KR20180035162A - 신규한 3d 바이오 프린팅용 바이오 잉크 및 이의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 3D 바이오 프린팅용 바이오 잉크 및 이의 이용에 관한 것으로, 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 천연 고분자를 혼합하여 가교 반응시키는 단계를 포함하는 바이오 잉크 조성물의 제조 방법; 상기 방법에 따라 제조된 바이오 잉크 조성물; 및 상기 바이오 잉크 조성물을 포함하는 조직 공학용 지지체를 제공한다.

Description

신규한 3D 바이오 프린팅용 바이오 잉크 및 이의 이용{Novel Bioink for 3D Bioprinting and Uses Thereof}

본 발명은 신규한 3D 바이오 프린팅용 바이오 잉크 및 이의 이용에 관한 것이다.

3D 바이오 프린팅은 살아있는 세포를 바이오 잉크와 함께 프린트하여, 인체에 이식 가능한 3 차원 인공 구조체 또는 지지체를 만드는 기술로써, 상기 바이오 프린팅 기술은 원하는 모양 및 구조를 제작할 수 있다는 장점을 통해 이식용 장기 부족 문제에 대한 효과적인 해결책으로 전망되고 있다. 이러한 바이오 잉크가 실제로 활용되기 위해서 반드시 가져야 하는 특징으로는 구조를 유지하기 위한 충분한 물성을 지녀야 할 뿐만 아니라 살아있는 세포가 죽지 않고 지속적으로 기능할 수 있어야 한다. 즉, 바이오 잉크는 지지체로서 자가복구기능을 통해 손실한 조직을 재생시키기 위하여 조직과 조직을 이어주는 역할을 하며, 이를 위하여 조직재생이 원활히 이루어지도록 세포친화성이 뛰어나야 한다. 또한, 세포가 3 차원 적으로 잘 자라며 영양분 및 배설물 등의 교환이 잘 이루어질 수 있도록 일정한 크기영역에서 3 차원적으로 잘 연결되어 있는 기공구조를 가지고, 조직의 재생속도에 맞추어 분해되어 없어지는 생분해성과 재생되는 동안 형태를 유지시켜줄 기계적 강도를 가져야하며, 생체안전성이 뛰어나야 한다. 특히, 뼈와 치아와 같은 경조직 재생에 있어서는 재생부위에 따른 기계적 물성확보가 중요하다.

구체적으로 조직 재생용 지지체는 첫째, 이식 부위에서 물리적으로 안정해야 하고, 둘째, 재생 효능을 조절할 수 있는 생리 활성을 나타내어야 하며, 셋째, 새로운 조직을 형성한 후에는 생체 내에서 분해되어야 하고 넷째, 분해산물이 독성을 갖지 않아야 한다.

종래의 지지체 제조법인 합성 고분자를 사용한 기술들은 세포-인식(cell-recognition)이 부족할 뿐만 아니라 소수성 표면(Hydrophobic Surface)을 가지고 있어 바이오 잉크로 활용되기에 상당한 어려움이 있다. 또한, 천연 고분자를 사용한 경우에는 너무 낮은 물성을 지녀 3차원 스캐폴드를 제작할 수 없다는 단점에 의해 바이오 잉크 개발이 지연되고 있다.

한편, 코아세르베이트는 음이온성 고분자 전해질과 양이온성 고분자 전해질이 특정 조건에서 혼합되었을 때 형성되는 콜로이드 물질의 일종으로, 코아세르베이트가 형성되었을 때 용액의 흡광도는 증가하게 되고, 용액 상에서 동그란 구 형태로 외부 용액과 분리되어 존재한다. 코아세르베이트 형성 시, 참여 전해질은 용액에서 분리되어 응축되고 여전히 액상을 띠게 되며, 이때 표면장력이 줄어들고 점성이 늘어나는 등, 물성도 변화한다. 코아세르베이트는 단백질과 그 반대 성질을 띠는 고분자 전해질과의 혼합을 통해서도 일어날 수 있다(C.G. deKruif 등, 2004, Current Opinion in Colloid and Interface　Science 9, 340-349). 코아세르베이트의 낮은 표면장력에 기인해 약물, 효소, 세포, 식품첨가물 등의 기능성 물질을 미세캡슐 안에 고정화 하는데 쓰이는 기술도 보고되어 있다. (Schmitt C. 등, 1998, Critical Review in Food Science and Nutrition 8, 689-753).

해양 생명체인 홍합(mussel)은 접착 단백질들(adhesive proteins)을 생산, 분비함으로써 홍합 자신을 바다 속의 바위와 같은 젖은 고체표면에 단단히 부착할 수 있어, 파도의 충격이나 바닷물의 부력 효과에 영향을 받지 않는다 (J.H. Waite 등, 1983, Biological Review 58, 209-231; H.J. Cha 등, 2008, Biotechnology Journal 3,631-638). 이러한 홍합 접착 단백질은 현재 알려진 화학 합성 접착제와 비교하였을 때 강력한 자연 접착제로 알려져 있으며, 대부분 에폭시 수지보다 약 두 배 정도의 높은 인장강도를 나타내면서도 휘어질 수 있는 유연성을 가지고 있다.　또한, 홍합 접착 단백질은 플라스틱, 유리, 금속, 테플론 및 생체물질 등의 다양한 표면에 접착할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 젖은 표면에 몇 분 안에 붙을 수 있다.　이러한 특성은 아직까지 화학접착제 분야에서는 미완의 과제로 남아있다. 또한, 접착 단백질은 인간세포를 공격하거나 면역반응을 일으키지 않는 것으로 알려져 수술시 생체조직의 접착이나 부러진 치아의 접착 등의 의료분야에 응용 가능성이 크다 (J. Dove 등, 1986, Journal of American Dental Association 112, 879). 특히, 상기 홍합 접착 단백질은 세포의 표면 접착 기술 분야에도 이용될 수 있는데, 세포의 표면 접착 기술은 세포 배양 및 조직 공학 분야에 필요한 매우 중요한 기술 중의 하나로, 즉 세포 및 조직 배양을 위해 세포를 세포배양 표면에 효율적으로 접착시키는 기술이므로 특정 세포의 증식 및 분화를 촉진시키는 데 매우 중요하다 (M. Tirrell 등, 2002, Surf. Sci., 500, 61-83).

따라서, 양이온성 단백질, 특히, 홍합 접착 단백질 기반의 코아세르베이트를 이용한 바이오 잉크는 지지체의 조건인 물리적 안정성, 생리활성 인자 조절, 생분해성 및 생체적합성을 만족하는 프린팅용 생채재료로서 바이오 프린팅에 응용함으로써 효율적으로 생체 조직을 치유할 수 있는 해결책이 될 수 있을 것이다.

출원번호 10-2010-0075717

이에, 본 발명자들은 생체용 소재를 제공하기에 적합한 신규한 3D 바이오 프린팅용 바이오 잉크를 개발하고자 예의노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 양이온성 단백질인 홍합 접착 단백질(MAP)과 천연 고분자에 추가적인 가교 기작을 처리하여 코아세르베이트 기반-바이오 잉크를 제작하였고, 이를 이용한 경우 합성 고분자의 활용 없이 뛰어난 물성을 나타내며 조직 공학적 치유력을 증대시키는 효과를 나타낸다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 일 목적은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 천연 고분자가 혼합되어 형성된 코아세르베이트(coacervate)를 가교화하는 단계를 포함하는 3D 바이오 프린터용 바이오 잉크 조성물의 제조 방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조된 3D 바이오 프린터용 바이오 잉크 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물을 포함하는 3D 바이오 프린터용 카트리지를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물을 포함하는 3D 생체 소재를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 3D 생체 소재를 포함하는 조직공학적 지지체를 제공하는 데 있다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

이 때, 여기서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 천연 고분자가 혼합되어 형성된 코아세르베이트(coacervate)를 가교화하는 단계를 포함하는 3D 바이오 프린터용 바이오 잉크 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서 홍합 접착 단백질은 홍합에서 유래된 접착 단백질로, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 국제특허공개 제WO2006/107183호 또는 제WO2005/092920호에 기재된 모든 홍합 접착 단백질을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체는, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 단백질; 또는 상기 군에서 선택된 1 종 이상의 아미노산 서열이 연결된 융합 단백질일 수 있으며, 보다 바람직하게는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있고, 가장 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질이다.

본 발명에서 홍합 접착 단백질의 변이체(mutants)는 바람직하게는 홍합 접착 단백질의 접착력을 유지하는 전제 하에 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실말단이나 아미노말단에 추가적인 서열을 포함하거나 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실말단 또는 아미노말단에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것이거나 홍합 접착 단백질을 이루는 타이로신 잔기 총수의 1 내지 100%, 바람직하게는 5 내지 100%가 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)로 치환된 것일 수 있다.

상기 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 RGD(Arg Gly Asp), RGDS(Arg Gly Asp Ser), RGDC(Arg Gly Asp Cys), RGDV(Arg Gly Asp Val), RGDSPASSKP(Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro), GRGDS(Gly Arg Gly Asp Ser), GRGDTP(Gly Arg Gly Asp Thr Pro), GRGDSP(Gly Arg Gly Asp Ser Pro), GRGDSPC(Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys) 및 YRGDS(Tyr Arg Gly Asp Ser)로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상일 수 있다.

상기 홍합 접착 단백질의 카르복실말단 또는 아미노말단에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 홍합 접착 단백질의 변이체는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다.

본 발명에서의 상기 홍합 접착 단백질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 외부 유전자를 발현할 수 있는 용도로 제작된 통상의 벡터에 발현 가능하도록 삽입하여, 유전공학적인 방법으로 대량 생산할 수 있다. 상기 벡터는 단백질을 생산하기 위한 숙주세포의 종류 및 특성에 따라 적절히 선택하거나, 신규로 제작할 수 있다. 상기 벡터를 숙주세포에 형질전환하는 방법 및 형질전환체로부터 재조합 단백질을 생산하는 방법은 통상의 방법으로 용이하게 실시할 수 있다. 상기한 벡터의 선택, 제작, 형질전환 및 재조합 단백질의 발현 등의 방법은, 본원발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시할 수 있으며, 통상의 방법에서 일부의 변형도 본원발명에 포함된다.

본 발명에서 천연 고분자는 상기 양이온성인 홍합 접착 단백질과 결합하여 코아세르베이트를 형성할 수 있는 천연 고분자 물질이라면 제한없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 상기 양이온성인 홍합 접착 단백질의 pI(Isoelectric point)보다 낮은 고분자, 더 바람직하게는 pI 수치가 2 내지 6인 고분자, 보다 더 바람직하게는 pI 수치가 2 내지 4인 고분자일 수 있다. 상기 pI 수치를 초과하거나 미만인 경우 코아세르베이트가 형성되기 어려우므로 상기 pI 범위내의 음이온성 고분자를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 바람직하게는 상기 천연 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid, HA), 키토산(Chitosan), 알긴산(alginate), 젤라틴(gelatin), 알부민(albumin), 캐러지넌(carrageenan), 헤모글로빈(hemoglobin) 및 헤파린(heparin)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 보다 바람직하게는 히알루론산(hyaluronic acid, HA), 키토산(Chitosan) 또는 알긴산(alginate)일 수 있고, 가장 바람직하게는 히알루론산일 수 있다.

상기 음이온성 고분자의 평균 분자량은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 1kDa 내지 300kDa으로 이루어진 군에서 선택된 분자량을 가질 수 있으며 보다 바람직하게는 10kDa 내지 100kD, 더 바람직하게는 17kDa 내지 59kDa, 가장 바람직하게는 17kDa, 35kDa 또는 59kD의 분자량을 가질 수 있다. 상기 분자량을 초과하거나 미만인 경우 코아세르베이트가 형성되지 않을 수 있기 때문이다.

본 발명의 3D 바이오 프린터용 바이오 잉크 조성물은 목적하는 효과를 달성할 수 있는 한 1 종 이상의 생체 활성물질을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 생체 활성물질은 생체에 투여되거나 피부 표면에 도포할 경우 일정한 약리 활성을 나타내는 물질로, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 약물, 효소, 세포 및 식품첨가물로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있으며, 보다 바람직하게는 항암제, 항생제, 항염증제, 호르몬, 호르몬 길항제, 인터루킨, 인터페론, 성장 인자, 종양 괴사 인자, 엔도톡신, 림포톡시, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 프로테아제 저해제, 알킬포스포콜린, 방사선 동위원소 표지 물질, 계면활성제, 심혈관계 약물, 위장관계 약물 및 신경계 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

또한, 본 발명에서 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 홍합 접착 단백질과 천연 고분자는 1:0.01 내지 100의 중량비로 혼합되어 형성될 수 있으며, 7:3 중량비로 혼합하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 3D 바이오 프린터용 바이오 잉크 조성물을 제조하기 위한 용매의 종류, 적정 pH, 적정 온도는 코아세르베이트가 효과적으로 형성될 수 있는 공지된 조건과 동일하다.

상기 가교화는 가교제를 첨가하여 상기 천연 고분자에 포함된 타이로신 잔기가 광반응을 통해 광가교결합될 수 있다.

즉, 본 발명의 목적은 홍합 접착 단백질과 천연 고분자의 가교젤 제형을 통해 세포를 포집하고, 그 생물학적 활성을 유지시킬 수 있는 바이오 잉크 조성물을 제조하는 것이다.

예컨대, 본 방법에 따른 바이오 잉크 조성물은 히알루론산에 티라민이 결합(conjugate)된 히알루론산 하이드로겔 시스템으로 제작하여 추가적인 가교 기작을 통해 물성을 높일 수 있다.

상기 가교제는 티라민, 하이드록시페닐아세트산, 하이드록시프로피온산, 도파민, 에피네프린 및 하이드록시에틸아닐린로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종을 이용할 수 있으며, 가교제가 광반응을 통해 광가교결합할 수 있도록 타이로신 잔기를 제공할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 바이오 잉크는 자외선을 사용하지 않고 추가적 가교 기작을 이용해 통상적인 교차결합을 시키므로 가교 시 발생하는 세포독성 문제를 해결할 수 있으며, 3D 바이오프린팅용 바이오 잉크로서 활용가능한 이식용 3차원 스캐폴드를 제작할 수 있다.

본 발명의 방법에 따른 바이오 잉크 조성물은 천연 고분자의 분자량 조절을 통해 가교젤의 물성을 조절할 수 있으며, 이를 통해 목적 장기, 목적 세포에 적합한 환경을 조성할 수 있다.

생체 고분자와 화학 작용기는 1: 400 내지 600의 몰 비로 혼합되는 것이 바람직한데, 상기 범위가 1: 400 미만이면 기계적 강도가 낮아지는 문제점을 가지며, 1: 600을 초과하는 경우에는 기계적 강도가 지나치게 높아져 지나친 가교도에 의해 각종 물질의 이동이 제한될 수 있어 바람직하지 않으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 고분자 농도는 1 내지 30wt%인 것이 바람직한데, 상기 범위를 벗어나는 경우에는 높은 점도에 의해 바이오 잉크로서 사용할 수 없는 가능성이 우려되어 바람직하지 않으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 바이오 잉크 조성물은 아세트산, 증류수, 또는 완충용액의 용매를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 완충용액은 2-(n-morpholino)ethanesulfonic acid, 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-tiazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride 및 Phosphate buffer saline 중에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하다.

또한, 본 바이오 잉크 조성물은 세포, 유착 방지용 물질, 염료 및 약물 중에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물을 포함하는 3D 바이오 프린터용 카트리지를 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물을 포함하는 3D 생체 소재를 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 3D 생체 소재를 포함하는 조직공학적 지지체를 제공한다.

또한, 본 발명에 따르면, 상기 3D 생체 소재를 포함하는 약물 전달체, 또는 유착방지제를 제공할 수 있다. 상기 약물은 일반적으로 사용되는 항생제, 항암제, 소염진통제, 항바이러스제, 항균제, 단백질 및 펩타이드 등을 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 바이오 잉크 조성물은 코아세르베이트와 추가적 가교 기작을 이용하여 장기 이식용 인공장기 제작을 위한 신규한 플랫폼으로써 조직공학적 지지체를 제공하며, 합성고분자 없이 생체고분자만을 활용하여 뛰어난 생체적합성을 지님과 동시에 뛰어난 물성을 보유할 수 있는 바이오 잉크 및 이를 이용한 삼차원 스캐폴드 인공 구조체를 제작하는 데 이용될 수 있다. 따라서, 이를 신체 결손이 있는 생체조직에 적용하여 조직을 재생시킬 수 있는 효과가 있을 것으로 예상된다.

도 1은 다양한 분자량에 따른 히알루론산과 티라민의 결합 확인 수율을 나타낸 것이다. 티라민의 경우 275 nm 에서 가장 큰 흡광도를 가지며, 그 농도와 흡광도는 서로 비례 관계에 있음을 활용하였다. 티라민의 농도에 따른 흡광도 표준 곡선을 작성한 뒤, 희석된 히알루론산의 흡광도를 측정하여 수율을 계산하였다.
도 2는 HA와 MAP의 배합 조건에 따른 coacervate 생성량을 측정하기 위해 혼탁도를 측정한 것이다. 실험은 PBS (phosphate-buffered saline, pH 7.8) 에서 진행하였다. MAP와 HA의 최적 농도 비율은 7:3 (wt:wt)로 확인되었다.
도 3a 내지 도 3c은 Alg-Tyr과 MAP 혼합물(도 3a), Gelatin과 MAP 혼합물(도 3b), HA-Tyr과 MAP(도 3c) 코아세르베이트 시료에 대한 가교 전후 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 광경화 이전의 각진동수(Angular frequency)에 따른 점성을 측정한 것이다.
도 5는 홍합 접착 단백질과 히알루론산과의 코아세르베이트의 추가적 가교 기작을 통해 제작된 하이드로겔의 가교 후의 G' 및 G''을 레오미터를 통해 측정한 저장 탄성률(Storage modulus) 및 손실 탄성률(Loss modulus) 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 당업계에 공지된 GelMA 계열과 본 발명의 하이드로겔-홍합 접착 단백질 기반 코아세르베이트의 압축 탄성률(Compressive modulus)를 비교한 것이다.
도 7은 본 발명의 하이드로겔-홍합 접착 단백질 기반 코아세르베이트를 이용하여 제작된 3차원 구조체를 보여준다.
도 8은 본 하이드로겔-홍합 접착 단백질 기반 코아세르베이트를 이용한 3 차원 구조체의 세포 독성 확인한 결과이다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1. 타이로신기가 결합(conjugate)된 천연고분자 물질의 제작

본 발명자들은 생체 적합한 3D 바이오 잉크의 물성을 증가시키기 위하여, 고분자 물질에 타이로신기가 결합(conjugate)된 천연고분자 물질을 제작하였다.

먼저, 자연에 존재하는 키토산(Chitosan), 알긴산(Alginate) 및 히알루론산(Hyaluronic Acid)에 청색광을 이용한 광가교성 성질을 부여하기 위해, 이들의 타이로신(tyrosine) 반응기에 티라민(Tyramine) 또는 히드로페닐 아세트산(Hydrophenylacetic acid)을 반응시켜 Chi-Tyr, Alg-Tyr, HA-Tyr를 제작하였다.

구체적으로, HA-Tyr의 경우, 0.2 wt% 농도로 DW에 HA를 용해시켰다. 이후 49.84 mM의 EDC, NHS를 첨가한 뒤 74.76 mM의 티라민(Tyramine)을 넣어준 후 pH를 5.5로 적정 후 밤새 반응시켰다. Alg-Tyr의 경우, 1.0 wt% 농도로 DW에 Alginate를 용해시켰다. 이후 이 용액에 5 mM의 EDC, NHS 및 티라민을 첨가한 뒤 pH를 5.5로 적정 후 밤새 반응시켰다. Chi-Tyr의 경우 1.0 wt%로 1.0 wt% Acetic acid 용액에 용해시켰다. 이후 5 mM 의 EDC, NHS 및 Hydrophenylacetic acid를 첨가한 뒤 pH를 5.5로 적정 후 밤새 반응시켰다. 이후 상기 3 개의 물질 모두 최소 2일 이상의 투석(Dialysis)을 통해 정제한 뒤, 동결 건조를 거쳐 이하 실시예에 활용하였다.

추가적으로 다양한 분자량(111, 500 및 1010 kDa)에 따른 히알루론산과 티라민의 결합 확인 수율을 확인하였다. 275 nm에서 가장 큰 흡광도를 가지는 티라민은, 그 농도와 흡광도가 서로 비례 관계에 있음을 활용하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 티라민의 농도에 따른 흡광도 표준 곡선을 작성한 뒤, 희석된 히알루론산의 흡광도를 측정하여 수율을 계산하였다.

실시예 2. 재조합 홍합접착 단백질(MAP)의 제작

2-1. 재조합 홍합접착 단백질 fp-151의 제작

본 발명에서 사용한 홍합 접착 단백질 fp-151(서열번호 1)은 자연에 존재하는 홍합 접착 단백질 fp-1 중에서 80번 정도 반복되는 10개의 아미노산으로 구성된 데카펩타이드(decapeptide)가 대장균에서 발현될 수 있도록 6개의 데카펩타이드로 이루어진 fp-1 변이체를 합성하고 2 개의 fp-1 변이체 사이에 Mgfp-5의 유전자(Genbank No. AAS00463 또는 AY521220)를 넣은 후, 대장균에서 생산한 것이다 (D.S. Hwang et. al., Biomaterials 28, 3560-3568, 2007).

구체적으로 fp-1 (Genbank No. Q27409 또는 S23760)의 아미노산 서열에서, AKPSYPPTYK로 이루어진 펩타이드가 6회 반복 연결된 fp-1 변이체(이하, 6xAKPSYPPTYK라 함)를 제조하고 Mgfp-5의 N-말단에 상기 6xAKPSYPPTYK을 조합하고 또한 Mgfp-5의 C-말단에 6xAKPSYPPTYK를 조합하여 서열번호 1의 fp-151을 제조하였다. 상기 홍합 접착 단백질의 구체적 제조는 국제특허공개 제WO2006/107183호 또는 제WO2005/092920호에 나타낸 바와 동일하며, 상기 특허 문헌은 전체로서 참고문헌으로 본 발명에 포함된다.

2-2. 재조합 홍합접착 단백질 fp-151-RGD의 제작

상기 실시예 1-1의 fp-151의 C-말단에 피브로넥틴(fibronectin) RGD 그룹에서 선택된 GRGDSP 서열을 추가하여 서열번호 2의 fp-151-RGD를 제조하였다.

2-3. 재조합 홍합 접착 단백질 fp-131의 제작

홍합 접착 단백질 fp-131은 상기 실시예 1-1의 fp-151과 마찬가지 방식으로 2개의 fp-1 변이체 사이에 자연에 존재하는 홍합 접착 단백질 Mgfp-3A의 유전자(Genbank No. BAB16314 또는 AB049579)를 넣은 후, 대장균에서 생산한 것이다.

구체적으로 fp-1 (Genbank No. Q27409 또는 S23760)의 아미노산 서열에서, AKPSYPPTYK로 이루어진 펩타이드가 6회 반복 연결된 fp-1 변이체(이하, 6xAKPSYPPTYK라 함)를 제조하고 Mgfp-3의 N-말단에 상기 6xAKPSYPPTYK을 조합하고 또한 Mgfp-3의 C-말단에 6xAKPSYPPTYK를 조합하여 서열번호 3의 fp-131을 제조하였다.

실시예 3. 본 하이드로겔-홍합 접착 단백질 기반 코아세르베이트(coacervate)의 제조 및 광가교 가능성 확인

본 발명자들은, 상기 실시예 1에서 제조된 티라민이 결합(conjugate)된 하이드로겔(Chi-Tyr, Alg-Tyr, HA-Tyr)에 재조합 홍합 접착 단백질(MAP) fp-151를 혼합하여 하이드로겔-홍합 접착 단백질 기반 코아세르베이트(coacervate)를 형성시키고, 이에 광가료처리하여 하이드로겔-홍합 접착 단백질 기반 코아세르베이트(coacervate)의 고형화 상태를 확인하고자 하였다.

코아세르베이트(coacervate)는 특정 pH 조건에서 특정 비율로 음이온성 전해질 고분자와 양이온성 전해질 고분자를 혼합함으로써 생성된 콜로이드의 일종이다. 상기 코아세르베이트가 형성되면 용액의 흡광도가 증가되기 때문에 코아세르베이트의 형성 여부를 확인하기 위해 주로 흡광도를 측정하게 된다(V. Ducel et. al., Colloids and Surfaces a-Physicochemical and Engineering Aspects, 232, 239-247, 2004).

먼저, Chi-Tyr, Alg-Tyr, HA-Tyr에 재조합 홍합 접착 단백질 fp-151을 혼합한 혼합 용액을 제조하여 흡광도를 측정하였다.

또한, 대조군으로서 젤라틴(Gelatin)과 재조합 홍합 접착 단백질 fp-151을 혼합한 혼합 용액을 이용하였다.

그 결과, HA-Tyr과 MAP의 혼합시 코아세르베이트가 형성됨을 확인하였다.

또한, HA와 MAP의 배합 조건에 따른 코아세르베이트 생성량을 측정하기 위해 혼탁도를 측정하였다. 실험은 PBS (phosphate-buffered saline, pH 7.8)에서 진행하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 홍합 접착 단백질과 HA-Tyr의 최적 농도 비율이 7:3 wt%일 때 가장 많은 양의 코아세르베이트가 형성됨을 확인하였다.

이후, 광가교 기능을 추가하기 위해 Sodium persulfate 및 1 mM의 농도가 되도록 Tris(bipyridine) ruthenium(II) chloride를 첨가하였다. 이후 452 nm의 청색광을 조사하여 하이드로겔 형성을 확인하였다.

도 3a내지 3c에, Alg-Tyr과 MAP 혼합물(3a), Gelatin과 MAP 혼합물(3b), HA-Tyr과 MAP(3c) 코아세르베이트 시료에 대한 가교 실험 확인 결과를 나타내었다.

그 결과, 빠른 시간 내에 고형화되어 그 형태가 변화하지 않음을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 본 하이드로겔-홍합 접착 단백질 기반 코아세르베이트 제형의 물리적 성질 확인

실시예 1에서 제작되었던 제형들 중 HA-Tyr을 이용하여 광가교 성질이 부여된 코아세르베이트의 물리적 성질들을 확인하였다.

먼저, 광경화 이전의 각진동수(Angular frequency)에 따른 점성을 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 물질 자체의 초기 점성(viscosity)은 상당히 높지만 전단응력(Shear stress)가 가해질수록 점도가 내려가는 전단 동화(Shear-thinning) 성질을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 저장 탄성률(Storage modulus) 및 손실 탄성률(Loss modulus)을 측정하였다. 홍합 접착 단백질과 히알루론산과의 코아세르베이트의 추가적 가교 기작을 통해 제작된 하이드로겔의 가교 후의 G' 및 G''을 레오미터를 통해 측정하였다. 상기 가교 반응은 photoredox catalyst인 rubpy (Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride) 조건 하에서 SPS(sodium persulfate)를 이용하여 가교하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 광가교 이전에는 손실 탄성률이 더 높은 액체 상태로 존재하며, 광가교 이후에는 저장 탄성률이 더 높은 겔(gel) 상태가 되었음을 확인할 수 있었다.

또한, 당업계에 공지된 GelMA 계열과 본 발명의 하이드로겔-홍합 접착 단백질 기반 코아세르베이트의 압축 탄성률(Compressive modulus)를 비교하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 하이드로겔-홍합 접착 단백질 기반 코아세르베이트의 물성이 단순 GelMA 물질들이 가지는 물성(15% GelMA ~ 30kPa) 보다 4배 이상 높을 뿐만 아니라, 특수한 처리를 한 GelMA보다 더 높은 수치를 가지는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 본 하이드로겔-홍합 접착 단백질 기반 코아세르베이트를 이용한 생체재료 잉크(Biomaterial ink) 및 3D 프린터를 통한 3차원 구조체 제작

본 발명의 하이드로겔-홍합 접착 단백질 기반 코아세르베이트를 이용한 3차원 구조체 제작 능력을 확인하였다. CELLINK社에서 판매하는 INKREDIBLE+ 기기를 이용하였다. 기기의 Nozzle을 통해 나오는 용액을 청색광을 이용해 가교하였으며, 한 layer가 완전히 쌓이고 나면 동일 형태로 다차례 출력을 반복하여 제작하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 일정한 패턴 양식을 반복한 구조체를 제작할 수 있음을 확인하였다.

실시예 6. 본 하이드로겔-홍합 접착 단백질 기반 코아세르베이트를 이용한 3 차원 구조체의 세포 독성 확인

HUVEC 세포에 삼출물을 처리한 뒤 생존율이 48 시간 경과 후에 어떻게 변화하는 지에 대하여 조사하여 상기 실시예 5에서 제작된 구조체의 세포 독성 여부를 실험하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 세포의 생존율이 98.9%로 세포 독성이 없음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 하이드로겔-홍합 접착 단백질 기반 코아세르베이트는 안전하고 생체적합한 3 차원 구조체를 제공할 수 있으며, 이는 조직공학용 복합 지지체로서 유용하게 사용될 수 있다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Novel Bioink for 3D Bioprinting and Uses Thereof <130> POSTECH1-31p-1 <150> 10-2016-0125014 <151> 2016-09-28 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-151 <400> 1 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu 50 55 60 Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser 65 70 75 80 Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys 85 90 95 Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly 100 105 110 Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr 115 120 125 Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 130 135 140 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Thr Tyr Lys 195 <210> 2 <211> 202 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-151-RGD <400> 2 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu 50 55 60 Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser 65 70 75 80 Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys 85 90 95 Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly 100 105 110 Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr 115 120 125 Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 130 135 140 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Thr Tyr Lys Gly Arg Gly Asp Ser Pro 195 200 <210> 3 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-131 <400> 3 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp Ala 50 55 60 Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly 65 70 75 80 Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn 85 90 95 Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Gly Ser Ala 100 105 110 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 115 120 125 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 130 135 140 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 145 150 155 160 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Leu 165 170

Claims (10)

1. 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 천연 고분자가 혼합되어 형성된 코아세르베이트(coacervate)를 가교화하는 단계를 포함하는 3D 바이오 프린터용 바이오 잉크 조성물의 제조 방법:
   
2. 제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체는, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 단백질; 또는 상기 군에서 선택된 1 종 이상의 아미노산 서열이 연결된 융합 단백질인 것을 특징으로 하는, 방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 천연 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid, HA), 키토산(Chitosan), 알긴산(alginate), 젤라틴(gelatin), 알부민(albumin), 캐러지넌(carrageenan), 헤모글로빈(hemoglobin) 및 헤파린(heparin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 가교화는 가교제를 첨가하여 상기 천연 고분자에 포함된 타이로신 잔기가 광반응을 통해 광가교결합되는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 가교제는 티라민, 하이드록시페닐아세트산, 하이드록시프로피온산, 도파민, 에피네프린 및 하이드록시에틸아닐린로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종인 것을 특징으로 하는, 방법.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 천연 고분자는 1:0.01 내지 100의 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 방법에 따라 제조된 3D 바이오 프린터용 바이오 잉크 조성물.
   
8. 제7항의 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물을 포함하는 3D 바이오 프린터용 카트리지.
   
9. 제7항의 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물을 포함하는 3D 생체 소재.
   
10. 제9항의 3D 생체 소재를 포함하는 조직공학적 지지체.

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