KR101373518B1 - 췌도 캡슐 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 당뇨병 치료를 하기 위한 이식용 췌도 세포 캡슐에 관한 것으로, 보다 구체적으로 캡슐의 크기가 작은 췌도 세포 캡슐의 제조 방법, 이에 의하여 제조된 췌도 세포 캡슐 및 상기 캡슐을 포함하는 당뇨병 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 췌도 세포 캡슐은 이식 부피를 최소화하고 대사 물질의 용이한 통과 및 면역 세포의 투과를 방지하여 생체 내 이식 시 면역 거부 반응 없이 당뇨병을 효과적으로 치료할 수 있을 것이다.

Description

췌도 캡슐 및 이의 제조 방법 {Capsulated pancreatic islet and process for preparing the same}

본 발명은 당뇨병 치료를 하기 위한 이식용 췌도 세포 캡슐에 관한 것으로, 보다 구체적으로 캡슐의 크기가 작은 췌도 세포 캡슐의 제조 방법, 이에 의하여 제조된 췌도 세포 캡슐 및 상기 캡슐을 포함하는 당뇨병 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 췌도 세포 캡슐은 이식 부피를 최소화하고 대사 물질의 용이한 통과 및 면역 세포의 투과를 방지하여 생체 내 이식 시 면역 거부 반응 없이 당뇨병을 효과적으로 치료할 수 있을 것이다.

당뇨병은 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않는 등의 대사질환의 일종으로, 혈중 포도당의 농도가 높아지는 고혈당을 특징으로 하며, 고혈당으로 인하여 여러 증상 및 징후를 일으키고 소변에서 포도당을 배출하게 되는 질병이다. 당뇨병은 제1형과 제2형으로 구분되는데, 제1형 당뇨병 (인슐린-의존성 당뇨병)은 '소아당뇨'라고도 불리며, 인슐린을 전혀 생산하지 못하는 것이 원인이 되어 발생하는 질환이다. 인슐린이 상대적으로 부족한 제2형 당뇨병 (인슐린-비의존성 당뇨병)은 인슐린 저항성(insulin resistance; 혈당을 낮추는 인슐린 기능이 떨어져 세포가 포도당을 효과적으로 연소하지 못하는 것) 또는 인슐린 분비 장애를 특징으로 한다.

이 중 제1형 당뇨병은 가장 흔한 내분비성 질환 중에 하나이고, 절대적인 인슐린 부족을 특징으로 한다. 이를 치료하기 위한 방법의 하나로 널리 이용되는 인슐린 주사 요법은 생명의 질을 향상시키지만, 눈, 신장, 심혈관 시스템, 저혈당증 혼수와 같은 만성적인 합병증을 완전히 피할 수 없는 단점이 있다. 따라서, 이와 같은 통상적인 인슐린 주사 요법 이외의 다른 대사 조절을 향상시키는 유일한 대체 요법은 인슐린-생산 세포인 췌도(pancreatic islet, 또는 "랑게르한스 섬"이라고도 함) 또는 췌장의 이식이다. 그러나, 상기와 같은 췌장 또는 췌도 이식의 경우 공여자의 절대 부족 및 이식 거부를 억제하기 위한 면역억제제의 지속적인 투여 필요성이라는 커다란 문제점이 있다.

캡슐화 전략은 면역 억제 및 장기 부족에 연관된 상기 두 가지 문제에 대한 해결책으로 제시되고 있다. 이러한 기술은 외래 세포가 인공 막에 의해 항체 및 세포독성 세포를 포함하는 숙주의 면역시스템으로부터 보호된다는 법칙에 기반을 두고 있다. 캡슐화에 의한 면역보호는 면역억제제 없이, 동종이식 또는 이종이식을 가능하게 할 수 있으며, 돼지와 같은 동물을 장기의 공여자로서 사용할 수 있다는 가능성을 제공한다. 알지네이트-기반 캡슐에서 세포의 마이크로캡슐화는 가장 흔히 적용되는 면역 분리 절차이다 (Lim, F. and A.M. Sun, Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas. Science, 1980. 210(4472): p. 908-10). 마이크로캡슐화의 단순성 및 이식에서 면역억제제에 대한 대안의 긴급한 필요성에도 불구하고, 이 분야에서의 발전은 이와 같은 높은 기대를 충족시키지 못하고 있었다. 감소된 대사 물질, 큰 캡슐의 두꺼운 막 (일반적으로 >700 ㎛)과 관련된 산소의 운반 및 이식에 사용되는 마이크로캡슐화된 췌도의 전체 부피와 같은 문제점 때문에 발전이 어려웠다. 따라서, 이식 부피는 최소화하고 대사 산물의 이동을 최대화할 수 있는 췌도의 캡슐화 전략을 개발하고자 하는 필요성이 대두되고 있는 실정이다.

이와 같은 배경하에 본 발명자들은 이식 부피의 최소화 및 대사 산물의 이동을 최대화할 수 있는 캡슐화를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 새로운 개념의 디자인 및 응용을 개발하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명자들은 공기-구동 캡슐화장치(air-driven encapsulator)를 이용하여 등각의 마이크로캡슐(conformal microcapsule, 작은 캡슐)을 형성하였고, 생존능 및 글루코스에 반응하는 인슐린 분비 기능을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 (a) 췌도 공급원으로부터 췌도 세포를 분리하는 단계; (b) 상기 분리한 췌도 세포를 생체적합성 고분자 용액으로 분산시키는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 생체적합성 고분자 용액에 분산된 췌도 세포를 원심분리하여 공기방울을 제거하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계의 원심분리된 생체적합성 고분자 용액에 분산된 췌도 세포를 공기-구동 캡슐화 장치로 캡슐화하는 단계를 포함하는, 췌도 세포 캡슐의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 방법에 의해 제조된 췌도 세포 캡슐을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 췌도 세포 캡슐을 포함하는 당뇨병 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 당뇨병이 걸린 개체 또는 당뇨병에 걸릴 위험이 있는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 췌도 공급원으로부터 췌도 세포를 분리하는 단계; (b) 상기 분리한 췌도 세포를 생체적합성 고분자 용액으로 분산시키는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 생체적합성 고분자 용액에 분산된 췌도 세포를 원심분리하여 공기방울을 제거하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계의 원심분리된 생체적합성 고분자 용액에 분산된 췌도 세포를 공기-구동 캡슐화 장치로 캡슐화하는 단계를 포함하는, 췌도 세포 캡슐의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 "췌도"란 랑게르한스섬(Langerhans islets)을 의미하며, 췌도 이식은 제1형 당뇨병의 개선을 위한 실용적인 치료법이다. 이는 췌도가 인슐린을 분비하는 베타 세포를 포함하고 있기 때문에 췌도의 이식을 통해 인슐린 의존형인 제1형 당뇨병을 치료할 수 있기 때문이다. 본 발명에서는 NPCC(neonatal pancreatic cell cluster)를 이용하여 췌도 세포를 분리하였다.

본 발명에서 용어 "췌도 세포 캡슐"이란 췌도 세포를 생체적합성 고분자로 둘러싸서 캡슐의 형태를 형성하는 것을 의미한다. 이와 같은 췌도 세포 캡슐은 면역세포의 투과를 방지하여 이종 개체로부터 분리된 췌도 또는 동종 개체로부터 분리된 췌도에 의해 일어나는 면역 거부 반응을 억제할 수 있도록 한다.

상기 췌도 세포 캡슐의 제조방법은 바람직하게 (e) 캡슐화된 췌도 세포를 경화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이와 같은 경화는 췌도 세포 주위를 둘러싼 캡슐인 생체적합성 고분자를 더욱 단단하게 결합시키는 과정으로 교차결합(cross-linking)에 의해 경화시킬 수 있다. 경화시킬 수 있는 물질은 자유롭게 이용할 수 있으나, 그 예로 2가 양이온(Ca^{2 +}, Ba^{2 +})이 생체적합성 고분자와 강하게 결합하여 고형화시킬 수 있으며, Poly-L-lysin, 키토산, 알루미늄 3가 이온 (Al^{3 +}) 등 2가 이상의 양전하를 가지거나 1가 이상의 양전하를 가진 물질이 polymer 형태로 이루어진 경우 제한 없이 사용가능하다. 바람직하게는 Ca^{2 +}이다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 본 발명자들은 공기-구동 캡슐화 장치를 통과한 알지네이트 방울을 CaCl₂ 용액으로 경화시켰다.

상기 (a) 췌도 공급원으로부터 췌도 세포를 분리하는 단계에 있어서, 췌도 공급원은 인간에게 이식할 수 있는 췌도를 가지고 있는 포유 동물은 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 돼지, 소, 원숭이, 인간일 수 있으며, 바람직하게는 돼지이다. 돼지는 해부학적 및 생리학적으로 사람과 매우 유사한 구조로 장기가 사람과 유사한 크기이고, 사육이 쉽고 임신기간 (112일)이 짧으면서도 한꺼번에 많은 수의 새끼 (6~12마리)를 낳을 수 있는 장점이 있어서 췌도 공급원으로 바람직하게 사용될 수 있다. 또한, 돼지는 인슐린 대사능력이 사람과 유사하고, 식용으로 널리 이용되고 있어 거부감이 적으며, 비교적 다루기가 쉽고, 많은 양의 췌도 세포를 가지고 있기 때문에 췌도 공급원으로 바람직하게 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 돼지의 NPCC를 분리하여 사용한다. 돼지의 NPCC를 작은 조각으로 절단하여 콜라게나제 V로 분해한 후, Hams-F10 배지에서 배양하여 분리한다.

상기 (b) 분리한 췌도 세포를 생체적합성 고분자 용액으로 분산시키는 단계에 있어서, 생체적합성 고분자는 캡슐을 형성할 수 있는 고분자는 제한 없이 사용할 수 있으나, 그 예로 알지네이트(alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 황산콘드로이친(chondroitin sulfate), 덱스트란(dextran), 덱스트란 설파이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 헤파린 설파이텀(heparin sulfatem), 헤파란 설파이트(heparan sulfate), 키토산(chitosan), 젤란검(gellan gum), 잔탄검(xanthan gum), 구아검(guar gum), 수용성 셀룰로오스 유도체(cellulose derivatives) 또는 카라기난(carrageenan)일 수 있으며, 바람직하게는 알지네이트이며, 더욱 바람직하게는 알긴산 나트륨 용액일 수 있다.

상기 고분자 용액은 바람직하게는 0.1 내지 50%의 농도인 알지네이트 용액일 수 있으며, 더 바람직하게는 2%일 수 있다.

췌도 세포는 생체적합성 고분자 용액에서 균일하게 분산시키는 것이 중요하다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 고분자 용액으로 췌도 세포를 분산시키는 단계는 배양된 NPCC를 2% 농도의 알긴산 나트륨 용액으로 균일하게 분산되도록 피펫팅하여 수행한다.

상기 (c) 생체적합성 고분자 용액에 분산된 췌도 세포를 원심분리하여 공기방울을 제거하는 단계에 있어서, 공기 방울을 제대로 제거하지 않으며 남아 있는 공기 방울이 캡슐화 장치의 노즐 끝에 췌도 세포의 결집화를 유도하고, 노즐을 통한 생체적합성 고분자 용액의 흐름을 방해하기 때문에 용액 내 공기 방울의 제거는 본 발명의 균일한 캡슐화 형성에 매우 중요하다. 이와 같은 원심분리 단계는 본 발명자들이 새롭게 고안한 단계이다.

상기 (d) 원심분리된 생체적합성 고분자 용액에 분산된 췌도 세포를 공기-구동 캡슐화 장치로 캡슐화하는 단계에 있어서, 공기-구동 캡슐화 장치는 장치의 노즐을 통과하는 췌도가 분산된 고분자 용액에 공기를 분사하여 수백 ㎛의 작은 크기의 캡슐을 형성할 수 있는 장치이다. 이와 같은 공기-구동 캡슐화 장치는 공지 또는 상용의 다양한 장치를 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 J30 encapsulator를 사용할 수 있다.

이와 같이 제조된 췌도 세포 캡슐은 직경이 10 ㎛ 내지 1000 ㎛, 바람직하게는 10 ㎛ 내지 200 ㎛일 수 있으며, 더 바람직하게는 100 ㎛ 내지 200 ㎛, 가장 바람직하게는 200 ㎛일 수 있다. 이와 같이 작은 캡슐의 형성은 공기-구동 캡슐화장치를 통해 초박화된 피막을 덧씌우는 방식으로 피막의 두께가 매우 얇아지게 형성할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 제조된 췌도 세포 캡슐은 직경이 200 ㎛ 이하로 작은 부피를 차지하며, 등각의 캡슐로 췌도 세포의 노출이 없는 것을 특징으로 한다.

캡슐화된 췌도 세포와 이식된 생체 내의 혈관 간의 큰 거리는 췌도 세포의 생체 내 이식의 실패 원인 중 하나일 수 있다. 재혈관화는 캡슐화된 췌도 세포에서 일어날 수 없기 때문에 췌도 세포로의 영양분 및 산소의 공급은 혈액으로부터 이식된 췌도 세포로의 직접적인 전달 대신에 오직 수동적 확산에 의해서 매개된다. 따라서, 상당히 큰 확산 거리는 산소의 제한된 공급에 의해서 저산소증을 유발한다. 이와 같은 저산소증은 이식시에 췌도 세포의 파괴 등 기능 장애 및 괴사를 유발할 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법으로 제조된 췌도 세포 캡슐은 직경이 200 ㎛ 이하로 작은 부피를 차지하여 산소의 공급이 원활하여 생존능이 증가하게 되며, 이는 본 발명의 일 실시예에서 배양 28일 째에 생존능이 큰 캡슐 내의 생존능보다 44.6%가 높은 것으로 확인하였다 (도 2).

본 발명의 방법으로 제조된 췌도 세포 캡슐은 불필요한 공간을 최소화하여 전체 이식 부피를 최소화할 수 있다. 캡슐의 직경이 최초 췌도 세포보다 3배 커지면 췌도 현탁액의 부피가 27배로 증가하며, 이와 같은 넓은 이식 부위를 찾기는 힘들어진다. 그러나, 기존에 보고된 작은 캡슐의 경우 불완전한 캡슐화에 기인한 불규칙한 표면이 관찰되었고, 캡슐 주위의 과잉 성장 및 이식 실패를 유발하였다. 즉, 캡슐의 제조에 있어서 돌출이 없는 작은 캡슐의 제작은 중요하며, 이와 같은 캡슐의 제조는 본 발명자들에 의해 최초로 개발되었다. 정전기적 캡슐화 또는 2개상 액상 유화(two phase aqueous emulsification) 과정과 같은 기존의 방법과 달리 본 발명의 공기-구동 캡슐화 장치를 사용한 방법은 작고 완전한 캡슐을 성공적으로 제작할 수 있다.

구체적인 일 실시예에 따르면, 본 발명자들은 생후 1-3일된 돼지의 NPCC(neonatal pancreatic cell cluster)를 잘게 절단하여 분리 배양한 후, 2% 알긴산 나트륨으로 재현탁하여, 용액 내에 균일하게 분산되도록 하였고, 공기방울을 원심분리에 의해 제거하였다. 현탁액을 속도가 135 ㎖/hr인 실린지 펌프로 이동시킨 후, 공기-구동 캡슐화 장치인 J30 encapsulator로 100 내지 200 ㎛ 직경의 캡슐화된 NPCC를 형성하고, CaCl₂로 교차결합하여 경화시켰다. 이와 같이 제조된 작은 캡슐은 NPCC의 어떠한 돌출도 나타내지 않는 것을 확인하였으며 (도 1B), 알지네이트로 구조적 지지를 제공받아서, 천연 NPCC가 물리적 스트레스에 의해 깨지고 시험관 내 배양 동안 붕괴되는 것 (도 1A)과 달리 안정한 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 물리적 자극에 의한 스트레스는 생체 내에서 이식 후에도 일어날 수 있기 때문에, 췌도 세포의 알지네이트로 인한 캡슐화는 이식된 췌도 세포의 생존 향상을 높일 수 있다는 것을 뒷받침한다. 또한, 본 발명자들은 본 발명의 작은 췌도 캡슐과 기존의 방법으로 제조된 큰 캡슐, 캡슐화되지 않은 천연 NPCC의 생존능을 메틸렌 블루 염색으로 분석한 결과, 큰 캡슐의 NPCC는 7일째에서 천연 NPCC 및 작은 캡슐의 NPCC (각각 86.83±2.32%, 87.67±2.07%) 보다 현저하게 낮은 생존능 (79.50±2.88%) 을 나타내었으며, 천연 NPCC의 생존능은 14일째에 급격히 감소하였으나, 작은 캡슐 내의 NPCC는 그들의 생존능을 유지하는 것을 확인하였으며 (82.0±2.19%), 더욱이 28일 째에는 큰 캡슐보다 작은 캡슐의 생존능이 44.6% 더 높은 것을 확인하였다 (도 2). 이와 같은 결과는 본 발명의 방법으로 제조된 췌도 캡슐이 생체 내 이식 후에도 안정적으로 생착할 수 있을 뿐만 아니라 생존능이 증가하는 것을 뒷받침하는 것이다. 또한, 본 발명자들은 본 발명의 방법으로 제조된 췌도 세포 캡슐이 췌도의 기능인 글루코스에 반응하여 인슐린을 분비할 수 있는지 확인하기 위하여 차등적인 농도의 글루코스에 따른 인슐린 분비를 SI 값으로 측정한 결과, 각각 14일 및 28일째에 글루코스 처리에 반응한 작은 캡슐로 캡슐화된 NPCC의 SI값 (2.67±0.09 및 2.13±0.09)은 천연 NPCC의 SI값 (2.04±0.25, 1.53±0.32) 및 큰 캡슐의 NPCC의 SI값 (2.04±0.34, 1.13±0.10)보다 현저하게 높은 SI값을 나타내는 것을 확인하였다 (도 3). 이와 같은 결과는 얇은 막에 의하여 글루코스 확산이 좀 더 잘되어 이에 반응하여 췌도의 본래 기능인 인슐린 분비를 할 수 있는 것을 뒷받침하는 것이다. 아울러, 캡슐은 당뇨병 치료를 위한 췌도의 이종 이식에 있어서 필요한, 항체와 같은 면역세포는 투과시키지 않으며, 글루코스 및 인슐린과 같은 저분자량 물질을 투과시킬 수 있는지 확인한 결과, 100-200 ㎛ 범위의 작은 캡슐은 150 kDa 크기의 덱스트란을 성공적으로 블로킹하였으며, 20 kDa 크기의 덱스트란의 캡슐 내로의 투과를 허용하는 것을 확인하였다 (도 4). 글루코스, 영양분, 인슐린, 및 대사물질(<75 kDa)과 같은 저분자량의 분자에 대한 투과도를 소유하는 캡슐과 면역글로불린 분자량에 대한 컷-오프(cutoff)는 IgG에 대해서 150 kDa, 활성화된 보체에 대해 500 kDa 및 IgM 에 대해 800 kDa이므로, 각각 20 kDa 및 150 kDa의 덱스트란을 대표적인 예로 사용하였다. 이와 같은 결과는 본 발명의 캡슐을 생체 내에 이식시 면역 거부 반응을 유발하지 않을 수 있음을 시사하는 것이며, 면역억제제의 투여가 필요 없음을 뒷받침하는 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 췌도 세포 캡슐을 제공한다. 췌도 세포 캡슐 및 제조 방법은 상기에서 설명한 바와 같다.

바람직하게 상기 췌도 세포 캡슐의 직경은 100 내지 200 ㎛이며, 등각의 캡슐로 췌도 세포의 노출이 없는 것일 수 있다. 바람직하게 췌도 세포를 둘러싼 캡슐막은 알지네이트일 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 췌도 세포 캡슐을 포함하는 당뇨병 치료용 조성물을 제공한다.

상기 당뇨병 치료는 바람직하게 상기 캡슐을 생체에 이식하여 수행할 수 있다. 본 발명자들은 본 발명의 췌도 세포 캡슐의 생존능이 높고, 글루코스에 반응하는 인슐린 분비능이 높으며, 대사물질은 투과시키지만 면역세포는 투과시키지 않는 것을 확인하여 면역 억제제의 투여가 없이도, 작은 부위에 이식하여 인슐린을 분비하여 당뇨병을 치료할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 용어 "치료"란 본 발명의 췌도 세포 캡슐을 포함하는 조성물 투여에 의해 당뇨병 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 상기 당뇨병 치료는 당뇨병이 발생할 수 있는 임의의 포유 동물에 적용이 가능하며, 그 예로 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등 가축을 제한없이 포함하나, 바람직하게는 인간일 수 있다.

본 발명에 따른 췌도 세포 캡슐은 당뇨병 치료를 필요로 하는 환자에게 이식할 수 있으며, 이식 부위로는 복강, 피하, 근육내, 내부장기, 장기 동맥/정맥의 혈관질, 뇌-척수액 또는 림프액 등이 바람직하다. 또한, 본 발명에 따른 췌도 세포 캡슐은 면역억제제의 투여가 없어도 되나, 바람직하게는 면역억제제 또는 항염증제와 조합하여 당뇨병 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 상기 면역억제제는 시클로스포린(cyclosporine), 시롤리무스(sirolimus), 라파마이신(rapamycin) 및 오르타크롤리무스(ortacrolimus)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 항염증제는 아스피린, 이부프로펜, 스테로이드 및 비스테로이성 항염증제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 면역억제제 또는 항염증제는 췌도 캡슐의 이식 후 6개월 동안, 바람직하게는 1개월 동안 투여되는 것이 좋다.

상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 캡슐의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화할 수 있다.

본 발명에 따른 췌도 세포 캡슐을 수여자에게 이식하기 위해서는, 이식되는 췌도 캡슐의 양은 마우스의 경우 4,000 내지 10,000 IEQ/kg, 비인간영장류의 경우 10,000 내지 15,000 IEQ/kg가 바람직하며, 공여자의 종류, 성별 및 췌장 상태, 수여자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 당뇨병이 걸린 개체 또는 당뇨병에 걸릴 위험이 있는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용한 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 조성물은 표적 부위로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 췌도 세포 캡슐은 췌도의 돌출 없이 작은 캡슐을 형성하여, 이식될 부피를 줄이는 한편, 생체 내 생존능 및 인슐린 분비능이 향상되는 효과를 나타낸다. 아울러, 선택적인 투과성을 갖고 있어서 면역 거부 반응을 일으키는 면역 세포의 투과는 방지하는 한편, 생체 생존에 필요한 대사물질을 투과하여 생존능이 향상된다. 이와 같은 면역 거부 반응의 억제는 이종 개체로부터 장기를 공여받아 이식할 수 있는 효과가 있으며, 다양한 공여자로부터 면역 거부 반응 없이, 이식용 췌도 세포 캡슐을 제공할 수 있을 것이다.

도 1은 천연 NPCC (naive neonatal pancreatic cell cluster) (A), 작은 캡슐 내 NPCC (B), 큰 캡슐 내 NPCC(C)의 현미경 사진을 나타낸 도이다. 배율은 각각 100x, 100x 및 40x 이다. 각 그림의 스케일 바는 200 ㎛를 나타낸다.
도 2는 작은 캡슐 및 큰 캡슐로 캡슐화된 NPCC의 생존능을 나타낸 도이다. 세포 생존능을 28일 동안 1, 4, 7, 14, 21 및 28일째에 평가하였다. 분석은 6번 수행하였다.
도 3은 작은 캡슐화된 NPCC 및 큰 캡슐화된 NPCC로부터의 글루코스-자극 인슐린 분비를 나타낸 도이다. 천연 췌도를 대조군으로 사용하여 분석하였다. 글루코스 농도 변화 (2.8 내지 20 mM)에 따른 NPCC로부터 분비되는 인슐린의 양을 전기화학 발광 면역측정법으로 결정하였다. 분석은 6번 수행하였다. 도 3A는 14일, 도 3B는 28일째에 측정한 결과이다. 다른 위첨자 ^{a, b, c} 값은 통계학적으로 다르다 (P<0.05).
도 4는 FITC-덱스트란으로 처리된 칼슘 알지네이트 캡슐의 현미경 이미지를 나태낸 도이다. 도 4A는 20 kDa, 도 4B는 70 kDa 및 도 4C는 150 kDa의 덱스트란에 대한 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 재료의 준비

본 발명의 신생 췌장 세포 집단(neonatal pancreatic cell cluster, NPCC)의 분리, 배양, 및 캡슐화에 사용된 모든 화합물 및 시약은 다른 언급이 없다면 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.

실시예 2: 통계 분석

모든 데이터는 실험 그룹간의 차이를 결정하려고 one-way ANOVA로 처리한 후, Prism version 4.0 (Graphpad Software, San Diego, USA)을 사용하여 Tukey’s test를 수행하였다. P 값이 0.05보다 작을 때 통계학적 유의성을 결정하였다.

실시예 3: NPCC ( neonatal pancreatic cell cluster )의 분리

생후 1-3일 된 신생 돼지를 췌장 공여자로 사용하였다. 이전에 확립된 방법인 Mazzitelli, S., et al.의 방법 (Mazzitelli, S., et al., Production and characterization of alginate microcapsules produced by a vibrational encapsulation device. J Biomater Appl, 2008. 23(2): p. 123-45.)에 따라 NPCC를 분리하였다.

구체적으로, 새끼 돼지에게 0.1 mg/kg 아자페론 (stresnil, Janssen, Bruxelles, 벨기에) 및 125 mg/kg 틸레타민 하이드로클로라이드 및 졸라제팜 하이드로클로라이드 (zoletil, Virbac, Carros, 프랑스)를 순차적으로 근육주사로 투여하였다. 전체 새끼 돼지를 정중선 수직 절개로 췌장을 노출시키는 복벽 절개를 시행하였다. 주변의 유문, 십이지장, 및 동맥으로부터 췌장을 조심스럽게 절개하였다. 특히 주의를 기울여 장 니킹(bowel nicking)에 의한 박테리아 오염을 피하도록 하였다. 췌장을 작은 조각 (2 ㎣)으로 잘라서, HBSS(Hank’s balanced salt solution)으로 세척하였다. 상기 조직을 우유 빛깔이 될 때까지 2.5 mg/㎖ 콜라게나제 V (Roche Diagnostics, S.p.A., 이탈리아)로 37℃ 증류수 수조에서 7~10 분간 분해하였다. 분해된 펠릿(pellet)을 2분간 1,000 rpm에서 원심분리시킨 후, 100 U/㎖ 페니실린, 0.1 mg 스트렙토마이신 (Invitrogen, Carlsbad, 미국), 0.25% BSA 분획 V (bovine serum albumin fraction V) 및 12.5 mM HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)가 첨가된 HBSS(Hank's balanced salt solution)에서 2번 세척하였다. 마지막으로, 상기 조직을 0.5% BSA 분획 V, 50 mM IBMX(isobutyl-1-methylxanthine), 10 mM 니코틴아미드, 2 mM L-글루타민, 100 U/㎖ 페니실린, 0.1 mg/㎖ 스트렙토마이신이 첨가된 Hams-F10에 재현탁시킨 후, 100ⅹ15 mm 페트리 디쉬에 도말하였다. 배양 배지는 48시간마다 교체하였다.

실시예 4: 공기-구동 캡슐화 장치에 의한 NPCC 캡슐화

상기 실시예 3에서 시험관 내에서 배양된 NPCC를 원심분리에 의해 수확하여, 최종 농도가 생리식염수에서 2% 되는 알긴산 나트륨(sodium alginate, Pronova UP-LVG, NovaMatrix, Sandvika, 노르웨이)용액으로 재현탁하였다. NPCC를 포함하는 상기 알지네이트 용액을 부드럽게 피펫팅하여 NPCC가 균일하게 분산되도록 하였고, 용액 내의 공기 방울은 원심분리에 의해 제거하였다. 상기 현탁액을 속도가 135 ㎖/hr인 실린지 펌프 (KDS100, KD Scientific Inc., Holliston, 미국)로 이동시켰고, 공기 역학 노즐에 의해 방울을 형성하였다.

캡슐화된 NPCC에 대한 작은 캡슐 (100-200 ㎛) 및 큰 캡슐(700-800 ㎛)의 효과를 조사하고자 상기 두 타입의 캡슐을 준비하였다. 작은 캡슐은 캡슐화 장치(J30 encapsulator, Nisco Engineering AG, Zurich, 스위스)를 사용하였다. 큰 캡슐은 알지네이트 노즐 직경이 500 ㎛인 공기-구동 캡슐화 시스템을 사용하여, 이전 Wolters, G.H., et al.의 방법 (Wolters, G.H., et al., A versatile alginate droplet generator applicable for microencapsulation of pancreatic islets. J Appl Biomater, 1991. 3(4): p. 281-6)과 유사하게 제조하였다. 두 방울은 110 mM CaCl₂ 용액에서 5분간 교차결합(cross-linking)에 의해 경화시켰고, 2번 세척하였다.

그 결과, 작은 캡슐 및 큰 캡슐로의 NPCC의 캡슐화는 성공적으로 수행되었다. 특히, 공기-구동 캡슐화 장치를 사용한 작은 캡슐은 NPCC의 어떠한 돌출도 나타나지 않았다 (도 1B). 작은 캡슐의 NPCC는 얇은 알지네이트 막을 가지며, 이는 200 ㎛를 초과하지 않았다. 이에 반해, 큰 캡슐은 2개 이상의 NPCC가 발견되었다. 작은 췌도 세포는 천연 NPCC로부터 분리되었다 (도 1A). 그러나 캡슐화된 NPCC는 알지네이트에 의해 기계학적으로 지지되었다 (도 1B 및 1C).

실시예 5: 캡슐화된 NPCC 의 시험관 내( in vitro ) 생존능 및 인슐린 분비능 평가

상기 실시예 4에서 제조한 캡슐화된 NPCC (천연 (naive), 작은 캡슐 및 큰 캡슐)를 각각 시험관 내에서 배양하여서, 생존능 및 인슐린 분비를 확인하였다.

구체적으로, 캡슐화 후 배양한 지 1, 4, 7, 14, 21, 28일째에 자동화 세포 계수기 (Invitrogen)를 사용하여, 메틸렌 블루 염색으로 생존능을 평가하였다.

그 결과, NPCC의 생존능은 모든 실험 그룹 (천연, 작은 캡슐 및 큰 캡슐)에서 1일 후에 90% 이상이었고, 1주일 후 점차적으로 떨어졌다. 큰 캡슐의 NPCC는 7일째에서 천연 NPCC 및 작은 캡슐의 NPCC (각각 86.83±2.32%, 87.67±2.07%) 보다 현저하게 낮은 생존능 (79.50±2.88%)을 나타내었다. 천연 NPCC의 생존능은 14일째에 급격히 감소하였으나, 작은 캡슐 내의 NPCC는 그들의 생존능을 유지하였다 (82.0±2.19%) (도 2).

이와 같은 결과는 본 발명의 작은 캡슐로 캡슐화된 NPCC의 생존능이 천연 NPCC, 큰 캡슐로 캡슐화된 NPCC 보다 생존능이 높다는 것을 뒷받침하는 것이다.

또한, 칼슘 알지네이트 마이크로캡슐로 캡슐화된 췌도의 인슐린 분비를 조사하기 위하여, 캡슐화된 NPCC가 글루코스에 반응하는 인슐린 분비를 14일째 및 28일째에 검사하였다. 엄선한 NPCC의 배양 중 각각 순차적으로 2시간 동안 2.8 및 20 mM의 글루코스에 노출시켰다. 상기 상등액을 각 배양 말기에 수득하여서, -20℃에서 보관하였다. 상등액 내의 인슐린 양을 자동화된 Roche Modular Analytics E170 (Roche Diagnostics)에서 전기화학 발광 면역측정법 (Elecsys insulin reagents kit, Roche Diagnostics, Mannheim, 독일)으로 측정하였다. SI(Stimulation index)는 자극 대 기본 인슐린의 비로 계산되며, 인슐린 분비의 능력을 나타낸다.

그 결과, 캡슐화된 췌도는 정지 배양 배지에서 글루코스에 반응하여 인슐린을 분비하였다. 각각 14일 및 28일째에 글루코스 처리에 반응한 작은 캡슐로 캡슐화된 NPCC의 SI값 (2.67±0.09 및 2.13±0.09)은 천연 NPCC의 SI값 (2.04±0.25, 1.53±0.32) 및 큰 캡슐의 NPCC의 SI값 (2.04±0.34, 1.13±0.10)보다 현저하게 높은 SI값을 나타내었다 (도 3).

이와 같은 결과는 본 발명의 작은 캡슐화된 NPCC의 인슐린 분비능력이 천연 또는 큰 캡슐보다 높다는 것을 뒷받침하는 것이다.

실시예 6: 선택적 투과도 분석

향상된 생존능 및 인슐린 분비능을 가지는 본 발명의 작은 캡슐로 캡슐화된 NPCC가 글루코스 및 인슐린과 같은 저분자량 물질의 투과를 허용하는 반면, 항체와 같은 고분자량 물질의 투과를 블로킹하는지 여부를 확인하기 위하여, 투과도를 분석하였다.

약 100개의 알지네이트 캡슐을 증류수에서 20, 70, 150 kDa의 0.1% 플루오레신 이소사이오사이네이트(fluorescein isothiocyanate)로 표지된 덱스트란(FITC-dextran)과 배양하였다. 5분, 20분, 5시간, 1일 및 3일 후에, 캡슐을 수거하여서 증류수로 3번 세척하였다. 그 후, 캡슐을 현미경 슬라이드에 옮겨 놓고 글래스 커버 슬립으로 닫은 다음 형광 현미경으로 사진을 찍었다.

그 결과, 100-200 ㎛ 범위의 작은 캡슐은 150 kDa 크기의 덱스트란을 성공적으로 블로킹하였으며, 20 kDa 크기의 덱스트란의 캡슐 내로의 투과를 허용하였다 (도 4).

이와 같은 결과는 본 발명의 캡슐화된 NPCC 또는 췌도 세포는 대사 물질과 같은 물질을 자유롭게 통과시키며, 면역 거부 반응을 일으키는 항체와 같은 면역물질을 효과적으로 블로킹할 수 있음을 뒷받침하는 결과이다.

즉, 본 발명의 캡슐화된 NPCC 또는 췌도 세포는 세포 생존능 및 인슐린 분비능이 우수할 뿐만 아니라, 면역 물질을 효과적으로 블로킹하며, 영양분 및 대사물질의 이동을 허용하여 장기 이식 시 이식된 세포의 생착능 및 이식 공여자의 종류를 넓힐 수 있음을 시사한다.

Claims (10)

1. (a) 췌도 공급원으로부터 췌도 세포를 분리하는 단계;
   (b) 상기 분리한 췌도 세포를 생체적합성 고분자 용액으로 분산시키는 단계;
   (c) 상기 (b) 단계의 생체적합성 고분자 용액에 분산된 췌도 세포를 원심분리하여 공기방울을 제거하는 단계; 및
   (d) 상기 (c) 단계의 원심분리된 생체적합성 고분자 용액에 분산된 췌도 세포를 공기-구동 캡슐화 장치로 캡슐화하는 단계를 포함하는, 캡슐 직경이 10 내지 200 ㎛인 췌도 세포 캡슐의 제조 방법.
   
2. 제1항에 있어서, (e) 캡슐화된 췌도 세포를 경화시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 알지네이트인 것인 방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 생체적합성 고분자 용액은 0.1 내지 50% (w/v) 농도의 알지네이트 용액인 것인 방법.
   
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 상기 췌도 공급원은 돼지인 것인 방법.
   
7. 제1항 내지 제4항 또는 제6항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 췌도 세포 캡슐.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 췌도 세포 캡슐은 등각의 캡슐로 췌도 세포의 노출이 없는 것을 특징으로 하는 것인 캡슐.
   
9. 제7항의 캡슐을 포함하는 당뇨병 치료용 조성물.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 당뇨병 치료는 상기 캡슐을 생체에 이식하여 수행하는 것인 조성물.
    
    

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