ES2409537B1 - Medio de cultivo celular útil para la proliferación in vitro de células del epitelio del limbo esclerocorneal - Google Patents

Abstract

Medio de cultivo celular útil para la proliferación in vitro de células de epitelio del limbo esclerocorneal.#La presente invención proporciona un medio de cultivo celular carente de componentes de origen animal no humano y de compuestos nocivos para el organismo humano, útil para la proliferación in vitro de células de epitelio del limbo esclerocorneal, tanto de las células epiteliales diferenciadas o en proceso de diferenciación como de las células madre presentes entre ellas. Por tanto, las células cultivadas en el medo de cultivo de la invención pueden ser aplicadas de forma segura en clínica, por ejemplo, en procedimientos de terapia celular para la regeneración epitelial de la superficie ocular, preferiblemente en los casos de Síndrome de Insuficiencia Límbica (SIL).

Description

ES 2 409537 Al Medio de cultivo celular útil la in vitro de células del del limbo esclerocorneal La presente invención se encuadra en el campo de la terapia celular, específicamente dentro de los medios de cultivo celulares útiles para expandir y cultivar in vitro células del epitelio del limbo esclerocorneal que posteriormente puedan ser aplicadas de forma segura en clínica durante procedimientos de regeneración tisular de la superficie ocular. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR La superficie ocular está definida como una unidad anatómica, histológica, fisiológica y patológica que está constituida por la película lagrimal y por el epitelio de la conjuntiva, del limbo esclerocorneal (en adelante, limbo) y de la córnea junto con los tejidos conectivos adyacentes. La córnea es uno de los tejidos avasculares y transparentes del globo ocular que permite que la luz llegue hasta la retina, por lo que mantener intacta su estructura es esencial para poder generar una visión normal. Sin embargo, su contacto directo con el exterior y con los rayos ultravioletas produce un continuo desgaste de su epitelio que hace fundamental la continua regeneración del mismo. La regeneración del epitelio corneal se produce gracias a la existencia de células madre que se localizan en el epitelio limbar y que son las llamadas células madre epiteliales limbares (CM EL). El limbo es la zona de transición entre la córnea y la conjuntiva. El limbo tiene dos capas, una epitelial superficial y una estromal profunda. La capa epitelial del limbo está formada por 8 -12 capas de células escamosas no queratinizadas, siendo las más superficiales similares, al menos en apariencia, al epitelio corneal, con la diferencia de que se acompañan de células melanocíticas y de Langerhans. Sus células basales son más cuboidales y se adentran en el interior de la matriz estromal subyacente. Debajo del epitelio limbar se sitúa la membrana basal, que permite el paso de factores de 2

crecimiento y citoquinas desde el estroma al epitelio. Debajo de la membrana basal se encuentra el estroma limbar, formado por fibras de co lágeno, proteoglicanos y glicoproteínas, donde residen múltiples tipos celulares como melanocitos, macrófagos, mastocitos, linfocitos, células mesenquimales, fibroblastos y células plasmáticas. Además, la capa estromal contiene vasos sanguíneos, linfálicos y fibras nerviosas, que desempeñan entre otras funciones a porta r a las CM EL los nutrientes necesarios. Anatómicamente, en el limbo se pueden encontrar las empa lizadas de Vogt, estructuras compuestas por crestas de tejido fibrovascular orientadas en sentido radial y alternadas

entre capas de epitelio limbar. Hay múltiples evidencias clínicas y de laboratorio que sugieren que en las capas basales del epitelio limbar se encuentran las células madre del epitelio cornea!. Se ha propuesto que las células madre se localizan en un microambiente altamente especializado en su conservación y mantenimiento, denominado nicho de células madre, localizado en las zonas

más basales de las empalizadas de Vogt.

La constante renovación del epitelio corneal se produce por una migración de las CMEL desde el nicho limbar a l epitelio corneal durante la cual se van produciendo diferentes estadías de diferenciación celular, encontrando las

células más diferenciadas en las capas superficiales del epitelio cornea!.

Las CM EL son células indiferencia das, con capacidad de autorrenovación ilimitada y capacidad de diferenciarse a otros linajes celulares. Además, presentan un tamaño celular pequeño, un ratio núcleo citoplasma alto y ausencia de marcadores específicos de células epiteliales cornea les diferenciadas, como las citoqueratinas (K) 3 Y 12.

En ocasiones, las CM EL o su nicho pueden verse alteradas/o por diferentes

causas, entre las que se incluyen causas primarias, más raras, en las que falla

prin cipalmente el nicho limbar (aniridia congénita y displasias ectodérmicas), y causas secundarias, mucho más frecuentes, como causticaciones químicas o térmicas, radiaciones ultravioleta o ionizantes, conjuntivitis cicatrizantes (como el síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide de las membranas mucosas, rosácea, etc), múltiples cirugías, secuelas e infecciones extensas, abuso de lentes de contacto, pterigia, etc. Estas alteraciones en las CMEL o en su nicho producen una entidad clínica denominada deficiencia de células madre del limbo o sindrome de insuficiencia limbica (SIL). Esta patologia, que puede ser unilateral o bilateral (afectando a un solo ojo o a ambos) y tolal o parcial (afectando a la totalidad del anillo limbar o solo a una región del mismo), se caracteriza por la conjuntivalización, vascularización, inflamación y opacificación de la córnea, lo que produce un síndrome de dolor crónico y en

numerosas ocasiones pérdida parcial o completa de la visión.

A lo largo del tiempo se han desarrollado diferentes técnicas para el tratamiento del SIL, entre las que encontramos la queratoplastia penetrante, los injertos de membrana amniótica, el trasplante de tejido limbar y, más recientemente, el

trasplante de células limbares epiteliales (entre las que se encuentran las CM EL) expandidas y cultivas in vHro. El objetivo de estas técnicas es eliminar las alteraciones de la superficie ocular y obtener una nueva fuente de células madre que sean capaces de regenerar el epitelio cerneal de forma fisiológica. Sin embargo, las dos primeras técnicas mencionadas solo cumplen el primero

de los objetivos y de forma temporal. Por otro lado, un trasplante de tejido limbar en casos de SIL unilateral, en el que normalmente el tejido donante procede del ojo contralateral del propio paciente (trasplante autólogo), implica pérdida de tejido limbar del ojo sano, lo que supone riesgo de desarrollar SIL bilateral. Si por el contrario el trasplante es realizado en pacientes con daño bilateral, en los cuales el tejido limbar procede de un donante compatible vivo o cadáver (trasplante alogénico), el mayor problema es el riesgo de rechazo inmune (ocasionando vascularización e inflamación), que hace necesaria una inmunosupresión sistémica mantenida durante al menos tres años y, en muchas ocasiones, incluso de por vida, lo que ocasiona gastos sanitarios

importantes en morbilidad, visitas médicas, analiticas repetidas, etc.

Una forma de minimizar la posible lesión del ojo donante, en el caso de los trasplantes autólogos, y el riesgo de inflamación y rechazo, en el caso de los trasplantes alogénicos, es realizar un trasplante de células epiteliales limbares expandidas y cultivadas in vitro, ya que la cantidad de tejido limbar necesario

para realizar el cultivo celular es mínima y los cultivos celulares obtenidos a partir de estos tejidos tienen muy pocas células presentadoras de antígenos, lo que disminuye su inmunogenicidad (Fernández A., el al., 2008, An Sisl Sanil Navar., 31: 53-69; Shortt AJ., el al., 2007, Surv Ophlha/mol., 52: 483-502; Burman S., Sangwan V., 2008, Glin Ophlhalmol., 2: 489-502).

El procedimiento realizado para llevar a cabo el trasplante de células epiteliales limbares cultivadas in vitro consiste en el aislamiento de células epiteliales limbares del nicho limbar donante, entre las que se encuentran las GMEL, su posterior expansión y cultivo in vitro, normalmente sobre membrana amniótica,

y finalmente el trasplante del complejo membrana amniótica-células epiteliales limbares a la superficie ocular del receptor.

Aunque el trasplante de células epiteliales limbares cultivadas in vilro es la mejor estrategia terapéutica que existe actualmente para el tratamiento de SIL

Y se realiza de forma relativamente frecuente en estos casos, la metodología utilizada para ello está en continua controversia. Así, en la actualidad existen unos 20 ensayos clínicos en los que se han utilizado este tipo de trasplantes y entre todos ellos existen numerosas variantes.

Actualmente, se utilizan principalmente dos métodos para establecer un cultivo primario de células epiteliales limbares. Por un lado, la obtención de biopsias de la zona limbar que son directamente sembradas (explantes), y por otro lado, la obtención de células epiteliales limbares en suspensión por tratamientos enzimáticos, bien a partir de explantes o bien a partir de porciones mayores del

anillo limbar, que posteriormente son sembradas.

Además del método de obtención de las células del nicho limbar, están en continua controversia las condiciones de cultivo en las que se tienen que mantener dichas células durante su cultivo in vítro. En la actualidad, el sustrato más utilizado para el cultivo y expansión in vítro de este tipo celular es la

membrana amniótica, por ser antiinflamatoria, antimicrobiana, tener capacidad para estimular la reepitelización y presentar baja inmunogenicidad (Riau AK., el al., 2010, Biomaterials, 31: 216-225). Sin embrago, el medio de cultivo utilizado para el cultivo de células epiteliales del nicho limbar varía mucho entre los diferentes laboratorios y grupos clínicos, encontrándose en ocasiones componentes en estos medios de cultivo que pueden comprometer el posterior uso clínico de los cultivos primarios obtenidos.

En este sentido, durante mucho tiempo los medios de cultivo utilizados para la expansión y cultivo in vilro de CM EL han estado y siguen estando

suplementados con productos de origen animal no humano, lo que implica un alto riesgo de zoonosis, de transmisión de bacterias, virus y/u otros agentes infecciosos, como por ejemplo los priones responsables de la transmisión de la encelalopatia espongilorme. La adición de suero sanguineo de origen animal no humano al medio de cultivo es uno de los grandes problemas. En diversos

ensayos clínicos de trasplante de células epiteliales limbares expandidas y cultivadas in vitro se suplementó el medio de cultivo con suero fetal bovino por sus propiedades proliferativas y no diferenciadoras (Kruse FE, Tseng SC., 1993, Invest Ophtha/mol Vis Sei., 34: 2976-2989). Posteriormente, estudios in vitro y ensayos clínicos, han demostrado que la sustitución del suero fetal

bovino por suero humano no altera las características morfológicas, proliferativas y estadía de diferenciación de las células cultivadas (Kolli S., el al., 2009, Stem Cel/s, 28: 597-<310) ni tampoco el resultado clinico de los trasplantes.

Otro de los compuestos problemáticos usados normalmente en el cultivo celular in vitro de CM EL es la toxina colérica (Pellegrini G., et al., 1997, Lancet,

349: 990-993), endotoxina secretada por la bacteria Vibrio cholerae responsable del cólera. Su uso en cu ltivo in vitro está justificado por inducir la proliferación celular: induce la fosforilación de proteínas Gs, lo que produce una acumulación intracelular de AMP cíclico (AMPc), molécula que actúa como segundo mensajero regulando la proliferación celular. Actualmente, la acción

de esta molécula sobre queratinocitos cultivados in vitro está en controversia.

Algunos autores han demostrado que el AMPc disminuye la proliferación celular, mientras que otros han encontrado que este compuesto aumenta la proliferación cuando se usa en un rango de entre 10-14 y 10-8 M. Además, se ha demostrado que el isoproterenol, utilizado en rangos de entre 10-6 y 10-5 M,

tiene efectos similares a los de la toxina colérica en cultivos de queratinocitos (Green H., 1978, Celf, 15:801-811).

Por otro lado, el dimetil sulfóxido (DMSO) es una sustancia de naturaleza anfolérica que se caracteriza por su acción sobre la membrana plasmática de las células y su interacción con moléculas de agua, por lo que es usado normalmente como criopreservante celular. Sin embargo, se ha demostrado que el DMSO es una sustancia tóxica para el organismo humano, ya que provoca vasoconstricción, vómitos, problemas cardiovasculares y en algunos casos problemas neurológicos. Por otro lado, el DMSO es frecuentemente

utilizado en el cultivo in vitro de células epiteliales limbares por su capacidad generalizada para permeabilizar la membrana plasmática y como protector frente a los radicales libres que se pueden acumular en cultivo. Sin embargo, se ha demostrado recientemente que este compuesto induce la disminución de la proliferación y el aumento de la diferenciación celular en células de epitelio

corneal humano (Cao XG., el al., 2007, Invesl Ophlhalmol Vis Sci., 48: 37143718).

Por tanto, se considera necesario disponer de un medio de cultivo libre de compuestos animales no humanos y de componentes potencialmente nocivos

para el organismo humano, que permita establecer cultivos primarios de células del epitelio limbar humano, cultivando un elevado número de células madre presentes en el epitelio limbar, que puedan utilizarse como terapia celular segura.

Algunos ejemplos de medios de cultivo desarrollados hasta la fecha para

cumplir estos objetivos son aquellos que incluyen en sus composiciones factores de crecimiento recombinantes humanos (Mariappan l., el al., 2010, Nalure Prolocols, 5(8): 1470-1479), suero sanguíneo de cordón umbílical (PekKiang Ang L., el al., 2011, IOVS Papers in Press 10-6527), ausencia de toxina colérica (Ghoubay-Benallaoua D., el al., 2011, Molecular Vision, 17: 341-354) o

fibroblaslos embrionarios humanos que sirvan como sustrato para el crecimiento celular en condiciones libres de suero (Notara M., et al., 2007, Regenerative Medicine, 2(6): 919-927).

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

La presente invención proporciona un medio de cultivo celular, de ahora en adelante "medio de cultivo de la invención", que carece de componentes de origen animal no humano y de compuestos nocivos para el organismo humano, el cual es útil para llevar a cabo la proliferación in vilro de células del epitelio

del limbo esclerocorneal (o epitelio limbar). Además, este medio de cultivo permite mantener el fenotipo de las células madre (CM EL) presentes entre las células del epitelio limbar. Por tanto, las células expandidas y cultivadas en el medio de cultivo de la invención pueden ser aplicadas de forma segura en clínica, por ejemplo, en procedimientos de terapia celular para la regeneración

epitelial de la superficie ocular, preferiblemente en los casos de Síndrome de Insuficiencia Límbica (SIL).

Esta aplicación presenta la ventaja de evitar la transmisión de enfermedades de origen animal no humano al paciente y de evitar, si el trasplante es autólogo,

o disminuir, si el trasplante es alogénico, el riesgo de rechazo inmunológico, riesgos inherentes al trasplante de células del epitelio limbar cultivadas en otros medios de cultivo que contienen componentes de origen animal no humano, como por ejemplo suero fetal bovino (FBS). Ademas, presenta la ventaja de evitar posibles efectos secundarios, como vómitos, vasoconslricción o problemas cardiovasculares, producidos por la presencia habitual en otros medios de cultivo de componentes nocivos para el organismo humano, como

por ejemplo DMSO o toxina colérica.

Por todo ello, un primer aspecto de la invención se refiere a un medio de cultivo celular, "medio de cultivo de la invención", que comprende un medio base suplementado con:

a.

entre 50 y 1.500 tg/ml, preferiblemente 50 g/ml, de al menos un compuesto antibacteriano, más preferiblemente de gentamicina,

b.

entre 0,25 y 1.250 Jlg/ml, preferiblemente 2,5 Jlg/ml, de al menos un compuesto antifúngico, más preferiblemente de anfotericina B,

c.

entre 0,25 !lg/ml y 5 mg/ml, preferiblemente 5 Jlg/ml, de insulina recombinanle humana o de IGFs, más preferiblemente de insulina recombinanle humana,

d.

entre 0,1 Y 500 tg/ml, preferiblemente 0,4 pg/ml, de un compuesto esteroide, más preferiblemente de un compuesto glucocorticoide, aun más preferiblemente de hidrocortisona,

e.

entre 2 y 100 ng/ml, preferiblemente 5 ng/ml, de al menos un factor de crecimiento o molécula que active los receptores de EGF, más preferiblemente de un factor de crecimiento seleccionado de la lista que comprende: EGF, TGF-alfa, HB-EGF,

anfiregulina, epiregulina, betacelulina, o neuroregulina, aun más

preferiblemente de EGF,

f.

entre 10 " y lO" M, preferiblemente 10 " M, de isoproterenol,

g.

entre O y 0,2 mM, preferiblemente 0,18 mM, de adenina,

h.

entre 10-11 y 150xl0-9 M, preferiblemente 2x10.o M, de al menos

una hormona tiroidea, más preferiblemente de triiodotironina o de tetraiodotironina, aun más preferiblemente de triiodotironina, y

i. entre un O y un 20%, preferiblemente un 10%, de suero humano.

El medio base que puede ser utilizado en el medio de cultivo de la invención podría ser cualquiera de los conocidos en el estado de la técnica para el cultivo celular in vitra, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, medio basal "Eagle", CRCM-30, CMRL-1 066, "Dulbecco's Modified Eagle's Medium" (DMEM), "Fischer's Medium", "Glasgow Minimum Essenlial Medium", Ham's F-10, Ham's F-12 (F12), "High Cell Density Medium", "Iscove's Modified Dulbecco's Medium", Leibovitz's L-15, McCoy's 5A, medio 199, "Minimum Essential Medium Eagle", "Alpha Minimum Essential Medium", CnT20, NCTC 109, NCTC

135, RPMI-1640, "William's Medium E", Waymouth's MB 75211, Waymouth's MB 7051 1, "Keratinocyte serum-free medium" (KSFM), o cualquiera de sus combinaciones. En una realización preferida, el medio de cultivo de la invención comprende un medio base DMEM/F12 en, por ejemplo, aunque sin limitarnos, cualquiera de las siguientes proporciones: (1:1), (2:1) o (3:1), más

preferiblemente en proporción (1: 1 ).

Se entiende por "compuesto anlibacleriano" aquel compuesto, o mezcla de compuestos, que inhibe el crecimiento o mata a las bacterias. El agente antibacteriano, tal y como se entiende en la presente invención, puede ser

bacteriostático, el cual inhibe el crecimiento de las bacterias sin llegar a provocar su muerte, o bactericida, que destruye las bacterias. Ejemplos de compuestos antibacterianos son, aunque sin limitarnos, los aminoglucósidos (estreptomicina, neomicina, kanamicina, netilmicina, gentamicina, etc.), los beta-Iactámicos (penicilinas y cefalosporinas), los polipéptidos (vancomicina,

bacitracina, polimixina B, etc.), las quinolonas (norfloxacino, ácido nalidixico, etc.), los macrólidos (eritromicina, azitromicina, etc.), las tetraciclinas (doxiciclina, tetraciclina, etc.) y otros como el cloranfenicol, la clindamicina o la lincomicina. En otra realización preferida, el compuesto antibacteriano del medio de cultivo de la invención es gentamicina.

Se entiende por "compuesto antifúngico" aquel compuesto, o mezcla de compuestos, que inhibe el crecimiento o mata a los hongos. El agente antifúngico, tal y como se entiende en la presente invención, puede ser fungiestático, el cual inhibe el crecimiento de los hongos sin llegar a provocar su muerte, o fungicida, que destruye los hongos. Ejemplos de compuestos antifúngicos son, aunque sin limitarnos, la anfotericina B, los azoles

(ketoconazol, fluconazol, itraconazol, etc.), la flucitosina, la terbinafina, la nislatina o la griseofulvina. En otra realización preferida, el compuesto antifúngico del medio de cultivo de la invención es anfotericina B.

La insulina es un péptido que en cultivo in vitro es capaz de producir un

aumento en la proliferación celular, inhibir la apoptosis y cerrar fisuras epiteliales. Estos procesos se realizan a través de un mecanismo de acción que tiene su origen en la activación de los receptores de insulina (RI), localizados en la membrana plasmática, cuya presencia ya ha sido demostrada en células de la superficie ocular. Actualmente se conoce la existencia de dos péptidos análogos a la insulina, los factores de crecimiento similares a la insulina (IGFs) I y 11. Al igual que la insulina, estos péptidos pueden aumentar la proliferación celular y disminuir la apoptosis. Debido a la similitud en el mecanismo de acción de estos compuestos, los IGFs pueden ejercer una función similar a la ejercida por la insulina durante su uso para la expansión y

cultivo in vitro de células del epitelio limbar, aumentando la proliferación celular sin modificar el fenotipo celular. Por ello, tanto la insulina como estos IGFs, preferiblemente IGF I y/o 11, pueden ser empleados en el medio de cultivo de la invención.

La hidrocortisona es un compuesto esteroide, concretamente un glucocorticoide, cuyo mecanismo de acción comienza con la entrada de la molécula al citoplasma celular a través de un trasporte pasivo, donde se une de forma específica a sus receptores citoplasmáticos. Este conjunto receptorhidrocortisona entra en el núcleo celular uniéndose a regiones específicas del

ADN (elementos de respuesta a glucocorticoides), regulando la activación de otros factores de transcripción, como el AP-1, produciendo finalmente un aumento en la proliferación celular. Así mismo se ha comprobado que otros compuestos del grupo de los esteroides, como por ejemplo, pero sin limitarnos, la dexametasona, producen este mismo efecto. Por ello, diferentes compuestos del grupo de los esleroides ejercen una función similar a la hidrocorlisona durante su uso para la expansión y cultivo in vitro de células del epitelio limbar,

aumentando la proliferación celular. Así, diferentes compuestos del grupo de los esleroides, preferiblemente de los glucocorticoides, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, la dexametasona o la hidrocortisona, pueden ser empleados en el medio de cultivo de la invención.

El Factor de Crecimiento Epitelial (EGF) es un compuesto implicado en la proliferación celular. Actualmente se conoce que el EGF comienza su mecanismo de acción en la célula diana cuando se une al receptor específico para EGF (EGFR). En ausencia de ligandos, los EGFR residen en la membrana de forma ¡nactivada. Cuando el EGF se une a su receptor, se

produce la dimerización de éste, que activa la ruta de señalización Ras/MAPK, activando la molécula MAPK, capaz de traslocarse al núcleo y activar genes que participan en la proliferación celular. Otra vía importante tras la activación de EGFR es la de PI3K, la cual genera señales para la supervivencia celular y previene la apoptosis. Además, la activación de los EGFR controla la

proliferación celular por medio de la activación de canales de calcio y del

intercambio

Na-H. El EGF forma parte de una familia de factores de

crecimiento,

cuya principal función es estimular la proliferación de

queratinocitos.

En este contexto, se puede afirmar que los factores de

crecimiento o moléculas que se unen y/o activan los receptores de EGF (EGFR), como por ejemplo, aunque sin limitarnos, el factor de crecimiento transformante (TGF-alfa), el factor de crecimiento parecido a EGF heparina (HB-EGF), la anfiregulina, la epiregulina, la betacelulina o las neuroregulinas, adicionados al medio de cultivo de la invención pueden estimular de la misma forma en que lo hace el EGF la proliferación celular de las células del epitelio

limbar, ya que se unen al mismo receptor celular, y por tanto activan las mismas cascadas de transducción de señales intracelulares.

La triiodotironina (T3) es una hormona tiroidea y, por ello, está implicada en la regulación del metabolismo celular y en la corregulación de la proliferación, apoptosis y diferenciación celular. La T3 es capaz de atravesar la membrana plasmática celular y unirse a sus receptores específicos , situados en la membrana nuclear, donde actúan como factores de transcripción dependientes de ligando. Por otro lado, se sabe que la hormona tiroidea lelraiodolironina o tiroxina (T4), al igual que la T3, atraviesa la membrana plasmática y que una vez en el interior de la célula es transformada en T3 a través del selenoenzima desyodasa tipo 11, enzima que se ha demostrado que está presente en

queratinocitos de piel humana. Por tanto, la hormona T4 puede desencadenar los mismos efectos celulares que la T3. En este contexto, la adición de otras hormonas tiroideas además de la T3, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, la T 4 al medio de cultivo de la invención puede ejercer los mismos efectos en el cultivo in vitro de células del epitelio limbar que la adición de T3.

El suero sanguíneo humano está formado por numerosos componentes, los cuales ejercen efectos beneficiosos sobre el cultivo in vitro de células del epitelio limbar, como estimulación de la proliferación y de la adhesión celular. En este sentido, no solamente el suero sanguíneo humano comercial

(alogénico) puede ser utilizado, sino que en el medio de cultivo de la invención se puede utilizar también suero humano autólogo. Por ello, en otra realización preferida, el suero humano del medio de cultivo de la invención es de origen autólogo.

Como demuestran los ejemplos de la invención, el medio de cultivo descrito anteriormente es de utilidad en la expansión y cultivo in vitre de células del epitelio limbar, tanto de las células epiteliales diferenciadas o en proceso de diferenciación (transitorias) como de las células madre presentes entre ellas. Por ello, otro aspecto de la invención se refiere al uso del medio de cultivo de la

invención para la proliferación in vitro de células del epitelio del limbo esclerocorneal.

El término "prol iferación" se refiere a los procesos de crecimiento, expansión, adhesión, división o multiplicación que sufren las células.

El "limbo esclerocorneal" es la zona circular, ligeramente sobreelevada, que

corresponde a la línea de transición entre la córnea y la conjuntiva-esclera.

Histológicamente el limbo esclerocorneal está formado por el epitelio, la membrana basal y el estroma. El término "células del epitelio del limbo esclerocorneal" se refiere tanto a las células epiteliales limbares diferenciadas o en proceso de diferenciación (transitorias), como a las células madre (células indiferenciadas) presentes en el epitelio limbar, también llamadas CMEL, responsables de la regeneración epitelial de la superficie ocular, preferiblemente de la córnea. La caracterización de las células del epitelio del limbo esclerocorneal se puede realizar mediante, por ejemplo, pero sin limitarnos, la identificación de proteínas de superficie y/o intracelulares, el

análisis de expresión de genes, y/u otros marcadores. Los métodos que pueden ser utilizados para dicha caracterización incluyen, pero no se limitan: análisis inmunocitoquímico, análisis por inmunofluorescencia, análisis por northern blot, análisis por western blot, RT-PCR, análisis de expresión génica en microarrays, o análisis morfológicos por microscopía óptica o electrónica.

Preferiblemente, en la presente invención las células del epitelio del limbo esclerocorneal se caracterizan por análisis mediante inmunofluorescencia o por RT-PCR a tiempo rea l, más preferiblemente por análisis mediante inmunofluorescencia. Así, las células epiteliales limbares en proceso de

diferenciación o diferenciadas son aq uellas células localizadas en el epitelio del limbo esclerocorneal que se caracterizan por ser positivas a la tinción con anticuerpos anti-K3 y/o K12. Las "células madre del epitelio del limbo esclerocorneal" son aquellas células localizadas en el epitelio limbar, preferiblemente en la capa basal de dicho epitelio, que se caracterizan por ser

positivas a la tinción con anticuerpos anti-proteína ABCG2 y/o anti-K15.

En una realización preferida, las células del epitelio del limbo esclerocorneal son células madre.

Las células del epitelio del limbo esclerocorneal pueden proceder de cualquier

animal, preferiblemente mam ífero, más preferiblemente humano. En una realización más preferida, las células del epitelio del limbo esclerocorneal proceden de un humano.

La posibilidad de que las células del epitelio limbar cultivadas en presencia del

medio de cultivo de la invención sean de origen autólogo, permite que el posterior trasplante de éstas para la regeneración tisular de la superficie ocular pueda realizarse sin que sea necesaria la inmunosupresión del sujeto trasplantadoPor ello, en una realización aun más preferida, las células del

.

epitelio del limbo esclerocorneal son de origen autólogo.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para la proliferación in vítro de células del epitelio del limbo esclerocorneal, de ahora en adelante método de la invención", que comprende:

a.

sembrar células del epitelio del limbo esclerocorneal en un sustrato, y

b.

cultivar las células del paso (a) en presencia del medio de cultivo de la invención.

En una realización preferida, las células del epitelio del limbo esclerocorneal en

el método de la invención son células madre. Además, las células del epitelio del limbo esclerocorneal pueden proceder de un humano, pero también de mamíferos no humanos, como por ejemplo, pero sin limitarse, roedores, rumiantes, felinos o cánidos. En una realización más preferida, las células del epitelio del limbo esclerocorneal del método de la invención proceden de un

humano. En una realización aun rnás preferida, las células del epitelio del limbo esclerocorneal son de origen autólogo.

En la presente descripción se entiende por "origen autólogo" cualquier procedencia de la muestra, tomada de los tejidos o células de un individuo o paciente, que es la misma en un donante y en el receptor de los mismos cuando le son administrados tras su tratamiento o trasplantados tras su

modificación.

En el paso (a) del método de la invención se pueden sembrar células del epitelio limbar obtenidas, por ejemplo, aunque sin limitarnos, por digestión enzimática a partir de un tejido limbar, o bien se puede sembrar directamente

una porción de, preferiblemente, 1-2 mm2 (explante) procedente de este tejido.

El "sustrato" que se puede utilizar para sembrar las células en el paso (a) del método de la invención es cualquier recipiente o superficie de los conocidos en el estado de la técnica para el cultivo de células, preferiblemente para el cultivo de células del epitelio del limbo esclerocorneal. Ejemplos de este tipo de sustratos y/o soportes son, aunque sin limitarnos, sustratos de plástico, preferiblemente en forma de placa o frasco de cultivo, más preferiblemente soportes de poliestireno, soportes de vidrio, membrana amniótica, preferiblemente humana, o biomateriales. En otra realización preferida, el sustrato del paso (a) del método de la invención es un biomaterial. En otra

realización preferida, el sustrato del paso (a) del método de la invención es plástico. Además, opcionalmente dicho sustrato puede estar recubierto de uno

o varios componentes favorecedores de la adhesión celular, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, poli-L-lisina, laminina o fibroblastos, preferiblemente humanos.

Se entiende por "biomaterial" cualquier sustancia farmacológicamente inerte diseñada para ser implantada o incorporada al organismo vivo, que es biocompatible, no tóxica, químicamente estable y presenta una adecuada resistencia mecánica, entre otras propiedades deseables para el uso clinico. El Los medios de cultivo celular confieren a las células expandidas y cultivadas in vitro ciertas características que son consecuencia de la respuesta celular a los estímulos externos específicos que ejerce el medio de cultivo sobre ellas. Por tanto, como muestran los ejemplos de la invención, las células del epitelio del limbo esclerocorneal, preferiblemente células madre, obtenidas mediante el método de la invención presentan unas caraclerí sticas fenotípicas, aunque no funcionales, diferentes a las de otras células del epitelio limbar que no han estado sometidas a estas condiciones específicas de cultivo in vitro. Por ello,

biomaterial

de la invención puede ser, aunque sin lim itarnos, metálico,

cerámico,

polim érico, incluyendo biopolímeros, o una combinación de los

anteriores.

otro aspecto de la invención se refiere a una célula obtenible mediante el método de la invención, de ahora en adelante "célula de la invención", En una realización preferida, la célula de la invención es una célula madre. En una realización más preferida, la célula de la invención se caracteriza por expresar al menos un marcador propio de células madre del epitelio limbar seleccionado de entre: K15 y ABCG2.

Otro aspecto de la invención se refiere a una población celular que comprende la célula de la invención, de ahora en adelante "población celular de la invención".

Las células madre presentes en el epitelio del limbo esclerocorneal son capaces de dividirse y diferenciarse para reemplazar las células lesionadas o senescentes de la superficie ocular, preferiblemente del epitelio de la córnea, por células nuevas manteniendo así una población celular constante. La célula de la invención presenta también esta propiedad, preferiblemente cuando expresa los marcadores K15 y/o ABCG2 propios de células madre. Por tanto, dicha célula y la población celular de la invención son de utilidad en el tratamiento y/o prevención de lesiones o enfermedades degenerativas, inflamatorias o genéticas de la superficie ocular, entendiéndose por "superficie

ocular" la región del globo ocular que corresponde a la pelicula lagrimal, la córnea, el limbo esclerocorneal y la conjuntiva. Preferiblemente, la célula de la invención y la población celular de la invención son útiles para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de un limbo esclerocorneal que presente destrucción, inexistencia o perturbación de la funcionalidad de las células madre, como es el caso de las patologías englobadas bajo la denominación de síndrome de insuficiencia límbica (SIL).

Así, la célula o la población celular de la invención pueden ser trasplantadas a la superficie ocular de un sujeto que padezca una lesión o enfermedad degenerativa, inflamatoria o genética de la superficie ocular con el objetivo de incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional del

limbo esclerocorneal, de la córnea o de la conjuntiva; preferiblemente para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de un limbo esclerocorneal que presente destrucción, inexistencia o perturbación de la funcionalidad de las células madre, como es el caso de las palologias englobadas bajo la denominación de síndrome de insuficiencia límbica (SIL).

Por todo ello, otro aspecto de la invención se refiere al uso de la célula o de la población celular de la invención para la elaboración de un medicamento o, alternativamente, a la célula o a la población celular de la invención para su uso como medicamento, de ahora en adelante "medicamento de la invención".

El umedicamento" al que se refiere la presente invención puede ser de uso humano o veterinario, aunque preferiblemente es de uso humano. El "medicamento de uso humano" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades para el tratamiento o prevención de enfermedades o lesiones en seres humanos o que pueda usarse en seres humanos o administrarse a seres humanos con el fin de restaurar, corregir o modificar las funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico médico. El "medicamento de uso veterinario" es toda sustancia o combinación

de suslancias que se presente como poseedora de propiedades curativas o preventivas con respecto a las enfermedades o lesiones animales o que pueda administrarse al animal con el fin de restablecer, corregir o modificar sus funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico veterinario.

En una realización preferida, el medicamento de la invención es para la prevención y/o tratamiento de lesiones o enfermedades degenerativas,

inflamatorias o genéticas de la superficie ocular. En una realización más preferida, la superficie ocular es la córnea. En una realización aun más preferida, la enfermedad es el Sindrome de Insuficiencia Límbica (SIL).

Las enfermedades de la superficie ocular cursan con signos y síntomas de

inflamación ocular y/o con disminución de la agudeza visual. Ejemplos de este tipo de enfermedades son, aunque sin limitarnos, inflamación crónica del epitelio corneoconjuntival, metaplasia escamosa, déficit de células madre limbicas (SIL), edema corneal (por ejemplo, por disfunción endotelial, hipoxia o trauma), distrofias/degeneraciones del epitelio corneal, defecto epitelial persistente o erosión epitelial corneal recidivante.

El "Síndrome de insuficiencia límbica o SIL" es el término empleado para englobar a todas las patologias que cursan con la perturbación de la funcionalidad, la destrucción o la inexistencia de las células madre del limbo

esclerocorneal. Dentro de las patologías englobadas bajo este término se encuentran, por ejemplo, aunque sín limitarnos, aquellas provocadas por quemaduras químicas o térmicas, conjuntivitis cicatrizantes autoinmunes (como por ejemplo, aunque sin limitarnos, el síndrome de Stevens-Johnson o el penfigoide cicatrizal), aquellas provocadas por cirugías o criotera pias,

queratopatía inducida por lentes de contacto, infecciones microbianas, ectasias, aquellas provocadas por radiación ionizante o ultravioleta, aquellas provocadas por el uso de medicación como los anti-metabolitos o el 5fluorouracilo o la mitomicina c (iatrogénicos); aquellas patologías congénitas como, por ejemplo, aunque sin limitarnos, aniridia, coloboma, neoplasia,

distrofia corneal, deficiencias hormonales, enfermedades ulcerativas periféricas de la córnea, queratopatía neurotrófica, queratopatía bullosa crónica, limbitis crónica, pterigium o insuficiencia limbar idiopática, o en general, la ceguera corneal.

El medicamento de la invención puede utilizarse tanto solo como en combinación con otros medicamentos o composiciones para el tratamiento y/o

prevención de lesiones o enfermedades degenerativas, inflamatorias o genéticas de la superficie ocular, preferiblemente de la córnea, más preferiblemente para el tratamiento y/o prevención del SIL.

Preferiblemente, el medicamento de la invención es un medicamento de terapia celular somática. Se entiende por "terapia celular somática" la utilización de células somáticas vivas, tanto autólogas (procedentes del propio paciente), como alogénicas (de otro ser humano) o xenogénicas (de animales), cuyas caracteristicas biológicas han sido alteradas sustancialmente como resultado de su manipulación, para obtener un efecto terapéutico, de diagnóstico o

preventivo, por medios metabólicos, farmacológicos o inmunológicos. Entre los medicamentos de terapia celular somática se encuentran, por ejemplo, pero sin limitarse: células manipuladas para modificar sus propiedades inmunológicas, metabólicas o funcionales de otro tipo en aspectos cualitativos o cuantitativos; células clasificadas, seleccionadas y manipuladas, que se someten

posteriormente a un proceso de fabricación con el fin de obtener el producto terminado; células manipuladas y combinadas con componentes no celulares (por ejemplo, matrices o productos sanitarios biológicos o inertes) que ejercen la acción pretendida en principio en el producto acabado; derivados de células autólogas expresadas ex vivo (in vitro) en condiciones específicas de cultivo; o

células modificadas genéticamente o sometidas a otro tipo de manipulación para expresar propiedades funcionales homólogas o no homólogas anteriormente no expresadas.

El término "tratamiento", tal como se entiende en la presente invención, se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de lesiones o enfermedades degenerativas, inflamatorias o genéticas de la superficie ocular, preferiblemente de la córnea, más preferiblemente como consecuencia del SIL, en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente humano) que incluye:

(i) inhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su

desarrollo;

(ii) aliviar la enfermedad o la condición patológica, es decir, causar la regresión de la enfermedad o la condición patológica o su sintomatología; o

(jii) estabilizar la enfermedad o la condición patológica.

El término "prevención", tal como se entiende en la presente invención,

consiste en evitar la aparición de la enfermedad, es decir, evitar que se produzca la enfermedad o la condición patológica en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente humano), en particular, cuando dicho sujeto tiene predisposición por la condición patológica, pero aún no se ha diagnosticado que la tenga.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica, de ahora en adelante "composición de la invención", que comprende la célula o la población celular de la invención.

La composición de la invención puede comprender además excipientes y/o vehículos farmacéutica mente aceptables. Por ello, en una realización preferida, la composición de la invención además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

El término "excipiente hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de los elementos de la composición de la invención, estabiliza dichos elementos, activa o ayuda a la preparación de la composición en el sentido de darle consistencia. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos, como por ejemplo es el caso de almidones,

azúcares o celulosas, la función de protección de la composición, como por ejemplo, para aislarla del aire y/o la humedad, la función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación, la función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.

El "vehículo farmacéuticamente aceptable", al igual que el excipiente, es una sustancia que se emplea en la composición para diluir cualquiera de los componentes de la presente invención comprendidos en ella hasta un volumen

o peso determinado. El vehículo farmacéuticamente aceptable es una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los elementos de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros elementos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición.

Preferiblemente, la com posición de la invención comprende la célula o la población celular de la invención en una cantidad terapéuticamente efectiva,

entendiéndose por "cantidad terapéutica mente efectiva" la cantidad de célula o

de población celular de la invención que produzca el efecto deseado. La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, la edad, peso, sexo, tipo de patología, estado de salud general del individuo o tolerancia del mismo.

La composición de la presente invención puede formularse para su administración en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Como ejemplos de preparaciones se incluye cualquier composición sólida (comprimidos, píldoras, cápsulas, gránulos, etc.) o líquida (soluciones,

suspensiones o emulsiones) para administración oral, tópica o parenteral. La composición de la presente invención también puede ser formulada en forma de liposomas o nanosferas, de formulaciones de liberación sostenida o de cualquier otro sistema convencional de liberación.

Tal composición y/o sus formulaciones, así como la célula o la población celular

de la invención, pueden administrarse a un animal, incluyendo un mam ífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse,

parenteral (intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, intraeslromal, intralesional, intraarterial, intramuscular, intranasal, subcutánea, intracapsular, etc.), tópica, intraocular, percutánea, espray nasal, implante quirúrgico, pintura quirúrgica interna, bomba de infusión o vía catéter.

En una realización más preferida, la composición de la invención además comprende otro principio activo. Como se emplea aquí, el término "principio activo", "sustancia activa", sustancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto

diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de una lesión o enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad

específica o el efecto .

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas

y características de la invención se desprenderán en pa rte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Muestra el porcentaje de cultivos primarios de células del epitelio del limbo esclerocorneal cultivados en plástico en presencia del medio de cultivo de la invención que alcanzan confluencia (Al y el tiempo que

tardan dichos cultivos en alcanzar dicho estado (B).

Fig. 2. Muestra la morfología de las células del epitelio del limbo esclerocorneal obtenidas a partir de ex plantes del tejido y cultivadas en presencia del medio de cultivo de la invención. Morfología de los cultivos primarios de células del epitelio del limbo esclerocorneal cultivadas sobre

plástico y en presencia del medio de cultivo de la invención.

Fig. 3. Muestra la expresión génica relativa, analizada mediante RT -PCR a tiempo real, de los marcadores citoqueratina (K) 3, K12, K15 Y la proteína transportadora de membrana ABCG2 en células del epitelio limbar

cultivadas con el medio de cultivo de la invención sobre plástico. La expresión del marcador K12 fue tomada como calibrador interno, a la que se le asignó valor 1. Los resultados representados proceden de 5 experimentos independientes (n=5) utilizando cultivos primarios de tejidos procedentes de 5 donantes diferentes. El análisis estadístico se realizó, por un lado, mediante la

comparación del grupo con valor 1 con el resto de grupos mediante el test TStudent para una muestra y, por otro lado, mediante la comparación de los

otros grupos entre si con un ANOVA de un factor ("·psO,001).

Fig. 4. Muestra el porcentaje de células positivas durante la

inmunofluorescencia para los marcadores específicos de células epiteliales cornea les diferenciadas (citoqueratinas (K) 3 Y K12) Y para los marcadores de células madre de epitelio limbar (K15 y proteína transportadora ABCG2) en células de epitelio limbar cultivadas sobre plástico con el medio de cultivo de la invención. Los resultados mostrados

proceden de 4 experimentos independientes (n=4) realizados a partir de cultivos primarios de tejidos procedentes de 4 donantes diferentes. El análisis estadistico se realizó con un ANOVA de un factor (·psO,05).

Fig, 5, Muestra la expresión génica relativa del marcador citoqueratina (K)

3 en cultivos primarios de limbo cultivados in vitro con dos medios de cultivo diferentes : el medio de cultivo de la invención (IOBA-SH) y un medio comercial sin suero pero con componentes de origen animal no

humano (CnT20). El calibrador utilizado fueron los niveles de expresión del ARNm de K15 en cada una de las condiciones analizadas. Se observa que el marcador K3 (propio de células epiteliales cornea les diferenciadas) se expresa significativamente menos cuando se utiliza el medio de cultivo de la invención

que cuando se utiliza el medio de cultivo CnT20, lo que indica que las células limbares cultivadas con el medio de cultivo de la invención presentan un fenotipo más propio de células ¡ndiferenciadas que cuando se utiliza otro medio de cultivo para este tipo celular. Los experimentos mostrados proceden de 5 cultivos primarios distintos (n=5) procedentes de al menos 3 donantes

diferentes. Los dalos fueron analizados estadísticamente con una T de Student

("p0,01 ).

Fig. 6. Muestra la expresión proteica de los marcadores propios de célula madre de epitelio Iimbar citoqueratina (K) 15 Y proteína transportadora de

membrana ABCG2 en cultivos primarios de limbo cultivados in vitro con dos medios de cultivo diferentes : el medio de cultivo de la invención (IOBA-SH) y un medio comercial sin suero pero con componentes de origen animal no humano (CnT20). Se observa que los marcadores K15 y ABCG2 se expresan significativamente más cuando se utiliza el medio de

cultivo de la invención que cuando se utiliza el medio de cultivo CnT20, lo que indica que los cultivos de células cultivadas en presencia del medio de cultivo de la invención presentan un mayor porcentaje de células con fenotipo típico de células limbares ind iferenciadas. Los datos mostrados proceden de cuatro experimentos independientes (n=4) a partir de cultivos primarios procedentes

de al menos 3 donantes diferentes. Los datos fueron analizados

estadísticamente con una T Student (*p':::;O,05; **p:=;:O,01; ***p':::;O,001).

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del medio de cultivo de la invención en la proliferación in vitro de células del epitelio del limbo esclerocorneal, tanto de células epiteliales diferenciadas o en proceso de diferenciación, como de células madre (indiferenciadas). Estos ejemplos específicos que se proporcionan sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención y se incluyen solamente con fines ilustrativos, por lo que no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

EJEMPLO 1. CRECIMIENTO IN VITRO DE CÉLULAS EPITELIALES DEL

LIMBO ESCLEROCORNEAL y DE LAS CÉLULAS MADRE PRESENTES ENTRE ELLAS.

1.1. Determinación de la composición de un medio de cultivo idóneo para el crecimiento in vitro de células epiteliales del limbo esclerocorneal y de

las células madre presentes entre ellas.

Se intentó determinar la composición de un medio de cultivo en el que no se utilizasen compuestos de origen animal no humano ni componentes potencialmente nocivos como suplementos, con el objetivo de crecer células epiteliales del limbo esclerocorneal aisladas del nicho limbar y las células madre presentes entre ellas. En dicho medio de cultivo no se utilizó ni toxina colérica ni DMSO como suplementos, sino que éstos fueron sustituidos por otros componentes, como se verá más adelante. Además, los componentes de origen animal no humano fueron eliminados.

El DMSO no fue empleado en el medio de cultivo de la invención por la toxicidad que presenta para el organismo humano y por comportarse como un agente diferenciador y que aumenta la apoptosis en los cultivos in vitro.

La toxina colérica, normalmente empleada en este tipo de medios de cultivo, se sustituyó por isoproterenol, compuesto cuyo mecanismo de acción es similar al de la toxina colérica, pero que no presenta peligrosidad biológica. Está demostrado que el isoproterenol presenta una menor activación de la proliferación que la toxina colérica, ya que la toxina colérica induce un cambio permanente en las proteínas Gs, induciendo un aumento constante en la concentración de AMPc, mientras que el isoproterenol cambia temporalmente las proteínas Gs, por lo que el aumento de AMPc es temporal. Por ello, se adicionaron al medio de cultivo adenina y triiodolironina para potenciar la proliferación celular. La concentración de isoproterenol añadida a este medio de cultivo para inducir la proliferación fue de 10" M.

En el medio de cultivo de la invención se propuso además la sustitución de los componentes animales por otros de origen humano con el objetivo de disminuir los riesgos de zoonosis. Especialmente se propuso la sustitución del suero fetal bovino por suero humano, ya que este último no modifica las características morfológicas, ni el estadio de diferenciación de las células madre del epitelio

del limbo esclerocorneal cultivadas, ni el resultado clínico de los trasplantes de dichos cultívos celulares. Por ello, se suplementó el medio de cultívo de la invención con un 10% de suero sanguíneo de origen humano, ya que la presencia de suero sanguíneo favorece la proliferación de células progenitoras del limbo. Todos los demás componentes con un posible origen animal como la

insulina, el EGF, la hidrocortisona, la adenina y la triidotironina fueron sustituidos por compuestos de origen humano, recombinante o de síntesis química.

Por tanto, el medio de cultivo diseñado consistió en un medio de cultivo base

DMEM/F12 en proporción 1: 1 suplementado con:

a. 50 lg/ml de gentamicina,

2,5 g/ml de fungizona (anfotericina B),

c.

5 Jlg/ml de insulina recombinante humana,

d.

0, 4 ¡.¡g/ml de hídrooorlísona,

e.

5 ng/ml de factor de crecimiento epitelial (EGF),

1 J.'M de isoproterenol,

g.

0,18 mM de adenina,

h.

2 nM de triiodotironina, y

i.

10% de suero humano.

Este medio de cultivo se empleó pa ra llevar a cabo la expa nsión y cultivo in vitro de células epiteliales del limbo esclerocorneal, y de las células madre

presentes entre ellas, sobre plástico.

1.2. Establecimiento de cultivos primarios de células del epitelio del limbo

esclerocorneal.

Se establecieron cultivos primarios de células del epitelio del limbo esclerocorneal a partir de explantes del nicho limbar, utilizando como sustrato plástico (poliestireno) y como medio de cultivo el descrito en el apartado anterior.

Las muestras de tejido corneo-limbo-escleral fueron enviadas por el Banco de Ojos de Barraquer de Barcelona, previo consentimiento informado, y procedian de donantes cadáver cuyos tejidos oculares no pudieron ser utilizados para el

trasplante de órganos. Así, los tejidos utilizados para el estudio pertenecieron a 6 donantes de una edad media de 82,87±2,83 años y fueron utilizados en los 3,25±0,45 días posteriores a la enucleación, tiempo durante el cual fueron mantenidos a 4°C. Posteriormente, las muestras fueron lavadas en tampón salino suplementado con gentamicina y fungizona. Seguidamente, el exceso de

conjuntiva, esclera, iris y endotelio fueron retirados y el botón corneal fue separado con ayuda de un trépano, obteniendo de esta forma el anillo limboescleral. Se escogieron explantes procedentes de la zona superior e inferior del limbo, ya que ésta es el área descrita donde se localiza la mayor concentración de empalizadas de Vogt y, por tanto, de células madre del epitelio limbar. Se

'

cortaron porciones (explantes) de 1-2 mm que fueron colocados sobre las placas de cultivo. Los cultivos primarios se realizaron en una superficie de 1 cm . Los explantes fueron incubados con suero sanguíneo humano (50 ¡JI)

morfología y del fenotipo adquirido por las células del epitelio limbar cultivadas in vitro se realizó mediante:

Análisis morfológico: la morfología, el tamaño celular y la homogeneidad

de los cultivos se controló mediante la toma de fotografías con un microscopio óptico invertido de contraste de fases.

Caracterización celular: el fenotipo celular se analizó mediante RT -PCR a tiempo real (ARNm) e inmunofluorescencia. Actualmente, están descritos marcadores que se expresan mayoritariamente en el epitelio

diferenciado de la córnea y otros que, por el contrario, se expresan mayoritariamente en células indiferenciadas del epitelio de limbo. Por ello, se estudió la expresión de marcadores de epitelio corneal humano diferenciado y de células madre de epitelio limbar en células cultivadas con el medio de cultivo de la invención sobre plástico. Como marcadores

de epitelio corneal diferenciado se estudió la expresión de tas K3 y K12 .

En el caso de las células madre de epitelio limbar, se estudió la expresión de la K15 y de la proteína transportadora de membrana ABCG2.

En cuanto al análisis morfológico, las células del epitelio limbar cultivadas en presencia del medio de cultivo de la invención sobre plástico (Fig. 2) presentaron una morfología cuboidal y homogénea propia de células epiteliales.

Mediante RT -PCR a tiempo real, se observó que la expresión génica relativa de la K3 era significativamente menor que la expresión de K12, ambas específicas de epitelio corneal diferenciado. Además, se observó mayor expresión génica relativa, aunque de forma no significativa, de la K15 con respecto a las K3, K12 Y a la proteina transportadora de membrana ABCG2. Asi mismo, no se

observaron diferencias significativas en la expresión génica relativa de la proteína transportadora específica de célula madre ABCG2 con respecto a la del resto de marcadores analizados (Fig. 3).

A nivel proteico, se estudió mediante inmunofluorescencia la expresión de los mismos marcadores en células cultivadas sobre plástico en presencia del medio de cultivo de la invención. La preparación de las células para realizar

posteriormente la inmunofluorescencia fue la que se describe a continuación.

Los CPLH fueron cultivados hasta alcanzar confluencia (70%-90%). Posteriormente, las células fueron levantadas incubándolas con Versene durante 30 min a 37'C y 5% CO,. Se centrifugaron las células por citospin durante 10 minutos a 800 rpm y baja aceleración, depositándolas en cristales

tratados con poli-L-lisina. Finalmente fueron fijadas con metanol durante 10 minutos a -20°C. Se observó así un alto porcentaje de células positivas para las K3 y K12. Sin embargo, la K15 se observó en un 56%. Además, un 90% de las células expresaron la proteina ABCG2 (Fig. 4).

En base a estos resultados, se puede afirmar que el medio de cultivo de la invención es adecuado para el cultivo in vilro de células del epitelio limbar, ya que los cultivos celulares limbares incubados con dicho medio presentan tanto marcadores de células epiteliales diferenciadas cornea les (K3 y K12) como de células madre limbares (K15 y ABCG2). La elevada expresión de los

marcadores K15 y ABCG2 demuestra la existencia de células madre entre la población celular obtenida, lo que indica que el medio de cultivo de la invención favorece el estado indiferenciado de las células madre de epitelio limbar y permite la expansión y cultivo in vitro de las mismas.

EJEMPLO 2. ESTUDIOS ADICIONALES DE CARACTERIZACiÓN CELULAR SOBRE LAS CÉLULAS DEL EPITELIO DEL LIMBO ESCLEROCORNEAL CULTIVADAS EN PRESENCIA DEL MEDIO DE CU LTIVO DE LA INVENCiÓN.

Se llevaron a cabo estudios de caracterización adicionales sobre las células cultivadas en presencia del medio de cultivo de la invención, con el objetivo de demostrar que efectivamente las células obtenibles mediante el método de cultivo de la invención presentan unas caracteristicas fenotípicas, aunque no funcionales, diferentes a las de otras células del epitelio limbar que no han estado sometidas a estas condiciones específicas de cultivo in vítro.

2.1. Se analizó la expresión proteica, mediante inmunofluorescencia, de marcadores propios de diferentes tipos celulares presentes en el nicho limbar, como melanocitos (MART-1), células dendríticas (CD11 c) y células endoteliales (PECAM), en muestras de tejido de limbo humano sano y en muestras de cultivos primarios expandidos y cultivados in vitro con el medio de la invención,

para valorar las posibles diferencias existentes entre las células presentes en estos dos tipos de muestras.

Métodos: los tejidos limboesclerales humanos fueron fijados en formaldehido 4%, incluidos en "Tissue-Tek-OCT" y cortados mediante criostato en secciones

de 5 fJm. Por otro lado, cuando las células de los cultivos primarios de epitelio limbar cultivados con el medio de cultivo de la invención alcanzaron confluencia fueron levantadas, incubándolas con tripsina 0,25%-lmM EDTA durante 5 min. Posteriormente, las células se centrifugaron por citospin durante 10 min a 800 rpm y baja aceleración, depositándolas en cristales tratados con poli-L-lisina, y

finalmente fueron fijadas con metanol frío durante 10 min a -20°C. Ambos tipos de muestras (células cultivadas en el medio de la invención y tejidos limbares) fueron permeabilizados con Triton X-100 al 0,3% durante 10 min e incubados 1 hora con suero de burro al 5%. Las muestras se incubaron toda la noche a 4°C con los anticuerpos primarios de ratón anti-MART1 humano, anti-CD1lc

humano y anti-PECAM humano a dilución 1 :50, 1 :50 y 1 :20, respectivamente.

Posteriormente las muestras fueron incubadas 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario anti-ratón AlexaFluor-488. Los núcleos fueron contrateñidos con ioduro de propidio y los resultados fueron observados con un microscopio de fluorescencia invertido.

Resultados: las células del nicho limbar humano sano expresan, a nivel proteico, marcadores específicos de melanocitos (MART -1 ), células dendríticas (CD1 1c) y células endoteliales (PECAM), mientras que las células de los cultivos primarios de limbo obtenidos con el medio de la invención no expresan estos marcadores. Estos resultados demuestran, por tanto, que las células del nicho lim boesclerocorneal obtenidas mediante el método de la invención

(células de la invención) presentan unas características fenotípicas diferentes a las de otras células del nicho limbar que no han estado sometidas a estas condiciones específicas de cultivo in vitro.

2.2. Se analizó, mediante RT -PCR a tiempo real, la expresión de ARNm de los

marcadores K3 y K15 en cultivos primarios de limbo obtenidos mediante dos metodologías diferentes, con el fin de valorar las diferencias existentes entre las células obtenidas por ambas metodologías. Una de las metodologías utilizadas es la metodología de la invención. La otra metodología analizada difiere del método de la invención tanto en el área de cultivo de los cultivos

primarios (3,8 cm2) como en el medio de cultivo utilizado para la expansión y cultivo celular. En esta segunda metodología se utilizó el medio comercial CnT20, libre de suero pero con presencia de otros componentes de origen animal no humano.

Métodos: cuando los cultivos primarios alcanzaron confluencia, se realizó la extracción y cuantificación del ARNm celular con los reactivos de "RNeasy Mini Kit" y "Quany-iR RNA Assay", respectivamente. Todas las muestras fueron tratadas con la enzima DNasa, utilizando los reactivos "RNase-Free ONase I Se!". Seguídamente, se sintetizó el ADN complementario (ADNc), a partir de 1

¡lg de ARNm de cada una de las muestras, utilizando los reactivos "SuperScript VILO cDNA Syntetís kit". Fínalmente se real izó la PCR a tiempo real propíamente dícha a partir de 20 ng de ADNc de cada muestra, con el reactivo "Taqman Universal PCR Master Mix" y con los cebadores y las sondas Taqman específicos para los genes de K3 y K15 ("Taqman Target Primer-Taqman

prabe"). Todos los reactivos fueran utilizados siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Todas las muestras fueron analizadas por duplicado y un control negativo fue incluido en cada análisis. Se utilizó como control endógeno de expresión génica el gen que codifica para la enzima gliceraldehído-3-fosfatodeshidrogenasa (GAPDH). El análisis de los datos se realizó siguiendo el método comparativo de valores CI, donde se utilizó como calibrador la expresión del gen K15, a cuya expresión se le asignó el valor de 1. Se analizó

el número de veces que se expresó el gen K3 con respecto al gen K15 en los cultivos primarios de limbo obtenidos con ambas metodologías. Los experimentos fueron realizados en 5 cultivos primarios distintos (n=5) procedentes de al menos 3 donantes diferentes. Los datos fueron analizados

estadísticamente mediante el test de T de Student ('pO,05; "pO,01;

"·pO,00 1).

Resultados: las células limbares expandidas y cultivadas in vítro con ambas metodologías expresaron menos ARNm del marcador propio de epitelio corneal diferenciado K3 que del marcador propio de célula madre K15. Sin embargo,

los cultivos primarios obtenidos con la metodologla de la invención expresaron 305,5 veces menos K3 que K15, mientras que los cultivos primarios obtenidos con la metodología alternativa utilizando el medio de cultivo CnT20 expresaron tan solo 3,9 veces menos K3 que K15 (Fig. 5). La expresión de K3 es significativamente menor cuando los cultivos primarios se obtuvieron con el

método de la invención. De esta forma, queda demostrado que las células limbares cultivadas con el método de la invención presentan un fenotipo más propio de células indiferenciadas que cuando se utiliza otro método de cultivo para este tipo celular. Así mismo, también ha quedado evidenciado que las células del nicho limboesclerocorneal obtenidas mediante el método de la

invención presentan unas características fenotípicas diferentes a las de las células del nicho limbar que no han estado sometidas a estas condiciones específicas de cultivo in vitro.

2.3. Se analizó la expresión proteica, mediante inmunofluorescencia, de

marcadores que se expresan de forma mayoritaria en las células madre del epitelio limbar (K15 y ABCG2) en cultivos primarios de limbo obtenidos por dos metodologías diferentes, para valorar las diferencias existentes entre las células obtenidas mediante ambas metodologías. Una de las metodologías utilizadas fue la metodologia de la invención. La otra metodologia analizada difiere del método de la invención tanto en el área de cultivo de los cultivos primarios (3,8 cm2), como en el medio de cultivo utilizado para el cultivo celular

(medio CnT20).

Métodos: cuando los cultivos primarios de epitelio limbar cultivados con el método de la invención alcanzaron confluencia, las células fueron levantadas incubándolas con Versene. Posteriormente, las células se centrifugaron por

citospin durante 10 min a 800 rpm y baja aceleración, depositándolas en cristales tratados con poli-L-lisina. Por otro lado, cuando los cultivos primarios cultivados con CnT20 sobre 3,8 cm2 alcanzaron confluencia, las células fueron levantadas incubándolas con tripsina 0,25%-1 mM EDTA durante 5 mino Posteriormente, las células fueron sembradas en una multicámara de 8 pocillos

en una densidad de 25.000 células/cm2 e incubadas con medio de cultivo CnT20 durante 18-20 horas. Las células fueron fijadas con metanol frío durante 10 min a -20'C y fueron permeabilizadas con Triton X-100 al 0,3% durante 10 min e incubadas 1 hora con suero de burro al 5%. Posteriormente, las muestras se incubaron toda la noche a 4°C con los anticuerpos primarios de ratón anti

K15 humana y anti-ABCG2 humana a dilución 1 :50 y 1 :20, respectivamente. Seguidamente, se incubaron 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario anti-ratón AlexaFluor-488. Los núcleos fueron contrateñidos con ioduro de propidio y los resultados fueron observados con un microscopio de fluorescencia invertido. En cada muestra se tomaron imágenes a 20X

aumentos de forma aleatoria de cinco campos diferentes y se cuantificó el porcentaje de células positivas para cada marcador. Los experimentos fueron realizados en 4 cultivos primarios distintos (n=4) procedentes de al menos 3 donantes diferentes y los datos fueron analizados estadístícamente con una T

de Student ('p0,05; " p';O,Ol; ···p';O,OOl).

Resultados: en los cultivos primarios de epitelio limbar obtenidos a partir del método de la invención el 56% y 89,7% de las células expresaron los

marcadores K15 Y ABCG2, respectivamente. Sin embargo, solamente el 8,10% y 16,5% de las células de los cultivos primarios obtenidos con el otro método (medio CnT20), expresaron los marcadores K15 y ABCG2, respectivamente. El porcentaje de células que expresaron los marcadores K15 y ABCG2 fue 5 significativamente mayor en los cultivos obtenidos con el método de la invención (Fig. 6). De esta forma, queda demostrado que las células limbares cultivadas con el método de la invención presentan un fenotipo más propio de células ¡ndiferenciadas que cuando se utiliza otro método de cultivo para este tipo celular y que, por tanto, las células del nicho limboesclerocorneal obtenidas

10 mediante el método de la invención presentan unas características fenotípicas diferentes a las de otras células del nicho limbar que no han estado sometidas a estas condiciones específicas de cultivo in vitro.

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1. Medio de cultivo celular que comprende un medio base suplementado

   con:

   5

   a.

   entre 20 y 1 00 g/ml de al menos un compuesto antibacteriano,

   b.

   entre 0,25 y 10 IJg/ml de al menos un compuesto antifúngico,

   c.

   entre 0,25 flg/ml y 10 g/ml de insulina recombinante humana o

   de IGFs,

   lO

   d. entre 0,1 Y 10 ug/ml de un compuesto esteroide,

   e.

   entre 2 y 20 ng/ml de al menos un factor de crecimiento que

   active los receptores de EGF,

   f.

   entre 10,7 y 10,5 M de isoproterenol,

   entre 0,15 Y 0,2 mM de adenina,

   15

   h. entre 10,10 y 10xl0,9 M de al menos una hormona tiroidea, y

   i.

   entre 5 y 20% de suero humano.

2. 2.

   Medio de cultivo celular según la reivindicación 1 donde el suero

   humano es de origen autólogo,

   20

3. 3.

   Uso del medio de cultivo celular según cualquiera de las reivindicaciones

   1

   ó 2 para la proliferación in vilro de células del epitelio del limbo

   esclerocorneal.

   25

   4. Uso del medio de cultivo celular según la reivindicación 3 donde las

   células del epitelio del limbo esclerocorneal son células madre.

   Uso del medio de cultivo celular según cualquiera de las reivindicaciones 3 Ó 4 donde las células del epitelio del limbo esclerocorneal proceden de un humano.
4. 6. Uso del medio de cultivo celular según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 donde las células del epitelio del limbo esclerocorneal son de

   origen autólogo.
5. 7. Método para la proliferación in vitro de células del epitelio del limbo 5 esclerocorneal que comprende:

   a.

   sembrar células del epitelio del limbo esclerocorneal en un sustrato, y

   b.

   cultivar las células del paso (a) en presencia del medio de cultivo celular descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 62.

   lO
6. 8. Método según la reivindicación 7 donde el sustrato del paso (a) es un biomaterial.
7. 9. Método según la reivindicación 7 donde el sustrato del paso (a) es 15 plástico.
8. 10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 donde las células del epitelio del limbo esclerocorneal son células madre.

   20 11 . Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 donde las

   células del epitelio del limbo esclerocorneal proceden de un humano.
9. 12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 donde las células del epitelio del limbo esclerocorneal son de origen autólogo.

10. 13.

    Célula obtenible mediante el método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.

11. 14.

    Población celular que comprende la célula según la reivindicación 13.

12. 15.

    Uso de la célula según la reivindicación 13 o de la población celular según la reivindicación 14 para la elaboración de un medicamento.

13. 16.

    Uso de la célula o de la población celular según la reivindicación 15 donde el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de lesiones

    o enfermedades degenerativas, inflamatorias o genéticas de la superficie 5 ocular.
14. 17. Uso de la célula o de la población celular según la reivindicación 16 donde la superficie ocular es la córnea.

    10 18. Uso de la célula o de la población celular según la reivindicación 17 donde la enfermedad es el Síndrome de Insuficiencia Límbica.
15. 19. Composición farmacéutica que comprende la célula según la reivindicación 13 o la población celular según la reivindicación 14.

16. 20.

    Composición según la reivindicación 19 que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. 21.

    Composición según cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20 que

    20 además comprende otro principio activo.