CN113717939B - 真鲷脑细胞系及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了真鲷脑细胞系及其构建方法与应用。该真鲷脑细胞系，名称为真鲷脑BB细胞，于2021年8月12日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021227，目前已传至75代，形态以成纤维样细胞为主；该细胞系的建立在丰富鱼类细胞库的同时可为水产动物病毒性疾病的病原分离、培养、检测提供保障，还可为体外基因组RNA干扰、基因敲除提供一个新的研究工具，同时具有作为监测环境污染物的作用。

Description

真鲷脑细胞系及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及真鲷脑细胞系及其构建方法与应用。
背景技术
鱼类细胞系作为重要的实验模型，具有成本低廉、可控性强、利于大量样本分析等显著优点，被广泛应用于水生生物的病毒学、免疫学、毒理学等研究领域。敏感细胞系是病毒研究的重要载体，病原诊断、感染机理及免疫预防都要以细胞系为前提。自Wolf建立第一株鱼类细胞系RTG-2开始，300多株鱼类细胞系被建立，40余种水生生物病毒在此基础上得以分离。与此同时有学者提出，鱼类细胞系在生态毒理学研究中也是一种多用途工具，可取代鱼类急性毒性实验来评价药物的细胞毒性。水产动物重金属污染已成为非常普遍的食品卫生问题，镉(Cd)是一种典型的生物累积性有毒污染物，广泛存在于水环境中，破坏水生生态系统，对水生生物的生长发育构成严重威胁，对人体健康存在潜在危险。与活体鱼相比，鱼类培养细胞作为重金属污染的实验对象具有以下优点：细胞均一性和重复性好，实验条件可控；药物与细胞直接作用，反应速度快；成本低，不需要换水、充气等大型养殖设备。
真鲷(Pagrus major)是名贵的海水经济鱼类，分布于印度洋北部至太平洋中部，包括中国、印度尼西亚、日本、韩国、菲律宾，属近海暖水性底层鱼类。随着工业的发展及养殖规模的扩大，海洋重金属污染及病害发生日益频繁，病毒病已成为真鲷养殖的一大瓶颈，主要致病原包括真鲷虹彩病毒(Red sea bream iridovirus,RSIV)、神经坏死病毒(Nervous necrosis virus,NNV)、石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)等几种海水鱼类病毒，死亡率高达90％，经济损失惨重。NNV属于野田病毒科(Nodaviridae)，宿主广泛，能感染120多种养殖及野生鱼类，包括石斑、鲷科、牙鲆等海水鱼类以及欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)、鲶(Parasilurusasotus)、鳜等淡水鱼类。第一株被用于NNV研究的细胞系是1996年英国学者Frerichs等用纹月鳢(Channastriatus)鱼苗建立的SSN-1细胞系，随后的敏感细胞系主要来自于石斑鱼(Epinepheluscoioides)、海鲈(Latescalcarifer)、鲳鯵等鱼类组织。敏感细胞系的建立不仅增强了NNV诊断的灵敏度，还使在细胞水平研究病毒的复制和致病性成为可能。
脑细胞特别是端脑和小脑等部位含有大量增生细胞，因此，硬骨鱼的脑组织被很多学者共认为适于细胞系的建立。鉴于此，越来越多关于鱼源脑组织细胞系如褐点石斑鱼细胞系BMGB、鳜脑细胞系CPB、斑石鲷脑细胞系OPPB、金头鲷脑细胞系SaB-1、杂交鳢脑细胞系CAMB的研究得以开展。真鲷作为NNV的敏感宿主，迄今已成功建立的细胞系主要来自其肾脏、胚胎和尾鳍等组织，但对该病毒的敏感性较低或未提及。感染NNV后，发病鱼主要表现为嗜睡，脑和视网膜出现空泡化；作为NNV感染的靶器官，真鲷脑组织细胞系尚未见报道，因此，有必要构建真鲷脑细胞系。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种真鲷脑细胞系。
本发明第二方面的目的，在于提供第一方面的真鲷脑细胞系的构建方法。
本发明第三方面的目的，在于提供第一方面的真鲷脑细胞系的培养方法。
本发明第四方面的目的，在于提供第一方面的真鲷脑细胞系的应用。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种真鲷脑细胞系，名称为真鲷脑BB细胞，于2021年8月12日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C2021227。
本发明的第二个方面，提供本发明第一方面的真鲷脑细胞系的构建方法，包括如下步骤：1)取真鲷脑组织，剪碎，采用含血清胶原酶消化液消化，离心，去上清，用增殖培养液重悬，25～30℃下培养，得到原代真鲷脑细胞；2)原代真鲷脑细胞长成单层后，用胰蛋白酶消化，用增殖培养液重悬，进行传代培养，得到真鲷脑细胞系。
优选地，所述含血清的胶原酶消化液为含有10～20v/v％胎牛血清、0.1～0.2w/v％Ⅰ型胶原酶、200～400U/mL青霉素、200～400μg/mL链霉素、0.5～1.0μg/mL两性霉素B的L-15培养液。
优选地，所述增殖培养液为含有20～30v/v％胎牛血清、10～20ng/mL人表皮生长因子、10～20ng/mL人碱性成纤维生长因子、100～200U/mL青霉素、100～200μg/mL链霉素、0.25～0.5μg/mL两性霉素B，pH值为7.0～7.4的L-15培养液。
优选地，步骤1)中所述真鲷脑组织通过如下步骤得到：将真鲷用70～75v/v％酒精浸泡消毒2～3分钟，擦除体表粘液，然后在无菌条件下解剖取下脑组织。
优选地，步骤1)中所述剪碎的方法如下：在HBSS平衡液中将脑组织剪成50～100立方毫米的组织块。
优选地，步骤1)中所述剪碎后还包括如下步骤：500～600转/分离心收集组织块，离心2～3次。
优选地，步骤1)中所述消化的条件为：25～30℃下消化4～8h。
优选地，步骤1)中所述离心的条件为：1000～1400转/分离心3～7分钟。
优选地，步骤2)中所述真鲷脑细胞传代培养至5代后，所述增殖培养液为含有9～11v/v％胎牛血清、pH值为7.0～7.4的L-15培养液。
优选地，步骤2)中所述真鲷脑细胞传代培养至25代前(包含25代)，按1:2的比例传代。
优选地，步骤2)中所述真鲷脑细胞传代培养至25代后，按1:3的比例传代。
本发明的第三个方面，提供本发明第一方面的真鲷脑细胞系的培养方法，采用胰酶消化本发明第一方面的真鲷脑细胞系，加入培养基培养；
所述培养基为含胎牛血清的DMEM培养基、含胎牛血清的L-15培养基和含胎牛血清的M199培养基中的至少一种。
优选地，所述培养基为含胎牛血清的M199培养基。
进一步优选地，所述培养基为含10％胎牛血清的M199培养基。
本发明的第四个方面，提供本发明第一方面的真鲷脑细胞系的应用。
本发明第一方面的真鲷脑细胞系在培养水产动物病毒中的应用。
本发明第一方面的真鲷脑细胞系在分离水产动物病毒中的应用。
本发明第一方面的真鲷脑细胞系在非诊断治疗目的地检测水产动物病毒中的应用。
本发明第一方面的真鲷脑细胞系在药物筛选中的应用，所述药物为用于预防或治疗水产动物病毒感染所致的疾病的药物。
本发明第一方面的真鲷脑细胞系在环境污染物监测中的应用。
优选地，所述水产动物病毒为神经坏死病毒、石斑鱼虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、鳜弹状病毒和罗非鱼湖病毒中的至少一种。
优选地，所述环境污染物为重金属，进一步为镉。
本发明的有益效果是：
本发明通过发明人的大量创造性劳动，采用胶原酶消化法分离真鲷脑组织细胞，进行原代培养，首次构建得到真鲷脑细胞系，名称为真鲷脑BB细胞(BB细胞)，于2021年8月12日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021227，目前已传至75代，形态以成纤维样细胞为主；病毒敏感性试验显示，除神经坏死病毒(NNV)和石斑鱼虹彩病毒(SGIV)外，鳜弹状病毒(SCRV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和罗非鱼湖病毒(TiLV)等几种常见淡水鱼类病毒感染BB细胞均可产生明显的细胞病变效应；NNV、SGIV、ISKNV、SCRV和TiLV分别感染不同代次BB细胞后收获的病毒滴度稳定在8.0～8.3log TCID50/mL、7.0～7.2log TCID50/mL、4.0～4.2log TCID50/mL、4.3～4.5log TCID50/mL和4.3～4.5log TCID50/mL；PCR检测进一步证实上述病毒可感染BB细胞；毒理学试验显示，镉对BB细胞暴露24h后，可产生明显的细胞毒性，随着Cd浓度的增大，BB细胞活力逐渐降低，呈现剂量-效应关系；镉暴露组的BB细胞，经Annexin和PI双重染色后显示绿色和红光荧光，表明镉可诱导BB细胞产生明显的细胞凋亡和坏死现象；该细胞系的建立在丰富鱼类细胞库的同时可为水产动物病毒性疾病的病原分离、培养、检测提供保障，还可为体外基因组RNA干扰、基因敲除提供一个新的研究工具，同时具有作为监测环境污染物的作用。
附图说明
图1是不同代次的真鲷脑细胞的形态特征图：其中，A是第一代的真鲷脑细胞的形态特征图(4×)；B是第24代的真鲷脑细胞的形态特征图(4×)。
图2是不同代次冻存的真鲷脑细胞复苏后的存活率统计图。
图3是不同代次的真鲷脑细胞的核型分析结果图：其中，A是第15代的真鲷脑细胞的核型分析统计结果图；B是第60代的真鲷脑细胞的核型分析统计结果图；C是第60代的真鲷脑细胞的中期核型图。
图4是不同培养基对真鲷脑细胞生长的影响的结果图：其中，A是不同培养基中真鲷脑细胞数随时间变化的折线图；B是在含不同浓度的FBS的M199培养基中真鲷脑细胞数随时间变化的折线图。
图5是真鲷脑细胞(BB细胞)的转染效率结果图：其中，A是含有pEGFP-N1的真核表达载体通过脂质体2000转染BB细胞后的结果图(20×)；B是明场下的BB细胞图(20×)。
图6是神经坏死病毒(Nervous necrosis virus,NNV)对真鲷脑细胞(BB细胞)的影响图：其中，A是未感染的BB细胞图(20×)；B是被NNV感染48h后的BB细胞图(20×)；C是被NNV感染72h后的BB细胞图(20×)。
图7是石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)对真鲷脑细胞(BB细胞)的影响图：其中，A是未感染的BB细胞图(10×)；B是被SGIV感染24h后的BB细胞图(10×)；C是被SGIV感染48h后的BB细胞图(10×)。
图8是传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen kidneynecrosis virus,ISKNV)对真鲷脑细胞(BB细胞)的影响图：其中，A是未感染的BB细胞图(20×)；B是被ISKNV感染48h后的BB细胞图(20×)；C是被ISKNV感染96h后的BB细胞图(20×)。
图9是鳜弹状病毒(Siniperca chuatsirhabdovirus,SCRV)对真鲷脑细胞(BB细胞)的影响图：其中，A是未感染的BB细胞图(10×)；B是被SCRV感染24h后的BB细胞图(10×)；C是被SCRV感染48h后的BB细胞图(10×)。
图10是罗非鱼湖病毒(Tilapia Lake Virus，TiLV)对真鲷脑细胞(BB细胞)的影响图：其中，A是未感染的BB细胞图(10×)；B是被TiLV感染3d后的BB细胞图(10×)；C是被TiLV感染4d后的BB细胞图(10×)。
图11是不同病毒感染细胞液的PCR检测结果图：其中，A是ISKNV感染细胞液、SCRV感染细胞液、SGIV感染细胞液的PCR检测结果图；B是TiLV感染细胞液、NNV感染细胞液的PCR检测结果图；A中，M表示Marker 2000,1表示ISKNV阴性对照；2表示ISKNV感染细胞液；3表示SCRV阴性对照；4表示SCRV感染细胞液；5表示SGIV阴性对照；6表示SGIV感染细胞液；B中，M表示Marker 2000,1表示TiLV阴性对照；2表示TiLV感染细胞液；3表示NNV阴性对照；4表示NNV感染细胞液。
图12是Cd浓度对真鲷脑细胞活力的影响图。
图13是Cd暴露对真鲷脑细胞的影响图：其中，A是不同处理的真鲷脑细胞的形态图(10×)；B是Cd暴露24h后以及对照组的真鲷脑细胞的明场、Annexin V-FITC染色、PI染色及Annexin V-FITC/PI染色合并图(20×)。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
本实施例中所使用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。
实施例1真鲷脑细胞系的构建
1.脑组织的处理：首先将体长约为8cm的健康真鲷(购自广东省阳江市某养殖场)用75％酒精浸泡消毒2分钟，用纱布擦除体表粘液，置于超净工作台中解剖取下脑组织，在装有HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)平衡液的小玻璃瓶中将脑组织粗剪成50～100立方毫米的组织块，600转/分离心收集组织块，反复离心3次。
2.原代培养：将组织块放入含血清胶原酶消化液(消化液配方为含有10v/v％胎牛血清、0.1w/v％的Ⅰ型胶原酶、200U/mL的青霉素、200μg/mL链霉素、0.5μg/mL两性霉素B的L-15培养液)中28℃消化6小时，当消化结束后，1200转/分离心5分钟，收集经消化处理的组织细胞悬液，加5毫升真鲷脑细胞专用增殖培养液(培养液配方为含有20v/v％胎牛血清、10ng/mL人表皮生长因子、10ng/mL人碱性成纤维生长因子、100U/mL的青霉素、100μg/mL链霉素、0.25μg/mL两性霉素B，pH值为7.2的L-15培养液)重悬，将细胞悬液转至25mL细胞培养瓶中，28℃培养箱中培养。每隔3～5天，吸出2.5mL上述25mL培养瓶中的培养液，以去除未贴壁的组织和死细胞，加入2.5mL新鲜的真鲷脑细胞专用培养液。
3.传代培养：待真鲷脑细胞长成单层后(约21天)，吸出培养瓶中的培养液，用HBSS平衡液清洗2次，加入0.5mL胰蛋白酶消化液(0.25％trypsin-EDTA solution，GIBCO)消化1～2min，吸去胰蛋白酶消化液，加入10mL真鲷脑细胞专用增殖培养液，用滴管吹打培养瓶底制成细胞悬液；按1：2的比例进行传代培养(取出5mL脑细胞悬液，加入到新的25mL培养瓶中，加入10mL真鲷脑细胞专用增殖培养液)，待细胞长成单层后(3～5天)，仍以上述的相同方法进行传代培养；传代至25代后，按1：3的比例，每2～3天传代一次。当传至第5代后，真鲷脑细胞专用增殖培养液中去除人表皮生长因子、人碱性成纤维生长因子、青霉素、链霉素、两性霉素B，胎牛血清浓度降至10v/v％。
上述真鲷脑细胞系，名称为真鲷脑BB细胞，于2021年8月12日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021227。
图1是不同代次的真鲷脑细胞的形态特征图：图1中A是第一代的真鲷脑细胞，主要由上皮样和成纤维样细胞组成；图1中B是第24代的真鲷脑细胞，主要是成纤维细胞样细胞。
实施例2真鲷脑细胞的特性
1.细胞冻存与复苏
细胞冻存：从培养的第5代到第65代细胞，每隔5代冻存一次。当传代培养的真鲷脑细胞生长至对数生长期时，采用程序降温盒于-80℃冰箱过夜后移入液氮罐中长期保存。
细胞复苏：挑取第30、40、50和第60代的冻存细胞，分别在冻存6个月、1年和2年后从液氮罐中取出，迅速置于37℃水浴中解冻，将细胞悬液移入细胞培养瓶中，加入5mL含10％FBS的M199培养基，28℃培养过夜，次日更换新鲜培养基。在细胞解冻后取少量细胞悬液于离心管中，用台盼蓝染色，显微镜下观察并计算细胞存活率。结果如图2所示：冻存6个月、1年和2年后，分别挑取第30、40、50和第60代的冻存细胞进行复苏，细胞表现出80～90％的存活率，2～3天即可长满；该细胞已传代70余次，细胞状态良好能稳定增殖，形态无明显变化，证明真鲷脑细胞已成为连续的传代细胞系，命名为真鲷脑细胞(真鲷脑BB细胞、BB细胞)系。
2.核型分析
将第15代、第60代细胞传至75cm2的培养瓶中，约48h左右，加入终浓度为0.2μg/mL的秋水仙素(Sigma公司)，28℃继续培养4h；胰酶消化细胞、0.075M的KCl溶液重悬，加入甲醇：冰乙酸(3：1)固定液。采用冷滴片法进行细胞滴片，相差显微镜下观察、计数；随机选择100个形态和分散较好的分裂相，进行核型分析。结果如图3所示：在第15代时98％的细胞含有48个染色体，第60代细胞的染色体数量在32～50中都有分布，其中细胞染色体众数为42和48。
3.细胞生长特性
(1)最佳培养基的选择
将对数生长期的第55代BB细胞用胰酶消化后，分别添加含10％FBS的Dulbecco’smodified Eagle’s medium(DMEM，Gibico)、Leibovitz’s medium L-15(Gibico)和M199(Gibico)培养基将初始细胞浓度调整至2×105个/mL，接种到12孔板中，每孔1mL，28℃培养，每隔24h取3个复孔用细胞计数仪(Count star)计数，取平均值。连续计数7天，绘制细胞生长曲线。结果如图4所示：细胞生长曲线呈S型，L15和M199培养基培养至第3d时细胞量最多，分别为7.38×105个/mL和10.54×105个/mL，BB细胞在DMEM培养基中一直生长缓慢，至第5d细胞量才达到最高值4.89×105个/mL。由此可见，细胞在M199中生长速度快、峰值高，可作为培养BB细胞的最佳培养基。
(2)最适血清浓度的确定
将对数生长期的第55代BB细胞用胰酶消化后，分别添加含4％、6％、8％、10％FBS的M199培养基将初始细胞浓度调整至2×105个/mL，接种到12孔板中，每孔1mL，28℃培养，每隔24h取3个复孔用细胞计数仪(Count star)计数，取平均值。连续计数7天，并绘制生长曲线。结果如图4所示：分别添加10％、8％血清的试验组，细胞在第3d达到峰值然后开始数量减少；添加6％和4％血清的试验组，细胞在第2d达到峰值然后开始数量减少。4个试验组中，10％血清组细胞增殖速度最快、峰值最高，因此，M199培养基中添加10％血清最适合BB细胞生长。
4.细胞转染
将含有pEGFP-N1的大肠杆菌划线接种LA-Kan+平板、挑取单菌落扩大培养后，根据OMEGA无内毒素质粒提取试剂盒说明书进行无内毒素质粒提取，参照Invitrogen的脂质体转染法转染60代的BB细胞，倒置荧光显微镜(Leica)观察荧光。结果如图5所示：pEGFP-N1质粒转染BB细胞后24h即可观察到绿色荧光，说明BB细胞可以作为表达外源基因的细胞受体。
实施例3神经坏死病毒(Nervous necrosis virus,NNV)、石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)、传染性脾肾坏死病毒(infectious spleenkidneynecrosis virus,ISKNV)、鳜弹状病毒(Siniperca chuatsirhabdovirus,SCRV)、罗非鱼湖病毒(Tilapia Lake Virus，TiLV)感染真鲷脑细胞(BB细胞)的敏感性
取对数生长期的第55代BB细胞，NNV按0.1MOI，SGIV、SCRV和TiLV均按0.01MOI，28℃孵育1h；ISKNV按1MOI进行接毒，28℃孵育2h，然后分别补加含2％血清的M199，28℃继续培养。每日观察细胞病变情况，当CPE达80％时，-80℃反复冻融两次，收获病毒液。
1.对不同病毒的敏感性
(1)BB细胞对NNV的敏感性
取对数生长期的第55代BB细胞，NNV按0.1MOI进行接毒，28℃孵育1h，然后补加含2％血清的M199，28℃继续培养。每日观察细胞病变情况，当CPE达80％时，-80℃反复冻融两次，收获病毒液。结果如图6所示：NNV感染BB细胞48h后，细胞皱缩、变圆；感染后第96h，大量细胞崩解脱落；而对照组细胞生长良好；表明BB细胞对NNV敏感，此病毒可在BB细胞上增殖。
将收获的NNV病毒液用M199培养液依次作10倍系列稀释，取10-4～10-10稀释度的病毒液接种长满BB细胞单层(第50代、第55代、第60代细胞)的96孔板中，最后一列作为对照，每个稀释度设8个平行，每孔100μL，28℃孵育1h后，补加含2％血清的M199培养液。放置28℃培养箱继续培养，每日观察记录细胞病变孔数。连续观察10d，Reed-Muench法计算TCID50。不同代次细胞收获的病毒滴度稳定在8.0～8.3logTCID50/mL，说明不同代次细胞对NNV感染的灵敏度比较稳定且滴度较高，因此BB细胞属于NNV高敏感细胞系。
(2)BB细胞对SGIV的敏感性
取对数生长期的第55代BB细胞，SGIV按0.01MOI进行接毒，28℃孵育1h，然后补加含2％血清的M199，28℃继续培养。每日观察细胞病变情况，当CPE达80％时，-80℃反复冻融两次，收获病毒液。结果如图7所示：SGIV感染BB细胞24h后，部分细胞脱落；感染后第48h，细胞肿胀，大量细胞崩解脱落；而对照组细胞生长良好；表明BB细胞对SGIV敏感，此病毒可在BB细胞上增殖。
将收获的SGIV病毒液用M199培养液依次作10倍系列稀释，取10-4～10-10稀释度的病毒液接种长满BB细胞单层(第50代、第55代、第60代细胞)的96孔板中，最后一列作为对照，每个稀释度设8个平行，每孔100μL，28℃孵育1h后，补加含2％血清的M199培养液。放置28℃培养箱继续培养，每日观察记录细胞病变孔数。连续观察10d，Reed-Muench法计算TCID50。不同代次细胞收获的病毒滴度稳定在7.0～7.2logTCID50/mL，说明不同代次细胞对SGIV感染的灵敏度比较稳定且滴度较高，因此BB细胞属于SGIV高敏感细胞系。
(3)BB细胞对ISKNV的敏感性
取对数生长期的第55代BB细胞，ISKNV按1MOI进行接毒，28℃孵育2h，然后补加含2％血清的M199，28℃继续培养。每日观察细胞病变情况，当CPE达80％时，-80℃反复冻融两次，收获病毒液。结果如图8所示：ISKNV感染BB细胞48h后，BB细胞主要表现为一定程度的皱缩和少量变圆；感染后第96h，感染细胞呈现变圆肿大，少量细胞崩解脱落；而对照组细胞生长良好；表明BB细胞对ISKNV敏感，此病毒可在BB细胞上增殖。
将收获的ISKNV病毒液用M199培养液依次作10倍系列稀释，取10-2～10-8稀释度的病毒液接种长满BB细胞单层(第50代、第55代、第60代细胞)的96孔板中，最后一列作为对照，每个稀释度设8个平行，每孔100μL，28℃孵育2h后，补加含2％血清的M199培养液。放置28℃培养箱继续培养，每日观察记录细胞病变孔数。连续观察10d，Reed-Muench法计算TCID50。不同代次细胞收获的病毒滴度稳定在4.0～4.2logTCID50/mL，说明不同代次细胞对ISKNV感染的灵敏度比较稳定且滴度相对较高，BB细胞属于ISKNV中度敏感细胞系。
(4)BB细胞对SCRV的敏感性
取对数生长期的第55代BB细胞，SCRV按0.01MOI进行接毒，28℃孵育1h，然后补加含2％血清的M199，28℃继续培养。每日观察细胞病变情况，当CPE达80％时，-80℃反复冻融两次，收获病毒液。结果如图9所示：SCRV感染BB细胞后42～48h，大多细胞变圆，细胞间出现拉丝、脱落、空斑的现象；而对照组细胞生长良好；表明BB细胞对SCRV敏感，此病毒可在BB细胞上增殖。
将收获的SCRV病毒液用M199培养液依次作10倍系列稀释，取10-2～10-8稀释度的病毒液接种长满BB细胞单层(第50代、第55代、第60代细胞)的96孔板中，最后一列作为对照，每个稀释度设8个平行，每孔100μL，28℃孵育1h后，补加含2％血清的M199培养液。放置28℃培养箱继续培养，每日观察记录细胞病变孔数。连续观察10d，Reed-Muench法计算TCID50。不同代次细胞收获的病毒滴度稳定在4.3～4.5logTCID50/mL，说明不同代次细胞对SCRV感染的灵敏度比较稳定且滴度相对较高，BB细胞属于SCRV中度敏感细胞系。
(5)BB细胞对TiLV的敏感性
取对数生长期的第55代BB细胞，TiLV按0.01MOI进行接毒，28℃孵育1h，然后补加含2％血清的M199，28℃继续培养。每日观察细胞病变情况，当CPE达80％时，-80℃反复冻融两次，收获病毒液。结果如图10所示：TiLV感染BB细胞后3天后，细胞开始收缩、变圆，少量细胞脱落；感染后第4d，大量细胞崩解脱落，细胞呈“破渔网状”；而对照组细胞生长良好；表明BB细胞对TiLV敏感，此病毒可在BB细胞上增殖。
将收获的TiLV病毒液用M199培养液依次作10倍系列稀释，取10-2～10-8稀释度的病毒液接种长满BB细胞单层(第50代、第55代、第60代细胞)的96孔板中，最后一列作为对照，每个稀释度设8个平行，每孔100μL，28℃孵育1h后，补加含2％血清的M199培养液。放置28℃培养箱继续培养，每日观察记录细胞病变孔数。连续观察10d，Reed-Muench法计算TCID50。不同代次细胞收获的病毒滴度稳定在4.3～4.5logTCID50/mL，说明不同代次细胞对TiLV感染的灵敏度比较稳定且滴度相对较高，BB细胞属于TiLV中度敏感细胞系。
2.NNV、SGIV、ISKNV、SCRV、TiLV感染BB细胞后的PCR检测
对上述收获的病毒液分别提取病毒基因组，根据GenBank登录的NNV衣壳蛋白序列、SGIV和ISKNV的主衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)序列、鳜弹状病毒G蛋白序列、罗非鱼湖病毒Segment 3序列设计引物，进行PCR扩增(见表1)。结果如图11所示：可扩增到562bp、317bp、372bp、491bp、430bp的单一条带，与预期片段大小一致；将PCR产物测序，结果与GenBank登录的NNV衣壳蛋白、SGIV和ISKNV的MCP、鳜弹状病毒G蛋白、罗非鱼湖病毒Segment 3序列一致，同源性为100％，表明上述病毒可以成功感染到BB细胞。
表1 PCR扩增引物序列
Figure BDA0003265459580000101
实施例4真鲷脑细胞(BB细胞)的毒理学研究
1.BB细胞活力测定
将密度为2×105个/mL的第55代BB细胞，接种到96孔细胞培养板中，28℃过夜培养后用PBS洗2次。按照每孔加入(180μLΜ199培养基含5％血清+20μLCdCl2)的方式，参照预实验结果，使Cd的终浓度分别达到0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001mol/L共6个浓度梯度，对照组直接加入200μL含5％血清的M199培养基，每个Cd浓度组及对照组均设置4个复孔，28℃培养箱中培养24h后，收集96孔培养板中Cd暴露后的BB细胞，采用MTT法测定细胞活力。实验所得数据均表示为平均数±标准差(mean±SD)，通过SPSS 22.0统计软件进行数据处理，并利用t检验对细胞活力进行组间差异性分析，当P＜0.05时差异显著，P<0.01时差异极显著。结果如图12所示：随着Cd浓度的增大，BB细胞活力逐渐降低，并呈现剂量-效应关系。当Cd浓度高于0.001mol/L时，处理组与对照组差异极显著(P<0.01)。
2.BB细胞凋亡检测
将密度为2×105个/mL的第55代BB细胞，接种到12孔细胞培养板中，28℃过夜培养后用PBS洗2次。根据预实验结果，按照(900μL含5％血清的M199培养基+100μLCdCl2)的方式，选取终浓度为0.1mg/L Cd对BB细胞进行24h暴露，对照组直接加入1000μL含5％血清的M199培养基。按照Annexin-V-FLUOS染色试剂盒说明书对Cd暴露后的BB细胞进行凋亡检测。染色后马上于倒置荧光显微镜下观察结果。结果如图13所示：镉对BB细胞暴露24h后，倒置显微镜可见部分细胞收缩、变圆、48h后大部分细胞变圆、脱落，而对照组细胞无变化；经Annexin和PI双重染色后，镉暴露24h的BB细胞显示绿色和红色荧光；对照组BB细胞无红色或绿色荧光。以上结果表明，镉可引起BB细胞产生明显的细胞凋亡和坏死现象。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所
<120> 真鲷脑细胞系及其构建方法与应用
<130>
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgagtcaaca cgggtggaga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgtgtcagtc atgtgtcgct 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgggcaagag ttttcggtc 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aacggcaacg ggagcacta 19
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgtgagaccg tgcgtagt 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agggtgacgg tcgatatg 18
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctgaatctcc aagaatggaa aacc 24
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aattttggcc aactcgattc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tatgcagtac tttccctgcc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ttgctctgag caagagtacc 20

Claims (9)

1.一种真鲷脑细胞系，名称为真鲷脑BB细胞，于2021年8月12日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021227。
2.权利要求1所述的真鲷脑细胞系的培养方法，采用胰酶消化权利要求1所述的真鲷脑细胞系，加入培养基培养；
所述培养基为含胎牛血清的DMEM培养基、含胎牛血清的L-15培养基和含胎牛血清的M199培养基中的至少一种。
3.权利要求1所述的真鲷脑细胞系在如下（1）～（3）中任一种中的应用；
（1）分离水产动物病毒；
（2）培养水产动物病毒；
（3）非诊断治疗目的地检测水产动物病毒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述水产动物病毒为神经坏死病毒、石斑鱼虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、鳜弹状病毒和罗非鱼湖病毒中的至少一种。
5.权利要求1所述的真鲷脑细胞系在药物筛选中的应用，所述药物为用于预防或治疗水产动物病毒感染所致的疾病的药物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：
所述水产动物病毒为神经坏死病毒、石斑鱼虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、鳜弹状病毒和罗非鱼湖病毒中的至少一种。
7.权利要求1所述的真鲷脑细胞系在环境污染物监测中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述环境污染物为重金属。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述环境污染物为镉。
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Establishment and characterization of a fibroblast cell line derived from the dorsal fin of red sea bream, Pagrus major (Temminck & Schlegel);C-C Ku, C-H Lu1 and C-S Wang;《Journal of Fish Diseases》;20101231;第187-195页 *
基于CPB细胞扩增体系的鳜弹状病毒增殖条件的优化;罗霞 等人;《水产学报》;20180930;第1481-1488页 *

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