CN113621553A - 一种双斑东方鲀卵巢组织细胞系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种双斑东方鲀卵巢组织细胞系及其应用，属于生物技术领域。本发明将双斑东方鲀的卵巢进行分离培养，获得其原代细胞，并进行连续继代培养，最终建立稳定的双斑东方鲀卵巢细胞系。该细胞系的细胞性状优良，以长纤维状细胞为主，分裂旺盛，传代时间短，易消化，贴壁率好，耐饥饿。本发明的双斑东方鲀卵巢细胞系为双斑东方鲀性腺发育机制研究提供了一种新的体外模型。

Description

一种双斑东方鲀卵巢组织细胞系及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种双斑东方鲀卵巢组织细胞系及其应用。

背景技术

双斑东方鲀 (Takifugu bimaculatus)，属鲀形目，鲀科，东方鲀属，为近海暖温性底层鱼类，分布于我国南海、东海和黄海南部。其经济价值高、开发潜力大的水产珍品。双斑东方鲀是福建省养殖的河鲀鱼主要品种，是鱼虾贝生态混养模式主要搭配养殖品种，对于阻断对虾病害的水平传播、提高养殖成活率起到重要作用，目前在福建省已经达到一定的规模。2015年养殖面积8万亩以上，产量1.1万吨左右，产值8亿元以上，漳浦县为河豚鱼主产区，产量占全省90%以上。

建立鱼类细胞系能为鱼类病毒分离、抗病毒机制、疫苗研发、转基因技术、嵌合体组织工程等研究提供极大的便捷，且设施人力等资源要求相对活体实验低，重复性好，研究周期短。细胞培养为开展鱼类毒理、病理、遗传分析等研究提供了重要的体外模型。

目前关于双斑东方鲀细胞系的建立未见报道；仅有关于其他东方鲀属的部分细胞系的建立及少部分分离培养。王培军等采用组织块培养和细胞悬液培养暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）的肾脏组织对暗纹东方纯组织细胞的原代培养方法进行了研究和探索，但有并达到预期的效果；Samuel等对星点东方鲀（Takifugu niphobles）和红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）大脑、肝脏、鳍、脾脏、肾脏、鳔和肌肉进行原代培养，其中眼细胞的生长速度最快，两种河鲀的各种组织中衍生的细胞进行多次继代培养，红鳍东方鲀眼细胞在近一年的过程中已经在连续培养中维持超过60次继代。Zhang等（Zhang et al.Initiation of two ovarian cell lines from Fugu rubripes (Temminck et. Schlegel)[J]. 海洋学报(英文版), 2015. 701-711.）从红鳍东方鲀卵巢中建立了称为TSOC1和TSOC2的细胞系，TSOC1由梭形上皮样细胞组成，而另一种是鹅卵石样细胞，并研究了包括温度，FBS浓度和pH在内的生长要求条件。Yang等已建立红鳍东方鲀精巢细胞系，命名为TRS，并证明了可有效地将外源基因或蛋白质传递到TRS中。

本研究将双斑东方鲀的卵巢进行分离培养，获得其原代细胞，并进行连续继代培养，最终建立稳定的双斑东方鲀卵巢细胞系，为双斑东方鲀性腺发育机制研究提供了一种新的体外模型。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有问题，提供一株双斑东方鲀卵巢组织细胞系及其应用。本发明将双斑东方鲀的卵巢进行分离培养，获得其原代细胞，并进行连续继代培养，最终建立稳定的双斑东方鲀卵巢细胞系，为双斑东方鲀性腺发育机制研究提供了一种新的体外模型。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株双斑东方鲀卵巢细胞系，所述细胞系分类命名为双斑东方鲀卵巢细胞FGO，已于2021年4月26日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：C202175，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

一株双斑东方鲀卵巢细胞系(FGO)的构建方法，包括以下步骤：

（1）双斑东方鲀卵巢组织的获取：将7个月大，长8-10cm的双斑东方鲀幼鱼在含三抗的灭菌海水，中暂养1 - 2h，使用添加1wt‰次氯酸钠的灭菌海水对鱼体表面进行消毒15min，然后滴入占灭菌海水体积0.005 - 0.015%的丁香酚，直至鱼体翻转，腹部朝上，对刺激应激无反应为止；以灭菌纱布块擦除鱼体表面粘液，再以浸有酒精的纱布擦拭鱼体表面后，将鱼体移入超净台，用解剖器具取出卵巢组织，于含三抗的PBS溶液中漂洗3 - 4次；

上述三抗为三抗的100 ×浓缩液：含10000 U/mL青霉素、10000 μg/mL链霉素及10000 U/mL两性霉素B；

三抗的灭菌海水：配制海水时每100 mL海水加入1 mL三抗的100 ×浓缩液；

含三抗的PBS溶液：100mL PBS液加入1 mL三抗的100 ×浓缩液；

（2）原代培养：将上述双斑东方鲀卵巢组织切碎至1 mm³的小组织块，以PBS溶液漂洗三次；漂洗后将上述小组织块转移至15 mL离心管中，使用0.25wt%胰酶消化法获得单细胞，并利用70 μm细胞过滤筛过滤消化的细胞，转移至15 mL离心管中，收集细胞沉淀，用5mL完全培养液重悬细胞后接种于细胞培养瓶中，于27℃恒温培养启动原代培养，每2 - 3天更换完全培养液一次；

（3）传代培养：原代培养至贴壁细胞增殖至80-90%覆盖率时，移除旧培养液，加入5mL含1vol%三抗的PBS溶液清洗1次；然后以0.25wt%胰酶消化法传代悬起细胞，以细胞悬液与完全培养液的体积比为1:2进行传代；以后每隔3-4天传代一次，直至60代，成功建立双斑东方鲀卵巢细胞系。

上述完全培养液：以L-15培养液为基础培养液，胎牛血清、β-巯基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纤维素钠、人碱性成纤维生长因子（Human FGF- basic）、人上皮细胞生长因子（Human EGF）、人肝细胞生长因子（Human HGF）、青霉素、链霉素、鱼血清与鱼胚提取物（TEE）的添加量分别为15vol%~20vol%、0.5vol‰、50 μg/mL、50 μg/mL、20 μg/L、10 μg/L、2μg/L、100 IU/mL、100 μg/mL、1vol%和1vol%。

上述鱼血清的制备方法：用15% (w/v) EDTA浸润10 mL注射器，从双斑东方鲀成鱼的尾静脉取血到15 mL的置于冰上的离心管中。3,500g离心15 min，转移上清液到50 mL离心管中，4 °C孵育过夜，3,500 g再离心30 min，上清液用0.2 μm过滤器过滤除菌，每10 mL一管分装储存于15 mL离心管中，- 20°C储存。

上述鱼胚提取物（TEE）的制备方法：至少收集2000个发育至第7天（30 hpf或受精后孵化前）的健康双斑东方鲀胚胎，用1 × PBS清洗3次，- 20℃保存备用。取500个胚胎，在玻璃匀浆器中用冷的1 × PBS在冰上匀浆，将匀浆液转移到15 mL离心管中。在液氮—37 °C水浴反复冻结—融解3次后，将匀浆液进行4°C、3,500g离心30 min。转移上清液至新的1.5mL离心管中，18,000g、4°C离心至少30 min以保证匀浆液分为3层：最上层是脂质层，最底层是碎片，中间层是双斑东方鲀胚胎提取物（TEE），清晰且呈绿色。收集TEE到15 mL离心管中，尽可能减少脂质污染。如果分层不清晰，重复离心分层步骤以获取最佳的分层效果和TEE产量。TEE用0.2 μm过滤器过滤除菌，并用1 × PBS调整体积到1 mL含400个胚胎（即2.5 μL/胚胎）。然后每1 mL 分装到一个1.5 mL离心管中，- 20°C储存。

上述一株双斑东方鲀卵巢细胞系在双斑东方鲀性腺发育相关功能基因研究中的应用。

上述一株双斑东方鲀卵巢细胞系在基因编辑和功能分析中的应用。

上述一株双斑东方鲀卵巢细胞系在药理学，或基因筛选中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

（1）本发明成功构建了首个双斑东方鲀卵巢细胞系。本发明的双斑东方鲀卵巢细胞系的细胞性状优良，以长纤维状细胞为主，分裂旺盛，传代时间短，易消化，贴壁率好，耐饥饿。

（2）本发明细胞系的构建方法重复性强、构建的细胞系稳定性好。

（3）本发明的构建方法所使用的完全培养液中包括L-15培养液、胎牛血清FBS、β-巯基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纤维素钠、Human FGF- basic、Human EGF、Human HGF、青霉素及链霉素，L-15培养液和胎牛血清FBS为细胞生长提供了充足的营养；β-巯基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纤维素钠、Human FGF- basic、Human EGF和Human HGF的加入可以刺激细胞活性、加速细胞分裂增殖，同时为细胞体外培养提供了良好的缓冲环境，能够使细胞在长期培养时维持稳定的pH；鱼血清与鱼胚提取物有助于提高鱼细胞培养中细胞的有丝分裂活性，可能是目前培养基中的关键添加剂之一；青霉素、链霉素与两性霉素B加大了抗菌谱，特别在原代培养时，能有效地抑制细菌生长，防止细胞污染。

附图说明：

图1 双斑东方鲀卵巢组织细胞系原代培养的显微镜照片。A：原代培养第2天的显微镜照片；B：原代培养第5天的显微镜照片。

图2 双斑东方鲀卵巢组织细胞系传代培养的显微镜照片。A：传代培养第1代的显微镜照片；B：传代培养第5代的显微镜照片；C：传代培养第10代的显微镜照片；D：传代培养第20代的显微镜照片；E：传代培养第30代的显微镜照片；F：传代培养第40代的显微镜照片；G：传代培养第50代的显微镜照片 ；H：传代培养第60代的显微镜照片。

图3 双斑东方鲀卵巢组织细胞系冻存后复苏24h后的显微镜照片。A：复苏24h后的显微镜照片；B：复苏72h后的显微镜照片；C：复苏后再传代24h的显微镜照片；D：复苏后再传代48h的显微镜照片。

图4 双斑东方鲀卵巢组织细胞系在不同传代比例下的增殖曲线。

图5 双斑东方鲀卵巢组织细胞系在不同FBS浓度对细胞增殖的影响。

图6 双斑东方鲀卵巢组织细胞系在不同培养液对细胞增殖的影响。

图7 FGO细胞验证。FGO：双斑东方鲀卵巢细胞FGO；O：卵巢组织；FGT：双斑东方鲀精巢细胞；T：精巢组织；H：心脏组织；K：头肾组织；B：脑组织；S： 脾脏组织；M：肌肉组织。

图8 双斑东方鲀卵巢组织细胞系的染色体图（100×）。

图9 电转染后双斑东方鲀卵巢细胞状况的共聚焦显微镜照片。

图10 河鲀毒素结合蛋白各组织分布电泳结果。L：肝脏、O：卵巢组织、FGO：卵巢组织细胞、M：Maker #2501、S：脾脏组织、B：脑组织、T：精巢组织、FGT：精巢细胞。

图11 河鲀毒素结合蛋白序列比对结果。

图12 sgRNA体外活性检测。

图13 sgRNA细胞敲除实验电泳结果。

图14 CRISP/Cas9基因编辑检测结果。

图15 双斑东方鲀卵巢组织细胞系饥饿处理的显微镜照片。A：饥饿处理30天后的显微镜照片；B：饥饿处理后更换完全培养液36h的显微镜照片。

具体实施方式

以下结合实施实例对本发明做进一步说明，需要指出的是，本实施实例仅用于解释本发明，而非对本发明的限制。

实施例 1

一株双斑东方鲀卵巢细胞系的建立方法，包括以下步骤：

（1）将7个月大，长8-10cm的双斑东方鲀幼鱼在含三抗的灭菌海水中暂养1 ~2 h，使用添加1wt‰次氯酸钠的灭菌海水对鱼体表面进行消毒15 min。结束时滴入占灭菌海水体积0.005 - 0.015%的滴丁香酚，直至鱼体翻转，腹部向上，对刺激无应激反应为止。以灭菌纱布块擦除鱼体表黏液。以浸有75vol%酒精的纱布擦拭鱼体表2次。将鱼体移入超净台，用解剖器具取出卵巢组织，于含三抗的PBS溶液中漂洗3 - 4次。

上述三抗为三抗的100 ×浓缩液即含10000 U/mL青霉素、10000 μg/mL链霉素及10000 U/mL两性霉素B；

三抗的灭菌海水：配制海水时每100 mL海水加入1 mL三抗的100 ×浓缩液；

含三抗的PBS溶液：100mL PBS液加入1 mL三抗的100 ×浓缩液。配制海水时每100mL海水加入1 mL三抗的100 ×浓缩液。

（2）将卵巢组织块以两把11号手术刀交叉切碎至1 mm³大小的小组织块。将切好的小组织块以含三抗的PBS溶液漂洗三次。漂洗后将上述小组织块转移至15mL离心管中，使用0.25wt%胰酶消化法获得单细胞，并利用70 μm细胞过滤筛过滤消化的细胞，转移至15mL离心管中，收集细胞沉淀，用5mL完全培养液重悬细胞后接种于25 cm²细胞培养瓶中，于27℃恒温培养启动原代培养，每2-3天换完全培养液一次。如图1A-B所示，双斑东方鲀卵巢组织启动原代培养后第3天即有贴壁细胞贴壁（图1 A），至第5天已有细胞扩增至70-80%（图1B）。

所述完全培养液以L-15培养液为基础培养液，胎牛血清、β-巯基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纤维素钠、人碱性成纤维生长因子（Human FGF- basic）、人上皮细胞生长因子（Human EGF）、人肝细胞生长因子（Human HGF）、青霉素、链霉素、鱼血清与鱼胚提取物（TEE）的添加量分别为15vol%~20vol%、0.5vol‰、50 μg/mL、50 μg/mL、20 μg/L、10 μg/L、2 μg/L、100 IU/mL、100 μg/mL、1vol%和1vol%。

上述鱼血清的制备方法：用15% (w/v) EDTA浸润10 mL注射器，从双斑东方鲀成鱼的尾静脉取血到15 mL的置于冰上的离心管中。3,500g离心15 min，转移上清液到50 mL离心管中，4 °C孵育过夜，3,500 g再离心30 min，上清液用0.2 μm过滤器过滤除菌，每10 mL一管分装储存于15 mL离心管中，- 20°C储存可达1年以上。

上述鱼胚提取物（TEE）的制备方法：至少收集2000个发育至第7天（30 hpf或受精后孵化前）的健康双斑东方鲀胚胎，用1 × PBS清洗3次，- 20℃保存备用。取500个胚胎，在玻璃匀浆器中用冷的1 × PBS在冰上匀浆，将匀浆液转移到15 mL离心管中。在液氮—37 °C水浴反复冻结—融解3次后，将匀浆液进行4°C、3,500g离心30 min。转移上清液至新的1.5mL离心管中，18,000g、4°C离心至少30 min以保证匀浆液分为3层：最上层是脂质层，最底层是碎片，中间层是双斑东方鲀胚胎提取物（TEE），清晰且呈绿色。收集TEE到15 mL离心管中，尽可能减少脂质污染。如果分层不清晰，重复离心分层步骤以获取最佳的分层效果和TEE产量。TEE用0.2 μm过滤器过滤除菌，并用1 × PBS调整体积到1 mL含400个胚胎（即2.5 μL/胚胎）。然后每1 mL 分装到一个1.5 mL离心管中，- 20°C储存可达1年以上。

注意：在加入培养基前，取冷冻的TEE在室温(25°C)融化，18,000g、4 °C离心至少30 min以去除碎片。分层不清晰和上清液转移不干净会影响TEE质量。

（3）当双斑东方鲀卵巢细胞系原代培养贴壁细胞覆盖率达到80-90%或是更高时，原代细胞会出现较明显的接触抑制，此时以胰酶消化法启动传代培养。采用经典细胞消化步骤：移除原先培养瓶中的旧培养液；加入5 mL PBS溶液（含1%（v/v）三抗），清洗1次以去除原培养液中的血清、二价金属离子（此类物质会极大的影响胰蛋白酶的消化作用）；去除上述PBS溶液，加入0.5 mL 0.25wt%的商品化的含EDTA的胰酶消化液（Gibco，25200072），晃动瓶体，使胰酶溶液与底层细胞充分接触，倒出胰酶消化液（此步应较快进行，否则易造成消化过度；移除胰酶消化液时应留有足够使平底保持湿润的溶液，否则瓶底易出现部分区域变干而影响消化）；移出培养瓶，倒置显微镜下观察，至大多数细胞变圆解除贴壁后，立即移入超净台加入5 mL完全培养液终止消化；吹打，镜检吹打效果，如若残余细胞过多则可重复消化一次；以1:2-10的比例将细胞悬液接种至新培养瓶，补齐培养液至5 mL后将培养瓶置于27℃恒温培养，以后每隔2-3天传代一次。

如图2 A - H 所示，双斑东方鲀卵巢细胞系从1代至第60代较稳定地呈现，以长纤维状为主，在纤维状细胞的夹缝里常常伴有少许卵圆形的细胞。

获得的双斑东方鲀卵巢组织细胞系，其分类命名为双斑东方鲀卵巢组织细胞FGO，于2021年4月26日保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202175，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

实施例 2

实施例1制备的双斑东方鲀卵巢细胞系的冻存与复苏。

（1）冻存：取一瓶75cm²的生长旺盛铺满培养瓶瓶底的双斑东方鲀卵巢细胞系细胞，采用0.25wt%胰酶消化法，离心后收集细胞沉淀，缓慢加入3 mL配置好的细胞冻存液，并轻轻吹打细胞，使其均匀分散在细胞冻存液中，使用移液枪将液体移入冻存管中。冻存管在4℃放置1 h，再置于程序梯度降温冻存盒中（温度下降速度为1℃/min），将冻存盒置于-80℃放置1天，最后取出冻存管并浸入液氮中，可长期冻存。

冻存液配方，按体积百分比计：10%二甲亚砜（DMSO）+90%胎牛血清（Zeta-life,Australia Origin, Z7010FBS-500）

（2）复苏：将冻存管从液氮中取出，迅速放置在已经调节好温度（40℃）的水浴锅中，融化细胞的过程中应不断地摇晃冻存管，使其快速均匀解冻，直至完全融化。将融化的细胞悬液转移到25 cm²培养瓶离心管中，向培养瓶中补齐5 mL的完全培养液，于27℃，5%CO₂培养。24 h后更换新的完全培养液，继续培养。

如图3 A-B 所示，对于双斑东方鲀卵巢细胞系冻存后复苏24 h贴壁率达到60%-80%，与冻存前的细胞形态无明显差异；如图11所示冻存后复苏72 h后细胞可长满培养瓶瓶底；如图12，复苏后的双斑东方鲀卵巢细胞能进行正常传代，且与冻存前细胞以及冻存复苏后的细胞形态无差异。

实施例 3

实施例1的双斑东方鲀卵巢细胞系不同传代比例增殖曲线的影响：

从实施例1所建立的双斑东方鲀卵巢细胞系中选取形态良好、增殖旺盛的细胞，消化传代，分别以1:2、1:3、1:5和1:10进行传代至25 cm²细胞培养瓶（即向4个培养瓶分别加入2.5 mL，1.6 mL，1 mL，0.5 mL细胞悬液，而后用完全培养液将各瓶溶液总量补齐至5mL）。从传代24h起每隔24h拍照一次，采用经典五点交叉取样法对培养细胞进行倒置显微拍摄统计视野观测细胞数，每组取5点观测细胞数总和作图分析。

如图4所示，对于双斑东方鲀卵巢细胞系，不同的传代比例对细胞影响很大，除了1:2、1:3传代组外，其余组增殖均十分缓慢。第一天末的总贴壁数目与接种密度成正比，之后除1:2组以外，其余组均以较慢的速度增殖。

实施例 4

实施例1的双斑东方鲀卵巢细胞系不同FBS浓度对细胞增殖的影响：

分别配置含0vol%，5vol%，10vol%，15vol%，20vol%FBS浓度的培养液（其他成分相同，分别包含：0.5vol‰、50 μg/mL、50 μg/mL、20 μg/L、10 μg/L、2 μg/L、100 IU/mL、100 μg/mL、1vol%和1vol%的β-巯基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纤维素钠、人碱性成纤维生长因子（Human FGF- basic）、人上皮细胞生长因子（Human EGF）、人肝细胞生长因子（HumanHGF）、青霉素、链霉素、鱼血清与鱼胚提取物（TEE）），取形态良好的双斑东方鲀卵巢和精巢细胞，将细胞消化传至75cm²培养瓶中，待其细胞覆盖率达90%时再将细胞传至含不同FBS浓度的培养基中，3天后采用五点计数法对各瓶细胞进行计数并作图分析。

如图5所示，FBS浓度过低或者培养液不含FBS都对细胞不友好，卵巢细胞很难正常生长，几乎不会进行扩增，而适当提高FBS浓度，细胞会明显增加扩增速度，15vol％和20vol％的FBS浓度使细胞能得到较好的扩增，总体来看，细胞的扩增效率和FBS浓度呈正相关。

实施例 5

实施例1的双斑东方鲀卵巢细胞系不同培养液对FGO细胞的影响

为了确定FGO的最适基础培养基，我们在实验前分别配置以M199、MEM、DMEM/F-12、L-15为基础培养基的添加15vol%胎牛血清FBS以及0.5vol‰、50 μg/mL、50 μg/mL、20 μg/L、10 μg/L、2 μg/L、100 IU/mL、100 μg/mL、1vol%和1vol%的β-巯基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纤维素钠、人碱性成纤维生长因子（Human FGF- basic）、人上皮细胞生长因子（Human EGF）、人肝细胞生长因子（Human HGF）、青霉素、链霉素、鱼血清（自制）与鱼胚提取物（自制）的完全培养液，再取增殖能力较好的细胞进行培养，在27℃下使用不同培养基培养，每隔1天在显微镜下观察并采用五点交叉取样法进行统计，对观测细胞数总和作图分析。

如图6所示，在1-2天细胞在各种培养液中均能较好地扩增生长，MEM培养液中的细胞在经过短暂地增殖后细胞几乎停止了扩增，说明MEM培养液并不适合FGO细胞。在L-15培养液中的增殖速度明显快于其他三种，且能持续扩增，因此，L-15培养液为最适合FGO细胞的培养液。

实施例 6

实施例1的双斑东方鲀卵巢细胞系的鉴定与验证

使用RT-PCR技术，对双斑东方鲀卵巢细胞系进行鉴定如图7。

COI基因(上游引物序列为: 5’-ATCCTTCCTCCTTCTGCT-3’,下游引物序列为: 5’-TTGTATTTAGGTTTCGGTCA-3’)，在各组织和FGO细胞中都有扩增出，割胶纯化后，测序序列与NCBI双斑东方鲀COI基因的序列比对结果在98%以上；

foxl2基因(上游引物序列为: 5’-AAAGAGCGACCCAAAGAGGA-3’,下游引物序列为:5’-AGAACGGGAACTTACTGATGATGT-3’)，在卵巢和卵巢细胞有明显的表达，PCR产物测序比对率99%；而dmrt1基因(上游引物序列为: 5’-GAGTCATGGCGGCTCAGGT-3’,下游引物序列为:5’-CACGCTAAAGATGGGTGGG-3’)，在卵巢与卵巢细胞均没有表达，表明FGO细胞是来自卵巢细胞。

实施例 7

实施例1的双斑东方鲀卵巢细胞系的染色体分析：

取分裂旺盛的双斑东方鲀卵巢细胞，接种至75 cm²细胞培养瓶，待细胞增长处于对数期，加入终浓度为20 μg/mL的秋水仙碱，继续培养6-8 h后收集细胞得到细胞悬液。将细胞悬液移至15 mL离心管，1000 g离心10 min，轻轻吸出上清液，加入4 mL 0.075 M KCl低渗30 min；加入0.5 mL新鲜配置预冷的卡诺氏固定液预固定10 min，2000 g离心10 min；取细胞沉淀加入0.5 mL卡诺氏固定液，以移液枪重悬沉淀；再加入1 mL卡诺氏固定液；30cm高度向玻璃载玻片(于-20 ℃预处理)滴片，水平放置以使其彻底延展，65℃干燥；而后浸入含Giemsa染液工作液的染缸中染色10 min，双蒸水冲洗以去除玻片表面渣滓，干燥，中性树脂封片，1000 ×油镜观察计数。

如图8和表1所示，对双斑东方鲀卵巢细胞系的染色体分析72%观测到的分裂相细胞染色体数目为44条。

表1 双斑东方鲀卵巢组织细胞系的染色体图（100×）

实施例 8

实施例1的双斑东方鲀卵巢细胞系转染pEGFP-N1质粒

感受态细菌细胞制备：采用大肠杆菌DH5α菌种，采用经典氯化钙法制备感受态细胞，-80℃长期保存。

质粒制备：按照HiPure Plasmid MaxiPrep Kit质粒大提试剂盒（TransGene公司）说明书提取pEGFP-N1质粒，-20℃保存。

质粒转化：取1 ng 质粒DNA溶液置于EP管中，冰浴放置。从-80℃冰箱取出100 μL感受态细菌悬液，迅速溶解，加入DNA溶液中，冰浴10 min。42℃，水浴2 min。将EP管于37℃220 rpm培养1 h。而后将转化后的菌液涂布于含抗生素的LB固体培养平板上。

转染细胞：取旺盛生长的双斑东方鲀卵巢细胞系细胞，待细胞覆盖率至70%-80%后，即在电转细胞的前一天晚上换液，此次换液不含双三抗。用0.25wt%的胰酶在37℃消化细胞，收集悬浮细胞于15 mL离心管内。离心收集细胞,控制转数在 800-1000转。离心3-5min，弃掉上清。吸取一定量的OPTI-MEM I充分重悬细胞(建议2 mL)，再次离心收集细胞。弃掉上清。(最大程度地洗掉血清，血清会影响转化效率)；加入同样体积的OPTI-MEM I，悬浮细胞，进行第二次离心收集细胞。结束后，弃上清，用250 μl Opti MEM I悬浮至1 × 10⁶个/mL细胞，使得电阻达到200欧姆。充分悬浮细胞，每20 uL的重悬细胞加入pEGFP-N1质粒5μg，每个gap=2mm电极杯中添加25 μL细胞-质粒混合物；充分混匀细胞，分装至电极杯中，每个电极杯26 μL。设置程序，进行电转实验。在27℃，5% CO₂恒温培养箱内正常培养细胞直至观察分析，于48 h后DAPI染色并使用共聚焦荧光显微镜拍照。如图9所示，转染48 h后，于共聚焦荧光显微镜下镜检能够检测到绿色荧光，pEGFP-N1质粒在该细胞系中有表达。说明建立的双斑东方鲀卵巢细胞系能适应外源基因的转染实验。

实施例 9

S1.体外转录合成sgRNA：通过与红鳍东方鲀PSTBP2基因(GenBank: XM_029836965)和NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)中双斑东方鲀染色体水平参考基因组(GenBank: GCA_004026145.2)比较，获得双斑东方鲀PSTBP2基因。根据测序结果所获得的河鲀毒素结合蛋白pstbp基因的序列片段，利用华中农业大学Zhao等（ZhaoC, Zheng X, Qu W, et al. CRISPR-offinder: a CRISPR guide RNA design and off-target searching tool for user-defined protospacer adjacent motif[J].International Journal of Biological Sciences. 2017, 13(12): 1470-1478.）设计的sgRNA软件进行设计。筛选出的sgRNA（sgRNA1: 5’-GGATCCACTCT-3’; sgRNA2: 5’-GGTGTCATCGTGTTAAATGA-3’）加上T7接头序列以及西南大学提供的T7-sgRNA质粒上的骨架序列(5’-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT-3’)送上海生工公司合成。将公司合成序列以西南大学提供T7-sgRNA质粒为模板（Manghwar H, Li B, Ding X, et al. CRISPR/Cas systems in genome editing:methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, andstrategies to mitigate off-target effects[J]. Advanced science (Weinheim,Baden-Wurttemberg, Germany), 2020, 7 (6): 1902312-1902312.），PCR线性化处理；线性化产物割胶回收。以1 μg回收产物为模板，用T7聚合酶进行体外转录;

S2.sgRNA体外活性检测：验证所得的河鲀毒素结合蛋白片段回收产物为对照（不添加sgRNA），以下反应体系检测：

Microtube管中加入上述反应体系，混匀，于37℃，孵育反应3 h；电泳检测。

R Cas9混合物制备：Microtube管中加入以下反应体系，混匀，于37℃，孵育反应3h；

S4.细胞电转染：取增殖较好的FGO细胞，在电转细胞的前一天晚上换液，此次换液不含三抗。用胰酶消化，离心收集细胞，弃上清。吸取2 mL的OPTI-MEM I充分重悬细胞，再次离心收集细胞，弃掉上清。加入同样体积的OPTI-MEM I，悬浮细胞，进行第二次离心收集细胞。结束后，弃上清，用25 μL Opti MEM I悬浮细胞，使电阻达200欧姆。充分悬浮细胞，加入孵育3 h的CrispR Cas9混合物，每个gap=2 mm电极杯中添加5 μg的质粒；充分混匀细胞，分装至电极杯中，每个电极杯26 μL。设置程序，进行电转实验；每个实验设置3个平行实验。正常培养细胞直至观察分析，于48 h后提取细胞DNA，进行PCR验证实验，回收PCR产物，连接PMD 19-T载体并送测。

R1：通过PCR扩增，电泳图如（图10）测序结果比对，获得了388 bp序列片段(如下)，使用NCBI BLAST在线软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对，与红鳍东方鲀河鲀毒素结合蛋白比对率为98% (图11)。

R2：以验证所得的河鲀毒素结合蛋白pstbp基因的片段回收产物为阴性对照(不添加sgRNA)，有活性sgRNA在体外检测时会将DNA切碎（图12 R2），而没有活性的sgRNA则DNA条带可见（图12 R1）。

R3：通过电转染双斑东方鲀卵巢组织细胞，将CrispR Cas9混合物导入细胞体内，进行pstbp基因敲除实验。敲除pstbp基因后的细胞形态与正常细胞没有明显差别。为了验证敲除结果，我们提取了两株敲除细胞的DNA，并利用PCR扩增进行电泳检测，结果(如图13)，利用sgRNA1敲除的细胞，PCR扩增后条带大小与对照组相似(如图13 R1a、R1b)，而利用sgRNA2敲除的细胞，PCR扩增后条带有不同片段大小的条带(如图13 R2a、R2b)，将PCR产物送测，R1a、R2a的测序结果与对照组基本一致，R2a、R2b测序结果出现重叠峰，说明利用sgRNA2能达到一定的敲除效果。测序序列分别与原始序列进行比对(图14)，利用sgRNA1进行敲除的细胞，扩增所得片段与河鲀毒素结合蛋白pstbp基因序列基本一致，sgRNA1位点为发生突变；而利用sgRNA2进行敲除的细胞，扩增所得片段在sgRNA2位点发生突变，说明利用sgRNA2能达到一定的敲除效果。

实施例 10

实施例1的双斑东方鲀卵巢细胞系的饥饿处理取细胞覆盖率80%-100%的双斑东方鲀细胞，用完全培养液换液，于27℃，5vol% CO₂培养，30 d后发现培养液颜色由橙色变成浅黄色，说明培养液中的营养物质被大量消耗。显微镜下观察双斑东方鲀卵巢细胞形态，如图15 A所示，可见由大量细胞解除贴壁而形成空洞状；部分细胞由于营养消耗细胞发生皱缩，在显微镜下观察折光性增强；细胞仍有较多细胞存活且形态未发生变化。如图15 B所示，当再次补给新鲜的完全培养液后，存活下来的细胞能再次增值，分裂仍然旺盛，形态也未发生变化。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学、集美大学

<120> 一种双斑东方鲀卵巢组织细胞系及其应用

<130> 9

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> COI基因上游引物

<400> 1

atccttcctc cttctgct 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> COI基因下游引物

<400> 2

ttgtatttag gtttcggtca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> foxl2基因上游引物

<400> 3

aaagagcgac ccaaagagga 20

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> foxl2基因下游引物

<400> 4

agaacgggaa cttactgatg atgt 24

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> dmrt1基因上游引物

<400> 5

gagtcatggc ggctcaggt 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> dmrt1基因下游引物

<400> 6

cacgctaaag atgggtggg 19

<210> 7

<211> 11

<212> DNA

<213> sgRNA1

<400> 7

ggatccactc t 11

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> sgRNA2

<400> 8

ggtgtcatcg tgttaaatga 20

<210> 9

<211> 77

<212> DNA

<213> T7-sgRNA

<400> 9

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgct 77

Claims (8)

1.一株双斑东方鲀卵巢细胞系，其特征在于：所述细胞系分类命名为双斑东方鲀卵巢细胞FGO，已于2021年4月26日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：C202175，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

2.权利要求1所述的一株双斑东方鲀卵巢细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

双斑东方鲀卵巢组织的获取：将7个月大，长8-10cm的双斑东方鲀幼鱼在含三抗的灭菌海水，中暂养1 - 2h，使用添加1wt‰次氯酸钠的灭菌海水对鱼体表面进行消毒15 min，然后滴入占灭菌海水体积0.005 - 0.015%的丁香酚，直至鱼体翻转，腹部朝上，对刺激应激无反应为止；以灭菌纱布块擦除鱼体表面粘液，再以浸有酒精的纱布擦拭鱼体表面后，将鱼体移入超净台，用解剖器具取出卵巢组织，于含三抗的PBS溶液中漂洗3 - 4次；

所述三抗为三抗的100 ×浓缩液：含10000 U/mL青霉素、10000 μg/mL链霉素及10000U/mL两性霉素B；

所述含三抗的灭菌海水：配制海水时每100 mL海水加入1 mL三抗的100 ×浓缩液；

所述含三抗的PBS溶液：100mL PBS液加入1 mL三抗的100 ×浓缩液；

（2）原代培养：将上述双斑东方鲀卵巢组织切碎至1mm³的小组织块，以PBS溶液漂洗三次；漂洗后将上述小组织块转移至15 mL离心管中，使用0.25wt%胰酶消化法获得单细胞，并利用70 μm细胞过滤筛过滤消化的细胞，转移至15 mL离心管中，收集细胞沉淀，用5 mL完全培养液重悬细胞后接种于细胞培养瓶中，于27℃恒温培养启动原代培养，每2 - 3天更换完全培养液一次；

（3）传代培养：原代培养至贴壁细胞增殖至80-90%覆盖率时，移除旧培养液，加入5 mL含1vol%三抗的PBS溶液清洗1次；然后以0.25wt%胰酶消化法传代悬起细胞，以细胞悬液与完全培养液的体积比为1:2进行传代；以后每隔3-4天传代一次，直至60代，成功建立双斑东方鲀卵巢细胞系。

3.根据权利要求2所述的一株双斑东方鲀卵巢细胞系的构建方法，其特征在于：上述完全培养液以L-15培养液为基础培养液，胎牛血清、β-巯基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纤维素钠、人碱性成纤维生长因子、人上皮细胞生长因子、人肝细胞生长因子、青霉素、链霉素、鱼血清与鱼胚提取物的添加量分别为15vol%~20vol%、0.5vol‰、50 μg/mL、50 μg/mL、20 μg/L、10 μg/L、2 μg/L、100 IU/mL、100 μg/mL、1vol%和1vol%。

4.根据权利要求2所述的一株双斑东方鲀卵巢细胞系的构建方法，其特征在于：所述鱼血清的制备方法为：用15% (w/v) EDTA浸润10 mL注射器，从双斑东方鲀成鱼的尾静脉取血到15 mL的置于冰上的离心管中，3,500g离心15 min，转移上清液到50 mL离心管中，4 °C孵育过夜，3,500 g再离心30 min，上清液用0.2 μm过滤器过滤除菌，每10 mL一管分装储存于15 mL离心管中，- 20°C储存。

5.根据权利要求2所述的一株双斑东方鲀卵巢细胞系的构建方法，其特征在于：所述鱼胚提取物的制备方法为：至少收集2000个发育至第7天即30 hpf或受精后孵化前的健康双斑东方鲀胚胎，用PBS清洗3次，- 20℃保存备用；取500个胚胎，在玻璃匀浆器中用冷的PBS在冰上匀浆，将匀浆液转移到15 mL离心管中，在液氮—37 °C水浴反复冻结—融解3次后，将匀浆液进行4°C、3,500g离心30 min，转移上清液至新的1.5 mL离心管中，18,000g、4°C离心至少30 min以保证匀浆液分为3层：最上层是脂质层，最底层是碎片，中间层是双斑东方鲀胚胎提取物，清晰且呈绿色；收集双斑东方鲀胚胎提取物到15 mL离心管中；双斑东方鲀胚胎提取物用0.2 μm过滤器过滤除菌，并用PBS调整体积到1 mL含400个胚胎，然后每1 mL分装到一个1.5 mL离心管中，- 20°C储存。

6.权利要求1所述的一株双斑东方鲀卵巢细胞系在双斑东方鲀性腺发育相关功能基因研究中的应用。

7.权利要求1所述的上述一株双斑东方鲀卵巢细胞系在基因编辑和功能分析中的应用。

8.权利要求1所述的上述一株双斑东方鲀卵巢细胞系在药理学，或基因筛选中的应用。

Images