KR20120013626A

KR20120013626A - 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자로 형성된 코아세르베이트

Info

Publication number: KR20120013626A
Application number: KR1020100075717A
Authority: KR
Inventors: 차형준; 최유성; 강동균; 송영훈; 임성혜; 최봉혁
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2010-08-05
Filing date: 2010-08-05
Publication date: 2012-02-15
Also published as: KR101250923B1

Abstract

본 발명은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자로 형성된 코아세르베이트의 신규한 용도에 대한 것으로, 구체적으로 홍합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 혼합하여 형성된 코아세르베이트를 이용한 생체활성물질 전달용 조성물 및 생체 활성물질 전달체에 관한 것이다. 본 발명에서 홍합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 혼합하여 형성된 코아세르베이트는 생체 활성물질을 봉입(encapsulation)할 수 있는 활성이 있으므로 생체활성물질 전달용 조성물의 유효성분으로 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자로 형성된 코아세르베이트{Coacervate formed from mussel adhesive proteins or mutants thereof and anionic polymer}

본 발명은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자로 형성된 코아세르베이트의 신규한 용도에 대한 것으로, 구체적으로 홍합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 혼합하여 형성된 코아세르베이트를 이용한 생체활성물질 전달용 조성물 및 생체 활성물질 전달체에 관한 것이다.

해양 생명체인 홍합(mussel)은 접착 단백질들(adhesive proteins)을 생산, 분비함으로써 홍합 자신을 바다 속의 바위와 같은 젖은 고체표면에 단단히 부착할 수 있어, 파도의 충격이나 바닷물의 부력 효과에 영향을 받지 않는다 (J.H. Waite 등, 1983, Biological Review 58, 209-231; H.J. Cha 등, 2008, Biotechnology Journal 3, 631-638).

홍합 접착 단백질은 현재 알려진 화학 합성 접착제와 비교하였을 때 강력한 자연 접착제로 알려져 있으며, 대부분 에폭시 수지보다 약 두 배 정도의 높은 인장강도를 나타내면서도 휘어질 수 있는 유연성을 가지고 있다.　또한 홍합 접착 단백질은 플라스틱, 유리, 금속, 테플론 및 생체물질 등의 다양한 표면에 접착할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 젖은 표면에 몇 분 안에 붙을 수 있다.　이러한 특성은 아직까지 화학접착제 분야에서는 미완의 과제로 남아있다. 또한 접착 단백질은 인간세포를 공격하거나 면역반응을 일으키지 않는 것으로 알려져 수술시 생체조직의 접착이나 부러진 치아의 접착 등의 의료분야에 응용 가능성이 크다 (J. Dove 등, 1986, Journal of American Dental Association 112, 879). 특히 상기 홍합 접착 단백질은 세포의 표면 접착 기술 분야에도 이용될 수 있는데, 세포의 표면 접착 기술은 세포 배양 및 조직 공학 분야에 필요한 매우 중요한 기술 중의 하나로, 즉 세포 및 조직 배양을 위해 세포를 세포배양 표면에 효율적으로 접착시키는 기술이므로 세포의 증식 및 분화를 촉진시키는 데 매우 중요하다 (M. Tirrell 등, 2002, Surf. Sci., 500, 61-83).

한편, 코아세르베이트는 음이온성 고분자 전해질과 양이온성 고분자 전해질이 특정 조건에서 혼합되었을 때 형성되는 콜로이드 물질의 일종으로, 코아세르베이트가 형성되었을 때 용액의 흡광도는 증가하게 되고, 용액 상에서 동그란 구 형태로 외부 용액과 분리되어 존재한다. 코아세르베이트 형성 시, 참여 전해질은 용액에서 분리되어 응축되고 여전히 액상을 띠게 되며, 이때 표면장력이 줄어들고 점성이 늘어나는 등, 물성도 변화한다. 코아세르베이트는 단백질과 그 반대 성질을 띠는 고분자 전해질과의 혼합을 통해서도 일어날 수 있다 (C.G. de Kruif 등, 2004, Current Opinion in Colloid and Interface　Science 9, 340-349). 코아세르베이트의 낮은 표면장력에 기인해 약물, 효소, 세포, 식품첨가물 등의 기능성 물질을 미세캡슐 안에 고정화 하는데 쓰이는 기술도 보고되어 있다. (Schmitt C. 등, 1998, Critical Review in Food Science and Nutrition 8, 689-753).

그러나 홍합접착단백질로부터 코아세르베이트를 형성한 연구는 전혀 없으며 아울러 홍합접착단백질을 생체 활성물질 전달용으로 사용하기 위한 연구도 전혀 없다.

이에 본 발명자들은 양이온성인 홍합 접착 단백질과 음이온성 고분자를 혼합하는 경우 코아세르베이트가 형성되고 이를 통하여 생체 활성물질을 전달하는데 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합되어 형성된 코아세르베이트(coacervate)를 포함하는 생체활성물질 전달용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 (a) 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합되어 형성된 코아세르베이트 및 생체 활성물질을 포함하고, (b) 상기 코아세르베이트의 내부에 상기 생체 활성물질이 봉입된 것을 특징으로 하는 생체 활성물질 전달체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 (a) 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합되어 형성된 코아세르베이트 및 생체 활성물질을 혼합하는 단계 및 (b) 상기 코아세르베이트가 생체 활성물질 주위에 피막을 형성하는 단계를 포함하는 생체 활성물질 전달체의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합되어 형성된 코아세르베이트(coacervate)를 포함하는 생체활성물질 전달용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합되어 형성된 코아세르베이트 및 생체 활성물질을 포함하고, (b) 상기 코아세르베이트의 내부에 상기 생체 활성물질이 봉입된 것을 특징으로 하는 생체 활성물질 전달체를 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합되어 형성된 코아세르베이트 및 생체 활성물질을 혼합하는 단계 및 (b) 상기 코아세르베이트가 생체 활성물질 주위에 피막을 형성하는 단계를 포함하는 생체 활성물질 전달체의 제조방법을 제공한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에서 홍합 접착 단백질은 홍합에서 유래된 접착 단백질로, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 국제공개번호 제WO2006/107183A1호 또는 제WO 2005/092920호에 기재된 모든 홍합 접착 단백질을 포함한다.

바람직하게는 상기 홍합 접착 단백질은 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드, (b) 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드, (c) 서열번호 6의 아미노산 서열이 1 내지 10회 연속하여 연결된 폴리펩타이드 및 (d) 상기 (a)의 폴리펩타이드, (b)의 폴리펩타이드 및 상기 (c)의 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 이종 이상이 융합된 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 (c)에서 폴리펩타이드는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다. 또한 상기 (d)에서 융합된 폴리펩타이드는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다.

본 발명에서 홍합 접착 단백질의 변이체(mutants)는 바람직하게는 홍합 접착 단백질의 접착력을 유지하는 전제하에 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실말단이나 아미노말단에 추가적인 서열을 포함하거나 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실말단 또는 아미노말단에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것이거나 홍합 접착 단백질을 이루는 타이로신 잔기 총수의 1 내지 100%, 바람직하게는 5 내지 100%가 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)로 치환된 것일 수 있다.

상기 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 RGD(Arg Gly Asp, 서열번호 8), RGDS(Arg Gly Asp Ser, 서열번호 9), RGDC(Arg Gly Asp Cys, 서열번호 10), RGDV(Arg Gly Asp Val, 서열번호 11), RGDSPASSKP(Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro, 서열번호 12), GRGDS(Gly Arg Gly Asp Ser, 서열번호 13), GRGDTP(Gly Arg Gly Asp Thr Pro, 서열번호 14), GRGDSP(Gly Arg Gly Asp Ser Pro, 서열번호 15), GRGDSPC(Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys, 서열번호 16) 및 YRGDS(Tyr Arg Gly Asp Ser, 서열번호 17)로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상일 수 있다.

상기 홍합 접착 단백질의 카르복실말단 또는 아미노말단에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 홍합 접착 단백질의 변이체는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다.

본 발명에서의 상기 홍합 접착 단백질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 외부 유전자를 발현할 수 있는 용도로 제작된 통상의 벡터에 발현 가능하도록 삽입하여, 유전공학적인 방법으로 대량 생산할 수 있다. 상기 벡터는 단백질을 생산하기 위한 숙주세포의 종류 및 특성에 따라 적절히 선택하거나, 신규로 제작할 수 있다. 상기 벡터를 숙주세포에 형질전환하는 방법 및 형질전환체로부터 재조합 단백질을 생산하는 방법은 통상의 방법으로 용이하게 실시할 수 있다. 상기한 벡터의 선택, 제작, 형질전환 및 재조합 단백질의 발현 등의 방법은, 본원발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시할 수 있으며, 통상의 방법에서 일부의 변형도 본원발명에 포함된다.

본 발명에서 음이온성 고분자는 상기 양이온성인 홍합 접착 단백질과 결합하여 코아세르베이트를 형성할 수 있는 고분자 물질이라면 제한없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 상기 양이온성인 홍합 접착 단백질의 pI (Isoelectric point)보다 낮은 고분자, 더 바람직하게는 pI 수치가 2 내지 6인 고분자, 보다 더 바람직하게는 pI 수치가 2 내지 4인 고분자일 수 있다. 상기 pI 수치를 초과하거나 미만인 경우 코아세르베이트가 형성되기 어려우므로 상기 pI 범위내의 음이온성 고분자를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 음이온성 고분자는 예를 들면, 히아루론산(hyaluronic acid), 페레독신(ferredoxin), 폴리스티렌술폰산(poly styrene sulfonic acid), 아라비아 검(gum arabic), 젤라틴(gelatin), 알부민(albumin), 카보폴(carbopol), 고 또는 저 메톡실 펙틴(high or low methoxyl pectin), 카르복시메틸 구아검 나트륨(sodium carboxymethyl guar gum), 잔탄 검(xanthan gum), 유청 단백질(whey protein), 레구민(faba bean legumin), 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 알긴산(alginate), 캐러지넌(carrageenan), 헥사메타인산 나트륨(sodium hexametaphosphate), 카제인 나트륨(sodium casinate), 헤모글로빈(hemoglobin), 헤파린(heparin) 및 세포외 다당체 B40(exopolysaccharide B40)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 상기 음이온성 고분자의 평균 분자량은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 1kDa 내지 300kDa으로 이루어진 군에서 선택된 분자량을 가질 수 있으며 보다 바람직하게는 10kDa 내지 100kD, 더 바람직하게는 17kDa 내지 59kDa, 가장 바람직하게는 17kDa, 35kDa 또는 59kD의 분자량을 가질 수 있다. 상기 분자량을 초과하거나 미만인 경우 코아세르베이트가 형성되지 않을 수 있기 때문이다.

본 발명에서 생체 활성물질은 생체에 투여되거나 피부 표면에 도포할 경우 일정한 약리 활성을 나타내는 물질로, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 약물, 효소, 세포 및 식품첨가물로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상일 수 있으며, 보다 바람직하게는 항암제, 항생제, 항염증제, 호르몬, 호르몬 길항제, 인터루킨, 인터페론, 성장 인자, 종양 괴사 인자, 엔도톡신, 림포톡시, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 프로테아제 저해제, 알킬포스포콜린, 방사선 동위원소 표지 물질, 계면활성제, 심혈관계 약물, 위장관계 약물 및 신경계 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 항염증제로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 덱사메타손(dexamethasone)일 수 있다.

본 발명에서 코아세르베이트는 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자가 결합하여 형성된 콜로이드의 일종을 말한다. 즉 본 발명에서 코아세르베이트는 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합되어 형성되는 것이다.

본 발명에서 코아세르베이트는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 수용성 용매, 보다 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 아세톤, 아세트산 수용액에서 제조될 수 있으며, 더 바람직하게는 아세트산 수용액, 보다 더 바람직하게는 0.1% 내지 10%의 아세트산 수용액, 더욱 더 바람직하게는 0.5 내지 8%의 아세트산 수용액에서 형성될 수 있다.

상기 용매에서 상기 코아세르베이트를 제조하는 경우 적정 pH는 이에 한정되지만 바람직하게는 pH 2.0 내지 pH 10.0일 수 있으며, 보다 바람직하게는 pH 2.0 내지 pH 6.0일 수 있으며, 더 바람직하게는 pH 2.5 내지 pH 5.5일 수 있다. 상기 pH를 초과하거나 미만인 경우 코아세르베이트가 형성되지 않거나 고분자의 변형이 발생할 수 있기 때문이다. 상기 용매에 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체 및 음이온성 고분자의 첨가량은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 각각 용매 전체 부피 대비 0.001 내지 100%(w/v)일 수 있으며 보다 더 바람직하게는 0.01 내지 30 %(w/v)일 수 있다.

본 발명에서 코아세르베이트는 이에 한정되지만 바람직하게는 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자를 1:0.01 내지 1:10의 중량비로 혼합하여 형성될 수 있으며, 보다 바람직하게는 1:0.25 내지 1:2.5의 중량비로, 더 바람직하게는 1:0.25 내지 1:2.33의 중량비로 혼합하여 형성될 수 있다. 상기 혼합비를 초과하거나 미만인 경우 코아세르베이트가 효과적으로 형성되지 않을 수 있기 때문이다.

본 발명에서 코아세르베이트 형성시 적정 온도는 4 내지 100℃일 수 있으며 바람직하게는 10 내지 60℃일 수 있으며, 상기 온도를 초과하거나 미만인 경우 코아세르베이트가 형성되지 않거나 고분자의 변형이 발생할 수 있기 때문이다.

상기와 같이 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체 및 음이온성 고분자를 혼합하여 형성된 코아세르베이트는 생체 활성물질을 효과적으로 전달할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서 홍합 접착 단백질 또는 그의 변이체와 히아루론산, 또는 헤파린을 혼합하여 형성된 코아세르베이트, 보다 더 바람직하게는 서열번호 1 또는 3의 폴리펩타이드로 이루어진 홍합 접착 단백질 또는 서열번호 2의 변이체에 히아루론산이나 헤파린을 혼합하여 코아세르베이트를 형성하고 이를 생체 활성물질의 예로 고추씨 기름를 추가 혼합한 결과, 상기 코아세르베이트가 고추씨기름 주위에 피막을 형성함을 알 수 있다.

따라서 본 발명의 생체 활성물질 전달용 조성물은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합되어 형성된 코아세르베이트(coacervate)를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 생체 활성물질 전달용 조성물은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 약학적 조성물의 형태일 수 있다.

본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 코아세르베이트를 0.0001 내지 50 중량%로 포함한다. 본 발명의 조성물은 상기 유효성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 코아세르베이트 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 코아세르베이트를 포함하는 조성물은 정맥내(intravein), 복막내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 생체 내 전달될 수 있다. 투여량은 대상의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 약 0.1 내지 100 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.5 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

한편 본 발명의 생체 활성물질 전달체는 (a) 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합되어 형성된 코아세르베이트 및 생체 활성물질을 포함하고, (b) 상기 코아세르베이트의 내부에 상기 생체 활성물질이 봉입된 것을 특징으로 한다.

상기 생체 활성물질 전달체는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 마이크로 캡슐일 수 있다.

상기 코아세르베이트는 이에 한정되지 않지만 앞서 기재한 바와 같이, 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자를 pH 2.0 내지 pH 10.0에서 1:0.01 내지 1:10의 중량비로 혼합되어 형성될 수 있다.

상기 코아세르베이트는 생체 활성물질, 예를 들어 고추씨기름 주위에 피막을 형성하여, 코아세르베이트 내부에 상기 생체 활성물질을 효과적으로 봉입할 수 있어, 생체 활성물질 전달체인 마이크로 캡슐을 형성할 수 있다. 나아가 상기와 같이 형성된 장시간이 경과하여도 그 형태를 유지하는 특성이 있다.(<실시예 2> 참조)

상기와 같이 형성된 생체 활성물질 전달체의 크기는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 지름기준으로 1 내지 50um 수 있다.

본 발명의 생체 활성물질 전달체는 코아세르베이트의 내부에 생체 활성물질이 소수성이든 친수성이든 관계없이 봉입이 가능하므로, 소수성 또는 친수성 생체 활성물질을 효과적으로 봉입함으로써 생체 활성물질을 효과적으로 전달할 수 있다. 상기 생체 활성물질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 상기 코아세르베이트의 내부에 분산 형태나 코어 형태로 봉입될 수 있다. 상기 봉입은 생체 활성물질의 주변에 피막을 형성함으로써 생체 활성물질을 encapsulation하는 것을 말한다.

본 발명의 생체 활성물질 전달체는 약학적 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있으며, 이에 대해서는 앞서 기재한 것과 같다.

한편 본 발명의 생체 활성물질 전달체의 제조방법은 (a) 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자 및 생체 활성물질을 혼합하는 단계 및 (b) 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체 및 음이온성 고분자에 의해 형성된 코아세르베이트가 생체 활성물질 주위에 피막을 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 (a) 단계에서 혼합은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자 및 생체 활성물질을 동시에 혼합하는 경우를 의미하거나 보다 바람직하게는 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자중 어느 하나가 녹아있는 용액에 생체 활성물질을 혼합하고, 이후 코아세르베이트 형성을 유도하기 위해 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자중 나머지 하나를 추가 혼합하는 경우를 의미한다.

구체적으로 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자의 혼합비는 앞서 기재한 바와 동일하다. 또한, 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 앞서 기재한 적정 pH로 설정된 용매에 0.0001 내지 50 중량%로 혼합할 수 있다. 또한 상기 (a) 단계에서 혼합시 생체 활성물질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 앞서 기재한 적정 pH로 설정된 용매에 부피대비 0.01 내지 20%(v/v), 보다 더 바람직하게는 0.1내지 2%(v/v)로 혼합하는 것이 바람직하다.

상기 생체 활성물질 전달체를 제조하기 위한 용매의 종류, 적정 pH, 적정 온도는 앞서 기재한 코아세르베이트가 효과적으로 형성될 수 있는 조건과 동일하다.

구체적으로 적정 용매는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 수용성 용매, 보다 바람직하게는 인산염 수용액 또는 아세트산 수용액에서 제조될 수 있으며, 더 바람직하게는 아세트산 수용액, 보다 더 바람직하게는 0.1% 내지 10%의 아세트산 수용액, 더욱 더 바람직하게는 0.5 내지 8%의 아세트산 일 수 있다.

적정 pH는 이에 한정되지만 바람직하게는 pH 2.0 내지 pH 10.0일 수 있으며, 보다 바람직하게는 pH 2.0 내지 pH 6.0일 수 있으며, 더 바람직하게는 pH 2.5 내지 pH 5.5일 수 있다. 상기 pH를 초과하거나 미만인 경우 코아세르베이트가 형성되지 않거나 고분자의 변형이 발생되므로 생체 활성물질 전달체가 효과적으로 형성될 수 없기 때문이다.

또한 적정 온도는 4 내지 100℃일 수 있으며 바람직하게는 10 내지 60℃일 수 있으며, 상기 온도를 초과하거나 미만인 경우 코아세르베이트가 형성되지 않거나 고분자의 변형이 발생할 수 있기 때문이다.

본 발명에서 홍합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 혼합하여 형성된 코아세르베이트는 생체 활성물질을 봉입(encapsulation)할 수 있는 활성이 있으므로 생체활성물질 전달용 조성물의 유효성분으로 효과적으로 이용될 수 있다.

도 1은 홍합 접착 단백질인 fp-151과 음이온성 고분자인 히아루론산(17kDa)을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 2는 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(17kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 3은 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산(17kDa)을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 4는 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산(17kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 5는 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD와 히아루론산(17kDa)을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 6은 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD와 히아루론산(17kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 7은 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(35kDa)을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 8은 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(35kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 9는 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(59kDa)을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 10은 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(59kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 11은 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산(35kDa)을 pH 3.8의 아세트산 용액에서 80:20으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 12는 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산(59kDa)을 pH 3.8의 아세트산 용액에서 80:20으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 13은 홍합 접착 단백질 fp-151과 헤파린을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 14는 홍합 접착 단백질 fp-131과 헤파린을 다양한 pH의 아세트산 용액에서 80:20으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 15은 홍합 접착 단백질 fp-131과 페레독신을 pH 4.5의 아세트산 용액에서 70:30으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 16은 홍합 접착 단백질 fp-5과 히아루론산(35kDa)을 pH 4.6의 아세트산 용액에서 80:20으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 17는 홍합 접착 단백질 fp-5과 히아루론산(35kDa)을 pH 4.6에서 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 18은 홍합접착 단백질 fp-151과 히아루론산(35kDa)을 이용한 코아세르베이트와 홍합접착 단백질 fp-131과 히아루론산(35kDa)을 이용한 코아세르베이트를 이용해 고추씨기름을 미세캡슐안에 고정화한 결과이다.
도 19는 도 18에서 형성된 미세캡슐이 8일 동안 유지되는지 여부를 확인한 결과이다.
도 20은 홍합접착 단백질 fp-151과 헤파린을 이용한 코아세르베이트를 이용해 고추씨기름을 미세캡슐 안에 고정화한 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 참조예 1>

홍합 접착 단백질의 제조

<1-1> 홍합 접착 단백질 fp -151의 제조

상기 홍합 접착 단백질 fp-151은 자연에 존재하는 홍합 접착 단백질 fp-1 중에서 80번 정도 반복되는 10개의 아미노산으로 구성된 데카펩타이드(decapeptide)가 대장균에서 발현될 수 있도록 6개의 데카펩타이드로 이루어진 fp-1 변이체를 합성하고 2개의 fp-1 변이체 사이에 Mgfp-5의 유전자(Genbank No. AAS00463 또는 AY521220)를 넣은 후, 대장균에서 생산한 것이다 (D.S. Hwang et. al., Biomaterials 28, 3560-3568, 2007).

구체적으로 fp-1 (Genbank No. Q27409 또는 S23760)의 아미노산 서열에서, 서열번호 6으로 표시되는 AKPSYPPTYK로 이루어진 펩타이드가 6회 반복 연결된 서열번호 7의 fp-1 변이체(이하, 6xAKPSYPPTYK라 함)를 제조하고 Mgfp-5의 N-말단에 상기 6xAKPSYPPTYK을 조합하고 또한 Mgfp-5의 C-말단에 6xAKPSYPPTYK를 조합하여 서열번호 1의 fp-151을 제조하였다.

<1-2> 홍합 접착 단백질 fp -151- RGD 의 제조

상기 <실시예 1-1>의 fp-151의 C-말단에 피브로넥틴(fibronectin) RGD 그룹에서 선택된 GRGDSP 서열을 추가하여 서열번호 2의 fp-151-RGD를 제조하였다.

<1-3> 홍합 접착 단백질 fp -131의 제조

홍합 접착 단백질 fp-131은 상기 <실시예 1-1>의 fp-151과 마찬가지 방식으로 2개의 fp-1 변이체 사이에 자연에 존재하는 홍합 접착 단백질 Mgfp-3A의 유전자(Genbank No. BAB16314 또는 AB049579)를 넣은 후, 대장균에서 생산한 것이다.

구체적으로 fp-1 (Genbank No. Q27409 또는 S23760)의 아미노산 서열에서, 서열번호 6으로 기재되는 AKPSYPPTYK로 이루어진 펩타이드가 6회 반복 연결된 서열번호 7의 fp-1 변이체(이하, 6xAKPSYPPTYK라 함)를 제조하고 Mgfp-3의 N-말단에 상기 6xAKPSYPPTYK을 조합하고 또한 Mgfp-3의 C-말단에 6xAKPSYPPTYK를 조합하여 서열번호 3의 fp-131을 제조하였다.

<1-4> 홍합 접착 단백질 fp -5의 제조

홍합 접착 단백질 fp-5은 자연에 존재하는 홍합 접착 단백질 Mgfp-5의 유전자(Genbank No. AAS00463 또는 AY521220)를 대장균에서 생산한 것이다(D.S. Hwang et. al., applied and environmental microbiology, 3352-3359, 2004).

< 실시예 1>

홍합 접착 단백질을 이용한 코아세르베이트(coacervate)의 형성

코아세르베이트(coacervate)는 특정 pH조건에서 특정 비율로 음이온성 전해질 고분자와 양이온성 전해질 고분자를 혼합함으로써 생성된 콜로이드의 일종이다. 상기 코아세르베이트가 형성되면 용액의 흡광도가 증가되기 때문에 코아세르베이트 의 형성 여부를 확인하기 위해 주로 흡광도를 측정하게 된다(V. Ducel et. al., Colloids and Surfaces a-Physicochemical and Engineering Aspects, 232, 239-247, 2004). 하기 실시예는 상기 참조예에서 제조된 홍합 접착단백질과 음가 전해질 고분자를 혼합한 경우 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인한 것이다.

<1-1> 홍합 접착 단백질 fp -151과 히아루론산(17 kDa )을 이용한 코아세르베이트 형성

상기 <참조예 1-1>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-151과 음가 전해질 고분자인 히아루론산(hyaluronic acid)을 혼합한 경우 코아세르베이트가 형성되는지 확인하였다.

구체적으로 17kDa의 분자량을 지닌 히아루론산(Lifcore Biomedical; Minesota, 미국)을 0.05%(w/v) 농도로 5% 아세트산(수산화나트륨으로 pH 조절)에 녹이고, 상기와 동일한 용액에 녹인 홍합 접착 단백질 fp-151을 용질(홍합 접착 단백질 및 히아루론산) 부분에서 차지하는 비율을 10%(w/w)씩 상승시키면서 혼합하였다. 상기 혼합 후, UV-spectrphotometer (Optizen 3220UVbio, Mecasys, 대전, 한국)를 이용해 600nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그 결과를 도 1에 기재하였다.

상기 도 1에 기재된 바와 같이, pH 2.5에서 fp-151과 히아루론산(17kDa)의 중량비가 58:42, pH 3.0에서 63:37, pH 3.5에서 68:32일 때 코아세르베이트가 가장 잘 형성됨을 알 수 있었다.

또한 상기 흡광도의 증가가 코아세르베이트의 형성에 의한 것인지를 현미경 사진을 통해 확인하고 그 결과를 도 2에 기재하였다.

상기 도 2에 기재된 바와 같이, 10 μm 정도 크기의 원형체가 형성된 것을 확인할 수 있었으며, 이는 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(17kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트임을 알 수 있었다.

<1-2> 홍합 접착 단백질 fp -131과 히아루론산(17 kDa )을 이용한 코아세르베이트 형성

상기 <참조예 1-3>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-131을 사용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 3 및 도 4에 기재하였다.

상기 도 3 및 도 4에 기재된 바와 같이, fp-131과 히아루론산 (17kDa)의 중량비가 pH 2.5에서 41:59, pH 3.0에서 56:44, pH 3.5에서 59:41에서 코아세르베이트가 가장 잘 형성됨을 확인할 수 있었다.

<1-3> 홍합 접착 단백질 fp -151- RGD 와 히아루론산(17 kDa )을 이용한 코아세르베이트 형성

상기 <참조예 1-2>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD를 사용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 5 및 도 6에 기재하였다.

상기 도 5 및 도 6에 기재된 바와 같이, fp-151-RGD와 히아루론산의 (17kDa) 중량비가 pH 2.5에서 60:40, pH 3.0에서 70:30, pH 3.5에서 73:27에서 코아세르베이트가 가장 잘 형성됨을 확인할 수 있었다. 특히 fp-151보다 fp-151-RGD를 이용한 경우 흡광도가 보다 많이 증가하므로 코아세르베이트 보다 잘 형성됨을 알 수 있었다.

<1-4> 홍합 접착 단백질 fp -151과 히아루론산(35 kDa )을 이용한 코아세르베이트 형성

히아루론산(35kDa)을 사용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 7 및 도 8에 기재하였다.

상기 도 7 및 도 8에 기재된 바와 같이, fp-151과 히아루론산 (35kDa)의 중량비가 pH 2.5에서 59:41, pH 3.0에서 70:30, pH 3.5에서 77:27에서 코아세르베이트가 가장 잘 형성됨을 확인할 수 있었다. 특히 17kDa 히아루론산보다 35kDa 히아루론산을 이용한 경우 흡광도가 보다 많이 증가하므로 코아세르베이트 보다 잘 형성됨을 알 수 있었다.

<1-5> 홍합 접착 단백질 fp -151과 히아루론산(59 kDa )을 이용한 코아세르베이트 형성

히아루론산(59kDa)을 사용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 9 및 도 10에 기재하였다.

상기 도 9 및 도 10에 기재된 바와 같이, fp-151과 히아루론산 (59kDa)의 중량비가 pH 2.5에서 62:38, pH 3.0에서 71:29, pH 3.5에서 75:25에서 코아세르베이트가 가장 잘 형성됨을 확인할 수 있었다. 특히 17kDa 히아루론산보다 59kDa 히아루론산을 이용한 경우 흡광도가 보다 많이 증가하므로 코아세르베이트 보다 잘 형성됨을 알 수 있었다.

<1-6> 홍합 접착 단백질 fp -131과 페레독신을 이용한 코아세르베이트 형성

홍합 접착 단백질로 상기 <참조예 1-3>에서 제조된 fp-131을 사용한 것을 제외하고는 상기 fp-131과 페레독신의 중량비가 pH 4.5에서 70:30일 때, <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 17에 기재하였다.

상기 도 15에 기재된 바와 같이, 홍합 접착 단백질 fp-131과 페레독신(ferredoxin)을 이용한 경우 코아세르베이트가 형성됨을 알 수 있었다.

<1-7> 홍합 접착 단백질 fp -131과 히아루론산(35 kDa )을 이용한 코아세르베이트 형성

상기 <참조예 1-3>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-131을 사용한 것을 제외하고는 상기 fp-131과 히아루론산(35kDa)의 중량비가 pH 3.8에서 80:20일 때, <실시예 1-5>와 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 11에 기재하였다.

<1-8> 홍합 접착 단백질 fp -131과 히아루론산(59 kDa )을 이용한 코아세르베이트 형성

상기 <참조예 1-3>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-131을 사용한 것을 제외하고는 상기 fp-131과 히아루론산(59kDa)의 중량비가 pH 3.8에서 80:20일 때, <실시예 1-6>과 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 12에 기재하였다.

<1-9> 홍합 접착 단백질 fp -151과 헤파린( heparin )을 이용한 코아세르베이트 형성

헤파린(heparin, sigma)과 fp-151의 흡광도 측정 실험이 pH 4.0, pH 5.0, pH 5.5에서 각각 수행되었다. 헤파린을 0.02%(w/v)의 농도로 상기 pH를 지니는 100mM sodium acetate buffer에 녹이고, 동일한 용액에 녹인 fp-151을 10%씩 비율 변화로 10~90%까지 혼합하고 흡광도를 특정하여 그 결과를 도 13 및 도 14에 기재하였다.

상기 도 13 및 도 14에 기재된 바와 같이, fp-151과 헤파린의 중량비가 pH 5.0에서 90:10인 경우 흡광도가 가장 높았으며, 도 14에서 코아세르베이트가 형성됨을 확인하였다.

<1-10> 홍합 접착 단백질 fp -5과 히아루론산(35 kDa )을 이용한 코아세르베이트 형성

상기 <참조예1-4>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-5를 사용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 1-4>와 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 16 및 도 17에 기재하였다.

상기 도 16 및 도 17에 기재된 바와 같이, fp-5과 히아루론산 (35kDa)의 중량비가 pH 4.6에서 80:20로 혼합하였을 때 흡광도가 가장 많이 증가됨을 알 수 있었다.

< 실시예 2>

코아세르베이트의 미세캡슐 형성 활성

<2-1> 홍합 접착 단백질 fp -151과 히아루론산(35 kDa )에 의해 형성된 코아세르베이트의 미세캡슐 형성 활성

수산화나트륨으로 pH 3.8로 맞춘 100mM 아세테이트 버퍼에 fp-151을 10g/L로 녹인 다음, 최종부피의 1%양의 고추씨기름을 더해 이를 유화하기 위해 10분 동안 교반하였다. 상기 교반 후, 히아루론산을 fp-151과 질량비가 8:2(fp-151: 히아루론산)가 되도록 고추씨기름의 유화액에 히아루론산(35kDa)을 추가적으로 첨가하였다.

상기 첨가 후, 미세캡슐이 형성되는지 여부를 고추씨 기름이 띄는 형광을 이용하여 형광현미경(Olympus)을 통해 확인하고 그 결과를 도 18에 기재하였다. 또한 8일 경과할 때까지 미세캡슐이 유지되는지 여부를 확인하여 그 결과를 도 19에 기재하였다.

상기 도 18 및 도 19에 기재된 바와 같이, 홍합 접착 단백질과 히아루론산에 의해 형성된 코아세르베이트는 미세캡슐을 형성할 수 있는 활성이 있으며, 특히 상기와 같이 형성된 미세캡슐이 8일이 경과하여도 그대로 유지됨을 알 수 있다.

<2-2> 홍합 접착 단백질 fp -131과 히아루론산(35 kDa )에 의해 형성된 코아세르베이트의 미세캡슐 형성 활성

홍합 접착 단백질로 fp-131을 이용한 것을 제외하고 상기 <실시예 2-1>과 동일한 방법으로 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산(35kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 미세캡슐 형성 활성이 있는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 18 및 도 19에 기재하였다.

<2-3> 홍합 접착 단백질 fp -151과 헤파린에 의해 형성된 코아세르베이트의 미세캡슐 형성 활성

히아루론산 대신 헤파린을 이용한 것과 fp-151과 헤파린의 질량비가 9:1이 되도록 한 것을 제외하고 상기 <실시예 2-1>과 동일한 방법으로 홍합 접착 단백질 fp-151과 헤파린에 의해 형성된 코아세르베이트의 미세캡슐 형성 활성이 있는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 20에 기재하였다.

<110> POSTECH Foundation <120> Coacervate formed from mussel adhesive proteins or mutants thereof and anionic polymer <130> DPP20103801KR <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-151 <400> 1 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu 50 55 60 Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser 65 70 75 80 Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys 85 90 95 Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly 100 105 110 Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr 115 120 125 Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 130 135 140 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Thr Tyr Lys 195 <210> 2 <211> 202 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-151-RGD <400> 2 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu 50 55 60 Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser 65 70 75 80 Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys 85 90 95 Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly 100 105 110 Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr 115 120 125 Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 130 135 140 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Thr Tyr Lys Gly Arg Gly Asp Ser Pro 195 200 <210> 3 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-131 <400> 3 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp Ala 50 55 60 Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly 65 70 75 80 Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn 85 90 95 Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Gly Ser Ala 100 105 110 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 115 120 125 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 130 135 140 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 145 150 155 160 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Leu 165 170 <210> 4 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-3 <400> 4 Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly 1 5 10 15 Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp 20 25 30 Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 <210> 5 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-5 <400> 5 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His 1 5 10 15 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser 65 70 75 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment sequence derived from FP-1 <400> 6 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-1 <400> 7 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 50 55 60 <210> 8 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 1 <400> 8 Arg Gly Asp 1 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 2 <400> 9 Arg Gly Asp Ser 1 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 3 <400> 10 Arg Gly Asp Cys 1 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 4 <400> 11 Arg Gly Asp Val 1 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 5 <400> 12 Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro 1 5 10 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 6 <400> 13 Gly Arg Gly Asp Ser 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 7 <400> 14 Gly Arg Gly Asp Thr Pro 1 5 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 8 <400> 15 Gly Arg Gly Asp Ser Pro 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 9 <400> 16 Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 10 <400> 17 Tyr Arg Gly Asp Ser 1 5

Claims

홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합되어 형성된 코아세르베이트(coacervate)를 포함하는 생체활성물질 전달용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드,
(b) 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드,
(c) 서열번호 6의 아미노산 서열이 1 내지 10회 연속하여 연결된 폴리펩타이드 및
(d) 상기 (a)의 폴리펩타이드, (b)의 폴리펩타이드 및 상기 (c)의 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 이종 이상이 융합된 폴리펩타이드로
이루어진 군에서 선택된 일종 이상인 생체활성물질 전달용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 (c)의 폴리펩타이드는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 것인 생체활성물질 전달용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 (d) 융합된 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것인 생체활성물질 전달용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질의 변이체는, 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실말단(carboxyl-terminal) 또는 아미노말단(amino-terminal)에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것인 생체활성물질 전달용 조성물.
제5항에 있어서, RGD를 포함하는 폴리펩타이드는 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상인 것인 생체활성물질 전달용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질의 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드인 생체활성물질 전달용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질의 변이체는 홍합 접착 단백질을 이루는 타이로신 잔기 총수의 1 내지 100%가 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)로 치환된 것인 생체활성물질 전달용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 음이온성 고분자는 히아루론산(hyaluronic acid), 페레독신(ferredoxin), 폴리스티렌술폰산(poly styrene sulfonic acid), 아라비아 검(gum arabic), 젤라틴(gelatin), 알부민(albumin), 카보폴(carbopol), 고 또는 저 메톡실 펙틴(high or low methoxyl pectin), 카르복시메틸 구아검 나트륨(sodium carboxymethyl guar gum), 잔탄 검(xanthan gum), 유청 단백질(whey protein), 레구민(faba bean legumin), 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 알긴산(alginate), 캐러지넌(carrageenan), 헥사메타인산 나트륨(sodium hexametaphosphate), 카제인 나트륨(sodium casinate), 헤모글로빈(hemoglobin), 헤파린(heparin) 및 세포외 다당체 B40(exopolysaccharide B40)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 생체활성물질 전달용 조성물.
제9항에 있어서, 상기 음이온성 고분자의 평균 분자량은 1kDa 내지 300kDa인 생체활성물질 전달용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 코아세르베이트는 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자를 pH 2.0 내지 pH 10.0에서 1:0.01 내지 1:10의 중량비로 혼합되어 형성된 것인 생체활성물질 전달용 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 활성물질은 항암제, 항생제, 항염증제, 호르몬, 호르몬 길항제, 인터루킨, 인터페론, 헤파린, 효소, 성장 인자, 종양 괴사 인자, 엔도톡신, 림포톡시, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 프로테아제 저해제, 알킬포스포콜린, 방사선 동위원소 표지 물질, 계면활성제, 심혈관계 약물, 위장관계 약물 및 신경계 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 생체 활성물질 전달용 조성물.
(a) 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합되어 형성된 코아세르베이트 및 생체 활성물질을 포함하고,
(b) 상기 코아세르베이트의 내부에 상기 생체 활성물질이 봉입된 것을 특징으로 하는 생체 활성물질 전달체.
제13항에 있어서, 상기 생체 활성물질 전달체는 마이크로 캡슐인 것인 생체 활성물질 전달체.
제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 생체 활성물질은 항암제, 항생제, 항염증제, 호르몬, 호르몬 길항제, 인터루킨, 인터페론, 헤파린, 효소, 성장 인자, 종양 괴사 인자, 엔도톡신, 림포톡시, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 프로테아제 저해제, 알킬포스포콜린, 방사선 동위원소 표지 물질, 계면활성제, 심혈관계 약물, 위장관계 약물 및 신경계 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 생체 활성물질 전달체.
(a) 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자 및 생체 활성물질을 혼합하는 단계 및
(b) 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체 및 음이온성 고분자에 의해 형성된 코아세르베이트가 생체 활성물질 주위에 피막을 형성하는 단계를 포함하는 생체 활성물질 전달체의 제조방법.
제16항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자를 pH 2.0 내지 pH 10.0에서 1:0.01 내지 1:10의 중량비로 혼합하는 것인 생체 활성물질 전달체의 제조방법.
제16항에 있어서, 상기 생체 활성물질 전달체는 마이크로 캡슐인 것인 생체 활성물질 전달체의 제조방법.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 활성물질은 항암제, 항생제, 항염증제, 호르몬, 호르몬 길항제, 인터루킨, 인터페론, 헤파린, 효소, 성장 인자, 종양 괴사 인자, 엔도톡신, 림포톡시, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 프로테아제 저해제, 알킬포스포콜린, 방사선 동위원소 표지 물질, 계면활성제, 심혈관계 약물, 위장관계 약물 및 신경계 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 생체 활성물질 전달체의 제조방법.