CN114921400A - 一种紫贻贝原代血细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种紫贻贝原代血细胞的培养方法。所述方法包括以下步骤：(1)提取紫贻贝血淋巴；(2)将步骤(1)中得到的血淋巴分离为血细胞和血淋巴上清液；(3)将所述血淋巴上清液制备为血细胞培养液；(4)用步骤(3)制备的血细胞培养液将步骤(2)中得到的血细胞重悬，得到血细胞悬液；(5)利用血细胞悬液进行血细胞培养。应用本发明方法进行的紫贻贝原代血细胞培养，培养48h内的血细胞密度与初始密度持平，并且细胞状态稳定、形态良好，有效解决了血细胞凝结和形变的问题，为相关贝类免疫学与生态毒理学研究提供了细胞工具和支撑。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种紫贻贝原代血细胞的培养方法。
背景技术
近年来，近海生态环境的恶化，不仅对贝类食品安全构成了严重威胁，还通过影响免疫功能及基础代谢造成了贝类的生理过程紊乱，严重制约了贝类养殖产业的健康发展。贻贝在世界贝类养殖中具有重要地位， 2019年全球贻贝养殖产量20.69×105t，占贝类养殖总产量的12％，其中紫贻贝(Mytilus edulis)产量约占贻贝总产量的58％。更重要的是，贻贝为营固着的滤食性生物，对环境污染的规避能力弱、蓄积能力强，加之其广泛的地理分布，因此常被作为灵敏指示近海环境变化的岗哨生物，用以监测近海环境污染状况。
贝类免疫系统是生物体抵御外源胁迫的第一道屏障，血淋巴中的血细胞是其免疫功能的主要承担者。血细胞具有吞噬和包囊作用，可清除病原生物和自身损伤或死亡细胞，同时对机体的炎症、伤口进行修复，在宿主免疫防御机制中起着重要作用。由于贝类是开放式循环系统，血细胞更易接触环境中的有害物质而产生免疫毒性，因此血细胞被认为是外源物质攻击的关键“靶器官”，具有潜力作为细胞免疫学与生态毒理学的重要研究模型。然而，由于贝类血细胞的细胞形态、生理结构、功能分化、营养需求等方面的特殊性，至今还没有建立起成熟永生细胞系，原代细胞培养仍然是主要依托的方法。但是，即使是原代细胞培养，目前可参考的、认可度高的培养技术仍十分有限，严重限制了相关贝类免疫学与生态毒理学研究的深入开展。
发明内容
针对上述技术问题，本发明目的提供一种紫贻贝原代血细胞的培养方法，该方法对后续在细胞层面开展相关理论研究提供了技术支持。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
本发明提供一种紫贻贝原代血细胞的培养方法，包括以下步骤：
(1)提取紫贻贝血淋巴；
(2)将步骤(1)中得到的血淋巴分离为血细胞和血淋巴上清液；
(3)将所述血淋巴上清液制备为血细胞培养液；
(4)用步骤(3)制备的血细胞培养液将步骤(2)中得到的血细胞重悬，得到血细胞悬液；
(5)利用血细胞悬液进行血细胞培养。
在上述紫贻贝原代血细胞的培养方法中，作为一种优选实施方式，步骤(1) 在无菌条件下进行；优选地，步骤(1)中使用无菌针管提取血淋巴；优选地，所述无菌针管中吸有抗凝剂；优选地，所述抗凝剂的有效成分为柠檬酸钠；优选地，所述抗凝剂为阿氏液；优选地，所述抗凝剂与所述血淋巴的体积比为1:(8～10)，更优选的体积比为1：9。
在上述紫贻贝原代血细胞的培养方法中，作为一种优选实施方式，步骤(1) 中所述紫贻贝为生长状态良好的成年紫贻贝；优选地，所述紫贻贝壳长5±0.5cm；优选地，所述紫贻贝为经实验室条件驯化至少一周的成年紫贻贝；优选地，所述紫贻贝在水环境中饥饿处理16～32h后再进行血淋巴的提取，更优选为24h。
本发明中选取生长状态良好的成年紫贻贝用于提取血淋巴，选取标准为外壳紧闭，附着足丝强健有力，养殖水体清澈的成年紫贻贝。在提取血淋巴前对紫贻贝进行饥饿处理是为了让紫贻贝将摄食的小球藻代谢掉，避免提取血淋巴的过程中吸入残留在体内的小球藻。饥饿时间过短，提取血淋巴时易吸入小球藻，饥饿时间过长则会影响紫贻贝的生长状态。
在上述紫贻贝原代血细胞的培养方法中，作为一种优选实施方式，所述实验室条件驯化为：将成年紫贻贝在海水温度为18±2℃、盐度为31±1‰、pH为8.1 ±0.1的实验室条件下驯化两周，期间每日更换新鲜海水，并投喂小球藻，所述小球藻在所述海水中的浓度为1.5×105cells/mL。
本发明在提取血淋巴步骤前对野外养殖的贻贝进行驯化，能够使其适应实验室条件、保持稳定的个体生长状态，以降低所提取的血淋巴的个体差异性。本发明优选实施方式中小球藻的投喂量模拟了海域中的充足食物量的环境，有利于紫贻贝在驯化过程中保持良好的生长状态。本发明步骤(1)中所述的血淋巴提取方法，可以采用本领域常规方法，也可以参照专利No：CN204705520U，采用其中紫贻贝后闭壳肌穿刺取血装置从闭壳肌穿刺取血，具体可以参见该篇文献说明书中记载的后闭壳肌穿刺取血方法步骤。
在上述紫贻贝原代血细胞的培养方法中，作为一种优选实施方式，步骤(2) 中，将所提取的全部血淋巴混合均匀后再进行分离。
本发明的优选实施方式中，将多个紫贻贝中提取的血淋巴混合均匀后再进行分离，可以降低个体差异性的影响。
在上述紫贻贝原代血细胞的培养方法中，作为一种优选实施方式，步骤(2) 中的分离方法为离心，离心所得上清为血淋巴上清液，离心所得沉淀为血细胞；优选地，所述离心的温度为14～16℃，更优选为15℃；优选地，所述离心的离心力为380～420g，更优选为400g。
在上述紫贻贝原代血细胞的培养方法中，作为一种优选实施方式，步骤(3) 中对所述血淋巴上清液进行除菌处理，然后加入抗生素，制得所述血细胞培养液；优选地，所述除菌处理为过膜除菌；更优选的，过膜除菌所用的滤膜为0.22μm 的无菌滤膜；优选地，所述抗生素为青霉素、链霉素、庆大霉素和卡那霉素；优选地，所述抗生素在血细胞培养液中的浓度为：青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、庆大霉素50μg/ml、卡那霉素100μg/ml。
在上述紫贻贝原代血细胞的培养方法中，作为一种优选实施方式，步骤(4) 还包括对所得血细胞悬液进行过滤；优选地，步骤(4)中，使用筛绢对所述血细胞悬液进行过滤；优选地，所述筛绢的规格为400目。
本发明的优选实施方式中，使用400目的筛绢对血细胞悬液进行过滤，400 目的筛绢孔径略大于血细胞粒径，可以使单个的血细胞通过，同时能够有效去除凝结的细胞团。使用筛绢进行过滤，不仅对血细胞的伤害小，还具有操作简单便捷、过滤效率高的优势。
在上述紫贻贝原代血细胞的培养方法中，作为一种优选实施方式，步骤(5) 中，使用所述血淋巴上清液将步骤(4)得到的血细胞悬液稀释至(2.5～7.5)× 105cells/mL再进行培养，更优选为5×105cells/mL；步骤(5)中所述血细胞培养为将稀释后的所述血细胞悬液接种至细胞培养板中，置于无菌培养箱进行培养；优选地，所述细胞培养板为六孔细胞培养板；优选地，所述培养箱的培养条件为温度：15℃、相对湿度：40％。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：相对于现有技术，本发明紫贻贝原代血细胞培养方法，能够有效解决血细胞凝结和形变的问题，培养得到的细胞在培养48h内的细胞密度稳定在初始密度5×105cells/mL，并且细胞状态稳定、形态良好，符合原代培养要求，达到实验研究标准，为相关贝类免疫学与生态毒理学研究提供了细胞工具和支撑。
附图说明
图1为实施例1中培养紫贻贝原代血细胞0h的照片(400×)；
图2为实施例1中培养紫贻贝原代血细胞12h的照片(400×)；
图3为实施例1中培养紫贻贝原代血细胞24h的照片(400×)；
图4为实施例1中培养紫贻贝原代血细胞48h的照片(400×)；
图5为对比例1中培养紫贻贝原代血细胞0h的照片(400×)；
图6为对比例1中培养紫贻贝原代血细胞12h的照片(400×)；
图7为对比例1中培养紫贻贝原代血细胞24h的照片(400×)；
图8为对比例1中培养紫贻贝原代血细胞48h的照片(400×)；
图9为对比例2中培养紫贻贝原代血细胞0h的照片(400×)；
图10为对比例2中培养紫贻贝原代血细胞12h的照片(400×)；
图11为对比例2中培养紫贻贝原代血细胞24h的照片(400×)；
图12为对比例2中培养紫贻贝原代血细胞48h的照片(400×)。
具体实施方式
本发明公开了一种紫贻贝原代血细胞的培养方法，优选地，所述方法包括如下步骤：(1)选取生长状态良好的成年紫贻贝，无菌条件下使用吸有抗凝剂的针管提取血淋巴；(2)将提取的血淋巴混合液离心，收集血淋巴上清液，获得血细胞沉淀；(3)将收集的血淋巴上清液过膜除菌，加入抗生素，制得血细胞培养液；(4) 向血细胞沉淀中加入血细胞培养液，吹打重悬血细胞，过无菌筛绢去除凝结细胞团，得到血细胞悬液；(5)将血细胞悬液接种至细胞培养板中，置于无菌培养箱中进行培养。相对于现有技术，应用本发明方法进行的紫贻贝原代血细胞培养，有效解决了血细胞凝结和形变的问题，培养得到的细胞生长状态稳定，达到实验研究标准，为相关贝类免疫学与生态毒理学研究提供了细胞工具和支撑。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明的紫贻贝原代血细胞培养方法进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
1.一种紫贻贝原代血细胞的培养方法，具体操作步骤为：
(1)选择壳长5±0.5cm的成年紫贻贝，在海水温度为18±2℃、盐度为31± 1‰、pH为8.1±0.1的实验室条件下驯化两周，期间每日更换新鲜海水，并投喂小球藻，使其在海水中的浓度为1.5×105cells/mL。
(2)选取10只驯化后生长状态良好的紫贻贝，在水环境中饥饿处理24h后取出，使用75％酒精棉球擦拭贻贝外壳。
(3)在无菌条件下，用吸有100μLAlsever抗凝剂的1mL注射器提取900μL 血淋巴(提取方法参照专利No：CN204705520U)，将采集的血淋巴打入15mL无菌离心管中混合均匀；
(4)将离心管置于15℃条件下400g离心5min，分别收集血淋巴上清液和血细胞沉淀；
(5)将收集的血淋巴上清液过0.22μm无菌滤膜去除杂质，然后在血淋巴上清液中加入抗生素，制得血细胞培养液；抗生素在血细胞培养液中的终浓度分别为：青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、庆大霉素50μg/ml、卡那霉素100μg/ml；
(6)向血细胞沉淀中加入少量血细胞培养液，轻轻吹打重悬血细胞，将血细胞悬浮液过灭菌400目筛绢打入无菌培养瓶以去除凝结细胞团，制得血细胞悬液，显微镜观察确定细胞密度，再用血细胞培养液将血细胞悬液稀释至5×105 cells/mL；
(7)每孔2mL加于6孔板中，封口膜封口，置于15℃、40％相对湿度的无菌培养箱中培养。
(8)培养0、12、24、48h的紫贻贝原代血细胞的倒置显微镜观察结果见图1-4，从图中可以看出血细胞状态稳定、形状边界明显且圆润饱满。
2.紫贻贝血细胞细胞计数
在培养12、24、48h后随机吸取20μL稀释后的血细胞悬液，立刻加入60μL 贝氏固定液(含有2wt％氯化钙、4wt％多聚甲醛)固定，用血球计数板对血细胞进行计数。
细胞计数结果显示，本发明方法培养的紫贻贝原代血细胞，在培养48h内的细胞密度稳定在初始密度5×105cells/mL，并且细胞状态稳定、形态良好，均已达到原代细胞培养要求，实验证明本发明方法可行。不同时间培养紫贻贝原代血细胞的显微照片参见图1-4。
对比例1
与实施例1中紫贻贝准备工作和细胞培养条件相同，不同之处在于血细胞的制备差异，仅进行实施例1中的步骤(1)、(2)、(3)和(7)，其中，血细胞提取与实施例1的步骤(3)略有不同，本对比例的具体步骤如下：
在无菌条件下，用1mL注射器提取血淋巴(提取方法参照专利No： CN204705520U)，注射器中未提前吸有抗凝剂，将采集的血淋巴打入15mL离心管中混合均匀，每2mL加于6孔板中，封口膜封口，置于无菌培养箱中培养。
培养0、12、24、48h的紫贻贝原代血细胞的倒置显微镜观察结果见图5-8，结果显示，细胞凝结严重，且随培养时间的延长凝结细胞团变大，在培养24h 出现大量破损细胞碎片，在培养48h几乎没有完整细胞存在。说明加入抗凝剂并经过筛绢过滤可有效解决细胞凝结问题，同时说明血淋巴除菌后加入抗生素可有效延长细胞体外培养时间。
对比例2
与实施例1基本相同，不同之处仅在于血细胞培养液不同，如下：
实验选用Quinn et al.(2009)文章中描述的贻贝血细胞培养液替换实施例1中的血细胞培养液，具体配制方法为：向50mL无菌水中加入Leibovitz L-15培养液(Gibco)15mL、青霉素-链霉素-庆大霉素(100X)1mL、卡那霉素(1000X)0.1mL、HEPES 0.238g，用无菌水定容至100mL，制得培养液。向50mL培养液中加入 1mL L-谷氨酰胺(100X，200mM)、10mL胎牛血清，用培养液定容至100mL，过0.22μm滤膜除菌，即制得血细胞培养液。
本对比例使用的Leibovitz L-15培养液(Gibco)中含有作为酸碱指示剂的苯酚红，因此没有额外添加苯酚红。
结果显示，在培养12h时就有大量细胞发生形变、边界模糊，且随培养时间的延长形变加剧，如图9-12所示。本发明所使用的紫贻贝原位血淋巴制备的血细胞培养液可有效解决细胞形变问题。
参考文献：Quinn B,Costello M J,Dorange G,et al.Development ofan invitro culture method for cells and tissues from the zebra mussel(Dreissenapolymorpha)[J]. Cytotechnology,2009,59(2):121-134.
上述实施例仅是为了清楚地说明所做的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或者变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种紫贻贝原代血细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取紫贻贝血淋巴；
(2)将步骤(1)中得到的血淋巴分离为血细胞和血淋巴上清液；
(3)将所述血淋巴上清液制备为血细胞培养液；
(4)用步骤(3)制备的血细胞培养液将步骤(2)中得到的血细胞重悬，得到血细胞悬液；
(5)利用血细胞悬液进行血细胞培养。
2.如权利要求1所述的紫贻贝原代血细胞的培养方法，其特征在于，步骤(1)在无菌条件下进行；优选地，步骤(1)中使用无菌针管提取血淋巴；优选地，所述无菌针管中吸有抗凝剂；优选地，所述抗凝剂的有效成分为柠檬酸钠；优选地，所述抗凝剂为阿氏液；优选地，所述抗凝剂与所述血淋巴的体积比为1:(8～10)，更优选的体积比为1：9。
3.如权利要求1所述的紫贻贝原代血细胞的培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述紫贻贝为生长状态良好的成年紫贻贝；优选地，所述紫贻贝壳长5±0.5cm；优选地，所述紫贻贝为经实验室条件驯化至少一周的成年紫贻贝；优选地，所述紫贻贝在水环境中饥饿处理16～32h后再进行血淋巴的提取，更优选为24h。
4.如权利要求3所述的紫贻贝原代血细胞的培养方法，其特征在于，所述实验室条件驯化为：将成年紫贻贝在海水温度为18±2℃、盐度为31±1‰、pH为8.1±0.1的实验室条件下驯化两周，期间每日更换新鲜海水，并投喂小球藻，所述小球藻在所述海水中的浓度为1.5×105cells/mL。
5.如权利要求1所述的紫贻贝原代血细胞的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，将所提取的全部血淋巴混合均匀后再进行分离。
6.如权利要求1所述的紫贻贝原代血细胞的培养方法，其特征在于，步骤(2)中的分离方法为离心，离心所得上清为血淋巴上清液，离心所得沉淀为血细胞；优选地，所述离心的温度为14～16℃，更优选为15℃；优选地，所述离心的离心力为380～420g，更优选为400g。
7.如权利要求1所述的紫贻贝原代血细胞的培养方法，其特征在于，步骤(3)中对所述血淋巴上清液进行除菌处理，然后加入抗生素，制得所述血细胞培养液；优选地，所述除菌处理为过膜除菌；更优选的，过膜除菌所用的滤膜为0.22μm的无菌滤膜；优选地，所述抗生素为青霉素、链霉素、庆大霉素和卡那霉素；优选地，所述抗生素在血细胞培养液中的浓度为：青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、庆大霉素50μg/ml、卡那霉素100μg/ml。
8.如权利要求1所述的紫贻贝原代血细胞的培养方法，其特征在于，步骤(4)还包括对所得血细胞悬液进行过滤；优选地，步骤(4)中，使用筛绢对所述血细胞悬液进行过滤；优选地，所述筛绢的规格为400目。
9.如权利要求1所述的紫贻贝原代血细胞的培养方法，其特征在于，步骤(5)中，使用所述血淋巴上清液将步骤(4)得到的血细胞悬液稀释至(2.5～7.5)×105cells/mL再进行培养，更优选为5×105cells/mL；步骤(5)中所述血细胞培养为将稀释后的所述血细胞悬液接种至细胞培养板中，置于无菌培养箱进行培养；优选地，所述细胞培养板为六孔细胞培养板；优选地，所述培养箱的培养条件为温度：15℃、相对湿度：40％。
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