KR20160083027A

KR20160083027A - 용출 매트릭스 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20160083027A
Application number: KR1020167014346A
Authority: KR
Inventors: 마크 씨. 포즈난스키; 타오 첸
Original assignee: 더 제너럴 하스피탈 코포레이션
Priority date: 2013-11-07
Filing date: 2013-11-07
Publication date: 2016-07-11
Also published as: IL245121A0; JP6538042B2; RU2016120644A; EP3065701A1; CN105705136A; AU2013404939A1; CA2940756A1; EP3065701A4; ZA201602662B; AU2013404939B2; WO2015069256A1; JP2016539101A; RU2665359C2; BR112016010191A2; MX2016005507A; EP3065701B1

Abstract

자가면역 질환 치료용의, 하나 이상의 세포를 캡슐화하는 CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스가 기재되어 있다.

Description

용출 매트릭스 및 이의 용도 {ELUTING MATRIX AND USES THEREOF}

이식(transplantation)은 타입 I 당뇨병(T1DM)과 같은 자가면역 질환을 갖는 개체를 위한 잠재력있는 치유 접근법이나, 그 효용성은 이식된 세포의 급성 및 만성 면역거부반응에 의해 제한된다(N. Papeta et al. Transplantation 83, 174 (Jan 27, 2007); A. M. Shapiro et al. The New England journal of medicine 355, 1318 (Sep 28, 2006); J. S. Kaddis et al. JAMA 301, 1580 (Apr 15, 2009); R. P. Robertson. The New England journal of medicine 350, 694 (Feb 12, 2004); R. B. Jalili et al. Diabetes 59, 2219 (Sep, 2010); and V. Vaithilingam, The review of diabetic studies: 7, 62 (Spring, 2010)). 면역거부반응은 현재 뚜렷한 장기간 효과를 보이지 않는 반면 수용체가 감염 및 암의 증가된 위험에 노출되는 접근법인 연속적 전신 면역 억제에 의해 관리되고 있다(A. G. Mallett, G. S. Korbutt. Tissue engineering. Part A 15, 1301 (Jun, 2009); N. Sakata et al. World journal of gastrointestinal pathophysiology 3, 19 (Feb 15, 2012); M. C. Poznansky et al. The Journal of clinical investigation 109, 1101 (Apr, 2002); and M. C. Poznansky et al. Nature medicine 6, 543 (May, 2000)). 국소 해부 부위 특이적 면역 조절의 유도를 통한 전신 면역억제 필요성을 극복할 수 있는 대안적 치료가 바람직할 것이다.

CXCL12 폴리펩타이드는 효과기(effector) T 세포를 밀쳐내는 반면, 면역억제성 조절 T 세포를 해부 부위에 채용할 수 있다. CXCL12는 부위 특이적 방식으로 주입(implant)된 매트릭스의 급성 및 만성 면역 파괴를 둘 다 극복할 수 있고, 동시에 발생하는 전신 면역 억제에 대한 필요성을 없앨 수 있다.

한 양태에서, 본원은 CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스로 캡슐화된 하나 이상의 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

몇몇 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스는 효과기 T 세포를 밀쳐내기에 충분한 속도로 CXCL12 폴리펩타이드를 방출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스는 약 1.0ng/mL/hr 이상의 속도로 CXCL12 폴리펩타이드를 방출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드는 CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스로부터 약 1.5ng/mL/hr 이상, 약 2ng/mL/hr 이상, 약 2.5ng/mL/hr 이상, 약 3ng/mL/hr 이상, 약 4ng/mL/hr 이상, 약 5ng/mL/hr 이상 또는 이를 초과하는 속도로 방출될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드는 약 1.0ng/mL/hr 내지 약 3ng/mL/hr의 속도로 방출될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드는 약 1.75ng/mL/hr의 속도로 방출될 수 있다. 단지 예로서, 본원에 기재된 조성물은 보이든 챔버(boyden chamber) 내에서 시험관내(in vitro) 효과기 T 세포를 밀쳐내는 능력을 특징으로 할 수 있다.

CXCL12 폴리펩타이드는 용출 매트릭스 내에 임의의 농도로 존재할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드의 농도는, 예를 들어, 상기 용출 매트릭스로부터의 CXCL12 폴리펩타이드의 바람직한 용출 속도 및/또는 이의 방출 시간에 대해 최적화될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드는 상기 매트릭스 내에 약 100ng/mL의 농도로 존재할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드는 상기 매트릭스 내에 약 100ng/mL 내지 약 1㎍/mL의 농도로 존재할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 용출 매트릭스 내의 CXCL12 폴리펩타이드의 농도는 약 3개월 내지 약 2년 동안 약 100ng/mL 내지 약 1㎍/mL의 농도로 유지될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 용출 매트릭스 내의 CXCL12 폴리펩타이드의 농도는 상기 조성물을 대상체에 주입한 경우 약 3개월 내지 약 2년 동안 약 100ng/mL 내지 약 1㎍/mL의 농도로 유지될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 매트릭스 내의 CXCL12 폴리펩타이드의 유지된 농도는 약 100 내지 200ng/mL일 수 있다.

CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스를 생성시키기 위해, CXCL12 폴리펩타이드를 용출 매트릭스에 미리 부하하거나 용출 매트릭스내 동일 반응계에서 생산할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스 내의 CXCL12 폴리펩타이드는 CXCL12 폴리펩타이드 분비 세포 또는 CXCL12 폴리펩타이드를 분비하도록 가공된 세포에 의해 제공될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 매트릭스 내의 CXCL12 폴리펩타이드는 상기 매트릭스 내의 섬세포(islet cell)에 의해 제공될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 상기 용출 매트릭스에 존재하는 CXCL12 폴리펩타이드는 치료될 대상체의 종을 기초로 한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드는 사람 CXCL12 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.

CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스는 다양한 매트릭스 구조를 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스는 캡슐을 형성할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스는 고체 또는 발포체 매트릭스 형태일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스는 다중-구획(multi-compartment) 또는 다층 매트릭스를 생성시킬 수 있다. 이들 실시양태에서, 상기 세포(들) 및 CXCL12 폴리펩타이드는 CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스의 같거나 다른 구획 또는 층에 존재할 수 있다.

CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스의 두께는 다양한 적용 요구에 맞도록 변할 수 있다. 단지 예로서, CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스의 두께는 용출 매트릭스로부터의 CXCL12 폴리펩타이드의 빠른 방출 또는 느린 방출을 위해 조정될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 매트릭스의 두께는 약 200 내지 약 500㎛일 수 있다.

CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스로 캡슐화된 상기 세포(들)는 임의의 공급원, 임의의 종 및/또는 임의의 조직 종류로부터 회수되거나 유래될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스로 캡슐화된 상기 세포(들)는 줄기 세포로부터 특정한 세포 종류로 분화될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스로 캡슐화된 상기 세포(들)는 자가조직일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스로 캡슐화된 상기 세포(들)는 동종이계(allogeneic) 세포(들) 또는 이종(xenogeneic) 세포(들)일 수 있다.

몇몇 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스로 캡슐화된 상기 세포(들)는 이들의 기능 및/또는 활성을 바람직한 기간 동안, 예를 들어, 대상체에 상기 조성물의 주입시, 유지할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포(들)는 이들의 기능 및/또는 활성을 적어도 약 1개월 또는 그 보다 길게, 예를 들어, 적어도 약 2개월, 적어도 약 3개월 또는 그 보다 길게 유지할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포(들)는 이들의 기능 및/또는 활성을 대상체에 본원에 기재된 조성물이 주입된 후 적어도 약 1개월 동안 또는 그 보다 길게 유지할 수 있다.

CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스로 캡슐화된 세포의 종류에 따라, 상기 세포는 상이한 기능 및/또는 활성을 수행할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스로 캡슐화된 상기 세포(들)는 대상체의 혈당 수준을 조절할 수 있다. 예를 들어, 주입시 XCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스로 캡슐화된 상기 세포(들)는 주위 또는 주변의 포도당 수준에 반응하여 인슐린을 방출할 수 있다. 이들 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스로 캡슐화된 상기 세포(들)는 섬세포를 포함할 수 있다. 섬세포는 인슐린 생산 세포, iPS(induced pluripotent stem) 세포로부터 유래된 섬세포, 돼지 섬세포, 사람 섬세포 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.

몇몇 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스로 캡슐화된 상기 세포(들)는 제거될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포(들)는 CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스로 생체내(in vivo) 제공될 수 있다.

CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스는 적어도 하나 이상의 생체적합성 생체중합체를 포함할 수 있다. 생체적합성 중합체는 생분해성 또는 비분해성일 수 있다. 생체적합성 중합체는 탄수화물계, 단백질계 및/또는 합성된 것일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 생체적합성 중합체는 이들이 캡슐화된 세포에 불활성이고(예를 들어, 세포 신호화의 자극 또는 억제가 없는) 용출될 CXCL12 폴리펩타이드에 투과되고 임의로 감작화될 표적 분자에 투과되도록 선택될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 생체적합성 중합체는 상기 용출 매트릭스의 평균 공극 크기가 약 130kD 보다 큰 분자는 제외시키도록 선택될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스는 알기네이트 겔을 포함할 수 있다. 알기네이트 겔은 마누론산(M) 및 굴루론산(G)을 각각의 용도에 특별한 성질을 얻도록 선택된 (M/G) 비로 포함할 수 있다. (M/G) 비에 의해 최적화될 수 있는 알기네이트 겔의 예시적 성질은 분자량 컷오프, 기공도, 공극 크기, 겔 강도 및/또는 CXCL12 폴리펩타이드의 방출 프로파일을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다.

몇몇 실시양태에서, 알기네이트 겔은 마누론산을 높은 함량으로 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 겔은 마누론산(M) 및 굴루론산(G)을 약 1 또는 1 초과의 (M/G) 비로 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 겔의 농도는 약 1% w/v 내지 약 5% w/v로 변할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 겔의 농도는 약 2% w/v일 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 CXCL12 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 세포의 층을 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드 발현 세포는 중피세포를 포함할 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 상기 용출 매트릭스 위에 CXCl12 폴리펩타이드의 흡수층을 추가로 포함할 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 상기 조성물은 주사용 조성물로 제형화될 수 있다.

다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 질환 또는 장애의 치료를 위해 대상체의 표적 부위에 주입되거나 주사될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 조성물은 CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스로 캡슐화된 하나 이상의 섬세포를 포함할 수 있다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 예를 들어, 당뇨병 치료용 조성물은 CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스로 캡슐화된 동종이식편 또는 이종이식편 섬세포를 포함하는 조성물로서 특징지을 수 있고, 여기서 상기 매트릭스는 (a) 200 내지 500㎛의 매트릭스 두께, 및 약 100ng/ml 내지 약 1㎍/ml의 매트릭스 내의 CXCL12 폴리펩타이드의 농도; (b) 타입 I 당뇨병을 갖는 대상체에서의 혈청 포도당 농도를 조절하는 작용제가 매트릭스를 통해 확산되도록 하는 기공도; 및 (c) 상기 작용제와 섬세포와의 상호작용을 기초로 한 상기 섬세포에 의한 인슐린 생산(인슐린은 상기 매트릭스를 통해 대상체에서의 혈청 포도당 농도 또는 혈당 수준을 조절하기에 충분한 속도로 방출된다)을 특징으로 한다. 상기 매트릭스 두께, CXCL12 농도 및/또는 용출 속도는 적어도 약 4개월 또는 약 4개월까지의 기간 동안 상기 섬세포의 붕해를 억제하도록 조절될 수 있고, 이에 의해 상기 기간 동안 상기 대상체에서의 혈당 수준의 조절이 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 매트릭스 두께, CXCL12 농도 및/또는 용출 속도는 약 6개월 또는 그 보다 긴 기간 동안 상기 섬세포의 붕해를 억제하도록 조절될 수 있다.

다른 양태에서, 섬세포를 이를 필요로 하는 대상체에 제공하는 방법이 또한 본원에 기재되어 있다. 상기 방법은 본원에 기재된 조성물 중 하나 이상의 실시양태를 대상체에 주입하는 것을 포함하고, 상기 섬세포는 일정 기간 동안 대상체에서 혈당을 조절한다. 단지 예로서, 대상체에 주입시, CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스로 캡슐화된 상기 섬세포는 적어도 약 1개월 또는 그 보다 긴 기간 동안, 예를 들어, 적어도 약 2개월, 적어도 약 3개월, 적어도 약 6개월, 적어도 약 9개월, 적어도 약 1년, 적어도 약 2년 또는 그 보다 긴 기간 동안 대상체에서 혈당을 조절할 수 있다.

몇몇 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스로 캡슐화된 상기 섬세포는 대상체의 공복 혈청 포도당 농도를 약 80mg/dl 내지 120mg/dl의 혈액 수준으로 유지시키거나 회복시킬 수 있다.

몇몇 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스는 효과기 T 세포 또는 대식세포에 의해 붕해되지 않는다.

몇몇 실시양태에서, 조절 T 세포가 주입 부위에 존재할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 효과기 T 세포가 주입 부위에 부재할 수 있다. 단지 예로서, 조절 T 세포의 존재 또는 효과기 T 세포의 부재는 유동 세포분석법 또는 면역조직화학으로 측정할 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 대상체에 CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스로 캡슐화된 하나 이상의 섬세포 세포를 포함하는 조성물을 반복 주입할 수 있다.

본원에 기재된 추가 양태는 섬세포 보충이 필요한 현존하는 이종이식편 섬세포 침착물을 갖는 대상체에서 섬세포를 보충하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 대상체에 현존하는 섬세포의 반감기를 재고; (b) 상기 섬세포의 집계된 반감기가 일정 기간 동안 상기 대상체에서의 혈당 조절을 제공하기 위한 치료적 수준이도록 섬세포를 대상체에 제공하고; (c) 상기 섬세포의 반감기를 기초로 단계 a) 및 b)를 반복하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 대상체에 현존하는 섬세포의 반감기는 대상체의 혈당 수준 변화를 모니터링함으로써 평가하거나 추정할 수 있다. 예를 들어, 당뇨병 상태로의 혈당의 회귀는 대상체에 섬세포를 보충할 필요성에 대한 암시일 수 있다.

CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스를 포함하는 조성물이 또한 본원에 제공된다. 상기 매트릭스는 (a) CXCL12 폴리펩타이드가 상기 조성물로부터 서서히 용출되고 자가면역 질환의 활성 부위를 통과하도록 하는 기공도; (b) 투여된 후 상기 조성물이 이동되지 않게 만들어 상기 매트릭스의 상당한 부분이 상기 조성물의 투여 부위 및 투여 부위 부근에 위치하도록 하는 작용제를 특징으로 하고; CXCL12 폴리펩타이드 농도 및 용출 속도는 상기 자가면역 질환의 추가 발달을 억제하도록 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 주사로 투여될 수 있다. 이들 실시양태에서, 상기 조성물은 주사용 조성물로 제형화될 수 있다.

본 발명의 다른 특징 및 이점이 발명의 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 다른 양태들을 아래에 기재하고 이들은 본 발명의 범위 내에 있다.

실시예를 통해 제시된 아래의 상세한 설명은, 본 발명을 특정 실시양태로 제한할 의도가 아니며, 본원에 참고로 도입된 첨부된 도면과 함께 이해될 수 있다.
도 1a 내지 1d는 고농도의 CXCL12로 동종이식편 섬을 피복하면 거부가 지연됨을 보여준다. 도 1a는 이식후 동종이식편 섬의 비율의 생존 곡선이다. BALB/C 섬을 약 100ng/ml 및 약 1㎍/ml 농도의 CXCL12 또는 PBS 단독에 노출시키고 6마리의 수용체에 STZ 처리된 당뇨병 C57BL의 신장 캡슐 밑에 이식하였다. 고혈당증으로의 복귀는 이식거부반응의 암시로 간주되는 반면, 지속되는 정상혈당은 동종이식편 생존으로 간주되었다. 섬을 약 1㎍/ml(100ng/ml은 아님)의 CXCL12로 코팅한 결과 PBS 대조군에 비해 이식거부반응이 유의적으로 지연되었다(p= 0.012, 로그 랭크 시험(log-rank test))(그룹당 12마리의 동물). 도 1b는 동종이식편 섬의 특징이 되는 이미지 세트이다. 피막하 섬 이식편 부위의 대표적인 헤마톡실린 및 에오신(H & E) 염색은 ~1㎍/ml CXCL12 섬에서의 단핵 세포 침윤이 코팅되지 않은 대조군(왼쪽 패널)에 비해 감소되었음을 보여주었다. ~1㎍/ml CXCL12 및 PBS 코팅된 섬 이식편 부위의 인슐린 염색은 대조군(가운데 패널)에 비해 CXCL12 코팅된 섬에서 더 많은 수의 기능적 섬 및 인슐린 분비 수준을 보였다. 추가로, 형광 염색은 대조군(오른쪽 패널)에 비해 CXCL12 코팅된 섬에서 CXCL12 염색의 증거를 보여주었다. CXCL12 및 인슐린의 공동 염색은 보다 밝은 색상으로 나타난다. 도 1c는 CD3 면역염색을 기초로 섬 이식편에 존재하는 CD3+ 세포의 수를 정량화한 막대 그래프이고, CD3+ 세포의 ~1㎍/ml CXCL12 코팅된 이식편에서의 이식 영역으로의 침윤이 코팅되지 않은 대조군(그룹당 6마리의 동물)에 비해 유의적으로 감소됨을 보여준다(p= 0.001). 도 1d는 FoxP3 염색을 기초로 섬 이식편에 존재하는 FoxP3+ 세포의 수를 정량화한 막대 그래프이고, 1㎍/ml CXCL12 코팅된 이식편으로의 FoxP3+ 세포 국소화가 PBS 대조군(n= 6)보다 유의적으로 더 크다는 것을 보여준다(p= 0.0016).
도 2a 내지 2c는 CXCL12 코팅된 동종이계의 섬을 사용한 저용량 CsA 처리가 이식편 생존을 증가시키지 않음을 보여준다. 도 2a는 CXCL12 코팅되거나 코팅되지 않은 섬을 이식하고 CsA 처리를 하거나 하지 않은 후의 비당뇨병으로 남아 있는 마우스 비율의 생존 곡선이다. CXCL12 코팅과 CsA 처리를 조합한 경우 이식 후 23일에 이식편 생존이 유의적으로 감소하였다(p = 0.0245, 로그 랭크 시험). 도 2b는 각각의 연구 조건에서 CD3, FoxP3 및 인슐린에 대한 면역조직화학 염색의 이미지 세트이다. 염색은 도 2a에 도시한 생존 데이터와 일치하였고, 감소된 CD3+ 및 증가된 FoxP3+ 세포 침윤 뿐만 아니라 CXCL12 + CsA 섬에 비해 CXCL12 코팅된 섬에서의 인슐린이 더 많이 발현됨을 보여주었다. 도 2c는 3가지의 연구 조건 각각에서 섬 이식편에서의 CD3+ 및 FoxP3+ 세포의 수를 정량화한 막대 그래프이다. CXCL12 코팅 단독에 비해 유의적으로 감소된 수의 FoxP3+ 세포(p= 0.0188) 및 증가된 수의 CD3+ 세포(p= 0.0002)가 CXCL12 + CsA 이식편에서 관찰되었다.
도 3a 내지 3c는 CXCL12 코팅이 C57BL/6 특이적 CD4 T 세포의 수에 영향을 미치지 않음을 보여준다. BALB/c 섬 이식 후 10일에 C57BL/6 마우스에서 비장을 제거하고, 1mM BrdU의 존재하에 비장세포를 미토마이신-C 처리된 BALB/c 비장세포로 자극하였다. 이어서 세포를 BrdU의 도입에 대해 염색하였다. 도 3a는 음성 염색 대조군(음영부)과 비교한 비장세포 내의 BrdU의 도입을 보여준다. 도 3b는 코팅되지 않은 섬(선) 및 CXCL12 코팅된 섬(음영부)을 투여받은 마우스로부터의 CD4 T 세포로의 BrdU의 도입에 차이가 없음을 보여준다. 도 3c는 각각의 마우스 그룹에서 비장당 알로 특이적(allo-specific) CD4 T 세포의 평균 수를 보여주고 CXCL12 코팅된 섬이 동종이계 조직(n= 3)에 대한 전신 면역 반응을 조절하지 않음을 나타내는 막대 그래프이다.
도 4a 내지 4c는 STZ 처리된 당뇨병 NOD/LtJ 마우스의 신장 캡슐 밑에 이식된 NOD/LtJ 마우스 동계 섬의 CXCL12 코팅 또는 PBS 노출의 실험 데이터를 나타낸다. 도 4a는 이식 후 비당뇨병으로 남아 있는 마우스 비율의 생존 곡선이고; CXCL12 코팅된 섬과 PBS 노출된 섬 사이에 유의적 차이가 있고(로그 랭크 시험, p= 0.017), 이는 이식된 동계 CXCL12 코팅된 섬의 장기 생존 및 기능을 가리킨다. 도 4b는 섬 이식편에서의 CD3+의 수를 정량화하는 막대 그래프이고, CXCL12 코팅된 섬 이식편으로의 CD3+ 세포의 침윤이 유의적으로 감소되었음을 보여준다(p= 0.0081). 도 4c는 섬 이식편에서의 FoxP3+의 수를 정량화하는 막대 그래프이고, PBS 노출된 섬에 비해 CXCL12 코팅된 섬으로의 FoxP3+ 세포의 국소화가 유의적으로 증가되었음을 보여준다(p= 0.0019).
도 5a 내지 5d는 자발적 당뇨병 NOD/LtJ 마우스의 신장 캡슐 밑에 이식된 NOD/LtJ 마우스 동계 섬의 CXCL12 코팅 또는 PBS 노출의 실험 데이터를 나타낸다. 도 5a는 이식 후 비당뇨병을 유지시키는 마우스 비율의 생존 곡선으로서, CXCL12 코팅된 섬과 PBS 노출된 섬 사이에 유의한 차이는 없었다(로그 랭크 시험, p= 0.24). 도 5b는 1㎍/ml CXCL12로 코팅된 섬 이식편으로의 단핵 세포 침윤이 감소된 것을 보여주는 H & E 염색의 이미지 세트(왼쪽 패널) 및 CXCL12로 코팅된 이식편에서의 두 단백질의 증가된 수준을 보여주는, 인슐린 및 CXCL12에 대한 면역형광 염색의 이미지 세트(오른쪽 패널)이다. 도 5c는 섬 이식편에서의 CD3+ 세포의 수를 정량화한 막대 그래프이고, 생존에는 차이가 없으나 CXCL12로 코팅된 섬 이식편으로의 CD3+ 세포의 침윤이 유의적으로 감소하였음을 보여준다(p= 0.0015). 도 5d는 섬 이식편에서의 FoxP3+ 세포의 수를 정량화한 막대 그래프이고, CXCL12로 코팅된 섬에 대한 FoxP3+ 세포의 국소화가 PBS 노출된 섬에 비해 유의적으로 증가하였음을 보여준다.
도 6a 내지 6f는 Ca-LVM 알기네이트 캡슐로의 CXCL12의 도입이 복막강으로 이식된 동종이계 및 이종 섬의 거부반응을 지연시킴을 보여준다. 도 6a는 시험관내에서 시간에 따른 세포 비함유 칼슘 가교결합된 ~3.3% 알기네이트 캡슐재로부터의 CXCL12 방출 키네틱을 보여주는 선그래프이다. 비가교결합된 나트륨 알기네이트 중의 CXCL12의 농도는 1㎍/ml이었고; CXCL12의 유의한 양이 CaCl₂ 가교결합 용액(n= 3)에서 소실되었다. 1.5% 내지 3.3%의 알기네이트 농도에 대한 CXCL12 방출 프로파일에는 차이가 없었다(데이터는 표시하지 않음). 처음 24시간 동안 1.5% 알기네이트 캡슐로부터의 CXCL12의 초기 방출 속도는 1.75ng/ml/hr±0.01ng/ml/hr이었고, 4일 후 0.18ng/ml/hr±0.002ng/ml/hr의 방출 속도로 안정화되었다. 도 6b는 CXCL12 및 바륨 가교결합된 알기네이트 캡슐 사이의 정전 상호반응을 보여주는 막대 그래프이다. 왼쪽 패널은 NaCl의 부재하에서의 배양에 비해 1M NaCl과의 배양 후 비드에 유의적으로 더 낮은 양의 CXCL12가 잔류됨을 보여준다. 오른쪽 패널은 NaCl 비함유 배지에서의 배양에 비해 1M NaCl과의 배양 후 배지에 유의적으로 더 많은 양의 CXCL12가 용출됨을 보여준다(n= 3, *p< 0.05). 도 6c는 CXCL12 도입이 캡슐화된 쥐과 섬에서 카스파제-3 활성을 현저히 감소시킴을 보여주는 카스파제-3 활성의 막대 그래프이다(대조군에 대해 ~100ng/ml CXCL12의 경우 p= 0.0019 및 ~1㎍/ml CXCL12의 경우 p= 0.00028). 쥐과 섬을 Ca-LVM, 또는 ~100ng/ml 또는 ~1㎍/ml의 CXCL12를 도입한 Ca-LVM(Ca-LVM-CXCL12)으로 캡슐화한 다음, 시험관내에서 48시간 동안 배양한 후, 카스파제-3 활성을 측정하였다. 도 6d는 이식 후 동종이식편 섬의 비율을 보여주는 생존 플롯이다. 1㎍/ml CXCL12의 Ca-LVM 캡슐재로의 도입은 두 그룹 모두에서 동종이계 섬(n= 12)의 거부반응을 지연시킨다(p= 0.0237, Gehan-Breslow-Wilcoxon 시험). 도 6e는 이식 후 동종이식편 섬의 비율을 보여주는 생존 플롯이다. ~1㎍/ml CXCL12의 도입이 또한 알로 감작화된(all0-sensitized) NOD/LtJ 마우스로 이식된 캡슐화된 동종이계 섬의 거부반응을 지연시킨다(Ca-LVM 캡슐, n= 7; Ca-LVM-CXCL12 캡슐, n= 9; p= 0.0066, Gehan-Breslow-Wilcoxon 시험). 도 6f는 이식 후 동종이식편 섬의 비율을 보여주는 생존 플롯이다. ~1㎍/ml CXCL12의 도입은 유의적으로 당뇨병 C57BL/6 마우스로 이식된 캡슐화된 돼지 이종 섬의 거부반응을 지연시킨다(p= 0.0389, 로그 랭크 시험). 대조군 및 실험군: Ca-LVM 캡슐, Ca-LVM-10ng/ml CXCL12 캡슐, Ca-LVM-100ng/ml CXCL12 캡슐(n= 6), Ca-LVM-1㎍/ml CXCL12 캡슐(*p< 0.01)(그룹 크기= 6)(Gehan-Breslow-Wilcoxon 시험).
도 7a 내지 7g는 T 세포 부분모집단의 CXCL12로의 이동 행태 및 연관된 CXCR4 발현을 보여준다. 도 7a 및 7c는 CD3+CD8+ T 세포의 이동 반응을 보여주는 막대 그래프이다. 도 7b 및 7d는 CD3+CD4+CD25hi T 세포의 이동 반응을 보여주는 막대 그래프이다. 세포 이동 반응은 CXCL12, CXCL12로 코팅된 섬(I-CXCL12) 및 CXCL12로 캡슐화된 섬(E-CXCL12)에 대한 반응으로 정량화하였다. CXCL12는 3개의 세트 모두 ~1㎍/ml의 농도로 사용하였다. CD8+ 및 CD4+CD25hi T 세포는 ~1㎍/ml CXCL12(M/CXCL12) 및 CXCL12로 코팅되거나 캡슐화된 섬에 대해 낮은 수준의 주화성(chemotaxis)을 겪었다. CD4+CD25hi가 아닌 CD8+ T 세포는 CXCL12로 코팅되거나 캡슐화된 섬에 대한 반응으로 반주화성(fugetaxis) 또는 화학적 반발성(chemorepulsion)을 겼었다. 최소 수준의 주화성 및 반주화성이 CXCL12로 코팅되지 않은 섬(I-Cont) 또는 캡슐화되지 않은 섬(E-Cont)에 노출된 CD8+ 또는 CD4+CD25hi T 세포에 대해 검출되었다(ns= 유의하지 않음; *p< 0.05; **p< 0.005, 스튜던트 t 시험(Student's t test)). 이러한 상이한 이동 반응을 설명하기 위해, CD4+, CD8+ 및 조절 T 세포에 대한 CXCR4 발현을 비교하였다. 도 7e는 CD8+ 및 조절 T 세포에 대한 게이팅 전략(gating strategy)의 한 예를 보여준다. 도 7f는 CXCR4 발현의 평균 형광 강도(MFI)를 보여주는 플롯이다. CXCR4를 발현하는 각 집단의 %를 계산하였고, 도 7g의 대표적인 히스토그램은 CD4+CD25- 및 CD8+ T 세포에 비해 CXCR4의 Treg 세포에 의해 증가된 발현을 도시한 것이다(p<0.0001, 스튜던트 t 시험).
도 8은 시험관내 시간에 따른 칼슘 가교결합된 3.3% 알기네이트 캡슐재 내의 CXCL12 보유 키네틱을 보여주는 선 그래프이다. 비가교결합된 나트륨 알기네이트 내의 CXCL12 농도는 1㎍/ml(n= 3)이었다. 1.5% 내지 3.3%의 알기네이트 농도에 대한 CXCL12 방출 프로파일은 차이가 없었다(데이터는 표시하지 않음).

정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술용어 및 과학용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 이해가 충돌하는 경우, 정의를 포함하는 본원이 통제할 것이다.

본원에 사용된 용어 "알기네이트"는 알긴산"으로도 알려져 있고, 일반적으로 우로네이트 당(uronate sugar)을 2개 이상 포함하는 탄수화물 중합체(예를 들어, 다당류)를 말한다.

용어 "동종이계"는 같은 종에 속한 것 또는 같은 종에서 얻은 것을 의미한다.

용어 "동종이식편"은 같은 종에서 얻은 세포 또는 조직의 이식편을 말한다.

용어 "이종"은 다른 종에 속한 것 또는 다른 종에서 얻은 것을 의미한다.

용어 "이종이식편"은 다른 종에서 얻은 세포 또는 조직의 이식편을 말한다.

용어 "효과기 T 세포"는 사이토카인을 방출함으로써 특정 면역 반응을 증가시킬 수 있는 분화된 T 세포를 말한다.

용어 "조절 T 세포"는 항원에 대한 B 세포 또는 다른 T 세포의 면역 반응을 감소시키거나 억제하는 T 세포를 말한다.

"CXCL12 또는 SDF-1 폴리펩타이드"는 CXCL12 특이적 항체에 결합하고 주화성(chemotaxis) 또는 반주화성(fugetaxis) 활성을 갖는 단백질 또는 이의 단편을 의미한다. 주화성 또는 반주화성 활성은 (예를 들어, 관심 물질을 향하거나 이로부터 멀어지는) T 세포 이동 방향을 평가하여 측정한다. 예를 들어, "Poznansky et al., Nature Medicine 2000, 6:543-8"을 참조한다.

"대상체"는 사람, 가축, 및 동물원의 동물, 스포츠 동물 또는 애완동물, 예를 들어, 마우스, 토끼, 돼지, 양, 염소, 소 및 고등 영장류를 비롯한 포유강(class mammalia)의 임의의 동물을 포함하는 척추동물이다.

본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 등은 장애 및/또는 이와 관련된 증상의 감소 또는 개선을 말한다. 불가능하지는 않지만, 장애 또는 병태의 치료가 장애, 병태 또는 이와 관련된 증상을 완전히 없애야 하는 것은 아님을 이해할 것이다.

본 기재에서, "구성되다", "구성하는", "함유하는" 및 "갖는" 등은 미국 특허법에서 여겨지는 의미를 가질 수 있고 "포함하다", "포함하는" 등을 의미할 수 있고; "~로 필수적으로 이루어지는" 또는 "필수적으로 구성되는" 등 역시 미국 특허법에서 여겨지는 의미를 가질 수 있고, 이 용어는 언급된 것보다 많은 것의 존재에 의해 기재된 기본적인 또는 새로운 특징이 변하지 않는한, 언급된 것보다 많은 것이 존재할 수 있는, 제한을 두지 않는 용어이고, 선행 기술의 실시양태는 배제된다.

다른 정의는 본 기재 전반에 걸친 관계에서 기술한다.

본 발명의 조성물 및 방법

본 발명의 조성물은 하나 이상의 세포를 캡슐화하는 CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스에 관한 것이다.

CXCl12 폴리펩타이드는 당해 기술분야에 알려져 있다. 예를 들어, "Poznansky et al., Nature Medicine 2000, 6:543-8"을 참조한다. 용어 CXCL12 및 SDF-1은 교환 사용될 수 있음을 주목한다. 한 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드는 NP_001029058과 아미노산 서열이 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상 또는 약 100% 동일하고 케모카인(chemokine) 또는 반주화성 활성을 갖는다. 예시적 SDF-1 이소폼(isoform)을 아래 표 1에 나타낸다:

다른 실시양태에서, 예시적 CXCL12/SDF-1 폴리펩타이드의 서열은 mnakvvvvlvlvltalclsdgkpvslsyrcpcrffeshvaranvkhlkilntpncalqivarlknnnrqvcidpklkwiqeylekalnkg rreekvgkkekigkkkrqkkrkaaqkrkn이다.

또 다른 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드는 CXCL12 이소폼 델타 폴리펩타이드와 아미노산 서열이 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상 또는 약 100% 동일하고 케모카인 또는 반주화성 활성을 갖는다. 예시적 CXCL12 이소폼 델타 폴리펩타이드의 서열은 MNAKVVVVLVLVLTALCLSDGKPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLKWIQEYLEKALNNLISAAPAGKRVIAGARALHPSPPRACPTARALCEIRLWPPP EWSWPSPGDV이다.

CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스는, 예를 들어, CXCL12 폴리펩타이드를 약 1.0ng/mL/hr 이상, 예를 들어, 약 1.0ng/mL/hr 내지 약 3ng/mL/hr의 속도로 방출시킴을 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드가 약 1.75ng/mL/hr의 속도로 방출된다. CXCL12 폴리펩타이드는 상기 매트릭스 내에 약 100ng/mL, 예를 들어, 약 100ng/ml 내지 약 1㎍/ml의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, CXCL12 폴리펩타이드는 상기 매트릭스 내에 약 100ng/ml 내지 약 1㎍/ml의 농도로 약 3개월 내지 약 2년 동안 존재한다. 농도, 방출 속도 및 기간은 선택된 세포 종류 및 치료될 장애에 따라 달라지고 적합한 매개변수의 선택은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있거나 명백할 것이다. 일반적으로, CXCL12 폴리펩타이드는 효과기 T 세포를 특정 해부 위치에서 밀쳐내기에 충분한 속도로 방출된다. 효과기 T 세포를 밀쳐내는 CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스의 능력은, "Poznansky et al., Journal of clinical investigation, 109, 1101 (2002)"에 이미 기재되어 있는 바와 같이, 보이든 챔버 분석을 사용하여 시험관 내에서 평가할 수 있다.

용출 매트릭스는 캡슐화된 세포에 불활성(예를 들어, 세포 신호화의 자극 또는 억제가 없음)인 당해 기술분야에 공지된 생체적합성 중합체를 포함할 수 있고, 용출될 CXCL12 폴리펩타이드 및 감작화될 분자(예를 들어, 포도당)가 투과될 수 있다. 상기 매트릭스의 두께는 약 200 내지 약 500㎛이고, 특정 실시양태에서, 상기 세포 주변에 캡슐을 형성한다. 생체적합성 중합체는 생분해성 또는 비분해성일 수 있다. 생체적합성 중합체는 탄수화물계, 단백질계 및/또는 합성된 것, 예를 들어, PLA일 수 있다. 매트릭스에 사용하기 적합한 생체적합성 물질은 폴리-디메틸-실록산(PDMS), 폴리-글리세롤-세바케이트(PGS), 폴리락트산(PLA), 폴리-L-락트산(PLLA), 폴리-D-락트산(PDLA), 폴리글리콜라이드, 폴리글리콜산(PGA), 폴리락타이드-코-글리콜라이드(PLGA), 폴리디옥산온, 폴리글루코네이트, 폴리락트산-폴리에틸렌 옥사이드 공중합체, 개질된 셀룰로오스, 콜라겐, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리하이드록시프로피온산, 폴리포스포에스테르, 폴리(알파-하이드록시산), 폴리카프로락톤, 폴리카보네이트, 폴리아미드, 폴리언하이드라이드(polyanhydride), 폴리아미노산, 폴리오르토에스테르, 폴리아세탈, 폴리시아노아크릴레이트, 붕해성 우레탄, 지방족 폴리에스테르폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 아실 치환된 셀룰로오스 아세테이트, 비분해성 폴리우레탄, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 플루오라이드, 폴리비닐 이미다졸, 클로로설폰화 폴리올레핀, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리비닐 알콜, 나일론 실리콘, 폴리(스티렌-블록-부타디엔), 폴리노르보르넨 및 하이드로겔을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 적합한 중합체는 "The Polymer Handbook, 3rd edition (Wiley, N.Y., 1989)"를 참조하여 수득할 수 있다. 이들 중합체들의 조합도 사용할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스는 CXCL12 폴리펩타이드를 발현하는 세포, 예를 들어, 중피세포의 부가 층을 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 매트릭스의 외층은 CXCL12 폴리펩타이드의 흡수층을 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 상기 용출 매트릭스는 알기네이트(예를 들어, 알긴산)를 포함하고, 일반적으로 우로네이트 당을 2개 이상 포함하는 탄수화물 중합체(예를 들어, 폴리사카라이드)를 말한다. 우로네이트 당은 마누론산의 염(또는 마누로네이트), 굴루론산의 염(또는 굴루로네이트) 및/또는 이의 이성질체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트는 마누로네이트, 굴루로네이트 및/또는 이의 이성질체를 포함하는 직쇄 탄수화물 중합체(예를 들어, 폴리사카라이드)일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트는 마누로네이트, 굴루로네이트 및/또는 이의 이성질체의 코-(co-)탄수화물 중합체일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "이성질체"는 분자식은 동일하나 구조가 상이한 화합물을 말한다. 배치 및/또는 형태만 상이한 이성질체는 "입체이성질체"라 한다. 용어 "이성질체"는 또한 거울상이성질체를 지칭하는 데 사용된다. 용어 "거울상이성질체"는 서로 거울상이며 겹치지 않는 분자 이성질체 쌍 중 하나를 기술하는 데 사용된다. 거울상이성질체를 지정하거나 지칭하는 데 사용되는 다른 용어는 "입체이성질체"(키랄 중심 주변의 배열 또는 입체화학이 다르기 때문; 모든 거울상이성질체는 입체이성질체이지만, 모든 입체이성질체가 거울상이성질체는 아니다) 또는 "광학 이성질체"(순수한 거울상이성질체의 광학 활성 때문이며, 이 활성은 다른 방향의 평면 편광된 빛을 회전시키는 상이한 순수한 거울상이성질체의 능력이다)를 포함한다. 거울상이성질체는 일반적으로 융점 및 비점과 같은 동일한 물리적 특성을 갖고, 또한 동일한 분광 특성을 갖는다. 거울상이성질체는 평면 편광된 빛과의 상호작용 면에서 및 생물학적 활성 면에서 서로 다를 수 있다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 마누론산의 염(또는 마누로네이트)은 β-D-마누로네이트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 굴루론산의 염(또는 굴루로네이트)은 α-L-굴루로네이트를 포함할 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 알기네이트는 적어도 하나 또는 이를 초과하는 마누로네이트의 단독중합체 영역(M-블록), 적어도 하나 또는 이를 초과하는 굴루로네이트의 단독중합체 영역(G-블록), 적어도 하나 또는 이를 초과하는 마누로네이트와 굴루로네이트의 교대 구조의 영역(MG-블록 또는 GM-블록)을 포함하는 블록 중합체일 수 있다.

이들 블록의 비율, 분포 및/또는 길이는 알기네이트 겔의 화학적 및/또는 물리적 성질을 부분적으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 알기네이트 중합체 중의 G 단량체와 M 단량체의 상대 함량은, 예를 들어, 공극 크기, 안정성 및 생분해성, 겔 강도 및 알기네이트 겔의 탄성에 영향을 미칠 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 알기네이트 중합체에서 M 함량에 비해 G 함량이 낮으면 일반적으로 보다 생분해성인 겔이 될 수 있다. G 함량이 더 높은 알기네이트 겔은 M 함량이 더 높은 알기네이트 겔에 비해 공극 크기가 더 크고/크거나 겔 강도가 더 강하며, M 함량이 더 높은 알기네이트 겔은 공극 크기가 더 작고 겔 강도가 더 낮다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 하나 이상의 알기네이트 중합체는 적어도 약 10중량%, 적어도 약 20중량%, 적어도 약 30중량%, 적어도 약 40중량%, 적어도 약 50중량%, 적어도 약 60중량%, 적어도 약 70중량%, 적어도 약 80중량%, 적어도 약 90중량% 또는 그 초과의 M-블록 함량을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 하나 이상의 알기네이트 중합체는 적어도 약 10중량%, 적어도 약 20중량%, 적어도 약 30중량%, 적어도 약 40중량%, 적어도 약 50중량%, 적어도 약 60중량%, 적어도 약 70중량%, 적어도 약 80중량%, 적어도 약 90중량% 또는 그 초과의 G-블록 함량을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 하나 이상의 알기네이트 중합체는 적어도 약 10중량%, 적어도 약 20중량%, 적어도 약 30중량%, 적어도 약 40중량%, 적어도 약 50중량%, 적어도 약 60중량%, 적어도 약 70중량%, 적어도 약 80중량%, 적어도 약 90중량% 또는 그 초과의 GM-블록 및/또는 MG-블록 함량을 포함할 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 하나 이상의 알기네이트 중합체는 굴루론산에 대한 마누론산의 비(M/G)가 약 0.01 내지 약 100, 약 0.1 내지 약 50, 약 0.5 내지 약 25, 또는 약 1 내지 약 20일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 하나 이상의 알기네이트 중합체는 M/G 비가 약 1 내지 약 100, 약 1 내지 약 50, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 10, 또는 약 1 내지 약 5일 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 하나 이상의 알기네이트 중합체는 마누론산에 대한 굴루론산의 비(G/M)가 1.5 이하 또는 1 이하일 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 하나 이상의 알기네이트 중합체는 G/M 비가 약 1.5일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 하나 이상의 알기네이트 중합체는 G/M 비가 약 1일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 하나 이상의 알기네이트 중합체는 G/M 비가 1.5 미만일 수 있고, 이는, 예를 들어, 1.4 미만, 1.3 미만, 1.2 미만, 1.1 미만, 1.0 미만, 0.9 미만, 0.8 미만, 0.7 미만, 0.6 미만, 0.5 미만, 0.4 미만, 0.3 미만, 0.2 미만, 0.1 미만, 0.05 미만, 0.01 미만, 0.0075 미만, 0.005 미만, 0.001 미만 또는 그 보다 낮은 비를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 하나 이상의 알기네이트 중합체는 G/M 비가 1 미만일 수 있고, 이는, 예를 들어, 0.9 미만, 0.8 미만, 0.7 미만, 0.6 미만, 0.5 미만, 0.4 미만, 0.3 미만, 0.2 미만, 0.1 미만, 0.05 미만, 0.01 미만, 0.0075 미만, 0.005 미만, 0.001 미만, 0.0001 미만 또는 그 보다 낮은 비를 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 하나 이상의 알기네이트 중합체는 마누론산에 대한 굴루론산의 비(G/M)가 적어도 약 1.5 이상일 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 하나 이상의 알기네이트 중합체는 G/M 비가 약 1.5일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 하나 이상의 알기네이트 중합체는 G/M 비가 1.5 초과일 수 있고, 이는, 예를 들어, 2 초과, 2.5 초과, 3 초과, 3.5 초과, 4 초과, 4.5 초과, 5 초과, 6 초과, 7 초과, 8 초과, 9 초과, 10 초과, 15 초과, 20 초과, 30 초과, 40 초과, 50 초과, 60 초과, 70 초과, 80 초과, 90 초과, 100 초과 또는 그 보다 높은 비를 포함한다.

알기네이트 중합체의 평균 분자량은, 예를 들어, 겔화 시간, 공극 크기, 겔 강도 및/또는 겔의 탄성에 영향을 미칠 수 있다. 알기네이트 중합체의 평균 분자량은 약 2kDa 내지 10,000kDa의 범위일 수 있다. 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 일반적으로 알기네이트 중합체의 분자량이 낮을수록 생분해성이 더 높은 겔이 생성될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 알기네이트 중합체의 평균 분자량은 약 5kDa 내지 약 10,000kDa, 약 10kDa 내지 약 5,000kDa, 약 25kDa 내지 약 2,500kDa, 약 50kDa 내지 약 1,000kDa, 약 50kDa 내지 약 500kDa, 또는 약 50kDa 내지 약 250kDa일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 알기네이트 중합체의 평균 분자량은 약 5kDa 내지 약 350kDa일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 알기네이트 중합체의 평균 분자량은 약 2kDa 내지 약 100kDa일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 알기네이트 중합체의 평균 분자량은 약 50kDa 내지 약 500kDa일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 알기네이트 중합체의 평균 분자량은 약 50kDa 내지 약 300kDa일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 알기네이트 중합체의 평균 분자량은 약 75kDa 내지 약 200kDa일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 알기네이트 중합체의 평균 분자량은 약 75kDa 내지 약 150kDa일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 알기네이트 중합체의 평균 분자량은 약 150kDa 내지 약 250kDa일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 알기네이트 중합체의 평균 분자량은 약 100kDa 내지 약 1,000kDa일 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 알기네이트 중합체의 평균 분자량은 75kDa 미만이거나 그 보다 작을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 알기네이트 중합체의 평균 분자량은 적어도 약 75kDa, 적어도 약 80kDa, 적어도 약 90kDa, 적어도 약 100kDa, 적어도 약 110kDa, 적어도 약 120kDa, 적어도 약 130kDa, 적어도 약 140kDa, 적어도 약 150kDa, 적어도 약 160kDa, 적어도 약 170kDa, 적어도 약 180kDa, 적어도 약 190kDa, 적어도 약 200kDa, 적어도 약 250kDa, 적어도 약 300kDa 또는 그 보다 클 수 있다.

한 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 알기네이트 중합체는 약 75kDa 내지 약 200kDa의 평균 분자량과 약 1의 마누론산에 대한 굴루론산의 비(G/M)를 갖는다. 한 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스의 알기네이트 중합체는 약 75kDa 내지 약 200kDa의 평균 분자량과 1 미만의 마누론산에 대한 굴루론산의 비(G/M)를 갖는다.

제한없이, 상기 분자량은 피크 평균 분자량(Mp), 수 평균 분자량(Mn) 또는 중량 평균 분자량(Mw)일 수 있다.

알기네이트는 임의의 공급원으로부터 유도될 수 있고/있거나 당해 기술분야에서 알려진 임의의 방법으로 생성시킬 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트는 해초류 또는 켈프의 줄기 및/또는 잎으로부터 유도될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트는 녹조류(Chlorophyta), 갈조류(Phaeophyta), 홍조류(Rhodophyta) 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유도될 수 있다. 해초류 또는 켈프의 예는 다양한 종류의 라미나리아(Laminaria)(예를 들어, Laminaria hyperborea, Laminaria digitata 및 Laminaria japonica(이에 한정되지 않음)), Lessonia nigrescens, Lessonia trabeculata, Durvillaea antarctica, Ecklonia maxima, Macrocystis pyrifera, Ascophyllum nodosum, 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

몇몇 실시양태에서, 알기네이트는 세균성 알기네이트, 예를 들어, 세균을 사용한 미생물 발효에 의해 생산된 것일 수 있다. 알기네이트 생산에 사용될 수 있는 세균의 예는 Pseudomonas(예를 들어, Pseudomonas Aeruginosa) 및 Azotobacter(예를 들어, Azobacter Vinelandii)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 세균은 알기네이트와 유사한 구조를 갖는 폴리사카라이드 중합체를 생산할 수 있는데, 예를 들면 C2 및 C3 하이드록실 부분에 아세틸 그룹이 있는 것이 다르다.

몇몇 실시양태에서, 알기네이트는 개질될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트는 화학적으로 개질될 수 있다. 예를 들어, 화학적으로 개질된 알기네이트는 프로필렌 글리콜 알기네이트(PGA)를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, PGA는 부분적으로 중화된 알긴산을 압력하에 프로필렌 옥사이드 기체와 접촉시켜 만들 수 있다. 프로필렌 옥사이드는 알긴산과 반열 반응하여 혼합된 1급/2급 에스테르를 생성시킨다.

몇몇 실시양태에서, 알기네이트는 임상 등급의 것, 예를 들어, 생체내에서 사용하기에 적합한 것일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트는 사용 전에 세포 캡슐화를 위해 정제할 수 있다. 예를 들어, "Mallet and Korbutt, Tissue Eng Part A. 2009. 15(6):1301-1309"를 참조한다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트는 적은 내독소를 가질 수 있다. 예를 들어, 내독소는 알기네이트에 150EU 이하/g, 100 EU 이하/g, 75EU 이하/g, 50EU 이하/g, 25EU 이하/g, 20EU 이하/g, 10EU 이하/g, 5EU 이하/g, 1EU 이하/g, 0.5EU 이하/g, 0.1EU 이하/g의 양으로 존재할 수 있다.

본원에 기재된 다양한 양태의 방법에 당해 기술 분야에서 인지되는 임의의 알기네이트를 사용할 수 있다. 본원에 기재된 조성물에 사용될 수 있는 알기네이트의 예는 나트륨 알기네이트(알긴산의 나트륨염), 칼륨 알기네이트(알긴산의 칼륨염), 칼슘 알기네이트, 마그네슘 알기네이트, 트리에탄올아민 알기네이트, PGA 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 가용성 알기네이트는 나트륨 알기네이트, 칼륨 알기네이트 및 암모늄 알기네이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는 1가 염의 형태일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트는 칼슘 알기네이트일 수 있다. 한 실시양태에서, 칼슘 알기네이트는 나트륨 알기네이트에서 나트륨염을 제거하고 칼슘으로 대체시켜 만들 수 있다. 국제 특허출원 WO 2007/140312; WO 2006/051421; WO2006/132661 및 WO1991/007951, 및 미국 특허 제8,481,695호에 기재되어 있고/있거나 상기에 기재된 방법으로 제조되는 알기네이트를 또한 본원에 기재된 다양한 양태의 조성물 및 방법에 사용할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 시판중인 알기네이트, 예를 들어, FMC BioPolymer 및 Novamatrix에서 구입한 것을 또한 본원에 기재된 다양한 양태의 조성물 및 방법에 사용할 수 있다.

알기네이트는 일반적으로 2가 이온 및/또는 3가 이온의 존재하에 겔 매트릭스를 생성시킨다. 알기네이트 겔을 생성시키는데 사용될 수 있는 2가 또는 3가 이온의 비제한적인 예는 칼슘 이온, 바륨 이온, 스트론튬 이온, 구리 이온, 아연 이온, 마그네슘 이온, 망간 이온, 코발트 이온, 납 이온, 철 이온, 알루미늄 이온 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 알기네이트 매트릭스는 공유 가교결합된 것일 수 있다. 알기네이트를 공유 가교결합시키는데 사용할 수 있는 공유 가교결합제의 예는 카보디이미드, 알릴 할라이드 옥사이드, 디알데히드, 디아민 및 디이소시아네이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 용출 매트릭스 제형은 주사, 주입 또는 이식(피하, 정맥내, 근육내, 복막내, 피내, 비경구, 직장 및/또는 질내 등), 흡입, 경구/코 또는 국소 투여에 적합한 것들을 포함한다. 상기 제형은 단위 투여 형태로 편리하게 존재할 수 있고 약학 분야에 잘 알려진 임의의 방법으로 제조할 수 있다. 투여형에 배합될 수 있는 CXCL12 폴리펩타이드의 양은 치료될 숙주, 특정 투여 방식, 예를 들어, 주사 또는 이식에 따라 변할 것이다. 본 발명의 제형은 약제 생산 분야에 알려진 임의의 방법에 따라 제조할 수 있고, 감미제, 방향제, 착색제 및 보존제를 함유할 수 있다. 제형을 생산에 적합한 비독성의 약제학적으로 허용되는 첨가제와 혼합할 수 있다. 제형은 하나 이상의 희석제, 유화제, 보존제, 완충제, 부형제 등을 포함할 수 있고, 액체, 유화액, 크림, 로션, 겔, 패치 및 임플란트 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스는 적어도 하나의 세포를 캡슐화한다. 캡슐화된 세포는 연성 및 피부 세포, 간세포, 신장 세포, 간 세포, 심장 세포, 췌장 세포, 섬세포, 내장에 존재하는 세포, 골모세포 및 뼈 또는 연골을 생성하는 기타 세포, 및 조혈 세포를 포함하는 줄기 세포, 신경 세포, 평활근 또는 골격근 세포, 근세포, 섬유아세포, 연골 세포, 지방 세포, 섬유근원세포, 외배엽 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 상기 세포는 섬세포(예를 들어, 돼지 섬세포, 사람 섬세포, 또는 줄기 또는 iPS 세포로부터 유래된 섬세포)와 같은 인슐린 생산 세포이다.

본 발명의 용출 매트릭스는 환자에 이식되거나 삽입된 리필가능한 CXCL12 폴리펩타이드 전달 장치이다. 예를 들어, 상기 매트릭스는 바늘 또는 카테테르 입구를 포함할 수 있어서 매트릭스를 환자에게서 제거하지 않고 세포를 주입하거나 제거할 수 있다. 다르게는, 연관된 면역 거부반응없이 용출 매트릭스를 대상체(예를 들어, "감작화된 대상체")에 반복 투여할 수 있다.

본 발명의 CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스는 류마티스관절염, 포도막염, 인슐린 의존성 당뇨병, 용혈빈혈, 류마티스열, 크론병, 길랑-바레 증후군, 건선, 갑상선염, 그레이브스병, 중증근무력증, 사구체신염, 자가면역 간염 및 전신 홍반성 루푸스를 포함한, 그러나 이에 한정되지 않는 자가면역 질환의 치료에 유용하다.

한 실시양태에서, 본 발명의 CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스는 당뇨병의 치료에 사용되는 섬세포와 함께 제형화될 수 있다. 당뇨병은 신체가 충분한 인슐린을 생산하지 않은 결과로서, 또는 신체 세포가 생산된 인슐린에 적합하게 반응하지 않기 때문에 사람이 고혈당(포도당) 수준을 갖는 병태이다. 건강한 사람에 있어서, 혈당 수준은 주로 호르몬 인슐린의 작용에 의해 좁은 범위 내에서 유지된다. 인슐린은 순환 포도당 농도에 반응하여 적합한 속도로 췌장 베타 세포에 의해 방출되며, 상기 반응은 기타 순환 영양소, 섬 신경지배 및 인크레틴 호르몬을 포함하는 기타 인자에 의해 조절된다. 인슐린은 간 포도당 방출 속도를 포도당 제거 비율에 맞도록 함으로써 포도당 농도를 유지시킨다.

따라서 인슐린은 신체 세포가 포도당을 흡수하여 이를 에너지로 바꿀 수 있도록 한다. 신체 세포가 포도당을 흡수하지 않으면, 포도당이 신체에 축적(고혈당증)되어, 다양한 잠재적인 의학적 합병증을 야기시킨다. 따라서, 당뇨병은 증가된 혈당으로 인해 이것이 적당히 조절되지 않는 경우 심혈관 질환, 신부전, 망막증 및 신경병증과 같은 2차 합병증을 초래하는 것을 특징으로 한다.

두 가지의 주요한 병리생리학이 증가된 혈당증과 관련이 있다. 첫 번째는 췌장 인슐린 생산 베타 세포에 대한 자가면역 공격(타입 1 당뇨병)인 반면, 두 번째는 저하된 베타 세포 기능 및 증가된 말초 인슐린 저항(타입 2 당뇨병)과 관련된다. 타입 1 당뇨병과 유사하게, 베타 세포 사멸이 또한 타입 2 당뇨병에서도 관찰된다. 타입 1 당뇨병 및 보통의 타입 2 당뇨병은 사람에게 인슐린을 주사해야 한다.

타입 1 DM은 일반적으로 췌장의 랑게르한스섬의 인슐린 생산 베타 세포의 손실로 인한 인슐린 결핍을 특징으로 한다. 이 타입의 당뇨병은 추가로 면역 매개된 것 또는 특발성으로 분류할 수 있다. 대부분의 타입 1 당뇨병은 베타 세포의 손실이 T 세포 매개된 자가면역 공격인, 면역 매개된 본성을 갖는다. 타입 2 당뇨병은 인슐린 저항과 조합된 베타 세포 기능부전을 특징으로 한다. 인슐린에 대한 체세포의 부족한 반응성은 인슐린 수용체와 관련된 것으로 여겨진다. 타입 1 당뇨병과 유사하게, 불충분한 베타 세포의 양이 또한 다수의 타입 2 당뇨병 환자에서 병리학적 요인이다. 타입 2 당뇨병의 초기에, 고혈당증이 인슐린 분비를 개선시키고 간에 의한 포도당 생산을 감소시키는 여러 가지의 조치 및 약물에 의해 반전될 수 있다. 질환 진행으로서, 인슐린 분비의 손상이 일어나고, 인슐린의 치료적 대체가 종종 특정 환자에서 필요하게 된다.

조절 T 세포는 가슴샘에서 기원된 CD+4 T 세포의 서브셋으로, 일반적으로 내성 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 조절 T 세포는 면역 조절에 활성적으로 기능을 하고, 이식 거부반응의 동종면역 반응을 억제한다(C. A. Piccirillo, Cytokine 43, 395 (Sep, 2008); G. Xia et al. Translational research: the journal of laboratory and clinical medicine 153, 60 (Feb, 2009); K. J. Wood, Transplantation proceedings 43, 2135 (Jul-Aug, 2011); and G. Feng et al., transplantation 86, 578 (Aug, 2008)). 조절 T 세포는 쥐과 자가면역 당뇨병을 예방하고 이식된 섬의 자가반응 파괴를 조절한다(M. J. Richer et al., PloS one 7, e31153 (2012) and D. R. Tonkin et al. Immunol 181, 4516 (Oct 1, 2008)). 섬 이식은 섬 이식의 이전 연구에서는 당뇨병의 잠재적인 치료적 접근법을 나타냈으나, 이식된 섬의 면역 매개된 거부반응으로 인해 전신 면역 억제로 혈당 수준의 장기간 조절을 성취할 수 없었다. 이식된 섬을 캡슐화하는 매트릭스로의 CXCL12의 도입은 세포 매개된 체액성 항-(anti)섬 면역에 물리적 및 생물학적 배리어 둘 다를 제공한다. CXCL12 폴리펩타이드는 효과기 T 세포를 밀쳐내고 면역 억제성 T 세포를 채용하는 반면, 전신 면역억제의 필요성을 감소시키거나 없앤다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스는 면역억제를 수반하지 않으면서 췌장 세포, 특히 베타 세포가 부족한 환자의 췌장의 적어도 일부의 재생, 대체 또는 치환(부분적으로 또는 전체적으로)에 유용하다. 췌장이 충분한 인슐린을 생산하지 않거나 어떠한 인슐린이라도 필요한 임의의 환자가 이러한 치료에 유리하다. 부족한 인슐린 생산은 정상(건강한) 대상체에 비해 낮은 수준의 인슐린 생산을 포함하며, 또한 정상(건강한) 대상체와 비슷한 인슐린 수준을 생산하나 인슐린 저항, 과잉의 음식 소비, 병적 비만 등으로 인해 보다 높은 인슐린 수준이 필요한 대상체도 포함한다.

본 발명의 CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스는 조절 T 세포를 선택적으로 채용함으로써 이식된 매트릭스의 생존을 연장시키고 감작화된 숙주에서 조차 면역 파괴에 대한 보호를 제공한다. 따라서, 본 발명의 CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스는 회복가능하고, 목적한 경우 면역 전신 거부반응없이도 반복적으로 투여할 수 있다. 게다가, 본 발명의 CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스는 지속적인 섬 생존과 캡슐화된 섬으로부터의 CXCL12 폴리펩타이드의 연속적 보호를 적어도 약 1개월 내지 약 2년 동안 제공한다. 이 기간 동안, 대상체내 포도당의 공복 혈청 농도가 약 80mg/dl 내지 약 120mg/dl의 혈액 수준에서 유지된다. 따라서, 본 발명의 CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스는 당뇨병 치료에 특히 유용하다.

특정 실시양태에서, 당뇨병 치료용의 CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스는 약 1.5 내지 약 2% w/v의 고 마누론산, 칼슘 가교결합된 알기네이트, 약 100ng/ml 내지 약 1μg/ml의 CXCL12 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 섬세포를 포함하고, CXCL12 폴리펩타이드가 약 1.0ng/ml/hr 내지 약 3ng/ml/hr의 속도로 방출된다. 예시적 캡슐화 과정은 공여체 섬을 2mL 여과된 디티존/PBS와 혼합함으로써, 섬세포의 제조로 개시된다. 80mg의 알기네이트-LVM(Pronova UP LVM 나트륨 알기네이트)을 5mL의 300mOsmo NaCl과 용해될 때까지 혼합한다. 약 800 내지 약 1000개의 섬을 cRPM 중에서 3분 동안 300rpm x G에서 스핀다운하고, DMEM에 재현탁시키고, 300rpm x G에서 3분 동안 다시 스핀한다. 1mL 주사기를 사용하여 0.75mL 알기네이트와 섬을 혼합할 수 있다. 알기네이트와 섬을 18g 니들을 사용하는 60mL 주사기에 부하할 수 있다. 부하된 주사기를, ?대의 전압 세트(예를 들어, 1.21kV), 1500의 주파수 세트 및 최대의 진폭 세트를 갖는 캡슐화기에 놓는다. 캡슐화 후, 캡슐을 5분 동안 300mOsmo CaCl₂에서 교반하고, 캡슐을 새로운 비이커 속으로 여과하고, DMEM으로 세척하고 배양한다.

본 발명을, 본 발명 및 이의 다수의 이점을 보다 잘 이해하도록 하는 아래의 설명적이고 비제한적인 실시예를 통해 추가로 기재한다.

실시예

하기 실시에는 본 발명의 몇몇 실시양태와 양태를 설명한다. 다양한 수정, 추가, 치환 등이 본 발명의 취지 또는 범위를 변경시키지 않고 수행될 수 있고, 이러한 수정 및 변형은 하기 특허청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 범위 내에 포함됨이 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 하기 실시예는 어떤 식이로든 본 발명을 제한하지 않는다.

섬 이식은 타입 1 당뇨병의 잠재적인 치료적 접근법을 나타낸다. 그러나, 섬 이식은 일반적으로 이식된 섬의 면역 매개된 거부반응을 조절하기 위해 전신 면역 억제를 필요로 하고 사람 섬 공급이 제한된다. 하기 실시예는 케모카인 CXCL12가 면역 억제성 조절 T 세포(Treg)를 해부 부위에 채용하면서 효과기 T 세포를 밀쳐낼 수 있고, CXCL12를 사용한 공여체 섬의 코팅 또는 캡슐화가 국소적 면역 고립을 유도할 수 있고 전신 면역 억제 없이 동종이식편 또는 이종이식편을 보호할 수 있음을 보여준다. 아래 실시에에서, 섬 이식은 인슐린 의존성 당뇨병의 쥐과 모델로 수행하였다. CXCL12를 사용한 섬의 코팅 또는 케모카인을 도입하는 알기네이트를 사용한 섬의 미세캡슐화는 동종섬 또는 이종섬 생존 및 기능을 연장시킬 뿐만 아니라 Treg 침투를 선택적으로 증가시킨다. 아래 제시된 데이터는 전신 면역억제를 할 필요없이 동종섬(alloislet) 또는 이종섬(xenoislet) 이식을 위한 국소적 면역 고립을 유도하기 위해 CXCL12가 알기네이트 캡슐재 내의 코팅으로서 또는 성분으로서 사용됨을 나타낸다.

실시예 1. CXCL12 폴리펩타이드를 사용한 동종섬의 직접 코팅

이 실시예에서는, 이식 전 CXCL12 폴리펩타이드를 사용한 동종섬의 코팅이 장기 섬 생존 및 기능뿐만 아니라 이식 부위에서의 조절 T 세포(Treg)의 축적을 야기할 수 있는지를 측정하기 위한 것이었다. 섬 캡슐은 일반적으로 피브로넥틴을 함유하고, 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, CXCL12는 이 매트릭스 단백질(15)에 안정되게 결합하고 그로부터 용출될 수 있다. 따라서, BALB/C 마우스로부터의 섬을 완충 용액(예를 들어, PBS)에 노출시키거나 약 100ng/ml 또는 약 1㎍/ml의 농도의 CXCL12로 코팅하고 스트렙토조토신(STZ) 처리된 당뇨병 C57BL/6 마우스의 왼쪽 신장 캡슐 밑에 이식하였다. 마우스가 250mg/dl 초과의 2회 연속 혈당 기록을 나타내는 당뇨병 상태로 복귀된 시점에서 마우스를 희생시켰다. ~1㎍/ml의 CXCL12로 코팅된 동종이식 섬 이식편은 PBS 단독에 노출되었던 동종섬보다 유의적으로 긴 시간 동안 수용체 마우스를 비당뇨병 상태로 유지시켰다(p= 0.012; 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 로그 랭크 시험)(도 1a). 100ng/ml의 CXCL12 폴리펩타이드로 코팅된 섬은 PBS 노출된 섬과 유사한 비율로 거부반응을 일으켰다(p= 0.31). 단핵 세포의 이식편으로의 침윤은 PBS 대조군에 비해 약 1μg/ml의 CXCL12 코팅에서 감소되었다(도 1b). 인슐린 발현 및 CXCL12 존재가 또한 PBS 처리된 동종이식편에 비해 CXCL12 코팅된 동종섬에서 보여졌다(도 1b). CD3 및 FoxP3 T 세포의 이식편으로의 침윤을 정량화하였다. CD3+ T 세포의 섬 이식편으로의 침윤이, 면역조직화학으로 측정한 바, PBS 노출된 동종섬에 비해 CXCL12에서 유의적으로 감소되었다(도 1c, p= 0.001). 또한, 섬 동종이식편의 CXCL12 코팅은 PBS 노출된 동종섬에 비해 CXCL12 코팅된 이식편 내 및 그 주위에서의 FoxP3+ T 세포 침윤의 유의적 증가와 관련이 있었다(도 1d, p= 0.0016).

실시예 2. CXCL12 코팅 및 저용량 사이클로스포린 A의 동시 사용

다음은, 예를 들어, 저용량(예를 들어, ~2mg/kg)의 사이클로스포린 A(CsA) 처리 형태의 전신 면역억제의 동시 사용이 CXCL12 코팅된 동종섬 생존을 증가시킬 수 있는지를 측정하기 위한 것이었다. 이 실험에서 CXCL12 코팅 단독은 PBS 노출된 대조군에 비해 동종섬 생존을 연장시키는 것으로 나타난 반면(p= 0.0245), 저용량 CsA 처리와 조합된 CXCL12 코팅은 섬 생존을 연장시키지 않았고 CXCL12 코팅과 CXCL12 처리의 조합은 CXCL12 코팅 단독에 비해 감소된 섬 생존을 초래했다(p= 0.046)(도 2a). 대조군과 실험군간의 섬 생존의 유의적 차이는 이식 후 23일에 나타났다. 섬 이식편의 염색은 CD3+ T 세포가 CXCL12 코팅 단독(p= 0.0002) 또는 CsA 처리 단독(p= 0.0027)에 비해 CXCL12 코팅+ CsA 처리된 동물에서 많이 침윤됨을 보였다(도 2b 및 2c). CXCL12 코팅된 섬이 투여된 동물의 치료에 저용량 CsA를 추가함은 또한 CXCL12 코팅된 섬 단독(p= 0.0188)에 비해 이식편으로의 FoxP3 세포 침윤의 유의적 감소를 야기했다(도 2c). CsA가 CXCL12에 대한 신호화 경로의 특정 요소, 예를 들어, 케모카인 매개된 세포 이동을 억제하는 것으로 이전에 기재되었다(16). 본원에 제시된 연구 결과는 CXCL12과 저용량 사이클로스포린 A의 동시 사용이 동종섬 이식에서 면역 보호 효과를 증대시키지 않음을 나타낸다.

CXCL12 코팅된 섬은 PBS 노출된 섬보다 긴 생존을 나타내기 때문에, 다음은 이 현상이 세포 매개된 항-섬 면역에 대한 케모카인의 영향때문인지를 측정하기 위한 것이었다. 동종-반응성 수준을 알아내기 위해, 혼합된 림프구 반응(MLR)을 마우스가 CXCL12 코팅된 섬 또는 코팅되지 않은 섬을 이식받은 지 21일에 수행하였다. 이들 두 그룹간에 차이는 검출되지 않았고, 이는 CXCL12가 T 세포 매개된 거부반응을 저속화할 수 있는 해부 부위를 만들 수 있지만 항-섬 면역의 생성에는 영향을 주지 않음을 나타낸다(도 3a 내지 3c). 따라서, 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, CXCL12 코팅은 전신 항-동종이계 세포 매개된 반응의 생성을 방지하기 보다는 국소 면역 고립을 유도할 수 있다.

실시예 3. 전당뇨병 및 당뇨병 마우스 모델에서의 CXCL12 코팅된 동계 섬의 이식

CXCL12 코팅이 동계 섬 이식에서 거부반응을 저하시키거나 방지하는 기능을 할 수 있는지를 측정하기 위해, 당뇨병 NOD/LtJ 마우스를 사용하였다. 이 모델에서, 비당뇨병 NOD/LtJ 마우스로부터의 동계 섬을 STZ 처리된 당뇨병 NOD/LtJ 마우스에 이식하였다. 동계 섬의 CXCL12 코팅은 PBS 노출된 섬보다 유의적으로 긴 기간의 정상혈당을 야기했다(도 4a)(p= 0.017). 조직병리학적 및 면역조직화학적 연구는 중(heavy) 단핵 세포가 CXCL12 코팅된 섬이 아닌 PBS 처리된 섬 내로 침윤됨을 보였다(이미지는 표시하지 않음). 즉, H & E 염색은 ~1㎍/ml의 CXCL12로 코팅된 섬 이식편으로의 감소된 단핵 세포 침윤을 나타냈고 인슐린 및 CXCL12에 대한 면역형광 염색은 CXCL12 코팅된 이식편에서 두 단백질의 증가된 수준을 보였다. 이 실험에서 CXCL12 및 인슐린에 대한 염색은 PBS 노출된 섬과 비교할 때 건강한 인슐린 생산 및 CXCL12 양성 섬을 나타냈다. 동계 섬의 CXCL12 코팅은 또한 PBS 노출된 동계 NOD/LtJ 섬에 비해 공여체 섬으로의 CD3+ T 세포 침윤이 저하됨을 보였다(도 4b)(p= 0.0081). 동계 NOD/LtJ 섬의 CXCL12 코팅은 또한 PBS 처리된 대조군에 비해 섬 이식 부위에서의 FoxP3+ 세포수를 유의적으로 증가시켰다(p= 0.0019)(도 4c). 동계 섬의 CXCL12 코팅은 자발적 당뇨병 NOD/LtJ 마우스에서의 당뇨병의 재발률을 저하시키지 않은 반면(도 5a)(p= 0.24), 헤마톡실린 및 에오신과 인슐린/CXCL12 염색은 대조군에 비해 CXCL12 코팅된 섬에서 감소된 단핵 세포 침윤 및 증가된 인슐린 발현을 나타냈다(도 5b 및 5c). 또한, CD3+ T 세포 침윤이 일관되게 감소되었고 PBS 대조군에 비해 CXCL12 코팅된 이식편으로의 FoxP3+ 세포 침윤이 증가되었다(도 5d). 종합해 보면, 동계 섬의 CXCL12 코팅은 전당뇨병 모델에서의 거부반응은 방지할 수 있지만, 당뇨병 모델에서는 반드시 그렇지는 않다. 이 동계 이식 세트에서 CXCL12 코팅의 사전 생존 효과의 이러한 결여는, 예를 들어, 이식된 섬의 CXCL12 코팅에 의한 확립된 체액성 항-섬 면역 반응 차단의 비능률성 때문일 수 있다.

실시예 4. 감작화된 수용체 및 비감작화된 수용체에 CXCL12가 도입된 알기네이트 캡슐재(알기네이트에 캡슐화된 섬세포)의 사용

인슐린 자가항체의 초기 발현이 당뇨병으로의 진행과 관련이 있고 아마도 주로 인슐린염을 반영한다는 것이 이전에 기재되었다(17-19). 실시예 3에 나타낸 바와 같이, 이식용 섬의 CXCL12 코팅 효능은 사전에 생성된 항-섬 항체 세팅에서의 중재로서 더 효과적이었다. 이 실시예에서는, 알기네이트 미소캡슐로의 CXCL12의 도입이 세포 매개된 체액성 항-섬 면역에 물리적 및 생물학적 배리어 둘 다를 제공함으로써 이식된 섬을 보호할 수 있는지를 측정하기 위한 것이었다.

한 실시양태에서, 캡슐화 매트릭스는 2% 저점도, 고 마누론산, 칼슘 가교결합된 알기네이트(Ca-LVM) 및 거기에 도입된 CXCL12 폴리펩타이드(이후 "Ca-LVM-CXCL12"로 지칭됨)로 구성된다. 도 6a는 Ca-LVM-CXCL12 캡슐재가 CXCL12를 처음 3시간에 걸친 초기 신속 방출 후 약 1.75±0.4ng/ml/hr로 시험관내 장기 방출시킴을 보여준다. 또한 알기네이트 매트릭스 내에 CXCL12가 장기 보유되고, 이로써 세포 비함유 캡슐의 22일의 시험관내 배양 후(데이터는 표시하지 않음) 잔류하는 캡슐내 CXCL12 농도가 약 100 내지 200ng/ml로 된다. 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 매트릭스 내의 CXCL12의 장기 보유는 양전하를 띤 케모카인(pI 9)과 음전하를 띤 알기네이트(pI 2) 간의 정전 상호작용 때문인 것으로 보인다(20). 이는 CXCL12가, NaCl을 함유하지 않는 배지에 비해, 1M NaCl과 함께 배양한 결과 배지 속으로 효과적으로 용출되는 것이 관찰되는 것에 의해 지지된다. 유사하게, CXCL12는 NaCl의 부재하에 배양하는 경우 캡슐 내에 함유되지만, 1M NaCl 중에서는 캡슐로부터 추출되었다(도 6b). CXCL12는 또한 섬에 대한 사전 생존 요인인 것으로 나타났기 때문에, 섬 생존능력에 대한 CXCL12의 Ca-LVM 캡슐재로의 도입 효과를 또한 평가하였다. 본원에 제공된 연구 결과는 CXCL12의 상기 캡슐재로의 도입이 시험관내 배지에서의 적어도 48시간 후 측정된 캡슐화된 섬에서의 카스파제-3 활성 수준을 비개질된 Ca-LVM 알기네이트와 비교했을 때 유의적으로 감소시켰음을 보여준다(100ng/ml CXCL12; p= 0.0019)(1㎍/ml CXCL12; p= 0.00028)(도 6c).

전신 면역 억제없이 자발적 당뇨병 NOD/LtJ 마우스로의 Ca-LVM-CXCL12 캡슐재의 동종섬 이식을 평가하였다. 동종섬을 당뇨병 NOD/LtJ 마우스의 복막강으로 이식한 경우, Ca-LVM 알기네이트로의 CXCL12의 도입은 비개질된 Ca-LVM 알기네이트와 비교했을 때 섬 기능 및 생존을 유의적으로 연장시켰다(이식 후 비당뇨병 상태의 평균 일수- Ca-LVM-CXCL12= 136; Ca-LVM= 62)(p= 0.048)(도 6d). 이식 후 12주에 회수된 Ca-LVM-CXCL12 캡슐의 조직병리학적 연구는, 섬들이 괴사됐거나 분해된 비개질된 Ca-LVM 캡슐(데이터는 표시하지 않음)과 비교했을 때, 섬 형태가 손상되지 않았음을 보여주었다. Ca-LVM-CXCL12로 캡슐화된 섬은 이식 후 6주에 위상차 현미경법 및 H & E 염색을 사용한 바, 비개질된 Ca-LVM로 캡슐화된 괴사성 섬과 비교했을 때 생존가능하고 손상되지 않았다. 따라서, CXCL12 도입은 이식 후 6주에 섬 건강상태를 개선시키고 괴사를 감소시킨다. 이어서 C57BL/6 마우스로부터의 동종섬을, C57BL/6 마우스로부터의 피부 이식편을 사전에 받았고 거부반응을 일으켰던 자발적 당뇨병 NOD/LtJ 마우스에 이식하였다. Ca-LVM-CXCL12로 캡슐화된 동종섬은 Ca-LVM 단독으로 캡슐화된 섬에 비해 수용체에서 유의적으로 더 길게 생존하고 정상혈당 수준을 유의적으로 더 길게 유지시켰다(도 6e). 이는 캡슐재로의 CXCL12의 도입이 수용체 마우스에서의 면역 기억 반응으로부터 섬을 보호하는 것을 보여준다.

이어서 이종섬이 CXCL12를 도입한 알기네이트 캡슐재에 의해 보호될 수 있는 지를 측정하고자 하였다. 돼지 이종섬을 Ca-LVM 또는 Ca-LVM과 약 10ng/ml, 약 100ng/ml 또는 약 1㎍/ml의 농도의 CXCL12로 캡슐화하고, 당뇨병 C57BL/6 마우스의 복막강에 이식하였다. 약 1㎍/ml의 농도의 CXCL12를 함유하는 Ca-LVM으로 캡슐화된 돼지 섬은 Ca-LVM 또는 Ca-LVM-CXCL12(~10ng/ml)로 캡슐화된 섬에 비해 현저히 긴 시간 동안 수용체 마우스에서 정상혈당을 지속시켰다(도 6f).

실시예 5. 시험관내 CD8+ T 세포 및 Treg 세포에 대한 CXCL12 코팅 또는 미세캡슐화의 효과

캡슐재 내의 CXCL12의 코팅 또는 도입이 이종섬 또는 동종섬 이식편의 면역 고립을 지속시키는 메카니즘이 CD8+ T 세포의 선택적 반주화성 및 CD4+ Treg 세포의 이식편 부위로의 끌림을 포함하는지를 측정하기 위해, NOD/LtJ 마우스에서의 CXCR4의 발현 및 상기 마우로스부터의 T 세포 부분모집단의 이동을 각각 유동 세포분석법 및 이주 분석으로 연구하였다. 배지 단독, 재조합 CXCL12, CXCL12 코팅된 섬 또는 Ca-LVM-CXCL12 캡슐화된 섬에 반응하는 NOD/LtJ 마우스로부터 유래된 T 세포를 보이든 챔버 기초 분석으로 연구하였다. 각 조건에 대해 상부 챔버를 정제된 CD3+CD8+ T 세포(도 7a 및 7c) 또는 CD4+CD25hi+ Treg 세포(도 7b 및 7d)로 채웠다. 상부 및 하부 웰을 배지, CXCL12(~1㎍/ml), CXCL12(~1㎍/ml)로 코팅된 섬 또는 Ca-LVM-CXCL12(~1㎍/m)로 캡슐화된 섬으로 채웠다. CD3+CD8+ T 세포 및 CD4+CD25hi+ Treg 세포 모두 CXCL12, CXCL12 코팅된 섬 또는 Ca-LVM-CXCL12로 캡슐화된 섬에 반응하여 주화성을 겪었다. 그러나, CD8+ 세포를 Treg 세포보다는 CXCL12, CXCL12 코팅된 섬 또는 Ca-LVM-CXCL12 캡슐화된 섬과 함께 배양하는 경우 현저히 큰 반주화성(fugetactic) 반응이 검출되었다. 검출가능한 수준의 Treg 세포의 반주화성은 수행된 조건에서는 측정되지 않았다.

다음은 CD8+ 세포와 CD4+ Treg 세포간의 CXCL12에 대한 차등 이동 반응이 부분적으로 이들 두 T 세포 부분모집단에 대한 케모카인의 동계 수용체 CXCR4의 차등 발현에 의한 것인지를 측정하기 위한 것이었다. NOD/LtJ 마우스의 비장으로부터의 CD8+ T 세포는 CD4+CD25hiFoxP3+ Treg 세포보다 유의적으로 낮은 수준의 CXCR4를 발현하였다(p< 0.005)(도 7e 및 7f). 이들 데이터는 이식된 동종섬 주위의 캡슐재 내의 CXCL12 코팅 또는 CXCL12 도입으로, 이 이식 모델에서 CD8+ T 세포는 밀쳐지는 반면 이식편 내의 Treg 세포는 우선적으로 채용될 수 있음을 보여준다.

논의

실시예 1 내지 5에 나타낸 연구 결과는 CXCL12를 사용한 섬의 코팅이 STZ 처리된 당뇨병 NOD/LtJ 마우스에서의 동종섬 및 동계섬(syngeneic islet) 이식에서 섬 거부반응을 지연시킬 수 있음을 보여준다. 구체적으로, CXCL12가 도입된 Ca-LVM 기초 알기네이트 캡슐재가 감작화된 당뇨병 NOD/LtJ 마우스로의 이식에서 이전부터 존재하는 체액성 및 세포 매개된 항-섬 반응을 둘 다 갖는 동종섬을 보호하는 것으로 관찰되었다.

실시예 1 내지 5의 이식 모델은 CXCL12를 사용한 섬의 코팅 또는 캡슐화가 이식 부위에서의 Treg 세포의 축적을 야기하는 것을 보여준다.

따라서, 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 종양 및 이식 세트 둘 다에서, Treg 세포의 보유/축적은 면역 억제성 미세환경의 확립과 관련될 수 있다. 본원에 나타낸 연구 결과는 CXCL12를 사용한 동종섬 또는 이종섬의 코팅 또는 캡슐화가 국소 면역 고립의 도입을 통해 지연된 섬 거부반응과 수반된 장기 섬 기능을 야기할 수 있음을 보여준다. 이식된 동종섬 및 이종섬 주위의 임상적 등급 알기네이트 캡슐재로의 CXCL12의 도입으로 전신 면역 억제없이 감작화된 숙주에서 섬 기능을 지속시키고 면역 파괴로부터 보호할 수 있다는 발견은 놀랍고 또한 임상적으로 해석할 수 있는 발견이다.

실시예 1 내지 5에 사용된 예시적 물질 및 방법

동물 및 당뇨병의 유도. 6주령의 암컷 BALB/c(H2^d), 6주령의 암컷 C57BL/6(H2^b) 및 6 내지 8주령의 암컷 NOD/LtJ(H2^g7) 마우스를 사용하였다. 동물은, 예를 들어, 잭슨 래보러토리(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에서 구입할 수 있다. 모든 절차는 매사추세츠 종합병원(Massachusetts General Hospital)의 Subcommittee on Research Animal Care가 승인한 Public Health Service Policy on Humane Care of LaboratoryAnimals이 따라 수행하였다. 고혈당증은 18 내지 20주령의 NOD/LtJ 마우스에서 자발적이었고, 4주령 및 6주령 NOD/LtJ 마우스와 6주령 C57BL/6 마우스에서 200mg/kg의 스트렙토조토신(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)의 복막내(IP) 주사에 의해 유도되었다. 3회 연속 혈당 판독치가 250mg/dl이 넘는 마우스가 고혈당증으로 간주되었다.

췌장섬 분리, CXCL12 코팅 및 알기네이트 캡슐재로의 케모카인의 도입. 원발성 섬을 "Papeta et la., Transplantation 83, 174 (2007)"에 이전에 기재된 바와 같이 공여체 마우스에서 분리하였다. 예를 들어, 섬을 암컷 6주령 BALB/c 공여체, 암컷 6주령 C57BL/6 공여체 또는 암컷 4주령 NOD/LtJ 공여체에서 분리하였다. 췌장에 Liberase TL(예를 들어, ~83㎍/ml)(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)을 통상의 담즙관을 통해 주입하고, ~20분 동안 ~37℃에서 다이제스트하였다. 섬을 폴리수크로즈/포도당 밀도 구배(Mediatech, Manassas, VA) 상에서 정제하고 현미경하에 선별하였다. 섬을 RPMI 1640(Mediatech, 10% 소 태아 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% L-글루타민이 보충됨)에서 적어도 2일 동안 또는 그 보다 길게 배양하여 회수하였다. 신장 캡슐을 통해 이식된 최소 450개의 섬을 이식 전에 ~100ng/ml 또는 ~1㎍/ml CXCL12(PeproTech Inc, Rocky Hill, NJ)를 함유하거나 함유하지 않는 DPBS(Mediatech)에서 ~3시간 동안 ~37℃에서 배양하였다. 별도로, 캡슐화 전에, CXCL12를 ~1㎍/ml의 농도로 액체 Na-LVM 알기네이트(초고순도 LVM, Novamatrix)로 도입하였다.

Ca-LVM 알기네이트 캡슐의 생성 및 이식. 대략 1000개의 C57BL/6 섬을 ~1㎍/ml CXCL12를 함유하거나 함유하지 않는 ~300mOsmo NaCl 용액 중의 ~1.5% 알기네이트(초고순도 LVM, Novamatrix, Drammen, Norway) ~0.75mL에 혼합하였다. 이어서 혼합물을 1500Hz에서 진동하는 1.21kV로 하전된 300㎛ 노즐을 사용하여 주사기가 있는 캡슐화기(Inotech Research Encapsulator, IE-50R)에 넣는다. 알기네이트는, 예를 들어, 300mOsmo(대략 118mM) CaCl₂에서 약 5분 동안 가교결합시키고, 여과한 다음, DMEM(Mediatech)으로 세척하여 과잉 칼슘을 제거한다.

알기네이트 캡슐 내의 CXCL12 보유 및 알기네이트 캡슐로부터의 CXCL12 방출 및 카스파제-3 분석. 캡슐 형성 전에, ~3.6% LVM을 ~10㎍/ml CXCL12(Peprotech, Rocky Hill, NJ) 스톡 용액과 혼합하여 ~1㎍/ml CXCL12를 함유하는 ~3.3% LVM을 수득하였다. 0.5mm 노즐 및 30mL/h의 유속을 사용하여 5kV의 전하에서 정전 액적 생성기(Nisco Engineering, Zurich, Switzerland)를 사용하여 칼슘 가교결합된 LVM 캡슐을 형성하였다. CXCL12를 함유하는 비세포 캡슐을, ~1.6g/L 소 혈청 알부민(Sigma Aldrich)을 함유하는 DMEM(Sigma Aldrich, St. Louis, MO) 중의 비세포 배지 처리된 멀티웰 플레이트에서 배양하였다. 캡슐 대 배지의 비율을 실험 기간에 걸쳐 약 1:2 v/v 로 유지시켰다. 각 시점에서, 캡슐의 ~0.1mL 샘플을 제거하고 110mL 나트륨 시트레이트 용액을 사용하여 가용화하였다. 추가로, 각 시점에서, 모든 배지를 제거하고 신선한 배지를 첨가하였다. 배지 및 가용화된 캡슐 샘플 둘 다 ELISA(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 CXCL12 함량에 대해 분석하였다. 섬 세포소멸(apoptosis)에 대한 CXCL12와 조합된 캡슐화의 효과를 측정하기 위해, 쥐과 섬을 본원에 기재된 바와 같이 ~1㎍/ml CXCL12를 함유하거나 함유하지 않는 알기네이트 캡슐재로 캡슐화하였다. 대조군으로서, 섬을 또한 섬 세포사멸의 공지된 유도제인 스트렙토조토신에 노출시킬 수도 있다. 예를 들어, 섬을 48시간 동안 시험관내에서 이 조건하에 배양할 수 있고, 캡슐화된 섬에서의 카스파제-3 활성을 ELISA 기초 분석(R 및 D 시스템, Minneapolis, MN)을 사용하여 측정하였다.

알기네이트 캡슐로부터의 CXCL12의 염석. CXCL12 캡슐을 다음과 같이 개질하여 위에 기재한 바와 같이 생성시켰다: 캡슐을, 20mM 염화칼슘을 사용하여 가교결합시켜 고농도 염화나트륨 용액에서의 이들의 용해를 방지하였다. 캡슐을 ~0.1% BSA와 함께 ~1M NaCl 중에서 ~6시간 동안 배양한 후, 용액을 수집하고 pH 9.0의 200mM 에틸렌디아민테트라아세트산 이나트륨염(ED2SS)을 사용하여 비드를 용해시켰다. 용액 및 가용화된 캡슐 샘플을 위에 기재한 바와 같이 ELISA를 사용하여 CXCL12를 함량에 대해 분석하였다. 대조군 샘플을 NaCl 비함유 CaCl₂ 용액에서 배양하고, 캡슐에 보유된 CXCL12 및 캡슐로부터 방출된 CXCL12를 측정하였다.

섬 이식 모델. 변화가능하게 처리된 섬을 수용체 마우스의 왼쪽 신장 캡슐 밑에 이식하거나 Ca-LVM 알기네이트로 캡슐화하고 복막강을 통해 이식하였다. 다음 4개의 상이한 예시적 이식 모델을 사용하였다: (1) BALB/C 섬을 STZ 유도된 당뇨병 C57BL/6 마우스의 신장 캡슐 밑에 이식하였다; (2) 전당뇨병(전감작화된) NOD/LtJ 섬을 자발적 당뇨병 NOD/LtJ 마우스의 신장 캡슐 밑에 이식하였다; (3) 전당뇨병(전감작화된) NOD/LtJ 섬을 6주령 당뇨병(전감작화된, STZ 유도된 당뇨병) NOD/LtJ 마우스의 신장 캡슐 밑에 이식하였다; (4) C57BL/6 섬을 Ca-LVM 알기네이트로 캡슐화하고 6주령의 STZ 유도된 당뇨병 NOD/LtJ 마우스의 복막강에 이식하였다.

수용체의 혈당 조절 모니터링. 수용체의 꼬리 정맥 혈당 수준을 1주일에 적어도 2회 모니터링하고 섬 이식편 기능을 해석하는 데 사용하였다. 이식 거부반응은 고혈당증으로의 복귀(예를 들어, 250mg/dl을 넘는 3회 연속 측정을 특징으로 함)로 정의하였다. 이식 거부반응시 마우스를 희생시켰다.

면역조직화학 및 면역형광 염색. 피막 밑 섬 이식편을 함유하는 신장을 파라핀이 도입된 4% 포름알데히드에 고정시키고, 이식편의 5㎛ 절편을 슬라이드용으로 절단하였다. 몇몇 절편을 헤마톡실린 및 에오신(H & E)으로 염색시켰다. 또한 CD3(Dako, Denmark), FoxP3(eBioscience, CA) 및 인슐린(Dako, Denmark)에 대한 원발성 항체를 사용하여 면역조직화학을 수행하였다. 이어서 적합한 2차 항체를 각각의 원발성 항체와 쌍(pair)을 짓고 DAB(3,3'-디아미노벤지딘)를 염색용 기질로서 사용하였다. 핵염색(청색)을 아비딘-바이오틴 복합체 IHC 염색법을 위한 마이어의 해말럼(Meyer's haemalum)으로 수행하였다. 10배 확대율의 Zeiss Axio Observer Z1을 사용하여 카메라 이미지를 찍고 섬 이식편 절편을 CD3+ 및/또는 FoxP3+ T 세포 침윤에 대해 수기하였다. 각각의 마커에 양성인 세포의 수를 이식 부위 근처의 5개의 무작위 선택된 고배율 영역에 기록하였다. 인슐린(기니 피그 항-인슐린, 1:800, Invitrogen) 및 CXCL12(토끼 항-마우스 CXCL12, 1:200, Cell Sciences)에 대한 형광 원발성 항체를 사용하여 면역형광 염색을 또한 수행하였다. 슬라이드를 세척하고, 원발성 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 배양한 다음, 적합한 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다(염소 항-기니 피그 IgG[Dylight 488, 1:200, Jackson Immunoresearch] 및 염소 항-토끼 IgG[Dylight 549, 1:200, Jackson Immunoresearch]). 2차 항체를 적용한 후, 조직을 세척하고, To-Pro-3(1:5000, Invitrogen)으로 대조염색하고, 적층시켰다. 면역형광 슬라이드의 디지털 이미지를 공초점 현미경으로 수득하였다(LSM 5 Pascal, Carl Zeiss).

사이클로스포린 A 처리. C57BL/6 마우스에 PBS 또는 CXCL12(~1㎍/ml)로 코팅된 450개의 BALB/c 섬을 이식하였다. 수용체는 다음 3가지 처리 그룹 중 하나로 처리되었다: (A) PBS 코팅된 섬의 수용체를 위한 사이클로스포린 A(CsA, Sigma) 주사; (B) CXCL12 코팅된 섬의 수용체를 위한 CsA 주사; 및 (C) CXCL12 코팅된 섬의 수용체를 위한 PBS 주사. 그룹 A 및 B의 경우, CsA를 에탄올에 용해시켜 제조하고 이식한 날 및 그 후 이식 거부반응이 있을 때까지 매일 ~2mg/kg으로 피하 주사하였다.

혼합된 림프구 반응. 반응 세포 공여를 위한 C57BL/6 마우스(n= 3/그룹)를 다음 3개의 그룹 중 하나에 할당하였다: CXCL12 코팅된 섬 이식, 코팅되지 않은 섬 이식 또는 비처리. 변동가능한 처리 후 10일에, 비장을 기계적으로 파괴하고 여과한 다음, M-용해 완충제(R&D Systems)를 사용하여 적혈구를 용해시켰다. 비처리된 BALB/c 마우스 비장으로부터의 동종이계 자극 세포를 유사하게 준비하고, 37℃에서 1시간 동안 20㎍/ml Mitomycin C(Sigma Aldrich)와 함께 배양하고, 배지로 반복 세척하고, 37℃ 및 5% CO₂에서 반응 세포와 함께 1:1 비율로 3일 동안 공동 배양하였다. 자극 종결 전 18시간에, 세포를 브로모데옥시유리딘(BrdU, BD Biosciences)의 1mM 용액으로 펄싱(pulsing)하였다. 배양한 지 72시간 후, 세포를 세척하고, 이어서 항-마우스 CD3(APC-Cy7), CD8(PerCP) 및 CD4(PE-Cy7)(BD Biosciences)로 염색하였다. 세포를 Cytofix/Cytoperm(BD Biosciences)으로 침투성으로 만들고, DNase 소화(Sigma Aldrich)시키고, PE-컨쥬게이트 항-BrdU 항체(BD Biosciences)로 염색하였다. 유동 세포분석을 LSRII(BD Biosciences)에 대해 수행하고, 데이터를, BrdU를 포함하는 비장당 비자극된 세포 수를 제외한 T 세포(자극되었고 BrdU를 포함)에 대해 FlowJo 소프트웨어(TreeStar)로 분석하였다.

이동 분석. 2가지 종류의 이동 분석을 수행하였다. 첫 번째, 세포 이동을 "Poznansky et al., Journal of clinical investigation, 109, 1101 (2002)"에 이전에 기재된 바와 같이 보이든 챔버(96-웰 포맷, 3㎛ 공극; ChemoTx System, Neuro Probe Inc, Gaithersburg, MA)를 사용하여 측정하였다. 예를 들어, 0.5% FBS가 보충된 ~30μL의 RPMI 1640을 50개의 대조군 섬 또는 1㎍/ml CXCL12(PeproTech Inc, Rocky Hill, NJ)로 코팅된 섬과 함께 하부 및 상부 챔버에 첨가하였다. CD4, CD25 및/또는 CD8 MACS 분리 키트(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)로 각각 분리된 7,000개의 T-reg 세포 또는 CD8 T 세포를 보이든 챔버의 상부 챔버에 부하하였다. 37℃ 및 5% CO₂에서 3시간 동안 배양한 후, 막의 상부 표면 상의 세포를 제거하고 세포를 하부 챔버로 이동시키고 3회 계수하였다. 별도로, 캡슐 내로 CXCL12가 도입되어 있거나 있지 않은 캡슐화된 섬으로의 이동을 또한 트랜스웰 시스템(Transwell system)(24-웰 포맷, 3㎛ 공극, Corning)을 사용하여 측정하였다. 간단히 말하면, 0.5% FBS가 보충된 500μl의 RPMI 1640을 단독으로 또는 10개의 대조군 캡슐 또는 ~1㎍/ml CXCL12 도입된 캡슐과 함께 저부 챔버에 부하하였다. 100μl의 배지를 단독으로 또는 변경가능하게 처리된 캡슐과 함께, 목적한 집락의 10⁵개의 세포와 함께 상부 챔버에 부하하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO₂에서 3시간 동안 배양하고 이동된 세포의 수를 3회 계수하였다. 두 분석을 위해, 이동 지수를 CXCL12 존재하에서 계수된 세포의 수와 배지 단독 대조군에서 계수된 세포의 수 사이의 비로서 계산하였다.

T 세포 서브셋에 대한 CXCR4 발현의 정량화. 비장세포를 비처리된 NOD/LtJ 마우스로부터 수확하고 마우스 적혈구 용해 완충제(Mouse Erythrocyte Lysing Buffer(R&D Systems))를 사용하여 적혈구를 용해시켰다. 이어서 세포를 표면 마커 CD3ε, CD4, CD8α, CD25 및 CXCR4(CD184)(CD3ε: 클론 145-2C11; CD4: 클론 RM 4-5; CD8α: 클론 53-6.7; CD25: 클론 PC61; CXCR4: 클론 2B11, BD Biosciences)에 대해 염색하고, 고정시키고, 제조자의 지시에 따라 BD Cytofix/Cytoperm(BD Biosciences)으로 침투성으로 만들고, 세포내 마커 FoxP3(클론 MF23, BD Biosciences)에 대해 염색하였다. 유동 세포분석법을 4 Laser LSR II(BD Biosciences)로 수행하였다. FlowJo 소프트웨어(Tree Star)를 사용하여 데이터를 분석하고 형광-마이너스-원 게이팅 전략(fluorescence-minus-one gating strategy)을 사용하여 게이팅을 완수하였다.

통계적 분석. 그룹들 간의 섬 이식편 생존을 카플란-마이어법을 사용하여 비교하고, 생존 데이터는 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 5 통계적 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 수치 변수는 스튜던트 t 시험을 사용하여 비교하였다. 0.05 미만의 p 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

상술한 기재로부터, 본원에 기재된 발명을 다양한 용도 및 조건에 사용되도록 변형 및 수정할 수 있음이 명백할 것이다. 이러한 실시양태는 또한 하기 특허청구범위의 범위 내에 있다. 본원의 변수의 임의의 정의에서의 구성 요소의 목록에 대한 설명은 그 변수의 정의를 열거된 구성 요소 단독 또는 조합(또는 부분조합)으로서 포함한다. 본원의 실시양태의 설명은 그 실시양태를 임의의 단일 실시양태 또는 기타 실시양태와의 조합 또는 그의 일부로서 포함한다.

참조문헌

본 명세서에 언급된 모든 특허, 특허출원 및 문헌은 각각의 독립적인 특허 및 문헌이 참조로 도입된 것이 구체적으로 및 개별적으로 제시된 것처럼 같은 정도로 참조로 본원에 도입된다. 본원에 도입된 참조문헌은 다음을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다:

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Claims

CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스로 캡슐화된 하나 이상의 세포를 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 매트릭스가 약 1.0ng/mL/hr 이상의 속도로 CXCL12 폴리펩타이드를 방출하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 CXCL12 폴리펩타이드가 약 1.0ng/mL/hr 내지 약 3ng/mL/hr의 속도로 방출되는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 CXCL12 폴리펩타이드가 상기 매트릭스 내에 약 100ng/mL의 농도로 존재하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 매트릭스가 캡슐을 형성하는, 조성물.
제5항에 있어서, 상기 매트릭스 두께가 약 200 내지 약 500㎛인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포가 동종이계(allogeneic) 세포 또는 이종(xenogeneic) 세포인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포가 약 1개월 이상 동안 활성을 유지하는, 조성물.
제8항에 있어서, 상기 활성이 대상체에서의 혈당 수준을 조절하는 것인, 조성물.
제9항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포가 섬세포(islet cell)인, 조성물.
제10항에 있어서, 상기 섬세포가 인슐린 생산 세포, iPS(induced pluripotent stem) 세포로부터 유래된 섬세포, 돼지 섬세포 또는 사람 섬세포인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 CXCL12 폴리펩타이드가 약 1.75ng/mL/hr의 속도로 방출되는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 매트릭스가 알기네이트 겔을 포함하는, 조성물.
제13항에 있어서, 상기 알기네이트 겔이 마누론산(M) 및 굴루론산(G)을 약 1 또는 1 초과의 (M/G) 비로 포함하는, 조성물.
제14항에 있어서, 상기 알기네이트 겔이 약 2% w/v인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 CXCL12 폴리펩타이드가 사람 CXCL12 폴리펩타이드인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 매트릭스 내의 CXCL12 폴리펩타이드의 농도가 약 3개월 내지 약 2년 동안 약 1㎍/ml 내지 약 100ng/ml의 농도로 유지되는, 조성물.
제17항에 있어서, 상기 매트릭스 내의 CXCL12 폴리펩타이드의 유지된 농도가 약 100 내지 200ng/ml인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 매트릭스 내의 CXCL12 폴리펩타이드가 상기 매트릭스 내의 섬세포에 의해 제공되는, 조성물,
제1항에 있어서, 상기 매트릭스의 평균 공극 크기가 약 130KD보다 큰 분자는 제외시키는, 조성물.
제1항에 있어서, CXCL12 폴리펩타이드를 발현하는 세포의 층을 추가로 포함하는, 조성물.
제21항에 있어서, 상기 세포가 중피세포인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 매트릭스 위에 CXCL12 폴리펩타이드의 흡수층을 추가로 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포가 제거되는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포가 상기 매트릭스로 생체내 제공되는, 조성물.
제1항에 있어서, CXCL12 폴리펩타이드가 효과기(effector) T 세포를 밀쳐내기에 충분한 속도로 방출되는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 보이든 챔버(boyden chamber) 내에서 시험관내 효과기 T 세포를 밀쳐내는 능력을 특징으로 하는, 조성물.
섬세포를 이를 필요로 하는 대상체에 제공하는 방법으로서, 상기 방법은 제10항의 조성물을 대상체에 주입(implant)하는 것을 포함하고, 상기 섬세포는 일정 기간 동안 대상체에서 혈당을 조절하는, 제공방법.
제28항에 있어서, 상기 일정 기간이 약 1개월 이상인, 방법.
제28항에 있어서, 상기 섬세포가 대상체의 공복 혈청 포도당 농도를 약 80mg/dl 내지 약 120mg/dl의 혈액 수준으로 유지시키는, 방법.
제28항에 있어서, 상기 대상체에 CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스로 캡슐화된 섬세포를 하나 이상 포함하는 조성물을 반복 주입하는, 방법.
제28항 또는 제31항에 있어서, 상기 매트릭스가 효과기 T 세포 또는 대식세포에 의해 붕해되지 않는, 방법.
제28항에 있어서, 조절 T 세포가 주입 부위에 존재하는, 방법.
제28항에 있어서, 효과기 T 세포가 주입 부위에 부재하는, 방법.
제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 조절 T 세포의 존재 또는 상기 효과기 T 세포의 부재가 유동 세포분석법 또는 면역조직화학으로 측정되는, 방법.
CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스로 캡슐화된 동종이식편 또는 이종이식편 섬세포를 포함하는 조성물로서, 상기 매트릭스가
a) 200 내지 500㎛의 매트릭스 두께, 약 100ng/ml 내지 약 1㎍/ml의 매트릭스 내의 CXCL12 폴리펩타이드의 농도;
b) 타입 I 당뇨병을 갖는 대상체에서의 혈청 포도당 농도를 조절하는 작용제가 매트릭스를 통해 확산되도록 하는 기공도;
c) 상기 작용제와 섬세포와의 상호작용을 기초로 한 상기 섬세포에 의한 인슐린 생산(인슐린은 상기 매트릭스를 통해 대상체에서의 혈청 포도당 농도를 조절하기에 충분한 속도로 방출된다)을 특징으로 하고,
상기 매트릭스 두께, CXCL12 농도 및 용출 속도는 약 4개월까지의 기간 동안 상기 섬세포의 붕해를 억제하도록 선택되고, 이에 의해 상기 기간 동안 상기 대상체에서의 혈당 수준의 조절이 제공되는, 조성물.
제36항에 있어서, 상기 기간이 약 6개월인, 조성물.
섬세포 보충이 필요한 현존하는 이종이식편 섬세포 침착물을 갖는 대상체에서 섬세포를 보충하는 방법으로서,
a) 상기 대상체에 현존하는 섬세포의 반감기를 재고;
b) 상기 섬세포의 집계된 반감기가 일정 기간 동안 상기 대상체에서의 혈당 조절을 제공하는 치료적 수준이도록 섬세포를 대상체에 제공하고;
c) 상기 섬세포의 반감기를 기초로 단계 a) 및 b)를 반복하는 것을 포함하는, 보충 방법.
CXCL12 폴리펩타이드 용출 매트릭스를 포함하는 조성물로서, 상기 매트릭스가
a) CXCL12 폴리펩타이드가 상기 조성물로부터 서서히 용출되고 자가면역 질환의 활성 부위를 통과하도록 하는 기공도;
b) 투여된 후 상기 조성물이 이동되지 않게 만들어 상기 매트릭스의 상당한 부분이 상기 조성물의 투여 부위 및 투여 부위 부근에 위치하도록 하는 작용제를 특징으로 하고,
CXCL12 폴리펩타이드 농도 및 용출 속도는 상기 자가면역 질환의 추가 발달을 억제하도록 선택되는, 조성물.
제39항에 있어서, 상기 투여가 주사에 의한 것인, 조성물.