KR101823205B1 - 약물을 봉입한 이식 치료용 세포 클러스터 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 세포 클러스터는 생체 내로 이식 세포와 약물이 함께 전달됨으로써 봉입된 약물이 정확한 이식 부위에 작용하게 되므로, 이식 세포의 산화적 스트레스를 감소시켜 높은 생존율의 효과를 나타낼 수 있도록 한다.

Description

약물을 봉입한 이식 치료용 세포 클러스터 및 이의 제조방법{Drug-encapsulated cell cluster for transplanting and preparing method thereof}

본 발명은 약물을 봉입한 이식 치료용 세포 클러스터 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

당뇨병은 췌장소도(췌도)에서 분비되는 호르몬인 인슐린이 부족하거나 없을 경우에 발생하는 병으로, 크게 인슐린 의존형인 제1형 당뇨병과 인슐린 비의존형인 제2형 당뇨병으로 나뉠 수 있다.

제1형 당뇨병은 대개 30~40세 이전의 젊거나 어린 연령층에서 갑작스럽게 발생하고, 심한 체중감소, 의식장애 등을 호소하게 된다. 환자들은 대부분 마른 체형을 갖고 있으며, 당뇨병성 급성 합병증의 일종인 당뇨병성 케톤산혈증이 발생되기 쉽다. 또한, 제1형 당뇨병은 췌장에서 인슐린이 거의 만들어지지 않아서 인슐린을 사용하지 않는 경우 생명의 위험을 초래하게 되므로, 반드시 인슐린의 사용과 더불어 식사조절, 적절한 운동으로 치료해야 하므로 삶의 질이 떨어질 수 있다.

제2형 당뇨병은 주로 40세 이후에 많이 발생하고, 췌장의 인슐린 분비능력이 정상보다 감소되어 있거나 인슐린 분비는 정상이지만 비만 등의 이유로 인슐린의 작용이 저하되어 나타난다. 제2형 당뇨병은 임상증상이 뚜렷하지 않은 경우가 많으며, 초기에는 인슐린 분비의 감소에 앞서서 인슐린 저항성의 증가로 인하여 대사 장애가 나타나고, 특수한 경우 이외에는 당뇨병성 케톤산혈증을 일으키지 않는 것이 특징이다. 따라서, 초기에 식사와 운동요법에 의하여 체중을 감량하면 당뇨병이 호전되는 경우가 많다.

제1형 당뇨병은 현재의 치료방법으로는 완치를 기대할 수 없는 만성 질환으로 일단 발생하면 일생 동안 철저한 자가관리가 필요하고, 거의 정상에 가까운 혈당조절만이 당뇨병성 만성 합병증을 예방할 수 있다. 그러나 현재의 치료법인 인슐린 주사요법과 함께 운동요법 및 식이요법으로는 완치가 불가능하고 합병증의 위험이 여전히 존재하는 등 한계가 있다. 또한, 제1형 당뇨병 환자의 일부에서는 반복적인 저혈당 발생과 저혈당 인지능 부족으로 철저한 혈당 조절이 불가능하다. 제2형 당뇨병 역시 최종적으로는 제1형 당뇨병 환자와 같이 인슐린 주사요법을 수행하여야 한다. 따라서 당뇨병 환자에게서 정상에 가까운 혈당을 유지시킬 수 있는 가장 근본적이고 이상적인 치료방법으로는 인슐린의 분비가 생리적으로 조절되는 췌장 혹은 췌도세포 이식이라고 할 수 있다.

따라서, 최근에는 췌장 이식 및 췌도세포 이식을 통한 당뇨병 치료가 많이 시행되고 있다. 췌도세포는 인슐린을 분비하는 세포가 포함되어 있는 세포 클러스터로, 혈중의 포도당 농도에 따라 생물학적으로 자발적인 분비능을 조절할 수 있기 때문에, 이식 후에 인슐린의 주사 없이 당뇨를 치료할 수 있게 된다. 하지만, 이러한 췌도세포 이식의 경우에도 몇 가지 풀어야 할 문제점이 있다. 그 중 하나는 췌장으로부터 췌도세포를 분리하였을 때 췌도세포의 생존율 또는 기능 등 활성에 문제가 생기게 된다는 것이다. 이러한 문제점들을 해결하기 위해서 분리된 췌도세포의 활성을 유지한 상태로 이식 가능한 췌도세포 이식 치료의 연구가 진행되었다.

한국공개특허 제2012-0064896호

본 발명의 목적은 약물을 봉입한 이식 치료용 세포 클러스터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 세포 클러스터를 유효성분으로 포함하는 이식 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 약물 및 생분해성 고분자를 혼합하여 마이크로스피어를 제조하는 단계; 및 상기 마이크로스피어와 이식 세포를 혼합하여 세포 클러스터를 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이식 치료용 세포 클러스터의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 이식 치료용 세포 클러스터로, 약물 및 생분해성 고분자를 혼합하여 얻은 마이크로스피어와 이식 세포를 포함하는 세포 클러스터를 제공한다.

본 발명에 따른 세포 클러스터는 이식 세포와 함께 약물을 생체 내로 전달함으로써 봉입된 약물이 정확한 이식 부위에 국소적으로 오랜 기간 동안 작용하게 되므로, 약물의 전신적인 부작용이 없이, 이식세포의 산화적 스트레스를 감소시켜 높은 생존율을 나타낼 수 있도록 한다.

도 1은 본 발명의 세포 클러스터를 형성하는 과정을 도식화하였다.
도 2는 본 발명의 세포 클러스터를 SEM을 통해 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 X-선 회절과 시차주사 열량측정법(DSC)를 이용하여 분석한 마이크로스피어의 입자 형태를 나타낸 것이다.
도 4는 In vitro에서 마이크로스피어에 봉입된 커큐민이 방출되는 형태를 관찰한 결과이다.
도 5는 MTT array를 통하여 마이크로스피어의 독성을 확인한 결과이다.
도 6은 세포 클러스터를 형광 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 7은 세포 클러스터 내부의 마이크로스피어 입자의 분포를 확인하기 위하여 공초점레이저 현미경을 통해 약물의 분포를 관찰한 결과이다.
도 8은 마이크로스피어와 이식세포의 혼합 비율이 다른 세포 클러스터를 각각 저농도, 고농도의 포도당 용액에 차례로 반응시켜 분비되는 인슐린의 양을 ELISA를 통해 분석한 것이다.
도 9는 도 8의 각 실험군의 SI값을 나타낸 것이다.
도 10은 정상 산소 조건에서 세포 배양한 후, Bax, Bcl-2 및 HO-1의 발현양을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 저산소 조건에서 세포 배양한 후, Bax, Bcl-2 및 HO-1의 발현양을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

본 명세서에서 용어 "췌도세포"는 바람직하게는 조정된 방식으로, 더욱 바람직하게는 글루코스 농도 의존적 방식으로 인슐린, 인슐린 유사체, 인슐린 전구체 또는 인슐린 유사 인자를 분비할 수 있는 세포를 의미한다.

본 명세서에서 용어 "당뇨병"은 췌장 베타 랑게르한스섬 세포가 기능 장애를 일으켜서 글루코스 수준 순환에 대한 반응성이 손실된 질환을 의미한다. 이러한 질환 상태는 선천적 대사 오류, 외상 손상, 화학적 손상, 전염성 질환, 만성 알코올 섭취, 내분비병증, 유전자 질환, 예컨대 다운 증후군으로 인해 초래될 수 있거나, 기타 내분비 췌장에 직접적으로 또는 간접적으로 손상을 초래하는 기타 병인으로 초래될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감(부분적이거나 전체적으로), 검출 가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방 조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병 상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다.

그러나 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

이하, 본 발명의 세포 클러스터에 대해 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 약물 및 생분해성 고분자를 혼합한 마이크로스피어와 이식 세포를 포함하는 세포 클러스터에 관한 것이다.

본 발명에서 약물은 생체 내에서 서방출되는 것이라면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 생체 내에서 항산화제, 면역 억제제, 항염증제, 항혈액응고제, 신생혈관 촉진제, 신화적 스트레스 억제제 등으로 작용될 수 있는 것을 포함한다.

상기 약물은 생분해성 고분자에 의해 생체 내로 전달되어 서방출 된다.

상기 생분해성 고분자는 폴리락트산(PLA), 폴리락타이드, 폴리락틱-코-글리콜산, 폴리락타이드-코-글리콜라이드(PLGA), 폴리포스파진, 폴리이미노카보네이트, 폴리포스포에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 락트산과 카프로락톤의 공중합체, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시발레이트, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리아미노산, 락트산과 아미노산의 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 유도체, 키토산 유도체, 헤파린 유도체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 약물 및 생분해성 고분자는 혼합하여 마이크로스피어를 형성하는 것을 포함한다. 상기 마이크로스피어는 평균 입경이 1 내지 10μm, 예를 들면, 1 내지 4μm, 2 내지 4μm, 2 내지 5μm, 3 내지 5μm일 수 있다. 상기 마이크로스피어의 평균 입경 범위에서 약물이 가장 안정적이면서도 효율적으로 봉입되고 안정적인 세포클러스터를 형성할 수 있다.

본 발명에 따른 세포 클러스터에 포함되는 이식 세포는 췌도세포, 줄기세포(Stem cell), 간세포(Hepatocytes) 및 섬유아세포(Fibroblast)로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 췌도 세포는 인간 또는 돼지에서 유래한 것을 포함한다.

현재 인간으로부터 기증받은 췌장에서 분리한 췌도세포 뿐만 아니라, 돼지로부터 분리한 췌도세포가 췌도세포 이식 치료에 이용되고 있으며, 본 발명의 이식 치료용 세포 클러스터 또한 돼지로부터 분리한 췌도세포를 포함할 수 있다.

췌도세포의 이식은 당업계에서 공지된 적절한 이식 부위(예를 들면, 신장 피막 하 및 간문맥 등)를 선정하고, 이식 부위에 공지된 방식, 예를 들면 복강 절개 없이 초음파 투시 하에서 경피적으로 간문맥을 통해 간 내로 준비한 췌도를 주입하는 방법 등을 통해 수행된다. 이식에 적합한 췌도세포의 조건은 ABO 일치형으로서 췌도(islet) 수가 5,000 IEQ/kg(객체 체중) 이상, 췌도 순도(islet purity)가 30% 이상, 최종 부피가 10ml 이하이며 그램 염색상 음성이고, 엔도톡신 음성인 경우 이식 조건이 된다(Shapiro J et al., International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation, N Engl J Med 355:1318-1330(2006)).

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 세포 클러스터는 췌도세포-결함(islet cell-deficiency) 질병을 치료하기 위한 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 췌도세포-결함 질병은 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 및 당뇨병성 만성 신질환으로 구성된 군에서 선택된 질병이고, 이 외에도 췌도세포의 이식으로 치료가 가능한 질병에 대해서라면, 특별한 제한 없이 췌도세포 이식 치료에 있어서, 본 발명의 세포 클러스터의 적용이 가능하다.

상기 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 및 당뇨병성 만성 신질환은 모두 췌도 세포 이식으로 치료가 가능한 질병이다.

예를 들면, 상기 췌도세포-결함 질병은 제1형 당뇨병이다.

제1형 당뇨병의 경우에는, 인슐린을 분비하는 췌도의 베타세포가 파괴됨으로 인하여 인슐린의 분비기능이 소실되어 발생하고, 췌도세포 이식이 제1형 당뇨병에 대한 좋은 치료 방법이 될 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 세포 클러스터는 간질환을 치료하기 위한 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 간질환은 간경변 또는 간섬유화로 인한 질병이고, 이 외에도 간세포의 이식으로 치료가 가능한 질병에 대해서라면, 특별한 제한 없이 간세포 이식 치료에 있어서 본 발명에 따른 세포 클러스터의 적용이 가능하다.

또한, 본 발명의 일 구현예에 따른 세포 클러스터는 치과 영역에서의 골 재생 또는 장기의 기능 복원, 회복 및 염증반응의 완화를 위한 줄기세포 이식 치료 시 적용될 수 있다.

아울러 본 발명은 본 발명에 따른 세포 클러스터를 유효성분으로 포함하는 이식 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 당뇨병성 만성 신질환 및 간질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 질병에 적용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 약학적 조성물은 세포 이식 시 세포와 함께 객체(subject)에 투여될 수 있고, 세포 이식 후에도 세포 이식 부위에 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 전분, 당, 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 및 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제, 포비돈, 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸 알코올, 헤파린 및 그의 유도체, 폴리에틸렌글리콜 및 그의 유도체, 키토산 및 그의 유도체 및 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

한 양태로서, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액 (Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.

본 발명의 조성물은 국소적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여를 위해 공지의 기술로 적합한 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방, 억제 또는 경감 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다.

본 발명에 따른 세포 클러스터의 이식 양은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여 방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명에 따른 세포 클러스터는 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제와 병용하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명의 세포 클러스터의 제조방법에 대해 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은, 약물 및 생분해성 고분자를 혼합하여 마이크로스피어를 제조하는 단계; 및 상기 마이크로스피어와 이식 세포를 혼합하여 세포 클러스터를 형성하는 단계를 포함하는 세포 클러스터의 제조방법에 관한 것이다.

상기 제조방법에서 마이크로스피어를 제조하는 단계는 약물 및 생분해성 고분자를 유기용매와 혼합하여 혼합 용액을 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 유기용매는 약물과 생분해성 고분자를 혼합하기 위해 사용되는 것으로, 유기용매의 종류로는 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이드, 클로로포름, 아세톤, 다이메틸설폭사이드, 다이메틸포름아마이드, N-메틸피롤리돈, 다이옥산, 테트라하이드로퓨란, 에틸아세테이트, 메틸에틸케톤 및 아세토나이트릴로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 제조방법에서 세포 클러스터를 형성하는 단계는 이식세포와 상기 마이크로스피어를 응집시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 이식세포와 마이크로스피어를 응집시키는 단계는 현적 배양법(hanging drop culture)을 이용하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약물, 생분해성 고분자 및 이식 세포의 종류, 용도 등은 세포 클러스터에서 전술한 바와 같다.

본 발명의 실시예에 따른 세포 클러스터를 형성하는 제조방법을 도식화하여 도 1에 나타내었다. 도 1에서 보는 바와 같이, 개체로부터 분리한 췌도세포와 커큐민이 봉입된 PLGA를 혼합하여 hanging drop 기술을 통해 세포 클러스터를 형성하였다. 상기 세포 클러스터는 생체 내로 이식되었을 때 이식 세포의 산화적 스트레스를 경감시켜 세포의 생존율을 향상시킬 수 있는 효과를 나타낼 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 췌도세포의 분리

Sprague-Dawley(SD) rat으로부터 췌도 세포를 분리하였다. 케타민(Ketamine)과 자일라진(Xylazine)을 이용하여 마취를 하고, 콜라게나제(Collagenase)를 주입하여 췌장을 분리한 후 효소 반응을 통하여 췌도 세포를 분리하였다. 분리한 췌도 세포는 2~3일간 배양한 후 0.25%의 trypsin-EDTA에 10분동안 반응시켜 단일세포로 만들었다.

실시예 2: 약물을 봉입한 마이크로스피어의 제조

약물을 봉입한 마이크로스피어는 전기 분사(electrospraying) 방법을 통해 제조하였다. 5mg의 커큐민(curcumin)과 145mg의 PLGA를 메틸렌클로라이드(methylene chloride)에 녹여 혼합 용액을 만든 후, 혼합 용액을 고성능의 주사기 펌프 안에 담고 노즐을 통하여 분사시켰다. 진공 농축기(Vaccum evaporator)를 이용하여 메틸렌클로라이드를 완전히 제거하여 마이크로스피어를 채취하였다. (이때, 노즐의 사이즈는, 안은 0.55mm이고 밖은 0.80mm이며, 분사되는 기체의 속도는 0.5ml/h 이고, 전압은 15kV이며 분사 노즐로부터 마이크로스피어를 재취하는 바닥까지의 거리는 20cm이다.)

실시예 3: 세포 클러스터의 제조

상기 실시예 1에서 분리한 췌도 단일 세포와 실시예 2에서 제조한 마이크로스피어를 개수 별로 혼합하여 세포 클러스터를 형성하였다. 췌도 단일 세포와 마이크로스피어를 각각 500:100, 500:500 및 500:1,000의 비율로 혼합하여 현적 배양법(hanging drop culture)을 통해 배지 플레이트 뚜껑에 한 방울씩 점적한 후, 뒤집어서 중력에 의해 세포 클러스터가 형성되도록 하였다. 배지 플레이트는 인산완충용액(phosphate buffer saline, PBS)을 담아서 방울이 건조되지 않도록 하였다. 약 7일 동안 배양 한 후 형성된 세포 클러스터를 수거하였다.

실험예 1: 커큐민을 봉입한 마이크로스피어의 성질 분석

1) 마이크로스피어의 외형 분석

커큐민이 봉입된 마이크로스피어의 모양을 SEM(S-4100, Hitachi, Japan)을 통해 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보는 바와 같이, 마이크로스피어의 평균 입자는 3 내지 5μm를 나타내며, encapsulation efficiency는 약 79.59±3.26%을 나타내었다.

2) 고체 상태에서의 마이크로스피어 입자 형태 분석

X-선 회절(X-ray diffraction, XRD)과 시차주사 열량측정법(Differential scanning calorimetry, DSC)을 이용하여 고체 상태에서의 마이크로스피어 입자의 형태를 분석하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보는 바와 같이, 커큐민의 XRD 값은 약 10~30도를 나타내어 커큐민은 결정형을 가지는 약물임을 예측할 수 있다. 결정형을 가지는 약물을 PLGA를 통해 마이크로스피어로 만들게 되면, 무정형 형태를 가지기 때문에 결정을 나타내는 피크를 찾을 수 없으므로, 마이크로스피어에 약물이 잘 봉입되었음을 예측할 수 있다.

3) 마이크로스피어에 봉입된 약물의 방출 형태 분석

In vitro에서 0.5%의 tween 20, 0.1% 글루타치온(gluthione), PBS(pH 7.4) 용액이 첨가된 배지를 사용하여 커큐민이 방출되는 형태를 37일 동안 관찰하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보는 바와 같이, 37일째까지 커큐민의 약 40%가 서서히 방출되는 것을 확인할 수 있으나, 방출된 약물의 농도가 낮을지라도 세포 클러스터 내부에 국소적으로 존재하여 충분히 췌도세포의 산화적 스트레스를 낮출 수 있을 것으로 예측 가능하다.

실험예 2: 마이크로스피어의 독성 확인

INS-1 세포를 배양하여 세포 생존율 측정기법(MTT array)을 통하여 마이크로스피어의 독성을 확인하였다. 1x10⁴ 개의 INS-1 세포를 96 배양 플레이트에 담고 24시간 동안 배양기에서 배양한 후, PLGA-마이크로스피어를 처리하여 48시간 동안 반응하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5의 결과에 따르면, 약물을 봉입하지 않은 마이크로스피어(control)와 커큐민을 봉입한 마이크로스피어를 농도별로 처리하여 독성을 확인한 결과, 모든 그룹에서 90% 이상의 생존율을 유지하는 것을 통해 마이크로스피어는 특별한 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다.

실험예 3: 세포 클러스터의 약물 분포 관찰

상기 실시예 3에서 제조한 세포 클러스터를 형광 현미경을 이용하여 관찰하였다. 세포 내부의 마이크로스피어 입자의 분포를 확인하기 위하여 공초점레이저 현미경을 통해 약물의 분포를 관찰하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6은 커큐민이 가지고 있는 형광 성질을 이용하여 세포 클러스터를 형성 시킨 후의 약물 분포를 관찰한 것이다. 도 6의 결과에 따르면, 약물의 양을 많이 넣을수록 많은 양의 마이크로스피어 입자가 분포하고, 일부는 뭉쳐서 클러스터를 형성하고 있는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 4: 세포 클러스터의 포도당에 대한 반응성 평가

실시예 3에서 제조한 세포 클러스터(췌도세포와 마이크로스피어의 혼합 비율이 각각 500:500과 500:1,000)를 20개씩 취하여 microtube에 취하여 저농도(2.8mM)의 포도당 용액과 고농도(28mM)의 포도당 용액에서 차례대로 각각 2시간 동안 반응하여 분비되는 인슐린의 양을 효소면역분석법(ELISA)을 통해 분석하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었고, 각 실험군의 SI(stimulation index) 값은 도 9에 나타내었다.

도 8 및 도 9에 따른 실험 결과에서, 췌도세포와 마이크로스피어의 혼합 비율이 1:1인 실험군의 경우, 고농도의 포도당 용액에서 인슐린 분비 능력은 대조군에 비해 약 1.9배 증가하였고, 혼합 비율이 1:2인 경우 약 2.7배 증가하였다. 자극지수(stimulation index, SI) 값도 혼합 비율이 1:1인 경우, 약 2배 증가하였고, 혼합 비율이 1:2인 경우 약 1.5배 증가한 것을 확인할 수 있다. 따라서 인슐린 분비 능력은 통계적으로 유의하게 증가한 것을 알 수 있고, SI 값의 경우 유사 혹은 증가 경향을 보이는 것을 확인할 수 있다.

실험예 4: 산소 조건에 따른 세포괴사 관련 인자 및 heme oxygenase의 발현양 측정

세포 클러스터로 이식 시 췌도세포의 기능 및 활성이 증가되는 기전을 확인하기 위해서 웨스턴 블로팅(western blotting)법을 이용해 산소 조건에 따른 각각의 단백질 발현양을 비교하였다. 그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다. 도 10은 정상 산소 조건에서의 단백질 발현양을 나타낸 것이고, 도 11은 저산소 조건에서의 단백질 발현양을 나타낸 것이다.

도 10에서 보는 바와 같이, 정상 산소 조건 및 저산소 조건 모두에서 췌도세포의 혼합비율이 높아질수록 세포 사멸과 관련된 Bax의 발현은 점점 감소하는 것을 확인할 수 있고, 세포 생존 및 산화적 스트레스 완화와 관련된 Bcl-2 및 heme oxygenase의 발현은 점점 증가하는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 췌도세포를 약물과 함께 세포 클러스터 형태로 이식하게 되면 이식된 췌도세포의 산화적 스트레스를 감소시켜 산소 조건에 관계없이 높은 생존율의 효과를 나타낼 수 있을 것으로 예측할 수 있다.

Claims (13)

1. 약물로서 커큐민 및 생분해성 고분자로서 폴리락타이드-코-글리콜라이드(PLGA)를 혼합한 마이크로스피어; 및 이식 세포로서 췌도 세포를 포함하는 세포 클러스터로서, 상기 약물은 생체 내에서 서방출되는 것이며,
   이식 세포와 마이크로스피어의 혼합 비율은 1:1 내지 1:2인 이식 치료용 세포 클러스터.
   
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3. 제1항에 있어서,
   마이크로스피어는 평균 입경이 1 내지 10μm인 이식 치료용 세포 클러스터.
   
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5. 제1항에 있어서,
   췌도세포는 인간 또는 돼지에서 유래한 것을 포함하는 이식 치료용 세포 클러스터.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 세포 클러스터는 췌도세포-결함(islet cell-deficiency) 질병 치료를 위한 것인 이식 치료용 세포 클러스터.
   
7. 제6항에 있어서,
   췌도세포-결함 질병은 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 및 당뇨병성 만성 신질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 질병인 이식 치료용 세포 클러스터.
   
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10. 제1항에 따른 이식 치료용 세포 클러스터를 유효성분으로 포함하는 이식 치료용 약학적 조성물.
    
11. 약물로서 커큐민 및 생분해성 고분자로서 폴리락타이드-코-글리콜라이드(PLGA)를 혼합하여 마이크로스피어를 제조하는 단계; 및
    이식 세포로서 췌도 세포와 상기 마이크로스피어를 1:1 내지 1:2의 비율로 혼합하여 현적 배양법(hanging-drop)으로 세포 클러스터를 형성하는 단계를 포함하는 제1항, 제3항, 제5항, 제6항, 제7항 중 어느 한 항에 따른 이식 치료용 세포 클러스터의 제조방법.
    
12. 제11항에 있어서,
    마이크로스피어를 제조하는 단계는 커큐민과 폴리락타이드-코-글리콜라이드(PLGA)를 유기용매와 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이식 치료용 세포 클러스터의 제조방법.
    
13. 제12항에 있어서,
    유기용매는 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이드, 클로로포름, 아세톤, 다이메틸설폭사이드, 다이메틸포름아마이드, N-메틸피롤리돈, 다이옥산, 테트라하이드로퓨란, 에틸아세테이트, 메틸에틸케톤 및 아세토나이트릴로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 이식 치료용 세포 클러스터의 제조방법.

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