KR20180111450A - 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로입자 및 이의 제조방법 - Google Patents

홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로입자 및 이의 제조방법 Download PDF

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KR20180111450A
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Abstract

본 발명은 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로입자는 실린지를 통한 최소 침습형 생체 주입이 가능하여 세포전달체로서 조직 손상 부위에 치료용 줄기세포를 효율적으로 전달할 수 있다. 또한, 조직의 결함 부위의 크기에 알맞게 적용할 수 있는 조직공학용 지지체, 또는 약물 전달체 등으로 폭넓게 응용될 수 있다.

Description

홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로입자 및 이의 제조방법 {Porous microspheres comprising mussel adhesive protein and method for preparing the same}
본 발명은 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
줄기세포는 다양한 조직으로 발달할 수 있는 분화능을 지니고 있으며, 조직공학 및 재생의학 분야에서는 줄기세포를 이식하여 인체 조직이나 장기를 복구하고 질병을 치료하기 위한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 특히, 생체 조직부위에 줄기세포를 직접 주입(direct injection)하는 방식은 최소 침습적으로 적용이 가능하기 때문에 임상 분야에서 주목받고 있으나, 주입 과정에서 세포가 쉽게 손상되거나 사멸하는 등 낮은 세포 전달 효율의 한계점을 지닌다.
마이크로입자(microsphere, MS)는 1-1000 μm의 직경을 갖는 3차원 구조체로 높은 표면적-부피비를 지니고 있어 세포의 효율적인 탑재가 가능하기 때문에, 정형외과나 구강안면외과 등 여러 분야에서 최소 침습 방식으로 다양한 모양과 크기를 지니는 조직 결함 부위를 채울 수 있는 주사형 세포전달체로서 그 활용 가능성이 증대되고 있다. 한편, 마이크로입자는 약물을 탑재하여 원하는 부위에 약물을 전달하는 용도로도 사용이 가능하다. 이러한 마이크로입자는 생체에 도입해야 하기 때문에 생체적합성 및 생분해성이 요구되며, 적절한 수준의 기계적 물성을 기반으로 세포의 부착 및 성장이 용이해야 한다.
마이크로입자는 현재 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체(PLGA), 폴리하이드로에틸메타크릴레이트(Poly-HEMA), 폴리스티렌, 폴리아크릴아마이드(PAA) 등의 합성고분자를 기반으로 하는 것이 대부분이다. 이러한 합성고분자 기반의 마이크로입자는 분자구조와 분자량을 쉽게 조절할 수 있어서 기계적 물성과 생분해속도를 조절하기 용이하다는 장점을 지니고 있으나, 상대적으로 생체적합성이 낮고 세포와 직접적인 상호작용을 하기 위한 기능성이 부족하기 때문에, 궁극적으로 세포 생활성이 손실되거나 세포 분화능의 조절이 어렵다는 문제점이 있다. 반면, 콜라겐, 키토산 등의 천연고분자의 경우 세포외기질과 비슷한 성질을 가지며 우수한 생체적합성을 지니고 있어 생체 내 적용을 위한 대안으로 제기되고 있으나, 낮은 기계적 물성으로 인해 세포 전달 환경에서 유지력이 낮다는 한계점을 지닌다.
따라서, 이러한 문제점을 극복하기 위해서 적절한 수준의 기계적 물성을 기반으로 세포를 효율적으로 부착, 성장할 수 있는 환경을 제공하면서 생체 내에서의 부작용을 최소화할 수 있는 이상적인 생체재료 기반의 마이크로입자 개발이 필요하다.
한편, 해양 생명체인 홍합(mussel)은 접착 단백질(adhesive proteins)을 생산 및 분비함으로써 홍합 자신을 바다 속의 바위와 같은 젖은 고체표면에 단단히 부착할 수 있어, 파도의 충격이나 바닷물의 부력 효과에 영향을 받지 않는다. 홍합 접착 단백질은 강력한 자연 접착제로 알려져 있으며, 높은 생체적합성과 생분해성을 지니면서도, 화학 합성 접착제와 비교하였을 때 높은 인장강도와 유연성을 나타낸다. 또한, 홍합 접착 단백질은 플라스틱, 유리, 금속, 테플론 및 생체물질 등의 다양한 표면에 접착할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 아직까지 화학접착제 개발에서 미완의 과제로 남아 있는 젖은 표면에서의 접착도 몇 분 안에 가능하다.
특히, 홍합 접착 단백질 내에 존재하는 도파(3,4-디하이드록시페닐알라닌, DOPA) 잔기는 표면 접착에서 중요한 역할을 하며, 도파-퀴논(DOPA-quinone)으로 산화하면서 주변 도파 잔기 및 아미노산과 결합하여 가교작용을 일으키는 가교 중재자로서 홍합 족사의 뛰어난 기계적 특성을 가능케 하는 것으로 알려져있다.
그러나, 현재까지 홍합 접착 단백질이 포함하는 도파의 산화반응을 이용하여 마이크로입자를 만들거나 이를 세포전달체로 응용하려는 시도는 없었다.
본 발명자들은 이전의 연구에서, Mefp-1에서 80번 정도 반복되는 데카펩타이드를 6번 반복하여 Mgfp-5의 양쪽 말단에 융합한 새로운 형태의 홍합접착단백질인 fp-151을 개발하였으며, 상기 홍합접착단백질이 대장균에서 대량생산이 가능하고, 정제과정 또한 매우 단순하여 산업적 이용 가능성이 매우 높음을 확인한 바 있다(국제특허공개 WO2006/107183 또는 WO2005/092920).
이러한 대량생산 기술을 바탕으로, 본 발명자들은 대장균 시스템에서 대량생산한 홍합접착단백질의 타이로신 잔기를 높은 효율로 도파로 전환시키고, 간단한 미세 유체 공정(microfluidic device)를 이용하여 홍합 접착 단백질 기반의 다공성 마이크로입자를 제조하였으며, 이와 같이 제조된 다공성 마이크로입자가 세포 및 약물전달체로서 우수한 효능을 나타낸다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로입자 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로 입자형성용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 다공성 마이크로입자를 이용하는 세포전달체, 조직공학용 지지체 및 약물전달체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로 입자형성용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 다공성 마이크로입자를 포함하는 세포전달체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 다공성 마이크로입자를 포함하는 조직공학용 지지체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 다공성 마이크로입자를 포함하는 약물전달체를 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 미세유체채널 내부에서 홍합 접착 단백질, 산화제 및 기공유도물질(porogen)을 포함하는 유중수 에멀젼을 형성하는 단계; 2) 홍합 접착 단백질에 포함된 도파 잔기의 산화를 통해 상기 유중수 에멀젼을 가교시키는 단계; 및 3) 가교 후 얻어진 에멀젼 입자를 세척하고 기공을 형성시키는 단계를 포함하는, 다공성 마이크로입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로입자는 실린지를 통한 최소 침습형 생체 주입이 가능하여 세포전달체로서 조직 손상 부위에 치료용 줄기세포를 효율적으로 전달할 수 있다. 또한, 조직의 결함 부위의 크기에 알맞게 적용할 수 있는 조직공학용 지지체, 또는 약물 전달체 등으로 폭넓게 응용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 홍합 접착 단백질 기반의 다공성 마이크로입자를 포함하는 세포전달체의 제조방법에 관한 모식도이다.
도 2는 홍합 접착 단백질 fp-151의 타이로신 잔기에 대한 도파(DOPA) 잔기로의 전환율을 아미노산 분석기를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 플루오르에틸렌 프로필렌-폴리이미드(FEP-PI) 성분으로 구성된 미세유체채널에서 홍합 접착 단백질, 산화제 및 기공유도물질(porogen)을 포함하는 유중수 에멀젼(water-in-oil emulsion)을 형성하는 과정을 이미지로 나타낸 것이다.
도 4는 미세유체채널을 통해 형성한 에멀젼이 내부의 홍합 접착 단백질에 포함된 도파 잔기의 산화반응을 통해 가교되면서 응축하는 모습을 시간에 따라 이미지로 나타낸 것이다 (a: 에멀젼 형성 직후, b: 에멀젼 형성 후 12시간 경과, c: 에멀젼 형성 후 24시간 경과).
도 5는 도 4의 에멀젼 응축 과정에서 각 에멀젼 입자의 크기를 도식화한 그래프이다.
도 6은 에멀젼의 24시간 응축 과정을 거친 후 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 응축 과정을 통해 가교된 에멀젼을 에탄올, 아세톤 및 에탄올-염산 혼합액을 순차적으로 이용하여 세척하고, 그 과정에서 팽윤 및 기공이 형성되어 다공성 마이크로입자가 형성되는 과정을 관찰한 결과를 나타낸 것이다(a, b: 형광현미경으로 각각 FITC가 결합된 마이크로입자, 로다민이 결합된 마이크로입자를 관찰, c: SEM으로 다공성 마이크로입자의 구조를 관찰).
도 8은 다공성 마이크로입자 표면의 FT-IR 분석을 통해 도파가 산화제에 의해 도파-퀴논(1240 cm- 1)으로 변화되었음을 확인한 결과를 나타낸 것이다(MAP-PMS: 다공성 마이크로입자를 형성한 fp-151, MAP+ NaIO4: NaIO4를 처리한 fp-151, MAP: 수정된 fp-151).
도 9는 다공성 마이크로입자 표면의 전하를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 다공성 마이크로입자의 절단면의 기공 분포를 SEM을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 다공성 마이크로입자의 절단면의 기공 분포를 마이크로-컴퓨터 단층촬영(micro-computed tomography, micro-CT)을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 다공성 마이크로입자의 적용을 위해 실린지에 도입한 것을 이미지로 나타낸 것이다 (a: 다공성 마이크로입자 분말, b: PBS 용액에 혼합한 다공성 마이크로입자, c: 21-게이지 실린지에 도입된 다공성 마이크로입자).
도 13은 실린지를 통해 방출되는 다공성 마이크로입자의 모습을 시간 순서대로 촬영한 것이다.
도 14는 다공성 마이크로입자를 조직 결함 부위를 채우기 위한 지지체로 사용하기 위해 주형을 이용하여 실린더 형태로 제작한 구조체를 나타낸 것이다.
도 15는 동물조직의 피부 표면에서 대조군(알지네이트 마이크로입자, Alginate MS)에 비해 본 발명의 다공성 마이크로입자(MAP-PMS)의 뛰어난 접착성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 다공성 마이크로입자의 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, rMSC), 치주인대유래줄기세포(periodontal ligament stem cell, hPLDC) 및 혈관내피세포(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)에 대한 세포 부착 효율(cell loading efficiency)을 나타낸 것이다.
도 17은 다공성 마이크로입자의 배양 날짜에 따른 각 세포에 대한 성장 양상을 도식화한 그래프이다.
도 18은 다공성 마이크로입자에서 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)에 대한 부착 및 성장을 관찰한 결과를 나타낸 것이다(a: 세포 부착으로부터 1일 경과 후 메틸렌블루 염색 결과, b: 세포 부착으로부터 1일 경과 후 마이크로입자의 SEM 관찰 결과, c-f: 세포 부착 직후부터 0, 1, 4, 7일 경과 후 형광 염색 결과).
도 19는 최소 침습 주입을 통한 마이크로입자의 성공적인 생체 주입을 확인한 결과를 나타낸 것이다(a: 주입 당일의 마우스 관찰 결과, b: 주입으로부터 28일 경과 후 마우스 관찰 결과, c, d: 주입 당일 및 28일 경과 후 형광 분석 결과).
도 20은 본 발명에 따른 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로입자의 실린지를 통한 최소 침습형 생체 주입에 관한 모식도를 나타낸 것이다.
본 발명은 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로입자를 제공한다.
본 발명에 있어서, “마이크로입자(microsphere)”란 1-1000μm의 직경을 갖는 3차원 구조체를 의미한다. 상기 마이크로입자의 직경은 바람직하게는 1-500μm일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1-250μm일 수 있다. 상기 마이크로입자는 배지 내에 존재하는 주변의 세포를 표면에 부착시킴으로써 2차원 내지 3차원 세포배양에 사용될 수 있다.
본 발명의 “다공성 마이크로입자”는 균일한 기공을 갖는 다공성 입자이며, 홍합 접착 단백질을 포함하여 생체 적합성 및 부착능이 우수한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, “홍합 접착 단백질”은 홍합에서 유래한 접착 단백질로, 바람직하게는 미틸러스 에둘리스(Mytilus edulis), 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(Mytilus galloprovincialis) 또는 미틸러스 코루스커스(Mytilus coruscus)에서 유래한 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 본 발명의 홍합 접착 단백질은 상기 홍합 종에서 각각 유래한 Mefp(Mytilus edulis foot protein)-1, Mefp-2, Mefp-3, Mefp-4, Mefp-5, Mgfp(Mytilus galloprovincialis foot protein)-1, Mgfp-2, Mgfp-3, Mgfp-4 및 Mgfp-5, Mcfp(Mytilus coruscus foot protein)-1, Mcfp-2, Mcfp-3, Mcfp-4, 및Mcfp-5 또는 이의 변이체를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 fp(foot protein)-1 (서열번호 1), fp-2 (서열번호 5), fp-3 (서열번호 6), fp-4 (서열번호 7), fp-5 (서열번호 8), 및 fp-6 (서열번호 9)로 이루어진 군에서 선택된 단백질, 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 단백질이 연결되어 있는 융합 단백질, 또는 상기 단백질의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 홍합 접착 단백질은 WO2006/107183호 또는 WO2005/092920에 기재된 모든 홍합 접착 단백질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 홍합 접착 단백질은 fp-151 (서열번호 10), fp-131 (서열번호 12), fp-353 (서열번호 13), fp-153 (서열번호 14), fp-351 (서열번호 15) 등의 융합 단백질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 홍합 접착 단백질은 fp-1 (서열번호 1)에서 80번 정도 반복되는 데카펩타이드 (서열번호 2)가 1 내지 12회 또는 그 이상으로 연결된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열번호 2의 데카펩타이드가 12회 연속하여 연결된 fp-1 variant 폴리펩타이드(서열번호 3)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 홍합 접착 단백질은 접착력을 유지하는 전제 하에 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단이나 아미노 말단에 추가적인 서열을 포함하거나 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단 또는 아미노 말단에 RGD (Arg Gly Asp)를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산은, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 RGD (Arg Gly Asp, 서열번호 16), RGDS (Arg Gly Asp Ser, 서열번호 17), RGDC (Arg Gly Asp Cys, 서열번호 18), RGDV (Arg Gly Asp Val, 서열번호 19), RGDSPASSKP (Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro, 서열번호 20), GRGDS (Gly Arg Gly Asp Ser, 서열번호 21), GRGDTP (Gly Arg Gly Asp Thr Pro, 서열번호 22), GRGDSP (Gly Arg Gly Asp Ser Pro, 서열번호 23), GRGDSPC (Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys, 서열번호 24) 및 YRGDS (Tyr Arg Gly Asp Ser, 서열번호 25)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단 또는 아미노 말단에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 홍합 접착 단백질의 변이체는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 fp-1 variant-RGD 폴리펩타이드 또는 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 fp-151-RGD 폴리펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 홍합 접착 단백질은 전체 타이로신 잔기의 10 ~ 100%가 도파로 변형된 것일 수 있다. 대부분의 홍합 접착 단백질의 전체 아미노산 서열에서 타이로신이 차지하는 비중은 약 20-30% 이다. 천연 홍합 접착 단백질 내의 타이로신은 수화 과정을 통하여 -OH기가 첨가되어 도파의 형태로 변환된다. 그러나, 대장균에서 생산된 홍합접착단백질은 타이로신 잔기들이 변환되어 있지 않으므로, 별도의 효소 및 화학적 처리 방법에 의하여 타이로신 잔기를 도파로 변환시키는 수정 반응을 수행하는 것이 바람직하다. 홍합 접착 단백질에 포함된 타이로신 잔기를 도파로 수정하는 방법은 당업계에 알려진 방법을 사용할 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, 타이로시나아제를 사용하여 타이로신 잔기를 도파 잔기로 수정할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 버섯 타이로시나아제를 이용한 in vitro 효소 반응을 통해 상기의 도파 전환율을 만족시키는 홍합 접착 단백질을 생산하였다.
본 발명에 있어서, 상기 다공성 마이크로입자는 유중수 에멀젼(water-in-oil emulsion)으로부터 형성될 수 있으며, 상기 유중수 에멀젼은 홍합 접착 단백질에 포함된 도파 잔기의 산화반응에 의한 가교화를 통해 응축될 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 다공성 마이크로입자는 생체적합성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 다공성 마이크로입자는 생리활성물질을 적재(loading) 또는 부착(attachment)하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 마이크로입자에는 인체의 세포나 조직과 상호작용을 통하여 세포의 성장과 분화를 촉진시키고 아울러 조직의 재생과 회복을 도와주는 작용에 관여하는 각종 생리활성물질들이 쉽게 적재되거나 부착될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “생리활성물질”은 각종 생체분자들을 총칭하며 세포, 단백질, 핵산, 당, 효소 등을 포함한다. 상기 생리활성물질은 세포, 단백질, 폴리펩타이드, 다당류, 단당류, 올리고당류, 지방산, 핵산일 수 있고, 바람직하게는 세포일 수 있다. 상기 “세포”는 원핵세포 및 진핵세포를 포함한 모든 세포일 수 있고, 일 예로 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell), 지방질줄기세포(adipose stem cell), 조골세포(osteoblast), 치주인대세포(periodontal ligament cell), 혈관내피세포(vascular endothelial cell), 섬유세포(fibroblast), 간세포(hepatocyte), 신경세포(neurons), 암세포(cancer cell), B cell, 백혈구세포(white blood cell) 등을 포함한 면역세포 및 배아세포 등일 수 있다. 이 외에도, 생리활성물질은 핵산 물질로서 플라스미드 핵산, 당 물질로서 히아루론산, 헤파린 황산염, 콘드로이틴 황산염, 알진염, 단백질 물질로서 호르몬 단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로 입자 형성용 조성물을 제공한다.
상기 다공성 마이크로 입자 형성용 조성물은 산화제 및 기공유도물질(porogen)을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “산화제”는 NaIO4 , NaIO3, VOSO4, Na3VO4, Na2Cr2O7, Mn(OAc)3, MnO2, KMnO4, Na2S2O8, H2O2, Na2S2O4, BHP(tert-butyl hydroperoxide) 및 DTT(dithiothreitol) 등일 수 있고, 바람직하게는, NaIO4를 사용하여 도파 잔기를 산화시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “기공유도물질”은 중탄산암모늄(ammonium bicarbonate), 중탄산나트륨(sodium biocarbonate), 탄산칼슘(calcium carbonate) 등 기체를 형성하는 탄산염일 수 있고, 바람직하게는 중탄산암모늄일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명의 다공성 마이크로입자를 포함하는 세포전달체를 제공한다.
본 발명의 세포전달체는 실린지를 통한 최소 침습 방식으로 주입하여 생체조직의 재생 및 회복에 이용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 “생체조직”은 특별하게 제한되지 않으며, 예를 들어 피부, 뼈, 인대, 신경, 혈관, 근육, 안구, 뇌, 폐, 간, 심장, 방광, 신장, 위, 소장, 및 직장 등을 포함한다.
따라서, 본 발명의 다공성 마이크로입자는 조직 재생 및 회복이 필요한 부위에 실린지를 통해 최소 침습 방식으로 적용되어 세포를 전달하는 동시에, 조직의 결함부위를 채우거나, 약물을 전달할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로입자의 세포전달체로의 가능성을 확인하였으며, 보다 구체적으로는 상기 다공성 마이크로입자에, 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell), 치주인대유래줄기세포(periodontal ligament stem cell) 및 혈관내피세포(human umbilical vein endothelial cell)가 포함된 배지를 각각 섞어 부착시키고, 배지 상에서 6시간 동안 배양한 후 세포 부착을 측정하였을 때, 우수한 세포 부착 효율(cell loading efficiency)를 나타냄을 확인하였다.
또한, 본 발명은 본 발명의 다공성 마이크로 입자를 포함하는 조직공학용 지지체를 제공한다.
조직공학 기술이란 환자의 조직으로부터 분리된 세포를 지지체(scaffold) 위에 배양하여 또는 지지체가 되는 구성물과 함께 지지체를 형성하여 세포를 포함한 지지 복합체를 제조한 후 다시 이를 인체 내에 이식하는 것을 말한다. 조직공학 기술은 인공피부, 인공연골, 인공뼈, 인공혈관, 인공근육 등 인체의 거의 모든 장기의 재생에 적용될 수 있으며, 세포에 무해하고 실제 생체조직과 비슷한 물성을 갖는 지지체를 형성하는 것이 중요하다. 본 발명의 다공성 마이크로입자는 원하는 부피와 모양으로 적용이 가능하여 불규칙한 구조를 갖는 조직의 결함을 효과적으로 채울 수 있을 뿐만 아니라, 조직공학 기술에서 생체조직 및 장기의 재생을 최적화하기 위하여 생체조직과 유사한 지지체를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 지지체를 이용하여 간편하게 인공 세포외 기질을 구현할 수 있으며, 화장품, 상처 피복재, 치과용 매트릭스 등의 의료용 소재로도 활용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 다공성 마이크로 입자를 포함하는 약물전달체를제공한다. 본 발명에 따른 다공성 마이크로입자는 약물 전달용 유효 골격(scaffold)으로서의 인공세포외 매트릭스로 사용될 수 있다. 상기 약물은 특별하게 제한되지 않으며, 화학물질, 소분자, 펩타이드 또는 단백질 의약품, 핵산, 바이러스, 항균제, 항암제, 또는 항염증제 등을 포함할 수 있다.
상기 “소분자”는 조영제(예컨대, T1 조영제, 초상자성 물질과 같은 T2 조영제, 방사성 동위 원소 등), 형광 마커, 염색 물질 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 “펩타이드 또는 단백질 의약품”은 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄 항체, 결합단백질 또는 그 결합 도메인, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액 응고 인자 및 백신 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로는 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor;FGF), 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 전환 성장인자(transforming growth factor; TGF), 골형성 성장인자(bone morphogenetic protein; BMP), 인간성장호르몬(hGH), 돼지성장호르몬(pGH), 백혈구 성장인자(G-CSF), 적혈구성장인자(EPO), 대식세포성장인자(M-CSF), 종양 괴사 인자(TNF), 상피세포 성장인자(EGF), 혈소판유도성장인자(PDGF), 인터페론류, 인터루킨류, 칼시토닌, 신경성장인자(NGF), 성장호르몬 방출인자, 엔지오텐신, 황체형성호르몬 방출 호르몬(LHRH), 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 작동약(LHRH agonist), 인슐린, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬(TRH), 엔지오스타틴, 엔도스타틴, 소마토스타틴, 글루카곤, 엔도르핀, 바시트라신, 머게인, 콜리스틴, 단일 항체, 백신류 또는 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 “핵산”은 RNA, DNA 또는 cDNA일 수 있으며, 핵산의 시퀀스는 암호화 부위 서열 또는 비암호화 부위 서열(예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)이 될 수 있다.
상기 “바이러스”는 바이러스 전체 또는 바이러스의 핵산을 포함하는 바이러스 코어(즉, 바이러스의 엔빌로프 없이 패키지된 바이러스의 핵산)가 될 수 있다. 운반될 수 있는 바이러스 및 바이러스 코어의 예로는 파필로마 바이러스, 아데노 바이러스, 배큘로바이러스, 레트로 바이러스 코어 및 세밀키 바이러스 코어 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 “항균제”는 페니실린, 메티실린, 옥사실린, 나프실린, 암피실린, 카르복시페니실린, 아목시실린, 피파레실린 등의 페니실린계(penicillins); 세팔로스포린, 세파졸린, 세프타지딤, 세포페라존, 세포탁심, 세프티족심, 세프트리악손, 세프타지딤 등의 세팔로스포린계(Cephalosporins); 카바페넴, 메로페넴, 설박탐, 클라불라네이트, 타조박탐 등의 기타 베타락탐계(β-lactams); 스트렙토마이신, 네오마이신, 겐타마이신, 토브라마이신, 아미카신, 시소마이신, 아스트로마이신, 이세파마이신, 아베카신 등의 아미노글리코사이드계(aminoglycosides); 에리트로마이신, 클래리트로마이신 등의 마크로라이드계(macrolides); 테트라싸이클린, 메타싸이클린, 미노싸이클린, 티게싸이클린, 독시싸이클린 등의 테트라싸이클린계(tetracyclines); 반코마이신, 타이코플라닌 등의 글리코펩타이드계(glycopeptides); 린코마이신, 클린다마이신 등의 린코마이신계(lincosamides); 날리딕스산, 옥소리산, 플로로퀴놀론, 싸이프로플록사신, 노르플록사신, 레보플록사신 등의 퀴놀론계(quinolones); 리파마이신, 클로람페니콜, 폴리마이신, 트리메트로프림, 스트렙토그라민, 옥사졸리디논, 박시트라신 및 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 “항암제”는 파클리탁셀, 텍소티어, 아드리아마이신, 엔도스타틴, 앤지오스타틴, 미토마이신, 블레오마이신, 시스플레틴, 카보플레틴, 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 5-플로로우라실, 메토트렉세이트, 엑티노마이신-D 및 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 “항염증제”는 아세트아미노펜, 아스피린, 이부프로펜, 디크로페낙, 인도메타신, 피록시캄, 페노프로펜, 플루비프로펜, 케토프로펜, 나프록센, 수프로펜, 록소프로펜, 시녹시캄, 테녹시캄 및 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 1) 미세유체채널 내부에서 홍합 접착 단백질, 산화제 및 기공유도물질(porogen)을 포함하는 유중수 에멀젼을 형성하는 단계; 2) 홍합 접착 단백질에 포함된 도파 잔기의 산화를 통해 상기 유중수 에멀젼을 가교시키는 단계; 및 3) 가교 후 얻어진 에멀젼 입자를 세척하고 기공을 형성시키는 단계를 포함하는, 다공성 마이크로입자의 제조방법을 제공한다.
상기 1) 단계는 미세유체채널 내부에 계면활성제가 용해된 오일상과 도파를 포함하는 홍합 접착 단백질, 산화제 및 기공유도물질이 용해된 수상을 실린지 펌프를 이용하여 일정한 속도로 도입하여, 균일한 크기의 유중수 에멀젼을 연속적으로 형성하는 단계이다. 이때, 상기 홍합 접착 단백질, 산화제 및 기공유도물질을 다양한 농도로 혼합하여 에멀젼을 형성할 수 있다.
상기 오일상은 식물성, 광물성, 실리콘유 및 합성유로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는, 플루오리네이트 오일(fluorinated oil)일 수 있다.
상기 계면활성제는 일반적으로 유중수 에멀젼을 안정화시킬 수 있는 계면활성제로 fluorosurfactant, Tween®-20, Tween®-80, Pluronic® F108, Span-80, sodium dodecyl surfate(SDS), sodium lauryl surfate(SLS) 등으로 이루어진 군에서 1종 이상 선택하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는, fluorosurfactant일 수 있다.
상기 1) 단계에 있어서, 에멀젼을 형성하기 위한 미세유체채널은 플루오로에틸렌 프로필렌-폴리이미드(fluoroethylene propylene-polyimide, FEP-PI)의 소수성 표면으로 구성된 Ψ-형태의 마이크로채널이 바람직하나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 1) 단계에 있어서, 산화제는 홍합접착단백질에 포함된 도파를 산화시키기 위한 산화제로서 NaIO4를 이용하는 것이 바람직하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 홍합접착단백질이 10-20 wt%로 용해되어 있는 용액에 도파:IO4 - 분자의 비율이 2:1 내지 4:1이 되도록 NaIO4 용액을 첨가시켜서 수상에 도입할 수 있고, 더욱 바람직하게는 도파:IO4 - 분자의 비율이 2:1 이 되도록 NaIO4 용액을 첨가시킬 수 있다.
상기 1) 단계에 있어서, 기공유도물질은 중탄산암모늄(ammonium bicarbonate), 중탄산나트륨(sodium biocarbonate), 탄산칼슘(calcium carbonate) 등 기체를 형성하는 탄산염일 수 있고, 바람직하게는 상기 홍합접착단백질이 10-20 wt%로 용해되어 있는 용액에 2-5 wt%의 중탄산암모늄 용액을 첨가시켜서 수상에 도입할 수 있다.
상기 2) 단계는 상기 1) 단계에서 얻어진 에멀젼 내부의 홍합접착단백질에 포함된 도파 잔기를 산화반응을 통해 가교시키는 단계이다. 도파가 산화가 일어날 경우 도파-퀴논의 형태로 바뀌면서 도파-도파 결합을 유도하거나, 도파-퀴논이 주변의 아민(amine) 그룹 혹은 싸이올(thiol) 그룹과 결합하게 된다.
상기 3) 단계는, 상기 2) 단계의 가교된 에멀젼 입자를 세척하는 과정에서, 에멀젼 입자를 덮고 있던 오일 및 계면활성제가 제거되면서 마이크로입자를 구성하는 단백질 분자의 격자 내에 수분이 채워져 팽윤되고, 동시에 기공유도물질에 의한 기체 발생으로 기공이 생성되어 다공성 마이크로입자를 형성하는 단계이다.
상기 3) 단계에 있어서, 에멀젼 입자를 세척하기 위해 에탄올, 메탄올, 아이소프로필알콜, 아세톤, 염산, 수산화나트륨으로 구성된 군으로부터 1종 이상 선택하여 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.
상기 다공성 마이크로입자에 있어서, 생성되는 기공의 지름은 10 내지 50μm일 수 있고, 바람직하게는 20 내지 40μm일 수 있고, 더욱 바람직하게는 20 내지 30μm일 수 있다. 또한, 이러한 다공성 마이크로입자의 공극률은 50 내지 95%일 수 있고, 바람직하게는 70 내지 95%일 수 있고, 더욱 바람직하게는 90 내지 95%일 수 있다.
상기 제조방법으로 제조된 본 발명의 다공성 마이크로입자는 기공 구조를 가지고 있어 세포를 기공 내부에 부착시킴으로써 더 많은 세포를 전달할 수 있으며, 분리된 기공 내부 미세 환경을 통해 외부환경으로부터 세포를 효과적으로 보호하고, 효과적인 유체 순환 및 산소, 영양소 공급이 가능하기 때문에 세포전달체, 조직공학용 지지체, 약물전달체 등의 다양한 생의학적 응용이 가능하다.
실시예 1. 홍합 접착 단백질 기반의 다공성 마이크로입자 제조
홍합 접착 단백질 기반의 다공성 마이크로입자를 제조하기 위하여 하기와 같은 실험을 순차적으로 수행하였다. 본원 발명의 다공성 마이크로입자를 제조하기 위한 전체적인 실험의 개요를 도 1에 나타내었다.
1-1. 홍합 접착 단백질 fp -151의 생산
자연에 존재하는 홍합 접착 단백질 fp-1 중에서 80번 정도 반복되는 10개의 아미노산으로 구성된 데카펩타이드(decapeptide)가 대장균에서 발현될 수 있도록 6개의 데카펩타이드로 이루어진 fp-1 변이체를 합성하고, 2개의 fp-1 변이체 사이에 Mgfp-5의 유전자(Genbank No. AAS00463 또는 AY521220)를 넣은 후, 대장균에서 성공적으로 발현하도록 하였다. 이 후 아세트산을 이용한 정제 분리과정을 통해 홍합 접착 단백질 fp-151을 생산하였다 (D.S. Hwang et. al., Biomaterials 28, 3560-3568, 2007).
구체적으로 fp-1 (Genbank No. Q27409 또는 S23760)의 아미노산 서열에서, 서열번호 2로 표시되는 AKPSYPPTYK로 이루어진 펩타이드가 6회 반복 연결된 서열번호 3의 fp-1 변이체(이하, 6xAKPSYPPTYK라 함)를 제조하고 fp-5의 N-말단에 상기 6xAKPSYPPTYK을 조합하고 또한 fp-5의 C-말단에 6xAKPSYPPTYK를 조합하여 홍합 접착 단백질 fp-151을 제조하였다. 이는 대장균에서 성공적으로 발현하여 아세트산을 이용한 정제 분리과정을 통해 생산한 것이다. 상기 홍합 접착 단백질의 구체적 제조는 국제특허공개 제WO2006/107183호 또는 제WO2005/092920호에 나타낸 바와 동일하며, 상기 특허 문헌은 전체로서 참고문헌으로 본 발명에 포함된다. 제조된 fp-151을 서열번호 10에 나타내었다.
1-2. 도파 ( DOPA ) 수정반응
상기와 같이 제조된 홍합 접착 단백질 fp-151을 구성하는 타이로신 잔기를 도파로 전환시키기 위하여 타이로시나아제 효소(mushroom tyrosinase)를 이용하여 in vitro에서 수정 반응을 진행하였다. 구체적으로, 동결 건조된 홍합 접착 단백질 fp-151 150mg과 티로시나아제 5mg을 수정반응을 위한 버퍼 용액 (0.1M sodium phosphate, 20mM boric acid, 25mM ascorbic acid, pH 6.8) 100ml에 녹여서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 25% 아세트산 용액 3L를 이용하여 4시간 이상씩 3번 갈아주면서 투석을 시킨 후, 동결건조를 진행하였다. 홍합 접착 단백질 fp-151의 수정 효율을 분석하기 위하여 아미노산 조성 분석을 수행하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 도파 및 타이로신 잔기의 peak intensity를 통해 전체 타이로신 잔기 중 약 49.6%가 도파로 전환되었음을 확인하였다.
1-3. 미세유체채널에서 유중수 에멀전 (water-in-oil emulsion) 형성
상기 실시예 1-1을 통해 생산된 홍합 접착 단백질 fp-151를 이용하여 마이크로입자를 제조하기 위하여, 플루오르에틸렌 프로필렌-폴리이미드(FEP-PI) 성분으로 구성된 미세유체채널 및 NaIO4의 산화 작용을 통한 도파-도파 상호작용 기반의 가교반응을 이용하였다. 구체적으로, 수정된 fp-151를 10-20 wt%의 농도로 증류수에 녹인 후, NaIO4 용액을 도파:IO4 - 의 비율이 2:1이 되도록 넣은 후, 2-5 wt%의 중탄산암모늄과 함께 수상의 분산질(dispersed phase)로써, 1-2 wt %의 008-fluorosurfactant와 FC-40의 혼합액으로 오일상의 분산매(continuous phase)로써 도입하였다. 두 유체는 실린지 펌프를 이용하여 각각 10, 15 μL/min의 일정한 속도로 미세유체채널로 도입되었으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 약 260 μm의 지름을 갖는 균일한 유중수 에멀젼이 연속적으로 형성되는 것을 확인하였다. 상기 유중수 에멀젼(water-in-oil emulsion)은 홍합 접착 단백질, 산화제 및 기공유도물질(porogen)을 포함한다.
이후, 상기와 같이 제조된 에멀젼을 내부의 홍합 접착 단백질 fp-151에 포함된 도파 잔기의 산화반응을 통해 가교시키기 위하여 37℃ 에서 24시간 동안 보관하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4의 a는 에멀젼 형성 직후, b는 에멀젼 형성 후 12시간 경과, c는 에멀젼 형성 후 24시간 경과 시의 모습을 나타낸 것이다. 또한, 에멀젼 응축 과정에서 각 에멀젼 입자의 크기를 도식화한 그래프를 도 5에 나타내었다. 24시간 동안 응축 과정을 거친 에멀젼을 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 관찰한 결과를 도 6에 나타내었다.
도 4 내지 도 6에 나타낸 바와 같이, 도파 잔기의 산화반응을 통해 에멀젼이 가교됨에 따라 에멀젼의 크기는 작아지고, 색깔은 짙은 적갈색으로 변하면서 젤 형태의 응축된 에멀젼 입자를 얻을 수 있음을 확인하였다. 24시간의 가교 반응 이후 형성된 응축된 입자는 최종적으로 약 80μm의 지름을 가지는 것을 확인하였다.
1-4. 홍합 접착 단백질 fp -151을 이용한 다공성 마이크로입자 형성
상기와 같이 가교된 에멀젼 입자를 에탄올, 아세톤 및 에탄올-염산 혼합액을 순차적으로 이용하여 세척하였다. 이 과정에서 에멀젼 입자를 덮고 있던 오일 및 계면활성제가 제거되면서 단백질 분자의 격자 내에 수분이 채워져 팽윤 되고, 동시에 기공유도물질에 의한 기체 발생으로 기공이 생성되어 다공성 마이크로입자가 형성되었다. 마이크로입자의 다공성 구조를 명확히 관찰하기 위하여 홍합 접착 단백질 fp-151에 각각 FITC 및 RITC를 결합하여 형광현미경 및 SEM으로 탐지하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 형성된 다공성 마이크로입자의 지름은 약 220 μm이며, 상기 다공성 마이크로입자는 기공이 서로 연결된 형태의 3차원 다공성 마이크로입자임을 확인하였다. 이에 따라, 상기 다공성 마이크로입자는 세포가 부착하여 효율적으로 증식할 수 있는 세포 지지체로 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 2. 홍합 접착 단백질 fp -151 기반 다공성 마이크로입자의 물리적, 화학적 특성 분석
2-1. 다공성 마이크로입자 표면의 FT- IR spectroscopy 분석
상기 실시예 1에서 제조한 홍합 접착 단백질 기반의 다공성 마이크로입자(MAP-PMS) 표면의 화학적 결합 양상을 확인하기 위해 FT-IR spectroscopy 분석을 진행하고 그 결과를 도 8에 나타내었다. 비교군으로는 수정된 fp-151(MAP)과 NaIO4를 처리한 fp-151(MAP+ NaIO4) 코팅 표면을 사용하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 다공성 마이크로입자의 경우 카테콜에 포함된 C-O 결합을 나타내는 1240 cm- 1 파장 부근에서 NaIO4를 처리한 fp-151 코팅 표면과 비슷한 양상의 피크를 나타냄을 확인하였다. 이로써, 도파가 산화제에 의해 도파-퀴논으로 변화되어 충분한 가교가 진행되어 마이크로입자를 형성한 것임을 확인하였다.
2-2. 다공성 마이크로입자 표면의 전하 측정
형성된 다공성 마이크로입자의 표면이 갖는 전하를 알아보기 위하여, pH 7.4의 PBS에 도입하여 제타전위(zeta potential)을 확인하였다. 비교군으로는, 수정된 fp-151을 1 mg/ml의 농도로 PBS에 녹인 용액과, 이에 NaIO4를 처리한 용액을 사용하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 다공성 마이크로입자가 NaIO4를 처리한 fp-151 용액과 비슷한 수준의 제타전위(약 +6 mV)를 갖는 것을 확인하였다.
2-3. 다공성 마이크로입자의 절단면의 기공 분포 분석
다공성 마이크로입자의 기공구조를 면밀히 관찰하기 위하여, 마이크로입자를 절단하여 SEM 및 마이크로-컴퓨터 단층촬영(micro-computed tomography, micro-CT)을 통해 분석하였다. 그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다.
도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 20-30 μm의 지름을 갖는 기공이 서로 연결된 형태로 존재하며, 공극율이 약 95%임을 확인하였다.
실시예 3. 홍합 접착 단백질 fp -151 기반 다공성 마이크로입자의 적용 가능성 확인
다공성 마이크로입자의 적용가능성을 확인하기 위하여 다공성 마이크로입자를 실린지에 도입하고 다공성 마이크로입자의 방출 양상을 관찰하였다. 또한, 다공성 마이크로입자를 주형을 이용하여 실린더 형태의 구조체로 제작하고, 동물조직의 피부 표면에서 알지네이트 마이크로입자와 함께 접착성을 확인하였다. 그 결과를 도 12 내지 15에 나타내었다.
도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같이, 마이크로입자는 형태를 유지하면서 실린지를 통해 외부로 주입될 수 있음을 확인하였다. 또한, 도 14에 나타낸 바와 같이 마이크로입자는 주형을 이용하여 실린더 형태의 구조체로 제작할 수 있음을 확인하였다. 또한, 도 15에 나타낸 바와 같이, 실린지를 통해 마이크로입자를 동물의 피부조직 표면에 적용한 결과, 수분 환경에서 알지네이트 마이크로입자 대조군 비해 높은 접착성을 발휘하여 여러 번의 세척 후에도 적용부위에서 부착되어 있음을 확인하였다. 이를 통해 상기 다공성 마이크로 입자가 조직 재생 및 회복이 필요한 부위에 효과적으로 적용 가능함을 확인하였다.
실시예 4. 홍합 접착 단백질 기반 다공성 마이크로입자의 in vitro 세포전달 특성 분석
4-1. 다공성 마이크로입자의 세포 부착 효율 확인
상기 실시예 1에서 제조한 홍합 접착 단백질 기반 다공성 마이크로입자의 세포전달체로서의 효능을 확인하기 위하여 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, rMSC), 치주인대 유래 줄기세포(periodontal ligament stem cell, hPDLC) 및 혈관내피세포(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)를 이용하여 in vitro 세포실험을 진행하였다. 구체적으로, 1 × 104개의 마이크로입자 당 5 × 104개의 각 세포를 혼합하여 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 각 마이크로입자의 세포 부착을 확인한 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 최초에 도입한 세포 수 대비 세포 부착 효율(cell loading efficiency)이 약 55-70%임을 확인하였다.
4-2. 다공성 마이크로입자의 각 세포에 대한 성장 양상 확인
다공성 마이크로입자의 배양 날짜에 따른 각 세포에 대한 성장 양상을 확인하였다. 구체적으로, 매일 각 세포-마이크로입자 복합체의 배지를 교체하면서 7일동안 배양하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었다. 또한, 이 중 중간엽 줄기세포의 다공성 마이크로입자에 대한 부착 및 성장을 보다 면밀히 관찰하기 위하여 다공성 마이크로입자에 부착 1일 경과 후 메틸렌블루 염색을 진행하고 광학현미경, SEM 관찰 및 형광 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 다공성 마이크로입자에 배양된 모든 세포의 효율적인 세포 증식을 확인하였다. 또한, 도 18에 나타낸 바와 같이, 세포의 활성이 유지되고(도 18의 a), 다공성 마이크로입자의 표면과 기공 표면에서 세포가 효율적으로 부착되어 증식되고 있음을 확인하였다(도 18의 b). 또한, 형광 염색을 통해 핵과 세포질의 액틴 섬유를 관찰한 결과 시간이 경과함에 따라 세포의 증식과 함께 퍼짐 양상이 활발해짐을 확인하였다(도 18의 c).
실시예 5. 홍합 접착 단백질 기반 다공성 마이크로입자의 최소 침습형 in vivo 생체 주입 특성 분석
상기 실시예 1에서 제조한 홍합 접착 단백질 기반 다공성 마이크로입자의 최소 침습형 생체 주입 특성을 확인하기 위하여, 1 × 105개의 FITC가 탐지된 마이크로입자를 PBS 용액에 혼합한 후, 5주령의 면역 결핍 누드 마우스(Balb/C Nude)의 피하에 주입하였다. 주입 당일 및 주입 28일 경과 후, in vivo 형광 이미지 장치를 이용하여 생체 내에서의 마이크로입자의 거동을 확인하였다. 그 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19에 나타낸 바와 같이, 마이크로입자가 최소 침습 방식으로 성공적으로 주입되어 28일 후에도 어느 정도 잔존하는 것을 확인하였다.
이에 따라, 본원 발명의 홍합 접착 단백질 기반의 접착성 마이크로입자는 실린지를 통한 최소 침습형 생체 주입으로 세포전달체로서 조직 손상 부위에 치료용 줄기세포를 효율적으로 전달할 수 있음을 확인하였다. 또한, 조직의 결함 부위의 크기에 알맞게 적용할 수 있는 조직공학용 지지체, 또는 약물 전달체 등으로 폭넓게 응용될 수 있음을 확인하였다.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Porous microspheres comprising mussel adhesive protein and method for preparing the same <130> POSTECH1-42P-1 <150> KR 1020170041584 <151> 2017-03-31 <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 800 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-1 <400> 1 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 50 55 60 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 65 70 75 80 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 85 90 95 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 100 105 110 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 115 120 125 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 130 135 140 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 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Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His Val His Arg 130 135 140 His Gln Val Leu His Lys His Val His Asn His Arg Val Leu His Lys 145 150 155 160 His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His Val His Thr His Arg 165 170 175 Val Leu His Lys His Val His Lys His Arg Val Leu His Lys His Leu 180 185 190 His Lys His Gln Val Leu His Gly His Ile His Thr His Arg Val Leu 195 200 205 His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His Val His Thr 210 215 220 His Arg Val Leu His Lys His Val His Lys His Arg Val Leu His Lys 225 230 235 240 His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His Val His Met His Arg 245 250 255 Val Leu His Lys His Val His Lys His Arg Val Leu His Lys His Val 260 265 270 His Lys His His Val Val His Lys His Val His Ser His Arg Val Leu 275 280 285 His Lys His Val His Lys His Arg Val Glu His Gln His Val His Lys 290 295 300 His His Val Leu His Arg His Val His Ser His His Val Val His Ser 305 310 315 320 His Val His Lys His Arg Val Val His Ser His Val His Lys His Asn 325 330 335 Val 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-5 <400> 8 Lys His His His His His His Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr 1 5 10 15 Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly 20 25 30 Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys 35 40 45 Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys 50 55 60 Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Ser Ser <210> 9 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-6 <400> 9 Ile Ala Ala Leu Cys Gly Ile Val Lys Ser Ile Asp Ser Asp Asp Ser 1 5 10 15 Asp Tyr Asp Tyr Lys Gly Arg Gly Tyr Cys Thr Asn Lys Gly Cys Arg 20 25 30 Ser Gly Tyr Asn Tyr Phe Gly Asn Lys Gly Tyr Cys Lys Tyr Gly Glu 35 40 45 Lys Ser Tyr Thr Tyr Asn Cys Asn Ser Tyr Ala Gly Cys Cys Leu Pro 50 55 60 Arg Asn Pro Tyr Gly Lys Leu Lys Tyr Tyr Cys Thr Asn Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Cys Pro Asn Asn Tyr Tyr Phe Tyr Asn Asn Lys Gly Tyr Tyr Tyr Leu 85 90 95 Glu His His His His His His 100 <210> 10 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-151 <400> 10 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp Ser Ser 50 55 60 Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His 65 70 75 80 Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly 85 90 95 Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser 100 105 110 Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly 115 120 125 Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ala Lys Pro Ser Tyr 130 135 140 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 145 150 155 160 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 165 170 175 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 180 185 190 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Leu 195 200 <210> 11 <211> 202 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-151-RGD <400> 11 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu 50 55 60 Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser 65 70 75 80 Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys 85 90 95 Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly 100 105 110 Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr 115 120 125 Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 130 135 140 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 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Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp Ser Ser 50 55 60 Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His 65 70 75 80 Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly 85 90 95 Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser 100 105 110 Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly 115 120 125 Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ala Asp Tyr Tyr Gly 130 135 140 Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg 145 150 155 160 Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys 165 170 175 Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Gly Ser 180 185 <210> 15 <211> 187 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-351 <400> 15 Pro Trp Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr 1 5 10 15 Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys 20 25 30 Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 Pro Trp Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr 50 55 60 Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly 65 70 75 80 Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys 85 90 95 Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr 100 105 110 His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ala 115 120 125 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 130 135 140 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 145 150 155 160 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 165 170 175 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 180 185 <210> 16 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 1 <400> 16 Arg Gly Asp 1 <210> 17 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 2 <400> 17 Arg Gly Asp Ser 1 <210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> 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Claims (19)

  1. 홍합 접착 단백질을 포함하는, 다공성 마이크로입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열이 연결된 융합 단백질인, 다공성 마이크로입자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질인, 다공성 마이크로입자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 전체 타이로신 잔기의 10 ~ 100%가 도파(DOPA)로 변형된 것을 특징으로 하는, 다공성 마이크로입자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 다공성 마이크로입자는 유중수 에멀젼(water-in-oil emulsion)으로부터 형성되는 것을 특징으로 하는, 다공성 마이크로입자.
  6. 제5항에 있어서, 상기 유중수 에멀젼은 홍합 접착 단백질에 포함된 도파 잔기의 산화반응에 의한 가교화를 통해 응축되는 것을 특징으로 하는, 다공성 마이크로입자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 다공성 마이크로입자는 공극률이 50 내지 95%인 것을 특징으로 하는, 다공성 마이크로입자.
  8. 제1항에 있어서, 상기 다공성 마이크로입자는 생체적합성을 가지는 것을 특징으로 하는, 다공성 마이크로입자.
  9. 제1항에 있어서, 상기 다공성 마이크로입자는 생리활성물질을 적재(loading) 또는 부착(attachment)하는 것을 특징으로 하는, 다공성 마이크로입자.
  10. 제9항에 있어서, 상기 생리활성물질은 세포, 단백질, 폴리펩타이드, 다당류, 단당류, 올리고당류, 지방산 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 생리활성물질인 것을 특징으로 하는, 다공성 마이크로입자.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세포는 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell), 지방질줄기세포(adipose stem cell), 조골세포(osteoblast), 치주인대세포(periodontal ligament cell), 혈관내피세포(vascular endothelial cell), 섬유세포(fibroblast), 간세포(hepatocyte), 신경세포(neurons), 암세포(cancer cell), B 세포 및 백혈구세포(white blood cell)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 세포인 것을 특징으로 하는, 다공성 마이크로입자.
  12. 제1항에 있어서, 상기 다공성 마이크로입자는 최소 침습형 생체 주입이 가능한 것을 특징으로 하는, 다공성 마이크로입자.
  13. 홍합 접착 단백질을 포함하는, 다공성 마이크로 입자 형성용 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 산화제 및 기공유도물질(porogen)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 다공성 마이크로 입자 형성용 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 산화제는 NaIO4 , NaIO3, VOSO4, Na3VO4, Na2Cr2O7, Mn(OAc)3, MnO2, KMnO4, Na2S2O8, H2O2, Na2S2O4, BHP(tert-butyl hydroperoxide) 및 DTT(dithiothreitol)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는, 다공성 마이크로 입자 형성용 조성물.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 다공성 마이크로입자를 포함하는 세포전달체.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 다공성 마이크로입자를 포함하는 조직공학용 지지체.
  18. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 다공성 마이크로입자를 포함하는 약물 전달체.
  19. 1) 미세유체채널 내부에서 홍합 접착 단백질, 산화제 및 기공유도물질(porogen)을 포함하는 유중수 에멀젼을 형성하는 단계;
    2) 홍합 접착 단백질에 포함된 도파 잔기의 산화를 통해 상기 유중수 에멀젼을 가교시키는 단계; 및
    3) 가교 후 얻어진 에멀젼 입자를 세척하고 기공을 형성시키는 단계를 포함하는, 다공성 마이크로입자의 제조방법.
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