CN110709137A - 大胶囊化的治疗性细胞及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

描述了可以用于制备治疗性细胞植入物的大胶囊和屏障、胶囊化治疗性细胞的方法以及使用所述胶囊化的细胞治疗疾病的方法。

Description

大胶囊化的治疗性细胞及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2017年4月6日提交的美国临时申请62/482,413的优先权，将其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开文本总体上涉及细胞移植和治疗性细胞的胶囊化领域。描述了用于胶囊化治疗性细胞的大胶囊、用于胶囊化治疗性细胞的方法以及用于治疗诸如糖尿病等疾病的相关使用方法。
背景技术
提供以下讨论以帮助读者理解本公开文本，并不承认描述或构成本公开文本的现有技术。
糖尿病与胰岛素
糖尿病(diabetes mellitus，即diabetes)是一种机体产生或响应激素胰岛素的能力受损，从而导致碳水化合物代谢异常以及血液和尿液中葡萄糖水平升高的疾病。所述疾病细分为几种亚型，可替代地描述为1型糖尿病、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、青少年的成年发病型糖尿病(MODY)、成人隐匿性糖尿病(LADA)、脆弱性糖尿病、消瘦型糖尿病、1.5型、2型、3型、肥胖相关糖尿病、妊娠期糖尿病和本领域认可的其他术语。
通常，患有胰岛素依赖型糖尿病的受试者需要给予外源性胰岛素以充分降低血糖。非胰岛素依赖型受试者可以通过药物干预充分降低血糖，所述药物干预包括提高对胰岛素的敏感性或葡萄糖的排泄的药物类别。患有胰岛素依赖型糖尿病的受试者可以受益于细胞替代疗法，在所述疗法中，无论该疾病被标记为1型、MODY、LADA、脆弱性、消瘦型、1.5型、2型、3型、肥胖相关糖尿病还是其任何组合，都将产胰岛素细胞植入所述受试者体内。
I型糖尿病通常在儿童和年轻人中诊断出，并且以前称为幼年型糖尿病。只有5％-10％的患有糖尿病的人患有所述疾病的此种形式。成年发病型糖尿病是所述疾病的最常见形式，并且它的发生是由于产胰岛素β细胞的损伤或破坏、胰岛素抵抗的发展或产胰岛素β细胞的损伤和胰岛素抵抗的发展两者。由于遗传和环境因素的组合，不肥胖的成人和儿童中可能会出现糖尿病。在肥胖的成人和儿童中，胰腺可能会尝试制造额外的胰岛素以便控制血糖，但是随着时间的流逝，胰腺无法保持和维持血糖处于正常水平。机体也可能会对产生的胰岛素不那么敏感。胰岛素分泌β细胞的持续过度活跃可能导致β细胞功能障碍和死亡。
糖尿病的症状变化取决于受试者的血糖波动的多少。一些人(尤其是患有前驱糖尿病或非胰岛素依赖型糖尿病的那些人)最初可能没有出现症状。在I型糖尿病中，症状往往会很快出现并且更加严重。
I型和II型糖尿病的一些病征和症状包括但不限于口渴增加；尿频；极度饥饿；无法解释的体重减轻；尿液中存在酮(酮是在没有足够的可用胰岛素时发生的肌肉和脂肪分解的副产物)；疲劳；易怒；视力模糊；疮疡愈合缓慢；频繁感染，如牙龈或皮肤感染和阴道感染。
胶囊化的细胞
长期以来，生物医学研究的目标是创建一种这样的系统，其用于在半渗透性的屏障内胶囊化细胞，从而能够使外源细胞在有免疫能力的人类宿主中存活(Weir,Diabetologia,56(7):1458-61(2013))。为了实现此目标，所述胶囊化屏障必须允许气体、营养物和废物通过，但是所述屏障还必须对免疫细胞及其效应分子(其将靶向细胞进行免疫破坏)是不可渗透的。所述屏障还必须避免刺激炎症、纤维化或其他宿主对外源材料的防御。
在出版的科学文献中报道的最主要的屏障材料是碳水化合物聚合物海藻酸钠和硫酸纤维素(参见例如，Tuch等人,Diabetes Care,32(10):1887-9(2009)；Basta等人,Diabetes Care,34(11):2406-9(2011)；
Figure BDA0002296625520000021
等人,Pharmaceutics,6(3):447-66(2014))。
海藻酸钠在二价阳离子(如钙或钡)的存在下形成凝胶状基质。海藻酸钠基质经常补充有一层聚L-赖氨酸或聚L-鸟氨酸以降低孔隙率。
硫酸纤维素可以与共聚物聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(pDADMAC)络合以形成膜。海藻酸钠和硫酸纤维素还已经组合地用于形成与海藻酸盐和硫酸钠相互混合的屏障(Wang等人,Transplantation,85(3):331-7(2008)；Weber等人,J.Biotechnol.114(3):315-26(2004))。
细胞存活
有很少报道是关于这些障碍能够使外源细胞在有免疫能力的宿主体内存活和发挥作用持续延长的时间段(即至少六个月；参见Tuch,Basta,
Figure BDA0002296625520000031
Ma(Designing aretrievable and scalable cell encapsulation device for potential treatment oftype 1 diabetes,PNAS|在线发表于2017年12月26日)。胶囊化的细胞通常无法超出有限的时间发挥作用至少部分地归因于穿过屏障的氧气扩散较差，从而导致死亡或细胞功能受损或屏障周围纤维化组织的积累。为了解决此问题，一个小组生产了一种这样形式的海藻酸盐，其通过包含三唑类似物的共价连接的化学基团修饰，他们声称减少了宿主巨噬细胞对海藻酸盐的附着(参见Vegas等人,Nat.Biotechnol.,34(3):345-52(2016))。此小组生产了经修饰的海藻酸盐的微胶囊，其在植入腹膜腔后能够使源自胚胎干细胞的人胰岛素分泌细胞降低糖尿病小鼠体内的血糖长达六个月(参见Vegas等人,Nat.Med.,22(3):306-11(2016))。
可回收性
微胶囊的主要缺点是，如果移植物对患者来说成为安全风险或者如果移植物停止发挥作用并且需要更换，微胶囊无法从宿主中完全回收。本领域通常接受的是，旨在用于人类治疗用途的移植物应该是可回收的，以被认为对于治疗来说是安全且实用的。
实际治疗剂量
一个单独的小组描述了一种这样的装置，其由海藻酸盐组成，所述海藻酸盐粘附在编织的尼龙线表面上以形成长管状结构(参见Ma(Designing a retrievable andscalable cell encapsulation device for potential treatment of type 1diabetes.PNAS|在线发表于2017年12月26日)。据报道，除非部分的海藻酸盐与编织的线脱离，否则此形状在植入腹膜腔后是可回收的。另一个小组报道了一种可回收的用于皮下植入的平面大胶囊化装置(参见D’AMOUR 2015,STEM CELLS TRANSLATIONALMEDICINE 2015；4:1-9)。然而，这些装置由于容纳治疗性细胞的体积有限而受限。使用所描述的装置将治疗剂量递送给人类患者是不切实际的。例如，用于治疗体重60kg的胰岛素依赖型糖尿病患者的细胞的治疗剂量是6亿个细胞(Bruni 2015 Bruni A等人Diabetes Metab SyndrObes.2014年6月23日；7:211-23)。所描述的管状装置将需要60米长以容纳该治疗剂量。60kg的糖尿病患者将需要40个所描述的平面大胶囊化装置以接受治疗剂量。
胰岛素释放动力学
胰腺是一种高度血管化的器官，其实现胰岛素和其他胰腺激素的快速全身分布。胰腺内的每个胰岛都靠近血液微血管。胰腺循环也与肝脏(胰腺激素的主要作用部位)相连。因此，健康的胰腺能够在葡萄糖波动的几分钟内恢复正常的血糖水平。植入腹膜腔的装置与宿主脉管系统缺乏接近度，从而导致胰岛素缓慢释放到循环系统和长期的高血糖(Ma(Designing a retrievable and scalable cell encapsulation device for potentialtreatment of type 1 diabetes.PNAS|在线发表于2017年12月26日)。人体皮肤血管化较差，并且与肝脏也缺乏接近度。因此，预期皮下植入物不能使胰腺激素实现快速全身循环，从而导致高血糖。周期性高血糖是糖尿病发病的主要促成因素。
因此，无论是一般而言，还是专门用于治疗糖尿病，本领域仍然需要能够支持移植细胞的长期存活、可回收并且可以提供分泌的激素的快速分布的胶囊化屏障。本公开文本满足了那些需求。
发明内容
本文描述了可以用于制备治疗性细胞移植物的大胶囊化屏障、胶囊化治疗性细胞的方法以及使用所述胶囊化的细胞治疗疾病的方法。所述大胶囊化的细胞可从宿主中回收，能够以实际体积容纳治疗剂量的细胞，并且能够使分泌的激素快速分布。
在一方面，本公开文本提供了包含围住多个治疗性细胞的大胶囊的组合物，所述大胶囊包含至少一个屏障，所述屏障包含硫酸纤维素和葡甘聚糖或硫酸葡甘聚糖。在另一方面，本公开文本提供了包含围住多个治疗性细胞的大胶囊的组合物，所述大胶囊包含至少一个屏障，所述屏障包含海藻酸钠。
在另一方面，本公开文本提供了包含围住多个治疗性细胞的大胶囊的组合物，所述大胶囊至少包含第一屏障和第二屏障，其中所述第一屏障围在所述第二屏障内，并且其中所述大胶囊具有至少1.5mm的直径。
在另一方面，本公开文本提供了包含围住多个治疗性细胞的大胶囊的组合物，所述大胶囊包含圆柱形的形状和至少1.5mm的直径。
在一些实施方案中，所述治疗性细胞是产胰岛素细胞，如胰岛细胞。
在一些实施方案中，所述第一屏障可以包含硫酸纤维素和葡甘聚糖或硫酸葡甘聚糖，并且在一些实施方案中，所述第一屏障可以包含海藻酸钠。在一些实施方案中，所述海藻酸钠与二价阳离子钡(BaCl2)或钙(CaCl2)聚合。
在一些实施方案中，所述组合物还可以包含第二屏障。例如，在一些实施方案中，所述第二屏障可以包含硫酸纤维素和葡甘聚糖或硫酸葡甘聚糖。在一些实施方案中，所述第二屏障不包含葡甘聚糖或硫酸葡甘聚糖。在一些实施方案中，所述第一屏障和第二屏障均包含硫酸纤维素和葡甘聚糖或硫酸葡甘聚糖。
在一些实施方案中，所述大胶囊的直径是至少约1.5mm、至少约1.6mm、至少约1.7mm、至少约1.8mm、至少约1.9mm、至少约2.0mm、至少约2.1mm、至少约2.2mm、至少约2.3mm、至少约2.4mm或至少约2.5mm。
在一些实施方案中，所述硫酸纤维素与聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(pDADMAC)聚合。例如，在一些实施方案中，与pDADMAC聚合后，将所述大胶囊用聚亚甲基-共-胍(PMCG)洗涤。
在一些实施方案中，所述大胶囊是圆柱形的。
在一些实施方案中，多个圆柱形大胶囊在一端连接。
在另一方面，本公开文本提供了用于形成围住多个治疗性细胞的非粘附性大胶囊的方法，所述方法包括：在包含与pDADMAC聚合的硫酸纤维素的屏障中胶囊化多个治疗性细胞；将所述屏障用PMCG洗涤，其中所述PMCG通过与所述硫酸纤维素的未结合硫酸酯基团结合而包被所述屏障，其中形成非粘附性大胶囊。
在一些实施方案中，所述方法还包括在包含与pDADMAC聚合的硫酸纤维素的第二屏障中胶囊化所述非粘附性大胶囊以及将所述第二屏障用PMCG洗涤，其中所述PMCG通过与所述硫酸纤维素的未结合硫酸酯基团结合而包被所述屏障，并且其中形成双屏障非粘附性大胶囊。
在另一方面，本公开文本提供了治疗有需要的受试者的糖尿病的方法，所述方法包括将包含围住治疗性细胞的大胶囊的组合物植入患有糖尿病的受试者体内，所述大胶囊至少包含第一屏障和第二屏障，其中所述第一屏障围在所述第二屏障内，并且其中所述大胶囊具有至少1.5mm的直径。
在所公开的方法的一些实施方案中，所述受试者是成人，然而在一些实施方案中，所述受试者是儿童。在所公开的方法的一些实施方案中，所述受试者患有I型糖尿病，然而在一些实施方案中，所述受试者患有II型糖尿病。
在一些实施方案中，每个大胶囊是至少约10cm的长度、至少约11cm的长度、或至少12cm的长度、或至少13cm的长度、或至少14cm的长度、或至少15cm的长度、或至少16cm的长度、或至少17cm的长度、或至少18cm的长度、或至少19cm的长度、或至少20cm的长度。
在一些实施方案中，所述大胶囊容纳至少约50,000个细胞/cm、至少约60,000个细胞/cm、至少约70,000个细胞/cm、至少约80,000个细胞/cm、至少约90,000个细胞/cm、至少约1000,000个细胞/cm。
在一些实施方案中，所公开的大胶囊可以首尾连接。
在所公开的方法的一些实施方案中，将所述组合物植入所述受试者的大网膜或腹膜腔中。例如，可以将所述组合物锚定在网膜上或植入网膜囊中。
根据前述方面或实施方案中任一项所述的组合物，其用于治疗有需要的受试者的糖尿病。
根据前述方面或实施方案中任一项所述的组合物在制造用于治疗糖尿病的药物中的用途。
以下具体实施方式是示例性和解释性的，并且旨在提供对本发明的进一步解释。
附图说明
图1A-图1D示出了大胶囊。(A)由硫酸纤维素和魔芋葡甘聚糖组成的球形大胶囊的明视野图像。内囊容纳有多簇治疗性细胞。原始图像放大100倍。(B)植入后3周从正常大鼠体内取出的人抗原染色的大胶囊在40X放大倍数下的免疫荧光。大胶囊的表面没有粘附的宿主细胞，也没有炎症或纤维化的迹象。(C)在24X放大倍数下的未用硫酸魔芋葡甘聚糖形成的大胶囊，但是在其他方面与(B)中示出的大胶囊相同。未用硫酸魔芋葡甘聚糖形成的大胶囊在大胶囊周围具有宿主细胞的过度生长，并且在大胶囊内没有活的人细胞。(D)圆柱形大胶囊的明视野图像。内囊由海藻酸盐水凝胶组成，并且容纳有多簇治疗性细胞。外囊紧紧粘附在内囊上，并且由硫酸纤维素和魔芋葡甘聚糖组成。
图2示出了由内囊和外囊组成的双层大胶囊，所述内囊由海藻酸钠形成，并且所述外囊由硫酸纤维素和硫酸魔芋葡甘聚糖形成。此大胶囊具有非球形的形状。
图3A-图3B示出了大胶囊对20kDa的葡聚糖颗粒的渗透性。将魔芋葡甘聚糖或硫酸魔芋葡甘聚糖掺入硫酸纤维素膜中可以增加膜的渗透性。未用硫酸魔芋葡甘聚糖形成的大胶囊不允许20kDa的荧光纳米颗粒通过进入大胶囊内部(A)。冲洗后，大胶囊的内部无荧光。用硫酸魔芋葡甘聚糖形成的大胶囊允许20kDa的荧光纳米颗粒通过进入大胶囊内部(B)。冲洗后，大胶囊内部有荧光。
图4示出了在糖尿病大鼠体内血糖的调节。在第0天通过注射链脲佐菌素使正常的Sprague-Dawley大鼠患上糖尿病，从而导致血糖浓度快速升高。为了使动物保持健康，在第13天将缓释胰岛素丸植入皮肤下。在第67天，取出胰岛素丸，并且将容纳产胰岛素细胞的大胶囊经手术移植到网膜中。血糖浓度保持受控制。
图5A-图5C示出了来自啮齿动物的大胶囊的外植块。植入糖尿病大鼠体内后三周，取出容纳大胶囊的网膜囊。(A)显示囊血管化良好。(B)和(C)描绘了免疫荧光分析，其显示外植块内的大胶囊容纳有胰岛素表达细胞。(B)和(C)显示大胶囊的表面没有宿主细胞附着或炎症和纤维化的迹象。
图6A-图6C示出了来自啮齿动物的大胶囊的外植块。(A)在植入糖尿病大鼠体内三周后，外植由网膜形成的囊内的球形大胶囊。大胶囊在透明的网膜隔膜内作为球形可见。膜示出了非常接近大胶囊的微血管的致密网络。(B、C)在植入糖尿病大鼠体内三周后，外植圆柱形大胶囊。大胶囊粘附在宿主的网膜上。网膜的脉管系统明显非常接近大胶囊。
图7A-图7C显示大胶囊能够使植入的异种细胞存活。通过用活细胞(绿色)和死细胞(红色)的荧光指示剂染色，评估治疗性人细胞簇的细胞活力。细胞簇在植入前(A)与植入正常的有免疫能力的小鼠体内后9天(B)和47天(C)后同样有活力。
图8A-图8B示出了在植入后六个月，源自网膜的膜在外植的大胶囊周围。(A)膜是薄的、细胞化的并且含有胶原蛋白。原始放大倍数是400倍。(B)植入后六个月，大胶囊容纳有胰岛素表达细胞。
具体实施方式
本文描述了可以用于治疗性细胞移植的大胶囊化组合物、制备胶囊化的治疗性细胞的方法以及诸如治疗有需要的受试者的疾病的相关使用方法。
胶囊化的细胞的存活受到屏障膜的免疫保护和生物分子跨膜扩散特性的影响。植入物的长期功效取决于植入物屏障的物理完整性和植入物的生物相容性、或对宿主的炎症、纤维组织形成和其他外源体反应的低刺激、以及氧扩散、胶囊化的细胞的密度和在宿主体内的移植位置。实际递送治疗剂量的细胞的能力取决于治疗性细胞的负载密度。快速分布分泌的因子的能力取决于在宿主体内的移植位置和与宿主脉管系统形成近端连接的能力。
本公开文本描述了由硫酸纤维素形成的新颖的大胶囊组合物，其使得在将胶囊化的细胞植入有免疫能力的宿主体内后所述细胞能够存活和发挥作用超过六个月。本公开文本还描述了有助于从活宿主中回收胶囊的新颖的大胶囊形状。除了硫酸纤维素之外，所公开的胶囊化屏障还可以包含碳水化合物聚合物魔芋葡甘聚糖或硫酸魔芋葡甘聚糖，它们帮助控制屏障的孔隙率并且限制纤维化。本公开文本还提供了直径大于1.5mm的新颖的大胶囊双屏障膜设计，其允许高密度的治疗性细胞的植入和移植。本公开文本还提供了非球形大胶囊的形成。此外，用于制备所公开的大胶囊的方法可以包括包含聚亚甲基-共-胍(PMCG)的顺序聚合步骤以改善膜的机械特性。使用所公开的材料和技术形成的大胶囊可以通过将胶囊化的细胞植入受试者体内(例如，通过附着在大网膜上或进入由大网膜经手术形成的囊或其他通常用于此类基于细胞的治疗的植入部位)用于治疗有完全免疫能力的受试者的糖尿病。
I.定义
如本文所用，术语“约”将为本领域普通技术人员所理解，并且在某种程度上将根据其使用的上下文而变化。如果考虑到其使用的上下文本领域普通技术人员并不清楚所述术语的使用，则“约”将意指高达特定术语的正负10％。
如本文所用，“大胶囊”是指用于胶囊化治疗性细胞的基于聚合物的组合物。大胶囊的精确尺寸和形状没有特别限制，并且可以由用于制备大胶囊的方法和材料来决定。此外，所公开的大胶囊可以包含胶囊化治疗性细胞的多于一层的聚合物(即，屏障或膜)。
如本文所用，术语“屏障”或“膜”是指由至少一种聚合物组成的一层大胶囊。术语“屏障”和“膜”贯穿本公开文本可以互换使用。
如本文所用，术语“水凝胶”是指由通过与二价阳离子(如钙或钡)离子键合结合在一起的碳水化合物聚合物(如海藻酸盐)的团聚体产生的多孔基质。
如本文所用，当与基于细胞的疗法/植入中使用的外源治疗性细胞的存活和发挥作用相关使用时，“长期”意指至少六个月或更长的时间。
如本文所用，短语“治疗有效量”意指移植到受试者体内的胶囊化的细胞的这样的量，其提供被移植细胞的特定药理作用，即产生胰岛素并且调节血糖。应强调的是，治疗有效量的胶囊化的细胞在治疗给定受试者的糖尿病方面也并不总是有效的，即使此浓度被本领域技术人员认为是治疗有效量。仅为了方便起见，下文提供了示例性的量。
本领域技术人员可以根据治疗特定受试者所需的标准实践来调整此量。治疗有效量可以基于植入部位、受试者的年龄和体重和/或受试者的状况(包括受试者疾病的严重程度、受试者的饮食和/或受试者的总体健康)而变化。
如本文关于糖尿病所用的术语“治疗(treatment或treating)”是指以下中的一种或多种：减轻、改善或消除糖尿病的一种或多种症状或副发病变，如高血糖和低血糖、心脏病、肾脏疾病、肝脏疾病、视网膜病变、神经病变、非愈合性溃疡、牙周病；减轻受试者对外源性胰岛素调节血糖的依赖、在不使用外源性胰岛素的情况下调节受试者的血糖；降低受试者的糖基化血红蛋白的百分比或HbA1C水平；和/或减轻受试者对其他药物干预(如胰岛素增敏剂、葡萄糖排泄增强剂和本领域已知的其他治疗方式)的依赖。
术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文可互换使用，并且是指任何个体哺乳动物受试者，例如牛、犬、猫、马或人。
II.新颖的大胶囊和屏障
本文公开了用于胶囊化治疗性细胞(如胰岛细胞或其他产胰岛素细胞)的新颖的大胶囊和屏障。所公开的屏障包含新颖的材料组合，其相对于常规的胶囊化技术改善了胶囊的结构完整性、相对于常规的胶囊化技术提高了渗透性以增加分子向胶囊化的细胞的被动扩散、减少了纤维化的发生、有助于胶囊的制造；并且所公开的大胶囊具有独特的结构特征，其增加了胶囊化的细胞的存活、减少了纤维化的发生、有助于宿主脉管系对植入物的募集、有助于向宿主的植入和从宿主中的回收以及向大型哺乳动物递送治疗剂量。
胶囊化细胞(如产胰岛素细胞)的常规手段通常包括海藻酸盐胶囊、硫酸纤维素胶囊或水凝胶，其中的每种都在本文简略地讨论。
用于胶囊化产胰岛素细胞的常规的海藻酸盐胶囊是通过在二价阳离子(如钙或钡)的存在下海藻酸钠在产胰岛素细胞周围的聚合反应而形成。这形成了产胰岛素细胞被固定在适当的位置的水凝胶。改善这些水凝胶胶囊的性能的尝试包括：修饰海藻酸盐以减少细胞附着；用合成聚合物(如聚L-赖氨酸或聚L-鸟氨酸)包被胶囊以降低渗透性；调整甘露糖醛酸或古洛糖醛酸单体残基的比率以改善生物相容性；以及在柠檬酸钠中冲洗以液化胶囊的中心。
用于胶囊化产胰岛素细胞的常规的硫酸纤维素胶囊是通过硫酸纤维素和聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(pDADMAC)的聚合反应而形成。这些胶囊与海藻酸盐水凝胶的不同之处在于这些胶囊由围绕空心的柔性膜组成。由于这些胶囊的易压缩性，其比海藻酸盐水凝胶更易碎。这些胶囊的制造具有挑战性，因为新鲜制备的胶囊表面上未反应的pDADMAC与它们可能接触的其他胶囊不可逆地聚合。
常规的海藻酸盐水凝胶和硫酸纤维素胶囊是直径通常为600微米或更小的微胶囊。通常接受的是，较小的胶囊比较大的胶囊更优选，因为表面积体积比更大，从而允许气体和分子更快地扩散。
在将这些常规的微胶囊植入动物宿主体内之后，宿主细胞(包括巨噬细胞和成纤维细胞)粘附在胶囊的表面上。这些细胞将经几周的时间使细胞外基质蛋白沉积，沉积的细胞外基质蛋白构成外源胶囊周围的纤维化斑块。这些纤维组织形成抑制扩散进出胶囊内的细胞，从而导致功能丧失和细胞死亡。
与常规的微胶囊相比，所公开的大胶囊展示的宿主巨噬细胞和成纤维细胞的募集和粘附显著减少，并且因此纤维化斑块的沉积减少。此特性是以下的独特组合的结果：硫酸纤维素/pDADMAC、魔芋葡甘聚糖或硫酸魔芋葡甘聚糖的高生物相容性以及大胶囊的尺寸和形状。因此，这些胶囊内的细胞能够长期或至少六个月存活和发挥作用。
与常规的微胶囊相比，所公开的大胶囊可以附着在大网膜上。附着在大网膜上有助于宿主脉管系统从网膜向大胶囊的募集。与网膜脉管系统的接近能够使分泌的因子快速全身分布。
所公开的大胶囊可以包含至少一个屏障，所述屏障通过在与pDADMAC聚合之前将具有抗炎和抗凝特性的碳水化合物聚合物与硫酸纤维素混合而形成。抗炎抗凝剂的存在减少了宿主细胞的募集和粘附以及纤维组织形成。此方法还增加了屏障膜的渗透性，以允许膜向必需的生物分子扩散。魔芋葡甘聚糖或硫酸魔芋葡甘聚糖是这样一种碳水化合物聚合物的非限制性例子。其他例子是硫酸肝素和硫酸软骨素。
葡甘聚糖(即魔芋葡甘聚糖)是一种从魔芋植物(魔芋(Amorphophallus konjac))的根部收获的中性多糖。硫酸葡甘聚糖可以通过将硫酸酯基团化学加成到葡萄糖单体的游离的羟基上而形成。此方法可以例如通过在合适的溶剂(如二甲基甲酰胺、二甲亚砜或一种离子类溶剂)中在吡啶硫酸盐的存在下进行酯化反应来实现。硫酸葡甘聚糖聚合物与硫酸纤维素具有相似的粘度，并且在低浓度下不会抑制硫酸纤维素/pDADMAC大胶囊的形成。经修饰形式的葡甘聚糖在本领域中是已知的(参见例如，Reddy等人,Asian-AustralasJ.Anim.Sci.,17(2):259-62(2004)；Chen等人,Immunol Invest.,38(7):561-71(2009))，因此，出于本公开文本的目的，“葡甘聚糖”可以指经修饰的或未经修饰的葡甘聚糖。
此外，葡甘聚糖和硫酸葡甘聚糖具有抗凝特性。如本文所示，将葡甘聚糖掺入细胞胶囊化大胶囊中减少了纤维组织形成的沉积。这是葡甘聚糖与大胶囊的硫酸纤维素膜相互混合时减少纤维组织形成的首次证明。此外，葡甘聚糖提供了增加硫酸纤维素/pDADMAC膜的孔隙率的另外的益处，从而允许至少20kDa的分子被动扩散通过大胶囊屏障。
因此，在一些实施方案中，所公开的大胶囊包含至少一个屏障层，所述屏障层包含硫酸纤维素和葡甘聚糖。在一些实施方案中，所公开的大胶囊包含至少两个屏障层，所述屏障层包含硫酸纤维素和葡甘聚糖。
此外，在本领域中认识到，在高密度的细胞周围形成大胶囊很难。在高密度下，细胞和细胞簇穿过膜，从而损害屏障的完整性。优选高密度的细胞以使得能够以小体积移植治疗量的细胞。高密度的细胞是超过200万个细胞/毫升胶囊化聚合物溶液。
例如，常规的硫酸纤维素胶囊具有等于或小于600μm的直径并且由通过pDADMAC聚合的硫酸纤维素的单膜形成(参见例如，Stiegler等人,Transplant Proc.,38(9):3026-30(2006))。随着细胞密度的增加，在聚合步骤过程中细胞将滞留在聚合膜内的可能性也增加。当发生此情况时，对膜造成导致免疫保护屏障失效的缺陷。
常规的胶囊是通过将细胞和液体硫酸纤维素或液体海藻酸盐的混合物滴入聚合浴中而形成。细胞通过液滴均匀地分布。因此，较高的密度增加了细胞将暴露在胶囊表面上的可能性。这里所描述的圆柱形的形状是通过将细胞和液体海藻酸盐的混合物通过浸没的平头注射器针头排入聚合浴中而形成。流经注射器针头的流体的动力学表明，细胞将朝着所形成的圆柱体的中心集中。因此，可以将高密度的细胞胶囊化在此形状内，并且细胞将暴露在胶囊表面的可能性较低。在这些固定的细胞周围形成的第二屏障实际上消除了细胞暴露在胶囊表面的可能性。
所公开的大胶囊包含双屏障结构，并且具有至少约1.5mm的直径。此种设计确保了大胶囊的机械完整性，并且有助于增加大胶囊在体内的长期稳定性。此外，大胶囊的尺寸允许胶囊化高密度的治疗性细胞。
可以将高密度的治疗性细胞胶囊化在直径为1.5mm或更大的大胶囊内。在一些实施方案中，所公开的大胶囊可以由包含海藻酸盐的第一屏障组成。在一些实施方案中，所公开的大胶囊可以由包含与pDADMAC聚合的硫酸纤维素的第一屏障组成。第一屏障可以用聚亚甲基-共-胍(PMCG)来冲洗。随后，可以在第一屏障周围形成包含硫酸纤维素和任选的葡甘聚糖或硫酸葡甘聚糖的第二屏障，并且任选地，随后用PMCG冲洗，从而形成双屏障大胶囊。第一屏障直接围住治疗性细胞，使得可以在不受细胞和/或细胞碎片干扰的情况下形成第二屏障。此外，第二屏障是在植入大胶囊之后直接接触宿主的唯一屏障。
在一些实施方案中，所公开的大胶囊包含至少1个、至少2个或至少3个屏障。构成大胶囊的屏障可以包含相同或不同的材料。例如，所述屏障可以由硫酸纤维素；硫酸纤维素和葡甘聚糖；硫酸纤维素和硫酸葡甘聚糖；海藻酸钠；硫酸纤维素和海藻酸钠；海藻酸钠和硫酸葡甘聚糖；和/或硫酸纤维素、海藻酸钠和硫酸葡甘聚糖形成。在一些实施方案中，仅外部屏障包含葡甘聚糖或硫酸葡甘聚糖，因为仅大胶囊的这一层在植入后将直接与宿主相互作用。可以用于代替葡甘聚糖或硫酸葡甘聚糖的其他聚合物是硫酸肝素和硫酸软骨素。
在一些实施方案中，所公开的大胶囊是至少1.5mm的直径。例如，所公开的大胶囊可以具有约1.5mm、约1.6mm、约1.7mm、约1.8mm、约1.9mm、约2.0mm、约2.1mm、约2.2mm、约2.3mm或约2.4mm的直径。1.5mm和更大的直径导致移植到宿主后纤维组织形成减少。
在一些实施方案中，所公开的大胶囊是至少10cm的长度。例如，所公开的大胶囊可以具有至少约10cm、至少约11cm、至少约12cm、至少约13cm、至少约14cm、至少约15cm、至少约16cm、至少约17cm、至少约18cm、至少约19cm、至少约20cm或更长的长度。具有足够长度的大胶囊使得在需要取出大胶囊的情况下，大胶囊更容易从受试者中回收(即，增加可回收性)。
所公开的大胶囊的尺寸和结构还允许大胶囊围住治疗上有用的数目的细胞。例如，所公开的大胶囊可以容纳至少约50,000个细胞/cm、至少约60,000个细胞/cm、至少约70,000个细胞/cm、至少约80,000个细胞/cm、至少约90,000个细胞/cm或至少约1000,000个细胞/cm或更多。
在需要更多细胞的一些情况下，所公开的大胶囊可以首尾连接或编织在一起。
在一些实施方案中，所公开的大胶囊不是球形的。优选的形状是圆柱形管。圆柱形管具有至少1mm的直径，并且长度不受限制。圆柱形管具有高的表面积体积比，以使得能够充分扩散，同时有利于胶囊从活宿主中的回收。少量的管比大量的球形大胶囊更容易取出。由硫酸纤维素或硫酸纤维素和葡甘聚糖或硫酸葡甘聚糖组成的第二屏障膜提高了圆柱形管的物理完整性，从而改善了可回收性。
球形胶囊是通过将细胞和液体硫酸纤维素或液体海藻酸盐的混合物滴入聚合浴中而形成。细胞通过液滴均匀地分布。因此，较高的密度增加了细胞将暴露在胶囊表面上的可能性。这里所描述的圆柱形的形状是通过将细胞和液体海藻酸盐的混合物通过浸没的平头注射器针头排入聚合浴中而形成。流经注射器针头的流体的动力学表明，细胞将朝着所形成的圆柱体的中心集中。因此，可以将高密度的细胞胶囊化在此形状内，并且细胞将暴露在胶囊表面的可能性较低。在这些固定的细胞周围形成的第二屏障实际上消除了细胞暴露在胶囊表面的可能性。
在一些实施方案中，基底具有矩形条的形状，以使多个管状大胶囊能够在条的并置边或相对边上附着。在一些实施方案中，基底是圆形的，以使从附着中心点放射出的多个管状大胶囊能够附着。在一些实施方案中，基底的形状具有袢扣(tab)，其对于使缝合线通过而将基底附着在宿主组织上来说是有用的。在一些实施方案中，基底具有两个或更多个袢扣，以将基底附着在宿主组织上。
III.用于制备所公开的大胶囊的方法
本文公开了用于更有效地形成用于胶囊化治疗性细胞(如产胰岛素细胞)的大胶囊的方法。
将一定量的治疗性细胞悬浮于硫酸纤维素溶液中，至密度为200万个细胞/毫升。将硫酸纤维素/细胞混合物滴入含有聚合剂pDADMAC的缓冲溶液中。可以使用液滴发生器小心地控制液滴的尺寸，并且由此控制大胶囊的尺寸。此胶囊代表内囊。此方法可以产生球形胶囊。
在一些实施方案中，将治疗性细胞悬浮于海藻酸钠溶液中至密度为200万个细胞/毫升，并且滴入含有二价阳离子(如钙或钡)的缓冲聚合浴中。此方法可以产生球形水凝胶。
在一些实施方案中，将治疗性细胞悬浮于海藻酸钠溶液中至密度为200万个细胞/毫升，并且装载到具有平头针头或内部孔径为1.5mm的医用级管的注射器中。将针头或管的尖端浸没在含有二价阳离子(如钙或钡)的缓冲聚合浴中。将海藻酸盐/治疗性细胞混合物注入聚合浴中以产生呈圆柱形管形式的水凝胶。可以使用注射器泵小心地控制注射速度。
将由硫酸纤维素组成的球形内囊、由海藻酸钠组成的球形内囊或由海藻酸钠组成的圆柱形管浸入pDADMAC溶液中，并且在蒸馏水中简单冲洗。然后将内囊浸入硫酸纤维素和葡甘聚糖的溶液中以形成外囊。
可替代地，将由硫酸纤维素组成的球形内囊、由海藻酸钠组成的球形内水凝胶或由海藻酸钠组成的圆柱形管浸入硫酸纤维素和葡甘聚糖的溶液中。将内囊或管滴入pDADMAC溶液中以形成外囊。
如果在冲洗掉含有pDADMAC的聚合缓冲液后，允许包含与pDADMAC聚合的硫酸纤维素的大胶囊接触，则所述大胶囊具有已知的彼此牢固粘附的趋势。这导致在分离时，大胶囊的聚集体或大胶囊在物理上受到破坏。
如本文所公开，可以通过在每个大胶囊屏障聚合后，加入用聚亚甲基-共-胍(PMCG)的顺序洗涤步骤来最小化或消除此聚集。例如，将硫酸纤维素与pDADMAC聚合后，用PMCG的顺序洗涤消除了大胶囊之间的粘附，从而产生物理上完整的单个大胶囊。PMCG聚合另外地提供了增加大胶囊屏障的破裂强度的益处。
PMCG以前仅在膜形成过程中用作整体聚合物(Wang等人,Transplantation,85(3):331-7(2008))。相比之下，本文所描述的大胶囊设计不将PMCG用作膜的组成部分，而是作为结合并且占据硫酸纤维素的暴露的未结合的硫酸酯基团的包被材料。
因此，在一些实施方案中，制备包含硫酸纤维素的大胶囊的方法包括在与pDADMAC聚合之后用PMCG洗涤大胶囊的步骤。当制备包含多于一个屏障的大胶囊时，所述方法可以在每个后续屏障聚合之后，包括顺序PMCG洗涤步骤。
完全制备好胶囊后，可以冲洗大胶囊并且将其放回细胞培养基中。
通过使大胶囊与一块外科网接触，可以将大胶囊粘附到所述外科网上。添加一定量的硫酸纤维素以覆盖大胶囊和外科网的接触的部分。可替代地，添加一定量的硫酸纤维素和葡甘聚糖以覆盖大胶囊和外科网的接触的部分。添加pDADMAC聚合溶液以将大胶囊和外科网结合在一起。
IV.治疗方法
如上所述，本文所描述的大胶囊可以胶囊化治疗性细胞(例如，胰岛细胞或产胰岛素细胞)，并且因此所公开的大胶囊可用于治疗有需要的受试者的糖尿病的方法中。在一些实施方案中，所述受试者是患有胰岛素依赖型糖尿病的人类受试者。
所述方法通常涉及将治疗有效量的在本文所公开的大胶囊中胶囊化的产胰岛素细胞植入有需要的受试者体内。因此，在一些实施方案中，所述方法包括将治疗有效量的在大胶囊中胶囊化的产胰岛素细胞植入有需要的个体体内，所述大胶囊包含至少两个屏障并且具有至少1.5mm的直径。在一些实施方案中，所述方法包括将治疗有效量的在大胶囊中胶囊化的产胰岛素细胞植入有需要的个体体内，所述大胶囊包含至少一个屏障，其中所述外层屏障由(i)硫酸纤维素和葡甘聚糖或硫酸葡甘聚糖或(ii)海藻酸钠组成。在一些实施方案中，所述方法包括将治疗有效量的在大胶囊中胶囊化的产胰岛素细胞植入有需要的个体体内，所述大胶囊形成为圆柱形管的形状，所述圆柱形管由海藻酸盐的内囊和硫酸纤维素和硫酸葡甘聚糖的外囊组成。
在一些实施方案中，所述方法包括约每年一次、每两年一次、每三年一次、每四年一次、每五年一次或更长时间一次，将治疗有效量的在所公开的大胶囊中胶囊化的产胰岛素细胞植入有需要的个体体内。在一些实施方案中，所植入的细胞将在植入后存活至少六个月。因此，在一些实施方案中，所述受试者可能仅需要一个植入物。在一些实施方案中，可能需要每6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个月或更多个月一次、每1、2、3、4或5年或更多年一次或直到受试者反复出现高血糖或回到糖尿病状态对植入物进行更换。
在一些实施方案中，将胶囊化的细胞植入受试者的大网膜。大网膜(greateromentum，也称为great omentum、omentum majus、gastrocolic omentum、epiploon或caul)是脏层腹膜的大围裙状褶皱，其从胃垂下并且从胃大弯延伸，在到达后腹壁之前先上升到横结肠。因此，可以将胶囊化的细胞植入由网膜经手术形成的囊中。
在一些实施方案中，胶囊化的细胞附着在受试者的网膜上。在一些实施方案中，可以在不由网膜形成囊的情况下将胶囊化的细胞植入网膜。
在一些实施方案中，将胶囊化的细胞植入腹膜腔中。在一些实施方案中，将胶囊化的细胞植入腹膜腔中并且锚定在网膜上。在一些实施方案中，将胶囊化的细胞植入网膜囊中。在一些实施方案中，所述大胶囊是圆柱形管，并且在一些实施方案中，将胶囊化的细胞植入腹膜腔中，并且圆柱形管的一端锚定在网膜上。
胶囊化的细胞的示例性剂量可以根据所治疗个体的尺寸和健康状况而变化。例如，在一些实施方案中，在所公开的大胶囊中胶囊化的细胞的示例性植入物可以包含500万个细胞至1000万个细胞/Kg体重。所公开的大胶囊能够胶囊化治疗有效量的细胞；例如，至少约50,000个细胞/cm、至少约60,000个细胞/cm、至少约70,000个细胞/cm、至少约80,000个细胞/cm、至少约90,000个细胞/cm或至少约1000,000个细胞/cm或更多。
此外，除了胶囊化的治疗性细胞之外，所公开的治疗方法可以另外地包括给予第二治疗剂。例如，在一些实施方案中，所述另外的治疗性化合物可以包括但不限于胰岛素注射剂、二甲双胍、磺酰脲类、美格列脲、噻唑烷二酮类、DPP-4抑制剂、GLP-1受体激动剂和SGLT2抑制剂。
包括植入所公开的大胶囊的特定治疗方案可以根据它们是否将改善给定患者的结果来评估，意味着这将有助于稳定或正常化受试者的血糖水平或减少与糖尿病相关的症状或副发病变的风险或发生，所述症状或副发病变包括但不限于低血糖发作、糖基化血红蛋白水平(HbA1C水平)升高、心脏病、视网膜病变、神经病变、肾脏疾病、肝脏疾病、牙周病和非愈合性溃疡。
因此，出于本公开文本的目的，如果获得一种或多种有益或所需的结果(包括期望的临床结果)，则对受试者进行治疗。例如，有益或所需的临床结果包括但不限于以下中的一种或多种：减少由糖尿病引起的一种或多种症状、提高患有糖尿病的患者的生活质量、减少治疗糖尿病所需的其他药物的剂量、延迟或预防与糖尿病相关的并发症和/或延长个体的存活。
此外，虽然所述方法的受试者通常是患有糖尿病的受试者，但是患者的年龄不受限制。所公开的方法可用于治疗跨越所有年龄段和群组的糖尿病。因此，在一些实施方案中，所述受试者可以是儿科受试者，然而在其他实施方案中，所述受试者可以是成人受试者。
本领域技术人员将容易理解，本公开文本非常适合于实现所述目的并获得所提及的结果和优点、以及其中固有的那些。本领域技术人员将想到其中的修饰和其他用途。这些修饰涵盖在本公开文本的精神之内。给出以下实施例以说明本发明。然而，应该理解，本发明不限于这些实施例的具体条件或细节。
实施例
实施例1-大胶囊化的细胞的形成和测试
纤维素的硫酸酯化：与Zhang等人,Cellulose,17:427-435(2010)使用的方法类似地硫酸酯化纤维素。简而言之，将纤维素悬浮于无水二甲基甲酰胺(DMF)中，并且与DMF/乙酸酐/氯磺酸溶液缓慢混合，并且在50℃下搅拌5小时。然后将混合物倒入无水乙酸钠在乙醇中的饱和溶液中。将沉淀物离心，并且用在乙醇中的4％乙酸钠洗涤。收集沉淀物，并且在室温下将其与1M氢氧化钠的乙醇溶液混合15h。用乙酸/乙醇的50/50混合物将pH调节至8。将沉淀物用乙醇洗涤并且溶解于DI水中。将溶液通过0.45um过滤器过滤，在DI水中透析并且冻干。
葡甘聚糖的硫酸酯化：将葡甘聚糖悬浮于二甲亚砜溶液中。将吡啶硫酸盐逐滴添加到葡甘聚糖溶液中，并且将反应升至60℃持续2小时。将反应冷却至室温，并且用氢氧化钠溶液将pH调节至8。将硫酸葡甘聚糖用乙醇沉淀并且重悬于水中。将溶液用蒸馏水透析48小时，并且通过45um过滤器过滤。
感测葡萄糖的胰岛素表达细胞的分化：将在用geltrex(Life Technology)包被的组织培养皿上的E8培养基(Life Technology)中培养的干细胞系(SR1423)通过暴露于0.5mM EDTA与底物分离，并且转移到悬浮培养皿中的补充有10nM Rho激酶抑制剂(Y-27632，Sigma)的E8培养基中。将培养皿放置在以70-90RPM旋转的轨道振荡器上的37℃和6％CO2的湿润组织培养箱中过夜。将形成的簇从轨道振荡器中取出，收集并且重悬于DMEM中，所述DMEM含有0.2％人血清白蛋白、0.5X N2补充剂(Life Technology)、0.5X B27补充剂(Life Technology)、1X青霉素/链霉素(VWR)、激活素A(100ng/ml)和渥曼青霉素(1nM)。每天更换培养基持续三天或四天。收集簇并且将其重悬于RPMI/F12的50/50溶液中，所述溶液含有0.2％人血清白蛋白、0.5X B27补充剂、0.5X胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂(VWR)、1X青霉素/链霉素(VWR)、视黄酸(2uM)、KGF(50ng/ml)、Noggin(50ng/ml)和环巴胺(250nM)。每天更换培养基持续4天。收集簇并且将其重悬于DMEM(低葡萄糖)中，所述DMEM(低葡萄糖)补充有葡萄糖至8mM、0.5％人血清白蛋白、0.5X胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂、1X N2补充剂、1X青霉素/链霉素、KGF(50ng/ml)、Noggin(50ng/ml)和EGF(50ng/ml)。每隔一天更换培养基持续4天。收集簇并且将其重悬于DMEM(低葡萄糖)中，所述DMEM(低葡萄糖)补充有葡萄糖至8mM、0.5％人血清白蛋白、0.5X胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂、1X N2补充剂、1X青霉素/链霉素、Noggin(50ng/ml)、EGF(50ng/ml)、GSiXXI(1uM)、Alk5i(10uM)和T3(1uM)。每隔一天更换培养基持续4天。收集簇并且将其重悬于DMEM(低葡萄糖)中，所述DMEM(低葡萄糖)补充有葡萄糖至8mM、0.5％人血清白蛋白、0.5X胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂、1X N2补充剂、1X青霉素/链霉素、乙胞素(20ng/ml)、视黄酸(100nM)、Alk5i(10uM)和T3(1uM)。每隔一天更换培养基持续4天。收集簇并且将其重悬于CMRL 1066中，所述CMRL 1066补充有葡萄糖至8mM、0.5％人血清白蛋白、0.5X胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂、1X N2补充剂、1X青霉素/链霉素、1XGlutamax(Life Technology)、烟酰胺(10mM)、BMP4(10ng/ml)、Alk5i(10uM)和T3(1uM)。
细胞胶囊化：将包含1,00,000个或更多个感测葡萄糖的胰岛素表达细胞的细胞群悬浮于在130mM NaCl、10mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)(pH 7.4)中的一定体积的1.8％硫酸纤维素/0.1％葡甘聚糖中，以达到密度为200万个细胞/ml。将硫酸纤维素/葡甘聚糖/细胞混合物转移到由聚乙烯组成的不粘表面上，并且允许滴入1％聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(pDADMAC)、130mM NaCl、10mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)(pH 7.4)的搅拌溶液中。接触后，硫酸纤维素与pDADMAC聚合以在细胞周围形成呈直径大于2mm的球形大胶囊形式的膜。将大胶囊用宽口径移液管收集，并且转移到pDADMAC、130mM NaCl、含有0.3％聚(亚甲基-共-胍)(pMCG)的10mM MOPS(pH 7.4)的溶液中。收集大胶囊并且将其在130mM NaCl、10mM MOPS(pH 7.4)中冲洗两次。收集大胶囊并且将其与pDADMAC的1％溶液混合并且搅拌2分钟。收集大胶囊并且将其在蒸馏水中简单冲洗。然后将大胶囊在1.8％硫酸纤维素/0.1％葡甘聚糖在130mM NaCl、10mM MOPS(pH 7.4)中的溶液中浸没2分钟。收集大胶囊并且将其转移到130mM NaCl、10mM MOPS和0.3％聚(亚甲基-共-胍)(pMCG)(pH 7.4)的溶液中。最后，将大胶囊在130mM NaCl、10mM MOPS(pH 7.4)的溶液中冲洗四次，转移到培养基中，并且在37℃和6％CO2的湿润培养箱中孵育。
此方法形成了由含有胰岛素表达细胞的内膜和与内膜紧密相关的外膜组成的大胶囊(图1A)。用葡甘聚糖形成的膜限制了宿主细胞向表面的积累，从而抑制了纤维化(图1)。
在另一个例子中：将包含1,000,000个或更多个感测葡萄糖的胰岛素表达细胞的细胞群悬浮于在130mM NaCl、10mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)(pH 7.4)中的一定体积的2％海藻酸钠中，以达到密度为200万个细胞/ml。将海藻酸盐/细胞混合物转移到内部孔径为1mm的注射器中并且分配到20mM BaCl、10mM MOPS、100mM甘露醇(pH 7.4)的浴中，以形成呈圆柱形管形式的水凝胶。将管状大胶囊用宽口径移液管收集并且将其在130mM NaCl、10mM MOPS(pH 7.4)中冲洗两次。收集大胶囊并且将其与pDADMAC的1％溶液混合并且搅拌2分钟。收集大胶囊并且将其在蒸馏水中简单冲洗。然后将大胶囊在1.8％硫酸纤维素/0.1％硫酸葡甘聚糖在130mM NaCl、10mM MOPS(pH 7.4)中的溶液中浸没2分钟。最后，将大胶囊在130mM NaCl、10mM MOPS(pH 7.4)的溶液中冲洗四次，转移到培养基中，并且在37℃和6％CO2的湿润培养箱中孵育(图1和图2)。
胶囊的渗透性。通过在确定分子量的FITC-缀合的葡聚糖聚合物的存在下孵育1小时来确定大胶囊的渗透性。1小时后，从大胶囊的外部冲洗葡聚糖溶液。能够跨囊膜被动扩散的FITC-葡聚糖在冲洗和发荧光过程中仍保留在囊内。在没有葡甘聚糖的情况下由硫酸纤维素形成的双层大胶囊对20kDa的葡聚糖是不可渗透的。由硫酸纤维素和葡甘聚糖的混合物形成的双层大胶囊对20kDa的FITC-葡聚糖是可渗透的，但对70kDa的葡聚糖是不可渗透的(图3)。
胰岛素依赖型糖尿病的大鼠模型：使至少8周龄和至少200g体重的有免疫能力的Sprague-Dawley大鼠禁食2-6小时，并且通过静脉注射(I.V.)将60-65mg/kg的链脲佐菌素给予进尾静脉。认为动物患糖尿病，如果它们连续3天展示的非空腹葡萄糖水平>300mg/dl的话。确认高血糖后，通过皮下植入胰岛素缓释丸(Linplant；Linshin，士嘉堡，加拿大)，使葡萄糖水平稳定。通过经由尾刺或侧隐静脉收集一滴血来监测葡萄糖，并且将其施加到便携式血糖仪中。
胶囊/细胞向大鼠的移植。在上腹部制造腹中线皮肤切口。使腹壁成帐篷形并且在腹直肌中线一下子切开。进入腹部，并且将网膜分离并外露。将球形大胶囊放置于两薄片明胶海绵之间，并且放置于网膜的中央。将网膜的分离部分的角在移植物上折叠以形成囊，然后将其用缝合线缝合。将网膜囊放回腹腔中，并且缝合腹部切口，然后使用手术吻合钉缝合皮肤。
非球形管状胶囊向大鼠腹膜的移植。穿过真皮和腹壁制造腹部切口。将管状大胶囊引入宽口径移液管中。将移液管引入腹膜腔中，并且缓慢排出大胶囊。用缝合线缝合腹壁和真皮。
锚定的非球形管状胶囊向大鼠网膜的移植。穿过真皮和腹壁制造腹部切口。使网膜的一部分外露。将附着在大胶囊上的外科网块放在网膜上。缝合线将网连接到网膜上。将管状大胶囊和网膜的外露部分引入回腹膜中。用缝合线缝合腹壁和真皮。
血糖的调节：网膜植入容纳有胰岛素表达细胞的大胶囊后，通过链脲佐菌素处理而患糖尿病的有免疫能力的大鼠恢复正常血糖(图4)。
大胶囊的外植：通过用氯胺酮镇静，然后心内注射氯化钾对大鼠实施安乐死。切下容纳有大胶囊的网膜囊。可替代地，用剪刀切开圆柱形大胶囊到网膜上的附着，并且取出大胶囊。拍摄了外植块的形态和血管形成的证据(图6)。将外植块在PBS中冲洗，并且使用活/死细胞染色试剂盒(Biovision)并且按照制造商的说明对活细胞和死细胞染色(图7)。将外植的大胶囊保存在4％福尔马林中。将大胶囊包埋在最佳切割温度(OCT)复合物中，冷冻并且用冷冻切片机切成10um的厚度。将切片施加到显微镜载玻片上，并且针对胰岛素和胶原蛋白1的表达使用标准免疫组织化学技术染色。大胶囊仅展现粘附在大胶囊表面上的薄膜(图8A)。大胶囊容纳有可见的胰岛素表达细胞簇(图8B；还参见图5)。
实施例2-用所公开的胶囊化的细胞治疗糖尿病
此实施例说明了使用如本文所描述的大胶囊化的细胞治疗成人的I型糖尿病的方法。
患有胰岛素依赖型糖尿病的成人受试者接受包含治疗有效量的组合物的移植物进入受试者的网膜囊中、锚定在网膜上或进入腹膜腔中，所述组合物包含所公开的大胶囊化的胰岛细胞。评估受试者的血糖水平。在植入治疗有效数目的大胶囊化的细胞之后，对受试者进行监测，以确保受试者的血糖水平已经稳定。随着时间的推移，进一步筛选受试者的糖基化血红蛋白以及糖尿病的副发病变。
*****

Claims (49)

1.一种组合物，其包含围住多个治疗性细胞的大胶囊，所述大胶囊包含至少一个屏障，所述屏障包含：
(a)硫酸纤维素和葡甘聚糖或硫酸葡甘聚糖；或
(b)海藻酸钠。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述治疗性细胞是产胰岛素细胞。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其还包含第二屏障。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述第二屏障包含硫酸纤维素和葡甘聚糖或硫酸葡甘聚糖。
5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述第二屏障不包含葡甘聚糖或硫酸葡甘聚糖。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述大胶囊的直径是至少1.5mm。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述大胶囊的直径是至少2.0mm。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述海藻酸钠与二价阳离子钡(BaCl2)或钙(CaCl2)聚合。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述硫酸纤维素与聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(pDADMAC)聚合。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中与pDADMAC聚合后，将所述大胶囊用聚亚甲基-共-胍(PMCG)洗涤。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述大胶囊是至少约11cm的长度。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述大胶囊容纳至少约50,000个细胞/cm。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述大胶囊是圆柱形的。
14.一种组合物，其包含围住多个治疗性细胞的大胶囊，所述大胶囊至少包含第一屏障和第二屏障，其中所述第一屏障围在所述第二屏障内，并且其中所述大胶囊具有至少1.5mm的直径。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述大胶囊的直径是至少2.0mm。
16.根据权利要求14或权利要求15所述的组合物，其中所述治疗性细胞是产胰岛素细胞。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的组合物，其中所述第二屏障包含硫酸纤维素和葡甘聚糖或硫酸葡甘聚糖。
18.根据权利要求14-17中任一项所述的组合物，其中所述第一屏障和第二屏障均包含硫酸纤维素和硫酸葡甘聚糖。
19.根据权利要求17-18中任一项所述的组合物，其中所述硫酸纤维素与pDADMAC聚合。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中与pDADMAC聚合后，将所述大胶囊用PMCG洗涤。
21.根据权利要求14-16中任一项所述的组合物，其中所述第二屏障不包含葡甘聚糖或硫酸葡甘聚糖。
22.根据权利要求14-17中任一项所述的组合物，其中所述第一屏障包含海藻酸钠。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述海藻酸钠与二价阳离子钡(BaCl2)或钙(CaCl2)聚合。
24.根据权利要求14-23中任一项所述的组合物，其中所述大胶囊是至少约11cm的长度。
25.根据权利要求14-24中任一项所述的组合物，其中所述大胶囊容纳至少约50,000个细胞/cm。
26.根据权利要求14-25中任一项所述的组合物，其中所述大胶囊是圆柱形的。
27.一种组合物，其包含围住多个治疗性细胞的大胶囊，所述大胶囊包含圆柱形的形状和至少1.5mm的直径。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述大胶囊至少包含第一屏障和第二屏障，其中所述第一屏障围在所述第二屏障内。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述第一屏障包含：
(a)硫酸纤维素和葡甘聚糖或硫酸葡甘聚糖；或
(b)海藻酸钠。
30.根据权利要求28或权利要求29所述的组合物，其中所述第二屏障包含硫酸纤维素和葡甘聚糖或硫酸葡甘聚糖。
31.根据权利要求27-30中任一项所述的组合物，其中所述治疗性细胞是产胰岛素细胞。
32.根据权利要求27-31中任一项所述的组合物，其中所述大胶囊是至少约11cm的长度。
33.根据权利要求27-32中任一项所述的组合物，其中所述大胶囊容纳至少约50,000个细胞/cm。
34.一种用于形成围住多个治疗性细胞的非粘附性大胶囊的方法，其包括：
a.在包含与pDADMAC聚合的硫酸纤维素的屏障中胶囊化多个治疗性细胞；
b.将所述屏障用PMCG洗涤，其中所述PMCG通过与所述硫酸纤维素的未结合硫酸酯基团结合而包被所述屏障，
其中形成非粘附性大胶囊。
35.根据权利要求34所述的方法，其还包括在包含与pDADMAC聚合的硫酸纤维素的第二屏障中胶囊化所述非粘附性大胶囊以及将所述第二屏障用PMCG洗涤，其中所述PMCG通过与所述硫酸纤维素的未结合硫酸酯基团结合而包被所述屏障，并且其中形成双屏障非粘附性大胶囊。
36.一种治疗有需要的受试者的糖尿病的方法，其包括将包含围住治疗性细胞的大胶囊的组合物植入患有糖尿病的受试者体内，所述大胶囊至少包含第一屏障和第二屏障，其中所述第一屏障围在所述第二屏障内，并且其中所述大胶囊具有至少1.5mm的直径。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述受试者是成人。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述受试者是儿童。
39.根据权利要求36-38中任一项所述的方法，其中所述受试者患有I型糖尿病。
40.根据权利要求36-38中任一项所述的方法，其中所述受试者患有II型糖尿病。
41.根据权利要求36中任一项所述的方法，其中所述治疗性细胞是产胰岛素细胞。
42.根据权利要求36-41中任一项所述的方法，其中所述第二屏障包含硫酸纤维素和葡甘聚糖或硫酸葡甘聚糖。
43.根据权利要求36-42中任一项所述的方法，其中所述第一屏障和第二屏障均包含硫酸纤维素和葡甘聚糖或硫酸葡甘聚糖。
44.根据权利要求36-41中任一项所述的方法，其中所述第二屏障不包含葡甘聚糖或硫酸葡甘聚糖。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述组合物还包含葡甘聚糖凝胶。
46.根据权利要求36-41中任一项所述的方法，其中所述第一屏障包含海藻酸钠。
47.根据权利要求36-45中任一项所述的方法，其中将所述组合物植入所述受试者的网膜或腹膜腔中。
48.根据权利要求1-31中任一项所述的组合物，其用于治疗有需要的受试者的糖尿病。
49.根据权利要求1-31中任一项所述的组合物在制造用于治疗糖尿病的药物中的用途。
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