JP7033066B2

JP7033066B2 - 免疫寛容応答を生成する組成物及び方法

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Publication number: JP7033066B2
Application number: JP2018535329A
Authority: JP
Inventors: コーヘン、スマダール; モンソネゴ、アロン
Original assignee: ビー．ジー．ネゲブテクノロジーズアンドアプリケーションズリミテッド，アットベン‐グリオンユニバーシティー
Priority date: 2016-01-07
Filing date: 2017-01-05
Publication date: 2022-03-09
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Description

本発明は、概して、免疫寛容応答を生成する組成物及び方法に関する。詳細には、本発明は、免疫寛容応答を生成するための、硫酸化多糖類及び生物活性ポリペプチドを含む組成物に関する。

細胞同種移植拒絶の防止は、現在の細胞治療ストラテジーにおける大きな課題である。このような拒絶反応は、同種移植反応性エフェクターであるＣＤ４細胞及びＣＤ８Ｔ細胞によってもたらされる。免疫抑制薬による生涯にわたる治療は、アロ反応及び移植拒絶を減弱させることができるが、感染及び悪性腫瘍のリスク増加と関係がある。近年、栄養素及び老廃物に対して透過性を有する膜カプセル内の細胞カプセル化に依存する、同種異系細胞移植の免疫拒絶を防止するためのいくつかの生体材料ベースのストラテジーが開発されている。しかしながら、カプセルは、細胞侵入及び血管新生も阻害するため、デバイスのサイズは、２００μｍの酸素拡散距離に制限される。

理想的な細胞移植デバイスは、移植した細胞の生存能力を維持するためにその全体積の血管新生を可能にし、かつ宿主との移植片同化を促進すべきである。しかしながら、デバイスの血管新生は、しばしば、血液循環による白血球の広範な浸潤に起因して、同種移植拒絶のリスク増加と関連する。

トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）は、免疫調節性サイトカインであり、それは、自己免疫疾患及び癌において明らかであるように炎症過程を抑制するように作用するので、免疫寛容微小環境の生成を促進することができる。ＴＧＦ－βリッチ環境では、抗原を取り込む樹状細胞（ＤＣ）が免疫寛容原性となり、ＣＤ４＋Ｔ細胞の抗炎症調節性Ｔ細胞への分化をもたらし、エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞の産生だけでなく、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及び増殖も抑制する。

したがって、望ましくない全身的作用を回避しつつ、局所的な免疫寛容微小環境を生成するための改善された組成物及び方法が求められている。

本発明は、一態様では、対象における免疫寛容応答を誘導する方法であって、前記対象に対して、硫酸化多糖類と、該硫酸化多糖類の硫酸基に対して非共有的に結合する生物活性ポリペプチドとを含む組成物を投与するステップを有する方法に関する。一実施形態では、前記生物活性ポリペプチドは、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ－β１）である。

別の態様では、本発明は、対象における同種移植拒絶を減少させるかまたは防止する方法であって、前記対象に対して、硫酸化多糖類と、該硫酸化多糖類の硫酸基に対して非共有的に結合する生物活性ポリペプチドとを含む組成物を投与するステップを有する方法に関する。一実施形態では、前記生物活性ポリペプチドは、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ－β１）ある。

また、本発明は、対象における自己免疫疾患または障害を治療する方法であって、
前記対象に対して、硫酸化多糖類と、該硫酸化多糖類の硫酸基に対してそれぞれ非共有的に結合する第１の生物活性ポリペプチド及び第２の生物活性ポリペプチドとを含む組成物を投与するステップを有し、前記組成物が、支持マトリックスをさらに含み、前記支持マトリックスが、多糖類、タンパク質、細胞外マトリックス成分、合成ポリマー、及びそれらの任意の混合物からなる群より選択されるポリマーを含む方法に関する。一実施形態では、前記第１の生物活性ポリペプチドは、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ－β１）である。一実施形態では、前記第２の生物活性ポリペプチドは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）である。

アルギン酸硫酸塩／アルギン酸塩スキャフォールドの作製プロセスを示す。９０％のアルギン酸塩と１０％のアルギン酸硫酸塩との混合物を、カルシウムイオンを用いて架橋させた。次いで、その混合物を、９６ウェルプレートに注入し、凍結乾燥させ、マクロ多孔質スキャフォールドを作製した。ＴＧＦ－β及び血管新生因子を、スキャフォールドのアルギン酸硫酸塩に親和結合させた。アルギン酸硫酸塩スキャフォールドに親和結合したとき、及び元のスキャフォールドに吸収されたときの、残存したＴＧＦ－βの割合を表すグラフ。割合は、ＥＬＩＳＡで検出した、７日間の総入力ＴＧＦ－βから計算した。０．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－βに曝露させてから４０分後のＮＩＨ－３Ｔ３線維芽細胞の細胞株の溶解物を用いた、ｐ－ＳＭＡＤ２及びｐ－ＳＭＡＤ３のウェスタンブロットのプロット。Ｐ－ＳＭＡＤ２／アクチンのウェスタンブロットの分析を示すグラフ。レーン１：培地、ＴＧＦ－βなし；レーン２：培地＋ＴＧＦ－β；レーン３：スキャフォールドから経時的に放出されたＴＧＦ－β；レーン４：酸性ｐＨでＡｌｇ／ＡｌｇＳスキャフォールドから分離した後のａｆＴＧＦ－β；レーン５：ＥＤＴＡでアルギン酸硫酸塩／アルギン酸塩スキャフォールドを溶解させた後のａｆＴＧＦ－β。データは、３回の反復実験の平均値及びＳＤを表す。インビトロ実験のタイムラインを示す：ａｆＴＧＦ－β（５０ｎｇ／スキャフォールド）を含むまたは含まないＯＴＩＩ脾細胞を、スキャフォールド内に播種した。播種から２時間後、ＯＶＡペプチド（２０μｇ／ｍｌ）を培地に添加して脾細胞を活性化し、その後、サイトカインを測定した。ＴＧＦ－ＯＶＡ対照群と比較した、ＩＬ－１７（７２時間）のサイトカイン分泌の倍率変化を測定したグラフ。ＴＧＦ－ＯＶＡ対照群と比較した、ＩＬ－１０（４８時間）のサイトカイン分泌の倍率変化を測定したグラフ。ＴＧＦ－ＯＶＡ対照群と比較した、ＩＬ－２（２４時間）のサイトカイン分泌の倍率変化を測定したグラフ。ＴＧＦ－ＯＶＡ対照群と比較した、ＩＦＮ－γ（４８時間）のサイトカイン分泌の倍率変化を測定したグラフ。活性化後３日目の、リンパ球を示すＦＡＣＳプロット及びＣＤ４Ｔ細胞ゲーティングの代表的なＦＡＣＳプロット。活性化後３日目の、ＣＤ２５及びＦｏｘｐ３を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の代表的なＦＡＣＳプロット。ＴＧＦ－β欠損構築物の代表的なＦＡＣＳヒストグラムと比較した、ａｆＴＧＦ－β構築物内のＴｒｅｇの頻度の増加を示すＦＡＣＳヒストグラム。－ＴＧＦ－ＯＶＡ対照と比較した、ａｆＴＧＦ－βを含む及び含まない全ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｒｅｇの割合を測定したグラフ。赤：ａｆＴＧＦ－β；青：ＴＧＦ－β欠損；黒：対照。データは、３回の反復実験の平均値及び３つの別個の実験のＳＥＭを表す。結果は、不対ｔ検定により比較した（^＊＊ｐ＜０．０１）。播種後３日目の、ＣＤ２５及びＦｏｘｐ３を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の代表的なＦＡＣＳプロット。脾細胞をａｆＴＧＦ－β構築物及びＴＧＦ－β欠損構築物中で培養し、抗ＩＬ－１０（１ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ＯＶＡによって刺激した。赤：ａｆＴＧＦ－β；青：ＴＧＦ－β欠損；黒：対照。ａｆＴＧＦ－β構築物とＴＧＦ－β欠損構築物との間にＴｒｅｇの頻度の差がないことを示す代表的なＦＡＣＳヒストグラム。赤：ａｆＴＧＦ－β；青：ＴＧＦ－β欠損；黒：対照。ＴＧＦ－ＯＶＡ対照群と比較した、ａｆＴＧＦ－βを含むまたは含まない全ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｒｅｇの割合を示す。ＴＧＦ－ＯＶＡ対照と比較した、ａｆＴＧＦ－βを含むまたは含まないＩＬ－２分泌の倍率変化を示す。ＴＧＦ－ＯＶＡ対照と比較した、ａｆＴＧＦ－βを含むまたは含まないＩＦＮ－γ分泌の倍率変化を示す。ＴＧＦ－ＯＶＡ対照と比較した、ａｆＴＧＦ－βを含むまたは含まないＩＬ－１７分泌の倍率変化を示す。共培養後３日目の、ＣＤ２５及びＦｏｘｐ３を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の代表的なＦＡＣＳプロット。ＯＶＡＴ細胞を、ａｆＴＧＦ－β構築物及びＴＧＦ－β欠損構築物中で、ＣＤ１１ｃ^ｄｎｒＴｇマウス由来の脾細胞と共培養した。赤：ａｆＴＧＦ－β；青：ＴＧＦ－β欠損；黒：対照。ａｆＴＧＦ－β構築物とＴＧＦ－β欠損構築物との間に、Ｔｒｅｇ集団の差異がないことを示す代表的なＦＡＣＳヒストグラム。赤：ａｆＴＧＦ－β；青：ＴＧＦ－β欠損；黒：対照。ＴＧＦ－ＯＶＡ対照群と比較した、ａｆＴＧＦ－βを含むまたは含まない全ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｒｅｇの割合を測定したグラフ。ＴＧＦ－ＯＶＡ対照群と比較した、ａｆＴＧＦ－βを含むまたは含まないＩＬ－２分泌の倍率変化を測定したグラフ。ＴＧＦ－ＯＶＡ対照群と比較した、ａｆＴＧＦ－βを含むまたは含まないＩＦＮ－γ分泌の倍率変化を測定したグラフ。ＴＧＦ－ＯＶＡ対照群と比較した、ａｆＴＧＦ－βを含むまたは含まないＩＬ－１７分泌の倍率変化を測定したグラフ。ＴＧＦ－ＯＶＡ対照群と比較した、ａｆＴＧＦ－βを含むまたは含まないＩＬ－１０分泌の倍率変化を測定したグラフ。移植後の１０日目の線維芽細胞を含有する回収されたデバイスのＰＥＣＡＭ（ＣＤ３１）染色された凍結切片の、スキャフォールドへの宿主内皮細胞浸透を示す。移植後の１５日目の、アロ線維芽細胞（緑色）を含有するＴＧＦ－β欠損構築物内に形成された血管（赤色）の共焦点イメージングを示す。移植後の１５日目の、アロ線維芽細胞（緑色）を含有するａｆＴＧＦ－β欠損構築物内に形成された血管（赤色）の共焦点イメージングを示す。ＰＥＣＡＭ染色が占める面積を切片の総面積で割ることにより求めた血管密度を表すグラフ。データは、ＰＥＣＡＭ免疫染色断面スライドから無作為に選択した１５の異なるフィールドから収集した。ｎ＝５；結果は、不対ｔ検定により比較した（ｐ＜０．０５）。ａｆＴＧＦ－βを含まない構築物への浸透細胞を示す、ＣＤ１１ｃ＋細胞ゲーティングを示す代表的なＦＡＣＳプロット。ａｆＴＧＦ－β構築物と比較した、ＴＧＦ－β欠損構築物中の成熟ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８６＋ＤＣの増加レベルを示すＦＡＣＳプロット。全ＣＤ１１ｃ＋細胞由来のＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８６＋集団の割合が、ＴＧＦ－β欠損構築物において有意に高かったことを示すグラフ。ＴＧＦ－β欠損構築物に浸透するＣＤ４Ｔ細胞のゲーティングを示すＦＡＣＳプロット。ａｆＴＧＦ－β構築物及びＴＧＦ－β欠損構築物でゲートされた全浸透ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｒｅｇｓ割合を示すＦＡＣＳプロット。移植後の１０日目のａｆＴＧＦ－β構築物中のデバイスに浸透する全ＣＤ４＋Ｔ細胞において、Ｔｒｅｇｓ集団が有意に大きかったことを示すグラフ。ＴＧＦ－β欠損構築物中の浸透性リンパ球のゲーティングを示すＦＡＣＳプロット。ａｆＴＧＦ－βを含むまたは含まない構築物中のＣＤ６＋浸透性Ｔ細胞を示すＦＡＣＳプロット。ａｆＴＧＦ－β構築物及びＴＧＦ－β欠損構築物における全浸透性リンパ球に対する浸透性ＣＤ８＋集団の割合を示すグラフ。ＴＧＦ－β欠損構築物における浸透性ＣＤ８＋Ｔ細胞のゲーティングを示すＦＡＣＳプロット。ａｆＴＧＦ－βを含むまたは含まない構築物における活性ＣＤ８＋ＣＤ６９＋浸透性Ｔ細胞を示すＦＡＣＳプロット。ａｆＴＧＦ－βを有する全ＣＤ８＋浸透性Ｔ細胞に対する活性ＣＤ８＋ＣＤ６９＋Ｔ細胞の割合が、ＴＧＦ－β欠損構築物よりも低かったことを示すグラフ。移植後１５日目：ａｆＴＧＦ－β構築物におけるＧＦＰ＋線維芽細胞集団のゲーティングを示すＦＡＣＳプロット。移植後３日目に残存する線維芽細胞由来のＧＦＰ＋線維芽細胞の割合を示すグラフ。構築物の内部に残存したａｎｎｅｘｉｎＶ及びＰＩ染色ＧＦＰ＋細胞を測定するＦＡＣＳプロットを示す。生存線維芽細胞（ＧＦＰ＋ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＰＩ－）の割合がａｆＴＧＦ－βを有するデバイスにおいて有意に高かったことを示すグラフ。アポトーシス線維芽細胞（ＧＦＰ＋ＡｎｎｅｘｉｎＶ＋ＰＩ－）の割合がＴＧＦ－β欠損構築物において有意に高かったことを示すグラフ。ＴＧＦ－β欠損構築物中の死亡線維芽細胞（ＧＦＰ＋ＡｎｎｅｘｉｎＶ＋ＰＩ＋）の割合が有意に高かったことを示すグラフ。ｎ＝１２、各時点で結果を不対ｔ検定により比較した（^＊ｐ＜０．０５）。野生型（ＷＴ）マウス対照群と比較した、移植後の１５日目及び３０日目におマウスから単離し、培養し、アロ線維芽細胞溶解物を用いて活性化させた脾細胞によるＩＬ－１７（７２時間）の分泌の変化倍率を測定したグラフ。野生型（ＷＴ）マウス対照群と比較した、移植後の１５日目及び３０日目におマウスから単離し、培養し、アロ線維芽細胞溶解物を用いて活性化させた脾細胞によるＩＬ－２（２４時間）の分泌の変化倍率を測定したグラフ。野生型（ＷＴ）マウス対照群と比較した、移植後の１５日目及び３０日目におマウスから単離し、培養し、アロ線維芽細胞溶解物を用いて活性化させた脾細胞によるＩＦＮ－γ（４８時間）の分泌の変化倍率を測定したグラフ。野生型（ＷＴ）マウス対照群と比較した、移植後の１５日目及び３０日目におマウスから単離し、培養し、アロ線維芽細胞溶解物を用いて活性化させた脾細胞によるＩＬ－１０（４８時間）の分泌の変化倍率を測定したグラフ。細胞傷害アッセイ中にキャプチャした、インビトロでアロ繊維芽細胞とシナプスを形成する細胞傷害性ＣＤ８（ＧｒａｎｚｙｍｅＢ染色ＣＤ８＋、青色）Ｔ細胞の代表的な共焦点画像を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ａｆＴＧＦ－β及び移植したまたは移植しなかった宿主及びＷＴマウスの全脾細胞から移植後の１５日目及び３０日目に磁気的に単離し、次いで、アロ繊維芽細胞と１：４の比率で共培養した。細胞毒性アッセイにおいて線維芽細胞と共培養したＣＤ８＋ＣＤ１０７＋細胞の代表的なＦＡＣＳプロット。ＴＧＦ－β欠損構築物を移植した宿主から生成された場合、全ＣＤ８＋細胞に対する細胞傷害性ＣＤ８＋ＣＤ１０７＋Ｔ細胞の割合が、ｆＴＧＦ－β構築物及びＷＴマウスと比較して有意に高かったことを示すグラフ。ＴＧＦ－β欠損構築物を移植された宿主から生成された場合、全ＣＤ８＋細胞に対する細胞傷害性ＣＤ８＋ＣＤ１０７＋Ｔ細胞の割合が、ａｆＴＧＦ－β構築物及びＷＴマウスと比較して有意に高かったことを示すＦＡＣＳプロット。細胞毒性アッセイ後の全共培養線維芽細胞に対するアポトーシス性ＧＦＰ＋ＡｎｎｅｘｉｎＶ＋ＰＩ－線維芽細胞の割合を測定したグラフ。結果は、２元配置分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙＡＮＯＶＡ）により比較した、３回の反復実験の平均値と２つの別個の実験のＳＥＭを表す。Ｔｕｋｅｙの事後検定を行い、処置間の差異を決定した（^＊ｐ＜０．０５）。ＯＴＩＩマウスの脾臓から単離し、ＯＶＡペプチド（最終ペプチド濃度：２０μｇ／ｍｌ）を含むまたは含まないアルギン酸骨格内に播種した脾細胞の活性化７２時間後の共焦点画像を示す。播種日及び活性化３日後のリンパ球の代表的なＦＡＣＳプロット。上段の（Ａ）は、ＯＶＡ活性化が培養中のＣＤ４＋Ｔ細胞の維持に有効であることを示す、活性化したまたは活性化しなかった、播種前及び播種後３日目に発見されたＣＤ４＋Ｔ細胞集団のＦＡＣＳプロット。下段の（Ｂ）は、ＯＶＡ活性化の有無にかかわらず、播種前及び播種後３日目に発見されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓ集団のＦＡＣＳプロットであり、ＯＶＡペプチドによるＣＤ４＋活性化を示す。骨髄ＤＣを有し、ａｆＴＧＦ－β（５０ｎｇ／スキャフォールド）を含むまたは含まないアルギン酸スキャフォールド内で共培養した（０．５×１０^６細胞／培養物）ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＯＴＩＩマウスから磁気的に分離した）に対するＩＬ－２の分泌レベルを測定したグラフ。Ｔ細胞がＯＶＡペプチドによって活性化されたことが示された。骨髄ＤＣを有し、ａｆＴＧＦ－β（５０ｎｇ／スキャフォールド）を含むまたは含まないアルギン酸スキャフォールド内で共培養した（０．５×１０^６細胞／培養物）ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＯＴＩＩマウスから磁気的に分離した）に対するＩＦＮ－γの分泌レベルを測定したグラフ。Ｔ細胞がＯＶＡペプチドによって活性化されたことが示された。骨髄ＤＣを有し、ａｆＴＧＦ－β（５０ｎｇ／スキャフォールド）を含むまたは含まないアルギン酸骨格内で共培養した（０．５×１０^６細胞／培養物）ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＯＴＩＩマウスから磁気的に分離した）に対するＩＬ－１７の分泌レベルを測定したグラフ。Ｔ細胞がＯＶＡペプチドによって活性化されたことが示された。ａｆＴＧＦ－βの存在下でのＩＦＮ－γ及びＩＬ－１７レベルの有意な減少は、ａｆＴＧＦ－βの免疫調節を示す。骨髄ＤＣを有し、ａｆＴＧＦ－β（５０ｎｇ／スキャフォールド）を含むまたは含まないアルギン酸スキャフォールド内で共培養した（０．５×１０^６細胞／培養物）ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＯＴＩＩマウスから磁気的に分離した）に対するＩＬ－１０の分泌レベルを測定したグラフ。Ｔ細胞がＯＶＡペプチドによって活性化されたことが示された。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇのレベルを測定したグラフであり、ａｆＴＧＦ－β処置を受けた培養物において明らかなＴｒｅｇレベルの増加傾向を示す。結果は、２元配置分散分析により比較した、３回の反復実験の平均値及びＳＤを表す。Ｔｕｋｅｙの事後検定を行い、処置間の差異を決定した（^＊ｐ＜０．０５）。ＯＴＩＩマウスから単離し、培養物に１００ｎｇ／ｍｌ（０．５ｍｌの培地の５０ｎｇ／スキャフォールドのａｆＴＧＦ－β濃度に対応する）の最終濃度で添加した可溶性ＴＧＦ－βの存在下で培養し、２Ｄペトリ皿内でＯＶＡペプチド（最終濃度２０μｇ／ｍＬ）によって活性化させた全脾細胞によるＩＬ－２の分泌の倍数変化を、ＴＧＦ－β及びＯＶＡを含まない対照群と比較して示す。これにより、脾細胞が、ＯＶＡペプチドにより活性されたことが示された。ＯＴＩＩマウスから単離し、培養物に１００ｎｇ／ｍｌ（０．５ｍｌの培地の５０ｎｇ／スキャフォールドのａｆＴＧＦ－β濃度に対応する）の最終濃度で添加した可溶性ＴＧＦ－βの存在下で培養し、２Ｄペトリ皿内でＯＶＡペプチド（最終濃度２０μｇ／ｍＬ）によって活性化させた全脾細胞によるＩＦＮ－γの分泌の倍数変化を、ＴＧＦ－β及びＯＶＡを含まない対照群と比較して示す。これにより、ＴＧＦ－βの免疫調節作用が示された。ＩＬ－１０の分泌の変化（ｄ）は、ＴＧＦ－βを含むまたは含まない培地間の差異によるものではなく、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ集団に差異がないことによる。ＯＴＩＩマウスから単離し、培養物に１００ｎｇ／ｍｌ（０．５ｍｌの培地の５０ｎｇ／スキャフォールドのａｆＴＧＦ－β濃度に対応する）の最終濃度で添加した可溶性ＴＧＦ－βの存在下で培養し、２Ｄペトリ皿内でＯＶＡペプチド（最終濃度２０μｇ／ｍＬ）によって活性化させた全脾細胞によるＩＬ－１７の分泌の倍数変化を、ＴＧＦ－β及びＯＶＡを含まない対照群と比較して示す。これにより、ＴＧＦ－βの免疫調節作用が示された。ＩＬ－１０の分泌の変化（ｄ）は、ＴＧＦ－βを含むまたは含まない培地間の差異によるものではなく、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ集団に差異がないことによる。ＯＴＩＩマウスから単離し、培養物に１００ｎｇ／ｍｌ（０．５ｍｌの培地の５０ｎｇ／スキャフォールドのａｆＴＧＦ－β濃度に対応する）の最終濃度で添加した可溶性ＴＧＦ－βの存在下で培養し、２Ｄペトリ皿内でＯＶＡペプチド（最終濃度２０μｇ／ｍＬ）によって活性化させた全脾細胞によるＩＬ－１０の分泌の倍数変化を、ＴＧＦ－β及びＯＶＡを含まない対照群と比較して示す。これにより、ＴＧＦ－βの免疫調節作用が示された。ＩＬ－１０の分泌の変化（ｄ）は、ＴＧＦ－βを含むまたは含まない培地間の差異によるものではなく、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ集団に差異がないことによる。２Ｄ培養物中に播種後３日目の、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ２５及びＦｏｘｐ３発現の代表的なＦＡＣＳプロット。代表的なＦＡＣＳヒストグラムであり、可溶性ＴＧＦ－βの存在下では、Ｔｒｅｇが増加しないことを示している。赤：ＴＧＦ－β、青：ＴＧＦ－β無し、黒：対照群（Ｔｒｅｇは検出されなかった）。ＴＧＦ－β及びＯＶＡを含まない対照群と比較した、ａｆＴＧＦ－βを含むまたは含まない全ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋の割合の変化を表したグラフ。棒グラフは、３回の反復実験の平均値及び３つの別個の実験のＳＥＭを表し、不対ｔ検定により比較した（^＊ｐ＜０．０５）。親和結合ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦ－ββ（それぞれ、２００ｎｇ／スキャフォールド）を含み、ａｆＴＧＦ－β（１００ｎｇ／スキャフォールド）を含むまたは含まないスキャフォールドから単離し、ＧＦＰ＋アロ線維芽細胞（０．５×１０^６細胞／スキャフォールド）と共に初期播種したＧＦＰ＋細胞のＦＡＣＳプロットを示す。構築物は、マウスの腎臓被膜下に移植し、移植から３日後に回収した。移植から３日後に、ａｆＴＧＦ－β構築物とＴＧＦ－β欠損構築物との間に、播種した全細胞におけるＧＦＰ＋細胞の割合に有意差（ｐ＞０．０５）が見られなかったことを示すグラフである。ｎ＝５、結果は、不対ｔ検定により比較した。ＴＧＦ－β構築物またはＴＧＦ－β欠損構築物を移植した宿主の脾細胞から磁気的に分離し、ＣＤ８＋細胞毒性アッセイのためにアロ繊維芽細胞と共培養したＣＤ８＋細胞のＦＡＣＳプロットを示す。磁気的分離したものは、ＣＤ８を発現する細胞の純度が９３％を超えた。線維芽細胞と、ａｆＴＧＦ－β構築物またはＴＧＦ－β欠損構築物を移植した宿主マウスの脾臓から単離したＣＤ８＋Ｔ細胞とを１：４の比率で共培養することによって行ったＣＤ８＋毒性アッセイのライブイメージングを示す。対照群は、移植を受けていない野生型マウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞であった。

以下の詳細な説明では、本発明の完全な理解を提供するために、多数の具体的詳細が記載されている。しかしながら、本発明はこれらの具体的詳細がなくとも実施できることは、当業者であれば理解できるであろう。他の場合では、本発明を不明瞭にしないために、周知の方法、手順、及び構成要素については詳細に説明していない。

本発明は、一態様では、対象における免疫寛容応答を生成する方法であって、対象に対して、硫酸化多糖類と、該硫酸化多糖類の硫酸基に対して非共有的に結合する生物活性ポリペプチドとを含む組成物を投与するステップを有する方法に関する。一実施形態では、生物活性ポリペプチドは、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ－β１）である。

本発明は、一態様では、対象における免疫寛容応答を生成する方法であって、対象に対して、硫酸化多糖類と、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ－β１）とを含む組成物を投与するステップを有する方法に関する。このような組成物を哺乳類、一実施形態ではヒトに対して投与することは、ＴＧＦ－β１の局所放出に有用であり、これによって、自己免疫応答を含む免疫応答の高度に限局された抑制が達成される。別の態様では、免疫抑制は、樹状細胞（ＤＣ）成熟の阻害、Ｔｒｅｇ頻度の増加、ＩＬ－１０依存態様でのＣＤ４及びＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞のエフェクター機能の低下、及び炎症性サイトカインのレベルの減少を含む、いくつかのＴＧＦ－β１媒介作用を通じて実現される。さらに別の態様では、ａｆＴＧＦ－βの局所免疫調節作用は脾臓に投射され、アロ線維芽細胞特異的ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞のエフェクター機能を著しく低下させる。さらなる態様では、投与される組成物は、さらに高度に限局された作用を発揮し得る別の生物活性ポリペプチドを含む。このアプローチは、従来の経路を介した全身投与に起因する大規模な副作用を回避できるという利点を有する。

さらなる態様では、本発明は、対象における同種移植成功を向上させる方法であって、対象に対して、硫酸化多糖類と、該硫酸化多糖類の硫酸基に対して非共有的に結合する生物活性ポリペプチドとを含む組成物を投与するステップを有し、それによって、対象における同種移植成功を向上させる。一実施形態では、生物活性ポリペプチドは、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ－β１）である。

本発明はさらに、アロ細胞移植に対する宿主免疫応答の局所的抑制による、同種移植の成功の向上、または同種移植片拒絶を減少させるかまたは防止する方法に関する。免疫応答は、移植血管新生の結果であり、宿主との移植片同化にも重要である。下記の実施例は、免疫調節性サイトカインであるＴＧＦβ１の局所放出によって、最終的に抗同種移植細胞傷害性をもたらす炎症性シグナル伝達を局所的に抑制する（例えばＩＬ－１７Ａにより）免疫調節性微小環境が生成されることを示す。

さらに、本発明は、アロ細胞アポトーシスの抑制及びアロ細胞生存の増加による、同種移植成功を向上させる方法または同種移植拒絶を減少させるかまたは防止する方法を提供する。下記で示されるように、ＴＧＦβ１スキャフォールド（足場）により、驚くべきことに及び予期せぬことに、長期間の移植の後でさえも、アロ細胞のアポトーシスの割合が低く、かつアロ細胞の生存の割合が高いという結果が得られた。

一実施形態では、本発明は、対象における同種移植拒絶を減少させるかまたは防止する方法であって、対象に対して、硫酸化多糖類と、該硫酸化多糖類の硫酸基に対して非共有的に結合する生物活性ポリペプチドとを含む組成物を投与するステップを有し、生物活性ポリペプチドが、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ－β１）である、方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、対象における同種移植拒絶を減少させるかまたは防止する方法であって、対象に対して、ＰＤＧＦ－ββ－アルギン酸硫酸塩、ＶＥＧＦ－アルギン酸塩硫酸塩、及びＴＧＦ－β１－アルギン酸塩硫酸塩を含む組成物を投与するステップを有し、該組成物が支持マトリックスをさらに含み、支持マトリックスが、多糖類、タンパク質、細胞外マトリックス成分、合成ポリマー、及びそれらの任意の混合物からなる群より選択されるポリマーである、方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、宿主による抗同種移植免疫応答を引き起こすことなく、アロ細胞移植片の血管新生を促すことによって、同種移植片の宿主との同化を促進する方法に関する。したがって、本発明は、血管新生因子をＴＧＦ－β１と同時に局所放出することによって、同種移植片内の血管新生を促進する方法を提供する。例えば、動物に対して、硫酸化アルギン酸塩と、ＴＧＦβ及び血管新生因子ＶＥＧＦ・ＰＤＧＦ－βの混合物とを含むバイオコンジュゲートを投与することにより、血管新生因子の持続的放出を促進し、血管新生及び成熟血管の形成をもたらす。

また、本発明は、樹状細胞成熟の抑制によって免疫寛容応答を生成する方法に関する。いくつかの実施形態では、下記で示されるように、ＴＧＦ－β１の放出により、未成熟のままであるスキャフォールドに浸潤する樹状細胞の割合を高くし、それによって、Ｔｒｅｇ頻度を増加させて、細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞の活性化を抑制する。

本発明はさらに、生物活性ポリペプチド（これに限定しないが、ＴＧＦ－β１を含む）の長期間の提示を提供する。下記でより詳細に説明するように、本発明の組成物は、正に帯電したポリペプチド及び／またはヘパリン結合性ポリペプチド、例えばＴＧＦ－β１と可逆的及び特異的に相互作用することができる。この可逆的結合により、上記ポリペプチドの徐放をもたらし、その徐放を長期間持続することができる。本発明は、投与後に約１０日間にわたって維持されるポリペプチドの持続放出（徐放）を意図する。別の実施形態では、持続放出期間は、約１５日間である。別の実施形態では、持続放出期間は、約３０日間である。別の実施形態では、持続放出期間は、約６０日間である。別の実施形態では、持続放出期間は、６０日以上である。別の実施形態では、持続放出期間は、約１０日間ないし約１５日間、若しくは１０日間ないし１５日間、または約１５日間ないし約３０日間、若しくは１５日間ないし３０日間、または約３０日間ないし約６０日間、若しくは３０日間ないし６０日間、または投与後の１０日間、１５日間、３０日間、６０日間、またはそれらの間の任意の整数の日の間である。本発明はさらに、１０日間未満のポリペプチドの持続放出を意図する。別の実施形態では、持続放出期間は、１５日間未満である。別の実施形態では、持続放出期間は、３０日未満である。別の実施形態では、持続放出期間は、６０日未満である。別の実施形態では、持続放出期間は、９０日未満である。別の実施形態では、持続放出期間は、１２０日未満である。一実施形態では、本発明の組成物及び方法は、ポリペプチドの全身放出（例えば、対象の血流内への放出）を促進する。別の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、ポリペプチドの局所放出を促進する。

一実施形態では、本発明は、自己免疫疾患または障害を治療する方法であって、対象に対して、硫酸化多糖類と、該硫酸化多糖類の硫酸基に対して非共有的に結合する生物活性ポリペプチドとを含む組成物を投与するステップを有し、生物活性ポリペプチドが、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ－β１）である、方法を提供する。

本発明はさらに、対象における自己免疫疾患または障害を治療する方法であって、
対象に対して、硫酸化多糖類と、該硫酸化多糖類の硫酸基に対して非共有的に結合する第１の生物活性ポリペプチド及び第２の生物活性ポリペプチドとを含む組成物を投与するステップを有し、該組成物が、支持マトリックスをさらに含み、支持マトリックスが、多糖類、タンパク質、細胞外マトリックス成分、合成ポリマー、及びそれらの任意の混合物からなる群より選択されるポリマーである、方法に関する。一実施形態では、第１の生物活性ポリペプチドは、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ－β１）である。一実施形態では、第２の生物活性ポリペプチドは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）である。

本発明はさらに、全身的免疫抑制の副作用を回避しつつ、対象における自己免疫疾患または障害を抑制または治療する方法に関する。したがって、本発明は、生物活性ポリペプチド（これに限定しないが、局所的免疫抑制をもたらす自己免疫シグナル伝達を阻害するＴＧＦ－β１を含む）の局所放出を提供する。本発明により意図される自己免疫疾患及び障害としては、これに限定しないが、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、及び乾癬が挙げられる。

別の態様では、本発明は、自己免疫疾患または障害の抑制に関する。上記の自己免疫疾患または障害は、多発性硬化症、乾癬、及びＩ型糖尿病からなる群より選択される。

したがって、本発明の一態様は、これに限定しないが、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）を含む、多発性硬化症（ＭＳ）自己抗原に対して特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞において免疫寛容を誘導する方法を提供する。一実施形態では、本発明は、硫酸化多糖類、ＴＧＦ－β１、及びＭＯＧ、またはそれらの自己免疫原性断片を含むバイオコンジュゲートを投与することによって、ＭＯＧまたはその自己免疫原性断片に対して特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞において免疫寛容作用を誘導する方法を提供する。いくつかの自己免疫原性ＭＯＧ断片が当分野で既知であり、マウスＭＯＧアミノ酸１－２２、３５－５５、及び６４－９６に対応するペプチドが含まれる（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／００５３２４９号明細書参照）。一実施形態では、ＭＯＧ自己免疫原性断片は、ペプチドＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶ－ＶＨＬＹＲＮＧＫ（マウスＭＯＧ３５－５５；配列番号：１）である。

さらに別の態様では、本発明は、膵臓β細胞に対して特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞において免疫寛容を誘導することによって、膵臓β細胞（一実施形態では、Ｉ型糖尿病の根底にある）の自己免疫破壊を防止する方法を提供する。一実施形態では、本発明は、硫酸化多糖類、ＴＧＦ－β１、及び同種異系または同系のβ細胞を含むバイオコンジュゲートの投与によって、膵臓β細胞に対して特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞において免疫寛容作用を誘導する方法を提供する。

さらに別の態様では、本発明は、真皮ＣＤ４＋Ｔ細胞における免疫寛容を誘導することによって、ケラチノサイトの異常増殖（乾癬の根底にある）に関連する自己免疫炎症性シグナル伝達を抑制する方法を提供する。一実施形態では、本発明は、硫酸化多糖類、ＴＧＦ－β１、及び組織に相当する細胞または分子調製物（例えば、皮膚生検から得られた材料など）を含むバイオコンジュゲートの皮内投与によって、真皮ＣＤ４＋Ｔ細胞において免疫寛容作用を誘導する方法を提供する。

本明細書で使用される「生物活性ポリペプチド」という用語は、インビボで様々な薬理学的活性を示すポリペプチドを指し、これに限定しないが、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、血管新生因子、免疫調節物質、ホルモンなどを含む。本出願では、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、相互互換的に使用される。少なくとも１つの生物活性ポリペプチドは、正に帯電したポリペプチド及び／またはヘパリン結合性ポリペプチドであり得る。

一実施形態では、生物活性ポリペプチドは、ＴＧＦβである。本発明は、ＴＧＦ（ＴＧＦβ１－ＴＧＦβ５；ＴＧＦβ１－β３は哺乳類、ＴＧＦβ４はニワトリ、ＴＧＦβ５はカエルに見られる）の既知のアイソフォーム、並びにそれらの断片、突然変異体、相同体、類似体、及び対立遺伝子変異体を包含する。一実施形態では、ＴＧＦβは、哺乳類のＴＧＦβである。一実施形態では、ＴＧＦβは、ＴＧＦβ１である。別の実施形態では、ＴＧＦβは、ＴＧＦβ２である。別の実施形態では、ＴＧＦβは、ＴＧＦβ３である。別の実施形態では、ＴＧＦβは、ヒトＴＧＦβ１（遺伝子銀行アクセス番号Ｘ０２８１２）、またはマウスＴＧＦβ１（遺伝子銀行アクセス番号ＡＪ００９８６）のいずれかである。

一実施形態では、「正に荷電したポリペプチド」という用語は、約７．５の生理的ｐＨで正の正味電荷を有するポリペプチド／タンパク質を指す。正に帯電したタンパク質の例としては、これに限定しないが、インスリン、グラチラマー酢酸塩（コポリマー１またはＣｏｐ１としても知られている）、抗トロンビンＩＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）－γ（ヘパリン結合性タンパク質としても知られている）、ＩＧＦ、ソマトスタチン、エリスロポエチン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨ－ＲＨ）、及びインターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－６など）が挙げられる。

一実施形態では、「ヘパリン結合性タンパク質またはポリペプチド」という用語は、正に荷電した塩基性アミノ酸のクラスタを有し、特別に規定された負に帯電したスルホ基またはカルボキシル基を有するイオン対をヘパリン鎖上に形成するタンパク質を指す（「Capila and Linhardt, 2002」参照）。ヘパリン結合性タンパク質の例としては、これに限定しないが、トロンボポエチン（ＴＰＯ）；プロテアーゼ／エステラーゼ、例えば、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、セリンプロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰ１）、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１ＩＮＨ）、及びワクシニアウイルス補体制御タンパク質（ＶＣＰ）など；増殖因子、例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ：例えば、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ受容体、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ－β１）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ：例えば、ＰＤＧＦ－α、ＰＤＧＦ－β）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、及び骨形成タンパク質（ＢＭＰ：例えば、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－７）など；ケモカイン、例えば、血小板第４因子（ＰＦ－４、現在はＣＸＣケモカインリガンド４またはＣＸＣＬ４と呼ばれている）、ストロマ細胞由来因子－１（ＳＤＦ－１）、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＲＡＮＴＥＳ（血小板やＴ細胞由来の好酸球走化性物質）、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）、マクロファージ炎症性ペプチド－１（ＭＩＰ－１）、リンホタクチン、フラクタルカインなど；脂質または膜結合性タンパク質、例えば、アネキシン、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）など；病原体タンパク質、例えば、免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）コートタンパク質（例えば、ＨＩＶ－１ｇｐ１２０）、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）、Ｔａｔタンパク質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のウイルスコート糖タンパク質ｇＣ、ｇＢ、またはｇＤ、デングウイルスの外被タンパク質、熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質、細菌表面接着タンパク質ＯｐａＡなど；並びに、接着タンパク質、例えば、１－セレクチン、Ｐ－セレクチン、ヘパリン結合性増殖関連分子（ＨＢ－ＧＡＭ）、トロンボスポンジンＩ型反復（ＴＳＲ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、アミロイドＰ（ＡＰ）などが挙げられる。

したがって、一実施形態では、本発明の組成物及び方法における生物活性ポリペプチドは、第１の生物活性ポリペプチド、別の生物活性ポリペプチド、第２の生物活性ポリペプチド、または第３の生物活性ポリペプチドに関わらず、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、セリンプロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰ１）、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１ＩＮＨ）、ワクシニアウイルス補体制御タンパク質（ＶＣＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ受容体、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＣＸＣケモカインリガンド４（ＣＸＣＬ４）、ストロマ細胞由来因子－１（ＳＤＦ－１）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、血小板やＴ細胞由来の好酸球走化性物質（ＲＡＮＴＥＳ）、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）、マクロファージ炎症性ペプチド－１（ＭＩＰ－１）、リンホタクチン、フラクタルカイン、アネキシン、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）コートタンパク質ｇｐ１２０、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）、Ｔａｔタンパク質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のウイルスコート糖タンパク質ｇＣ、ｇＢ、またはｇＤ、デングウイルスの外被タンパク質、熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質、細菌表面接着タンパク質ＯｐａＡ、１－セレクチン、Ｐ－セレクチン、ヘパリン結合性増殖関連分子（ＨＢ－ＧＡＭ）、トロンボスポンジンＩ型反復（ＴＳＲ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、アミロイドＰ（ＡＰ）、またはそれらの任意の組み合わせである。

別の実施形態では、生物活性ポリペプチドは、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ｂＦＧＦ、ａＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＬ－６、ＴＰＯ、ＳＤＦ－１、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＭＯＧ、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－７、ＩＧＦ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。別の実施形態では、本発明の方法で使用される組成物は、生物活性ポリペプチドとして、ＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ、及びＰＤＧＦ－ββを含む。

本発明のいくつかの実施形態では、少なくとも１つのヘパリン結合性ポリペプチドは、ＰＤＧＦ－β、ＰＤＧＦ－α、ｂＦＧＦ、ａＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－６、ＴＰＯ、ＳＤＦ－１、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＢＭＰ、及びＩＧＦからなる群より選択される。本発明の他の実施形態では、少なくとも１つの生物活性ポリペプチドは、血管新生因子または血管形成活性を示す増殖因子、例えば、ＴＧＦ－β１、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ａＦＧＦ、ＰＤＧＦ－β、ＩＧＦ、及びそれらの任意の組み合わせである。

本発明の一実施形態では、少なくとも１つの血管新生因子は、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ－β、または、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、及びＴＧＦ－β１の組み合わせである。

一実施形態では、本発明の組成物及び方法における生物活性ポリペプチドは、サイトカインである。一実施形態では、生物活性ポリペプチドは、ＴＧＦ－βである。別の実施形態では、生物活性ポリペプチドは、インターロイキン（ＩＬ）－１０である。別の実施形態では、生物活性ポリペプチドは、ＩＬ－４である。別の実施形態では、生物活性ポリペプチドは、ＩＬ－５である。別の実施形態では、生物活性ポリペプチドは、ＩＬ－１３である。別の実施形態では、生物活性ポリペプチドは、ケモカインである。一実施形態では、ケモカインは、（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド（ＣＸＣＬ）１２である。別の実施形態では、ケモカインは、ＣＸＣＬ１１である。

本発明によれば、バイオコンジュゲートを形成する硫酸化多糖類は、互いに異なるモノサッカライド反復単位から構成してもよいし、互いに異なる長さであってもよいし、互いに異なる種類の結合で上記単位を連結してもよい。硫酸化多糖類は、例えば硫酸化セルロースのように線状であってもよいし、例えば硫酸化グリコーゲンのように分枝状であってもよいし、長さが互いに異なっていてもよく、例えば、硫酸化された四糖類または三糖類と同程度に短くてもよい。好適な硫酸化多糖類はホモ多糖類であり得、ホモ多糖類としては、これに限定しないが、例えば、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キトサン、キチン、またはヘテロ多糖類（これに限定しないが、例えば、アルギン酸塩（アルジネート）、ヒアルロン酸）が挙げられる。

本発明の一実施形態では、硫酸化多糖類は、ウロン酸残基、例えば、Ｄ－グルクロン酸、Ｄ－ガラクツロン酸、Ｄ－マンヌロン酸、Ｌ－イズロン酸、及びＬ－グルロン酸などを含む。ウロン酸残基を含む多糖類の例として、これに限定しないが、アルギン酸塩（一実施形態では、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、植物源由来のゴム及び粘液）、及び動物源由来のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）（例えば、ヒアルロン酸（ヒアルロナン））が挙げられる。ウロン酸を含む硫酸化多糖類は、化学的に硫酸化された多糖類であってもよいし、または天然の硫酸化多糖類であってもよい。

一実施形態では、硫酸化多糖類は、アルギン酸硫酸塩である。別の実施形態では、硫酸化多糖類は、ヒアルロン酸硫酸塩である。

アルギン酸は、褐藻類及び海藻から得られる、β－１、４－結合グルグロン酸及びマンヌロン酸単位からなる線状多糖類である。本明細書で使用される「アルギン酸塩」という用語は、海藻（例えば、Laminaria hyperborean、L. digitata, Eclonia maxima、Macrocystis pyrifera、Lessonia nigrescens、Ascophyllum codosum、L. japonica、Durvillaea Antarctica、D. potatorum）に由来し、β－Ｄ－マンヌロン酸（Ｍ）及びα－Ｌ－グルロン酸（Ｇ）残基を様々な割合で含むポリアニオン性多糖類を指す。

本発明における使用に適したアルギン酸塩は、一実施形態では、１：１ないし３：１の範囲の、一実施形態では１．５：１ないし２．５：１の範囲のα－Ｌ－グルロン酸とβ－Ｄ－マンニュロン酸との比を有し、一実施形態では約２ｋＤａ、一実施形態では１ないし３００ｋＤａ、一実施形態では５ないし２００ｋＤａ、一実施形態では１０ないし１００ｋＤａ、一実施形態では２０ないし５０ｋＤａの分子量を有する。

アルギン酸塩は、Ｃａ^２＋及びＢａ^２＋などの二価陽イオンの存在下でゲル化する。製薬／医薬分野では、アルギン酸塩は、主として細胞（細菌、植物細胞、哺乳類細胞）用のカプセル化材料として成功裏に使用されている。分子の場合、効果はかなり低く、２５０ｋＤａのサイズの巨大分子でさえ、アルギン酸ヒドロゲル系から急速に放出される。とりわけ、５ないし１００ｋＤａの範囲のサイズを有するサイトカインや増殖因子などの対象の生体分子が急速に放出される。

ヒアルロン酸は、グルクロン酸及びＮ－アセチルグルコサミンの二量体繰り返し単位から構成され、細胞外マトリックスに見られるコア複合プロテオグリカン凝集体を形成する。

多糖類を硫酸化することにより、様々なサイトカイン及び増殖因子などの重要なシグナルタンパク質の結合及び制御放出を可能にする特性が多糖類に付与されることが以前より分かっている。アルギン酸硫酸及びヒアルロン酸硫酸は両方とも、バイオコンジュゲートを形成するときにヘパラン硫酸及びヘパリンの生物学的特異性を模倣することが分かっている（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／０４３０５０号参照）。

当業者には理解されるように、生物活性ポリペプチドと硫酸化多糖類との間の結合は、イオン結合、静電相互作用、疎水性相互作用、水素結合、またはファンデルワールス力を含む可逆的非共有結合から選択される。

正電荷を有することにより、生物活性ポリペプチドは、硫酸基に起因する負電荷を有する硫酸化多糖類に対して、可逆的かつ非共有的に結合できることを理解されたい。

したがって、本発明はまた、少なくとも１つの生物活性ポリペプチドの持続的局所放出のための方法を提供する。

本発明の方法によれば、バイオコンジュゲートは、ヒトの身体の任意の部分に注入または移植することができ、上記の生物活性ポリペプチドの送達システムとして機能する。一実施形態では、本発明のバイオコンジュゲートは、流動性ゲルの形態であり得る。別の実施形態では、バイオコンジュゲートは、剛性の移植可能なスキャフォールドとして予め作製され得る。さらなる実施形態では、移植可能なスキャフォールドは、支持マトリックスをさらに含み得る。

支持マトリックスは、バイオコンジュゲートのための支持体または担体としての役割を果し、粒子または多孔質材料で構成され得る。マトリックス材料は、フレキシブルさ及び従順性を有し、意図しない位置への移動を防止するために所定位置に固定され得る。ポリマーマトリックス材料は、天然材料または合成材料のいずれかであり得、これに限定しないが、合成ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ポリエチレンオキシド）、ポリビニルアルコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びポリヒドロキシブチレートなど）、天然ポリマー（例えば、コラーゲン、フィブリン、ゼラチンなど）、または多糖類（例えば、キトサン、アルギン酸塩など）であり得る。

支持マトリックスは、送達方式に適切な任意の形態、例えば、ヒドロゲル、ビーズ、マイクロスフェア（マイクロビーズ）、ヒドロゲルマイクロカプセル、スポンジ、スキャフォールド、発泡体、コロイド分散液、ナノ粒子、懸濁液などを取り得る。したがって、硫酸化多糖類及び生物活性ペプチドのバイオコンジュゲートに基づく持続放出剤形は、液体、メッシュ、スポンジ、繊維、ヒドロゲルなどの形態を取り得る。

本明細書で使用される「ヒドロゲル」という用語は、水を含有することができる天然または合成の親水性ポリマー鎖のネットワークを指す。このようなネットワークを形成することができる組成物の例は、アルギン酸塩、カルシウム部分架橋アルギン酸塩溶液、キトサン、及び粘性ヒアルロナンである。

本明細書で使用される「バイオコンジュゲート」という用語は、生物活性ポリペプチドに対して共有的または非共有的に結合した硫酸化多糖類を指す。非共有結合の例は、イオン結合、静電相互作用、疎水性相互作用、水素結合、またはファンデルワールス力を含む結合である。

本明細書で使用する「スキャフォールド（足場）」という用語は、空隙を有する任意の合成または有機構造体を指す。このようなスキャフォールドの非限定的な例は、哺乳類の損傷組織におけるモールド、キャスト、及び空隙である。

本発明の組成物は、任意の適切な方法、これに限定しないが、例えば、肝臓内、皮内、経皮（例えば、徐放製剤で）、筋肉内、腹腔内、静脈内、冠動脈内、皮下、経口、硬膜外、局所、及び鼻腔内経路により投与することができる。投与はまた、対象に対してインプラント（またはその一部）を外科的に投与、移植、挿入、または注入することを含む。インプラント（またはその一部）は、皮下、筋肉内、または、インプラントが意図された機能を果たすことを可能にする別の身体位置に配置することができる。一般に、インプラント（またはその一部）は、これに限定しないが、対象の上腕、背部、または腹部などの部位への皮下移植によって投与される。投与のための他の適切な部位は、医療専門家によって容易に決定することができる。複数のインプラントまたはその一部を投与することにより、治療のための所望の投与量を達成することができる。任意の他の治療的に有効な投与経路を使用してもよい。投与はまた、本明細書に記載の組成物の対象への全身投与または局所投与のいずれかを包含する。

「対象」という用語には、ヒトが含まれるが、これに限定されない。別の実施形態では、対象はネズミであり、これは一実施形態ではマウスであり、別の実施形態ではラットである。別の実施形態では、対象は、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、またはブタである。別の実施形態では、対象は、哺乳類である。

硫酸化多糖類バイオコンジュゲートを製造する方法はよく知られており（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１５／００５１１４８号明細書参照）、下記でさらに説明する。

本発明は、硫酸化多糖類及び非硫酸化多糖類、例えばアルギン酸塩及びアルギン酸硫酸塩の混合物を意図する。本発明によれば、硫酸化多糖類の割合は、多糖類の総重量の約１重量％ないし約４０重量％の範囲、一実施形態では多糖類の総重量の約３％ないし約３０％の範囲、一実施形態では多糖類の総重量の約４％ないし約２０％の範囲、一実施形態では多糖類の総重量の約５％ないし約１０％の範囲であり得る。あるいは、上記の割合は、質量％を表す。別の実施形態では、これらのバイオコンジュゲートとの結合及びこれらのバイオコンジュゲートからの放出は、多糖類の硫酸化の程度、及び硫酸化多糖類の送達システムへの組み込みの程度によって調節することができる。

本発明はさらに、薬学的に許容される担体を硫酸化多糖類－生物活性ポリペプチドバイオコンジュゲートに添加することを意図する。「薬学的に許容される担体」という用語は、活性成分を意図された標的に送達し、ヒトまたは他のレシピエント動物に対して害を及ぼさないビヒクルを指す。本明細書で使用される「医薬品」という用語は、ヒト用の医薬品及び動物用の医薬品の両方を包含すると理解されたい。有用な担体としては、例えば、水、アセトン、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタン－１、３－ジオール、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、鉱油、化学物質から構成されたポリマー（例えば、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシブチラート）、天然ポリマー（例えば、コラーゲン、フィブリン）、または多糖類（例えば、キトサン、アルギン酸塩）が挙げられる。担体は、送達方式に適切な任意の形態、例えば、溶液、コロイド分散液、エマルジョン（水中油型または油中水型）、懸濁液、クリーム、ローション、ゲル、発泡体、ムース、スプレーなどの形態を取り得る。医薬品組成物を作製するための方法論及び成分はよく知られており、例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences, Eighteenth Edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Co. Easton Pa., 1990」に記載されている。一実施形態では、担体は、水性緩衝液である。別の実施形態では、担体は多糖類であり、一実施形態ではアルギン酸ヒドロゲルであり、別の実施形態ではヒアルロン酸である。

免疫寛容応答の例として、これに限定しないが、同種移植成功、同種移植拒絶の欠如、自己免疫障害の抑制、アロ細胞移植に対する免疫応答の抑制、アロ細胞アポトーシスの抑制、アロ細胞生存の増加、アロ細胞移植の血管新生の促進、生物活性ポリペプチドの長期間の提示、炎症性シグナル伝達の抑制、樹状細胞成熟の抑制、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性応答の抑制、及び制御性Ｔ細胞分化の促進が挙げられる。

本発明の組成物によって治療される疾患または障害の例としては、これに限定しないが、同種移植拒絶、多発性硬化症、乾癬、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、橋本甲状腺炎、原発性胆汁性肝硬変、活動性慢性肝炎、副腎炎／アジソン病、多発性筋炎、皮膚筋炎、自己免疫性溶血性貧血、心筋炎、心筋心膜炎、強皮症、ブドウ膜炎（水晶体ぶどう膜炎及び交感性眼炎を含む）、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、クローン病、及び潰瘍性大腸炎が挙げられる。

本明細書で引用した全ての特許、特許出願、及び科学刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

以下、いくつかの非限定的な実施例を参照して、本発明を説明する。

実施例
材料及び方法

化学物質

アルギン酸ナトリウム（＞６５％のグルロン酸モノマー含量；Ｍ．Ｗ．３０ｋＤａのＶＬＶＧ及び１００ｋＤａのＬＶＧ）は、ノバマトリックスＦＭＣバイオポリマー社（NovaMatrix, FMC BioPolymer）（ノルウェー国ドラメン）から購入した。細胞培養培地は、ギブコ社（Gibco；米国カリフォルニア州）から購入した、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（骨髄由来樹状細胞（ｂｍＤＣ）培地）またはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（クローン培地）から構成した。この培地に、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＨｙＣｌｏｎｅ（ＴＭ））、２ｍｍのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）、２．５Ｕ／ｍＬのナイスタチン（これらは全て、イスラエル国ギブツBeth HaEmekのバイオロジカルインダストリーズ社（Biological Industries）から購入）、及び５０μｍのβメルカプトエタノール（イスラエル国レホヴォトのシグマアルドリッチ社（Sigma-Aldrich）から購入）を添加した。また、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、バイオロジカルインダストリーズ社から購入した。アンモニウム－塩化物－カリウム（ＡＣＫ）溶解緩衝液は、バイオウィッタカー社（BioWhittaker；米国メリーランド州ウォーカーズビル）から購入した。イソフルランは、ミンラッド社（Minrad；米国ニューヨーク州）から購入した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞精製キットは、ステムセルテクノロジース社（STEMCELL Technologies；カナダ国バンクーバ）から購入した。ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ウェスタンブロッティング、及びＩＨＣに使用される全ての抗体は、別段の記載がない限り、バイオレジェンド社（BioLegend；米国カリフォルニア州）から購入した。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ－ββ）、及びトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ－β）は、ペプロテック社（PeproTech；米国ニュージャージー州）から購入した。ウェスタンブロッティングに使用されるホスファターゼ阻害剤及びニトロセルロース膜は、サンタクルーズバイオテック社（Santa Cruz Biotech；米国テキサス州）から購入した。ティシュー・テックＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（凍結組織切片作製用包埋剤）は、サクラ社（Sakura；米国カリフォルニア州）から購入した。他の全ての化学物質は、別段の記載がない限り、シグマアルドリッチ社から購入した。オボアルブミン（ＯＶＡ）ペプチドは、ジェンスクリプト社（GenScript；米国ニュージャージー州）から購入した。

動物及び細胞株

Ｃ５７／Ｂｌ６マウス及びＣＤ１１ｃｄｎＲトランスジェニックマウスは、ジャクソン研究所（Jackson Laboratory；米国メイン州）から購入した。ＯＶＡ特異的なＭＨＣクラスＩＩ拘束性アルファベータＴ細胞レセプター（ＯＴＩＩ）トランスジェニックマウスは、イスラエル国ネゲブのベングリオン大学（Ben-Gurion University）のＥｌｉＬｅｗｉｓ博士から寄贈された。全てのマウスをベングリオン大学医療センター（イスラエル国ベエルシェバ）の動物施設に収容して飼育し、オートクレーブしたベッド、食物、及び水を入れたオートクレーブしたケージ内で維持した。

ＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ１６５８（ＴＭ））は、ベングリオン大学のＥｌｉＬｅｗｉｓ博士から寄贈された。

アルギン酸塩マトリックスの作製

共有結合した接着ペプチドＧ４ＲＧＤＹ及びヘパリン結合性ペプチドＧ４ＳＰＰＲＲＡＲＶＴＹ（ＲＧＤ／ＨＢＰ）を有するアルギン酸塩を前述したようにして合成し、Ｆｒｅｅｍａｎらの２００９（Biomaterials. 2009;30(2122-31)）及びＦｒｅｅｍａｎらの２００８（Biomaterials. 2008;29(3260-8)）の方法に従ってアルギン酸硫酸塩を合成した。マクロ多孔質スキャフォールド（足場）は、凍結乾燥技術により製造した。簡単に説明すると、１．２％（ｗ／ｖ）アルギン酸ナトリウム溶液を均質化させて、均一なカルシウムイオン分布を得ることによって、１．３２％（ｗ／ｖ）Ｄ－グルコン酸／ヘミカルシウム塩と架橋させた。架橋溶液中の最終成分濃度は、アルギン酸塩は１．０％（ｗ／ｖ）、架橋剤は０．２２％（ｗ／ｖ）であった。アルギン酸塩架橋溶液５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに注入し、４℃に冷却し、－２０℃で２４時間凍結させ、０．０８バール及び－５７℃で４８時間凍結乾燥させた。スキャフォールドの滅菌は、生物学的フード内で紫外線（ＵＶ）光に１時間暴露させることによって達成された。

インビトロ放出実験及びＴＧＦ－β生体活性の評価

元のアルギン酸スキャフォールドと、アルギン酸塩／アルギン酸硫酸塩（Ａｌｇ／ＡｌｇＳ）スキャフォールド（すなわち、９０％の元のアルギン酸塩と１０％のアルギン酸硫酸塩）との２つのスキャフォールド群において、ａｆＴＧＦ－βの放出実験を実施した。ＴＧＦ－βが充填されたスキャフォールドを、回転振とう器上の４８ウェルプレート中の５００μＬの培地（１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、０．１ｍｇ／ｍＬのネオマイシン、及び０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が添加された高グルコースＤＭＥＭ（ｗ／ｖ））中で、３７℃にて７日間、滅菌条件下で培養した。スキャフォールドにＴＧＦ－βを充填した後の０、１、３、及び７日目に培地サンプルを収集し、放出されたＴＧＦ－βを、抗ヒト組換えＴＧＦ－βＥＬＩＳＡキットを用いて、製造業者の使用説明書に従って分析した。上記の時点での、残存したａｆＴＧＦ－βの定量のために、スキャフォールドの試料を採取し、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）に溶解させた。この溶液のｐＨをｐＨ＝３にして、アルギン酸鎖からａｆＴＧＦ－βを分離させ、遠心分離によって相分離させた。ＥＬＩＳＡの前に、溶液のｐＨをｐＨ＝７に戻した。ａｆＴＧＦ－βの割合（パーセンテージ）を、各時点で、「ＴＧＦ－βの量／スキャフォールドに充填したＴＧＦ－βの量」×１００として計算した。

全脾細胞の単離及び培養

動物を屠殺し、その脾臓を取り出し、均質化し、７０μｍのメッシュでろ過して単一細胞懸濁液を得た。赤血球を３００μＬのＡＣＫ緩衝液で溶解させ、残っている細胞をカウントした。細胞を、クローン培地（１０％のウシ胎児血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭの非必須アミノ酸、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、及び５０μＭのβ－メルカプトエタノールが添加されたＤＭＥＭ）中で培養した。

ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の磁気分離

全脾細胞の単一細胞懸濁液を受け取った後、ＥａｓｙＳｅｐ（ＴＭ）Ｍａｇｎｅｔ（ステムセルテクノロジース社；カナダ国バンクーバ）を製造業者の使用説明書に従って使用して、磁気ビーズ陰性選択キットによってＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞を分離した。フローサイトメトリーについて後で説明するようにして、精製されたＴ細胞をＣＤ４またはＣＤ８について染色し、フローサイトメトリーで分析して精製を評価した。

骨髄由来樹状細胞の精製及び培養

いくつかの改変を伴う以前の研究による方法に従って、骨髄由来前駆体を顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）と共に培養することによって、樹状細胞（ＤＣ）を生成した。０日目に、４－１２週齢のＣ５７／Ｂｌ６マウスの大腿骨及び脛骨を取り出し、ガーゼパッドを用いて周囲の組織から取り出した。その後、骨を冷たいＰＢＳ中に入れ、骨の先端をはさみで除去し、２７Ｇニードルを使用して骨髄を冷たいＰＢＳで洗浄した。得られた懸濁液を７０μｍのメッシュでろ過し、１００μＬのＡＣＫ緩衝液で赤血球を１分間溶解した。細胞懸濁液をＨＢＳＳで２回洗浄し、６℃にて６分間、１５０ｇで遠心分離し、ＤＣ培地［１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１μｇ／ｍＬ）、ナイスタチン（２．５Ｕ／ｍＬ）、５０μＭのβ－メルカプトエタノール、及び２０％のＪ５５４細胞由来ＧＭ－ＣＳＦ上清が添加されたＩＭＤＭ（詳細については後述する）］中で再懸濁させた。細胞を、１０ｍＬ培地中の細菌学的９０ｍｍペトリ皿上に５×１０^６細胞／皿で播種し、８日間培養した。細胞を、加湿チャンバー内で、３７℃にて５％ＣＯ_２で培養した。ＤＣ培地及びＧＭ－ＣＳＦは３日目及び５日目に交換し、８日目のさらなる実験に備えた。

ＧＭ－ＣＳＦ含有上清の生成

マウスＧＭ－ＣＳＦ構築物でトランスフェクト（形質転換）したＪ５５８細胞は、ＡｎｇｅｌＰｏｒｇａｄｏｒ教授（イスラエル国ネゲブのベングリオン大学）から寄贈された。トランスフェクトした細胞を、１ｍｇ／ｍＬのＧ－４１８の存在下で２週間培養することにより選択し、組織培養フラスコ中の組織に約２×１０^５細胞／ｍＬの密度で播種した。次いで、２－３日毎に、細胞を培地中で１：５に希釈し、それを３週間続けた。上清を０．２μｍのフィルターでろ過し、－８０℃で保存した。

マトリックス内での細胞の播種及び活性化：インビトロ培養

乾燥アルギン酸塩／アルギン酸硫酸塩マトリックス上に、ＴＧＦ－βを含むまたは含まない１４μＬの細胞懸濁液を滴下することによって、細胞を播種した（０．５×１０^６全細胞／マトリックス）。次いで、細胞構築物を５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、３７℃及び５％ＣＯ_２で１０分間培養して、マトリックス内での細胞分布を可能にした。次に、２００μＬの培地を徐々に添加し、細胞デバイスを２時間培養した。

細胞活性化のために、細胞構築物を４８ウェルプレートに移し、ＯＶＡペプチド（最終ペプチド濃度：２０ｍｇ／ｍＬ）の有無にかかわらず、１ｍＬの培地を添加した。培養は、加湿インキュベーター内で、３７℃、５％ＣＯ_２にて行った。

ＩＬ－１０阻害

精製した抗マウスＩＬ－１０（バイオレジェンド社；カタログ番号５０５０１２）を、ＩＬ－１０阻害剤として、最終濃度１ｎｇ／ｍＬ（培養物中のＩＬ－１０の最大濃度よりも一桁高い）で添加した。サンドイッチＥＬＩＳＡは、培養物中にＩＬ－１０の痕跡を示さなかった。

ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞のレトロウイルス感染

ＰＬＡＴ－Ｅ細胞を、１０％のＦＢＳ及び０．５％のペニシリン、ストレプトマイシン、ブラストサイジン、及びピューロマイシンを含有するＤＭＥＭ中で維持した。ＰＬＡＴ－Ｅパッケージング細胞を、１００ｍｍディッシュあたり８×１０^６の細胞数で播種し、一晩培養した。翌日、細胞を、ＰｏｌｙＪｅｔインビトロトランスフェクション試薬（シグナジェン社（SignaGen）；米国メリーランド州）を含むｐＭＸ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、培地を新しい培地と交換し、トランスフェクションの２４時間後及び４８時間後に収集した。

３Ｔ３／ＮＩＨ線維芽細胞を、形質導入の１日前、１２ウェルプレートあたり１０^５の細胞数で播種した。ウイルス含有上清（２４時間後に収集した）に２μｇ／ｍＬの硫酸プロタミンを添加し、線維芽細胞皿に移し、一晩培養した。トランスフェクションの２４時間後、ウイルス含有培地を４８時間上清と交換した。線維芽細胞に対して、３サイクルのトランスフェクションを行った。

マトリックス内でのＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞の播種：インビボ

乾燥した共有結合ＲＧＤ／ＨＢＰアルギン酸塩／アルギン酸硫酸塩マトリックス上に、３０μＬの細胞懸濁液（すなわち、２００ｎｇのＴＧＦ－βが添加されたまたはＴＧＦ－βが添加されていないＤＭＥＭ中の細胞）を滴下することによって、（上述したようにして）ＧＦＰを発現するように感染させたＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞を播種した（０．５×１０^６の全細胞数／マトリックス）。本願発明者は、３０μＬの細胞懸濁液が、アクセス液体を残さずにスキャフォールド全体を湿潤させるのに適切な容量であることを見出し、全ての増殖因子のスキャフォールドへの最大限の結合を確実にした。マトリックスを３７℃及び５％ＣＯ_２で５分間培養して、構築物を移植する前のスキャフォールド内での細胞分布を可能にした。

デバイスの移植

細胞をマトリックス内に播種した直後に、細胞移植デバイスを、イソフルランベースの麻酔装置で麻酔したＣ５７／Ｂｌ６野生型マウスの左腎被膜の下に移植した。移植後の異なる日（１０、１５、または３０日目）に、細胞移植デバイスをその周囲の線維症と共に外科的に除去した。これらの血管新生を免疫組織化学的検査によって分析し、浸透性リンパ球集団及び線維芽細胞生存をフローサイトメトリーにより分析した。移植後の１５日目及び３０日目に、全リンパ球培養及びＣＤ８＋細胞傷害性アッセイのために脾臓も取り出した。

線維芽細胞溶解物

ＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞（１０^７の細胞数）に対して、５サイクルの凍結及び解凍を行い、遠心分離し、Ｂｉｏ－Ｒａｄタンパク質アッセイ（バイオラッド社（Bio-Rad）；イスラエル国）によって総タンパク質濃度を測定した。

繊維芽細胞溶解物による全脾細胞の活性化

移植後の１５日目及び３０日目に、全脾細胞を９６ウェルＵプレートで培養し（１ウェルあたり２×１０^４の細胞数で）、繊維芽細胞溶解物（最終タンパク質濃度：１０ｍｇ／ｍＬ）によって活性化した。

ＣＤ８＋細胞傷害性アッセイ

上述したようにして、移植後の１５日目及び３０日目に、全脾細胞からＣＤ８＋Ｔ細胞を磁気的に分離した。ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を４：１の比で共培養した。共培養してから２時間後及び１２時間後に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性及び線維芽細胞の生存率をＦＡＣＳにより分析した。

ウェスタンブロッティング

ＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞を５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－βで４０分間処理し、プロテアーゼ阻害剤カクテル及びホスファターゼ阻害剤が添加された放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液［１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＧＴＡ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）、１％のＮＰ－４０］を使用して細胞溶解物を得た。細胞をＲＩＰＡと共に氷上で３０分間培養し、次いで１３、０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を回収し、Ｂｉｏ－Ｒａｄタンパク質アッセイによりタンパク質濃度を決定し、３０μｇ／ウェルのタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで使用し、次いで、ニトロセルロース膜上に移した。ニトロセルロース膜を、０．５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ２０）（ＴＢＳＴ）が添加されたトリス緩衝化生理食塩水中の５％のＢＳＡ（ＭＰバイオケミカル社（MP Biochemicals）；米国カリフォルニア州サンタアナ）または５％のミルクによって、室温で１時間ブロックし、その後、一次抗体と共に４℃で一晩培養した。ウサギ抗ホスホＳＭＡＤ２、ウサギ抗ＳＭＡＤ２／３（両方とも、米国マサチューセッツ州ダンバーズのセルシグナリング社（Cell Signaling）から得た）、及びマウス抗アクチン（米国カリフォルニア州サンタアナのＭＰバイオケミカル社）を使用してタンパク質を検出した。二次ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－コンジュゲート抗体として、ヤギ抗マウスＩｇＧ（米国カリフォルニア州サクラメントのジャクソン研究所）及びロバ抗ウサギＩｇＧ（英国のアマシャムＧＥヘルスケア社（Amersham, GE healthcare））を使用した。スーパーシグナルウエストピコ（Supersignal West Pico）化学発光基質キット（米国マサチューセッツ州ウォルサムのサーモサイエンティック社（Thermo Scientific））を使用して化学発光を誘導し、次いで、その化学発光をＩｍａｇｅＱｕａｎｔＬＡＳ４０００ソフトウェア（英国のＧＥヘルスケアライフサイエンス社（GE Healthcare Life Sciences））により検出した。バンド強度をＩｍａｇｅＪソフトウェアにより定量化した。

フローサイトメトリー分析

インビトロ実験後のマトリックス分析のために、まず、マトリックスを溶解し、次いで、遠心分離によって細胞を得、ＨＢＳＳで洗浄し、再度遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中、２％ＦＢＳ）中に懸濁させた。インビボ移植後の細胞移植デバイスの分析のために、マトリックス及びその周囲の線維症を均質化させ、７０μｍのメッシュでろ過して単一細胞懸濁液を得、細胞を遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中、２％ＦＢＳ）中に再懸濁させた。

単一細胞懸濁液を得た後、非特異的抗原結合を防ぐために、Ｆｃ遮断薬を５分間添加した。次いで、蛍光抗体を製造業者の使用説明書に従って添加し、プレートを氷上で１５分間培養した。その後、試料をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、６℃にて３分間、４２０ｇで２回遠心分離した。

細胞内ＦＡＣＳ染色（Ｆｏｘｐ３）のために、まず、細胞を蛍光抗体で染色し、次いで、固定緩衝液中で２０分間培養し、２回洗浄し、透過緩衝液中で１５分間培養した。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、細胞内抗体と共に３０分間培養し、遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させた。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを利用するＧａｌｌｉｏｓ（ＴＭ）フローサイトメーター（米国カリフォルニア州ブレアのベックマン・コールター社（Beckman Coulter, Inc.））をフローサイトメトリー分析に使用した。

この実験に使用される全ての抗体はｆｌｏｕｒ共役抗体であり、そのようなものには、ＡＰＣ－Ｃｙ７共役抗ＣＤ４（バイオレジェンド社：カタログ番号１００４１４）、ＰｅｒＣＰ共役抗ＣＤ８（バイオレジェンド社：カタログ番号１００７３２）、ＰＥ共役抗ＣＤ２５（バイオレジェンド社：カタログ番号１０１９０４）、ＰＥ－Ｃｙ７共役抗ＣＤ６９（バイオレジェンド社；カタログ番号１０４５１２）、ＡＰＣ共役抗ＣＤ１０７ａ（バイオレジェンド社；カタログ番号１２１６１４）、ＦＩＴＣ共役抗ＦｏｘＰ３（バイオレジェンド社；カタログ番号１３７２１４）、ＰＥ／Ｄａｚｚｌｅ共役抗ＣＤ１１ｃ（バイオレジェンド社；カタログ番号１１７３４８）、抗ＣＤ８６ブリリアントバイオレット（バイオレジェンド社；カタログ番号３０５４３１）、ＡＰＣ共役アネキシンＶ（バイオレジェンド社；カタログ番号６４０９２０）、及びＰＩ（バイオレジェンド社；カタログ番号４２１３０１）が含まれる。

ＥＬＩＳＡを用いたサイトカイン分泌分析

無細胞上清は、ＯＶＡペプチドまたは線維芽細胞溶解物を使用した活性化後にインビトロ及びエクスビボ実験から得た。ＩＬ－２測定のために、細胞活性化の２４時間後に上清を収集した。ＩＦＮ－γ並びにＩＬ－１０及びＩＬ－１７Ａの測定のために、細胞活性化の４８時間後及び７２時間後に上清を収集した。製造業者の使用説明書に従って、上清中のサイトカイン濃度を測定するためにサンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。

免疫組織化学及び共焦点イメージング分析

インビボ血管新生分析のために、細胞移植デバイス及びその周囲の線維症を動物から取り出し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で２４時間固定し、次いで、ショ糖溶液（３０％）中で４８時間培養した。その後、デバイスを、最適切断温度化合物（ＯＣＴ）中に埋め込み、－８０℃で保存した。水平断面（厚さ２０μｍ）をクライオスタット（ＬｅｃｉａＣＭ３０５０Ｓ）で切断し、使用するまで－８０℃に維持した。断面をＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ（０．０５％ｖ／ｖ）で洗浄した。染色前は、一次抗体希釈緩衝液を使用して、非特異的結合をブロックした。その後、切片を、一次モノクローナル抗マウスＣＤ３１抗体（バイオレジェンド社；カタログ番号９１０００３）と共に培養し、ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ６３３共役抗ラットＩｇＧ（バイオレジェンド社；カタログ番号４０５４１６）で染色した。

切片の共焦点イメージング（画像化）は、ＮｉｋｏｎＣ１ｓｉレーザー走査共焦点顕微鏡を使用して行った。血管密度を、血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ）の割合、全画像領域におけるＣＤ３１占有面積として計算し、Ｉｍａｒｉｓソフトウェア（米国コネチカット州サウスウィンザーのビットプレーン・サイエンティック・ソリューションズ社（Bitplane scientific solutions））を用いてＰＥＣＡＭ免疫染色断面スライドからランダムに選択された１５の別個の視野から決定した。

ＣＤ８＋細胞傷害性イメージングのために、ＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞と共培養する前に、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＳＮＡＲＦ１（米国カリフォルニア州のインビトロジェン社（Invitrogen））で染色した。共培養の１２時間後、ウェル内の細胞を４％ＰＦＡで固定した。グランザイムＢを染色する前に、一次抗体希釈緩衝液を使用して非特異的結合をブロックし、次いで、細胞を透過化した。その後、細胞を、フルオロ共役一次モノクローナル抗マウスグランザイムＢ（バイオレジェンド社；カタログ番号５１５４０５）と共に一晩培養した。ＣＤ８＋細胞傷害性アッセイを実施した切片及びウェルの共焦点イメージングをＮｉｋｏｎＣ１ｓｉレーザー走査共焦点顕微鏡を使用して行った。

活性化画像化の７２時間後のスキャフォールド内でのインビトロ脾細胞培養のために、スキャフォールドを収集し、ＤＭＥＭ緩衝液中の４％ＰＦＡ中で２０分間固定し、次いで、ショ糖溶液中で２４時間培養した。その後、デバイスを、Ｏ．Ｃ．Ｔ中に埋め込み、－８０℃で保存した。水平断面（厚さ３０μｍ）をクライオスタット（ＬｅｃｉａＣＭ３０５０Ｓ）で切断し、使用するまで－８０℃に維持した。断面をＤＭＥＭ緩衝液で洗浄した。染色前は、ＤＭＥＭ緩衝液中の２％ＢＳＡを使用して、非特異的結合をブロックした。その後、切片を、一次モノクローナル抗マウスＣＤ１１ｃ抗体（バイオレジェンド社；カタログ番号１１７３０２）及び一次モノクローナル抗マウスＣＤ４抗体（バイオレジェンド社；カタログ番号１００４０２）と共に培養し、ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８共役抗ラットＩｇＧ（バイオレジェンド社；カタログ番号４０５４１８）及びＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ５４６抗アルメニアンハムスターＩｇＧ（バイオレジェンド社；カタログ番号４０５４２３）を用いて染色した。

統計

全ての統計分析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍバージョン５．０２（米国カリフォルニア州サンディエゴのグラフパッドソフトウェア社（GraphPad Software）製）を使用して行った。全ての変数は、平均±ＳＥＭとして表した。インビトロ研究は、両側不対ｔ検定（ｐ＜０．０５）によって比較した。全てのエクスビボ実験は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）及びチューキーポストホック検定（ｐ＜０．０５）によって比較した。

実験承認

全ての手術及び実験手順は、イスラエル国ネゲブのベングリオン大学の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ：Institutional Animal Care and Use Committee）によって審査され承認された。

実施例１
細胞移植デバイスの構築及び免疫調節性

細胞移植デバイスは、マクロ多孔質構造に起因して移植後に効果的に血管新生を行うことが従来分かっているアルギン酸スキャフォールド（平均孔径＝８０μｍ）であった。血管新生を促進するために、親和結合した血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ－ββ）を、アルギン酸スキャフォールドに添加した。増殖因子のアルギン酸塩マトリックスに対する親和結合は、増殖因子がアルギン酸硫酸塩（スキャフォールドの乾燥重量の１０％を構成する）と相互作用することによってなされた。本発明者らは、ヘパリン結合性タンパク質ファミリーの増殖因子（例えば、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ－ββ、及びＴＧＦ－β）が、該増殖因子がヘパリン／ヘパラン硫酸と自然に相互作用する場合と同様の態様で、アルギン酸硫酸と相互作用することを以前に実証した（図１Ａ）。したがって、本発明者らは、増殖因子がアルギン酸スキャフォールドマトリックスと親和結合することにより、該増殖因子の生物学的機能が向上することを期待した。

この期待に基づいて、ＴＧＦ－βをアルギン酸硫酸塩／アルギン酸スキャフォールドに親和結合させることにより、免疫寛容性の微小環境を生成した（詳細は、図１Ａ及び上記の「材料と方法」を参照されたい）。このプロセスにより、ＴＧＦ－βが元のアルギン酸骨格に非特異的に吸着された場合と比較して、ＴＧＦ－βの提示期間が延長された。ＴＧＦ－βのＥＬＩＳＡは、アルギン酸硫酸塩含有スキャフォールドでは、７日後に、最初にロードされたａｆＴＧＦ－βは、その３０．２％±０．８％が、依然としてマトリックス中に存在し、一方、元のスキャフォールドでは、５．２％±０．３％しか残存していないことを明らかにした（図１Ｂ）。重要なことに、培地中に見られた放出されたＴＧＦ－β、及びアルギン酸塩／硫酸化アルギン酸塩マトリックスに親和結合したＴＧＦ－β（ａｆＴＧＦ－β）は、同様に線維芽細胞単層におけるＳＭＡＤ２リン酸化を活性化した（図１Ｃ、図１Ｄ）。注目すべきは、ａｆＴＧＦ－βは、それがマトリックスに依然として親和結合しているとき、及びそれがスキャフォールドから分離した後も同様の活性を示し、細胞が、親和結合形態及び放出時の両方において、ＴＧＦ－βと相互作用できることを示した。

次に、本発明者らは、アルギン酸硫酸塩／アルギン酸スキャフォールド（ａｆＴＧＦ－β構築物）のａｆＴＧＦ－βの空間提示により、免疫調節微小環境が生成されるかどうかを調べた。本発明者らは、全脾細胞白血球を培養し、生存を維持し、かつスキャフォールドにおいて抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導できるかどうかを試験するために予備研究を行った。この目的を達成するために、Ｔ細胞活性化ペプチドとしてのＯＶＡの存在下または非存在下で、赤血球枯渇脾臓白血球をＯＴＩＩＯＶＡ－ＴＣＲＴｇマウス（リンパ球がＯＶＡ特異的である）から単離し、スキャフォールドに播種した（図２Ａ）。図１３Ａは、細胞播種後の３日目の典型的な構築物を示し、白血球がスキャフォールド全体に分布し、ＤＣ及びＣＤ４Ｔ細胞が互いに近接し、細胞－細胞相互作用を可能にすることを示す。ＯＶＡにより誘導されたＴ細胞増殖が確認され、ＯＶＡ活性化の有無にかかわらず、Ｔ細胞の３２％及び６％が生存したことが明らかになった（図１３Ｂ）。ＯＶＡ活性化構築物中の生存リンパ球の約２０％は、ＣＤ４＋Ｄ２５＋であった（図１４Ａ、図１４Ｂ）。

ａｆＴＧＦ－βの免疫調節作用は、ａｆＴＧＦ－β構築物内に播種された脾細胞（図２Ｂ－図２Ｅ）及び精製されたＤＣ（図１５Ａ－図１５Ｅ）におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のサイトカインプロファイル及び出現により明らかになった。図１５Ｂ－図１５Ｅに示すように、ａｆＴＧＦ－βは炎症性サイトカインＩＬ－１７Ａの分泌を大幅に抑制し、調節性サイトカインＩＬ－１０を大幅に増加させ、かつ分泌ＩＬ－２またはＩＦＮ－γの分泌レベルには影響を与えない。重要なことには、デバイス中のａｆＴＧＦ－βの存在により、全ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の頻度が２．８８倍に増加する（ＯＶＡの有無に応じて、それぞれ全Ｔ細胞集団の３０．６％±３．４％及び１１．８％±３．１％、ｐ＝０．００８、図３、図４Ａ－図４Ｃ）。全体として、この発見は、ａｆＴＧＦ－βが細胞移植デバイス内で抗炎症環境を促進することを実証する。注目すべきことに、ａｆＴＧＦ－β構築物で観察されたＩＬ－１７の分泌レベルの低下及びＴｒｅｇ頻度の増加は、抗ＩＬ－１０（図５Ａ－図５Ｆ）の存在下では、または、ＣＤ１１ｃプロモーター下でヒトＴＧＦ－βレセプターＩＩ遺伝子のドミナントネガティブ型を発現するＣＤ１１ｃ^ｄｎｒＴｇマウス由来の脾細胞を用いた場合には、観察されなかった（図５Ｇ－図５Ｈ、図６Ａ－図６Ｅ）。

全体的に、本発明者らのデータは、ＤＣにおけるａｆＴＧＦ－βシグナル伝達がＩＬ－１０の上方調節を誘導し、それにより、Ｔｒｅｇ分化を助長し、ＣＤ４Ｔ細胞のエフェクター機能を減弱させる機序を指摘する。この機序は、２Ｄ細胞単層に可溶性ＴＧＦ－βを添加した場合（図１６Ａ－図１６Ｅ、図１７Ａ－図１７Ｂ）よりも、移植デバイスの３次元（３Ｄ）微小環境において非常に顕著であるように思われる。

実施例２
細胞移植デバイスのインビボ血管新生

移植後の細胞移植デバイスの血管新生は、とりわけ高密度播種細胞デバイスでは、移植されたアロ細胞の生存能力及び機能を支持するために重要である。血管新生を促進するために、本発明のデバイスに、ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦ－ββを添加した。ａｆＴＧＦ－β構築物における細胞の挙動及び生存率の差異（ＴＧＦ－βを欠く構築物と比較して）が血管新生の程度の差に起因する可能性を調べるために、本発明者らは、ａｆＴＧＦ－β構築物における血管新生の程度をＴＧＦ－β－欠損構築物と比較した。ａｆＴＧＦ－β構築物及びＴＧＦ－β－欠損構築物の両タイプの構築物に、ＧＦＰを発現するように感染させたスイスマウス由来の同種異系ＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞株（５×１０^５個の細胞／スキャフォールド）を播種した。

図７Ａは、腎臓被膜下に移植してから１０日以内に、両方の細胞播種デバイスにＰＥＣＡＭ＋（ＣＤ３１）内皮細胞を播種し、ＧＦＰ線維芽細胞間に散在する毛細血管を形成したことを示す。１５日目までに、ａｆＴＧＦ－βの有無にかかわらず、移植された構築物（図７Ｂ、図７Ｃ）には、細胞デバイスの３－４％を占める明確な毛細血管が観察された（図８）。

実施例３
インビボ局所免疫調節及びアロ線維芽細胞移植片生存率

次の一連の実験により、インビボでの、ａｆＴＧＦ－βスキャフォールドにおける局所免疫調節微小環境の確立を確認した。さらに、デバイス内での広範囲の血管新生を所与として、移植した同種繊維芽細胞の生存能力及び機能を維持するための、このような可能性のある移植デバイスの有効性を検討した。

移植後の１０日目及び１５日目に回収した構築物のＦＡＣＳ分析によって、ａｆＧＦ－β構築物は、ＴＧＦ－β欠損構築物と比較して、共刺激分子ＣＤ８６を発現する成熟ＣＤ１１ｃ＋ＤＣの割合が有意に低く（図９Ａ－図９Ｃ）、かつ、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの割合が有意に高いことが明らかになった（図９Ｄ－図９Ｆ、ｐ＜０．０５）。Ｔｒｅｇの増加は、移植後１０日目にのみ明白であった。したがって、移植後１０日目に、ＣＤＴ－β構築物は、ＴＧＦ－β欠損構築物と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が有意に低いことが明らかになった（それぞれ、２．１％±０．４％対５．５％±０．９％、ｐ＝０．０１９）（図９Ｇ－図９Ｉ）。さらに、移植後１０日目（それぞれ、１３．４％±３．５％対２２．９％±９．３、ｐ＝０．０１５）及び移植後１５日目（それぞれ、４％±０．８％対１２．０％±２．５％、ｐ＝０．０００１）には、ａｆＴＧＦ－β構築物は、ＴＧＦ－β欠損構築物と比較して、活性化マーカーＣＤ６９を発現するＣＤ８Ｔ細胞の断片が有意に減少することが観察された（図９Ｊ－図９Ｌ）。

免疫寛容性環境がアロ線維芽細胞生存に影響を及ぼすかどうかを調べるために、生存しているアロ線維芽細胞の数及びアポトーシスを起こしている細胞の頻度を調べた。移植後３日目に、デバイスから回収したＧＦＰ＋細胞を、デバイス中に存在した全ＧＦＰ＋細胞に対する割合として計算した（図１７Ｃ、図１７Ｄ）。このベースラインは、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性に関連しない細胞死を排除するように選択した。移植後１５日目では、デバイスから回収したアロ繊維芽細胞の割合は、ａｆＴＧＦ－β構築物及びＴＧＦ－β欠損構築物でそれぞれ５０．４％±２％及び４４．６％±０．７％であった（ｐ＜０．０５、図１０Ａ、１０Ｂ）。移植後３０日目では、ａｆＴＧＦ－βデバイスから回収したアロ繊維芽細胞は、より高い割合を示す傾向が見られた。生存しているアロ繊維芽細胞の生存率を、アネキシンＶ及びＰＩで標識したＧＦＰ細胞のＦＡＣＳ分析によってさらに検証した（図１０Ｃ）。移植後１５日目では、生存しているアロ線維芽細胞（ＧＦＰ＋Ａｎｎｅｘｉｎ－ＰＩ－）の割合は、ＴＧＦ－β構築物がＴＧＦ－β欠損構築物よりも有意に高かった（それぞれ、３８．５％±３．５％及び２３．２％±５．０％、ｐ＝０．０３８、図１０Ｄ）。したがって、移植後１５日目及び３０日目では、ＧＦＰ＋アロ線維芽細胞の全数に対するＧＦＰ＋ＡｎｎｅｘｉｎＶ＋ＰＩ－アポトーシス細胞及びＧＦＰ＋ＡｎｎｅｘｉｎＶ＋ＰＩ＋細胞の割合は、ａｆＧＦ－β構築物がＴＧＦ－β欠損構築物よりも有意に低かった（図１０Ｅ、図１０Ｆ）。これらのデータは、構築物中のａｆＴＧＦ－βの局所提示により浸潤性ＤＣが未成熟状態に維持され、これによって、Ｔｒｅｇの頻度を増加させ、細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞の活性化を抑制することを示す。

実施例４
親和結合したＴＧＦ－βによる、アロ細胞特異的末梢性Ｔ細胞の活性化の抑制

細胞または組織移植における大きな障害は、免疫抑制薬が抗原特異的ではないため、宿主防御機序が損なわれることである。加えて、休薬（薬物離脱）は、しばしば免疫応答の回復をもたらし、最終的には移植拒絶につながる。宿主免疫を損なうことのない、移植片の長期生存は、同種移植特異的Ｔ細胞寛容を誘導することによって達成され得る。血管が新生されたａｆＴＧＦ－β構築物がアロ線維芽細胞特異的末梢寛容を誘導するかどうかを調べるために、移植後１５日目及び３０日目にマウスから脾細胞を単離し、アロ種芽細胞特異的Ｔヘルパー及びＴ細胞傷害反応について調べた。ＴＧＦ－β欠損構築物の移植と比較して、ａｆＴＧＦ－β構築物を移植したマウスから切除した脾細胞は、移植後１５日目に、アロ線維芽細胞特異的Ｔｈ１７エフェクター機能が有意に減少した（図１１Ａ；ＴＧＦ－β欠損構築物を移植したマウスから切除した脾細胞と比較した、５５．５％分泌したＩＬ－１７、ｐ＜０．０５）。驚くべきことに、これらの脾細胞はまた、移植後３０日目にＴｈ１及び／またはＣＤ８Ｔ細胞エフェクター機能の低下を示した（図１１Ｂ－図１１Ｃ；ＴＧＦ－β欠損構築物を移植したマウスから切除した脾細胞と比較した、それぞれ４５．２％及び２０．９％分泌したＩＬ－２及びＩＦＮ－γ、ｐ＜０．０５）。ＩＬ－１０分泌レベルは、グループ間で有意な差を示さなかった（図１１Ｄ）。

次に、本発明者らは、アロ細胞特異的ＣＤ８Ｔ細胞の細胞傷害性応答が、ａｆＴＧＦ－β構築物を移植したマウスにおいても抑制されるかどうかを調べた。そのため、移植マウス及び野生型マウスから脾細胞を単離し、次いでＣＤ８Ｔ細胞を単離し（上記の「方法」及び図１７Ｅに記載したようにして）、それぞれ１：４の細胞比でアロ繊維芽細胞と共培養した。共焦点イメージングは、ＴＧＦ－β欠損構築物を移植したマウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞が、アロ線維芽細胞と免疫学的シナプスを形成し、細胞傷害性を発揮することを示した（図１１Ｅ及び図１８）。

ＣＤ８Ｔ細胞をアロ線維芽細胞と共培養してから２時間後及び１２時間後でＣＤ１０７を発現する細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞の頻度のＦＡＣＳ評価により、両方の時点において、細胞傷害性ＣＤ８＋ＣＤ１０７＋Ｔ細胞の割合は、ａｆＴＧＦ－β構築物を移植したマウス由来の脾細胞が、ＴＧＦ－β欠損構築物を移植したマウス由来の脾細胞よりも有意に低いことが示された（図１１Ｆ、図１２Ａ）。さらに、ａｆＴＧＦ－β構築物を移植したマウスから単離した脾臓由来ＣＤ８Ｔ細胞と共培養した場合、ＴＧＦ－β欠損構築物を移植したマウスと比較して、アポトーシスを起こしているアロ線維芽細胞の数は有意に少なかった（それぞれ、１５日目で３５．５％±５．１％対１７．２％±０．９％；図１２Ｂ、図１２Ｃ）。注目すべきことに、ａｆＴＧＦ－βを移植したマウスから得られた活性化ＣＤ８Ｔ細胞の頻度及び細胞傷害活性は、野生型マウスと同様であり、ＴＧＦ－β構築物の状況下でのアロ繊維芽細胞の移植は非常に軽度の細胞傷害性応答を励起することを示した。

本発明者らは、細胞移植デバイスにおけるマトリックスに対する親和結合としてのＴＧＦ－βの局所的提示が、細胞同種移植が拒絶されるのを防ぐ免疫調節微小環境を促進するという仮説を試験した。本発明者らは、未成熟表現型のＤＣを維持することによって、並びに、Ｔｒｅｇの頻度を増加させて、ＩＬ－１０依存的な態様のＣＤ４及びＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞のエフェクター機能を減少させることによって、ａｆＴＧＦ－βがその調節機能を発揮することを明らかにした。重要なことに、本発明者らは、ａｆＴＧＦ－βの局所免疫調節作用が脾臓に投射され、これによりアロ線維芽細胞特異的ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞のエフェクター機能が有意に低下することを明らかにした。

ＴＧＦ－βは、重要な免疫調節性サイトカインであり、これは、隣接するサイトカイン環境に応じて、抗炎症応答及び炎症誘発性応答の両方を促進することができる。提示されたＴＧＦ－βが、アルギン酸スキャフォールドに親和結合した場合に、活性化されたエフェクターＴ細胞を調節することができるか否かは不明である。本発明者らによるインビトロの結果は、ＤＣの場合、または大体において、脾細胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した場合、ａｆＴＧＦ－βは、ＣＤ４Ｔ細胞の活性化を抑制するとともに、ＩＬ－１０の分泌レベル及びＴｒｅｇｓの頻度を増加させることを示した。抗ＩＬ－１０またはＣＤ１１ｃ－ＤＮＲ脾細胞を用いてインビトロで実施したブロッキング実験は、ａｆＴＧＦ－βが、（１）ＤＣに対するＩＬ－１０シグナル伝達を向上させ、その未成熟表現型を維持するという２つの経路において調節機能を有することを示唆する。この結果、未成熟ＤＣは、過去の研究でも観察されたように、Ｔ細胞のエフェクター機能を低下させ、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの頻度を増加させ、そして、（２）それは、エフェクターＴ細胞に直接シグナルを伝達し、エフェクター機能を減弱させる。

注目すべきことに、ａｆＴＧＦ－βは、２Ｄ培養物中の可溶性ＴＧＦ－βよりも効果的である。この現象は、ＴＧＦ－βはマトリクスに親和結合したときの、ＴＧＦ－βの細胞に対する局所的な提示によってシグナル伝達が向上することに起因すると思われる。さらに、ＴＧＦ－βの親和結合は、元のスキャフォールドに吸着されたときの迅速な放出と比較して、活性サイトカインの長期間持続放出をもたらした。これらの機序の両方が、免疫調節環境の生成の成功に寄与する。ＴＧＦ－β制御放出システムは、インビトロ及びインビボでのＴｒｅｇの集団の誘導及び増殖のために従来使用されてきた。しかしながら、これらのシステムはいずれも、サイトカインの親和結合を利用していないか、または、このストラテジーを研究して、アロ細胞移植デバイスとしての使用を容易にする３Ｄ免疫調節環境を生成することを試みていない。

移植デバイスとして、アルギン酸塩スキャフォールドに、スキャフォールド血管新生を広範囲に促進する血管新生因子ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦ－βを添加した。このような細胞移植デバイスの潜在的な問題は、血管新生が促進され、移植された細胞への及び該細胞からの効率的な物質輸送を可能にするが、白血球浸潤の増進は、同種移植拒絶を促進し得ることである。本発明者らのデータは、インビトロ及びインビボの両方で観察されるように、ａｆＴＧＦ－βが同様の調節効果を発揮することを示した。ＴＧＦ－β欠損構築物と比較して、移植後の１０日目及び１５日目に回収されたａｆＴＧＦ－β含有構築物は、成熟ＤＣの頻度の有意な減少、Ｔｒｅｇの頻度の増加、及び細胞傷害性Ｔ細胞の頻度の減少を示した。さらに、脾細胞由来アロ線維芽細胞反応性ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞は、炎症促進性サイトカインのレベルの有意な低下を示し、細胞傷害活性はほぼ完全に消失したため、ａｆＴＧＦ－β構築物を移植したマウスも末梢寛容を誘起した。したがって、ＴＧＦ－βがスキャフォールド内に局所的に提示された場合には、移植されたデバイスの血管新生は、移植片の生存を増加させるだけでなく、移植された細胞に応答して誘起される末梢免疫反応を減弱させる。

本発明者らは、ＴＧＦ－β欠損構築物と比較したａｆＴＧＦ－β構築物の独特な特性を説明するために２段階のモデルを提案する。第１段階では、ａｆＴＧＦ－βは浸潤ＡＰＣにシグナルを伝達し、移植された細胞を取り込みながら、浸潤ＡＰＣを未成熟状態に維持する。移植後の数日以内に毛細血管が形成され、その毛細血管を通じてＡＰＣが排液リンパ節に移動し、ナイーブアロ線維芽細胞反応性ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞のアネルギまたは軽度の活性化のいずれかが促進される。第２段階では、スキャフォールド浸潤Ｔ細胞へのａｆＴＧＦ－βシグナル伝達は、未成熟ＤＣの存在と共に、ＤＣ活性化をさらに減弱させて、Ｔｒｅｇの分化及び／または増殖を促進する。これらのプロセスは、全体としては、ａｆＴＧＦ－β構築物の移植後の１５日目及び３０日目に観察されるアロ繊維芽細胞の細胞傷害性を有意に低下させる。

アルギン酸スキャフォールドは宿主内で減少するので、ＴＧＦ－βリッチ環境が局所抗原特異的免疫調節を全身的及び抗原特異的免疫寛容に拡張することが非常に重要である。１型糖尿病の場合、例えば、移植されたβ細胞に応答して誘起される末梢寛容は、膵臓における免疫攻撃をブロックし、膵島再生を防止できるであろう。免疫抑制薬の場合のように、病原体に対する宿主防御が損なわれることを回避しながら、他の組織特異的自己免疫疾患を治療するために、同様のストラテジーを用いることができる。

実施例５
多発性硬化症（ＭＳ）を治療するためのアルギン酸塩／硫酸化アルギン酸マトリックス（ａｆＴＧＦ－β）に対するＴＧＦ－βの親和結合

実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を、多発性硬化症（ＭＳ）のモデルとして使用した。Ｃ５７ＢＬ６マウスを、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）残基３５－５５で免疫化した。７－１０日後、マウスは、進行臨床スコアで尾及び四肢の麻痺を発症した。この疾患は、ＭＳの典型的な病変特性を形成する脊髄への白血球浸潤によって明らかにされる。病気は、しばしば、再発寛解型の形態で現れる。ＴＧＦ－β及びＭＯＧ３５－５５ペプチドを保有または欠損するアルギン酸塩／硫酸化アルギン酸スキャフォールドを、免疫化前後の互いに異なる時点（例えば、疾患発症の５日前、ピーク臨床スコアでの１５日目、または寛解時の２０日目）に移植し、ＥＡＥ臨床スコア、並びに、ＭＯＧ特異的ＣＤ４Ｔ細胞（サイトカインプロファイル及び活性化マーカー）の表現型及び脊髄の組織病理（すなわち、浸潤白血球及び脱髄）を調べた。ＥＡＥ臨床スコアは、「Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in the Mouse. Curr Protoc Immunol. 2007 May; CHAPTER: Unit-15.1」（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているようにして調べた。

結果は、ＭＯＧ特異的Ｔ細胞が寛容され、これにより、ＴＧＦ－β及びＭＯＧ３５－５５を保有するスキャフォールドを受け取った動物における、ＥＡＥ臨床スコアの減少、リンパ球浸潤、ＭＳ病変の減少を含む急性及び慢性疾患プロセスが予防または改善されることを示した。

臨床試験において、ＴＧＦβスキャフォールドは、ＭＳを有する対象の特異的ＨＬＡ対立遺伝子に依存して、いくつかの免疫優性エピトープを保有する。

実施例６
Ｉ型糖尿病を治療するためのａｆＴＧＦ－β

白血球が膵臓のβ細胞を破壊するＩ型糖尿病（ＮＯＤマウスなど）のマウスモデルにおいて、ＴＧＦ－βを発現する同種異系または同系の膵臓β細胞を、疾患発症前後（約１０週間）に移植し、マウスのインスリン及びグルコースレベル、並びに、免疫浸潤、病態生理、及びスキャフォールド及び膵臓の両方におけるβ細胞生存を調べた。

結果は、β細胞特異的リンパ球が寛容され、これにより、ＴＧＦβを発現する膵臓β細胞を受け取った動物におけるβ細胞死亡率の減少、インスリンレベルの上昇、及び血糖値の低下を含む急性及び慢性疾患プロセスが予防または改善されることを示した。

本発明の特定の特徴を図示及び説明したが、当業者であれば、様々な修正、置換、変更、及び均等物を想起できるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神に含まれるそのような全ての修正及び変更を包含することを意図していると理解されたい。

Claims

組成物であって、
アルギン酸硫酸塩と、前記アルギン酸硫酸塩の硫酸基に対して非共有的に結合するトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ－β１）ポリペプチドとを含み、
対象における免疫寛容応答の誘導に使用される、組成物。
前記免疫寛容応答が、末梢免疫寛容、前記組成物の投与領域に限局される免疫寛容応答、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の組成物。
前記免疫寛容応答が、同種移植成功の向上、アロ細胞移植に対する免疫応答の抑制、アロ細胞アポトーシスの抑制、アロ細胞生存の増加、アロ細胞移植の血管新生の促進、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１または２に記載の組成物。
前記免疫寛容応答が、前記ＴＧＦ－β１ポリペプチドの長期間の提示、炎症性シグナル伝達の抑制、樹状細胞成熟の抑制、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性応答の抑制、制御性Ｔ細胞分化の促進、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１または２に記載の組成物。
組成物であって、
アルギン酸硫酸塩と、前記アルギン酸硫酸塩の硫酸基に対して非共有的に結合されるトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ－β１）ポリペプチドとを含み、
対象における自己免疫疾患または障害の治療または抑制に使用される、組成物。
前記自己免疫疾患または傷害が、多発性硬化症、乾癬、及びＩ型糖尿病を含む、請求項５に記載の組成物。
前記自己免疫疾患または傷害がＩ型糖尿病である場合には、当該組成物は、膵臓β細胞をさらに含み、
前記自己免疫疾患または傷害が多発性硬化症である場合には、当該組成物は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
組成物であって、
アルギン酸硫酸塩と、前記アルギン酸硫酸塩の硫酸基に対して非共有的に結合されるトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ－β１）ポリペプチドとを含み、
対象における同種移植拒絶の減少または防止に使用される、組成物。
当該組成物が、前記アルギン酸硫酸塩の硫酸基に対して非共有的に結合する少なくとも１つの生物活性ポリペプチドをさらに含む、請求項１ないし８のいずれかに記載の組成物。
前記少なくとも１つの生物活性ポリペプチドが、正に帯電したポリペプチド、ヘパリン結合性ポリペプチド、血管新生活性を示すヘパリン結合性ポリペプチド、自己抗原、またはそれらの組み合わせを含む、請求項９に記載の組成物。
前記少なくとも１つの生物活性ポリペプチドが、
アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、セリンプロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰ１）、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１ＩＮＨ）、ワクシニアウイルス補体制御タンパク質（ＶＣＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ受容体、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＣＸＣケモカインリガンド４（ＣＸＣＬ４）、ストロマ細胞由来因子－１（ＳＤＦ－１）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、血小板やＴ細胞由来の好酸球走化性物質（ＲＡＮＴＥＳ）、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）、マクロファージ炎症性ペプチド－１（ＭＩＰ－１）、リンホタクチン、フラクタルカイン、アネキシン、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）コートタンパク質ｇｐ１２０、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）、Ｔａｔタンパク質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のウイルスコート糖タンパク質ｇＣ、ｇＢ、またはｇＤ、デングウイルスの外被タンパク質、熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質、細菌表面接着タンパク質ＯｐａＡ、１－セレクチン、Ｐ－セレクチン、ヘパリン結合性増殖関連分子（ＨＢ－ＧＡＭ）、トロンボスポンジンＩ型反復（ＴＳＲ）、アミロイドＰ（ＡＰ）、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－７、またはインターロイキン－１０（ＩＬ－１０）を含む、請求項９に記載の組成物。
血管新生活性を示す前記ヘパリン結合性ポリペプチドが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ａＦＧＦ、ＰＤＧＦ－ββ、ＩＧＦ、ＨＧＦ、ＢＭＰ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１０に記載の組成物。
血管新生活性を示す前記ヘパリン結合性ポリペプチドが、ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦ－ββの両方を含む、請求項１２に記載の組成物。
前記自己抗原が、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）を含む、請求項１０に記載の組成物。
当該組成物が、支持マトリックスをさらに含む、請求項１ないし１４のいずれかに記載の組成物。
前記支持マトリックスが、多糖類、タンパク質、細胞外マトリックス成分、合成ポリマー、及びそれらの任意の混合物からなる群より選択されるポリマーを含む、請求項１５に記載の組成物。
前記多糖類が、アルギン酸塩と硫酸化アルギン酸塩との組み合わせを含む、請求項１６に記載の組成物。
前記アルギン酸硫酸塩が、ウロン酸残基を含む、請求項１ないし１７のいずれかに記載の組成物。
Ｉ型糖尿病を治療するための細胞移植デバイスであって、
バイオコンジュゲートを含み、
前記バイオコンジュゲートが、アルギン酸硫酸塩と、前記アルギン酸硫酸塩の硫酸基に対して非共有的に結合されるトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ－β１）と、同種異系または同系の膵臓β細胞とを含む、細胞移植デバイス。
少なくとも１つの生物活性ポリペプチドをさらに含む、請求項１９に記載の細胞移植デバイス。