WO2018182278A1 - 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로입자 및 이의 제조방법 - Google Patents

홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로입자 및 이의 제조방법 Download PDF

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WO2018182278A1
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porous
porous microparticles
microparticles
mussel adhesive
seq
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차형준
김동표
조윤기
민경익
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포항공과대학교 산학협력단
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    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression

Definitions

  • the present invention relates to a porous microparticle comprising a mussel adhesive protein and a method for preparing the same.
  • Stem cells have a differentiation ability to develop into various tissues, and in the field of tissue engineering and regenerative medicine, research is being actively conducted to recover human tissues or organs and to treat diseases by transplanting stem cells.
  • direct injection of stem cells into biological tissues has been attracting attention in the clinical field because it can be applied in a minimally invasive manner, but the limitations of low cell delivery efficiency such as damage or death of cells are easily caused during injection.
  • Microparticles are three-dimensional structures with a diameter of 1-1000 ⁇ m and have a high surface area-volume ratio, which allows efficient cell loading, and are therefore widely used in various fields such as orthopedic and oral facial surgery.
  • an injection-type cell transporter capable of filling tissue defects having a shape and size, their applicability is increasing.
  • the microparticles can be used for the purpose of delivering the drug to the desired site by mounting the drug. Since such microparticles must be introduced into a living body, biocompatibility and biodegradability are required, and the attachment and growth of cells should be easy based on an appropriate level of mechanical properties.
  • Microparticles are currently based on synthetic polymers such as polylactide glycolide copolymer (PLGA), polyhydroethyl methacrylate (Poly-HEMA), polystyrene, polyacrylamide (PAA), and the like.
  • synthetic polymer-based microparticles have the advantage of easy control of mechanical properties and biodegradation rate by easily controlling molecular structure and molecular weight, but relatively low biocompatibility and lack of functionality for direct interaction with cells. Therefore, there is a problem that ultimately loss of cell viability or difficult control of cell differentiation capacity.
  • natural polymers such as collagen and chitosan have similar properties to extracellular substrates and have excellent biocompatibility, which has been suggested as an alternative for in vivo application. Has
  • mussels which are marine life, produce and secrete adhesive proteins so that they can be firmly attached to wet solid surfaces such as rocks in the sea, affecting the impact of waves and the buoyancy effects of seawater. Do not receive.
  • Mussel adhesive proteins are known as strong natural adhesives, and have high biocompatibility and biodegradability, but high tensile strength and flexibility when compared to chemical synthetic adhesives.
  • mussel adhesive proteins have the ability to adhere to a variety of surfaces, including plastics, glass, metals, Teflon, and biomaterials. It is possible inside.
  • the dopa (3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA) residues present in the mussel adhesion protein play an important role in surface adhesion and bind to surrounding dopa residues and amino acids while oxidizing to dopa-quinone. It is known to enable excellent mechanical properties of mussels as a crosslinking mediator causing crosslinking.
  • fp-151 a new type of mussel adhesive protein fused to both ends of Mgfp-5 by repeating a decapeptide repeated about 80 times in Mefp-1. Proteins can be mass produced in E. coli, and the purification process is also very simple, it has been confirmed that the industrial applicability is very high (WO2006 / 107183 or WO2005 / 092920).
  • the present inventors Based on this mass production technology, the present inventors convert tyrosine residues of mussel adhesive proteins mass-produced in Escherichia coli system into high-efficiency waveguides, and use microfluidic devices based on mussel adhesive protein-based porous microparticles.
  • the present invention was completed by confirming that the porous microparticles thus prepared showed excellent efficacy as cells and drug carriers.
  • an object of the present invention is to provide a porous microparticle comprising a mussel adhesive protein and a method for preparing the same.
  • an object of the present invention is to provide a cell carrier, a tissue engineering support, and a drug carrier using the porous microparticles.
  • an object of the present invention is to provide a cell or drug delivery method comprising the step of administering the porous microparticles to a subject.
  • the present invention provides a porous microparticle comprising a mussel adhesive protein.
  • the present invention also provides a composition for forming porous microparticles comprising a mussel adhesive protein.
  • the present invention also provides a cell carrier comprising the porous microparticles.
  • the present invention also provides a support for tissue engineering including the porous microparticles.
  • the present invention provides a drug carrier comprising the porous microparticles.
  • the present invention comprises the steps of: 1) forming a water-in-oil emulsion comprising mussel adhesive protein, oxidant and porogen inside the microfluidic channel; 2) crosslinking the water-in-oil emulsion through oxidation of the waveguide residues contained in the mussel adhesive protein; And 3) washing the emulsion particles obtained after crosslinking and forming pores.
  • the present invention also provides a cell delivery method comprising the step of administering the porous microparticles to the subject.
  • the present invention also provides a drug delivery method comprising the step of administering the porous microparticles to the subject.
  • Porous microparticles comprising the mussel adhesive protein according to the present invention is capable of minimally invasive bio-injection through a syringe to efficiently deliver therapeutic stem cells to tissue damage sites as cell carriers.
  • the present invention may be widely applied to a tissue engineering support, drug carrier, or the like, which can be suitably applied to the size of a defect site of a tissue.
  • Figure 1 is a schematic diagram of a method for producing a cell carrier comprising a mussel adhesive protein-based porous microparticles of the present invention.
  • Figure 2 shows the results of the analysis of the conversion rate of the mussel adhesive protein fp-151 to the dopa (DOPA) residues tyrosine residues through the amino acid analyzer.
  • DOPA dopa
  • FIG. 3 shows a water-in-oil emulsion comprising mussel adhesion protein, oxidant and porogen in a microfluidic channel composed of fluoroethylene propylene-polyimide (FEP-PI) components. It is an image of the process.
  • FEP-PI fluoroethylene propylene-polyimide
  • FIG. 4 is an image showing the condensation of the emulsion formed through the microfluidic channel as it cross-links through the oxidation reaction of the waveguide residue contained in the mussel adhesive protein therein (a: immediately after the emulsion is formed, b: the emulsion 12 hours after formation, c: 24 hours after emulsion formation).
  • FIG. 5 is a graph illustrating the size of each emulsion particle in the emulsion condensation process of FIG. 4.
  • Figure 6 shows the results observed using a scanning electron microscope (SEM) after 24 hours of condensation of the emulsion.
  • Figure 7 shows the result of observing the process of forming the porous microparticles by washing the emulsion crosslinked through the condensation process by using ethanol, acetone and ethanol-hydrochloric acid mixture sequentially, swelling and pores are formed in the process (a, b: fluorescence microscope to observe the FITC-coupled microparticles, rhodamine-coupled microparticles, c: SEM to observe the structure of the porous microparticles).
  • FIG. 8 shows the result of confirming that the waveguide is changed to dopa-quinone (1240 cm - 1 ) by an oxidizing agent through FT-IR analysis of the surface of the porous microparticles (MAP-PMS: fp-151 forming porous microparticles). , MAP + NaIO 4 : fp-151 treated with NaIO 4 , MAP: modified fp-151).
  • Figure 9 shows the results of confirming the charge on the surface of the porous microparticles.
  • FIG. 11 shows the results of confirming the pore distribution of the cut surface of the porous microparticles through micro-computed tomography (micro-CT).
  • porous microparticles (a: porous microparticle powder, b: porous microparticles mixed in the PBS solution, c: porous microparticles introduced into the 21-gauge syringe) ).
  • Figure 13 is a photograph taken in time order of the appearance of the porous microparticles released through the syringe.
  • Figure 14 shows the structure manufactured in the form of a cylinder using a mold for using the porous microparticles as a support for filling the tissue defect site.
  • Figure 15 shows the results confirmed the excellent adhesion of the porous microparticles of the present invention (MAP-PMS) compared to the control (alginate microparticles, Alginate MS) on the skin surface of animal tissues.
  • FIG. 16 shows cell adhesion efficiency of mesenchymal stem cells (rMSCs), periodontal ligament stem cells (hPLDCs), and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) of porous microparticles. (cell loading efficiency) is shown.
  • 17 is a graph illustrating the growth pattern for each cell according to the culture date of the porous microparticles.
  • Figure 18 shows the results of observation of adhesion and growth to mesenchymal stem cells in porous microparticles (a: methylene blue staining results after 1 day from cell adhesion, b: 1 day from cell adhesion SEM observation of microparticles after passage, cf: fluorescence staining after 0, 1, 4, 7 days immediately after cell attachment).
  • Figure 20 shows a schematic diagram of the minimally invasive bio-injection through a syringe of porous microparticles containing a mussel adhesive protein according to the present invention.
  • the present invention provides a porous microparticle comprising a mussel adhesive protein.
  • microsphere refers to a three-dimensional structure having a diameter of 1-1000 ⁇ m.
  • the diameter of the microparticles may be preferably 1-500 ⁇ m, more preferably 1-250 ⁇ m.
  • the microparticles can be used for two-dimensional to three-dimensional cell culture by attaching the surrounding cells present in the medium to the surface.
  • porous microparticles are porous particles having uniform pores, and may be characterized by excellent biocompatibility and adhesion, including mussel adhesive proteins.
  • “mussel adhesive protein” is an adhesive protein derived from mussels, preferably Mytilus edulis ), Mytilus galloprovincialis or Mytilus coruscus , or mussel adhesive proteins derived from Mytilus coruscus or variants thereof.
  • the mussel adhesive proteins of the present invention are Mefp (Mytilus edulis foot protein) -1, Mefp-2, Mefp-3, Mefp-4, Mefp-5, and Mgfp (Mytilus galloprovincialis foot protein) derived from the mussel species, respectively.
  • fp (foot protein) -1 SEQ ID NO: 1)
  • fp-2 SEQ ID NO: 5
  • fp-3 SEQ ID NO: 6
  • fp-4 SEQ ID NO: 7
  • fp- 5 SEQ ID NO: 8
  • fp-6 SEQ ID NO: 9
  • the mussel adhesive proteins of the present invention may include all mussel adhesive proteins described in WO2006 / 107183 or WO2005 / 092920.
  • the mussel adhesive protein is fp-151 (SEQ ID NO: 10), fp-131 (SEQ ID NO: 12), fp-353 (SEQ ID NO: 13), fp-153 (SEQ ID NO: 14), fp-351 (SEQ ID NO: Fusion proteins such as No. 15), but are not limited thereto.
  • the mussel adhesive protein of the present invention may include a polypeptide in which a decapeptide (SEQ ID NO: 2), which is repeated about 80 times in fp-1 (SEQ ID NO: 1), is linked 1 to 12 or more times.
  • the decapeptide of SEQ ID NO: 2 may be a fp-1 variant polypeptide (SEQ ID NO: 3) linked 12 consecutive times, but is not limited thereto.
  • the mussel adhesive protein may include an additional sequence at the carboxyl terminus or the amino terminus of the mussel adhesive protein or some amino acids may be substituted with other amino acids under the premise of maintaining adhesion.
  • a polypeptide consisting of 3 to 25 amino acids including RGD (Arg Gly Asp) may be linked to the carboxyl terminus or amino terminus of the mussel adhesive protein, but is not limited thereto.
  • RGD 3 to 25 amino acids including the RGD include, but are not limited to, RGD (Arg Gly Asp, SEQ ID NO: 16), RGDS (Arg Gly Asp Ser, SEQ ID NO: 17), RGDC (Arg Gly Asp Cys, sequence) No.
  • RGDV Arg Gly Asp Val, SEQ ID NO: 19
  • RGDSPASSKP Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro, SEQ ID NO: 20
  • GRGDS Gly Arg Gly Asp Ser, SEQ ID NO: 21
  • GRGDTP Gly Arg Gly Asp Thr Pro, SEQ ID NO: 22
  • GRGDSP Gly Arg Gly Asp Ser Pro, SEQ ID NO: 23
  • GRGDSPC Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys, SEQ ID NO: 24
  • YRGDS Tyr Arg Gly Asp Ser, SEQ ID NO: 25
  • a variant of a mussel adhesive protein linked to a polypeptide consisting of 3 to 25 amino acids including RGD at the carboxyl or amino terminus of the mussel adhesive protein may be a fp-1 variant-RGD polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or It may be a fp-151-RGD polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, but is not limited thereto.
  • the mussel adhesive protein may be a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the mussel adhesive protein may be one in which 10 to 100% of all tyrosine residues are modified by waveguide.
  • Tyrosine accounts for about 20-30% of the total amino acid sequence of most mussel adhesive proteins.
  • Tyrosine in the natural mussel adhesive protein is converted to the waveguide form by adding -OH groups through a hydration process.
  • mussel adhesive proteins produced in E. coli are not converted to tyrosine residues, it is preferable to perform a modification reaction to convert tyrosine residues to waveguides by a separate enzyme and chemical treatment method.
  • the method of modifying the tyrosine residue contained in the mussel adhesive protein by a method known in the art may be used, and is not particularly limited.
  • tyrosinase can be used to modify tyrosine residues to dopase residues.
  • mussel adhesive protein was produced by satisfying the waveguide conversion rate through an in vitro enzymatic reaction using mushroom tyrosinase.
  • the porous microparticles can be formed from a water-in-oil emulsion, the water-in-oil emulsion is condensed through cross-linking by the oxidation reaction of the waveguide residue contained in the mussel adhesive protein. Can be.
  • the porous microparticles may be characterized as having biocompatibility, the porous microparticles may be characterized in that the loading (loading) or (attachment) a bioactive material.
  • microparticles of the present invention can be easily loaded or attached to various bioactive substances involved in the action of promoting the growth and differentiation of cells through the interaction with cells or tissues of the human body and aiding the regeneration and recovery of tissues.
  • the "physiologically active substance” refers to various biomolecules and includes cells, proteins, nucleic acids, sugars, enzymes, and the like.
  • the bioactive substance may be a cell, a protein, a polypeptide, a polysaccharide, a monosaccharide, an oligosaccharide, a fatty acid, a nucleic acid, and preferably a cell.
  • the "cell” may be any cell including prokaryotic and eukaryotic cells.
  • the physiologically active substance includes, but is not limited to, plasmid nucleic acid as a nucleic acid material, hyaluronic acid as a sugar substance, heparin sulfate, chondroitin sulfate, alginate, and hormonal protein as a protein substance.
  • the present invention also provides a composition for forming porous microparticles comprising a mussel adhesive protein.
  • composition for forming porous microparticles may further include an oxidizing agent and a porogen.
  • the "oxidant" is NaIO 4 , NaIO 3 , VOSO 4 , Na 3 VO 4 , Na 2 Cr 2 O 7 , Mn (OAc) 3 , MnO 2 , KMnO 4 , Na 2 S 2 O 8 , H 2 O 2 , Na 2 S 2 O 4 , tert- butyl hydroperoxide (BHP), dithiothreitol (DTT), and the like, and preferably, NaIO 4 may be used to oxidize the waveguide residue.
  • BHP tert- butyl hydroperoxide
  • DTT dithiothreitol
  • the "air-sharing substance" may be a carbonate forming a gas such as ammonium bicarbonate, sodium bicarbonate, calcium carbonate, and preferably ammonium bicarbonate.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the present invention also provides a cell transporter comprising the porous microparticles of the present invention.
  • the cell carrier of the present invention can be used for the regeneration and recovery of biological tissues by injecting in a minimally invasive manner through a syringe.
  • biological tissue herein is not particularly limited and includes, for example, skin, bones, ligaments, nerves, blood vessels, muscles, eyes, brain, lungs, liver, heart, bladder, kidneys, stomach, small intestine, and rectum. And the like.
  • the porous microparticles of the present invention may be applied in a minimally invasive manner through a syringe to a site requiring tissue regeneration and recovery to deliver cells, and to fill defects of tissues or deliver drugs.
  • the porous microparticles containing mussel adhesive protein as a cell transporter more specifically, to the porous microparticles, mesenchymal stem cells, periodontal ligament-derived Excellent cell adhesion efficiency when measuring the cell adhesion after mixing and adhering the medium containing the stem cells (periodontal ligament stem cell) and vascular endothelial cells, and culturing for 6 hours on the medium (cell) loading efficiency).
  • the present invention also provides a support for tissue engineering comprising the porous microparticles of the present invention.
  • Tissue engineering technology refers to culturing cells isolated from a patient's tissue on a scaffold or forming a support together with a supporting member to prepare a support complex including the cells, and then transplanting the cells into the human body.
  • Tissue engineering technology can be applied to the regeneration of almost every organ of the human body, such as artificial skin, artificial cartilage, artificial bone, artificial blood vessels, artificial muscle, etc., and it is important to form a scaffold that is harmless to cells and has properties similar to those of actual biological tissues.
  • Porous microparticles of the present invention can be applied in the desired volume and shape to effectively fill the defects of irregular structures, as well as support for tissue similar to living tissue in order to optimize the regeneration of living tissue and organs in tissue engineering technology Can be provided.
  • the support of the present invention can easily implement an artificial extracellular matrix, it can be used as a medical material such as cosmetics, wound coating, dental matrix.
  • the present invention also provides a drug carrier comprising the porous microparticles of the present invention.
  • the porous microparticles according to the present invention can be used as an extracellular matrix as an effective scaffold for drug delivery.
  • the drug is not particularly limited and may include chemicals, small molecules, peptide or protein medicines, nucleic acids, viruses, antibacterial agents, anticancer agents, or anti-inflammatory agents.
  • the “small molecule” may be, but is not limited to, a contrast agent (eg, a T1 contrast agent, a T2 contrast agent such as a superparamagnetic substance, a radioisotope, etc.), a fluorescent marker, a dyeing agent, and the like.
  • a contrast agent eg, a T1 contrast agent, a T2 contrast agent such as a superparamagnetic substance, a radioisotope, etc.
  • a fluorescent marker e.g, a fluorescent marker, a dyeing agent, and the like.
  • the "peptide or protein drug” is a hormone, a hormonal analog, an enzyme, an inhibitor, a signaling protein or part thereof, an antibody or a part thereof, a single chain antibody, a binding protein or a binding domain, an antigen, an adhesion protein, a structural protein, a regulatory protein , Toxin proteins, cytokines, transcriptional regulators, blood clotting factors and vaccines, and the like.
  • FGF fibroblast growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • TGF transforming growth factor
  • BMP human growth hormone
  • hGH human growth hormone
  • pGH leukocyte growth factor
  • EPO erythrocyte growth factor
  • M-CSF macrophage growth factor
  • TGF tumor necrosis factor
  • EGF epidermal growth factor
  • PDGF platelet-induced growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • growth hormone releasing factor growth hormone releasing factor
  • engiotensin luteinizing hormone releasing hormone (LHRH)
  • LHRH agonist Hormone-releasing hormone agonist
  • TRH engiostatin, endostatin, somatostatin, glucagon, endorphins, vacitracin, mergin, colistin, single antibodies, vaccines or their Containing mixture
  • FGF vascular endothelial growth factor
  • TGF transforming growth factor
  • BMP bone morphogenetic protein
  • human growth hormone h
  • nucleic acid may be RNA, DNA or cDNA, and the sequence of nucleic acids may be coding site sequences or non-coding site sequences (eg, antisense oligonucleotides or siRNAs).
  • the “virus” may be a virus core (ie, a nucleic acid of a virus packaged without a virus envelope) including the virus as a whole or a nucleic acid of the virus.
  • viruses and viral cores that can be transported include, but are not limited to, papilloma virus, adenovirus, baculovirus, retroviral core and semilky virus core.
  • the "antibacterial agent” includes penicillins such as penicillin, methicillin, oxacillin, naphcillin, ampicillin, carboxypenicillin, amoxicillin, piperecillin and the like; Cephalosporins such as cephalosporins, cephazolines, ceftazidime, cepharazone, cephataxime, ceftizone, ceftriaxone and ceftazidime; Other beta-lactams such as carbapenem, meropenem, sulbactam, clavulanate, and tazobactam; Aminoglycosides such as streptomycin, neomycin, gentamycin, tobramycin, amikacin, sisomycin, astromycin, isepamycin, Malawiasin; Macrolides such as erythromycin and clarithromycin; Tetracyclines such as tetracycline, metacycline, minocycline, tigecycline and doxy
  • the "anticancer agent” includes paclitaxel, taxotier, adriamycin, endostatin, angiostatin, mitomycin, bleomycin, cisplatin, carboplatin, doxorubicin, daunorubicin, idarubicin, 5-fluorouracil, methotrexate , Actinomycin-D and mixtures thereof, but is not limited thereto.
  • Said "anti-inflammatory" is acetaminophen, aspirin, ibuprofen, diclofenac, indomethacin, pyroxhamm, phenpropene, flubiprofen, ketoprofen, naproxen, supropene, roxofene, synox Cycam, tenoxycam, and mixtures thereof, but is not limited thereto.
  • the present invention comprises the steps of: 1) forming a water-in-oil emulsion comprising mussel adhesive protein, oxidant and porogen inside the microfluidic channel; 2) crosslinking the water-in-oil emulsion through oxidation of the waveguide residues contained in the mussel adhesive protein; And 3) washing the emulsion particles obtained after crosslinking and forming pores.
  • a mussel adhesive protein including an oil phase and a waveguide in which the surfactant is dissolved in the microfluidic channel, an oxidant, and an aqueous phase in which the covalent conduction material is dissolved are introduced at a constant rate using a syringe pump. Continuously forming a water-in-oil emulsion of size.
  • the mussel adhesive protein, the oxidizing agent and the covalent material may be mixed at various concentrations to form an emulsion.
  • the oil phase may be selected from one or more selected from the group consisting of vegetable, mineral, silicone oil and synthetic oil, and preferably, may be fluorinated oil.
  • the surfactant is typically a surfactant that can stabilize the water-in-oil emulsion fluorosurfactant, Tween ® -20, Tween ® -80, Pluronic ® F108, Span-80, sodium dodecyl surfate (SDS), sodium lauryl surfate (SLS)
  • Tween ® -20, Tween ® -80, Pluronic ® F108, Span-80 sodium dodecyl surfate (SDS), sodium lauryl surfate (SLS)
  • SDS sodium dodecyl surfate
  • SLS sodium lauryl surfate
  • the microfluidic channel for forming an emulsion is preferably a ⁇ -type microchannel composed of a hydrophobic surface of fluoroethylene propylene-polyimide (FEP-PI), but not limited thereto. It doesn't work.
  • FEP-PI fluoroethylene propylene-polyimide
  • the oxidizing agent is preferably used NaIO 4 as an oxidizing agent for oxidizing the waveguide included in the mussel adhesive protein, but is not limited thereto.
  • NaIO 4 in a solution in which the mussel adhesive protein is dissolved at 10-20 wt% so that the ratio of dopa: IO 4 - molecules is 2: 1 to 4: 1.
  • the solution can be added to the aqueous phase by addition.
  • the covalent material may be a carbonate forming a gas such as ammonium bicarbonate, sodium bicarbonate, calcium carbonate, preferably the mussel adhesive protein 10 It can be introduced into the aqueous phase by adding 2-5 wt% ammonium bicarbonate solution to the solution dissolved at -20 wt%.
  • Step 2) is a step of crosslinking the dopa moiety included in the mussel adhesive protein in the emulsion obtained in step 1) through an oxidation reaction.
  • the dopa-quinone is converted into the form of dopa-dopa, or the dopa-quinone is bonded to the surrounding amine (amine) group or thiol (thiol) group.
  • step 3 in the process of washing the crosslinked emulsion particles of step 2), the oil and the surfactant covering the emulsion particles are removed and water is filled in the lattice of the protein molecules constituting the microparticles, and at the same time, The pores are generated by gas generation by the pore-conducting material to form porous microparticles.
  • step 3 one or more selected from the group consisting of ethanol, methanol, isopropyl alcohol, acetone, hydrochloric acid and sodium hydroxide may be used to wash the emulsion particles, but is not limited thereto.
  • the pore diameter may be 10 to 50 ⁇ m, preferably 20 to 40 ⁇ m, and more preferably 20 to 30 ⁇ m.
  • the porosity of such porous microparticles may be 50 to 95%, preferably 70 to 95%, more preferably 90 to 95%.
  • Porous microparticles of the present invention prepared by the above manufacturing method has a pore structure and can deliver more cells by attaching the cells inside the pores, and effectively protects the cells from the external environment through the separated pore inner microenvironment, Effective fluid circulation, oxygen and nutrient supply enable various biomedical applications such as cell carriers, tissue engineering scaffolds, and drug carriers.
  • the present invention also provides a cell delivery method comprising the step of administering the porous microparticles of the present invention to a subject.
  • the present invention also provides a drug delivery method comprising the step of administering the porous microparticles of the present invention to a subject.
  • a decapepide consisting of 10 amino acids repeated about 80 times was synthesized in E. coli fp-1 variant consisting of six decapeptides, 2 fp Mgfp-5 gene (Genbank No. AAS00463 or AY521220) was inserted between -1 variants, and then successfully expressed in E. coli. Subsequently, the mussel adhesive protein fp-151 was produced through purification process using acetic acid (D.S. Hwang et. Al., Biomaterials 28, 3560-3568, 2007).
  • a fp-1 variant (hereinafter, referred to as 6xAKPSYPPTYK) of SEQ ID NO: 3, to which a peptide consisting of AKPSYPPTYK represented by SEQ ID NO: 2 is repeatedly linked, is prepared 6 times.
  • Mussel adhesive protein fp-151 was prepared by combining the 6xAKPSYPPTYK at the N-terminus of fp-5 and 6xAKPSYPPTYK at the C-terminus of fp-5. It was successfully expressed in E. coli and produced through purification separation using acetic acid.
  • the specific preparation of the mussel adhesive protein is the same as that shown in WO2006 / 107183 or WO2005 / 092920, which is incorporated by reference in its entirety.
  • the prepared fp-151 is shown in SEQ ID NO: 10.
  • a modification reaction was performed in vitro using a tyrosinase enzyme (mushroom tyrosinase). Specifically, 150 mg of lyophilized mussel adhesive protein fp-151 and 5 mg of tyrosinase were dissolved in 100 ml of a buffer solution (0.1 M sodium phosphate, 20 mM boric acid, 25 mM ascorbic acid, pH 6.8) for the reaction and reacted for 1 hour. . Thereafter, using 3L of 25% acetic acid solution was changed to three times at least four hours, and then lyophilized. In order to analyze the fertilization efficiency of the mussel adhesive protein fp-151, amino acid composition analysis was performed, and the results are shown in FIG. 2.
  • a buffer solution 0.1 M sodium phosphate, 20 mM boric acid, 25 mM ascorbic acid, pH 6.8
  • microfluidic channel composed of fluoroethylene propylene-polyimide (FEP-PI) component and oxidation of NaIO 4 were prepared.
  • FEP-PI fluoroethylene propylene-polyimide
  • a crosslinking reaction based on waveguide-waveguide interaction was used. Specifically, after the modified fp-151 was dissolved in distilled water at a concentration of 10-20 wt%, a NaIO 4 solution was added so that the ratio of waveguide: IO 4 ⁇ was 2: 1, followed by 2-5 wt% of ammonium bicarbonate.
  • a dispersed phase of the aqueous phase 1-2 wt% of 008-fluorosurfactant and FC-40 were introduced as an oily continuous phase. Both fluids were introduced into the microfluidic channel at a constant rate of 10 and 15 ⁇ L / min using a syringe pump, respectively, and the results are shown in FIG. 3.
  • the water-in-oil emulsion includes mussel adhesive proteins, oxidants and porogens.
  • FIG. Figure 4a shows immediately after the emulsion is formed, b is 12 hours after the emulsion formation, c is 24 hours after the emulsion formation.
  • a graph illustrating the size of each emulsion particle in the emulsion condensation process is shown in FIG. 5.
  • the emulsion observed after condensation for 24 hours using a scanning electron microscope (SEM) is shown in FIG. 6.
  • the crosslinked emulsion particles were washed sequentially using ethanol, acetone and ethanol-hydrochloric acid mixture.
  • the oil and the surfactant covering the emulsion particles were removed, and the water was filled in the lattice of the protein molecules, and swelled.
  • pores were generated by the generation of gas by the pore-conducting material to form porous microparticles.
  • FITC and RITC were bound to mussel adhesive protein fp-151, respectively, and detected by fluorescence microscope and SEM, and the results are shown in FIG. 7.
  • the diameter of the formed porous microparticles was about 220 ⁇ m, and the porous microparticles were confirmed to be three-dimensional porous microparticles having pores connected to each other. Accordingly, it was confirmed that the porous microparticles can be used as a cell support that cells can attach and proliferate efficiently.
  • FT-IR spectroscopy analysis was performed to confirm the chemical binding pattern of the surface of the mussel adhesive protein-based porous microparticles (MAP-PMS) prepared in Example 1, and the results are shown in FIG. 8.
  • MAP-PMS mussel adhesive protein-based porous microparticles
  • porous microparticles of 1240 cm represents the CO contained in the combination of catechol was confirmed to represent a peak of similar pattern with fp-151 treated with NaIO 4 in the vicinity of the first wavelength-coated surface.
  • the waveguide was changed into the waveguide-quinone by the oxidizing agent so that sufficient crosslinking proceeded to form microparticles.
  • zeta potential was confirmed by introducing into PBS of pH 7.4.
  • a solution in which the modified fp-151 was dissolved in PBS at a concentration of 1 mg / ml and a solution treated with NaIO 4 were used. The results are shown in FIG.
  • porous microparticles had a zeta potential (about +6 mV) similar to that of the fp-151 solution treated with NaIO 4 .
  • microparticles were cut and analyzed by SEM and micro-computed tomography (micro-CT). The results are shown in FIGS. 10 and 11.
  • the pores having a diameter of 20-30 ⁇ m exist in the form connected to each other, it was confirmed that the porosity is about 95%.
  • the porous microparticles were introduced into the syringe and the release pattern of the porous microparticles was observed.
  • the porous microparticles were produced in a cylindrical structure using a mold, and the adhesion with alginate microparticles was confirmed on the skin surface of the animal tissue. The results are shown in FIGS. 12 to 15.
  • the microparticles can be injected to the outside through the syringe while maintaining the form.
  • the microparticles can be produced in a cylindrical structure using a mold.
  • the adhesion to the application site even after several washings by exhibiting a high adhesiveness compared to the alginate microparticle control in a water environment It was. This confirmed that the porous microparticles can be effectively applied to the area that requires tissue regeneration and recovery.
  • Example 1 mesenchymal stem cells (rMSCs), periodontal ligament stem cells (hPDLC) and blood vessels
  • rMSCs mesenchymal stem cells
  • hPDLC periodontal ligament stem cells
  • HAVEC human umbilical vein endothelial cells
  • the cell loading efficiency (cell loading efficiency) relative to the number of initially introduced cells is about 55-70%.
  • the growth pattern for each cell was confirmed according to the culture date of the porous microparticles. Specifically, the cells were cultured for 7 days while replacing the medium of each cell-microparticle complex every day. The results are shown in FIG. In order to more closely observe the adhesion and growth of the mesenchymal stem cells among them, methylene blue staining was performed one day after attachment to the porous microparticles, and optical microscopy, SEM observation, and fluorescence analysis were performed. The results are shown in FIG.
  • Example 5 Minimal Mussel Adhesion Protein-Based Porous Microparticles Invasive in vivo Bioinjection Characterization
  • the mussel adhesive protein-based adhesive microparticles of the present invention can efficiently deliver therapeutic stem cells to tissue damage sites as cell carriers by minimally invasive bio-injection through syringes.
  • the present invention can be widely applied as a tissue engineering support or drug carrier that can be suitably applied to the size of a defect site of tissue.

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Abstract

본 발명은 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로입자는 실린지를 통한 최소 침습형 생체 주입이 가능하여 세포전달체로서 조직 손상 부위에 치료용 줄기세포를 효율적으로 전달할 수 있다. 또한, 조직의 결함 부위의 크기에 알맞게 적용할 수 있는 조직공학용 지지체, 또는 약물 전달체 등으로 폭넓게 응용될 수 있다.

Description

홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로입자 및 이의 제조방법
본 발명은 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
줄기세포는 다양한 조직으로 발달할 수 있는 분화능을 지니고 있으며, 조직공학 및 재생의학 분야에서는 줄기세포를 이식하여 인체 조직이나 장기를 복구하고 질병을 치료하기 위한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 특히, 생체 조직부위에 줄기세포를 직접 주입(direct injection)하는 방식은 최소 침습적으로 적용이 가능하기 때문에 임상 분야에서 주목 받고 있으나, 주입 과정에서 세포가 쉽게 손상되거나 사멸하는 등 낮은 세포 전달 효율의 한계점을 지닌다.
마이크로입자(microsphere, MS)는 1-1000μm의 직경을 갖는 3차원 구조체로 높은 표면적-부피비를 지니고 있어 세포의 효율적인 탑재가 가능하기 때문에, 정형외과나 구강안면외과 등 여러 분야에서 최소 침습 방식으로 다양한 모양과 크기를 지니는 조직 결함 부위를 채울 수 있는 주사형 세포전달체로서 그 활용 가능성이 증대되고 있다. 한편, 마이크로입자는 약물을 탑재하여 원하는 부위에 약물을 전달하는 용도로도 사용이 가능하다. 이러한 마이크로입자는 생체에 도입해야 하기 때문에 생체적합성 및 생분해성이 요구되며, 적절한 수준의 기계적 물성을 기반으로 세포의 부착 및 성장이 용이해야 한다.
마이크로입자는 현재 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체(PLGA), 폴리하이드로에틸메타크릴레이트(Poly-HEMA), 폴리스티렌, 폴리아크릴아마이드(PAA) 등의 합성고분자를 기반으로 하는 것이 대부분이다. 이러한 합성고분자 기반의 마이크로입자는 분자구조와 분자량을 쉽게 조절할 수 있어서 기계적 물성과 생분해속도를 조절하기 용이하다는 장점을 지니고 있으나, 상대적으로 생체적합성이 낮고 세포와 직접적인 상호작용을 하기 위한 기능성이 부족하기 때문에, 궁극적으로 세포 생활성이 손실되거나 세포 분화능의 조절이 어렵다는 문제점이 있다. 반면, 콜라겐, 키토산 등의 천연고분자의 경우 세포외기질과 비슷한 성질을 가지며 우수한 생체적합성을 지니고 있어 생체 내 적용을 위한 대안으로 제기되고 있으나, 낮은 기계적 물성으로 인해 세포 전달 환경에서 유지력이 낮다는 한계점을 지닌다.
따라서, 이러한 문제점을 극복하기 위해서 적절한 수준의 기계적 물성을 기반으로 세포를 효율적으로 부착, 성장할 수 있는 환경을 제공하면서 생체 내에서의 부작용을 최소화할 수 있는 이상적인 생체재료 기반의 마이크로입자 개발이 필요하다.
한편, 해양 생명체인 홍합(mussel)은 접착 단백질(adhesive proteins)을 생산 및 분비함으로써 홍합 자신을 바다 속의 바위와 같은 젖은 고체표면에 단단히 부착할 수 있어, 파도의 충격이나 바닷물의 부력 효과에 영향을 받지 않는다. 홍합 접착 단백질은 강력한 자연 접착제로 알려져 있으며, 높은 생체적합성과 생분해성을 지니면서도, 화학 합성 접착제와 비교하였을 때 높은 인장강도와 유연성을 나타낸다. 또한, 홍합 접착 단백질은 플라스틱, 유리, 금속, 테플론 및 생체물질 등의 다양한 표면에 접착할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 아직까지 화학접착제 개발에서 미완의 과제로 남아 있는 젖은 표면에서의 접착도 몇 분 안에 가능하다.
특히, 홍합 접착 단백질 내에 존재하는 도파(3,4-디하이드록시페닐알라닌, DOPA) 잔기는 표면 접착에서 중요한 역할을 하며, 도파-퀴논(DOPA-quinone)으로 산화하면서 주변 도파 잔기 및 아미노산과 결합하여 가교작용을 일으키는 가교 중재자로서 홍합 족사의 뛰어난 기계적 특성을 가능케 하는 것으로 알려져 있다.
그러나, 현재까지 홍합 접착 단백질이 포함하는 도파의 산화반응을 이용하여 마이크로입자를 만들거나 이를 세포전달체로 응용하려는 시도는 없었다.
본 발명자들은 이전의 연구에서, Mefp-1에서 80번 정도 반복되는 데카펩타이드를 6번 반복하여 Mgfp-5의 양쪽 말단에 융합한 새로운 형태의 홍합접착단백질인 fp-151을 개발하였으며, 상기 홍합접착단백질이 대장균에서 대량생산이 가능하고, 정제과정 또한 매우 단순하여 산업적 이용 가능성이 매우 높음을 확인한 바 있다(국제특허공개 WO2006/107183 또는 WO2005/092920).
이러한 대량생산 기술을 바탕으로, 본 발명자들은 대장균 시스템에서 대량생산한 홍합접착단백질의 타이로신 잔기를 높은 효율로 도파로 전환시키고, 간단한 미세 유체 공정(microfluidic device)를 이용하여 홍합 접착 단백질 기반의 다공성 마이크로입자를 제조하였으며, 이와 같이 제조된 다공성 마이크로입자가 세포 및 약물전달체로서 우수한 효능을 나타낸다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로입자 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로 입자형성용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 다공성 마이크로입자를 이용하는 세포전달체, 조직공학용 지지체 및 약물전달체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 다공성 마이크로입자를 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 세포 또는 약물 전달 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로 입자형성용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 다공성 마이크로입자를 포함하는 세포전달체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 다공성 마이크로입자를 포함하는 조직공학용 지지체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 다공성 마이크로입자를 포함하는 약물전달체를 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 미세유체채널 내부에서 홍합 접착 단백질, 산화제 및 기공유도물질(porogen)을 포함하는 유중수 에멀젼을 형성하는 단계; 2) 홍합 접착 단백질에 포함된 도파 잔기의 산화를 통해 상기 유중수 에멀젼을 가교시키는 단계; 및 3) 가교 후 얻어진 에멀젼 입자를 세척하고 기공을 형성시키는 단계를 포함하는, 다공성 마이크로입자의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 다공성 마이크로입자를 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 세포 전달 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 다공성 마이크로입자를 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 약물 전달 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로입자는 실린지를 통한 최소 침습형 생체 주입이 가능하여 세포전달체로서 조직 손상 부위에 치료용 줄기세포를 효율적으로 전달할 수 있다. 또한, 조직의 결함 부위의 크기에 알맞게 적용할 수 있는 조직공학용 지지체, 또는 약물 전달체 등으로 폭넓게 응용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 홍합 접착 단백질 기반의 다공성 마이크로입자를 포함하는 세포전달체의 제조방법에 관한 모식도이다.
도 2는 홍합 접착 단백질 fp-151의 타이로신 잔기에 대한 도파(DOPA) 잔기로의 전환율을 아미노산 분석기를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 플루오르에틸렌 프로필렌-폴리이미드(FEP-PI) 성분으로 구성된 미세유체채널에서 홍합 접착 단백질, 산화제 및 기공유도물질(porogen)을 포함하는 유중수 에멀젼(water-in-oil emulsion)을 형성하는 과정을 이미지로 나타낸 것이다.
도 4는 미세유체채널을 통해 형성한 에멀젼이 내부의 홍합 접착 단백질에 포함된 도파 잔기의 산화반응을 통해 가교되면서 응축하는 모습을 시간에 따라 이미지로 나타낸 것이다 (a: 에멀젼 형성 직후, b: 에멀젼 형성 후 12시간 경과, c: 에멀젼 형성 후 24시간 경과).
도 5는 도 4의 에멀젼 응축 과정에서 각 에멀젼 입자의 크기를 도식화한 그래프이다.
도 6은 에멀젼의 24시간 응축 과정을 거친 후 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 응축 과정을 통해 가교된 에멀젼을 에탄올, 아세톤 및 에탄올-염산 혼합액을 순차적으로 이용하여 세척하고, 그 과정에서 팽윤 및 기공이 형성되어 다공성 마이크로입자가 형성되는 과정을 관찰한 결과를 나타낸 것이다(a, b: 형광현미경으로 각각 FITC가 결합된 마이크로입자, 로다민이 결합된 마이크로입자를 관찰, c: SEM으로 다공성 마이크로입자의 구조를 관찰).
도 8은 다공성 마이크로입자 표면의 FT-IR 분석을 통해 도파가 산화제에 의해 도파-퀴논(1240 cm- 1)으로 변화되었음을 확인한 결과를 나타낸 것이다(MAP-PMS: 다공성 마이크로입자를 형성한 fp-151, MAP+ NaIO4: NaIO4를 처리한 fp-151, MAP: 수정된 fp-151).
도 9는 다공성 마이크로입자 표면의 전하를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 다공성 마이크로입자의 절단면의 기공 분포를 SEM을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 다공성 마이크로입자의 절단면의 기공 분포를 마이크로-컴퓨터 단층촬영(micro-computed tomography, micro-CT)을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 다공성 마이크로입자의 적용을 위해 실린지에 도입한 것을 이미지로 나타낸 것이다 (a: 다공성 마이크로입자 분말, b: PBS 용액에 혼합한 다공성 마이크로입자, c: 21-게이지 실린지에 도입된 다공성 마이크로입자).
도 13은 실린지를 통해 방출되는 다공성 마이크로입자의 모습을 시간 순서대로 촬영한 것이다.
도 14는 다공성 마이크로입자를 조직 결함 부위를 채우기 위한 지지체로 사용하기 위해 주형을 이용하여 실린더 형태로 제작한 구조체를 나타낸 것이다.
도 15는 동물조직의 피부 표면에서 대조군(알지네이트 마이크로입자, Alginate MS)에 비해 본 발명의 다공성 마이크로입자(MAP-PMS)의 뛰어난 접착성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 다공성 마이크로입자의 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, rMSC), 치주인대유래줄기세포(periodontal ligament stem cell, hPLDC) 및 혈관내피세포(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)에 대한 세포 부착 효율(cell loading efficiency)을 나타낸 것이다.
도 17은 다공성 마이크로입자의 배양 날짜에 따른 각 세포에 대한 성장 양상을 도식화한 그래프이다.
도 18은 다공성 마이크로입자에서 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)에 대한 부착 및 성장을 관찰한 결과를 나타낸 것이다(a: 세포 부착으로부터 1일 경과 후 메틸렌블루 염색 결과, b: 세포 부착으로부터 1일 경과 후 마이크로입자의 SEM 관찰 결과, c-f: 세포 부착 직후부터 0, 1, 4, 7일 경과 후 형광 염색 결과).
도 19는 최소 침습 주입을 통한 마이크로입자의 성공적인 생체 주입을 확인한 결과를 나타낸 것이다(a: 주입 당일의 마우스 관찰 결과, b: 주입으로부터 28일 경과 후 마우스 관찰 결과, c, d: 주입 당일 및 28일 경과 후 형광 분석 결과).
도 20은 본 발명에 따른 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로입자의 실린지를 통한 최소 침습형 생체 주입에 관한 모식도를 나타낸 것이다.
본 발명은 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로입자를 제공한다.
본 발명에 있어서, “마이크로입자(microsphere)”란 1-1000μm의 직경을 갖는 3차원 구조체를 의미한다. 상기 마이크로입자의 직경은 바람직하게는 1-500μm일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1-250μm일 수 있다. 상기 마이크로입자는 배지 내에 존재하는 주변의 세포를 표면에 부착시킴으로써 2차원 내지 3차원 세포배양에 사용될 수 있다.
본 발명의 “다공성 마이크로입자”는 균일한 기공을 갖는 다공성 입자이며, 홍합 접착 단백질을 포함하여 생체 적합성 및 부착능이 우수한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, “홍합 접착 단백질”은 홍합에서 유래한 접착 단백질로, 바람직하게는 미틸러스 에둘리스(Mytilus edulis), 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(Mytilus galloprovincialis) 또는 미틸러스 코루스커스(Mytilus coruscus)에서 유래한 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 본 발명의 홍합 접착 단백질은 상기 홍합 종에서 각각 유래한 Mefp(Mytilus edulis foot protein)-1, Mefp-2, Mefp-3, Mefp-4, Mefp-5, Mgfp(Mytilus galloprovincialis foot protein)-1, Mgfp-2, Mgfp-3, Mgfp-4 및 Mgfp-5, Mcfp(Mytilus coruscus foot protein)-1, Mcfp-2, Mcfp-3, Mcfp-4, 및Mcfp-5 또는 이의 변이체를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 fp(foot protein)-1 (서열번호 1), fp-2 (서열번호 5), fp-3 (서열번호 6), fp-4 (서열번호 7), fp-5 (서열번호 8), 및 fp-6 (서열번호 9)로 이루어진 군에서 선택된 단백질, 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 단백질이 연결되어 있는 융합 단백질, 또는 상기 단백질의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 홍합 접착 단백질은 WO2006/107183호 또는 WO2005/092920에 기재된 모든 홍합 접착 단백질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 홍합 접착 단백질은 fp-151 (서열번호 10), fp-131 (서열번호 12), fp-353 (서열번호 13), fp-153 (서열번호 14), fp-351 (서열번호 15) 등의 융합 단백질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 홍합 접착 단백질은 fp-1 (서열번호 1)에서 80번 정도 반복되는 데카펩타이드 (서열번호 2)가 1 내지 12회 또는 그 이상으로 연결된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열번호 2의 데카펩타이드가 12회 연속하여 연결된 fp-1 variant 폴리펩타이드(서열번호 3)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 홍합 접착 단백질은 접착력을 유지하는 전제 하에 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단이나 아미노 말단에 추가적인 서열을 포함하거나 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단 또는 아미노 말단에 RGD (Arg Gly Asp)를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산은, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 RGD (Arg Gly Asp, 서열번호 16), RGDS (Arg Gly Asp Ser, 서열번호 17), RGDC (Arg Gly Asp Cys, 서열번호 18), RGDV (Arg Gly Asp Val, 서열번호 19), RGDSPASSKP (Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro, 서열번호 20), GRGDS (Gly Arg Gly Asp Ser, 서열번호 21), GRGDTP (Gly Arg Gly Asp Thr Pro, 서열번호 22), GRGDSP (Gly Arg Gly Asp Ser Pro, 서열번호 23), GRGDSPC (Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys, 서열번호 24) 및 YRGDS (Tyr Arg Gly Asp Ser, 서열번호 25)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단 또는 아미노 말단에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 홍합 접착 단백질의 변이체는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 fp-1 variant-RGD 폴리펩타이드 또는 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 fp-151-RGD 폴리펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 홍합 접착 단백질은 전체 타이로신 잔기의 10 ~ 100%가 도파로 변형된 것일 수 있다. 대부분의 홍합 접착 단백질의 전체 아미노산 서열에서 타이로신이 차지하는 비중은 약 20-30% 이다. 천연 홍합 접착 단백질 내의 타이로신은 수화 과정을 통하여 -OH기가 첨가되어 도파의 형태로 변환된다. 그러나, 대장균에서 생산된 홍합접착단백질은 타이로신 잔기들이 변환되어 있지 않으므로, 별도의 효소 및 화학적 처리 방법에 의하여 타이로신 잔기를 도파로 변환시키는 수정 반응을 수행하는 것이 바람직하다. 홍합 접착 단백질에 포함된 타이로신 잔기를 도파로 수정하는 방법은 당업계에 알려진 방법을 사용할 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, 타이로시나아제를 사용하여 타이로신 잔기를 도파 잔기로 수정할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 버섯 타이로시나아제를 이용한 in vitro 효소 반응을 통해 상기의 도파 전환율을 만족시키는 홍합 접착 단백질을 생산하였다.
본 발명에 있어서, 상기 다공성 마이크로입자는 유중수 에멀젼(water-in-oil emulsion)으로부터 형성될 수 있으며, 상기 유중수 에멀젼은 홍합 접착 단백질에 포함된 도파 잔기의 산화반응에 의한 가교화를 통해 응축될 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 다공성 마이크로입자는 생체적합성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 다공성 마이크로입자는 생리활성물질을 적재(loading) 또는 부착(attachment)하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 마이크로입자에는 인체의 세포나 조직과 상호작용을 통하여 세포의 성장과 분화를 촉진시키고 아울러 조직의 재생과 회복을 도와주는 작용에 관여하는 각종 생리활성물질들이 쉽게 적재되거나 부착될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “생리활성물질”은 각종 생체분자들을 총칭하며 세포, 단백질, 핵산, 당, 효소 등을 포함한다. 상기 생리활성물질은 세포, 단백질, 폴리펩타이드, 다당류, 단당류, 올리고당류, 지방산, 핵산일 수 있고, 바람직하게는 세포일 수 있다. 상기 “세포”는 원핵세포 및 진핵세포를 포함한 모든 세포일 수 있고, 일 예로 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell), 지방질줄기세포(adipose stem cell), 조골세포(osteoblast), 치주인대세포(periodontal ligament cell), 혈관내피세포(vascular endothelial cell), 섬유세포(fibroblast), 간세포(hepatocyte), 신경세포(neurons), 암세포(cancer cell), B cell, 백혈구세포(white blood cell) 등을 포함한 면역세포 및 배아세포 등일 수 있다. 이 외에도, 생리활성물질은 핵산 물질로서 플라스미드 핵산, 당 물질로서 히아루론산, 헤파린 황산염, 콘드로이틴 황산염, 알진염, 단백질 물질로서 호르몬 단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로 입자 형성용 조성물을 제공한다.
상기 다공성 마이크로 입자 형성용 조성물은 산화제 및 기공유도물질(porogen)을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “산화제”는 NaIO4 , NaIO3, VOSO4, Na3VO4, Na2Cr2O7, Mn(OAc)3, MnO2, KMnO4, Na2S2O8, H2O2, Na2S2O4, BHP(tert-butyl hydroperoxide) 및 DTT(dithiothreitol) 등일 수 있고, 바람직하게는, NaIO4를 사용하여 도파 잔기를 산화시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “기공유도물질”은 중탄산암모늄(ammonium bicarbonate), 중탄산나트륨(sodium biocarbonate), 탄산칼슘(calcium carbonate) 등 기체를 형성하는 탄산염일 수 있고, 바람직하게는 중탄산암모늄일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명의 다공성 마이크로입자를 포함하는 세포전달체를 제공한다.
본 발명의 세포전달체는 실린지를 통한 최소 침습 방식으로 주입하여 생체조직의 재생 및 회복에 이용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 “생체조직”은 특별하게 제한되지 않으며, 예를 들어 피부, 뼈, 인대, 신경, 혈관, 근육, 안구, 뇌, 폐, 간, 심장, 방광, 신장, 위, 소장, 및 직장 등을 포함한다.
따라서, 본 발명의 다공성 마이크로입자는 조직 재생 및 회복이 필요한 부위에 실린지를 통해 최소 침습 방식으로 적용되어 세포를 전달하는 동시에, 조직의 결함부위를 채우거나, 약물을 전달할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 홍합 접착 단백질을 포함하는 다공성 마이크로입자의 세포전달체로의 가능성을 확인하였으며, 보다 구체적으로는 상기 다공성 마이크로입자에, 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell), 치주인대유래줄기세포(periodontal ligament stem cell) 및 혈관내피세포(human umbilical vein endothelial cell)가 포함된 배지를 각각 섞어 부착시키고, 배지 상에서 6시간 동안 배양한 후 세포 부착을 측정하였을 때, 우수한 세포 부착 효율(cell loading efficiency)를 나타냄을 확인하였다.
또한, 본 발명은 본 발명의 다공성 마이크로 입자를 포함하는 조직공학용 지지체를 제공한다.
조직공학 기술이란 환자의 조직으로부터 분리된 세포를 지지체(scaffold) 위에 배양하여 또는 지지체가 되는 구성물과 함께 지지체를 형성하여 세포를 포함한 지지 복합체를 제조한 후 다시 이를 인체 내에 이식하는 것을 말한다. 조직공학 기술은 인공피부, 인공연골, 인공뼈, 인공혈관, 인공근육 등 인체의 거의 모든 장기의 재생에 적용될 수 있으며, 세포에 무해하고 실제 생체조직과 비슷한 물성을 갖는 지지체를 형성하는 것이 중요하다. 본 발명의 다공성 마이크로입자는 원하는 부피와 모양으로 적용이 가능하여 불규칙한 구조를 갖는 조직의 결함을 효과적으로 채울 수 있을 뿐만 아니라, 조직공학 기술에서 생체조직 및 장기의 재생을 최적화하기 위하여 생체조직과 유사한 지지체를 제공할 수 있다. 또한 본 발명의 지지체를 이용하여 간편하게 인공 세포외 기질을 구현할 수 있으며, 화장품, 상처 피복재, 치과용 매트릭스 등의 의료용 소재로도 활용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 다공성 마이크로 입자를 포함하는 약물전달체를제공한다. 본 발명에 따른 다공성 마이크로입자는 약물 전달용 유효 골격(scaffold)으로서의 인공세포외 매트릭스로 사용될 수 있다. 상기 약물은 특별하게 제한되지 않으며, 화학물질, 소분자, 펩타이드 또는 단백질 의약품, 핵산, 바이러스, 항균제, 항암제, 또는 항염증제 등을 포함할 수 있다.
상기 “소분자”는 조영제(예컨대, T1 조영제, 초상자성 물질과 같은 T2 조영제, 방사성 동위 원소 등), 형광 마커, 염색 물질 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 “펩타이드 또는 단백질 의약품”은 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄 항체, 결합단백질 또는 그 결합 도메인, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액 응고 인자 및 백신 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로는 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor;FGF), 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 전환 성장인자(transforming growth factor; TGF), 골형성 성장인자(bone morphogenetic protein; BMP), 인간성장호르몬(hGH), 돼지성장호르몬(pGH), 백혈구 성장인자(G-CSF), 적혈구성장인자(EPO), 대식세포성장인자(M-CSF), 종양 괴사 인자(TNF), 상피세포 성장인자(EGF), 혈소판유도성장인자(PDGF), 인터페론류, 인터루킨류, 칼시토닌, 신경성장인자(NGF), 성장호르몬 방출인자, 엔지오텐신, 황체형성호르몬 방출 호르몬(LHRH), 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 작동약(LHRH agonist), 인슐린, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬(TRH), 엔지오스타틴, 엔도스타틴, 소마토스타틴, 글루카곤, 엔도르핀, 바시트라신, 머게인, 콜리스틴, 단일 항체, 백신류 또는 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 “핵산”은 RNA, DNA 또는 cDNA일 수 있으며, 핵산의 시퀀스는 암호화 부위 서열 또는 비암호화 부위 서열(예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)이 될 수 있다.
상기 “바이러스”는 바이러스 전체 또는 바이러스의 핵산을 포함하는 바이러스 코어(즉, 바이러스의 엔빌로프 없이 패키지된 바이러스의 핵산)가 될 수 있다. 운반될 수 있는 바이러스 및 바이러스 코어의 예로는 파필로마 바이러스, 아데노 바이러스, 배큘로바이러스, 레트로 바이러스 코어 및 세밀키 바이러스 코어 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 “항균제”는 페니실린, 메티실린, 옥사실린, 나프실린, 암피실린, 카르복시페니실린, 아목시실린, 피파레실린 등의 페니실린계(penicillins); 세팔로스포린, 세파졸린, 세프타지딤, 세포페라존, 세포탁심, 세프티족심, 세프트리악손, 세프타지딤 등의 세팔로스포린계(Cephalosporins); 카바페넴, 메로페넴, 설박탐, 클라불라네이트, 타조박탐 등의 기타 베타락탐계(β-lactams); 스트렙토마이신, 네오마이신, 겐타마이신, 토브라마이신, 아미카신, 시소마이신, 아스트로마이신, 이세파마이신, 아베카신 등의 아미노글리코사이드계(aminoglycosides); 에리트로마이신, 클래리트로마이신 등의 마크로라이드계(macrolides); 테트라싸이클린, 메타싸이클린, 미노싸이클린, 티게싸이클린, 독시싸이클린 등의 테트라싸이클린계(tetracyclines); 반코마이신, 타이코플라닌 등의 글리코펩타이드계(glycopeptides); 린코마이신, 클린다마이신 등의 린코마이신계(lincosamides); 날리딕스산, 옥소리산, 플로로퀴놀론, 싸이프로플록사신, 노르플록사신, 레보플록사신 등의 퀴놀론계(quinolones); 리파마이신, 클로람페니콜, 폴리마이신, 트리메트로프림, 스트렙토그라민, 옥사졸리디논, 박시트라신 및 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 “항암제”는 파클리탁셀, 텍소티어, 아드리아마이신, 엔도스타틴, 앤지오스타틴, 미토마이신, 블레오마이신, 시스플레틴, 카보플레틴, 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 5-플로로우라실, 메토트렉세이트, 엑티노마이신-D 및 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 “항염증제”는 아세트아미노펜, 아스피린, 이부프로펜, 디크로페낙, 인도메타신, 피록시캄, 페노프로펜, 플루비프로펜, 케토프로펜, 나프록센, 수프로펜, 록소프로펜, 시녹시캄, 테녹시캄 및 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 1) 미세유체채널 내부에서 홍합 접착 단백질, 산화제 및 기공유도물질(porogen)을 포함하는 유중수 에멀젼을 형성하는 단계; 2) 홍합 접착 단백질에 포함된 도파 잔기의 산화를 통해 상기 유중수 에멀젼을 가교시키는 단계; 및 3) 가교 후 얻어진 에멀젼 입자를 세척하고 기공을 형성시키는 단계를 포함하는, 다공성 마이크로입자의 제조방법을 제공한다.
상기 1) 단계는 미세유체채널 내부에 계면활성제가 용해된 오일상과 도파를 포함하는 홍합 접착 단백질, 산화제 및 기공유도물질이 용해된 수상을 실린지 펌프를 이용하여 일정한 속도로 도입하여, 균일한 크기의 유중수 에멀젼을 연속적으로 형성하는 단계이다. 이 때, 상기 홍합 접착 단백질, 산화제 및 기공유도물질을 다양한 농도로 혼합하여 에멀젼을 형성할 수 있다.
상기 오일상은 식물성, 광물성, 실리콘유 및 합성유로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는, 플루오리네이트 오일(fluorinated oil)일 수 있다.
상기 계면활성제는 일반적으로 유중수 에멀젼을 안정화시킬 수 있는 계면활성제로 fluorosurfactant, Tween®-20, Tween®-80, Pluronic® F108, Span-80, sodium dodecyl surfate(SDS), sodium lauryl surfate(SLS) 등으로 이루어진 군에서 1종 이상 선택하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는, fluorosurfactant일 수 있다.
상기 1) 단계에 있어서, 에멀젼을 형성하기 위한 미세유체채널은 플루오로에틸렌 프로필렌-폴리이미드(fluoroethylene propylene-polyimide, FEP-PI)의 소수성 표면으로 구성된 Ψ-형태의 마이크로채널이 바람직하나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 1) 단계에 있어서, 산화제는 홍합접착단백질에 포함된 도파를 산화시키기 위한 산화제로서 NaIO4를 이용하는 것이 바람직하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 홍합접착단백질이 10-20 wt%로 용해되어 있는 용액에 도파:IO4 - 분자의 비율이 2:1 내지 4:1이 되도록 NaIO4 용액을 첨가시켜서 수상에 도입할 수 있다.
상기 1) 단계에 있어서, 기공유도물질은 중탄산암모늄(ammonium bicarbonate), 중탄산나트륨(sodium biocarbonate), 탄산칼슘(calcium carbonate) 등 기체를 형성하는 탄산염일 수 있고, 바람직하게는 상기 홍합접착단백질이 10-20 wt%로 용해되어 있는 용액에 2-5 wt%의 중탄산암모늄 용액을 첨가시켜서 수상에 도입할 수 있다.
상기 2) 단계는 상기 1) 단계에서 얻어진 에멀젼 내부의 홍합접착단백질에 포함된 도파 잔기를 산화반응을 통해 가교시키는 단계이다. 도파가 산화가 일어날 경우 도파-퀴논의 형태로 바뀌면서 도파-도파 결합을 유도하거나, 도파-퀴논이 주변의 아민(amine) 그룹 혹은 싸이올(thiol) 그룹과 결합하게 된다.
상기 3) 단계는, 상기 2) 단계의 가교된 에멀젼 입자를 세척하는 과정에서, 에멀젼 입자를 덮고 있던 오일 및 계면활성제가 제거되면서 마이크로입자를 구성하는 단백질 분자의 격자 내에 수분이 채워져 팽윤되고, 동시에 기공유도물질에 의한 기체 발생으로 기공이 생성되어 다공성 마이크로입자를 형성하는 단계이다.
상기 3) 단계에 있어서, 에멀젼 입자를 세척하기 위해 에탄올, 메탄올, 아이소프로필알콜, 아세톤, 염산, 수산화나트륨으로 구성된 군으로부터 1종 이상 선택하여 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.
상기 다공성 마이크로입자에 있어서, 생성되는 기공의 지름은 10 내지 50μm일 수 있고, 바람직하게는 20 내지 40μm일 수 있고, 더욱 바람직하게는 20 내지30μm일 수 있다. 또한, 이러한 다공성 마이크로입자의 공극률은 50 내지 95%일 수 있고, 바람직하게는 70 내지 95%일 수 있고, 더욱 바람직하게는 90 내지 95%일 수 있다.
상기 제조방법으로 제조된 본 발명의 다공성 마이크로입자는 기공 구조를 가지고 있어 세포를 기공 내부에 부착시킴으로써 더 많은 세포를 전달할 수 있으며, 분리된 기공 내부 미세 환경을 통해 외부환경으로부터 세포를 효과적으로 보호하고, 효과적인 유체 순환 및 산소, 영양소 공급이 가능하기 때문에 세포전달체, 조직공학용 지지체, 약물전달체 등의 다양한 생의학적 응용이 가능하다.
또한, 본 발명은 본 발명의 다공성 마이크로입자를 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 세포 전달 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 다공성 마이크로입자를 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 약물 전달 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 홍합 접착 단백질 기반의 다공성 마이크로입자 제조
홍합 접착 단백질 기반의 다공성 마이크로입자를 제조하기 위하여 하기와 같은 실험을 순차적으로 수행하였다. 본원 발명의 다공성 마이크로입자를 제조하기 위한 전체적인 실험의 개요를 도 1에 나타내었다.
1-1. 홍합 접착 단백질 fp -151의 생산
자연에 존재하는 홍합 접착 단백질 fp-1 중에서 80번 정도 반복되는 10개의 아미노산으로 구성된 데카펩타이드(decapeptide)가 대장균에서 발현될 수 있도록 6개의 데카펩타이드로 이루어진 fp-1 변이체를 합성하고, 2개의 fp-1 변이체 사이에 Mgfp-5의 유전자(Genbank No. AAS00463 또는 AY521220)를 넣은 후, 대장균에서 성공적으로 발현하도록 하였다. 이 후 아세트산을 이용한 정제 분리과정을 통해 홍합 접착 단백질 fp-151을 생산하였다 (D.S. Hwang et. al., Biomaterials 28, 3560-3568, 2007).
구체적으로 fp-1 (Genbank No. Q27409 또는 S23760)의 아미노산 서열에서, 서열번호 2로 표시되는 AKPSYPPTYK로 이루어진 펩타이드가 6회 반복 연결된 서열번호 3의 fp-1 변이체(이하, 6xAKPSYPPTYK라 함)를 제조하고 fp-5의 N-말단에 상기 6xAKPSYPPTYK을 조합하고 또한 fp-5의 C-말단에 6xAKPSYPPTYK를 조합하여 홍합 접착 단백질 fp-151을 제조하였다. 이는 대장균에서 성공적으로 발현하여 아세트산을 이용한 정제 분리과정을 통해 생산한 것이다. 상기 홍합 접착 단백질의 구체적 제조는 국제특허공개 제WO2006/107183호 또는 제WO2005/092920호에 나타낸 바와 동일하며, 상기 특허 문헌은 전체로서 참고문헌으로 본 발명에 포함된다. 제조된 fp-151을 서열번호 10에 나타내었다.
1-2. 도파 ( DOPA ) 수정반응
상기와 같이 제조된 홍합 접착 단백질 fp-151을 구성하는 타이로신 잔기를 도파로 전환시키기 위하여 타이로시나아제 효소(mushroom tyrosinase)를 이용하여 in vitro에서 수정 반응을 진행하였다. 구체적으로, 동결 건조된 홍합 접착 단백질 fp-151 150mg과 티로시나아제 5mg을 수정반응을 위한 버퍼 용액 (0.1M sodium phosphate, 20mM boric acid, 25mM ascorbic acid, pH 6.8) 100ml에 녹여서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 25% 아세트산 용액 3L를 이용하여 4시간 이상씩 3번 갈아주면서 투석을 시킨 후, 동결건조를 진행하였다. 홍합 접착 단백질 fp-151의 수정 효율을 분석하기 위하여 아미노산 조성 분석을 수행하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 도파 및 타이로신 잔기의 peak intensity를 통해 전체 타이로신 잔기 중 약 49.6%가 도파로 전환되었음을 확인하였다.
1-3. 미세유체채널에서 유중수 에멀전 (water-in-oil emulsion) 형성
상기 실시예 1-1을 통해 생산된 홍합 접착 단백질 fp-151를 이용하여 마이크로입자를 제조하기 위하여, 플루오르에틸렌 프로필렌-폴리이미드(FEP-PI) 성분으로 구성된 미세유체채널 및 NaIO4의 산화 작용을 통한 도파-도파 상호작용 기반의 가교반응을 이용하였다. 구체적으로, 수정된 fp-151를 10-20 wt%의 농도로 증류수에 녹인 후, NaIO4 용액을 도파:IO4 - 의 비율이 2:1이 되도록 넣은 후, 2-5 wt%의 중탄산암모늄과 함께 수상의 분산질(dispersed phase)로써, 1-2 wt%의 008-fluorosurfactant와 FC-40의 혼합액으로 오일상의 분산매(continuous phase)로써 도입하였다. 두 유체는 실린지 펌프를 이용하여 각각 10, 15 μL/min의 일정한 속도로 미세유체채널로 도입되었으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 약 260 μm의 지름을 갖는 균일한 유중수 에멀젼이 연속적으로 형성되는 것을 확인하였다. 상기 유중수 에멀젼(water-in-oil emulsion)은 홍합 접착 단백질, 산화제 및 기공유도물질(porogen)을 포함한다.
이후, 상기와 같이 제조된 에멀젼을 내부의 홍합 접착 단백질 fp-151에 포함된 도파 잔기의 산화반응을 통해 가교시키기 위하여 37℃ 에서 24시간 동안 보관하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4의 a는 에멀젼 형성 직후, b는 에멀젼 형성 후 12시간 경과, c는 에멀젼 형성 후 24시간 경과 시의 모습을 나타낸 것이다. 또한, 에멀젼 응축 과정에서 각 에멀젼 입자의 크기를 도식화한 그래프를 도 5에 나타내었다. 24시간 동안 응축 과정을 거친 에멀젼을 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 관찰한 결과를 도 6에 나타내었다.
도 4 내지 도 6에 나타낸 바와 같이, 도파 잔기의 산화반응을 통해 에멀젼이 가교됨에 따라 에멀젼의 크기는 작아지고, 색깔은 짙은 적갈색으로 변하면서 젤 형태의 응축된 에멀젼 입자를 얻을 수 있음을 확인하였다. 24시간의 가교 반응 이후 형성된 응축된 입자(microgel)는 최종적으로 약 80μm의 지름을 가지는 것을 확인하였다.
1-4. 홍합 접착 단백질 fp -151을 이용한 다공성 마이크로입자 형성
상기와 같이 가교된 에멀젼 입자를 에탄올, 아세톤 및 에탄올-염산 혼합액을 순차적으로 이용하여 세척하였다. 이 과정에서 에멀젼 입자를 덮고 있던 오일 및 계면활성제가 제거되면서 단백질 분자의 격자 내에 수분이 채워져 팽윤 되고, 동시에 기공유도물질에 의한 기체 발생으로 기공이 생성되어 다공성 마이크로입자가 형성되었다. 마이크로입자의 다공성 구조를 명확히 관찰하기 위하여 홍합 접착 단백질 fp-151에 각각 FITC 및 RITC를 결합하여 형광현미경 및 SEM으로 탐지하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 형성된 다공성 마이크로입자의 지름은 약 220 μm이며, 상기 다공성 마이크로입자는 기공이 서로 연결된 형태의 3차원 다공성 마이크로입자임을 확인하였다. 이에 따라, 상기 다공성 마이크로입자는 세포가 부착하여 효율적으로 증식할 수 있는 세포 지지체로 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 2. 홍합 접착 단백질 fp -151 기반 다공성 마이크로입자의 물리적, 화학적 특성 분석
2-1. 다공성 마이크로입자 표면의 FT- IR spectroscopy 분석
상기 실시예 1에서 제조한 홍합 접착 단백질 기반의 다공성 마이크로입자(MAP-PMS) 표면의 화학적 결합 양상을 확인하기 위해 FT-IR spectroscopy 분석을 진행하고 그 결과를 도 8에 나타내었다. 비교군으로는 수정된 fp-151(MAP)과 NaIO4를 처리한 fp-151(MAP+ NaIO4) 코팅 표면을 사용하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 다공성 마이크로입자의 경우 카테콜에 포함된 C-O 결합을 나타내는 1240 cm- 1 파장 부근에서 NaIO4를 처리한 fp-151 코팅 표면과 비슷한 양상의 피크를 나타냄을 확인하였다. 이로써, 도파가 산화제에 의해 도파-퀴논으로 변화되어 충분한 가교가 진행되어 마이크로입자를 형성한 것임을 확인하였다.
2-2. 다공성 마이크로입자 표면의 전하 측정
형성된 다공성 마이크로입자의 표면이 갖는 전하를 알아보기 위하여, pH 7.4의 PBS에 도입하여 제타전위(zeta potential)을 확인하였다. 비교군으로는, 수정된 fp-151을 1 mg/ml의 농도로 PBS에 녹인 용액과, 이에 NaIO4를 처리한 용액을 사용하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 다공성 마이크로입자가 NaIO4를 처리한 fp-151 용액과 비슷한 수준의 제타전위(약 +6 mV)를 갖는 것을 확인하였다.
2-3. 다공성 마이크로입자의 절단면의 기공 분포 분석
다공성 마이크로입자의 기공구조를 면밀히 관찰하기 위하여, 마이크로입자를 절단하여 SEM 및 마이크로-컴퓨터 단층촬영(micro-computed tomography, micro-CT)을 통해 분석하였다. 그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다.
도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 20-30 μm의 지름을 갖는 기공이 서로 연결된 형태로 존재하며, 공극율이 약 95%임을 확인하였다.
실시예 3. 홍합 접착 단백질 fp -151 기반 다공성 마이크로입자의 적용 가능성 확인
다공성 마이크로입자의 적용가능성을 확인하기 위하여 다공성 마이크로입자를 실린지에 도입하고 다공성 마이크로입자의 방출 양상을 관찰하였다. 또한, 다공성 마이크로입자를 주형을 이용하여 실린더 형태의 구조체로 제작하고, 동물조직의 피부 표면에서 알지네이트 마이크로입자와 함께 접착성을 확인하였다. 그 결과를 도 12 내지 15에 나타내었다.
도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같이, 마이크로입자는 형태를 유지하면서 실린지를 통해 외부로 주입될 수 있음을 확인하였다. 또한, 도 14에 나타낸 바와 같이 마이크로입자는 주형을 이용하여 실린더 형태의 구조체로 제작할 수 있음을 확인하였다. 또한, 도 15에 나타낸 바와 같이, 실린지를 통해 마이크로입자를 동물의 피부조직 표면에 적용한 결과, 수분 환경에서 알지네이트 마이크로입자 대조군 비해 높은 접착성을 발휘하여 여러 번의 세척 후에도 적용부위에서 부착되어 있음을 확인하였다. 이를 통해 상기 다공성 마이크로 입자가 조직 재생 및 회복이 필요한 부위에 효과적으로 적용 가능함을 확인하였다.
실시예 4. 홍합 접착 단백질 기반 다공성 마이크로입자의 in vitro 세포전달 특성 분석
4-1. 다공성 마이크로입자의 세포 부착 효율 확인
상기 실시예 1에서 제조한 홍합 접착 단백질 기반 다공성 마이크로입자의 세포전달체로서의 효능을 확인하기 위하여 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, rMSC), 치주인대 유래 줄기세포(periodontal ligament stem cell, hPDLC) 및 혈관내피세포(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)를 이용하여 in vitro 세포실험을 진행하였다. 구체적으로, 1 × 104개의 마이크로입자 당 5 × 104개의 각 세포를 혼합하여 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 각 마이크로입자의 세포 부착을 확인한 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 최초에 도입한 세포 수 대비 세포 부착 효율(cell loading efficiency)이 약 55-70%임을 확인하였다.
4-2. 다공성 마이크로입자의 각 세포에 대한 성장 양상 확인
다공성 마이크로입자의 배양 날짜에 따른 각 세포에 대한 성장 양상을 확인하였다. 구체적으로, 매일 각 세포-마이크로입자 복합체의 배지를 교체하면서 7일동안 배양하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었다. 또한, 이 중 중간엽 줄기세포의 다공성 마이크로입자에 대한 부착 및 성장을 보다 면밀히 관찰하기 위하여 다공성 마이크로입자에 부착 1일 경과 후 메틸렌블루 염색을 진행하고 광학현미경, SEM 관찰 및 형광 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 다공성 마이크로입자에 배양된 모든 세포의 효율적인 세포 증식을 확인하였다. 또한, 도 18에 나타낸 바와 같이, 세포의 활성이 유지되고(도 18의 a), 다공성 마이크로입자의 표면과 기공 표면에서 세포가 효율적으로 부착되어 증식되고 있음을 확인하였다(도 18의 b). 또한, 형광 염색을 통해 핵과 세포질의 액틴 섬유를 관찰한 결과 시간이 경과함에 따라 세포의 증식과 함께 퍼짐 양상이 활발해짐을 확인하였다(도 18의 c).
실시예 5. 홍합 접착 단백질 기반 다공성 마이크로입자의 최소 침습형 in vivo 생체 주입 특성 분석
상기 실시예 1에서 제조한 홍합 접착 단백질 기반 다공성 마이크로입자의 최소 침습형 생체 주입 특성을 확인하기 위하여, 1 × 105개의 FITC가 탐지된 마이크로입자를 PBS 용액에 혼합한 후, 5주령의 면역 결핍 누드 마우스(Balb/C Nude)의 피하에 주입하였다. 주입 당일 및 주입 28일 경과 후, in vivo 형광 이미지 장치를 이용하여 생체 내에서의 마이크로입자의 거동을 확인하였다. 그 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19에 나타낸 바와 같이, 마이크로입자가 최소 침습 방식으로 성공적으로 주입되어 28일 후에도 어느 정도 잔존하는 것을 확인하였다.
이에 따라, 본원 발명의 홍합 접착 단백질 기반의 접착성 마이크로입자는 실린지를 통한 최소 침습형 생체 주입으로 세포전달체로서 조직 손상 부위에 치료용 줄기세포를 효율적으로 전달할 수 있음을 확인하였다. 또한, 조직의 결함 부위의 크기에 알맞게 적용할 수 있는 조직공학용 지지체, 또는 약물 전달체 등으로 폭넓게 응용될 수 있음을 확인하였다.

Claims (21)

  1. 홍합 접착 단백질을 포함하는, 다공성 마이크로입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열이 연결된 융합 단백질인, 다공성 마이크로입자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질인, 다공성 마이크로입자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 전체 타이로신 잔기의 10 ~ 100%가 도파(DOPA)로 변형된 것을 특징으로 하는, 다공성 마이크로입자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 다공성 마이크로입자는 유중수 에멀젼(water-in-oil emulsion)으로부터 형성되는 것을 특징으로 하는, 다공성 마이크로입자.
  6. 제5항에 있어서, 상기 유중수 에멀젼은 홍합 접착 단백질에 포함된 도파 잔기의 산화반응에 의한 가교화를 통해 응축되는 것을 특징으로 하는, 다공성 마이크로입자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 다공성 마이크로입자는 공극률이 50 내지 95%인 것을 특징으로 하는, 다공성 마이크로입자.
  8. 제1항에 있어서, 상기 다공성 마이크로입자는 생체적합성을 가지는 것을 특징으로 하는, 다공성 마이크로입자.
  9. 제1항에 있어서, 상기 다공성 마이크로입자는 생리활성물질을 적재(loading) 또는 부착(attachment)하는 것을 특징으로 하는, 다공성 마이크로입자.
  10. 제9항에 있어서, 상기 생리활성물질은 세포, 단백질, 폴리펩타이드, 다당류, 단당류, 올리고당류, 지방산 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 생리활성물질인 것을 특징으로 하는, 다공성 마이크로입자.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세포는 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell), 지방질줄기세포(adipose stem cell), 조골세포(osteoblast), 치주인대세포(periodontal ligament cell), 혈관내피세포(vascular endothelial cell), 섬유세포(fibroblast), 간세포(hepatocyte), 신경세포(neurons), 암세포(cancer cell), B 세포 및 백혈구세포(white blood cell)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 세포인 것을 특징으로 하는, 다공성 마이크로입자.
  12. 제1항에 있어서, 상기 다공성 마이크로입자는 최소 침습형 생체 주입이 가능한 것을 특징으로 하는, 다공성 마이크로입자.
  13. 홍합 접착 단백질을 포함하는, 다공성 마이크로 입자 형성용 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 산화제 및 기공유도물질(porogen)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 다공성 마이크로 입자 형성용 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 산화제는 NaIO4 , NaIO3, VOSO4, Na3VO4, Na2Cr2O7, Mn(OAc)3, MnO2, KMnO4, Na2S2O8, H2O2, Na2S2O4, BHP(tert-butyl hydroperoxide) 및 DTT(dithiothreitol)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는, 다공성 마이크로 입자 형성용 조성물.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 다공성 마이크로입자를 포함하는 세포전달체.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 다공성 마이크로입자를 포함하는 조직공학용 지지체.
  18. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 다공성 마이크로입자를 포함하는 약물 전달체.
  19. 1) 미세유체채널 내부에서 홍합 접착 단백질, 산화제 및 기공유도물질(porogen)을 포함하는 유중수 에멀젼을 형성하는 단계;
    2) 홍합 접착 단백질에 포함된 도파 잔기의 산화를 통해 상기 유중수 에멀젼을 가교시키는 단계; 및
    3) 가교 후 얻어진 에멀젼 입자를 세척하고 기공을 형성시키는 단계를 포함하는, 다공성 마이크로입자의 제조방법.
  20. 제1항의 다공성 마이크로입자를 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 세포 전달 방법.
  21. 제1항의 다공성 마이크로입자를 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 약물 전달 방법.
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