KR102572188B1 - 매크로-캡슐화 치료 세포 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

치료 세포 이식체를 제조하는 데 사용될 수 있는 매크로-캡슐 및 장벽, 치료 세포를 캡슐화하는 방법, 및 캡슐화된 세포를 질환의 치료에 사용하는 방법이 기재되어 있다.

Description

매크로-캡슐화 치료 세포 및 이의 사용 방법
관련 출원
본원은 35 U.S.C. § 119(e)하에 2017년 4월 6일에 출원된 미국 가출원 제62/482,413호의 우선권을 주장한다.
분야
본 개시는 일반적으로 세포 이식 및 치료 세포의 캡슐화 분야에 관한 것이다. 치료 세포를 캡슐화하기 위한 매크로-캡슐(macro-capsule), 치료 세포를 캡슐화하는 방법, 및 당뇨병과 같은 질환을 치료하기 위한 관련된 사용 방법이 개시된다.
다음의 논의는 본 개시를 이해하는데 있어서 독자를 돕기 위해 제공되고, 이에 대한 종래 기술을 기재하거나 구성하기 위한 것으로 허용되지 않는다.
당뇨병 및 인슐린
진성 당뇨병(즉, 당뇨병)은 호르몬 인슐린을 생성하거나 이에 반응하는 신체의 능력이 손상되어 탄수화물의 비정상적인 대사 및 혈액 및 뇨에서 증가된 수준의 글루코스를 초래하는 질환이다. 상기 질환은 대안적으로 타입 1 진성 당뇨병, 인슐린 의존성 진성 당뇨병(IDDM), 젊은이들의 성숙 발병 당뇨병(MODY), 잠복성 성인 당뇨병(LADA), 취성 당뇨병, 영수성 당뇨병(lean diabetes), 타입 1.5, 타입 2, 타입 3, 비만 관련 당뇨병, 임신성 당뇨병, 및 당해 분야에서 허용되는 다른 명명법으로서 기재된 여러 하위 유형으로 세분된다.
일반적으로, 인슐린 의존성 당뇨병을 갖는 대상체는 혈당을 충분히 낮추기 위해 외인성 인슐린을 투여하는 것이 필요하다. 비인슐린 의존성 대상체는 인슐린에 대한 민감성 또는 글루코스의 배설을 향상시키는 약물 부류를 포함하는 약제학적 개입으로 혈당을 충분히 낮출 수 있다. 인슐린 의존성 당뇨병을 갖는 대상체는 그 질환이 타입 1, MODY, LADA, 취성, 영수성, 타입 1.5, 타입 2, 타입 3, 비만 관련 당뇨병 또는 이들의 임의의 조합으로서 표지되는지의 여부에 상관없이 인슐린 생성 세포가 대상체에게 이식되는 세포 대체 요법으로부터 이익을 얻을 수 있다.
타입 I 당뇨병은 일반적으로 어린이 및 청년에서 진단되고, 청소년 당뇨병으로서 이미 공지되어 있다. 당뇨병을 갖는 사람들 중 5 내지 10%만이 이러한 형태의 질환을 갖는다. 성숙 발병 당뇨병은 상기 질환의 가장 일반적인 형태이고, 그것은 인슐린 생성 베타 세포의 손상 또는 파괴, 인슐린 내성의 발달, 또는 인슐린 생성 베타 세포의 손상 및 인슐린 내성의 발달 모두에 기인하여 발생한다. 당뇨병은 유전적 및 환경적 인자의 조합에 기인하여 비-비만 성인 및 어린이에서 발생할 수 있다. 비만 성인 및 어린이에서, 췌장은 혈당을 조절하기 위해 여분의 인슐린을 제조하기 위해 시도할 수 있지만, 경시적으로 계속 할 수 없고 정상 수준으로 혈당을 유지할 수 없다. 신체는 또한 생성되는 인슐린에 덜 민감하게 될 수 있다. 인슐린 분비 베타 세포의 연장된 과활성은 베타 세포 기능장애 및 사망을 초래할 수 있다.
당뇨병 증상은 대상체의 혈당이 얼마나 많이 변하는지에 따라 달라진다. 일부 사람들, 특히 전당뇨병 또는 비인슐린 의존성 당뇨병을 갖는 사람들은 초기에 증상을 경험하지 않을 수 있다. 타입 I 당뇨병에서, 증상은 신속하게 발생되는 경향이 있고, 더욱 심각하다.
타입 I 및 타입 II 당뇨병의 징후 및 증상 중 일부는 갈증 증가, 빈번한 배뇨, 극도의 굶주림, 설명되지 않은 체중 감소, 뇨에 케톤의 존재(케톤은 이용가능한 인슐린이 충분하지 않을 경우에 발생하는 근육 및 지방 파괴의 부산물이다), 피로, 과민성, 시력 저하, 천천히 치유되는 상처, 잇몸 또는 피부 감염 및 질 감염과 같은 빈번한 감염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
캡슐화된 세포
생물의학적 연구의 목적은 외래 세포가 면역-적합성 인간 숙주 내에서 생존할 수 있게 하는 반투과성 장벽(barrier) 속에 세포를 캡슐화하기 위한 시스템을 생성하는 것이었다(참조: Weir, Diabetologia, 56(7): 1458-61 (2013)). 이 목적을 달성하기 위해, 캡슐화 장벽은 가스, 영양소 및 노폐물의 통과를 허용할 필요가 있지만, 장벽은 또한 면역 파괴를 위해 세포를 표적화하는 면역세포 및 그들의 이펙터 분자에 불투과성이어야 한다. 장벽은 또한 염증, 섬유증 또는 외래 물질에 대한 다른 숙주 방어를 자극하는 것을 피해야 한다.
공개된 과학 문헌에 보고된 가장 주요한 장벽 물질은 탄수화물 중합체 나트륨 알기네이트 및 셀룰로스 설페이트이다(참조: 예를 들어, Tuch et al., Diabetes Care, 32(10): 1887-9 (2009); Basta et al., Diabetes Care, 34(11):2406-9 (2011); Lohr et al., Pharmaceutics, 6(3):447-66 (2014)).
나트륨 알기네이트는 칼슘 또는 바륨과 같은 2가 양이온의 존재하에 겔형 매트릭스를 형성한다. 나트륨 알기네이트 매트릭스는 다공성을 감소시키기 위해 폴리-L-리신 또는 폴리-L-오르니틴의 층에 의해 빈번히 보충된다.
셀룰로스 설페이트는 공중합체 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드)(pDADMAC)와 복합체화되어 막을 형성할 수 있다. 나트륨 알기네이트 및 셀룰로스 설페이트는 또한 알기네이트 및 나트륨 설페이트와 혼합된 장벽을 형성하기 위해 조합하여 사용되었다(참조: Wang et al., Transplantation, 85(3):331-7 (2008); Weber et al., J. Biotechnol. 114(3):315-26 (2004)).
세포 생존
면역 적격성 숙주의 신체 내에서 연장된 시간 동안(즉, 적어도 6개월; 참조: Tuch, Basta, Lohr, Ma (Designing a retrievable and scalable cell encapsulation device for potential treatment of type 1 diabetes, PNAS | Published online December 26, 2017) 외래 세포의 생존 및 기능을 가능하게 하는 이러한 장벽에 대한 보고는 거의 없다. 제한된 시간을 넘어 기능하는 캡슐화된 세포의 일반적인 장해는 적어도 부분적으로 장벽을 가로 질러 불량한 산소 확산으로 인해 세포 기능의 사망 또는 장애 또는 장벽 주위의 섬유상 조직의 축적을 초래한다. 이 문제를 해결하기 위해, 하나의 그룹은 그들이 알기네이트에 대한 숙주 대식세포의 부착을 감소시킨다고 주장하는 트리아졸 유사체를 포함하는 공유 결합된 화학적 그룹에 의해 변형된 알기네이트의 형태를 생성했다(참조: Vegas et al., Nat. Biotechnol, 34(3):345-52 (2016)). 이 그룹은 배아 줄기 세포에서 유래한 인간의 인슐린 분비 세포가 복막강에 이식 후 최대 6개월에 당뇨병 마우스에서 혈당을 낮추도록 할 수 있는 변형된 알기네이트의 마이크로캡슐을 생성했다(참조: Vegas et al., Nat. Med, 22(3):306-l1 (2016)).
회복성
마이크로캡슐의 주요 결점은 이식이 환자에게 안전 위험이 되거나 이식이 기능을 멈추고 교체되어야 하는 경우 숙주에서 완전히 회복될 수 없다는 점이다. 인간 치료 용도를 위해 의도된 이식이 치료에 안전하고 실용적인 것으로 간주되도록 회복되어야 한다는 것이 당해 분야에서 일반적으로 허용된다.
실용적인 치료 용량
별도의 그룹은 긴 관형 구조를 생성하기 위해 직조된 나일론 트레드의 표면에 부착된 알기네이트로 구성된 장치를 기재했다(참조: Ma (Designing a retrievable and scalable cell encapsulation device for potential treatment of type 1 diabetes. PNAS | Published online December 26, 2017). 이 형상은 알기네이트의 부분이 직조된 트레드로부터 분리되지 않는 한 복막강에 이식 후 회복가능한 것으로 보고되어 있다. 또 다른 그룹은 회복가능한 피하 이식을 위한 평면 매크로캡슐화 장치를 보고했다(참조: D'AMOUR 2015, STEM CELLS TRANSLATIONALMEDICINE 2015;4: 1-9). 그러나, 이러한 장치는 치료 세포를 함유하기 위한 제한된 용적을 가짐으로써 손상된다. 기재된 장치를 사용하여 치료 용량을 인간 환자에게 전달하는 것은 비실용적일 것이다. 예를 들어, 60kg 체중의 인슐린 의존성 당뇨병을 치료하기 위한 세포의 치료 용량은 6억개의 세포이다(참조: Bruni 2015 Bruni A, et al. Diabetes Metab Syndr Obes. 2014 Jun 23;7:211-23). 기재된 관형 장치는 그 치료 용량을 함유하기 위해 60미터 길이일 필요가 있다. 60kg 당뇨병은 치료 용량을 수용하기 위해 기재된 평면 매크로캡슐화 장치 40개가 필요할 것이다.
인슐린 방출 동역학
췌장은 인슐린 및 다른 췌장 호르몬의 빠른 전신 분포를 달성하는 매우 혈관화된 기관이다. 췌장 내의 각 섬은 혈액 미세혈관에 인접되어 있다. 췌장 순환은 또한 췌장 호르몬의 주요 작용 부위인 간에 연결되어 있다. 따라서, 건강한 췌장은 글루코스 변동 수분 내에 정상적인 혈당 수준을 회복할 수 있다. 복막강에 이식된 장치는 숙주 혈관구조에의 근접성이 부족하여 순환으로 인슐린의 느린 방출 및 장기간의 고혈당을 유도한다(참조: Ma (Designing a retrievable and scalable cell encapsulation device for potential treatment of type 1 diabetes. PNAS | Published online December 26, 2017). 인간 피부는 불량하게 혈관화되고, 또한 간에의 근접성이 부족하다. 결과적으로, 피하 이식체는 췌장 호르몬의 빠른 전신 순환을 허용하여 고혈당증의 기간을 유도할 것으로 예상되지 않는다. 주기적인 고혈당증은 당뇨병 이환율의 주요 원인이다.
따라서, 이식된 세포의 장기간 생존을 지지할 수 있고, 회복가능하고, 일반적으로 그리고 구체적으로 모두 당뇨병을 치료하기 위해 분비된 호르몬의 신속한 분포를 제공할 수 있는 캡슐화 장벽이 당해 기술 분야에서 여전히 필요하다. 본 개시는 이러한 요구를 충족시킨다.
치료 세포 이식체를 제조하는데 사용될 수 있는 매크로-캡슐화 장벽, 치료 세포를 캡슐화하는 방법, 및 질환의 치료에 캡슐화된 세포의 사용 방법이 본원에 기재된다. 매크로-캡슐화된 세포는 숙주로부터 회복가능하고, 실용적인 용적으로 세포의 치료 용량을 함유할 수 있고, 분비된 호르몬의 신속한 분포를 가능하게 할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 개시는 복수의 치료 세포를 포함하는 매크로-캡슐을 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 매크로-캡슐은 적어도 하나의 장벽을 포함하고, 상기 장벽은 셀룰로스 설페이트 및 글루코만난 또는 글루코만난 설페이트를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 복수의 치료 세포를 포함하는 매크로-캡슐을 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 매크로-캡슐은 적어도 하나의 장벽을 포함하고, 상기 장벽은 나트륨 알기네이트를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 복수의 치료 세포를 포함하는 매크로-캡슐을 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 매크로-캡슐은 적어도 제1 장벽 및 제2 장벽을 포함하고, 상기 제1 장벽은 상기 제2 장벽 내에 포함되고, 상기 매크로-캡슐은 적어도 1.5mm의 직경을 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 복수의 치료 세포를 포함하는 매크로-캡슐을 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 매크로-캡슐은 원통형 형상 및 적어도 1.5mm의 직경을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료 세포는 섬 세포와 같은 인슐린 생성 세포이다.
일부 구현예에서, 제1 장벽은 셀룰로스 설페이트 및 글루코만난 또는 글루코만난 설페이트를 포함할 수 있고, 일부 구현예에서, 제1 장벽은 나트륨 알기네이트를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 나트륨 알기네이트는 2가 양이온 바륨(BaCl2) 또는 칼슘(CaCl2)과 중합된다.
일부 구현예에서, 조성물은 제2 장벽을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 제2 장벽은 셀룰로스 설페이트 및 글루코만난 또는 글루코만난 설페이트를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 장벽은 글루코만난 또는 글루코만난 설페이트를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 장벽은 모두 셀룰로스 설페이트 및 글루코만난 또는 글루코만난 설페이트를 포함한다.
일부 구현예에서, 매크로-캡슐의 직경은 적어도 약 1.5mm, 적어도 약 1.6mm, 적어도 약 1.7mm, 적어도 약 1.8mm, 적어도 약 1.9mm, 적어도 약 2.0mm, 적어도 약 2.1mm, 적어도 약 2.2mm, 적어도 약 2.3mm, 적어도 약 2.4mm 또는 적어도 약 2.5mm이다.
일부 구현예에서, 셀룰로스 설페이트는 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드)(pDADMAC)와 중합되었다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 매크로-캡슐은 pDADMAC와의 중합 후에 폴리메틸렌-코-구아니딘(PMCG)으로 세척되었다.
일부 구현예에서, 매크로-캡슐은 원통형이다.
일부 구현예에서, 복수의 원통형 매크로-캡슐은 하나의 말단에 결합된다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 pDADMAC와 중합된 셀룰로스 설페이트를 포함하는 장벽에서 복수의 치료 세포를 캡슐화하는 단계; 상기 장벽을 PMCG로 세척하는 단계를 포함하는, 복수의 치료 세포를 포함하는 비-부착성 매크로-캡슐을 형성하는 방법을 제공하고, 상기 PMCG는 셀룰로스 설페이트의 비결합된 설페이트 그룹에 결합함으로써 장벽을 코팅시키고, 비-부착성 매크로-캡슐이 형성된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 pDADMAC와 중합된 셀룰로스 설페이트를 포함하는 제2 장벽에서 비-부착성 매크로-캡슐을 캡슐화하는 단계 및 상기 제2 장벽을 PMCG로 세척하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 PMCG는 셀룰로스 설페이트의 비결합된 설페이트 그룹에 결합함으로써 장벽을 코팅시키고, 이중-장벽 비-부착성 매크로-캡슐이 형성된다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 당뇨병을 갖는 대상체에게 치료 세포를 포함하는 매크로-캡슐을 포함하는 조성물을 이식하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 당뇨병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 매크로-캡슐은 적어도 제1 장벽 및 제2 장벽을 포함하고, 상기 제1 장벽은 상기 제2 장벽 내에 포함되고, 상기 매크로-캡슐은 적어도 1.5mm의 직경을 갖는다.
개시된 방법의 일부 구현예에서, 대상체는 성인인 반면, 일부 구현예에서, 대상체는 어린이이다. 개시된 방법의 일부 구현예에서, 대상체는 타입 I 당뇨병인 반면, 일부 구현예에서, 대상체는 타입 II 당뇨병을 갖는다.
일부 구현예에서, 각 매크로-캡슐의 길이는 적어도 약 10cm, 적어도 약 11cm, 또는 적어도 12cm, 또는 적어도 13cm, 또는 적어도 14cm, 또는 적어도 15cm, 또는 적어도 16cm, 또는 적어도 17cm, 또는 적어도 18cm, 또는 적어도 19cm, 또는 적어도 20cm이다.
일부 구현예에서, 매크로-캡슐은 적어도 약 50,000개 세포/cm, 적어도 약 60,000개 세포/cm, 적어도 약 70,000개 세포/cm, 적어도 약 80,000개 세포/cm, 적어도 약 90,000개 세포/cm, 적어도 약 1000,000개 세포/cm를 함유한다.
일부 구현예에서, 개시된 매크로-캡슐은 말단-대-말단으로 결합될 수 있다.
개시된 방법의 일부 구현예에서, 조성물은 대상체의 더 큰 장막(omentum) 또는 복막강에 이식된다. 예를 들어, 조성물은 장막에 고정되거나 장막 파우치에 이식될 수 있다.
이를 필요로 하는 대상체에서 당뇨병을 치료하는데 사용하기 위한, 상기 양태 또는 구현예 중 어느 하나에 따르는 조성물.
당뇨병을 치료하기 위한 의약의 제조에서 상기 양태 또는 구현예 중 어느 하나에 따르는 조성물의 용도.
다음 상세한 설명은 예시적이고 설명적이며, 본 발명의 추가의 설명을 제공하는 것을 의도한다.
도 1a-1d는 매크로-캡슐을 도시한다. (a) 셀룰로스 설페이트 및 곤약 글루코만난으로 이루어진 구형 매크로-캡슐의 명 시야 이미지. 내부 캡슐은 치료 세포의 복수의 클러스터를 함유한다. 원래 이미지 100X 배율. (b) 40X 배율에서 이식 3주 후 정상 랫트로부터 제거된 인간 항원 염색된 매크로-캡슐의 면역형광. 매크로-캡슐의 표면은 부착된 숙주 세포도 염증 또는 섬유증의 증거도 갖지 않는다. (c) 곤약 글루코만난 설페이트로 형성되지 않았지만, 다르게는 24X 배율에서 (b)에 도시된 매크로-캡슐과 동일한 매크로-캡슐. 곤약 글루코만난 설페이트 없이 형성된 매크로-캡슐은 매크로-캡슐 주위에 숙주 세포의 과성장을 갖지만, 매크로-캡슐 내에 살아있는 인간 세포는 없다. (d) 원통형 매크로-캡슐의 명 시야 이미지. 내부 캡슐은 알기네이트 하이드로겔로 구성되고, 치료 세포의 복수의 클러스터를 함유한다. 외부 캡슐은 내부 캡슐에 밀접하게 부착되고, 셀룰로스 설페이트 및 곤약 글루코만난으로 구성된다.
도 2는 나트륨 알기네이트로부터 형성된 내부 캡슐과 셀룰로스 설페이트 및 곤약 글루코만난 설페이트로부터 형성된 외부 캡슐로 구성된 이중 층 매크로-캡슐을 도시한다. 이 매크로캡슐은 비구형 형상을 갖는다.
도 3a-3b는 20kDa 덱스트란 입자에 대한 매크로캡슐의 투과성을 도시한다. 셀룰로스 설페이트의 막에 곤약 글루코만난 또는 곤약 글루코만난 설페이트를 혼입하면 막의 투과성을 증가시킬 수 있다. 곤약 글루코만난 설페이트 없이 형성된 매크로-캡슐은 매크로-캡슐의 내부로 20kDa 형광성 나노입자의 통과를 허용하지 않는다(a). 매크로-캡슐의 내부는 세정 후 형광성이 아니다. 곤약 글루코만난 설페이트로 형성된 매크로-캡슐은 매크로-캡슐 내부에 20kDa 형광성 나노입자의 통과를 허용한다(b). 매크로-캡슐의 내부는 세정 후 형광성이다.
도 4는 당뇨병 랫트의 혈당 조절을 도시한다. 정상 스프라그-다울리 랫트는 0일째에 스트렙토조토신을 주사하여 당뇨병이도록 하여 혈당 농도의 빠른 상승을 유도했다. 동물을 건강하게 유지하기 위해, 서방형 인슐린 펠렛을 13일째에 피부 아래에 이식했다. 67일째에, 인슐린 펠렛을 제거하고, 인슐린 생성 세포를 함유하는 매크로-캡슐을 장막에 외과적으로 주입시켰다. 혈당 농도는 조절된 채로 유지되었다.
도 5a-5c는 설치류의 매크로-캡슐의 외식편을 도시한다. 당뇨병 랫트에 이식 3주 후, 매크로-캡슐을 함유하는 장막 파우치를 제거했다. (a)는 파우치가 충분히 혈관화되었음을 도시한다. (b) 및 (c)는 외식편 내의 매크로-캡슐이 인슐린 발현 세포를 함유함을 나타내는 면역형광 분석을 도시한다. (b) 및 (c)는 매크로-캡슐의 표면이 숙주 세포 부착 또는 염증 및 섬유증의 증거를 함유하지 않음을 도시한다.
도 6a-6c는 설치류의 매크로-캡슐의 외식편을 도시한다. (a) 장막으로부터 형성된 파우치 내의 구형 매크로-캡슐은 당뇨병 랫트에게 이식 3주 후에 외식되었다. 매크로-캡슐은 투명한 장막 막 내에서 구로서 가시적이다. 막은 매크로-캡슐에 바로 근접한 미세혈관의 밀집된 네트워크를 도시한다. (b, c) 원통형 매크로-캡슐은 당뇨병 랫트에게 이식 3주 후에 외식되었다. 매크로-캡슐은 숙주의 장막에 부착되었다. 장막으로부터의 혈관구조는 매크로-캡슐에 바로 근접해서 명백하다.
도 7a-7c는 매크로-캡슐이 이식된 이종 세포의 생존을 가능하게 한다는 것을 도시한다. 치료용 인간 세포의 클러스터는 살아있는(녹색) 및 죽은(적색) 세포의 형광성 지표로 염색함으로써 세포 생존력에 대해 평가되었다. 세포의 클러스터는 정삭적인 면역 적격 마우스에 이식 9일(b) 및 47일(c) 후와 같이 이식 전(a)에 동일하게 생존가능하다.
도 8a-8b는 이식 6개월 후 외식된 매크로-캡슐 주위의, 장막으로부터 시작된 막을 도시한다. (a) 막은 얇고, 세포화되고, 콜라겐을 함유한다. 원래 배율은 400X이다. (b) 매크로-캡슐은 이식 6개월 후 인슐린 발현 세포를 함유한다.
치료 세포 이식에 사용될 수 있는 매크로-캡슐화 조성물, 캡슐화된 치료 세포의 제조 방법, 및 이를 필요로 하는 대상체에서 질환의 치료와 같은 관련 사용 방법이 본원에 기재된다.
캡슐화된 세포의 생존은 장벽 막의 면역 보호 및 막을 가로 질러 생물학적 분자의 확산 특성에 의해 영향을 받는다. 이식의 장기간 효능은 이식 장벽의 물리적 완전성 및 이식의 생체적합성, 또는 숙주의 염증, 섬유종(fibroses), 및 다른 이물질 반응의 저자극뿐만 아니라 산소 확산, 캡슐화된 세포의 밀도, 및 숙주 내 생착 위치에 따라 달라진다. 세포의 치료 용량을 실제로 전달하는 능력은 치료 세포의 부하 밀도에 따라 달라진다. 분비된 인자를 신속하게 분배하는 능력은 숙주 내 생착 위치 및 숙주 혈관 구조와 근위 연결을 형성하는 능력에 따라 달라진다.
본 개시는 면역 적격 숙주에 세포의 이식 후 6개월보다 더 오랫동안 캡슐화된 세포의 생존 및 기능을 가능하게 하는 셀룰로스 설페이트로부터 형성된 신규한 매크로-캡슐 조성물을 기재한다. 본 개시는 살아있는 숙주로부터의 캡슐 회수를 촉진시키는 신규한 매크로-캡슐 형상을 추가로 기재한다. 개시된 캡슐화 장벽은 셀룰로스 설페이트 이외에, 장벽 다공성을 조절하고 섬유증을 제한하는 것을 돕는 탄수화물 중합체 곤약 글루코만난 또는 곤약 글루코만난 설페이트를 포함할 수 있다. 본 개시는 또한 고밀도 치료 세포의 이식 및 생착을 허용하는 1.5mm를 초과하는 직경을 갖는 신규한 매크로-캡슐 이중-장벽 막 설계를 제공한다. 본 개시는 또한 비구형 매크로-캡슐을 형성한다. 또한, 개시된 매크로-캡슐을 제조하는 방법은 막의 기계적 특성을 개선시키기 위해 폴리메틸렌-코-구아니딘(PMCG)을 포함하는 순차적 중합 단계를 포함할 수 있다. 개시된 물질 및 기술을 사용하여 형성된 매크로-캡슐은 캡슐화된 세포를 대상체에게 이식함으로써, 예를 들어, 더 큰 장막에, 또는 이러한 세포 기반 치료에 일반적으로 사용되는 더 큰 장막 또는 다른 이식 부위로부터 외과적으로 형성된 파우치에 부착시킴으로써 완전 면역 적격 대상체에서 당뇨병을 치료하는데 사용될 수 있다.
I. 정의
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 당업자에 의해 이해될 것이고, 그것이 사용되는 문맥에 따라 어느 정도 변할 것이다. 그것이 사용되는 문맥을 감안하여 당업자에게 명백하지 않은 용어가 사용되는 경우, "약"은 특정 용어의 ± 10%까지를 의미할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "매크로-캡슐"은 치료 세포를 캡슐화하기 위한 중합체 기반 조성물을 지칭한다. 매크로-캡슐의 정확한 크기 및 형상은 특별히 제한되지 않고, 마이크로-캡슐을 제조하기 위해 사용된 방법 및 물질에 의해 결정될 수 있다. 또한, 개시된 매크로-캡슐은 치료 세포를 캡슐화하는 중합체의 하나 이상의 층(즉, 장벽 또는 막)을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "장벽" 또는 "막"은 적어도 하나의 중합체로 구성된 매크로-캡슐의 층을 지칭한다. 용어 "장벽" 및 "막"은 본 개시 전반에 걸쳐 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "하이드로겔"은 칼슘 또는 바륨과 같은 2가 양이온과의 이온 결합에 의해 함께 결합된, 알기네이트와 같은 탄수화물 중합체의 응집체에 의해 생성된 다공성 매트릭스를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포 기반 요법/이식에 사용된 외래 치료 세포의 생존 및 기능과 관련하여 사용될 때 "장기간"은 적어도 6개월 이상의 기간을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "치료적 유효량"은 세포가 이식되는 특정 약리학적 효과를 제공하는, 즉 인슐린을 생성하고 혈당을 조절하는 대상체에게 이식된 캡슐화된 세포의 양을 의미한다. 캡슐화된 세포의 치료적 유효량은, 이러한 농도가 당업자에 의해 치료적 유효량인 것으로 간주될 지라도, 소정의 대상체에서 당뇨병을 치료하는데 항상 효과적이지는 않음이 강조된다. 단지 편의상, 예시적인 양이 하기에 제공된다.
당업자는 특정 대상체를 치료하기 위해 필요한 표준 관행에 따라 이러한 양을 조정할 수 있다. 치료적 유효량은 이식 부위, 대상체의 연령 및 체중, 및/또는 대상체 질환의 중증도, 대상체의 식이 및/또는 대상체의 전반적인 건강을 포함하는 대상체의 상태에 기초하여 달라질 수 있다.
당뇨병과 관련하여 본원에서 사용된 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 고혈당증 및 저혈당증과 같은 당뇨병, 심장 질환, 신장 질환, 간 질환, 망막증, 신경병증, 비치유성 궤양, 치주 질환 중 하나 이상의 증상 또는 공동-이환을 감소, 개선 또는 제거하고; 외인성 인슐린에 대한 대상체의 의존도를 감소시켜 혈당을 조절하고, 외인성 인슐린의 사용 없이 대상체의 혈당을 조절하고; 글리코실화된 헤모글로빈 또는 HbAlC 수준의 대상체의 백분율을 감소시키고/시키거나; 인슐린 감작제, 글루코스 배출 증강제 및 당업계에 공지된 다른 치료 방식과 같은 다른 약제학적 개입에 대한 대상체의 의존도를 감소시키는 것 중 하나 이상을 지칭한다.
용어 "개체", "대상체", 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 임의의 개별적 포유동물 대상체, 예를 들어, 소, 개, 고양이, 말 또는 사람을 지칭한다.
II. 신규한 매크로-캡슐 및 장벽
췌장 섬 세포 또는 다른 인슐린 생성 세포와 같은 치료 세포를 캡슐화하기 위한 신규한 매크로-캡슐 및 장벽이 본원에 개시된다. 개시된 장벽은 종래의 캡슐화 기술에 비해 캡슐의 구조적 완전성을 향상시키고, 캡슐화된 세포에 대한 분자의 수동적 확산을 증가시키기 위해 종래의 캡슐화 기술에 비해 투과성을 향상시키고, 섬유증의 발생을 감소시키고, 캡슐의 제조를 용이하게 하는 물질의 신규한 조합을 포함하고, 개시된 매크로-캡슐은 캡슐화 세포의 생존을 증가시키고, 섬유증의 발생을 감소시키고, 이식에 대한 숙주 혈관 구조의 동원을 촉진시키고, 숙주에의 이식 및 숙주로부터의 회복을 촉진시키고, 치료 용량을 큰 포유동물에게 전달하는 독특한 구조적 특성을 갖는다.
세포(예: 인슐린 생성 세포)를 캡슐화하는 통상적인 수단은 일반적으로 알기네이트 캡슐, 셀룰로스 설페이트 캡슐 또는 하이드로겔을 포함하며, 이들 각각은 본원에서 간단하게 논의된다.
인슐린 생성 세포를 캡슐화하는데 사용된 통상적인 알기네이트 캡슐은 칼슘 또는 바륨과 같은 2가 양이온의 존재하에 인슐린 생성 세포 주위의 나트륨 알기네이트의 중합을 통해 형성된다. 이는 인슐린 생성 세포가 적소에 고정되어 있는 하이드로겔을 형성한다. 이들 하이드로겔 캡슐의 성능을 개선시키기 위한 시도는 세포 부착을 감소시키기 위해 알기네이트을 변형시키고; 투과성을 감소시키기 위해 폴리-L-리신 또는 폴리-L-오르니틴과 같은 합성 중합체로 캡슐을 코팅하고; 생체적합성을 향상시키기 위해 만누론산 또는 글루론산 단량체성 잔기의 비를 조절하고; 캡슐의 중심을 액화하기 위해 나트륨 시트레이트로 세정하는 단계를 포함한다.
인슐린 생성 세포를 캡슐화하는데 사용된 통상적인 셀룰로스 설페이트 캡슐은 셀룰로스 설페이트 및 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드)(pDADMAC)의 중합을 통해 형성된다. 이들 캡슐은 중공 코어 주위에 가요성 막으로 구성된다는 점에서 알기네이트 하이드로겔과 상이하다. 이들 캡슐은 그들의 용이한 압축성으로 인해 알기네이트 하이드로겔보다 더 취성이다. 이들 캡슐은 새롭게 제조된 캡슐의 표면 상의 미반응된 pDADMAC가 그들이 접촉할 수 있는 다른 캡슐과 비가역적으로 중합하기 때문에 제조하기가 어렵다.
통상적인 알기네이트 하이드로겔 및 셀룰로스 설페이트 캡슐은 일반적으로 600㎛ 이하의 직경을 갖는 마이크로캡슐이다. 표면 대 용적 비가 클수록 가스 및 분자의 더 빠른 확산을 허용하기 때문에 더 큰 캡슐에 비해 더 작은 캡슐이 바람직하다는 것이 일반적으로 허용된다.
이들 통상적인 마이크로-캡슐이 동물 숙주 내에 이식된 후, 대식세포 및 섬유아세포를 포함하는 숙주 세포는 캡슐의 표면에 부착된다. 이들 세포는 수주에 걸쳐 외래 캡슐 주위에 섬유성 플라크를 구성하는 세포외 매트릭스 단백질을 침착시킬 것이다. 이들 섬유종은 캡슐 내에서 세포로 및 세포로부터의 확산을 억제하여 기능 손실 및 세포사를 초래한다.
통상적인 마이크로-캡슐과 대조적으로, 개시된 매크로-캡슐은 숙주 대식세포 및 섬유아세포의 극적으로 감소된 동원 및 부착, 따라서 섬유성 플라크의 감소된 침착을 증명한다. 이러한 특성은 셀룰로스 설페이트/pDADMAC, 곤약 글루코만난 또는 곤약 글루코만난 설페이트의 높은 생체적합성, 및 매크로-캡슐 크기 및 형상의 독특한 조합의 결과이다. 따라서, 이들 캡슐 내의 세포는 장기간 또는 적어도 6개월 동안 생존하고 기능할 수 있다.
통상적인 마이크로-캡슐과 대조적으로, 개시된 매크로-캡슐은 더 큰 장막에 부착될 수 있다. 더 큰 장막에의 부착은 장막으로부터 매크로-캡슐로의 숙주 혈관 구조의 동원을 촉진시킨다. 장막 혈관 구조에의 근접성은 분비된 인자의 신속한 전신 분포를 가능하게 한다.
개시된 매크로-캡슐은 항염증성 및 항응고 특성을 갖는 탄수화물 중합체를 pDADMAC와의 중합 전에 셀룰로스 설페이트와 혼합함으로써 형성되는 적어도 하나의 장벽을 포함할 수 있다. 항염증성 항응고제의 존재는 숙주 세포의 동원 및 부착 및 섬유종의 형성을 감소시킨다. 이 과정은 장벽 막의 투과성을 증가시켜 필수적인 생물학적 분자로의 막의 확산을 허용한다. 곤약 글루코만난 또는 곤약 글루코만난 설페이트는 이러한 탄수화물 중합체의 비제한적인 예이다. 다른 예는 헤파린 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트이다.
글루코만난(즉, 곤약 글루코만난)은 곤약 식물(아모포팔루스 곤약(Amorphophallus konjac)의 뿌리로부터 채취된 중성 다당류이다. 글루코만난 설페이트는 글루코스 단량체의 유리 하이드록실 그룹에 설페이트 그룹의 화학적 참가에 의해 형성될 수 있다. 이 과정은, 예를 들어, 디메틸 포름아미드, 디메틸 설폭사이드 또는 이온성 용매 부류 중 하나와 같은 적합한 용매에서 피리딘 설페이트의 존재하에 에스테르화에 의해 달성될 수 있다. 글루코만난 설페이트 중합체는 셀룰로스 설페이트와 유사한 점도를 갖고, 저농도에서 셀룰로스 설페이트/pDADMAC 매크로-캡슐의 형성을 억제하지 않는다. 글루코만난의 변형된 형태는 당업계에 공지되어 있고(참조: 예를 들어, Reddy et al., Asian- Austr alas J. Anim. Sci., 17(2): 259-62 (2004); Chen et al., Immunol Invest., 38(7):561-71 (2009)), 따라서 본 개시의 목적을 위해, "글루코만난"은 변형되거나 변형되지 않은 글루코만난을 지칭할 수 있다.
또한, 글루코만난 및 글루코만난 설페이트는 항응고 특성을 갖는다. 본원에 제시된 바와 같이, 세포 캡슐화 매크로-캡슐로 글루코만난을 혼입하면 섬유종의 침작을 감소시킨다. 이는 매크로-캡슐의 셀룰로스 설페이트 막과 혼합될 때 섬유종의 형성을 감소시키는 글루코만난의 첫 번째 증거이다. 또한, 글루코만난은 셀룰로스 설페이트/pDADMAC 막의 다공성을 증가시켜 매크로-캡슐 장벽을 통해 적어도 20kDa의 분자의 수동적 확산을 가능하게 하는 추가의 이점을 제공한다.
따라서, 일부 구현예에서, 개시된 매크로-캡슐은 셀룰로스 설페이트 및 글루코만난을 포함하는 적어도 하나의 장벽 층을 포함한다. 일부 구현예에서, 개시된 매크로-캡슐은 셀룰로스 설페이트 및 글루코만난을 포함하는 적어도 2개의 장벽 층을 포함한다.
또한, 고밀도 세포 주위에 매크로-캡슐을 형성하는 것이 어렵다는 것이 당업계에서 인지된다. 고밀도에서, 세포 및 세포 클러스터는 막을 가로 질러 장벽의 완전성을 손상시킨다. 고밀도의 세포가 세포의 치료량을 작은 용적으로 이식할 수 있도록 하기 위해 바람직하다. 고밀도의 세포는 캐슐화 중합체 용액 1㎖당 2백만 세포 이상이다.
예를 들어, 통상적인 셀룰로스 설페이트 캡슐은 600㎛ 이하의 직경을 갖고, pDADMAC에 의해 중합된 셀룰로스 설페이트의 단일 막으로 형성된다(참조: 예를 들어, Stiegler et al., Transplant Proc, 38(9):3026-30 (2006)). 세포 밀도가 증가함에 따라, 세포가 중합 단계 동안 중합된 막 내에 놓일 가능성도 또한 증가한다. 이것이 발생하면, 그것은 면역 보호성 장벽의 장애를 초래하는 막의 결합을 생성한다.
통상적인 캡슐은 세포 및 액체 셀룰로스 설페이트 또는 액체 알기네이트의 혼합물을 중합 욕에 적하함으로써 형성된다. 세포는 액적을 통해 균일하게 분포된다. 따라서, 고밀도는 세포가 캡슐의 표면에 노출될 가능성을 증가시킨다. 본원에 기재된 원통형 형상은 세포 및 액체 알기네이트의 혼합물을 수중 무딘 말단 주사 바늘을 통해 중합 욕으로 축출시킴으로써 형성된다. 주사기 바늘을 통해 유동하는 유체의 동역학은 세포가 형성되는 원통의 중심을 향해 집중될 것임을 나타낸다. 따라서, 고밀도의 세포는 세포가 캡슐의 표면에 노출될 가능성이 낮은 이 형상 내에 캡슐화될 수 있다. 이러한 고정된 세포 주위에 형성된 제2 장벽은 실질적으로 캡슐의 표면에 노출되는 세포의 가능성을 제거한다.
개시된 매크로-캡슐은 이중 장벽 구조를 포함하고, 적어도 약 1.5mm의 직경을 갖는다. 이 설계는 매크로-캡슐의 기계적 완전성을 보장하고, 생체내에서 매크로-캡슐의 장기간 안정성을 증가시키는데 기여한다. 또한, 매크로-캡슐의 크기는 고밀도 치료 세포의 캡슐화를 허용한다.
고밀도 치료 세포는 1.5mm 이상의 직경을 갖는 매크로-캡슐 내에 캡슐화될 수 있다. 일부 구현예에서, 개시된 매크로-캡슐은 알기네이트를 포함하는 제1 장벽으로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 개시된 매크로-캡슐은 pDADMAC와 중합된 셀룰로스 설페이트를 포함하는 제1 장벽으로 구성될 수 있다. 제1 장벽은 폴리메틸렌-코-구아니딘(PMCG)으로 세정될 수 있다. 후속적으로, 셀룰로스 설페이트 및, 임의로, 글루코만난 또는 글루코만난 설페이트를 포함하는 제2 장벽은 제1 장벽 주위에서 형성될 수 있고, 임의로, 후속적으로 PMCG로 세정되어 이중-장벽 매크로-캡슐을 형성할 수 있다. 제1 장벽은 제2 장벽이 세포 및/또는 세포 파편으로부터의 간섭 없이 형성될 수 있도록 치료 세포를 직접 포함한다. 또한, 제2 장벽은 매크로-캡슐이 이식된 후 숙주와 직접 접촉하는 유일한 장벽이다.
일부 구현예에서, 개시된 매크로-캡슐은 적어도 1개, 적어도 2개 또는 적어도 3개의 장벽을 포함한다. 매크로-캡슐을 구성하는 장벽은 동일하거나 상이한 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 장벽은 셀룰로스 설페이트; 셀룰로스 설페이트 및 글루코만난; 셀룰로스 설페이트 및 글루코만난 설페이트; 나트륨 알기네이트; 셀룰로스 설페이트 및 나트륨 알기네이트; 나트륨 알기네이트 및 글루코만난 설페이트; 및/또는 셀룰로스 설페이트, 나트륨 알기네이트 및 글루코만난 설페이트로부터 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 매크로-캡슐의 이 층만이 이식 후 숙주와 직접 상호작용하기 때문에 외부 장벽만이 글루코만난 또는 글루코만난 설페이트를 포함한다. 글루코만난 또는 글루코만난 설페이트 대신에 사용될 수 있는 다른 중합체는 헤파린 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트이다.
일부 구현예에서, 개시된 매크로-캡슐은 직경이 적어도 1.5mm이다. 예를 들어, 개시된 매크로-캡슐은 약 1.5mm, 약 1.6mm, 약 1.7mm, 약 1.8mm, 약 1.9mm, 약 2.0mm, 약 2.1mm, 약 2.2mm, 약 2.3mm, 또는 약 2.4mm의 직경을 가질 수 있다. 1.5mm 이상의 직경은 숙주에의 이식 후 섬유종의 형성을 감소시킨다.
일부 구현예에서, 개시된 매크로-캡슐는 길이가 적어도 10cm이다. 예를 들어, 개시된 매크로-캡슐은 적어도 약 10cm, 적어도 약 1lcm, 적어도 약 12cm, 적어도 약 13cm, 적어도 약 14cm, 적어도 약 15cm, 적어도 약 16cm, 적어도 약 17cm, 적어도 약 18cm, 적어도 약 19cm, 적어도 약 20cm, 또는 그 이상의 길이를 가질 수 있다. 매크로-캡슐이 충분한 길이를 가지면 매크로-캡슐이 제거되어야 할 필요가 있는 경우(즉, 회복성을 증가시키는 경우) 대상체로부터 매크로-캡슐을 더 쉽게 회복할 수 있게 한다.
개시된 매크로캡슐의 크기 및 구조는 또한 매크로-캡슐이 치료적으로 유용한 수의 세포를 포함하는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, 개시된 매크로-캡슐은 적어도 약 50,000개 세포/cm, 적어도 약 60,000개 세포/cm, 적어도 약 70,000개 세포/cm, 적어도 약 80,000개 세포/cm, 적어도 약 90,000개 세포/cm, 또는 적어도 약 1000,000개 세포/cm 또는 그 이상을 함유할 수 있다.
보다 많은 세포가 필요한 일부 경우에, 개시된 매크로-캡슐은 말단-대-말단으로 결합되거나 함께 직조될 수 있다.
일부 구현예에서, 개시된 매크로-캡슐은 구형이 아니다. 바람직한 형상은 원통형 튜브이다. 원통형 튜브는 적어도 1mm의 직경을 갖고, 길이에 제한되지 않는다. 원통형 튜브는 살아있는 숙주로부터의 캡슐의 회복을 촉진시키면서 적당한 확산을 가능하게 하도록 높은 표면 대 용적 비를 갖는다. 소수의 튜브는 다수의 구형 매크로-캡슐보다 제거하기 더 쉽다. 셀룰로스 설페이트 또는 셀룰로스 설페이트 및 글루코만난 또는 글루코만난 설페이트로 이루어진 제2 장벽 막은 원통형 튜브의 물리적 완전성을 향상시켜 회복성을 향상시킨다.
구형 캡슐은 세포 및 액체 셀룰로스 설페이트 또는 액체 알기네이트의 혼합물을 중합 욕에 적하함으로써 형성된다. 세포는 액적을 통해 균일하게 분포된다. 따라서, 고밀도는 세포가 캡슐의 표면에 노출될 가능성을 증가시킨다. 본원에 기재된 원통형 형상은 세포 및 액체 알기네이트의 혼합물을 수중 무딘 말단 주사기 바늘을 통해 중합 욕으로 축출시킴으로써 형성된다. 주사기 바늘을 통해 유동하는 유체의 동역학은 세포가 형성되는 원통의 중심을 향해 집중됨을 나타낸다. 따라서, 고밀도 세포는 세포가 캡슐의 표면에 노출될 가능성이 낮은 이 형상 내에 캡슐화될 수 있다. 이러한 고정된 세포 주위에서 형성된 제2 장벽은 실질적으로 캡슐의 표면에 노출될 세포의 가능성을 제거한다.
일부 구현예에서, 기판은 스트립과 병렬 상태로 또는 스트립의 대향 측면에 복수의 관형 매크로-캡슐의 부착을 가능하게 하는 직사각형 스트립의 형상을 갖는다. 일부 구현예에서, 기판은 부착 중심 지점으로부터 방출되는 복수의 관형 매크로-캡슐의 부착을 가능하게 하는 원형이다. 일부 구현예에서, 기판의 형상은 기판을 숙주의 조직에 부착하기 위해 봉합사를 통과시키는데 유용한 탭을 갖는다. 일부 구현예에서, 기판은 숙주의 조직에 기판을 부착하기 위한 2개 이상의 탭을 갖는다.
III. 개시된 매크로-캡슐의 제조 방법
인슐린 생성 세포와 같은 치료 세포를 캡슐화하기 위한 매크로-캡슐을 보다 효율적으로 형성하는 방법이 본원에 개시된다.
치료 세포의 양을 2백만개 세포/㎖의 밀도로 셀룰로스 설페이트의 용액에 현탁시킨다. 셀룰로스 설페이트/세포 혼합물을 중합제 pDADMAC를 함유하는 완충 용액에 적하한다. 액적의 크기, 및 따라서 매크로-캡슐은 액적 발생기를 사용하여 조심스럽게 조절될 수 있다. 이 캡슐은 내부 캡슐을 나타낸다. 이 과정은 구형 캡슐을 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 치료 세포는 2백만개 세포/㎖의 밀도로 나트륨 알기네이트의 용액에 현탁시키고, 칼슘 또는 바륨과 같은 2가 양이온을 함유하는 완충된 중합 욕에 적하한다. 이 과정은 구형 하이드로겔을 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 치료 세포는 2백만개 세포/㎖의 밀도로 나트륨 알기네이트의 용액에 현탁시키고, 무딘 말단 바늘 또는 내구 직경이 1.5mm인 의료용 튜브를 갖는 주사기에 적재한다. 바늘 또는 튜브의 팁은 칼슘 또는 바륨과 같은 2가 양이온을 함유하는 완충된 중합 욕에 침지시킨다. 알기네이트/치료 세포 혼합물을 중합 욕에 주입하여 원통형 튜브 형태로 하이드로겔을 생성한다. 주입 속도는 주사기 펌프를 사용하여 조심스럽게 조절될 수 있다.
셀룰로스 설페이트로 구성된 구형 내부 캡슐, 나트륨 알기네이트로 구성된 구형 내부 캡슐 또는 나트륨 알기네이트로 구성된 원통형 튜브는 pDADMAC의 용액에 침지시키고, 증류수로 간단히 세정한다. 이어서, 내부 캡슐은 셀룰로스 설페이트 및 글루코만난의 용액에 침지시켜 외부 캡슐을 형성한다.
대안적으로, 셀룰로스 설페이트로 구성된 구형 내부 캡슐, 나트륨 알기네이트로 구성된 구형 내부 하이드로겔 또는 나트륨 알기네이트로 구성된 원통형 튜브는 셀룰로스 설페이트 및 글루코만난의 용액에 침지시킨다. 내부 캡슐 또는 튜브를 pDADMAC의 용액에 적하하여 외부 캡슐을 형성한다.
pDADMAC와 중합된 셀룰로스-설페이트를 포함하는 매크로-캡슐은 pDADMAC를 함유하는 중합 완충액을 세정한 후 접촉하게 되면 서로 강하게 부착되는 경향이 공지되어 있다. 이는 분리될 때 물리적으로 손상되는 매크로-캡슐 또는 매크로-캡슐의 응집체를 초래한다.
본원에 개시된 바와 같이, 이 응집은 각 매크로-캡슐 장벽의 중합 후 폴리메틸렌-코-구아니딘(PMCG)에 의한 순차적 세척 단계에 첨가함으로써 최소화되거나 제거될 수 있다. 예를 들어, pDADMAC에 의한 셀룰로스 설페이트의 중합 후, PMCG에 의한 순차적 세척은 매크로-캡슐 사이의 부착을 제거하여 물리적으로 손상되지 않는 개별적 매크로-캡슐을 생성한다. PMCG 중합은 추가로 매크로-캡슐 장벽의 파열 강도를 증가시키는 이점을 제공한다.
PMCG는 이전에는 막의 형성 동안 통합 중합체로서만 사용되었다(참조: Wang et al., Transplantation, 85(3): 331-7 (2008)). 대조적으로, 본원에 기재된 매크로-캡슐 설계는 PMCG를 막의 통합 부분으로서 사용하지 않지만, 대신 셀룰로스 설페이트의 노출된 비결합된 설페이트 그룹에 결합하여 이를 차지하는 코딩 물질로서 사용한다.
따라서, 일부 구현예에서, 셀룰로스 설페이트를 포함하는 매크로-캡슐을 제조하는 방법은 pDADMAC와의 중합 후에 PMCG로 매크로-캡슐을 세척하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 장벽을 포함하는 매크로-캡슐을 제조할 때, 상기 방법은 각 후속적 장벽의 중합 후 순차적인 PMCG 세척 단계를 포함할 수 있다.
캡슐이 완전히 제조된 후, 매크로-캡슐을 세정하고 세포 배양 배지로 반환시킬 수 있다.
매크로-캡슐은 매크로-캡슐을 수술용 메쉬와 접촉되도록 위치시킴으로써 수술용 메쉬의 조각에 부착될 수 있다. 셀룰로스 설페이트의 양을 첨가하여 접촉되는 매크로-캡슐 및 수술용 메쉬의 부분을 피복한다. 대안적으로, 셀룰로스 설페이트 및 글루코만난의 양을 첨가하여 접촉되는 매크로-캡슐 및 수술용 메쉬의 부분을 피복한다. pDADMAC의 중합 용액을 첨가하여 매크로-캡슐 및 수술용 메쉬를 함께 결합한다.
IV. 치료 방법
상기 주시된 바와 같이, 본원에 기재된 매크로-캡슐은 치료 세포(즉, 섬 세포 또는 인슐린 생성 세포)를 캡슐화할 수 있고, 따라서 개시된 매크로-캡슐은 이를 필요로 하는 대상체에서 당뇨병을 치료하는 방법에 유용하다. 일부 구현예에서, 대상체는 인슐린 의존성 당뇨병을 갖는 인간 대상체이다.
상기 방법은 일반적으로 본원에 개시된 매크로-캡슐에 캡슐화된 치료적 유효량의 인슐린 생성 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 이식하는 단계를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 개체에게 적어도 2개의 장벽을 포함하고 적어도 1.5mm의 직경을 갖는 매크로-캡슐에 캡슐화된 치료적 유효량의 인슐린 생성 세포를 이식하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 개체에게 외부 장벽이 (i) 셀룰로스 설페이트 및 글루코만난 또는 글루코만난 설페이트 또는 (ii) 나트륨 알기네이트로 구성된 적어도 하나의 장벽을 포함하는 매크로-캡슐에 캡슐화된 치료적 유효량의 인슐린 생성 세포를 이식하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 개체에게 알기네이트의 내부 캡슐 및 셀룰로스 설페이트 및 글루코만난 설페이트의 외부 캡슐로 구성된 원통형 튜브의 형상으로 형성된 매크로-캡슐에 캡슐화된 치료적 유효량의 인슐린 생성 세포를 이식하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 개체에게 개시된 매크로-캡슐에 캡슐화된 치료적 유효량의 인슐린 생성 세포를 1년에 약 1회, 2년에 1회, 3년에 1회, 4년에 1회, 5년에 1회 또는 그 이상 이식하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 이식된 세포는 이식 후 적어도 6개월 동안 생존할 것이다. 따라서, 일부 구현예에서, 대상체는 하나의 이식체만을 필요로 할 수 있다. 일부 구현예에서, 이식체는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개월 또는 그 이상마다 1회, 1, 2, 3, 4, 또는 5년 또는 그 이상마다 1회 또는 대상체가 재발성 고혈당증을 갖거나 당뇨병 상태로 반환될 때까지 교체될 필요가 있다.
일부 구현예에서, 캡슐화된 세포를 대상체의 더 큰 장막에 이식한다. 더 큰 장막(큰 장막, 대망(omentum majus), 위결장 장막, 대망막(epiploon) 또는 대망막(caul)으로서 공지되기도 함)은 위에서 매달려 있고, 복부 후벽에 도달하기 전에 횡행 결장으로 올라가기 위해 위의 더 큰 곡률로부터 연장되는 내장 복막의 큰 앞치마형 접힘이다. 따라서, 캡슐화된 세포는 장막으로부터 외과적으로 형성된 파우치에 이식될 수 있다.
일부 구현예에서, 캡슐화된 세포는 대상체의 장막에 부착된다. 일부 구현예에서, 캡슐화된 세포는 장막으로부터 파우치를 형성하지 않고 장막에 이식될 수 있다.
일부 구현예에서, 캡슐화된 세포는 복막강에 이식된다. 일부 구현예에서, 캡슐화된 세포는 복막강에 이식되고 장막에 고정된다. 일부 구현예에서, 캡슐화된 세포는 장막 파우치에 이식된다. 일부 구현예에서, 매크로-캡슐은 원통형 튜브이고, 일부 구현예에서, 캡슐화된 세포는 장막에 고정된 원통형 튜브의 한 말단에 의해 복막강에 이식된다.
캡슐화된 세포의 예시적인 용량은 치료될 개체의 크기 및 건강에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 개시된 매크로-캡슐에 캡슐화된 세포의 예시적인 이식체는 체중 1kg당 5백만 세포 내지 1000만 세포를 포함할 수 있다. 개시된 매크로-캡슐은 치료적 유효량의 세포, 예를 들어, 적어도 약 50,000개 세포/cm, 적어도 약 60,000개 세포/cm, 적어도 약 70,000개 세포/cm, 적어도 약 80,000개 세포/cm, 적어도 약 90,000개 세포/cm, 또는 적어도 약 1000,000개 세포/cm 또는 그 이상을 캡슐화할 수 있다.
또한, 개시된 치료 방법은 캡슐화된 치료 세포 이외에 제2 치료제의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 추가의 치료 화합물은 인슐린 주사액, 메트포르민, 설포닐우레아, 메글리티니드, 티아졸리딘디온, DPP-4 억제제, GLP-1 수용체 작용제 및 SGLT2 억제제를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
개시된 매크로-캡슐을 이식하는 단계를 포함하는 특별한 치료 섭생은 소정의 환자의 결과를 개선시킬 것인지의 여부에 따라 평가될 수 있는데, 이는 대상체의 혈당 수준을 안정화시키거나 정상화시키거나 저혈당증의 에피소드, 글리코실화된 헤모글로빈의 상승된 수준(HbAlC 수준), 심장 질환, 망막병증, 신경병증, 신장 질환, 간 질환, 치주 질환 및 비치유성 궤양을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당뇨병과 관련된 증상 또는 공동-이환의 위험 또는 발생을 감소시키는 것을 도울 것임을 의미한다.
따라서, 본 개시의 목적을 위해, 바람직한 임상적 결과를 포함하는 하나 이상의 유익하거나 목적하는 결과가 수득되면, 대상체가 치료된다. 예를 들어, 유익하거나 목적하는 임상적 결과는 당뇨병으로 인한 하나 이상의 증상을 감소시키고, 당뇨병을 앓고 있는 사람들의 삶의 질을 증가시키고, 당뇨병을 치료하는데 필요한 다른 의약의 용량을 감소시키고, 당뇨병과 관련된 합병증을 지연시키거나 예방하고/하거나 개체의 생존을 연장시키는 것 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 대상체가 일반적으로 당뇨병을 갖는 대상체인 반면, 환자의 연령은 제한되지 않는다. 개시된 방법은 모든 연령군 및 코호트에 걸쳐 당뇨병을 치료하는데 유용하다. 따라서, 일부 구현예에서, 대상체는 소아 대상체일 수 있는 반면, 다른 구현예에서, 대상체는 성인 대상체일 수 있다.
당업자는 본 개시가 목적을 수행하고, 언급된 목적 및 이점뿐만 아니라 그 안의 고유한 목적을 수득하기에 충분히 적합하다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 그 변형 및 다른 용도가 당업자에게 일어날 것이다. 이들 변형은 본 개시의 사상 내에 포함된다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공된다. 그러나, 본 발명이 이들 실시예의 특정 조건 또는 세부 사항으로 제한되지 않음이 이해되어야 한다.
실시예
실시예 1 - 매크로-캡슐화 세포의 형성 및 시험
셀룰로스의 설페이트화: 셀룰로스를 문헌(참조: Zhang et al., Cellulose, 17:427-435 (2010))에 의해 사용된 방법과 유사하게 설페이트화했다. 간단하게, 셀룰로스를 무수 디메틸 포름아미드(DMF)에 현탁시키고, DMF/아세트산 무수물/클로로설폰산의 용액과 서서히 혼합하고, 50℃에서 5시간 동안 교반시켰다. 이어서, 혼합물을 에탄올 중 무수 나트륨 아세테이트의 포화 용액에 부었다. 침전물을 원심분리하고, 에탄올 중 4% 나트륨 아세테이트로 세척했다. 침전물을 수집하고, 실온에서 15시간 동안 1M 에탄올성 수산화나트륨과 혼합했다. pH를 아세트산/에탄올의 50/50 혼합물을 사용하여 8로 조정했다. 침전물을 에탄올로 세척하고, DI 수에 용해시켰다. 용액을 0.45㎛ 필터를 통해 여과시키고, DI 수로 투석하고 동결건조시켰다.
글루코만난의 설페이트화: 글루코만난을 디메틸설폭사이드의 용액에 현탁시켰다. 피리딘 설페이트를 글루코만난 용액에 적가하고, 반응물을 2시간 동안 60℃로 상승시켰다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, pH를 수산화나트륨 용액을 사용하여 8로 조정했다. 글루코만난 설페이트를 에탄올로 침전시키고, 물에 재현탁시켰다. 용액을 48시간 동안 증류수에 대해 투석하고, 45㎛ 필터를 통해 여과시켰다.
글루코스-감지 인슐린 발현 세포의 분화: 겔트렉스(Life Technology)로 코팅된 조직 배양 접시 상의 E8 배지(Life Technology)에서 배양된 줄기 세포주(SR1423)를 0.5mM EDTA에 노출시켜 기질로부터 분리하고, 10nM Rho 키나제 억제제(Y-27632, Sigma)가 보충된 E8 배지 중 현탁 배양 접시로 옮겼다. 배양 접시를 37℃ 및 6% CO2에서 밤새 가습된 조직 배양 배양기에서 70 내지 90RPM에서 회전하는 오르비탈 진탕기 상에 위치시켰다. 형성된 클러스터를 오르비탈 진탕기로부터 제거하고, 수집하고, 0.2% 인간 혈청 알부민, 0.5X N2 보충물(Life Technology), 0.5X B27 보충물(Life Technology), 1X 페니실린/스트렙토마이신(VWR), 액티빈 A (10Ong/ml) 및 워트만닌(1nM)을 함유하는 DMEM에 재현탁시켰다. 배양 배지를 3일 또는 4일 동안 매일 변화시켰다. 클러스터를 수집하고, 0.2% 인간 혈청 알부민, 0.5X B27 보충물, 0.5X 인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충물(VWR), 1X 페니실린/스트렙토마이신(VWR), 레티노산(2uM), KGF(50ng/ml), 노긴(50ng/ml), 및 사이클로파민(250nM)을 함유하는 RPMI/F12의 50/50 용액에 재현탁시켰다. 배지를 4일 동안 매일 변화시켰다. 클러스터를 수집하고, 8mM까지의 글루코스, 0.5% 인간 혈청 알부민, 0.5X 인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충물, 1X N2 보충물, 1X 페니실린/스트렙토마이신, KGF (50ng/ml), 노긴(50ng/ml) 및 EGF(50ng/ml)가 보충된 DMEM 저 글루코스에 재현탁시켰다. 배지를 4일 동안 격일로 변화시켰다. 클러스터를 수집하고, 8mM까지의 글루코스, 0.5% 인간 혈청 알부민, 0.5X 인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충물, 1X N2 보충물, 1X 페니실린/스트렙토마이신, 노긴(50ng/ml), EGF(50ng/ml), GSiXXI(1uM), Alk5i(10uM), 및 T3(1uM)이 보충된 DMEM 저 글루코스에 재현탁시켰다. 배지를 4일 동안 격일로 변화시켰다. 클러스터를 수집하고, 8mM까지의 글루코스, 0.5% 인간 혈청 알부민, 0.5X 인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충물, 1X N2 보충물, 1X 페니실린/스트렙토마이신, 베타셀룰린(20ng/ml), 레티노산(100nM), Alk5i(10uM), 및 T3(1uM)이 보충된 DMEM 저 글루코스에 재현탁시켰다. 배지를 4일 동안 격일로 변화시켰다. 클러스터를 수집하고, 8mM까지의 글루코스, 0.5% 인간 혈청 알부민, 0.5X 인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충물, 1X N2 보충물, 1X 페니실린/스트렙토마이신, 1X 글루타맥스(Life Technology), 니코틴아미드(10mM]) BMP4(10 ng/ml), Alk5i(10uM), 및 T3(1uM)이 보충된 CMRL 1066에 재현탁시켰다.
세포 캡슐화: 1,00,000개 이상의 글루코스-감지 인슐린 발현 세포로 구성된 세포 집단을 130mM NaCl, 10mM 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산(MOPS), pH 7.4에서 1.8% 셀룰로스 설페이트/0.1% 글루코만난의 용적으로 현탁시켜 2백만개 세포/ml의 밀도를 달성했다. 셀룰로스 설페이트/글루코만난/세포 혼합물을 폴리-에틸렌으로 구성된 비점착성 표면으로 옮기고, 1% 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드)(pDADMAC), 130mM NaCl, 10mM 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산(MOPS), pH 7.4의 교반 용액에 적하시켰다. 접촉시, 셀룰로스 설페이트는 pDADMAC와 중합하여 세포 주위에 막을 직경이 2mm를 초과하는 구형 매크로-캡슐 형태로 형성한다. 매크로-캡슐을 넓은 구멍 피펫을 사용하여 수집하고, 0.3% 폴리(메틸렌 코-구아니딘)(pMCG), pH 7.4를 함유하는 pDADMAC, 130mM NaCl, 10mM MOPS의 용액으로 옮겼다. 매크로-캡슐을 수집하고, 130mM NaCl, 10mM MOPS, pH 7.4에서 2회 세정했다. 매크로-캡슐을 수집하고, pDADMAC의 1% 용액과 혼합하고, 2분 동안 교반시켰다. 매크로-캡슐을 수집하고, 증류수로 간단하게 세정했다. 이어서, 매크로-캡슐을 130mM NaCl, 10mM MOPS, pH 7.4 중 1.8% 셀룰로스 설페이트/0.1% 글루코만난의 용액에 2분 동안 침지시켰다. 매크로-캡슐을 수집하고, 130mM NaCl, 10mM MOPS, 및 0.3% 폴리(메틸렌 코-구아니딘)(pMCG), pH 7.4의 용액으로 옮겼다. 최종적으로, 매크로-캡슐을 130mM NaCl, 10mM MOPS, pH 7.4의 용액에서 4회 세정하고, 배양 배지로 옮기고, 37℃ 및 6% C02에서 가습된 배양기에서 배양했다.
이 공정은 인슐린 발현 세포를 함유하는 내부 막 및 내부 막과 밀접하게 연관되는 외부 막으로 구성된 매크로-캡슐을 형성했다(도 1a). 글루코만난으로 형성된 막은 표면에 숙주 세포의 축적을 제한하여 섬유증을 억제한다(도 1).
또 다른 예에서: 1,000,000개 이상의 글루코스-감지 인슐린 발현 세포로 구성된 세포 집단을 130mM NaCl, 10mM 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산(MOPS), pH 7.4에서 2% 나트륨 알기네이트의 용적으로 현탁시켜 2백만개 세포/ml의 밀도를 달성했다. 알기네이트/세포 혼합물을 내부 구멍 크기 1mm를 갖는 주사기로 옮기고, 20mM BaCl, 10mM MOPS, 10OmM 만니톨, pH 7.4의 욕에 분배하여 하이드로겔을 원통형 튜브 형태로 생성했다. 튜브형 매크로-캡슐을 넓은 구멍 피펫으로 수집하고, 130mM NaCl, 10mM MOPS, pH 7.4로 2회 세정했다. 매크로-캡슐을 수집하고, pDADMAC의 1% 용액과 혼합하고 2분 동안 교반시켰다. 매크로-캡슐을 수집하고, 간단하게 증류수로 세정했다. 이어서, 매크로-캡슐을 130mM NaCl, 10mM MOPS, pH 7.4 중 1.8% 셀룰로스 설페이트/0.1% 글루코만난 설페이트의 용액에 2분 동안 침지시켰다. 최종적으로, 매크로-캡슐을 130mM NaCl, 10mM MOPS, pH 7.4의 용액에서 4회 세정하고, 배양 배지로 옮기고, 37℃ 및 6% CO2에서 가습된 배양기에서 배양했다(도 1 및 2).
캡슐 투과성. 매크로-캡슐의 투과성은 규정된 분자량의 FITC-접합된 덱스트란 중합체의 존재하에 1시간 동안 배양하여 결정했다. 1시간 후, 덱스트란 용액을 매크로-캡슐의 외부로부터 세정했다. 캡슐 막을 가로 질로 수동적으로 확산될 수 있는 FITC-덱스트란은 세정 및 형광 동안 캡슐 내에 잔류한다. 글루코만난 없이 셀룰로스 설페이트로부터 형성된 이중 층 매크로-캡슐은 20kDa 덱스트란에 투과성이 아니었다. 셀룰로스 설페이트 및 글루코만난의 혼합물로부터 형성된 이중 층 매크로-캡슐은 20kDa FITC-덱스트란에는 투과성이었지만, 70 kDa 덱스트란에는 투과성이 아니었다(도 3).
인슐린 의존성 당뇨병의 랫트 모델: 적어도 8주령 및 적어도 200g 체중의 면역 적격성 스프라그-다우리 랫트를 2 내지 6시간 동안 단식시키고, I.V.를 통해 꼬리 정맥으로 60-65mg/kg 스트렙토조토신을 투여했다. 동물은 3일 연속 >300 mg/dl의 비공복 글루코스 수준을 입증한 경우, 당뇨병으로 간주했다. 글루코스 수준은 인슐린 서방출 펠렛(Linplant; Linshin, Scarborough, Canada)의 피하 이식에 의해 고혈당증을 확인한 후 안정화되었다. 꼬리 찌름 또는 측면 복재 정맥을 통해 혈액 1방울을 수집하여 글루코스를 모니터링하고, 휴대용 글루코스 측정기에 적용했다.
랫트에 캡슐/세포의 생착. 복부 중선 피부 절개를 상복부에서 수행했다. 복벽은 거즈심을 넣어 벌려 두고, 직근 복부 중앙선에서 예리하게 절개했다. 복부에 접근하였고, 장막을 단리하고 외부화하였다. 구형 매크로-캡슐을 2개의 얇은 겔폼 시트 사이에 위치시키고, 장막 중심에 위치시켰다. 장막의 단리 부분의 모서리를 이식편 위에서 접어 파우치를 생성한 다음, 봉합사로 봉합했다. 장막 파우치를 복강에 다시 위치시키고, 복부 절개부에 이어, 피부를 수술 스테이플을 사용하여 봉합하였다.
랫트의 복막에 비구형 튜브형 캡슐의 생착. 진피 및 복벽을 통해 복부 절개를 수행했다. 튜브형 매크로-캡슐을 넓은 구멍 피펫에 도입했다. 피펫을 복막강에 도입하고, 매크로-캡슐을 서서히 배출시켰다. 복벽 및 진피를 봉합사로 봉합했다.
랫트의 장막에 고정된 비구형 튜브형 캡슐의 생착. 진피 및 복벽을 통해 복부 절개를 수행했다. 장막의 일부를 외부화하였다. 매크로-캡슐에 부착된 수술용 메쉬 조각은 장막 위에 놓였다. 봉합사가 메쉬를 장막에 접합했다. 튜브형 매크로-캡슐 및 장막의 외부화된 부분을 복막으로 다시 도입했다. 복벽 및 진피를 봉합사로 봉합했다.
혈당 조절: 스트렙토조토신으로 처리하여 당뇨병을 앓게 된 면역 적격 랫트는 인슐린 생성 세포를 함유하는 매크로-캡슐의 장막 이식 후 정상혈당증을 회복했다(도 4).
매크로-캡슐의 외식: 랫트를 케타민으로 진정시킨 후 염화칼륨을 심장내 주사하여 안락사시켰다. 매크로-캡슐을 함유하는 장막 파우치를 절제했다. 대안적으로, 원통형 매크로-캡슐의 장막에의 부착을 가위로 절단하고, 매크로-캡슐을 제거하였다. 외식편의 형태 및 혈관화의 증거를 촬영하였다(도 6). 외식편을 PBS로 세정하고, Live/Dead cell staining kit (Biovision)를 사용하고 제조업자 지침에 따라 생존 세포와 죽은 세포를 염색했다(도 7). 외식된 매크로-캡슐을 4% 포르말린에서 보존시켰다. 매크로-캡슐을 최적의 절단 온도 화합물(OCT)에 매립시키고, 동결시키고, 크라이오톰(cryotome)으로 10㎛ 두께로 절단했다. 박편을 현미경 슬라이드에 적용하고, 인슐린 및 콜라겐 1의 발현을 위해 표준 면역조직화학 기술을 사용하여 염색했다. 매크로-캡슐은 매크로-캡슐의 표면에 얇은 막 부착만을 나타냈다(도 8a). 매크로-캡슐은 생존가능한 인슐린 발현 세포의 클러스터를 함유했다(도 8b; 또한 도 5 참조).
실시예 2 - 개시된 캡슐화 세포로 당뇨병 치료
이 실시예는 인간 성인에서 타입 I 당뇨병을 치료하기 위해 본원에 기재된 매크로-캡슐화된 세포를 사용하는 방법을 예시한다.
인슐린 의존성 당뇨병을 갖는 성인 인간 대상체는 개시된 매크로-캡슐화된 섬 세포를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 포함하는 이식체를 장막에 부착된 대상체의 장막 파우치에 또는 복막강에 수용한다. 대상체는 혈당 수준에 대해 평가된다. 대상체는 치료적으로 유효한 수의 매크로-캡슐화된 세포의 이식 후 모니터링하여 대상체의 혈당 수준이 안정화되었음을 보장했다. 대상체는 글리코실화된 헤모글로빈 및 경시적인 당뇨병의 공동-이환에 대해 추가로 스크리닝된다.

Claims (49)

  1. 복수의 췌장 섬 세포 또는 인슐린 생성 세포를 포함하는 원통형의 매크로-캡슐(macro-capsule)을 포함하는 조성물로서, 매크로-캡슐은 복수의 췌장 섬 세포 또는 인슐린 생성 세포를 포함하는 제1 장벽(barrier), 제2 장벽 및 코팅층을 포함하고,
    제1 장벽은
    (a) 셀룰로스 설페이트 및 글루코만난 또는 글루코만난 설페이트; 또는
    (b) 나트륨 알기네이트를 포함하고;
    제2 장벽은 셀룰로스 설페이트 및 글루코만난 또는 글루코만난 설페이트를 포함하고; 및
    코팅층은 폴리메틸렌-코-구아니딘(PMCG)을 포함하고;
    원통형의 매크로-캡슐은 적어도 1.5mm의 직경을 보유하고, 및
    원통형의 매크로-캡슐은 적어도 20 kDa의 분자량을 가진 분자의 수동적 확산은 가능하게 하지만, 70 kDa의 분자량을 가진 분자의 투과는 가능하게 하지 않는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 매크로-캡슐은 적어도 약 11cm의 길이를 보유하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 매크로-캡슐은 적어도 약 50,000개 세포/cm를 함유하는 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 매크로-캡슐의 직경은 적어도 2.0 mm인 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 장벽 둘 모두는 셀룰로스 설페이트 및 글루코만난 설페이트를 포함하는 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 장벽은 나트륨 알기네이트를 포함하는 조성물.
  7. 당뇨병의 치료를 필요로 하는 대상체에서 당뇨병을 치료하는 방법에 사용하기 위한 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 조성물로서, 상기 방법은 당뇨병을 갖는 대상체에게 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 이식하는 단계를 포함하는 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 대상체는 성인인 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 대상체는 어린이인 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 대상체는 타입 I 당뇨병을 갖는 조성물.
  11. 제7항에 있어서, 대상체는 타입 II 당뇨병을 갖는 조성물.
  12. 제7항에 있어서, 조성물은 대상체의 장막(omentum) 또는 복막강(peritoneal cavity)에 이식 가능한 조성물.
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