ES2322637B1 - Microparticulas de alginato modificado con rgd como sistema de liberacion de farmacos. - Google Patents
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Abstract
Microipartículas de alginato modificado con RGD
como sistema de liberación de fármacos.
La presente invención tiene como objeto
proporcionar partículas de un material polimérico que contienen
células en su interior, en donde dichas partículas presentan una
resistencia sustancialmente superior a las microcápsulas conocidas
en el estado de la técnica. Dicha resistencia se consigue mediante
la funcionalización del material polimérico que forma la
microcápsula con un péptido que puede unirse a las proteínas de
adhesión de la membrana celular, de forma que las células actúan
como agentes reticulantes de la matriz lo que resulta en una mejora
de las propiedades mecánicas de las matrices.
Description
Micropartículas de alginato modificado con RGD
como sistema de liberación de fármacos.
La presente invención se relaciona con sistemas
de células encapsulados y, más concretamente, con microcápsulas
formadas por un material polimérico que ha sido modificado por un
péptido que es capaz de unirse a las proteínas de adhesión que se
encuentran en la membrana celular de forma que las células que se
encuentran en el interior de la microcápsula interaccionan con
dicho péptido. La invención también contempla microcápsulas en las
que las células han sido modificadas genéticamente para expresar
una proteína de interés terapéutico así como a las aplicaciones
terapéuticas de dichas microcápsulas.
La tecnología de la microencapsulación celular
se basa en la inmovilización de células dentro de una matriz
polimérica rodeada por una membrana semipermeable. Dichas células
encapsuladas están protegidas frente al rechazo del sistema inmune
celular y dependiente de anticuerpos y tienen el potencial de
producir un amplio abanico de sustancias terapéuticamente activas
(Orive, G, et al. 2003, Nat. Med. 9:104-107,
Orive, G. Trends Biotechnol. 2004, 22:87-92).
Estos sistemas "vivos" de liberación de
fármacos resultan especialmente interesantes para la expresión de
hormonas y factores de crecimientos de forma controlada y
continuada, para la liberación local y dirigida de fármacos y para
la mejora de la farmacocinética de péptidos y proteínas fácilmente
degradables, los cuales, frecuentemente, tienen una vida media
in vivo corta.
Debido a sus características, el alginato ha
sido empleado frecuentemente como material de microencapsulación.
Así, Orive, G. et al. (Mol. Therapy, 2005,
12:283-289) describen microcápsulas de alginato
recubiertas de una membrana semipermeable de
poli-L-lisina que contiene
mioblastos genéticamente modificados y que expresan eritropoietina
(EPO). Las microcápsulas de alginato están estabilizadas por medio
de cationes divalentes que, tras su implantación en el organismo,
tienden a difundir lo que resulta en una progresiva debilitación de
la estructura de la microcápsula. Hasta la fecha, los intentos por
mejorar la resistencia mecánica a largo plazo de estos sistemas se
han basado en el reforzamiento de las microcápsulas con una membrana
semipermeable (De Castro, M. et al. 2005, J Microencapsul.
22(3):303-15), mediante el uso de variantes
del alginato modificadas mediante la condensación polielectrolítica
con otro polímero, como el
polimetileno-co-guanidina (Orive,G.
et al. 2003, Int. J. Pharm. 18:57-68) o
mediante el entrelazado de las moléculas de alginato un monómero
etilénico (WO03/094898). Sin embargo, este tipo de polímeros
modificados no proporcionan un microambiente adecuado para la
viabilidad celular. La solicitud de patente estadounidense
US2006/0251630 describe microcápsulas de agarosa que contienen
células encapsuladas en las que las microcápsulas se han preparado
en presencia de fibrinógeno. Sin embargo, las microcápsulas están
destinadas a la liberación rápida de las células, por lo que son
cápsulas que no presentan una alta estabilidad. Markusen, J.F.
et al. (Tissue Engeneering, 2006, 12:821-830)
describen cápsulas de alginato modificadas con un péptido GRGDY y
que contienen células mesenquimales adultas, así como su uso como
sustituto de tejidos. Sin embargo, en este estudio no se demuestran
que las células encapsuladas sobrevivan más de 15 días desde el
momento de la implantación.
Por ello, existe una necesidad en la técnica de
microcápsulas de alginato que presenten una mayor estabilidad y
que, a la vez, garanticen durante largo tiempo la viabilidad de las
células que se encuentran en su interior.
En un primer aspecto, la invención se relaciona
con una partícula de 1 mm de diámetro como máximo que
comprende:
- a)
- un polímero X funcionalizado con, al menos, un péptido Y; y
- b)
- al menos, una célula que presenta en su superficie sitios de unión específicos para dicho péptido Y, en donde la célula se encuentra unida al polímero X mediante la interacción entre el péptido Y y los sitios de unión específicos para dicho péptido Y en la superficie de la célula.
En un segundo aspecto, la invención se relaciona
con una microcápsula que comprende una partícula de la invención
rodeada por una membrana semipermeable.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una partícula o microcápsula de la invención para su uso en
medicina.
medicina.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el uso de la partícula o microcápsula de la invención para la
preparación de un medicamento para el tratamiento y prevención de
enfermedades en las que se requiera una aportación del compuesto de
naturaleza peptídica con actividad biológica que es expresado por
las células que forman parte de las microcápsulas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el uso de la partícula o microcápsula de la invención como
dispositivo para la liberación de un compuesto de naturaleza
peptídica con actividad biológica.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método para la elaboración de una partícula de la invención que
comprende las etapas de:
- a)
- poner en contacto una sustancia polimérica que está modificada con un péptido Y con, al menos, una célula que presenta en su superficie sitios de unión específicos para dicho péptido Y; y
- b)
- aplicar condiciones que permitan la formación de partículas de material polimérico que tengan menos de 1 mm de diámetro.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método para preparar una microcápsula de la invención que
comprende las etapas de:
- a)
- poner en contacto una sustancia polimérica que está modificada con un péptido Y con unas células que tienen la capacidad de unirse a dicho péptido Y;
- b)
- aplicar condiciones que permitan la formación de partículas de material polimérico que tengan menos de 1 mm de diámetro; y
- c)
- recubrir la micropartícula formada en la etapa b) con una membrana de un material distinto al polímero usado en la etapa a).
Figura 1. a) viscosidad de la mezcla de
alginatos-RGD y la solución de alginato LVG. b)
Ilustración que describe el efecto de la bioactivación de las
matrices de alginato con RGD, lo que facilita la adhesión de la
células inmovilizadas a la matriz; c) Estudio de la estabilidad
osmótica de las cápsulas LVG frente a las bioactivadas con RGD; d)
Resistencia mecánica por compresión de ambas partículas mediante
texturometría.
Figura 2. a) Seguimiento durante 300 días del
hematocrito de los animales implantados con microcápsulas LVG y
bioactivadas con RGD frente a animales control; b) Imagen al
microscopio de cápsulas extraídas en el día 300 tras iniciarse el
tratamiento; c) Producción de EPO de las cápsulas explantadas a día
300 de los animales; d) Histología de las microcápsulas a día
300.
Figura 3: Estudio
dosis-respuesta: a) Imágenes iniciales de las
microcápsulas RGD con diferentes densidades celulares; b) y c)
viabilidad y producción de EPO de las células encapsuladas
respectivamente; d) viabilidad de las dosis de cápsulas a diferentes
densidades celulares durante 6 meses; e) ilustraciones
correspondientes a los agregados de microcápsulas y la
vascularización inducida a los 6 meses; f) Histología de las
diferentes microcápsulas.
Los autores de la presente invención han
observado que, sorprendentemente, cuando micropartículas de
alginato que contienen células se preparan con un alginato que ha
sido modificado mediante conjugación con un péptido de bioadhesión
celular, las micropartículas resultantes presentan una resistencia
física muy superior a las microcápsulas que contienen alginato no
modificado. Sin tener intención de estar vinculado por ninguna
teoría, se piensa que este efecto es debido a la aparición de
interacciones entre las moléculas de adhesión que están en la
superficie de las células microencapsuladas y los péptidos de
adhesión acoplados al alginato, lo que resulta en que las células
se incorporan a la matriz como agentes reticulantes, lo que resulta
en una mejora de las propiedades mecánicas de las matrices. Por
otro lado, los inventores han observado que la viablidad de las
células en las partículas puede verse comprometida si las
partículas tienen más de 1 mm de diámetro. Sin querer estar
vinculado por ninguna teoría, se piensa que el pequeño diámetro de
las partículas permite que las células se encuentren a una
distancia máxima de 100 a 200 \mum con respecto a la fuente de
nutrientes (habitualmente un capilar), lo que garantiza un aporte
óptimo de nutrientes.
Por ello, en un primer aspecto, la invención se
relaciona con una partícula de 1 mm de diámetro como máximo que
comprende:
- a)
- un polímero X funcionalizado con, al menos, un péptido Y; y
- b)
- al menos, una célula que presenta en su superficie sitios de unión específicos para dicho péptido Y, en donde la célula se encuentra unida al polímero X mediante la interacción entre el péptido Y y los sitios de unión específicos para dicho péptido Y en la superficie de la célula.
El diámetro exacto de las partículas no es
limitante siempre que sea inferior a 1 mm. Así, en formas
preferidas de realización, las partículas tienen, como máximo entre
1 y 0,9, entre 0,9 y 0,8, entre 0,8 y 0,7, entre 0,7 y 0,6, entre
0,6 y 0,5, entre 0,5 y 0,4, entre 0,4 y 0,3, entre 0,3 y 0,2, entre
0,2 y 0,1 o menos de 0,1 mm de diámetro.
Materiales de relleno adecuados para actuar como
soporte de las células pueden ser cualquier tipo de material
polimérico, en particular, los polímeros termoplásticos o los
polímeros hidrogeles.
Entre los polímeros del tipo hidrogel se
encuentran materiales naturales del tipo alginato, agarosa,
colágeno, almidón, ácido hialurónico, albúmina de suero bovina,
celulosa y sus derivados, pectina, condroitin sulfato, fibrina y
fibroina, así como hidrogeles sintéticos como sefarosa y
sefadex.
Entre los polímeros termoplásticos se encuentran
ácido acrílico, acrilamida, 2-aminoetil
metacrilato,
poli(tetrafluoroetileno-cohexafluorpropileno),
ácido metacrílico-(7-cumaroxi)etil éster,
N-isopropil acrilamida, ácido poliacrílico,
poliacrilamida, poliamidoamia,
poli(amino)-p-xilileno,
poli(cloroetilvoniléter), policaprolactona,
poli(caprolactona-co-trimetilen
carbonato), poli(carbonato urea)uretano,
poli(carbonato)uretano, polietileno, copolímero de
polietileno y acrilamida, polietilenglicol, polietilenglicol
metacrilato, poli(etilen tereflalato),
poli(4-hidroxibutil acrilato),
poli(hidroxietil metacrilato),
poli(N-2-hidroxipropil
metacrilato), poli(ácido láctico-ácido glicólico), poli(ácido L
láctico), poli(gamma-metil,
L-glutamato), poli(metilmetacrilato),
poli(propileno fumarato), poli(propileno óxido),
polipirrol, poliestireno, poli(tetrafluoro etileno),
poliuretano, polivinil alcohol, polietileno de peso molecular
ultra-alto,
6-(p-vinilbenzamido)-ácido hexanoico y
N-p-vinilbenzil-D-maltonamida
y copolímeros que contienen más de uno de dichos polímeros.
En una forma de realización preferida, el
polímero usado como soporte en la microcápsulas de la invención es
alginato. En principio, cualquier tipo de alginato capaz de formar
un hidrogel es adecuado para ser usado en las microcápsulas de la
invención. Así, las microcápsulas de la invención pueden contener
alginato formado mayoritariamente por regiones de ácido manurónico
(bloques MM), por regiones de ácido gulurónico (bloques GG) y por
regiones de secuencia mixta (bloques MG). El porcentaje y
distribución de los ácidos urónicos difieren según el origen del
alginato y contribuyen a las propiedades del alginato. El experto
en la materia conoce los porcentajes de cada uno de los distintos
bloques que aparecen en las distintas fuentes biológicas de los
alginatos. Así, la invención contempla el uso de alginatos
procedentes de Laminaria hyperborea, Letonia nigrescens,
Lessonia trabeculata, Durvillaea antarctica, Laminaria digitata,
Eclonia maxima, Macrocystis pyrifera, Ascophyllum nodosum y/o
Laminaria japonica así como mezclas de alginatos de distintas
especies hasta conseguir el contenido deseado en bloques GG, MM o
GM. Los bloques GG contribuyen a la rigidez del hidrogel, mientras
que los monómeros MM mantienen una gran resistencia a la fractura,
de forma que mediante el uso de una combinación adecuada de
polímeros de alginato, se puede obtener una mezcla cuyo módulo de
elasticidad presenta un valor adecuado mientras que la viscosidad de
la solución pre-gel se mantiene a niveles
suficientemente bajos como para permitir una adecuada manipulación
e inmovilización celular. Así, los alginatos que pueden usarse en la
presente invención incluyen alginatos GG, alginatos MM o
combinaciones de ambos en una relación de 90:10, 80:20, 70:30,
60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 o 10:90. En una forma de
realización preferida, se ha utilizado una mezcla de ambos tipos de
polímeros para formar hidrogeles binarios que contienen un 50% de
polímeros MVG irradiados y un 50% de polímeros de tipo MVG
sustituidos con secuencias RGD.
Adicionalmente, la invención también contempla
el uso de alginatos derivados del tratamiento de alginatos
naturales con enzimas que son capaces de modificar los bloques
integrantes para dar lugar a alginatos con propiedades mejoradas.
Así, alginatos resultantes del tratar alginatos con
C5-epimerasas, que convierten bloques M en bloques
G, así como con la enzima AlgE4 de la bacteria Azotobacter
vinelandii que es capaz de convertir los bloques M
relativamente rígidos en bloques MG. Alternativamente, la invención
contempla el uso de alginatos que han sido modificados por distintos
tratamientos físicos, en particular, rayos gamma, irradiación con
ultrasonidos o con luz ultravioleta según ha sido descrito por
Wasikiewicz, J.M. et al. (Radiation Physics and Chemistry,
2005, 73:287-295). Así, en una forma de realización
preferida, los alginatos han sido tratados con una fuente de rayos
gamma, preferentemente Co^{60}, en una dosis de
10-500 kGy. El tratamiento con rayos gamma resulta
en la degradación del alginato con lo que los bloques de alginatos
GG, MM o GM que se incorporan en la partícula son de menor peso
molecular.
El polímero que forma parte de las microcápsulas
se encuentra funcionalizado con un péptido Y, que permite la unión
de las células que se encuentran en las microcápsulas con el
polímero a través de la interacción específica entre componentes de
la membrana celular y el péptido Y. En principio, cualquier péptido
que posea sitios de unión específicos en el exterior de la membrana
celular puede ser usado en la presente invención. Así, el péptido Y
puede proceder de moléculas de adhesión celular que interacciona
con la matriz extracelular como la fibronectina, los distintos
miembros de la familias de las selectinas, las caderinas, las
lectinas, las integrinas, las inmunoglobulinas, las colectinas y
las galectinas.
En una forma de realización preferida, el
péptido Y es un péptido derivado de una región seleccionada de las
regiones de las fibronectina que intervienen en la unión con las
integrinas que se encuentran en la membrana celular.
Preferentemente, dichos péptidos derivan de la región de la décima
repetición tipo III de fibronectina que contiene el péptido RGD, de
la región de la decimocuarta repetición tipo III de la fibronectina
que contiene el péptido IDAPS, de la región CSI de fibronectina que
contiene el péptido LDV y la región CS5 de la fibronectina que
contiene el péptido REDV. Estos péptidos pueden consistir en
fragmentos de las regiones correspondientes que conservan su
capacidad adhesiva, como, por ejemplo, el péptido QAGDV del
fibrinógeno, el péptido LDV de la fibronectina y el péptido IDSP de
VCAM-I. En una forma de realización particular,
dicho péptido de unión a integrinas es un péptido derivado de la
décima repetición tipo III de la fibronectina que comprende la
secuencia RGD, como, por ejemplo, un péptido seleccionado del grupo
de RGD, RGDS, GRGD, RGDV, RGDT, GRGDG, GRGDS, GRGDY, GRGDF, YRGDS,
YRGDDG, GRGDSP, GRGDSG, GRGDSY, GRGDVY, GRGDSPK, CGRGDSPK,
CGRGDSPK, CGRGDSY, ciclo(RGDfK), YAVTGRGD,
AcCGGNGEPRGDYRAY-NH2, AcGCGYGRGDSPG and RGDPASSKP,
variantes cíclicas de dichos péptidos, variantes multivalentes
tanto lineales como ramificadas (ver por ejemplo Dettin, M. et
al. 2002, J. Biomed. Mater. Res. 60:466-471,
Monaghan; S. et al. 2001, Arkivoc, 2:U42-49,
Thumshirn, G. et al. 2003, Chemistry
9:2717-25, Scott, E.S. et al, 2001, J. Gene
Med. 3:125-134)) así como combinaciones de dos o
más de dichos péptidos.
El péptido de adhesión celular puede estar unido
al polímero que actúa como soporte a través del extremo
N-terminal o del extremo C-terminal
e, independientemente del punto de anclaje, puede estar unido
directamente al polímero que actúa como soporte o,
alternativamente, puede estar unido a través de un elemento
espaciador. Prácticamente, cualquier péptido con flexibilidad
estructural puede ser utilizado. A modo ilustrativo, dicho péptido
flexible puede contener repeticiones de restos de aminoácidos, tales
como (Gly)_{4},
Gly-Gly-Gly-Ser,
(Gly)_{13} (Beer, J.H. et al., 1992, Blood, 79,
117-128), SPASSKGGGGSrL6-NH2
(Craig, W.S. et al. 1995, Biopolimers,
37:157-175) o cualquier otra repetición de restos
de aminoácidos adecuada, o bien la región bisagra de un
anticuerpo.
Asimismo, la invención contempla distintos
grados de sustitución del alginato con el péptido bioadhesivo, de
forma que durante el proceso de conjugación del polímero con el
péptido de bioadhesión, las concentraciones de ambos componentes se
pueden variar de forma que el polímero modificado resultante tenga
el número deseado de péptidos bioadhesivos acoplados. Así, la
invención contempla alginatos que contienen entre 1 y 100, entre
100 y 200, entre 200 y 300, entre 300 y 400, entre 400 y 500, entre
500 y 600, entre 600 y 700, entre 700 y 800, entre 800 y 900 y
entre 900 y 1000 moléculas de péptido bioadhesivo por cada molécula
de polímero.
Las partículas de la invención pueden usarse tal
cual. Sin embargo, el alginato es un polímero poco estable que
tiende a perder calcio y por tanto, a perder su carácter de gel.
Además, las partículas de alginato son relativamente porosas lo que
resulta en que los anticuerpos pueden acceder a su interior y dañar
las células. Por estos motivos, es conveniente que las
micropartículas se rodeen de una membrana semipermeable que
confiera estabilidad a las partículas y que forme una barrera
impermeable a los anticuerpos. Por este motivo, en otro aspecto la
invención se relaciona con microcápsulas que comprenden una
partícula según la invención rodeadas de una membrana
semipermeable.
Por membrana semipermeable se entiende una
membrana que permite la entrada de todos aquellos solutos
necesarios para la viabilidad celular y, en el caso de que se usen
células que producen una proteína terapéutica, que permitan la
salida de las proteínas terapéuticas producidas por las células,
pero que es sustancialmente impermeable a los anticuerpos, de forma
que las células quedan protegidas de la respuesta inmune producida
por el organismo que alberga las microcápsulas.
Materiales adecuados para formar la membrana son
materiales insolubles en fluidos biológicos, preferentemente
poliamino ácidos, como por ejemplo
poli-L-lisina,
poli-L-ornitina,
poli-L-arginina,
poli-L-asparagina,
poli-L-aspártico, poli
benzil-L-aspartate,
poli-S-benzil-L-cisteína,
poli-gamma-bencil-L-glutamato,
poli-S-CBZ-L-cisteína,
poli-\varepsilon-CBZ-D-lisina,
poli-\delta-CBZ-DL-ornitina,
poli-O-CBZ-L-serina,
poli-O-CBZ-D-tirosine,
poli(\gamma-etil-L-glutamato),
poli-D-glutámico, poliglicina,
poli-\gamma-N-hexil
L-glutamato,
poli-L-histidina,
poli(\alpha,\beta-[N-(2-hidroxyetil)-DL-aspartamida]),
poli-L-hidroxiprolina,
poli(\alpha,\beta-[N-(3-hidroxipropil)-DL-aspartamida]),
poli-L-isoleucina,
poli-L-leucina,
poli-D-lisina,
poli-L-fenilalanina,
poli-L-prolina,
poli-L-serina,
poli-L-treonina,
poli-DL-triptófano,
poli-D-tirosina o una combinación de
los mismos. Más preferiblemente, los poli amino ácidos con poli
amino ácidos policatiónicos. Aún más preferiblemente, los poli
amino ácidos policatiónicos son
poli-L-lisina,
poli-L-ornitina y
poli-D-lisina.
La membrana que recubre la microcápsula es
habitualmente de un material policatiónico, que da lugar a la
formación de un complejo polianión-policatión que
contribuye a la estabilización del alginato y a reducir la porosidad
de la microcápsula y a formar una barrera inmunológica impermeable
a los anticuerpos. Sin embargo, la carga positiva de dicha membrana
favorece la adhesión celular a la superficie de la microcápsula lo
que resulta en una menor biocompatibilidad de la microcápsula. Por
ello, en una forma de realización particular, la membrana que rodea
la microcápsula está rodeada, a su vez, de una segunda membrana
formada mayoritariamente por un material que inhibe la adhesión
celular. En una forma de realización, preferida, dicho material que
forma la segunda membrana es un alginato.
Cualquier célula eucariota puede ser utilizada
en la presente invención siempre que presente en su superficie
sitios de unión para el péptido Y, pero las células de ratón, rata,
primate y humanas son las preferidas. Así células adecuadas para
llevar a cabo la invención son cardiomiocitos, células
endoteliales, células epiteliales, linfocitos (células B y T),
mastocitos, eosinófilos, células de la intima vascular, cultivos
primarios de células aisladas de distintos órganos, preferentemente
de células aisladas de los islotes de Langerhans, hepatocitos,
leucocitos, incluyendo leucocitos mononucleares, células madre de
origen embrionario, mesenquimales, de cordón umbilical o adultas (de
piel, pulmón, riñón e hígado), osteoclastos, condrocitos y otras
células del tejido conectivo. También son adecuadas células de
líneas establecidas tales como células T de Jurkat, células
NIH-3T3, CHO, Cos, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293,
3T3, mioblastos C2C12 y células W138.
En principio, el número de células que deben
formar parte de las microcápsulas no es esencial para la invención
siempre que exista un número de células suficiente para que se
contribuyan a la formación de la retícula y se obtenga el deseado
efecto de aumento de la resistencia mecánica de las
micropartículas. Así, en una forma preferida de realización, la
cantidad de células por cada mL de solución de alginato es entre 1 y
10 x 10^{6}, preferiblemente entre 2 y 9 x 10^{6}, más
preferiblemente entre 3 y 8 x 10^{6}, todavía más preferiblemente
entre 4 y 7 x 10^{6} y todavía más preferiblemente entre 5 y 6 x
10^{6}. Preferiblemente, el número de células en la mezcla
inicial es de 5; 3,75; 2,5 ó 1,25 x 10^{6} por cada mL de
solución de alginato.
En una forma de realización preferida, las
células que forman parte de las microcápsulas han sido modificadas
genéticamente de forma que producen proteínas terapéuticas. En este
caso, las células deben ser capaces de modular la expresión de las
secuencias insertadas y de modificar y procesar el producto de
forma que la proteína adquiera su conformación nativa. Ejemplos de
proteínas que pueden ser producidas por las células que forman
parte de las microcápsulas objeto de la invención son eritropoietina
(EPO), hormona liberadora de hormona adrenocortieotropa (CRH),
hormona liberadora de hormona somatotropa (GHRH), hormona
liberadora de gonadotrofinas (GnRH), hormona liberadora de
tirotropina (TRH), hormona liberadora de prolactina (PRH), hormona
liberadora de melatonina (MRH), hormona inhibidora de prolactina
(PIH), somatostatina, hormona adrenocorticotropa (ACTH), hormona
somatotropa o del crecimiento (GH), hormona luteinizante (LH),
hormona foliculoestimulante (FSH), tirotropina (TSH u hormona
estimulante del tiroides), prolactina, oxitocina, hormona
antidiurética (ADH o vasopresina), melatonina, factor inhibidor
Mülleriano, calcitonina, hormona paratifoidea, gastrina,
colecistoquinina (CCK), secretina, factor de crecimiento de tipo
insulina tipo I (IGF-I), factor de crecimiento de
tipo insulina tipo II (IGF-II), péptido
natriurético atrial (PNA), gonadotrofina coriónica humana (GCH),
insulina, glucagón, somatostatina, polipéptido pancreático (PP),
leptina, neuropéptido Y, renina, angiotensina I, angiotensina II,
factor VIII, factor IX, factor tisular, factor VII, factor X,
trombina, factor V, factor XI, factor XIII, interleuquina 1
(IL-1), Factor de Necrosis Tumoral Alfa
(TNF-\alpha), interleuquina 6
(IL-6), interleuquina 8 (IL-8 y
chemoquinas), interleuquina 12 (IL-12),
interleuquina 16 (IL-16), interferones alpha, beta,
gamma, factor de crecimiento neuronal (NGF), factor de crecimiento
derivado de las plaquetas (PDGF), factor de crecimiento
transformante beta (TGF-beta), proteínas
morfogenéticas del Hueso (BMPs), factores de crecimiento de los
fibroblastos (FGF y KGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF y
relacionados), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF),
factor estimulante de colonias de granulocitos
(G-CSF), factor de crecimiento glial, factor de
crecimiento de queratinocitos, factor de crecimiento endotelial,
antitripsina 1 alfa, factor de necrosis tumoral, factor estimulante
de colonias de granulocito y macrófagos (GM-CSF),
ciclosporina, fibrinógeno, lactoferrina, activador de plasminógeno
tipo tisular (tPA), quimotripsina, inmunoglobinas, hirudina,
superóxido dismutasa,
imiglucerasa.
imiglucerasa.
Los polipéptidos que codifican para proteínas de
interés terapéutico se encuentran asociados a secuencias que
regulan la expresión de dichos polipéptidos. Estas secuencias
pueden ser secuencias que regulan la transcripción, como promotores,
constitutivos o inducibles, enhancers, terminadores
transcripcionales y secuencias que regulan la traducción, como
secuencias no traducidas localizadas 5' ó 3' con respecto a la
secuencia codificante.
Las proteínas expresadas por las células que
forman parte de las microcápsulas de la invención pueden ser
expresadas de forma transitoria o de forma estable. En caso de que
las microcápsulas permanezcan un tiempo prolongado en el paciente,
es preferible usar células que expresen la proteína terapéutica de
forma estable. La expresión estable requiere la transformación del
polinucleótido que codifica para la proteína de selección
conjuntamente con un polinucleótido que codifica para una proteína
que permite seleccionar frente a aquellas células que no han
incorporado el marcador. Sistemas de selección adecuados son, sin
limitación, la timidina quinasa del virus del herpes, la
fosforribosiltransferasa hipoxantina guanina, adenina
fosforibosiltransferasa, genes que codifican para proteínas que
confieren resistencia a un antimetabolito como la dihidrofolato
reductasa, la piruvato transaminasa, el gen de resistencia a la
neomicina y a la higromicina.
Promotores adecuados para la expresión de las
proteínas terapéuticas incluyen, sin estar necesariamente
limitados, promotores constitutivos tales como los derivados de los
genomas de virus eucariotas tales como el virus del polioma,
adenovirus, SV40, CMV, virus del sarcoma aviar, virus de la
hepatitis B, el promotor del gen de la metalotioneina, el promotor
del gen de la timidina kinasa del virus del herpes simplex,
regiones LTR de los retrovirus, el promotor del gen de la
inmunoglobuina, el promotor del gen de la actina, el promotor del
gen EF-1alpha así como promotores inducibles en los
que la expresión de la proteína depende de la adición de una
molécula o de una señal exógena, tales como el sistema tetraciclina,
el sistema NFkappaB/luz UV, el sistema Cre/Lox y el promotor de los
genes de choque térmico.
En principio, la inserción del material genético
exógeno en las células que van a ser encapsuladas puede ser llevado
a cabo mediante cualquier método de los conocidos en la técnica.
Así, el gen o el vector que contiene el gen pueden ser administrados
mediante electroporación, transfección usando liposomas o proteínas
policatiónicas o usando vectores virales, incluyendo vectores
adenovirales y retrovirales y también vectores no virales.
En una forma de realización particular, la
proteína expresada por las células es la eritropoietina o una
variante de la misma. En particular, eritropoietinas adecuadas son
la eritropoietina humana así como variantes de la misma con una
actividad y/o estabilidad mejorada, tales cómo las variantes
descritas en la solicitud internacional de patente WO/2004/043382 o
la variante conocida como nueva proteína estimulante de la
eritropoiesis (NESP o darbepoietin alfa).
Las partículas y microcápsulas de la invención
tienen la propiedad de secretar las proteínas producidas por las
células que se encuentran en su interior, de forma que, si la
proteína tiene interés terapéutico, pueden ser usadas para el
tratamiento de aquellas enfermedades que requieran una aportación
de la proteína terapéutica en cuestión. Así, en otro aspecto, la
invención se relaciona con composiciones farmacéuticas que
contienen las partículas y microcápsulas de la invención así como a
métodos para el tratamiento de distintas enfermedades utilizando
las partículas y microcápsulas de la invención y a métodos para la
preparación de medicamentos que se pueden utilizar para el
tratamiento de enfermedades que requieren la administración de las
proteínas terapéuticas producidas por las partículas y
microcápsulas.
No existe prácticamente limitación en lo que ser
refiere al tipo de enfermedad que puede ser tratada usando las
partículas y microcápsulas de la invención siempre que exista una
proteína que tenga un efecto terapéutico sobre dicha enfermedad. Así
la tabla 1 recoge un número de enfermedades que pueden ser tratadas
con las microcápsulas de la invención con indicación de la proteína
terapéutica necesaria para tal tratamiento.
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En una forma de realización particular, la
proteína que es secretada por la proteína es la eritropietina, en
cuyo caso las microcápsulas pueden ser utilizadas para el
tratamiento y prevención de enfermedades caracterizadas por un bajo
nivel de glóbulos rojos o una producción deficiente de glóbulos
rojos. Ejemplos de tales enfermedades son anemia asociada al fallo
renal crónico, anemia relacionada con la terapia con AZT en
pacientes de SIDA, anemia en pacientes con enfermedades malignas de
tipo no mieloide que reciben quimioterapia, anemia asociada al
cáncer, anemia asociada con enfermedades inflamatorias crónicas
(artritis reumatoide), anemia en pacientes que han sufrido algún
tratamiento quirúrgico para eliminar la necesidad de transfusiones
alogénicas, anemia falciforme, talasemia, anemia asociada a
fibrosis quística, desordenes menstruales, pérdidas agudas de
sangre, anemia resultante de la radioterapia, la reducción de la
captación de oxígeno asociada a la altitud, esquizofrenia y
enfermedades neurodegenerativas.
Las microcápsulas de la invención, tras su
implantación en un sujeto, llegan a vascularizarse lo que garantiza
su permanencia en el tejido durante un largo tiempo. Además, debido
a la existencia de interacciones entre la matriz polimérica y las
células, éstas son funcionales durante más tiempo. Por ambos
motivos, las microcápsulas son capaces de producir proteína
terapéutica de manera estable durante tiempos prolongados, es
decir, actúan como medicamentos de liberación sostenida. Por ello,
las microcápsulas de la invención son especialmente útiles para la
expresión de proteínas de vida media en suero corta, ya que la
rápida eliminación de las proteínas se compensa con una secreción
estable y continuada de las mismas por parte de las microcápsulas.
Esto permite evitar la administración continua y repetida de agente
terapéutico en aquellos pacientes que requieran niveles basales de
dicho agente durante un tiempo prolongado. Por este motivo, en una
forma de realización preferida, las microcápsulas se usan para la
expresión de proteínas terapéuticas de corta semivida de
eliminación.
La semivida de eliminación de un fármaco es el
tiempo necesario para que la cantidad de dicho fármaco o agente
xenobiótico presente en el cuerpo (o en el plasma sanguíneo) se
reduzca a la mitad, mediante diversos procesos de eliminación que
incluyen degradación y la excreción renal. El término "corto"
referido a la semivida de eliminación indica que la proteína
terapéutica tiene una semivida menor de 24, 20, 15, 10, 7, 5, 3 o 1
hora(s).
Las microcápsulas de la invención pueden ser
administradas al paciente de forma parenteral y no parenteral,
incluyendo intravascular, intraperitoneal, subcutánea, intradérmica
o por inhalación.
Debido a la capacidad de las microcápsulas de
liberar las proteínas terapéuticas producidas por las células
encapsuladas, las microcápsulas resultan de gran utilidad como
dispositivo para la liberación de compuestos de naturaleza peptídica
con actividad biológica. Así en otro aspecto, la invención se
relaciona con el uso de las microcápsulas de la invención para la
liberación de compuestos peptídicos con actividad biológica. En una
forma de realización preferida, dicho compuesto tiene una corta vida
media de eliminación en suero. En otra forma de realización
preferida, la liberación se produce de forma controlada bajo la
aplicación de un estímulo externo.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método de preparación de las partículas de la invención que
comprende las etapas de:
- a)
- poner en contacto una sustancia polimérica que está modificada con un péptido Y con al menos una célula que presenta en su superficie sitios de unión específicos para dicho péptido Y; y
- b)
- aplicar condiciones que permitan la formación de partículas de material polimérico que tengan menos de 1 mm de diámetro.
Las condiciones necesarias en la segunda etapa
para promover la agregación de los polímeros y dar lugar a
partículas de menos de 1 mm de diámetro dependerán del tipo de
polímero que se use. En el caso de los polímeros termoplásticos, la
formación de las partículas requiere de calor. En el caso de que el
polímero sea el alginato, la formación de partículas requiere la
puesta en contacto de la mezcla polímero-células con
un catión divalente. Preferentemente, el catión divalente es calcio
y el paso de puesta en contacto de la solución
alginato-células con la solución de catión divalente
se hace mediante extrusión en fase gaseosa o líquida de la mezcla
polímero-células sobre la solución de cationes
divalentes o mediante aplicación de voltaje.
En otro aspecto, la invención proporciona un
método para la preparación de las microcápsulas de la invención que
comprende las etapas de:
- a)
- poner en contacto una sustancia polimérica que está modificada con un péptido Y con al menos una célula que presenta en su superficie sitios de unión específicos para dicho péptido Y;
- b)
- aplicar condiciones que permitan la formación de partículas de material polimérico que tengan menos de 1 mm de diámetro; y
- c)
- poner en contacto las partículas formadas en la etapa b) con un material que forma una membrana en torno a la microcápsula
en donde las etapas a) y b) se
corresponden esencialmente con las etapas del método de preparación
de las partículas de la
invención.
En la tercera etapa, las partículas de
polímero-células se recubren de una membrana que
confiere resistencia mecánica a las partículas y actúan como barrera
inmunológica. El proceso de recubrimiento se lleva a cabo mediante
la puesta en contacto de la micropartícula con el material de
recubrimiento. En una forma de realización preferida, en el caso de
que las partículas sean de alginato y el material que forma la
membrana externa sea un material policatiónico, la simple puesta en
contacto de las partículas con
poli-L-lisina permite que se forme
la membrana de recubrimiento, debido a la interacción directa que
se produce entre la carga positiva de la
poli-L-lisina y la carga negativa
de los alginatos.
En otra forma de realización preferida de la
invención, en caso de que las partículas contengan una capa externa
adicional, el método de preparación incluye una etapa adicional en
la que las microcápsulas se recubren de dicha capa adicional.
Preferentemente, cuando las microcápsulas están rodeadas de una
membrana de un material policatiónico y la capa adicional es
alginato, la etapa adicional requiere simplemente la puesta en
contacto de las microcápsulas con la solución de alginato, ya que
los alginatos, a través de su carga negativa, son capaces de
interaccionar con la membrana de material policatiónico.
La invención se ilustra a continuación en base a
los siguientes ejemplos que se proporcionan a modo ilustrativo y no
limitativo del alcance de la invención.
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Ejemplo
1
Se ajustó el peso molecular de las moléculas de
alginato ricos en restos de ácido gulurónico (Protanal LF240 D, FMC
Technologies) mediante irradiación con una fuente de cobalto 60. Se
variaron la dosis de irradiación de 2 a 5 Mrads. El peso molecular
final de las moléculas de alginato se analizó mediante cromatografia
de filtración en gel (Viscotek).
Tras la irradiación, se modificaron las
moléculas de alginato con oligopéptidos sintéticos que contenían la
secuencia
(glicina)_{4}-arginina-glicina-ácido
aspártico-tirosina (GGGGRGDY, Commonwealth
Biotechnology Inc.) utilizando para ello reacciones de carbodiimida
acuosa [1]. De forma resumida, se prepararon soluciones de alginato
en un tampón de hidrato del ácido
2-[N-morfolino]etanosulfónico (MES, Sigma)
que fueron posteriormente mezcladas con
N-hidroxisulfosuccinimida
(sulfo-NHS, Pierce Chemical), y
1-etil-3-[3-(dimetilamino)propil]carbodiimida
(EDC, Sigma) y los oligopéptidos. Tras dejar proceder la reacción
durante 24 horas, las moléculas de alginato modificadas se
purificaron usando filtros (Fisher) para eliminar las moléculas más
pequeñas de 3,500 g/mol. Tras la filtración, esterilización
y liofilización, el alginato modificado se reconstituyó hasta la concentración deseada en el medio de cultivo celular.
y liofilización, el alginato modificado se reconstituyó hasta la concentración deseada en el medio de cultivo celular.
Se comprobó la viscosidad de ambos geles
binarios, la solución con alginato-RGD y la
solución con alginato sin modificar y se observó que ambos exhibían
unos valores similares de viscosidad (Figura 1a).
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Ejemplo
2
Para evaluar los efectos adhesivos y
biomiméticos de los alginatos-RGD, se seleccionaron
como células candidatas mioblastos C2C12 esqueléticos de ratón
modificados por ingeniería genética que secretan eritropoietina
(EPO) y se mezclaron con la solución de polímero binario. Se
observó que tanto la concentración de RGD como de la composición de
alginato podían controlar el fenotipo de los mioblastos. Estas
células son fácilmente manipulables y una vez encapsuladas e
implantadas en el hospedador, salen de forma irreversible del ciclo
celular y se fusionan en miofibrillas multinucleadas. Lo último es
esencial para controlar la dosis terapéutica y para evitar posibles
riesgos de bioseguridad. Se seleccionó EPO como fármaco modelo
debido a sus efectos terapéuticos emergentes y porque es fácil de
monitorizar su expresión y bioactividad in vivo siguiendo su
nivel hematocrito. Además, debido a su farmacocinética débil, se
espera que la tecnología de la encapsulación celular pueda evitar
la continua y repetida inyección de EPO que actualmente se
practica.
Se fabricaron microcápsulas tridimensionales con
soluciones de alginato-RGD y de alginato sin
modificar (Figura 1b). Para asegurar una biocompatibilidad óptima,
una funcionalidad a largo periodo de tiempo y una cinética de
liberación de EPO de orden cero, se produjeron microcápsulas
uniformes y de pequeño diámetro (450 \mum).
Para evaluar y comparar la integridad mecánica
de las microcápsulas de alginato-RGD y de alginato
sin modificar, se estudió el comportamiento de expansión y la
resistencia mecánica de las cápsulas frente a compresión. La
expansión de las microcápsulas de alginato-RGD
(1,12 \pm 0,01) fue significativamente menor que la de los
sistemas de alginato no modificado (1,16 \pm 0,01) (n=20,
P<0,05) (Figura 1c), mientras que la resistencia de las cápsulas
a la compresión fue significativamente mayor (49,6 \pm 6,7 vs.
39,1 \pm 4,7; n= 20, P < 0,01) (Figura 1d). Estos resultados
apoyan la idea de la interacción de mioblastos a los ligados de
adhesión lo que proporciona una integridad mecánica adicional a los
andamios actuando las células como agentes reticulantes.
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Ejemplo
3
Para caracterizar la viabilidad y funcionalidad
de los mioblastos en las matrices, se estudió in vitro la
actividad metabólica celular y la liberación de EPO durante un
periodo de tres semanas. Estos estudios a corto plazo no mostraron
mayores diferencias entre los dos tipos de microcápsulas en
viabilidad celular ni en liberación de EPO. Tras 21 días en
cultivo, la secreción de EPO de microcápsulas de
alginato-RGD cargadas con 100 células medida fue
71\pm9 IU de EPO/24 h, mientras que la producción en matrices de
alginato no modificado fue de 72\pm5 IU EPO/24 h. Estos resultados
sugieren que las células se adaptaron satisfactoriamente a los
nuevos microambientes. Sin embargo, con el fin de evaluar el
posible impacto de matrices bioactivadas con RGD en la
supervivencia y funcionalidad a largo tiempo de las células
encapsuladas, se implantaron 0,2 mL de ambos tipos de microcápsulas
(alginato-RGD, 5x10^{6} células/mL alginato) en
tejido subcutáneo de ratones inmunocompetentes Balb/c (n=5) sin
implementación de protocolos de inmunosupresión (Figura 2c). Los
resultados indican que el hematocrito de todos los animales
implantados (tanto con microcápsulas-RGD o sin RGD)
aumentó significativamente (P<0,01) comparado con los ratones
control, los cuales mostraron un nivel basal constante durante el
estudio. Los ratones en los que se implantaron los sistemas con
alginato-RGD aumentaron su nivel hematocrito hasta
el día 28 (88,2%) y después mantuvieron un nivel asintótico cercano
al 80% hasta el final del estudio. Los recipientes con
microcápsulas sin modificar mostraron un comportamiento similar
hasta el día 120. De ahí en adelante, se detectó un progresivo
descenso en el hematocrito de los animales. Más aún, en los últimos
100 días del estudio el nivel hematocrito de los recipientes con
matrices de alginato-RGD fue significativamente
mayor que los sistemas de alginato sin modificar (P<0,01) (Figura
2a). Estos resultados indican que las matrices bioactivadas con RGD
muestran una funcionalidad más sostenida, manteniendo el nivel
hematocrito próximo al 80% durante 10 meses tras la administración
de una sola dosis. Por el contrario, las partículas de alginato no
modificado con RGD fueron capaces únicamente de mantener el nivel
hematocrito durante 100 días (Orive, G. et al. 2005, Mol.
Therapy, 12:283-289).
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Ejemplo
4
Se explantaron las microcápsulas de todos los
receptores a los 330 días del comienzo del estudio. En el momento
de la explantación, tanto las cápsulas con RGD como sin RGD
aparecieron formando una estructura neovascularizada e irregular que
se encontraba totalmente adherida al tejido subcutáneo. Las
microcápsulas se separaron de manera sencilla de los agregados y
aún mantenían la forma esférica y la membrana semipermeable
definida (Figura 2d). Para determinar la funcionalidad de las
células incluidas en dichas microcápsulas, se midió la cantidad de
EPO liberada de ambos sistemas (Figura 2e). Los resultados
confirman que los sistemas con RGD liberaron más EPO que las
cápsulas sin alginato modificado (P<0,05).
Los análisis histológicos de las cápsulas
revelaron una reacción inflamatoria mínima basada en una fina capa
de fibroblastos rodeando ambos tipos de cápsulas (Figura 2f) a
pesar de que se emplearon alginatos purificados comerciales para los
experimentos. Se ha visto que el propio proceso de implante atrae y
activa a las células del sistema inmune y estimula la liberación de
citoquinas. Sin embargo, la mínima reacción inmune observada no
altera la funcionalidad de las cápsulas. Es interesante el hecho de
que EPO inhibe a algunas citoquinas
pro-inflamatorias incluyendo la
IL-6, TNF-alfa y
MCP-1, que ejerce efectos deletéreos y desencadena
fallos en el transplante.
Otra importante observación histológica fue la
presencia de un elevado número de capilares rodeando los agregados
de microcápsulas RGD (Figura 2f). La formación de una red capilar
alrededor de las cápsulas reduce la distancia entre las células y la
vasculatura al mínimo, asegurando un mejor aporte nutricional y de
oxígeno y así mejorando la funcionalidad a largo plazo de los
sistemas.
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Ejemplo
5
Se realizó un estudio de
dosis-respuesta para evaluar la potencial
versatilidad de las cápsulas RGD para la liberación controlada de
fármacos. Se fabricaron matrices RGD con diferentes densidades
celulares (5; 3,75; 2,5 y 1,25x10^{6} células/mL alginato) y por
tanto, con diferentes dosificaciones de EPO (Figura 3a). Los
estudios de actividad metabólica in vitro y de producción de
EPO claramente mostraron una relación
dosis-dependiente (Figura 3b, 3c). Para evaluar el
potencial terapéutico de la invención, se implantaron
subcutáneamente 0,2 mL de diferentes matrices RGD en ratones Balb/c.
Los resultados indican que el hematocrito de todos los receptores
implantados con las microcápsulas RGD, independientemente de la
dosis, eran significativamente mayores que en ratones control para
todos los periodos de tiempo (P<0,05). El nivel hematocrito de
todos los ratones transplantados con las microcápsulas RGD
alcanzaron un pico al. día 28 (Figura 3d) a partir de un valor
basal (46 \pm 7). A ese punto, el hematocrito fue de 87 \pm 3;
88 \pm 4; 86,4 \pm 1,5; 81 \pm 8% para las densidades
celulares de 5; 3,75; 2,5 y 1,25x10^{6}.
Sólo se observó un efecto
dosis-dependiente en los 14 días iniciales. A partir
del día 28 hasta el día 60, el valor hematocrito obtenido con todas
las formulaciones no fue significativamente diferente, indicando
que se obtiene efecto hematopoyético máximo con todas las
formulaciones. En el resto de los periodos de tiempo, los ratones
recibieron una dosis mayor mostrando unos valores hematocrito
significativamente superiores que los receptores que recibieron una
dosis menor (P<0,05). Desde ese día hasta el final del estudio,
el hematocrito de los ratones con la menor
dosis-respuesta disminuyó progresivamente mientras
que las otras 3 formulaciones mantuvieron su hematocrito. A pesar
de que para el tratamiento de la anemia seria recomendable una
menor dosis de EPO, para el tratamiento de esquizofrenia o para
neuroprotección se emplearían dosis más elevadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se explantaron todas las microcápsulas RGD 200
días tras la implantación. Las microcápsulas formaron de nuevo
agregados irregulares rodeados por redes vasculares (Figura 3e).
Interesantemente, la vascularización de los agregados parece ser
también dosis-dependiente, con una formación de
capilares menor o incluso sin formación alguna en el caso de las
cápsulas RGD con menor densidad celular (1,25x10^{6}).
Los resultados aquí mostrados indican que una
dosis mínima de EPO seria necesaria para estimular la formación
capilar alrededor de los agregados de cápsulas.
El análisis histológico de las matrices de RGD
mostraron una menor respuesta inflamatoria y una red capilar
alrededor de los agregados de cápsulas (Figura 3f). Las
microcápsulas presentes en los agregados permanecieron intactas con
una membrana semipermeable definida y uniforme. Tras el aislamiento
de las matrices de los agregados, se ha observado que todas las
células encapsuladas permanecieron viables y liberaban cantidades
detectables de EPO.
Claims (24)
1. Una partícula de 1 mm de diámetro como máximo
que comprende:
- a)
- un polímero X funcionalizado con, al menos, un péptido Y;
- b)
- al menos una célula que presenta en su superficie sitios de unión específicos para dicho péptido Y, en donde la célula se encuentra unida al polímero X mediante la interacción entre el péptido Y y los sitios de unión específicos para dicho péptido Y en la superficie de la célula.
2. Partícula según la reivindicación 1, donde
dicho polímero X es alginato.
3. Partícula según las reivindicaciones 1 ó 2,
donde el péptido Y es un péptido que contiene la secuencia RGD.
4. Microcápsula que comprende
- a)
- una partícula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y
- b)
- una membrana semipermeable que envuelve la partícula.
5. Microcápsula según la reivindicación 4 donde
dicha membrana es una membrana de polilisina.
6. Microcápsula según las reivindicaciones 4 o 5
que contiene, rodeando a la membrana en su exterior, una segunda
membrana de un material que inhibe la adhesión celular.
7. Microcápsula según la reivindicación 6 en la
que la segunda membrana es de alginato.
8. Partícula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 o microcápsula según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 7, donde las células son células genéticamente
modificadas.
9. Partícula o microcápsula según la
reivindicación 8, donde dichas células expresan un compuesto de
naturaleza peptídica con actividad biológica.
10. Partícula o microcápsula según la
reivindicación 9, donde dichas células expresan un compuesto de
naturaleza peptídica con actividad biológica bajo el control de un
promotor de expresión constitutiva o inducible.
11. Partícula o microcápsula según cualquiera de
las reivindicaciones 8 a 10, donde dicho compuesto es
eritropoietina (EPO).
12. Partícula o microcápsulas según cualquiera
de las reivindicaciones 8 a 11 para su uso en medicina.
13. Uso de una partícula o microcápsula según
cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 para la preparación de un
medicamento para el tratamiento y prevención de enfermedades en las
que se requiera una aportación del compuesto de naturaleza
peptídica con actividad biológica que es expresado por las células
que forman parte de las microcápsulas.
14. Uso según la reivindicación 13 en el que el
compuesto de naturaleza peptídica tiene una corta vida media de
eliminación.
15. Uso según la reivindicación 14 en el que el
compuesto de naturaleza peptídico de corta vida media en suero es
la eritropoietina y la enfermedad a tratar o prevenir es una
enfermedad seleccionada del grupo de anemia asociada al fallo renal
crónico, anemia relacionada con la terapia con AZT en pacientes de
SIDA, anemia en pacientes con enfermedades malignas de tipo no
mieloide que reciben quimioterapia, anemia asociada al cáncer,
anemia asociada con enfermedades inflamatorias crónicas, en
particular, la artritis reumatoide, anemia en pacientes que han
sufrido algún tratamiento quirúrgico para eliminar la necesidad de
transfusiones alogénicas, anemia falciforme, talasemia, anemia
asociada a fibrosis quística, desordenes menstruales, pérdidas
agudas de sangre, anemia resultante de la radioterapia o de una
captación reducida de oxígeno asociada a la altitud, esquizofrenia
y enfermedades neurodegenerativas.
16. Uso de una partícula o microcápsula según
cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 como dispositivo para la
liberación de un compuesto de naturaleza peptídica con actividad
biológica.
17. Uso según la reivindicación 16, donde dicho
compuesto es un compuesto que muestra una corta vida media de
eliminación.
18. Uso según la reivindicación 16 o 17, en la
que dicha liberación se produce de forma controlada bajo la
aplicación de un estímulo externo.
\newpage
19. Método para la elaboración de una partícula
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende las
etapas de:
- a)
- poner en contacto una sustancia polimérica que está modificada con un péptido Y con al menos una célula que presenta en su superficie sitios de unión específicos para dicho péptido Y; y
- b)
- aplicar condiciones que permitan la formación de partículas de material polimérico que tengan menos de 1 mm de diámetro.
20. Método según la reivindicación 19 en el que
la sustancia polimérica modificada con el péptido Y es un alginato y
las condiciones empleadas en la etapa (b) consisten en poner en
contacto la mezcla de polímero modificado y células con una solución
de cationes divalentes.
21. Método para preparar una microcápsula según
cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 que comprende las etapas
de:
- a)
- poner en contacto una sustancia polimérica que está modificada con un péptido Y con unas células que tienen la capacidad de unirse a dicho péptido Y;
- b)
- aplicar condiciones que permitan la formación de partículas de material polimérico que tengan menos de 1 mm de diámetro;
- c)
- recubrir la micropartícula formada en la etapa b) con una membrana de un material distinto al polímero usado en la etapa a).
22. Método según la reivindicación 21 en el que
la sustancia polimérica modificada con el péptido Y es un alginato
y las condiciones empleadas en la etapa b) consisten en poner en
contacto la mezcla de polímero modificado y células con una
solución de cationes divalentes.
23. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 21 ó 22 que comprende adicionalmente la etapa de
recubrir las microcápsulas con una capa adicional de material
distinto al que forma la membrana formada durante la etapa c).
24. Método según la reivindicación 23 en el que
la capa adicional contiene mayoritariamente alginatos.
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