CN114921400A - 一种紫贻贝原代血细胞的培养方法 - Google Patents
一种紫贻贝原代血细胞的培养方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114921400A CN114921400A CN202210590268.XA CN202210590268A CN114921400A CN 114921400 A CN114921400 A CN 114921400A CN 202210590268 A CN202210590268 A CN 202210590268A CN 114921400 A CN114921400 A CN 114921400A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- blood cells
- blood
- hemolymph
- mytilus edulis
- cell culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 114
- 241000237536 Mytilus edulis Species 0.000 title claims abstract description 88
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 238000012258 culturing Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 210000000087 hemolymph Anatomy 0.000 claims abstract description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 36
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 35
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 12
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 10
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 9
- 239000013535 sea water Substances 0.000 claims description 9
- 241000195649 Chlorella <Chlorellales> Species 0.000 claims description 7
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 7
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 7
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 7
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims description 6
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 claims description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims description 5
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims description 5
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 5
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003048 aphrodisiac agent Substances 0.000 claims description 2
- 230000002509 aphrodisiac effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical group O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 230000037351 starvation Effects 0.000 claims description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 claims 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims 1
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 abstract description 11
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 8
- 231100000463 ecotoxicology Toxicity 0.000 abstract description 5
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 12
- 235000020638 mussel Nutrition 0.000 description 9
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000003677 hemocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229940000351 hemocyte Drugs 0.000 description 2
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 241000283070 Equus zebra Species 0.000 description 1
- 235000009161 Espostoa lanata Nutrition 0.000 description 1
- 240000001624 Espostoa lanata Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002696 acid base indicator Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007688 immunotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000386 immunotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0601—Invertebrate cells or tissues, e.g. insect cells; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
- C12N2509/10—Mechanical dissociation
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于细胞培养技术领域,具体涉及一种紫贻贝原代血细胞的培养方法。所述方法包括以下步骤:(1)提取紫贻贝血淋巴;(2)将步骤(1)中得到的血淋巴分离为血细胞和血淋巴上清液;(3)将所述血淋巴上清液制备为血细胞培养液;(4)用步骤(3)制备的血细胞培养液将步骤(2)中得到的血细胞重悬,得到血细胞悬液;(5)利用血细胞悬液进行血细胞培养。应用本发明方法进行的紫贻贝原代血细胞培养,培养48h内的血细胞密度与初始密度持平,并且细胞状态稳定、形态良好,有效解决了血细胞凝结和形变的问题,为相关贝类免疫学与生态毒理学研究提供了细胞工具和支撑。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域,具体涉及一种紫贻贝原代血细胞的培养方法。
背景技术
近年来,近海生态环境的恶化,不仅对贝类食品安全构成了严重威胁,还通过影响免疫功能及基础代谢造成了贝类的生理过程紊乱,严重制约了贝类养殖产业的健康发展。贻贝在世界贝类养殖中具有重要地位, 2019年全球贻贝养殖产量20.69×105t,占贝类养殖总产量的12%,其中紫贻贝(Mytilus edulis)产量约占贻贝总产量的58%。更重要的是,贻贝为营固着的滤食性生物,对环境污染的规避能力弱、蓄积能力强,加之其广泛的地理分布,因此常被作为灵敏指示近海环境变化的岗哨生物,用以监测近海环境污染状况。
贝类免疫系统是生物体抵御外源胁迫的第一道屏障,血淋巴中的血细胞是其免疫功能的主要承担者。血细胞具有吞噬和包囊作用,可清除病原生物和自身损伤或死亡细胞,同时对机体的炎症、伤口进行修复,在宿主免疫防御机制中起着重要作用。由于贝类是开放式循环系统,血细胞更易接触环境中的有害物质而产生免疫毒性,因此血细胞被认为是外源物质攻击的关键“靶器官”,具有潜力作为细胞免疫学与生态毒理学的重要研究模型。然而,由于贝类血细胞的细胞形态、生理结构、功能分化、营养需求等方面的特殊性,至今还没有建立起成熟永生细胞系,原代细胞培养仍然是主要依托的方法。但是,即使是原代细胞培养,目前可参考的、认可度高的培养技术仍十分有限,严重限制了相关贝类免疫学与生态毒理学研究的深入开展。
发明内容
针对上述技术问题,本发明目的提供一种紫贻贝原代血细胞的培养方法,该方法对后续在细胞层面开展相关理论研究提供了技术支持。
为实现上述目的,本发明的技术方案为:
本发明提供一种紫贻贝原代血细胞的培养方法,包括以下步骤:
(1)提取紫贻贝血淋巴;
(2)将步骤(1)中得到的血淋巴分离为血细胞和血淋巴上清液;
(3)将所述血淋巴上清液制备为血细胞培养液;
(4)用步骤(3)制备的血细胞培养液将步骤(2)中得到的血细胞重悬,得到血细胞悬液;
(5)利用血细胞悬液进行血细胞培养。
在上述紫贻贝原代血细胞的培养方法中,作为一种优选实施方式,步骤(1) 在无菌条件下进行;优选地,步骤(1)中使用无菌针管提取血淋巴;优选地,所述无菌针管中吸有抗凝剂;优选地,所述抗凝剂的有效成分为柠檬酸钠;优选地,所述抗凝剂为阿氏液;优选地,所述抗凝剂与所述血淋巴的体积比为1:(8~10),更优选的体积比为1:9。
在上述紫贻贝原代血细胞的培养方法中,作为一种优选实施方式,步骤(1) 中所述紫贻贝为生长状态良好的成年紫贻贝;优选地,所述紫贻贝壳长5±0.5cm;优选地,所述紫贻贝为经实验室条件驯化至少一周的成年紫贻贝;优选地,所述紫贻贝在水环境中饥饿处理16~32h后再进行血淋巴的提取,更优选为24h。
本发明中选取生长状态良好的成年紫贻贝用于提取血淋巴,选取标准为外壳紧闭,附着足丝强健有力,养殖水体清澈的成年紫贻贝。在提取血淋巴前对紫贻贝进行饥饿处理是为了让紫贻贝将摄食的小球藻代谢掉,避免提取血淋巴的过程中吸入残留在体内的小球藻。饥饿时间过短,提取血淋巴时易吸入小球藻,饥饿时间过长则会影响紫贻贝的生长状态。
在上述紫贻贝原代血细胞的培养方法中,作为一种优选实施方式,所述实验室条件驯化为:将成年紫贻贝在海水温度为18±2℃、盐度为31±1‰、pH为8.1 ±0.1的实验室条件下驯化两周,期间每日更换新鲜海水,并投喂小球藻,所述小球藻在所述海水中的浓度为1.5×105cells/mL。
本发明在提取血淋巴步骤前对野外养殖的贻贝进行驯化,能够使其适应实验室条件、保持稳定的个体生长状态,以降低所提取的血淋巴的个体差异性。本发明优选实施方式中小球藻的投喂量模拟了海域中的充足食物量的环境,有利于紫贻贝在驯化过程中保持良好的生长状态。本发明步骤(1)中所述的血淋巴提取方法,可以采用本领域常规方法,也可以参照专利No:CN204705520U,采用其中紫贻贝后闭壳肌穿刺取血装置从闭壳肌穿刺取血,具体可以参见该篇文献说明书中记载的后闭壳肌穿刺取血方法步骤。
在上述紫贻贝原代血细胞的培养方法中,作为一种优选实施方式,步骤(2) 中,将所提取的全部血淋巴混合均匀后再进行分离。
本发明的优选实施方式中,将多个紫贻贝中提取的血淋巴混合均匀后再进行分离,可以降低个体差异性的影响。
在上述紫贻贝原代血细胞的培养方法中,作为一种优选实施方式,步骤(2) 中的分离方法为离心,离心所得上清为血淋巴上清液,离心所得沉淀为血细胞;优选地,所述离心的温度为14~16℃,更优选为15℃;优选地,所述离心的离心力为380~420g,更优选为400g。
在上述紫贻贝原代血细胞的培养方法中,作为一种优选实施方式,步骤(3) 中对所述血淋巴上清液进行除菌处理,然后加入抗生素,制得所述血细胞培养液;优选地,所述除菌处理为过膜除菌;更优选的,过膜除菌所用的滤膜为0.22μm 的无菌滤膜;优选地,所述抗生素为青霉素、链霉素、庆大霉素和卡那霉素;优选地,所述抗生素在血细胞培养液中的浓度为:青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、庆大霉素50μg/ml、卡那霉素100μg/ml。
在上述紫贻贝原代血细胞的培养方法中,作为一种优选实施方式,步骤(4) 还包括对所得血细胞悬液进行过滤;优选地,步骤(4)中,使用筛绢对所述血细胞悬液进行过滤;优选地,所述筛绢的规格为400目。
本发明的优选实施方式中,使用400目的筛绢对血细胞悬液进行过滤,400 目的筛绢孔径略大于血细胞粒径,可以使单个的血细胞通过,同时能够有效去除凝结的细胞团。使用筛绢进行过滤,不仅对血细胞的伤害小,还具有操作简单便捷、过滤效率高的优势。
在上述紫贻贝原代血细胞的培养方法中,作为一种优选实施方式,步骤(5) 中,使用所述血淋巴上清液将步骤(4)得到的血细胞悬液稀释至(2.5~7.5)× 105cells/mL再进行培养,更优选为5×105cells/mL;步骤(5)中所述血细胞培养为将稀释后的所述血细胞悬液接种至细胞培养板中,置于无菌培养箱进行培养;优选地,所述细胞培养板为六孔细胞培养板;优选地,所述培养箱的培养条件为温度:15℃、相对湿度:40%。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:相对于现有技术,本发明紫贻贝原代血细胞培养方法,能够有效解决血细胞凝结和形变的问题,培养得到的细胞在培养48h内的细胞密度稳定在初始密度5×105cells/mL,并且细胞状态稳定、形态良好,符合原代培养要求,达到实验研究标准,为相关贝类免疫学与生态毒理学研究提供了细胞工具和支撑。
附图说明
图1为实施例1中培养紫贻贝原代血细胞0h的照片(400×);
图2为实施例1中培养紫贻贝原代血细胞12h的照片(400×);
图3为实施例1中培养紫贻贝原代血细胞24h的照片(400×);
图4为实施例1中培养紫贻贝原代血细胞48h的照片(400×);
图5为对比例1中培养紫贻贝原代血细胞0h的照片(400×);
图6为对比例1中培养紫贻贝原代血细胞12h的照片(400×);
图7为对比例1中培养紫贻贝原代血细胞24h的照片(400×);
图8为对比例1中培养紫贻贝原代血细胞48h的照片(400×);
图9为对比例2中培养紫贻贝原代血细胞0h的照片(400×);
图10为对比例2中培养紫贻贝原代血细胞12h的照片(400×);
图11为对比例2中培养紫贻贝原代血细胞24h的照片(400×);
图12为对比例2中培养紫贻贝原代血细胞48h的照片(400×)。
具体实施方式
本发明公开了一种紫贻贝原代血细胞的培养方法,优选地,所述方法包括如下步骤:(1)选取生长状态良好的成年紫贻贝,无菌条件下使用吸有抗凝剂的针管提取血淋巴;(2)将提取的血淋巴混合液离心,收集血淋巴上清液,获得血细胞沉淀;(3)将收集的血淋巴上清液过膜除菌,加入抗生素,制得血细胞培养液;(4) 向血细胞沉淀中加入血细胞培养液,吹打重悬血细胞,过无菌筛绢去除凝结细胞团,得到血细胞悬液;(5)将血细胞悬液接种至细胞培养板中,置于无菌培养箱中进行培养。相对于现有技术,应用本发明方法进行的紫贻贝原代血细胞培养,有效解决了血细胞凝结和形变的问题,培养得到的细胞生长状态稳定,达到实验研究标准,为相关贝类免疫学与生态毒理学研究提供了细胞工具和支撑。
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明的紫贻贝原代血细胞培养方法进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1
1.一种紫贻贝原代血细胞的培养方法,具体操作步骤为:
(1)选择壳长5±0.5cm的成年紫贻贝,在海水温度为18±2℃、盐度为31± 1‰、pH为8.1±0.1的实验室条件下驯化两周,期间每日更换新鲜海水,并投喂小球藻,使其在海水中的浓度为1.5×105cells/mL。
(2)选取10只驯化后生长状态良好的紫贻贝,在水环境中饥饿处理24h后取出,使用75%酒精棉球擦拭贻贝外壳。
(3)在无菌条件下,用吸有100μLAlsever抗凝剂的1mL注射器提取900μL 血淋巴(提取方法参照专利No:CN204705520U),将采集的血淋巴打入15mL无菌离心管中混合均匀;
(4)将离心管置于15℃条件下400g离心5min,分别收集血淋巴上清液和血细胞沉淀;
(5)将收集的血淋巴上清液过0.22μm无菌滤膜去除杂质,然后在血淋巴上清液中加入抗生素,制得血细胞培养液;抗生素在血细胞培养液中的终浓度分别为:青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、庆大霉素50μg/ml、卡那霉素100μg/ml;
(6)向血细胞沉淀中加入少量血细胞培养液,轻轻吹打重悬血细胞,将血细胞悬浮液过灭菌400目筛绢打入无菌培养瓶以去除凝结细胞团,制得血细胞悬液,显微镜观察确定细胞密度,再用血细胞培养液将血细胞悬液稀释至5×105 cells/mL;
(7)每孔2mL加于6孔板中,封口膜封口,置于15℃、40%相对湿度的无菌培养箱中培养。
(8)培养0、12、24、48h的紫贻贝原代血细胞的倒置显微镜观察结果见图1-4,从图中可以看出血细胞状态稳定、形状边界明显且圆润饱满。
2.紫贻贝血细胞细胞计数
在培养12、24、48h后随机吸取20μL稀释后的血细胞悬液,立刻加入60μL 贝氏固定液(含有2wt%氯化钙、4wt%多聚甲醛)固定,用血球计数板对血细胞进行计数。
细胞计数结果显示,本发明方法培养的紫贻贝原代血细胞,在培养48h内的细胞密度稳定在初始密度5×105cells/mL,并且细胞状态稳定、形态良好,均已达到原代细胞培养要求,实验证明本发明方法可行。不同时间培养紫贻贝原代血细胞的显微照片参见图1-4。
对比例1
与实施例1中紫贻贝准备工作和细胞培养条件相同,不同之处在于血细胞的制备差异,仅进行实施例1中的步骤(1)、(2)、(3)和(7),其中,血细胞提取与实施例1的步骤(3)略有不同,本对比例的具体步骤如下:
在无菌条件下,用1mL注射器提取血淋巴(提取方法参照专利No: CN204705520U),注射器中未提前吸有抗凝剂,将采集的血淋巴打入15mL离心管中混合均匀,每2mL加于6孔板中,封口膜封口,置于无菌培养箱中培养。
培养0、12、24、48h的紫贻贝原代血细胞的倒置显微镜观察结果见图5-8,结果显示,细胞凝结严重,且随培养时间的延长凝结细胞团变大,在培养24h 出现大量破损细胞碎片,在培养48h几乎没有完整细胞存在。说明加入抗凝剂并经过筛绢过滤可有效解决细胞凝结问题,同时说明血淋巴除菌后加入抗生素可有效延长细胞体外培养时间。
对比例2
与实施例1基本相同,不同之处仅在于血细胞培养液不同,如下:
实验选用Quinn et al.(2009)文章中描述的贻贝血细胞培养液替换实施例1中的血细胞培养液,具体配制方法为:向50mL无菌水中加入Leibovitz L-15培养液(Gibco)15mL、青霉素-链霉素-庆大霉素(100X)1mL、卡那霉素(1000X)0.1mL、HEPES 0.238g,用无菌水定容至100mL,制得培养液。向50mL培养液中加入 1mL L-谷氨酰胺(100X,200mM)、10mL胎牛血清,用培养液定容至100mL,过0.22μm滤膜除菌,即制得血细胞培养液。
本对比例使用的Leibovitz L-15培养液(Gibco)中含有作为酸碱指示剂的苯酚红,因此没有额外添加苯酚红。
结果显示,在培养12h时就有大量细胞发生形变、边界模糊,且随培养时间的延长形变加剧,如图9-12所示。本发明所使用的紫贻贝原位血淋巴制备的血细胞培养液可有效解决细胞形变问题。
参考文献:Quinn B,Costello M J,Dorange G,et al.Development ofan invitro culture method for cells and tissues from the zebra mussel(Dreissenapolymorpha)[J]. Cytotechnology,2009,59(2):121-134.
上述实施例仅是为了清楚地说明所做的实例,而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或者变动,这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举,因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种紫贻贝原代血细胞的培养方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)提取紫贻贝血淋巴;
(2)将步骤(1)中得到的血淋巴分离为血细胞和血淋巴上清液;
(3)将所述血淋巴上清液制备为血细胞培养液;
(4)用步骤(3)制备的血细胞培养液将步骤(2)中得到的血细胞重悬,得到血细胞悬液;
(5)利用血细胞悬液进行血细胞培养。
2.如权利要求1所述的紫贻贝原代血细胞的培养方法,其特征在于,步骤(1)在无菌条件下进行;优选地,步骤(1)中使用无菌针管提取血淋巴;优选地,所述无菌针管中吸有抗凝剂;优选地,所述抗凝剂的有效成分为柠檬酸钠;优选地,所述抗凝剂为阿氏液;优选地,所述抗凝剂与所述血淋巴的体积比为1:(8~10),更优选的体积比为1:9。
3.如权利要求1所述的紫贻贝原代血细胞的培养方法,其特征在于,步骤(1)中所述紫贻贝为生长状态良好的成年紫贻贝;优选地,所述紫贻贝壳长5±0.5cm;优选地,所述紫贻贝为经实验室条件驯化至少一周的成年紫贻贝;优选地,所述紫贻贝在水环境中饥饿处理16~32h后再进行血淋巴的提取,更优选为24h。
4.如权利要求3所述的紫贻贝原代血细胞的培养方法,其特征在于,所述实验室条件驯化为:将成年紫贻贝在海水温度为18±2℃、盐度为31±1‰、pH为8.1±0.1的实验室条件下驯化两周,期间每日更换新鲜海水,并投喂小球藻,所述小球藻在所述海水中的浓度为1.5×105cells/mL。
5.如权利要求1所述的紫贻贝原代血细胞的培养方法,其特征在于,步骤(2)中,将所提取的全部血淋巴混合均匀后再进行分离。
6.如权利要求1所述的紫贻贝原代血细胞的培养方法,其特征在于,步骤(2)中的分离方法为离心,离心所得上清为血淋巴上清液,离心所得沉淀为血细胞;优选地,所述离心的温度为14~16℃,更优选为15℃;优选地,所述离心的离心力为380~420g,更优选为400g。
7.如权利要求1所述的紫贻贝原代血细胞的培养方法,其特征在于,步骤(3)中对所述血淋巴上清液进行除菌处理,然后加入抗生素,制得所述血细胞培养液;优选地,所述除菌处理为过膜除菌;更优选的,过膜除菌所用的滤膜为0.22μm的无菌滤膜;优选地,所述抗生素为青霉素、链霉素、庆大霉素和卡那霉素;优选地,所述抗生素在血细胞培养液中的浓度为:青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、庆大霉素50μg/ml、卡那霉素100μg/ml。
8.如权利要求1所述的紫贻贝原代血细胞的培养方法,其特征在于,步骤(4)还包括对所得血细胞悬液进行过滤;优选地,步骤(4)中,使用筛绢对所述血细胞悬液进行过滤;优选地,所述筛绢的规格为400目。
9.如权利要求1所述的紫贻贝原代血细胞的培养方法,其特征在于,步骤(5)中,使用所述血淋巴上清液将步骤(4)得到的血细胞悬液稀释至(2.5~7.5)×105cells/mL再进行培养,更优选为5×105cells/mL;步骤(5)中所述血细胞培养为将稀释后的所述血细胞悬液接种至细胞培养板中,置于无菌培养箱进行培养;优选地,所述细胞培养板为六孔细胞培养板;优选地,所述培养箱的培养条件为温度:15℃、相对湿度:40%。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210590268.XA CN114921400A (zh) | 2022-05-26 | 2022-05-26 | 一种紫贻贝原代血细胞的培养方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210590268.XA CN114921400A (zh) | 2022-05-26 | 2022-05-26 | 一种紫贻贝原代血细胞的培养方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114921400A true CN114921400A (zh) | 2022-08-19 |
Family
ID=82809848
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210590268.XA Pending CN114921400A (zh) | 2022-05-26 | 2022-05-26 | 一种紫贻贝原代血细胞的培养方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114921400A (zh) |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008132350A2 (fr) * | 2007-03-23 | 2008-11-06 | Institut Francais De La Recherche Pour L'exploitation De La Mer (Ifremer) | Obtention de mollusques bivalves tetraploïdes a partir de geniteurs diploïdes |
CN102115487A (zh) * | 2010-11-30 | 2011-07-06 | 浙江大学 | 一种以贝壳为原料制备多肽的方法 |
CN102206646A (zh) * | 2011-03-28 | 2011-10-05 | 宁波大学 | 紫贻贝Hydramacin-1基因及其重组蛋白和制备方法 |
CN102643787A (zh) * | 2012-04-09 | 2012-08-22 | 宁波大学 | 紫贻贝c型溶菌酶及其制备方法 |
CN103160525A (zh) * | 2011-12-15 | 2013-06-19 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种紫贻贝g型溶菌酶基因及其重组蛋白和应用 |
US20200291077A1 (en) * | 2017-03-31 | 2020-09-17 | Postech Academy-Industry Foundation | Porous microspheres including mussel adhesive protein, and method for manufacturing same |
-
2022
- 2022-05-26 CN CN202210590268.XA patent/CN114921400A/zh active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008132350A2 (fr) * | 2007-03-23 | 2008-11-06 | Institut Francais De La Recherche Pour L'exploitation De La Mer (Ifremer) | Obtention de mollusques bivalves tetraploïdes a partir de geniteurs diploïdes |
CN102115487A (zh) * | 2010-11-30 | 2011-07-06 | 浙江大学 | 一种以贝壳为原料制备多肽的方法 |
CN102206646A (zh) * | 2011-03-28 | 2011-10-05 | 宁波大学 | 紫贻贝Hydramacin-1基因及其重组蛋白和制备方法 |
CN103160525A (zh) * | 2011-12-15 | 2013-06-19 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种紫贻贝g型溶菌酶基因及其重组蛋白和应用 |
CN102643787A (zh) * | 2012-04-09 | 2012-08-22 | 宁波大学 | 紫贻贝c型溶菌酶及其制备方法 |
US20200291077A1 (en) * | 2017-03-31 | 2020-09-17 | Postech Academy-Industry Foundation | Porous microspheres including mussel adhesive protein, and method for manufacturing same |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
BARRICK A 等: "Investigating the Establishment of Primary Cultures of Hemocytes from Mytilus Edulis", 《CYTOTECHNOLOGY》, vol. 70, no. 4, pages 1205 - 1220, XP036562191, DOI: 10.1007/s10616-018-0212-x * |
CANESI L 等: "Interactions of Cationic Polystyrene Nanoparticles with Marine Bivalve Hemocytes in a Physiological Environment: Role of Soluble Hemolymph Proteins", 《ENVIRON. RES》, vol. 150, pages 73, XP029698488, DOI: 10.1016/j.envres.2016.05.045 * |
FUNCTIONAL AND MORPHOLOGICAL CHANGES INDUCED IN MYTILUS HEMOCYTES BY SELECTED NANOPARTICLES: "Functional and Morphological Changes Induced in Mytilus Hemocytes by Selected Nanoparticles", 《NANOMATERIALS》, vol. 11, no. 2, pages 3 - 6 * |
孙敬锋 等: "贝类血细胞及其免疫功能研究进展", 《水生生物学报》, vol. 5, pages 601 - 607 * |
邱愚蘅 等: "不同暂养添加物对Cd2+胁迫的紫贻贝机体免疫功能的调节作用", 《食品工业科技》, vol. 40, no. 23, pages 10 - 16 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Wilkinson et al. | Marine sponges discriminate between food bacteria and bacterial symbionts: electron microscope radioautography and in situ evidence | |
CN103667176B (zh) | 鲤疱疹病毒ⅱ型敏感的异育银鲫脑组织细胞系及其建立方法和应用 | |
CN102304492B (zh) | 鲫肝细胞原代培养方法 | |
CN106591224B (zh) | 高纯度鸡前体肌内脂肪细胞的分离纯化及构建其与肌卫星细胞共培养体系的方法 | |
CN109161515B (zh) | 团头鲂原代肝细胞的分离培养方法 | |
US20210009943A1 (en) | Method for continuous culture of shrimp cells | |
CN102604892A (zh) | 一种人类骨髓、脐带血或外周血干细胞样本密度分离液及干细胞分离方法 | |
CN104818242B (zh) | 原代肝细胞的分离制备方法 | |
CN113717939B (zh) | 真鲷脑细胞系及其构建方法与应用 | |
CN114921400A (zh) | 一种紫贻贝原代血细胞的培养方法 | |
CN110358724B (zh) | 一种针对copd患者的原代支气管上皮细胞的分离培养方法 | |
CN111534476A (zh) | 一种贝类精巢生精细胞解离和分离的方法 | |
CN113604419B (zh) | 一种小鼠原代肝脏枯否细胞的提取方法 | |
CN111304146B (zh) | 一种促中华绒螯蟹造血组织发育免疫增强剂的筛选模型构建方法 | |
CN114107181B (zh) | 一种鲟鱼胚胎细胞系、培养基及其制备方法 | |
CN105062969A (zh) | 一种提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效率的方法 | |
CN113234660B (zh) | 一种草鱼输尿管组织细胞系及其应用 | |
CN110295137B (zh) | 一种乌斑鳢肾细胞系及其构建方法和应用 | |
CN112126619B (zh) | 弹状病毒敏感的黄鳝肾组织细胞系及应用 | |
CN112795484A (zh) | 海水寄生纤毛虫刺激隐核虫的外泌体提取分离方法及应用 | |
CN111919839A (zh) | 一种湖羊精液低温保存稀释液配方的制备方法及其使用方法 | |
CN106893680B (zh) | 一种从血液样本中富集丝状真菌的方法 | |
CN1239697C (zh) | 大菱鲆弹状病毒毒株及其制备方法和应用 | |
CN111004768B (zh) | 一种背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法及其应用 | |
CN114480195B (zh) | 一种幽门螺杆菌快速增菌培养试剂及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220819 |