて初期増殖が起こっている。

図１４ＡからＥは、皮膚組織内の位置、表現型、境界面および極性に関する、多様なＬＧＲ細胞の位置の一例を示す。図１４Ａは、免疫蛍光染色による、ＬＧＲ６（緑／フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））およびＬＧＲ５（赤／テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ））の発現の局在領域を示す。スケールバーは２０μｍである。図１４Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６（ＵＢＣＧＦＰ）マウス皮膚由来のＬＧＲ６＋^ＧＦＰ上皮幹細胞の蛍光標示式細胞分取による単離を示し、左は、ＬＧＲ６＋、ＣＤ３４およびＣＤ７３を用いた最終ソートゲートであり、右は、細胞のＧＦＰ発現を示し、抗体−コンジュゲート標識：ＣＤ７３／ＰＥ−７、ＬＧＲ６／Ｃｙ５、ＣＤ３４／ｅＦｌｏｕｒ４５０と相関している個々のヒストグラムである。図１４Ｃは、蛍光標示式細胞分取による単離後にプレーティングされたＬＧＲ６^＋ＧＦＰ上皮幹細胞の微分干渉コントラスト画像を示す。図１４ＤはＬＧＲ６^＋ＧＦＰ上皮幹細胞のＧＦＰ固有発現を示し、図１４Ｅは図１４Ｃと１４Ｄのマージ画像である。スケールバーは２０μｍを表す。

図１５ＡからＥは、創傷／傷害／組織の空隙周囲および／またはこの内部への配置による送達方法に関する、ＬＧＲ発現細胞小増殖巣の一例を示す。図１５Ａの３つの画像は、それぞれ、最初の熱傷テンプレート；Ｎｕ／Ｎｕマウスの背側における全層性熱傷；および創傷床の基底部における１０^５個のＬＧＲ６^＋ＧＦＰ上皮幹細胞含有ＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）の送達を示す。図１５Ａのスケールバーは１ｍｍである。図１５Ｂは、０日目における注射ポケットのＤＮＡ ＤＡＰＩ−ＢＬＵＥの免疫蛍光画像である。図１５Ｂは、抗−ＬＧＲ６／ＴＲＩＴＣ抗体標識の免疫蛍光画像であり、図１５ＣはＬＧＲ６^＋ＧＦＰ上皮幹細胞の免疫蛍光画像である。図１５Ｅは、図１５ＢからＤのマージ画像であり、２０μｍのスケールバーを有する。図１５ＡからＥは、全層性熱傷床の誘導およびその後の軟部組織欠損部内でのＬＧＲ６＋幹細胞の生着の検証を示す。

図１６ＡからＤは、送達可能な媒体による創傷内および創傷周囲への送達ならびにその後の組織および支持構造体の治癒、再生、例えば限定されないが、血管の脈管形成および／または脈管形成に関する、ＬＧＲ含有幹細胞増殖巣の一例を示す。全層性創傷内へのＬＧＲ６＋上皮幹細胞移植後の創傷治癒の進行。ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）製のＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）（対照）の注射後の創傷治癒の進行を図１６Ａに、図１６ＢのＬＧＲ６^＋ＧＦＰ上皮幹細胞播種ＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）と１５日間にわたって比較して示す。スケールバーは１ｍｍである。図１６Ｃに、１５日後の移植（ｉｍｐｌａｎｔ）ポケットを示し、白矢印は、治癒創傷床内に存在している残存ＬＧＲ６^＋ＧＦＰ上皮幹細胞集団の存在を示す。図１６Ｄにおいて、黒矢印は、ＬＧＲ６^＋ＧＦＰ上皮幹細胞がない熱傷創基底部の位置を示す。

図１７ＡからＤは、その後の組織ならびに関連付属器、例えば限定されないが、毛包および関連支持構造部の治癒および再生を伴う、創傷内および／または創傷周囲への送達後のＬＧＲ含有幹細胞増殖巣の一例を示す。図１７Ａは、創傷床内への１０日間のＬＧＲ６＋上皮幹細胞遊走での移植後の１０日目の免疫蛍光標識組織検体の共焦点画像の４つのパネルマトリックスである。図１７Ａを構成する画像は、ＬＧＲ６^＋ＧＦＰ ＥＳＣのＤＮＡ／ＤＡＰＩ−ＢＬＵＥ；抗−ＬＧＲ６／ＴＲＩＴＣ；ＧＦＰ発現を含む。

図１７Ｂは、全チャネルの微分干渉コントラスト画像のマージ画像である。赤い矢印は、発生中の毛包の発達領域を示す（また、上側の差し込み画像も参照のこと）。点線は、発生中の毛包と重なる上皮の分極を示し、一方、白矢印は、移植片注射ポケットの位置を示す（また、最初の注射ポケットの細胞集団の画像については、下側の差し込み図の画像の拡大図も参照のこと。図１７Ｂの差し込み図のグラフは、表示した対照およびＬＧＲ６＋^＋ＧＦＰ処置創傷床におけるＫＲＴ１７／サイトケラチン１７の遺伝子発現の比較を示す。

図１７Ｃを参照されたい。この３つの画像は、発生中の毛包（白抜き矢印）毛包嚢胞の形成を伴う１０日目のＬＧＲ６＋^＋ＧＦＰ ＥＳＣ処置創傷床である毛包試験集団熱傷床（ベタ矢印）および１０日目の対照創傷床を覆うために使用した移植ドームのものである。図１７Ｄを構成するグラフは、ＲＴ−ＰＣＲにより得られた１０日目の創傷床の定量であり、ＷＮＴリガンドの遺伝子発現の相対的倍数を示す。正の数はＬＧＲ６^＋ＧＦＰ上皮幹細胞創傷床における高発現を示し、一方、負の数は対照創傷床における高発現を示す。

図１８は、治癒促進経路の増進およびＬＧＲ６＋上皮幹細胞を受けた創傷と対照との遺伝子発現の比較に関する、創傷／傷害／組織の空隙内および／またはこの周囲への送達に関する、ＬＧＲ発現細胞小増殖巣を有する創傷／傷害／組織の空隙のＲＴ−ＰＣＲ定量およびインセットは遺伝子のヒートマップ解析の比較を示す。グラフは、脈管形成、創傷治癒および上皮成長因子に関する遺伝子発現の相対的倍数を示す。ＬＧＲ６＋上皮幹細胞療法および対照療法を受けた創傷床を比較するデータの相関的グラフ表示。差し込み図のヒートマップに関して、赤色は、ＬＧＲ６＋上皮幹細胞創傷床における発現が多いことを示し、一方、緑色は、対照創傷床における発現が多いことを示す。棒グラフにおいて、正の数はＬＧＲ６^＋ＧＦＰ上皮幹細胞創傷床における高発現を示し、負の数は対照創傷床における高発現を示す。ＮＣＢＩによるＵｎｉｇｅｎｅの用語を各定量の柱の上部に示し、アスタリスク（＊）Ｐ値は＜０．０５有意性の表示である。

図１９は、創傷／傷害／組織の空隙内および／またはこの周囲への送達ならびに創傷治癒因子の増進に関する、ＬＧＲ発現細胞小増殖巣の一例の相対的タンパク質デンシトメトリーをグラフにより示す。ＬＧＲ６＋ＥＳＣ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃアレイを受けた創傷の脈管形成被検物の発現を、脈管形成を調節および増進させる一般的なタンパク質と比べた比較。灰色の柱は対照創傷を示し、黒の柱は、ＬＧＲ６^＋ＧＦＰ ＥＳＣを受けた創傷を示す。差し込み図の画像は、ＨＲＰ化学発光による発色後のプロテオームアレイメンブレンの例を示す。色が明るいほどタンパク質の発現レベルが高いことを示す。

図２０ＡからＦは、骨組織の再生に関する、ＬＧＲ発現細胞小増殖巣の一例を示す。単離されたＬＧＲ小増殖巣は播種された骨であり得、バイアブルなままであり得る。図２０Ａは、培養のために採取された骨の巨視的な骨の画像である。図２０Ｂは、播種後７日目のＬＧＲ ＧＦＰを含む骨のＤＩＣ画像である。図２０Ｃは、播種後７日目のＬＧＲ６^＋ＧＦＰを含む骨の４８８ｎｍ緑色レーザー共焦点画像である。ＬＧＲ小増殖巣はインビトロで骨誘導を行い得ることは注目に値する。図２０Ｄは、補給物を含む培地で１週間の骨誘導後のＬＧＲ小増殖巣を示す。図２０Ｅは、インビトロで骨誘導を行い得、鍵となる骨形成遺伝子を上方調節し得る骨誘導後のＬＧＲ小増殖巣のアリザリンレッド染色である。最後に、図２０Ｆは、遺伝子発現の相対的倍数を示すＲＴ−ＰＣＲデータであり、ここで、灰色の柱は（対照の）非骨誘導ＬＧＲを表し、黒の柱は、７日間の培養後の骨誘導培地を受けたＬＧＲを表す。ＧＡＰＤＨを参照標準ハウスキーピング遺伝子として使用した。

例示的なプロトコル
以下は、本発明の一実施形態の実施のための実例のプロトコルシーケンスを示す一連の実施例である。

本発明による最小限分極機能性単位の作製の前に、ゼラチン質の支持体、例えば例示的な３次元のコラーゲンスカフォールドが、よく知られた方法によって以下のようにして作製され得る：
ｉ．１部の冷却した１０×培養培地の１０×ＰＢＳを８部の冷却したコラーゲンベースの溶液に、静かにグルグル回しながらゆっくり添加する。ＥＣＭおよびバイアビリティタンパク質をこの懸濁液に添加する；
ｉｉ．滅菌した０．１Ｍ ＮａＯＨを使用し、ｐＨ調整を注意深くモニタリングしながら混合物のｐＨを７．２から７．６に調整する；
ｉｉｉ．最終容量を滅菌したモレキュラーグレードウォーター（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｒａｄｅ ｗａｔｅｒ）で総量１０部に調整する；
ｉｖ．ゲル化を抑制するため、混合物の温度を２から１０℃に維持する，
ｖ．３７℃までおよそ９０から１２０分間昇温することによってゲルを形成させる；
ｖｉ．滅菌したマイクロニードルプレスでスカフォールドに孔をあける（必要であれば保存のために、スカフォールドにフリーズドライの方法を行ってもよい。）。

また、ＬＧＲ凝集塊抽出手順の開始前に、Ｐｕｌｓｅ Ｒｅｓｃｕｅ Ｍｅｄｉａ（ＰＲＭ）と称されるさらなる物質を作製し、利用可能にすることが推奨される。

ＰＲＭは、ヒトに対するものであるこの実施形態では、細胞を支持する無血清の培地混合物である、Ｌ−グルタミンを含有しており、別途パッケージングされた事前に選定されたヒト組換え上皮成長因子１−５３（ＥＧＦ １−５３）およびウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）とともに供給されるケラチノサイト−ＳＦＭであって、抗生物質−抗かび剤ペニシリン、ストレプトマイシンおよびアムホテリシンＢがＧＭＰ−フィブリノゲン：ヒトとともに添加されているＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからケラチノサイト−ＳＦＭ（１×）として販売されているものである。一実施形態において使用される薬剤は、１０，０００単位／ｍＬのペニシリン、１０，０００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび２５μｇ／ｍＬのＦＵＮＧＩＺＯＮＥ（登録商標）抗かび薬を含む溶液であるＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＧＩＢＣＯ（登録商標）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−抗かび薬である。ＰＲＭはヒト組織を輸送するために使用されるため、一次組織を安定化させるため、および輸送および加工処理中の微生物のバイアビリティを低下させるための補給的試薬が使用される。

以下は、具体的に、本発明の一実施形態による幹細胞微細凝集塊機能性単位を含むＬＧＲ発現上皮の作製および保存に関するものである。

［実施例１］
実施例１は、本発明の一実施形態による最小限分極機能性単位の抽出のための方法に関するものである。検体を得た後、これを関連輸送容器から取り出した後：
ｉ．検体を、パルスレスキュー（ｐｕｌｓｅ ｒｅｓｃｕｅ）培地を含む滅菌した５０ｍｌ容コニカルチューブ内に入れ、ロッカーに５分間入れ、新鮮培地と新たな容器で合計３回繰り返す；
ｉｉ．検体を取り出してパルス培地を含む滅菌した培養皿に入れ、脂肪および皮下要素を真皮コンパートメントおよび表皮コンパートメントから注意深く切除する。毛包単位は定位置に残し、過度に切開しない；
ｉｉｉ．切除した皮下脂肪成分を、ＰＲＭを含む別の５０ｍｌ容コニカルチューブに入れ、低速ロッカーで＋４℃に置く。
ｉｖ．残存皮膚要素を含む表皮コンパートメント、毛包コンパートメントおよび真皮コンパートメントを、超微細ＷＥＣＰＲＥＰ（登録商標） Ｂｌａｄｅまたは何らかの形態のマイクロ−１６ランセットを用いて、最小限分極機能性単位（ＭＰＦＵ）にセクション化する；
ｖ．ＭＰＦＵ成分を、パルス培地を含む別の５０ｍｌ容コニカルチューブに入れ、＋４℃に置く。

以下は、ＦＤＡおよび／またはＧＭＰの認証を得た慣用的なＣＬＩＡ設備および試薬を使用し、一次培養物を確立して酵素的調製を用いて機能性組織要素を調製する二次加工処理に関するものである：
［実施例２］
実施例２は、皮下組織および皮下脂肪の細胞成分の加工処理に関するものである。実施例２において以下の工程を列挙する：
ｉ．７０％エタノール（ＥｔＯＨ）を組織容器の外側に噴霧し、この組織容器を層流キャビネット内に入れる；
ｉｉ．微生物学的試験のために組織試料を送るか、または培地を移す；
ｉｉｉ．事前に洗浄した脂肪および皮下組織を１５０ｍｍの滅菌したペトリ皿に入れる；
ｉｖ．組織をＰＲＭで２回洗浄する；
ｖ．組織を、滅菌した外科用器具で小（３ｍｍ）片にトリミングし、パルス培地を含む滅菌した培養物保持皿に入れるとともにこの切除作業を終了する；
ｖｉ．保持皿から培地を吸引し、検体を、滅菌したスクープまたはピンセットで取り出した後、検体を、消化酵素の予備混合溶液（コラーゲナーゼとディスパーゼベース）であるＭＳＣ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｍｅｄｉａを含む５０ｍｌ容コニカルチューブに入れ、これを、３７℃の水浴中または乾熱低速振盪機内に入れ、３０分間または残存する粒状物質がほとんどなくなるまで振盪する；
ｖｉｉ．３７℃のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（等容量のＰＢＳ−ＥＤＴＡ）を添加して消化を止める；
ｖｉｉｉ．懸濁液を１０分間、遠心分離して「軟」ペレットを生成させる；
ｉｘ．上部の液体を廃棄し、滅菌したピペットを使用し、脂肪集団を保存塊の間質血管細胞群（ＳＶＦ）から分離する；
ｘ．２つの別々のコニカルチューブで、ＳＶＦをリン酸緩衝生理食塩水／ＥＤＴＡ，ＰＢＳ−ＥＤＴＡ（１ｍＭのＥＤＴＡ）中に再懸濁させ、脂肪細胞集団をＰＲＭ中に再懸濁させる；
ｘｉ．１００μｍの滅菌フィルターを使用し、懸濁液を滅菌した新たなコニカルチューブに入れる；
ｘｉｉ．フィルターをＰＢＳ−ＥＤＴＡで洗浄する；
ｘｉｉｉｖ．懸濁液を室温で１０分間スピン濾過した後、培地を吸引し、吸引した培地を既知容量の新鮮培地と交換する；
ｘｉｖ．ＣＯＵＮＴＥＳＳ（登録商標）自動セルカウンター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、細胞集団を計数してバイアビリティを測定する；
ｘｖ．得られた細胞集団の２０％を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＳＹＮＴＨＡ−ＦＲＥＥＺＥ（登録商標） ＣＴＳ（商標）（Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）での冷結保存のために取り出し、続いて、構築物のアセンブリのために残りの８０％の集団を用いて適切にカタロギングする。

［実施例３］
実施例３は、本発明の一実施形態による構築物の実施例への皮下組織および皮下脂肪成分の添加に関するものである。実例の成分添加の例は：
ｉ．アセンブルされて洗浄されたスカフォールドを既に含んでいる滅菌したＮＵＮＣ（登録商標）Ｓｋｉｎ Ｇｒａｆｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｄｉｓｈまたは自動ディッシュを層流フードに入れ、スカフォールドを再度、パルス培地で２回洗浄した後、細胞を添加する；
ｉｉ．各培養槽に追跡番号のラベルを差し込む；
ｉｉｉ．およそ５×１０^５から１×１０^６個の混合ＳＶＦ細胞／皿システムおよび１×１０^５個の脂肪細胞／皿を移す；
ｉｖ．状況の具体的な要件に指示されるとおりに自己ＰＲＰを含む、または含まない完全培養培地をローディングレザーバに添加する；
ｖ．皿を低速ロッカー上のインキュベータ内に１時間移した後、取り出し、別のセンチネルインキュベータ内に平らな状態で４８時間静置する；
ｖｉ．４８時間後に培養培地を洗浄し、非付着性細胞胞を廃棄し、完全培養培地を新しいものにする。細胞イメージングデバイス、例えば、ＥＶＯＳ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてイメージングし、指定された追跡番号とともに保存する。
ｖｉｉ．７２時間毎に培養培地を交換する；
ｖｉｉｉ．コンフルエンスになったら、培養物をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で洗浄し、培養培地を新鮮培地と交換する。
ｉｘ．上皮幹細胞機能性単一性構築物（ＥＳＣ ＦＳＵ）を直接、間葉幹細胞（ＭＳＣ）構築物の表面上に置き、ＥＳＣ培地を添加して両方の構築物を覆い、これらをイメージングし、構築物をインキュベータ内に戻す。
ｘ．構築物の培地を４８時間毎に変える／交換する
ことを含むものである。

［実施例４］
実施例４は、最小限分極上皮幹細胞単一性単位の富化に関するものである。実施例１の後、ＭＰＦＵを１５ｍｌ容コニカルチューブ内のパルスレスキュー培地中に入れ、スピン／遠心分離して軟ペレットにする。次いで、この物質を以下の部分消化の過程に供する：
ｉ．事前にアリコートに分けて凍結させた１０ｍｌの消化バッファー（コラーゲナーゼとディスパーゼベース）を入手する、これは、ＭＰＦＵに添加する前に室温にしておく；
ｉｉ．この消化溶液をＭＰＦＵの軟ペレットに添加して穏やかに混合し、チューブを軽く叩くことによってＭＰＦＵを溶液全体に分布させる；
ｉｉｉ．このチューブを３７℃の水浴中または乾燥インキュベータ内に１０分間入れる；
ｉｖ．チューブを浴／インキュベータから取り出し、チューブを穏やかに軽く叩き、内容物を繊維状物について検査する；
ｖ．繊維状物が観察されたら、内容物を遠心分離して軟ペレットにする；
ｖｉ．細胞ペレットを、５から１０ｍＬの既知組成ケラチノサイトＳＦＭ完全培地（ケラチノサイト−ＳＦＭ（１×），ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）中で洗浄し、遠心分離して再度、軟ペレットにする；
ｖｉｉ．活性化された機能性単一性単位のペレットを５ｍＬのケラチノサイト−ＳＦＭ完全培地中に再懸濁させる；および
ｖｉｉｉ．該単位の細胞密度を、ＣＯＵＮＴＥＳＳ（登録商標）Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定する。

［実施例５］
実施例５は、実施例４で得られた上皮幹細胞機能性単一性体（ＥＳＣ ａＦＳＵ）を構築物／スカフォールドに添加することを含むものである。この手順には：
ｉ．アセンブルされて洗浄されたスカフォールドを既に含んでいるＵＰＣＥＬＬ（商標） Ｓｕｒｆａｃｅ Ｓｋｉｎ Ｇｒａｆｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｄｉｓｈを配置し、生理学的ｐＨを確実にするため、スカフォールドを再度、パルス培地で２回洗浄した後、細胞を添加する；
ｉｉ．各培養槽を唯一の追跡番号でラベル表示する；
ｉｉｉ．ＥＳＣ ａＦＳＵを構築物に、使い捨てトランスファーピペットによって、既知組成ケラチノサイトＳＦＭ完全培地（自己ＰＲＰの添加は任意である。）を用いて移す；
ｉｖ．完全培養培地を、選択されたローディングレザーバに添加し、構築物の完全被覆を確実にする；
ｖ．皿を、低速ロッカー上のインキュベータに１時間移す。次いで、ロッカーから取り出し、別のセンチネルインキュベータ内に４８時間、平らな状態のままにしておく；
ｖｉ．４８時間目、培養培地を吸引し、新鮮ケラチノサイトＳＦＭ培養培地を添加する。培養物をＥＶＯＳ（登録商標）でイメージングし、培養物を指定された追跡番号とともに保存する。歯肉線維芽細胞（ＧＦ）集団およびバイアビリティタンパク質が増大する、および／またはこの時点で必要性が検出されればＰＲＰを補給する。
ｖｉｉ．培養培地を４８から７２時間毎に交換する；
ｖｉｉｉ．コンフルエンスに達したら、培養物をＤＰＢＳで洗浄し、培地を交換する。温度ベースシステムを用いてＥＳＣ構築物スカフォールディングの温度を下げ、皿からの放出を容易にする；
ｉｘ．ＥＳＣを直接、ＭＳＣ構築物の表面上に配し、混合培地を添加し、両方の構築物を被覆する。構築物をイメージングし、これをインキュベータ内に戻し、構築物培地を４８時間毎に交換する。
ｘ．分極の維持を確認するため、構築物を毎日イメージングし、分極が４８時間維持されていたことを確認した後、適切な角化（外皮形成）培地を添加する；
ｘｉ．構築物を収集時にパルス培地で２回洗浄し、培地を、ＣＴＳ（商標）ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）ＭＳＣ ＳＦＭベースを用いた既知組成輸送培地と交換する
ことが包含される。

［実施例６］
実施例６は、品質保証および構築物の仕上げ（冷結保存を伴う）のための実例のプロトコルを示す。これは、細胞療法適用のための基底の適正製造基準（ＧＭＰ）に従う輸送のための構築物の調製を包含し：
ｉ．適切な容量のＳＹＮＴＨ−Ａ−ＦＲＥＥＺＥ（登録商標）冷結保存培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を入手し、使用まで培地を２℃から８℃で保存する；
ｉｉ．細胞を調製し、収集し、密度をＣＯＵＮＴＥＳＳ（登録商標）Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて測定した後、所望の細胞量まで遠心分離する。この場合、ＳＹＮＴＨ−Ａ ＦＲＥＥＺＥ（登録商標）培地での冷結保存に典型的な細胞密度は５×１０^５から３×１０^６である；
ｉｉｉ．細胞ペレットを、所定の容量の２℃から８℃のＳＹＮＴＨ−Ａ−ＦＲＥＥＺＥ（登録商標）培地中に再懸濁させる；
ｉｖ．即座に、得られた懸濁液のアリコートを冷結保存バイアル内に、製造業者の仕様書に従って分注する；
ｖ．この冷結保存バイアルを、フリーザー温度を−８０℃に維持する適切な冷結保存システム、例えば、ＭＲ．ＦＲＯＳＴＹ（商標）システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．から入手可能）内に入れる；
ｖｉ．このバイアルを、−２００℃から−１２５℃での液体窒素の長期気相保存に移す
ことを含むものである。

本発明の本記載の実施形態を前述の本明細書において示した。当業者には、前述の説明および添付の図面に示された教示の恩恵が得られるように、本発明が関する本発明の多くの変形例および実施形態が思い浮かぶであろうことは理解されよう。従って、本発明は、本明細書に開示した具体的な実施形態に限定されないこと、および本発明の多くの変形例および他の実施形態が本発明の範囲に含まれていることが意図されていることもまた、理解されよう。さらに、本明細書において具体的な用語を用いているが、これらは、一般的および説明的な意味で用いているにすぎず、本発明の記載を限定する目的のものではない。

本発明は、創傷治療適用、組織工学、細胞療法適用、再生医療適用、医療／治療適用、組織治癒適用、免疫療法適用および組織移植治療適用における使用のための、上皮系、腺、毛、神経、骨、筋肉、脂肪、腱、血管、筋膜、眼組織およびペプチド分泌細胞要素を発生、再生、増進および／または治癒させる細胞要素の送達、塗布、移植、インプラント法、指向型播種、指向型遊走、指向型追跡、インセッティング、積層化および／または注射のための、単離されたロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体（ＬＧＲ）発現細胞を含む微細凝集塊多細胞移植片である構築物の作製方法および使用方法に関する。

Claims (9)

1. ａ）哺乳動物組織検体の真皮及び表皮から脂肪要素及び皮下要素の少なくとも一部を分離して、表皮コンパートメント、真皮コンパートメント、及び毛包コンパートメントを含む残存皮膚要素を提供するステップと、
   ｂ）前記残存皮膚要素をセクション化して、真皮セクション、表皮セクション、及び毛包セクションを含む細胞微細凝集塊を提供するステップと、
   ここで、前記毛包セクションは、ＬＧＲ４発現細胞、ＬＧＲ５発現細胞、ＬＧＲ６発現細胞、又はそれらの組み合わせから選択されるＬＧＲを発現している生幹細胞を含み、前記真皮セクション、前記表皮セクション、及び前記毛包セクションの間の天然の組織は維持されており、
   ｃ）脂肪要素及び皮下要素を加工処理して間葉由来細胞集団を提供するステップと、
   ｄ）前記間葉由来細胞集団を前記細胞微細凝集塊に添加するステップと、
   ｅ）前記細胞微細凝集塊を富化させるステップと、
   ｆ）富化された前記細胞微細凝集塊を送達基材に添加して組成物を得るステップ
   を含む方法により作成された組成物であって、
   前記組成物は、移植を必要とする対象における損傷した組織部位に移植されたとき、表皮、真皮及び付属物を含む機能性の極性組織をアセンブルすることができる、組成物。
2. 増殖因子をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
3. 遊走性／動員性の被検物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
4. リガンドファミリー、Ｒ−スポンジン、上皮由来増殖因子（ＥＤＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、Ｗｎｔタンパク質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び抗菌ペプチド又はその組み合わせからなる群より選択されるＬＧＲ特異的結合要素をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 送達基材が、スカフォールディング、マトリックス、粒子、細胞、コラーゲン、繊維又はその組み合わせから選択される、請求項１に記載の組成物。
6. 治療に使用するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
7. ｉ）創傷の治療における使用、ここで、組成物は、前記創傷の治癒を早める、及び／又は、
   ｉｉ）組織の治療における使用、ここで、組成物は、組織を治癒又は回復させる、及び／又は、
   ｉｉｉ）組織領域、創傷、空隙、欠損組織又は血液のいずれか一の治療のための治療構築物としての使用、及び／又は、
   ｉｖ）周囲の隣接組織の改変のための治療における治療構築物としての使用
   のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
8. ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物と、
   ｂ）抗生物質又は抗かび剤から選択される少なくとも１つの薬剤と、
   ｃ）フィブリノゲンと
   を含む組成物。
9. フィブリノゲンが、ヒトフィブリノゲンであり、組成物が、ペニシリン、ストレプトマイシン、又はその組み合わせ、及びアムホテリシンＢを含む、請求項８に記載の組成物。

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