CN109266678B

CN109266678B - 一种人Epo基因在牛β-casein基因座上定位整合的基因打靶方法

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Publication number: CN109266678B
Application number: CN201811160145.2A
Authority: CN
Inventors: 张学明; 王雅楠; 丁海麦
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-09-30
Filing date: 2018-09-30
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2038-09-30
Also published as: CN109266678A

Abstract

本发明公开了一种CRISPR/Cas9介导的人Epo基因在牛β‑casein基因座上定位整合的基因打靶方法。该方法包括，从人肾脏中提取得总RNA，PCR扩增牛β‑casein基因第二外显子上游1062bp片段及其下游1065bp片段分别被插入到骨架载体neo基因的上游和下游作为打把载体的5'同源臂和3'同源臂，将人EPO cDNA插入到5’同源臂下游，构建以neo基因作为正筛选因子的人EPO cDNA基因在牛β‑casein基因座定位整合的打把载体，基于打靶位点序列，设计并构建特异性断裂靶位点序列的CRISPR/Cas9表达载体，采用电击转染法将打把载体和CRISPR/Cas9表达载体共转染到牛胎儿成纤维细胞中，获得人Epo基因在牛β‑casein基因座上定位整合的基因打靶牛胎儿成纤维细胞。

Description

一种人Epo基因在牛β-casein基因座上定位整合的基因打靶方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种CRISPR/Cas9介导的人Epo基因在牛β-casein基因座上定位整合的基因打靶方法。

背景技术

促红细胞生成素(erythropoietin,简称EPO)是一种造血因子。EPO与红细胞前体细胞表面EPO受体结合，然后促进其血红蛋白的合成，使之增殖分化成红细胞，所以EPO通过控制红细胞前体细胞的增殖、分化和凋亡从而调控红细胞的生成，是一种造血因子。

促红细胞生成素除了有造血功能，纠正贫血外，还有很多其他生物学功能。EPO还是细胞保护因子，通过对抗细胞凋亡，抗氧化，抗炎症和促进细胞增殖来保护心脏，脑，肝脏，肾小管等多种器官，通过细胞免疫和体液免疫来调节机体免疫。近年EPO在治疗肾性贫血及肿瘤相关性贫血有一定的疗效，在临床应用中有巨大的潜在价值和应用前景。但是，因为EPO从人或动物体内得率较低，不能满足市场的需求，本发明人考虑采用动物乳腺生物反应器来高效制造具有生物活性的糖基化EPO蛋白。

动物乳腺生物反应器是乳汁中含有表达产物的转基因哺乳动物的总称；外源基因随机整合到细胞基因组中，并利用动物乳腺特异性启动子调控元件指导外源基因在乳腺中特异性表达。但是，这种利用转基因动物生产蛋白质，基因表达效率低和表达受位置效应影响等问题一直是制约动物乳腺生物反应器研究与产业化的主要因素。

基因打靶技术是用含已知序列的外源DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或非常相近的基因发生同源重组，定点整合到受体细胞基因组中并使该基因表达缺失或表达一种外源基因。该技术的产生和发展建立在胚胎干细胞技术、同源重组技术和转基因技术基础之上，并随着体外核移植技术的发展而进一步发展。但是，干细胞(ES)的基因打靶得到的动物存在生殖嵌合效应，这就把研究者们的目光转向了体细胞的基因打靶。体细胞基因打靶与核移植技术相结合的转基因方法对常规体外培养的体细胞进行基因打靶，有效解决外源基因表达受位置效应影响这一技术难题。

传统的体细胞基因打靶虽然能够解决位置效应，但基因打靶效率极低。研究发现，体细胞基因打靶的效率较干细胞低两个数量级，并且同源重组的效率远低于非同源末端连接的效率，这就使得在对体细胞进行基因打靶异常困难。传统的基因打靶效率低，一般在1×10^-6以下，特别是对于没有干细胞建系的大型的哺乳动物效率更低，所以，自然条件下的基因打靶很难成功的实现。直到研究发现，DNA断裂可以提高基因打靶效率；而人工核酸酶能够按照研究者的意愿对DNA进行靶向切割，并在此特异位点产生一个DNA双链切口，而后由细胞固有的DNA修复机制通过同源重组(HDR)或非同源末端连接(NHEJ)将切口修复，基于人工核酸酶介导的同源重组能够使基因打靶效率提高3～5个数量级，而且具有极高的特异性。目前应用最为广泛的CRISPR/Cas9能够高效的对靶基因进行切割，能够完成RNA导向的DNA识别及编辑，利用这种识别切割靶序列的人工核酸酶来介导基因打靶，就可以解决体细胞基因打靶存在的低效率的问题。为动物乳腺生物反应器制备具有生物活性的EPO蛋白提供了有利的条件。

发明内容

EPO是一种造血因子，用于治疗各种原因所引起的贫血，在神经损伤、心肌疾病、肿瘤等的诊断和治疗中也具有非常重要的作用。在临床应用中有巨大的潜在价值和应用前景。EPO由胎儿肝脏和成人肾脏肾小管旁细胞分泌。在基因重组技术前，EPO主要从尿液和血液中提取，EPO最早是在19世纪生活在高海拔地区的人的血液中发现的，Miyake等人从贫血病人的255公升尿液中提取了人EPO，但EPO在血清中含量是微微克分子级的所以得率很低且及不稳定，无法大规模利用。1985年Epo基因被克隆并在哺乳动物细胞中表达。自从第一批重组EPO制剂上市以来EPO药物不断更新换代，但如何延长半衰期，提高生物活性增加稳定性仍需要我们进一步研究探索。动物乳腺生物反应器具有生产成本低、周期短，产品质量高、易纯化，产品活性高、无污染，外源基因在动物体内可稳定遗传等优点，是目前最有效的生产外源蛋白的生物反应器，本实验室拟用动物乳腺生物反应器来制备人EPO蛋白从而弥补市场上这种药物蛋白的需求。但是转基因动物生产效率低、基因表达效率低制约了动物乳腺生物反应器的应用。基因打靶是将外源目的基因整合到受体细胞基因组中来表达基因，干细胞(ES)基因打靶得到的动物存在生殖嵌合效应，所以体细胞的基因打靶成为研究热点。传统的基因打靶技术同源重组效率低下，而人工核酸内切酶定点切割DNA大大提高了效率，目前应用最为广泛的CRISPR/Cas9能够高效的对靶基因进行切割完成RNA导向的DNA识别及编辑。牛奶由乳蛋白、乳糖和乳脂肪三部分组成，牛乳中酪蛋白表达量最高占80％左右，并且β-casein被敲除后对动物本身影响不大，所以选取牛的β-casein基因座为打靶位点。本发明在β-casein基因座第二外显子处选取靶位点，设计sgRNA，构建CRISPR/Cas9表达载体；从人肾脏组织中克隆EPO cDNA基因，以β-casein基因第二外显子上游1062bp片段及其下游1065bp片段分别作为5'同源臂和3'同源臂、neo基因作为正筛选因子位于两同源臂之间、人Epo基因位于5'同源臂下游，构建同源重组载体。两同源臂促进Epo同源重组整合在β-casein基因座上之后，β-casein基因固有的调控序列指导Epo基因高效表达，neo基因作为正筛选因子利于中靶克隆的富集；将CRISPR/Cas9质粒和同源重组载体共转染到牛胎儿成纤维细胞中；CRISPR/Cas9质粒在牛胎儿成纤维细胞中瞬时表达，RNA二聚体与Cas9蛋白形成的复合物在β-casein靶位点进行切割形成DSBs切口，细胞启动HD修复机制，打靶载体5'arm和3'arm序列之间的Epo基因和neo基因随着HD而整合到牛基因组中，实现人Epo基因在β-casein基因座上的定位整合；本研究以CRISPR/Cas9介导同源重组，提高打靶效率，为人Epo基因在牛β-casein基因座的定点整合建立可行的技术路线，进而为表达重组EPO的牛乳腺生物反应器的制备奠定基础。

本发明的目的在提供一种人Epo基因在牛β-casein基因座上定位整合的基因打靶方法，该方法能够显著提高人Epo基因在牛β-casein基因座定位整合的基因打靶效率。

本发明另一目的在于提供本发明的人Epo基因在牛β-casein基因座上定位整合载体的牛胎儿成纤维细胞用于在动物乳腺生物反应器中制备Epo的用途。

为了实现本发明目的，本发明的一种人Epo基因在牛β-casein基因座上定位整合的基因打靶方法，关键涉及2个载体的构建，即打靶载体和CRISPR/Cas9表达载体的构建。打靶载体是基于同源重组原理设计的，包含正筛选因子neo基因、人EPO cDNA基因，牛β-casein基因第二外显子上游1062bp片段作为5'同源臂及其下游1065bp片段作为3'同源臂，所述正筛选因子neo基因位于牛β-casein基因的第二外显子的5'同源臂和3'同源臂之间，所述人EPO cDNA基因位于所述5'同源臂的下游；本发明的一种CRISPR/Cas9表达载体，用于特异性地断裂打靶位点序列，包括引导序列sgRNA、Cas9蛋白序列和CRISPR结构序列。本发明还提供了所述载体用于获得人Epo基因在牛β-casein基因座上定位整合的牛胎儿成纤维细胞的应用。

本发明的一种CRISPR/Cas9介导的人Epo基因在牛β-casein基因座上定位整合的基因打靶方法，包括以下步骤：

1)从人肾脏中提取总RNA，用RT-PCR法扩增人EPO cDNA基因；

2)人Epo基因在牛β-casein基因座上定位整合的基因打靶载体的构建；

3)特异性断裂靶位点序列的CRISPR/Cas9表达载体的构建；

4)分离培养牛胎儿的成纤维细胞；

5)将步骤2)的打靶载体和步骤3)的CRISPR/Cas9表达载体共转染到牛胎儿成纤维细胞中，获得人Epo基因在牛β-casein基因座上定位整合的基因打靶牛胎儿成纤维细胞。

上述本发明的方法，步骤1)的RT-PCR法扩增，采用的引物为上游引物5'-GCCTCGAGATGGGGGTGCACGAATGTCC-3'，下游引物5'-GCCTCGAGTCATC TGTCCCCTGTCCTGC-3'，并在上下游引物5'端分别引入XhoⅠ酶切位点。

上述本发明的方法，步骤2)所构建的基因打靶载体的正筛选基因为编码新霉素磷酸转移酶的基因，即neo基因。

上述本发明的方法，步骤2)所构建的基因打靶载体的重组酶识别序列为Cre酶识别序列。

上述本发明的方法，步骤2)扩增所述牛β-casein基因5′同源臂的引物为上游引物5'-ATTGGGCCCGTGTGTCAAGAGATTGTGATGG-3'和下游引物5'-CATCTCGAGCAAGTCCTGGGAATGGGAAGATG-3'。

上述本发明的方法，步骤2)扩增所述牛β-casein基因3'同源臂的引物为上游引物5'-ATTGGATCCGGTCCTCATCCTTGCCTGC-3'和下游引物5'-GCTGGATCCGCTCCTCCTCTATGGGATTTTCC-3'。

上述本发明的方法，步骤3)所构建的CRISPR/Cas9表达载体的sgRNA的靶基因位点在牛β-casein基因座第二外显子处，其靶位点序列为：CCAGGAATTGAGAGCCATGAAGG。

所述人Epo基因在牛β-casein基因座上定位整合的打靶载体和特异性断裂打靶位点序列的CRISPR/Cas9表达载体在基因打靶中的应用。

所述人Epo基因在牛β-casein基因座上定位整合的打靶载体和特异性断裂打靶位点序列的CRISPR/Cas9表达载体在制备表达人Epo蛋白的牛乳腺生物反应器中的应用。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(1)本发明采用同源重组的方法，将目的基因Epo定位整合到牛β-casein基因启动子的下游，借助牛β-casein基因天然启动子使得目的基因高效表达。

(2)采用本发明方法制备得到的乳腺生物反应器能够在乳腺上皮细胞中高效表达具有生物学活性的人EPO蛋白因子。

(3)采用CRISPR/Cas9介导的基因打靶方法，较传统的体细胞基因打靶方法，能够显著提高基因打靶效率。

(4)本发明利用家畜动物乳腺生物反应器生产药用蛋白具有以下优点：乳腺可以不断分泌奶汁，长期收集不会对动物造成伤害；对动物的生理活动影响小，药物蛋白限制在乳腺内生产，分泌到乳汁中，不会进入血液，不会对转基因动物的正常生理活动造成影响；生物活性高，家畜乳腺可对表达的蛋白质进行糖基化、酯化、磷酸化和形成多聚体等一系列翻译后加工，产品接近天然提取物，活性高，不易产生抗药性；产量大，易提纯；设备简单，无环境污染；开发周期短；生产成本低。

(5)与传统的基因随机整合方法制备乳腺生物反应器不同，其外源基因的表达调控易受到整合部位邻近的DNA序列影响，表达水平差异大且大多停留在较低水平；本发明采用基因打靶方法制备的转基因动物外源基因定位表达不受位置效应影响，能够显著提高表达水平。

附图说明

图1-1人Epo在牛β-casein基因座定位整合原理图；

图1-2为pP40-5'arm-Epo-3'arm物理图谱；

图1-3为CRISPR/Cas9物理图谱；

图2为实验流程图；

图3为人肾脏组织RNA电泳图，1、2人肾脏组织总RNA；

图4为Epo基因电泳图，1表示RT-PCR扩增Epo基因产物，2表示100bp DNA LadderMarker；

图5为pJET-Epo质粒酶切图，1表示EcoR I+HindIII Maker，2、3和4表示pJET-Epo质粒，5、6和7表示pJET-Epo质粒XhoI单酶切；

图6为Epo测序结果与GeneBank中序列比较；

图7为克隆载体pJET-Epo部分测序结果；

图8为pP40-3'arm-5'arm质粒酶切图，1表示EcoR I+HindIII Maker，2表示pP40-5'arm质粒，3表示pP40-3'arm-5'arm质粒XhoⅠ单酶切，4表示pP40-3'arm-5'arm质粒ApaⅠ单酶切，5表示pP40-3'arm-5'arm质粒BamHⅠ单酶切；

图9为pP40-5'arm-Epo-3'arm质粒电泳图，1表示pP40-3'arm-5'arm质粒，2、2、5、7、10、11、12、13、14和15表示pP40-3'arm-5'arm质粒，3、3、4、6、8和9表示pP40-5'arm-Epo-3'arm质粒；

图10为pP40-5'arm-Epo-3'arm PCR鉴定电泳图，1表示EcoR I+HindIII Maker，2、3和4表示pP40-5'arm-Epo-3'arm质粒；

图11为Epo在载体pP40-5'arm-Epo-3'arm连接区的DNA测序结果图；

图12为牛胎儿成纤维细胞体外培养，A:组织块培养1d，少量成纤维细胞细胞迁出；B：组织块培养2d，均匀的成纤维细胞生长，也有少量不规则细胞和上皮细胞迁出；CD：组织块培养3～4d，成纤维细胞生长旺盛；E：组织块培养6d，各组织块周围的成纤维细胞已生长至完全汇合；F：传6代后细胞形态。G：传代至50d细胞形态；

图13为PCR法鉴定牛胎儿成纤维细胞性别，1表示100bp maker，2-3表示牛基因组DNA，4-7表示体外培养的来自4个不同牛胎儿的成纤维细胞；

图14为牛胎儿成纤维细胞对不同浓度G418的耐受性检测分析图；

图15为打靶细胞克隆的筛选；

图16为3'arm PCR鉴定，1表示EcoRI/HindⅢDNA Marker，2-7表示3'arm PCR,产物；

图17为5'arm PCR鉴定，1表示EcoRI/HindⅢDNA Marker，2-7表示5'arm PCR产物；

图18-1为阳性克隆的PCR产物测序结果，即PCR产物3'端测序结果；

图18-2为阳性克隆的PCR产物测序结果，即PCR产物5'端测序结果。

具体实施方式

以下实施例用于进一步阐明和理解本发明的实质，但不以此限制本发明的范围。

实验材料和方法

菌株与质粒

大肠杆菌DH5α为实验室保存；人肾脏组织由内蒙古包头市肿瘤医院病理科提供(伦理道德委员会批准)；载体质粒pJET1.2/blunt Cloning Vector购于Thermo，质粒pJET-5arm-Gdnf、pP40-3arm由本实验室保存。

活体材料

牛胚胎取自呼和浩特市回民区屠宰场。

主要试剂

PCR引物由Invitrogen公司合成；Trizol购自上海碧云天；溴酚蓝、EDTA、Tris饱和酚、十二烷基磺酸钠(SDS)、Tris碱、琼脂粉、酵母提取物购自Sigma公司；甘油、异丙醇、无水乙醇、异戊醇、氯仿、盐酸均为重庆化学试剂厂产品；氢氧化钠、氯化钠同属西陇化工有限公司；ApaⅠ、XhoⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ等限制性内切酶和T4DNA连接酶同属美国Thermo公司；100bpDNA Marker、500bp DNA Marker、EcoRⅠ+HindⅢLambda DNA Marker均购自美国Thermo公司；dNTP、D15000DNA Marker、2×Pfu MasterMix、Fast HiFidelity PCR Kit、DreamTaqDNAPolymerase同属天根生化科技有限公司；无水氯化钙(天津凯通化学试剂有限公司)琼脂糖(Biowest)核酸染色剂(GoldView)；RevertAid First Strand cDNA SynthesisKit、去内毒素质粒大提试剂盒均购自美国Thermo公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒均为天根生化科技有限公司。胎牛血清(FBS)、0.25％胰蛋白酶、青链霉素同属美国Gibco；二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司)，复方氯化钠注射液(山东齐都)，Tris平衡酚(天津灏洋)，蛋白酶K购自TAKARA公司，DMEM/F12购自上海立菲，台盼蓝购自美国invitrogen，NaH₂PO₄、Na₂HPO₄同属日本和光纯药；T25培养瓶、T75培养瓶、60mm培养皿和100mm培养皿均购于Corning公司，96孔细胞培养板、48孔细胞培养板、24孔细胞培养板、12孔细胞培养板、6孔细胞培养板均购于Nunc公司。

溶液配制

(1)焦碳酸二乙酯溶液

1mL焦碳酸二乙酯溶于1000mL水中，不断搅拌，室温静置12h直至完全溶解，高压蒸汽灭菌，室温备用。

(2)液体LB培养基

称取胰化蛋白胨2g，酵母提取物1g，NaCl 2g，于180mL去离子水中搅拌溶解，调pH至7.0，定容至200mL，高压蒸汽灭菌，4℃保存备用。

(3)固体LB培养基

称取胰化蛋白胨2g，酵母提取物1g，NaCl 2g，琼脂粉3g，于180mL去离子水中搅拌溶解，调pH至7.0，定容至200mL，高压蒸汽灭菌，4℃保存备用。

(4)SOB培养基

称取胰蛋白胨4g，酵母提取物1g，NaCl 0.1g，于180mL去离子水中搅拌溶解，加入250mmol/L KCl 2mL，调pH至7.4，定容至200mL，高压蒸汽灭菌，4℃保存备用，使用前加入1mL无菌的2M MgCl₂。

(5)SOC培养基

SOB中加入20mL除菌的1mol/L葡萄糖溶液，4℃保存备用。

(6)GYT溶液

甘油10mL，酵母提取物0.125mg，胰蛋白酶0.25mg，加去离子水定容至100mL高压灭菌，4℃保存备用。

(7)蓝药水

蔗糖2.06g，1M Tris-HCl(pH＝8.0)0.5mL，0.5M EDTA(pH＝8.0)1mL，溴酚蓝0.002g，加去离子水定容至20mL，-20℃保存备用。

(8)0.5mol/L EDTA(pH 8.0)

186.1g EDTA-Na·2H₂O，加去离子水800mL，用磁力搅拌器搅拌，调节pH至8.0，定容至总体积1L，高压灭菌，室温保存备用。

(9)10×TAE

Tris-base 48.4g，冰醋酸11.42mL，0.5mol/L，pH 8.0EDTA 20mL，溶于800mL去离子水中，定容至1L，室温保存备用。

(10)10N NaOH

400g NaOH颗粒慢慢加入到800mL水中(边加边搅拌)，溶解后定容至1L，室温保存备用。

(11)0.1mol/L CaCl₂

CaCl₂ 1.1g溶于90mL去离子水，定容至100mL，高压灭菌后，4℃保存备用。

(12)1M Tris-HCl(pH 8.0)

121.1g Tris-base溶于800mL去离子水，调节pH至8.0，定容至总体积1L，高压灭菌，室温保存备用。

(13)10％SDS

10g SDS溶于90mL去离子水中，68℃助溶，调节pH至7.2，定容至100mL，室温保存备用。

(14)50％甘油

50mL丙三醇，溶于50mL去离子水中，高压灭菌，-20℃保存备用。

(15)100mg/mL Amp

2g Ampicillin，溶于20mL无菌去离子水中，1mL每份分装在1.5mL的EP无菌管中，-20℃保存备用。

(16)0.8％琼脂糖凝胶

0.28g琼脂糖粉末置于锥形瓶中，加入35mL新配置的1×TAE盐酸缓冲液煮沸完全溶解后，室温凉至约70℃，加入核酸染料3.5μL，混匀，倒入安置好的胶槽中，冷却凝固。

(17)1％琼脂糖凝胶

0.35g琼脂糖粉末置于锥形瓶中，加入35mL新配置的1×TAE盐酸缓冲液，煮沸完全溶解后，室温凉至约70℃，加入核酸染料3.5μL，混匀，倒入安置好的胶槽中，冷却凝固。

(18)G418

G418粉末1g，溶于10mL无菌超纯水中，1mL每份分装在1.5mL的EP无菌管中，4℃保存备用。

(19)PBS

Na₂HPO₄ 0.5825g，NaH₂PO₄ 2H₂O 0.14g，NaCl 4.5g，溶于400ml去离子水中，调pH至7.4，定容至500ml，高压灭菌，室温保存备用。

(20)细胞冻存液

70％DMEM/F12，20％FBS，10％DMSO。

(21)细胞裂解液

1M Tris-HCl 3mL，1M NaCl 6mL，0.5M EDTA 0.3mL，10％SDS 0.6mL，去离子20.07mL，1mg/mL蛋白酶K 0.03mL(每次使用前加)，混匀，室温保存备用。

实施例1 CRISPR/Cas9介导的人Epo基因在牛β-casein基因座上的定位整合(定位整合原理见图1-1，实验流程见图2)

1、EPO cDNA基因的克隆

1.1人肾脏组织总RNA提取

用1‰DEPC充分浸泡EP管、移液枪枪头、研钵和电泳槽并过夜，高温高压灭菌，烘干备用。Trizol法提取组织中的总RNA具有高效、快速、纯度高等优点，所以采用Trizol法提取人肾脏组织中的RNA，其步骤如下：

(1)称取0.1g人肾脏组织，放入玻璃研钵磨碎，不断加入液氮，防止RNA降解。

(2)将研磨碎的肾脏组织转移至预冷EP管中，加入1mlTrizol快速匀浆。室温静置5min。

(3)加入200μL氯仿充分震荡混匀，室温静置5min，4℃12000r/min离心10min。

(4)取上清于干净EP管中，加等体积异丙醇，充分混匀，室温静置20min，4℃12000r/min离心10min。

(5)弃上清，加1ml 75％乙醇洗涤沉淀，4℃12000r/min离心10min。重复两次。室温放置数分钟，晾干乙醇，加40μL DEPC水溶解，-80℃保存备用。

(6)将提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定其完整性。

1.2 EPO cDNA基因的克隆

将提取得到的总RNA以oligo(DT)为引物合成cDNA第一链，采用Thermo的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，反应体系如下：RNA 3μL，oligo(DT)1μL，无菌水8μL混匀，65℃水浴5min，置于冰上冷却30s，再加5×reaction buffer 4μL，RNA抑制剂1μL，dNTP 2μL，AMV 1μL后混匀，45℃水浴1h，70℃水浴5min终止反应。然后以cDNA为模板进行PCR扩增，根据GenBank数据库里人促红细胞生成素的mRNA碱基序列设计一对引物，引物为上游引物5'-GCCTCGAGATGGGGGTGCACGAATGTCC-3'和下游引物5'-GCCTCGAGTCATCTGTCCCCTGTCCTGC-3'，上下游引物5'端分别引入XhoⅠ酶切位点，反应体系和反应条件如表2。扩增的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。

表2 Epo PCR反应体系和反应条件

1.3胶回收目的片段

使用天根DNA片段胶回收试剂盒将PCR产物纯化，方法如下：

(1)吸附柱CA2中加入500μL平衡液BL，12000r/min离心1min，倒掉废液。

(2)将目的DNA带胶切下，放入干净EP管中，称取重量。

(3)胶块中加入等体积PN(如凝胶0.1g，体积视为100μL，加100μL PN)，50℃水浴放置，温和翻转，确保胶充分溶解。

(4)胶降至室温，将溶液加到吸附柱中，室温放置2min，12000r/min离心1min，倒掉废液。

(5)向吸附柱中加600μL PW，静置2-5min，12000r/min离心1min，倒掉废液。

(6)重复步骤5。

(7)将吸附柱放回收集管中，12000r/min离心2min，吸附柱室温放置3min，彻底晒干。

(8)将吸附柱放在干净离心管中，向吸附柱膜中间加35μL EB，室温放置2min，12000r/min离心2min，收集Epo基因片段。

(9)使用紫外微量分光光度计测量胶回收Epo浓度。

1.4 Epo基因片段插入克隆载体

将胶回收Epo基因片段与质粒载体pJET 1.2通过T4DNA连接酶反应连接，反应体系为：2×buffer 5μL，hEpo 1.5μL，pJET 1.2 0.5μL，H₂O 2.5μL，T4 DNA连接酶0.5μL充分混匀，16℃过夜连接。将连接产物电击转化到感受态大肠杆菌DH5α中。

感受态大肠杆菌DH5α的制备和电击转化的步骤如下：

(1)在LB固体培养基上挑取一个DH5α单菌落，接种于50mL LB培养瓶中，于恒温摇床中，37℃120r/min培养12-16小时。

(2)将培养物分成两份各25mL，各接种于500mL LB培养基中，于恒温摇床中，37℃120r/min培养，每20min测一次OD600，控制在0.35到0.4之间。

(3)当OD600达到0.4时，冰浴15-30min。

(4)将培养物转移至预冷的离心管中，4℃3600r/min离心15min，弃去培养液，加500mL冰冷的蒸馏水重悬沉淀。

(5)4℃3600r/min离心20min，弃去液体，加250mL 10％预冷的甘油重悬沉淀。

(6)4℃3600r/min离心20min，弃去液体，加10mL 10％预冷的甘油重悬沉淀。

(7)4℃3600r/min离心20min，弃去液体，加1mL冰冷的GYT培养基。

(8)测OD600，用冰冷的GYT培养基稀释至浓度为2×10¹⁰-3×10¹⁰细胞/m(1.0OD600＝2.5×10⁸细胞/mL)。

(9)40μL体系分装在1.5mL EP管中，置于-80℃保存。

(10)电击杯冷却，加1μL pJET-Epo于40μL感受态细胞中。

(11)电脉冲25μF，电压2.5KV，电阻200Ω电击一次。

(12)脉冲后，迅速拿出电击杯，室温加1μL SOC培养基，于恒温摇床中，37℃80r/min培养1h。

(13)将步骤12中的菌液用涂布棒涂于含有终浓度为100μg/mL的Amp固体LB培养基上，每个培养皿菌液100μL。

(14)将培养皿正面放置在培养箱中，37℃培养15min左右，待菌液被培养基全部吸收后，倒置培养基，37℃培养12-14h。

1.5 hEPO cDNA基因序列检测

经抗生素筛选后，用接种环挑取阳性质粒单个菌落，于含有终浓度为100μg/mL的Amp的液体LB培养基中扩增培养，采用天根质粒小提试剂盒提取质粒，方法如下：

(1)将吸附柱放入吸附管中，向吸附柱中加入500μL平衡液BL。13400g离心30sec，倒掉废液。

(2)取过夜培养的菌液1.5mL于1.5mL EP管中，13400g离心2min，尽可能去除上清。

(3)向EP管中加入250μL缓冲液P1(含有RNase A)，悬浮细菌，充分颠倒混匀。

(4)加入250μL缓冲液P2，温和的颠倒混匀，使细菌充分裂解。此时可出现絮状沉淀，13400g离心10min。

(5)向EP管中加入350μL缓冲液P3，温和的颠倒混匀，此时可出现絮状沉淀，13400g离心10min。

(6)取上清液加到吸附柱中，室温静置2min，13400g离心30sec，倒掉废液。

(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，13400g离心30sec，倒掉废液。

(8)重复步骤(7)。

(9)13400g离心2min，倒掉废液，将吸附柱至室温干燥2-5min。

(10)将吸附柱转入1.5mL离心管中，向吸附柱中加入50-200μL洗脱缓冲液EP，室温放置2-5min，13400g离心2min，收集离心管中溶液，-20℃保存。提取得到的质粒进行XhoI酶切鉴定，反应体系为：质粒2μL，H₂O 6μL，10×buffer1μL，XhoI 1μL共10μL体系，37℃水浴10min，1％琼脂糖凝胶电泳检测。符合预期的菌落进行测序(立菲生物技术有限公司)。测序引物采用pJET 1.2载体通用上下游引物。测得序列与NCBI数据库上的序列对比(BLAST对照)。

2、基因打靶载体pP40-5'arm-Epo-3'arm(图1-2)的构建

2.1 5'同源臂的插入

2.1.1基因组DNA的提取

在内蒙古包头市当地屠宰场取新鲜黑白花奶牛血于EDTA抗凝剂管中，混匀，带回实验室，用血液基因组DNA提取试剂盒提取牛基因组DNA，步骤如下：

(1)取血液500μL，加入1-2.5倍体积的细胞裂解液CL，颠倒混匀，11500g离

(2)加入20μL Proteinase K溶液，混匀。

(3)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃水浴10min，期间颠倒混匀，直至溶液变得清亮。

(4)加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可出现絮状沉淀。

(5)将步骤(4)中的溶液加入吸附柱CB3中，13400g离心30sec，倒掉废液。

(6)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，13400g离心30sec，倒掉废液。

(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，13400g离心30sec，倒掉废液。

(8)重复步骤(7)。

(9)13400g离心2min，倒掉废液，将吸附柱至室温干燥2-5min。

(10)将吸附柱转入1.5mL离心管中，向吸附柱中加入50-200μL洗脱缓冲液TB，静置2-5min，13400g离心2min，收集离心管中溶液。将提取好的牛基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳，检查基因组的大小和完整性，-20℃保存。

2.1.2 5’arm和3’arm目的基因片段的获取

根据GenBank牛β-casein基因序列，设计出5’arm和3’arm同源臂扩增引物，5’arm同源臂上游引物：5'-ATTGGGCCCGTGTGTCAAGAGATTGTGATGG-3'，设计了ApaⅠ酶切位点；下游引物：5'-CATCTCGAGCAAGTCCTGGGAATGG GA AGATG-3'，设计了XhoⅠ酶切位点。3’arm同源臂的上游引物为：5'-ATTGGA TCCGGTCCTCATCCTTGCCTGC-3'，下游引物为：5'-GCTGGATCCGCTCCTCCT CTATGGGATTTTCC-3'，上下游均设计了BamHⅠ酶切位点。以牛基因组DNA为模板，用Dream Taq DNA聚合酶扩增5’arm和3’arm同源臂。反应体系如表3-1所示。

表3-1 5’arm和3’arm PCR体系

加样后混匀，再进行PCR，5’arm同源臂PCR反应条件为：95℃变性30sec，64℃复性30sec，72℃延伸90sec，共35循环。3’arm同源臂PCR反应条件为：95℃变性30sec，62℃复性30sec，72℃延伸90sec，共35循环。分别切胶回收，得到5’arm(5’同源臂)和3’arm(3’同源臂)，再进行测序，-2℃保存。2.1.3 5’arm和3’arm的克隆

将纯化后的5’arm和3’arm同源臂分别按如下体系和条件与克隆载体pJET1.2/blunt相连接：

(1)在冰面上进行以下操作，加入2×buffer 5μL，纯化后的5’arm 0.6μL，无菌去离子水2.9μL，DNA Blunting Enzyme 0.5μL，混匀。

(2)70℃水浴10min，立即冰浴。

(3)在冰面上加入0.5μL pJET1.2/blunt Cloning Vector和0.5μL T4DNALigase，混匀。

(4)22℃水浴30min。

将上述连接好的重组子pJET-5’arm和pJET-3’arm转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，步骤如下：

(1)取100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞悬液，在冰面上融化。

(2)加入10μL重组质粒pJET-5’arm和pJET-3’arm，轻轻混匀，冰浴30min。

(3)42℃水浴90sec，立即冰浴3-5min。

(4)加入800μL LB液体培养基，并转移至无菌小试管中，在恒温摇床中，37℃，100rpm/min，培养50min。

(5)将步骤(4)中的菌液全部转移在含有终浓度为100μg/mL的Amp的固体LB培养基的平板上，每个平板菌液250μL，用涂布棒涂匀菌液。

(6)将平板正面放置在细菌培养箱中，37℃培养15min左右，待平板中菌液被培养及全部吸收后，倒置平板，37℃培养。

pJET-5’arm和pJET-3’arm质粒的提取，用接种环挑取转化得到的菌落，于含有终浓度为100μg/mL的Amp的液体LB培养基的试管中，37℃培养过夜，将菌液8000g离心10min离心，收集细菌沉淀，利用试剂盒提取质粒，步骤如下：

(1)将吸附柱放入吸附管中，向吸附柱中加入500μL平衡液BL，13400g离心30sec，倒掉废液。

(2)取过夜培养的菌1.5mL于1.5mL EP管中，13400g离心2min，尽可能去除上清。

(3)向EP管中加入250μL缓冲液P1(含有RNaseA)，悬浮细菌，充分颠倒混匀。

(5)向EP管中加入350μL缓冲液P3，温和的颠倒混匀，此时可出现絮状沉淀13400g，离心10min。

(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，13400g离心30sec，倒掉废液。

(8)重复步骤(7)。

(9)13400g离心2min，倒掉废液，将吸附柱至室温干燥2-5min。

(10)将吸附柱转1.5mL离心管中，向吸附柱中加入50-200μL洗脱缓冲液EP，室温放置2-5min，13400g离心2min，收集离心管中溶液，-20℃保存。

pJET-5’arm和pJET-3’arm质粒的鉴定，用提取的质粒为模板，按照从基因组中获得5’arm和3’arm的PCR体系和条件，分别进行PCR，0.8％琼脂糖凝胶电泳，检测产物大小；再将质粒分别进行酶切鉴定，分别用XhoⅠ单酶切，XhoⅠ和ApaⅠ双酶切鉴定质粒pJET-5’arm；BamHⅠ鉴定质粒pJET-3’arm。体系如表3-2。

表3-2 pJET-5’armp和JET-3’arm酶切体系

混匀后，37℃水浴10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。

2.1.4 pP40-3’arm质粒的构建

pJET-3’arm质粒与pPGK-SV40质粒(参见CN101851639的制备，全文引入参考，用Not I、Ssp I酶切质粒pCMV-Red，回收264bp的SV40polyA转录终止信号序列，用Not I、EcoRV酶切质粒pPGK-neoLexP，将SV40polyA克隆到pPGK-neoLoxP载体上，得到pPGK-SV40，命名为pP40)分别用BamHⅠ酶切，电泳，切胶回收，分别得到3’arm/BamHⅠ小片段和pPGK-SV40/BamHⅠ大片段，再将两片段用T4DNA连接酶进行连接，得到pPGK-SV40-3’arm(简称为pP40-3’arm)重组质粒，经转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，过夜培养，收集细菌，按照前面方法提取质粒，载体质粒分别用XbaⅠ单酶切鉴定和BamHⅠ单酶切进行鉴定。由于同源臂3’arm两端均为BamHⅠ酶切位点，在插入到pPGK-SV40骨架载体上时，存在正向插入，也存在反向的可能性，在分别选取同源臂3’arm上的MunⅠ酶切位点和骨架上的MunⅠ位点做MunⅠ单酶切鉴定，判断出插入的方向。

2.1.5 pP40-5'arm-3'arm的构建

将5'同源臂克隆到pP40-3'arm的ApaⅠ/XhoⅠ位点上，命名为pP40-5'arm-3'arm。酶切鉴定重组载体。

2.2目的基因Epo的插入

XhoⅠ酶切pJET-Epo，胶回收小片段目的基因Epo，亚克隆到pP40-5'arm-3'arm XhoⅠ位点。由于插入的Epo基因两端都为XhoⅠ酶切位点，连接后的质粒可能是正向插入也可能存在反向插入，所以除了对重组质粒进行Epo片段大小的鉴定以外，还进行Epo插入的方向鉴定，用PCR法鉴定Epo插入的方向，Epo反向插入的重组载体即为我们构建的打靶载体，命名为pP40-5'arm-Epo-3'arm。

2.3无内毒素打靶载体pP40-5'arm-Epo-3'arm的制备

将含有pP40-5'arm-Epo-3'arm打靶载体的DH5α于200mL LB培养基扩增培养，用QIAGEN去内毒素质粒大量提取试剂盒提取质粒，紫外分光光度法检测质粒浓度和纯度，0.8％的琼脂糖凝胶检测质粒完整性，-20℃保存备用。

3、CRISPR/Cas9表达载体(图1-3)的构建

CRISPR/Cas9表达载体的构建，包括将CRISPR/Cas9的引导序列sgRNA、Cas9蛋白序列和CRISPR结构序列同时构建在同一表达载体上。其中，sgRNA的靶基因位点在牛β-casein基因座第二外显子处，其靶位点序列为：CCAGGAATTG AGAGCCATGA AGG。构建方法为：合成引物序列

Bovine-V-Gui-F：5’-CACCGCCAGGAATTGAGAGCCATGA-3’

Bovine-V-Gui-R：5’-AAACTCATGGCTCTCAATTCCTGGC-3’

载体PX330-GFP使用BbsⅠ酶切电泳回收，与Bovine-V-Gui-F/R退火产物连接转化，涂布于氨苄平板上，37℃培养过夜。次日，挑取单克隆，提取质粒，DNA测序鉴定。

4、组织块儿分离培养牛胎儿成纤维细胞

采自呼和浩特市回民屠宰场的4只带有子宫的牛胎儿带回实验室，立即用生理盐水将子宫反复清洗干净，将子宫浸泡于75％无水乙醇中，无菌操作，取出胎儿。分离培养牛胎儿成纤维细胞，方法如下：

(1)将牛胎儿用PBS清洗3遍，剪下牛胎儿耳部，放入无菌小烧杯中用剪刀剪成约1mm³见方的小块。

(2)转移至15mL无菌离心管中，用完全培养基补足到5mL，600g/min离心5min，重复清洗二遍。

(3)去上清，加入1mL培养液吹散组织块，吸入至25cm²培养瓶中，用枪头轻轻将组织块均匀分布，吸干周围培养液，倒置放入培养箱中，37℃，5％CO²培养3-4h。

(4)待组织块贴壁后，加入5mL 10％FBS+90％DMEM/F12培养液继续培养。每天观察并记录细胞的生长情况，待生长的细胞汇合度约80％～90％时，去除组织块，用0.25％的胰蛋白酶消化约2min，转移至75cm²培养瓶中传代扩大培养后，冷冻保存。

5、细胞冻存与细胞复苏培养

细胞冻存方法如下：

(1)待细胞扩大培养生长至70-80％，吸除培养基，PBS漂洗两遍。

(2)用0.25％的胰蛋白酶消化约2min，加入培养基终止消化，600g/min离心5min，去上清，加1mL培养基重悬细胞。

(3)细胞计数仪计数后，用细胞冻存液(10％DMSO+20％FBS+70％DMEM/F12)调整至1×10⁶cells/mL，每个冻存管分装1mL，4℃保存30min，-20℃保存1h，-80℃过夜冻存，再转移至液氮中长期保存。

细胞复苏方法如下：

(1)快速从液氮罐中取出冷冻管，37℃水浴不断摇晃，2min内使其完全融化；

(2)转至盛有5mL培养基的离心管中，600g/min离心5min，收集细胞去上清。

(3)加1mL培养基重悬细胞，接种到成有15mL培养基的100mm培养皿中，于37℃、5％CO²、饱和湿度条件下培养。

6、PCR法鉴定牛胎儿成纤维细胞的性别

以牛Y染色体上特有的S4重复序列为模板，设计一对PCR引物，同时以牛角蛋白5基因序列为模板，设计一对PCR引物作为内部参照。引物序列如下：

S4重复序列引物1：5'-TTCAGAGGTAGGACTCCACGCTT-3'

S4重复序列引物2：5'-AAATGACAATCCACCCCAGCACTC-3'

牛角蛋白5引物1：5'-TCCGTCTCCCGCACCAGTTT-3'

牛角蛋白5引物2：5'-TCCCGCTCCTCAGTCCTCAC-3'

以牛胎儿成纤维细胞基因组DNA为模板，PCR鉴定牛胎儿成纤维细胞的性别，PCR反应体系和反应条件如表4，PCR反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测分析。

表4 S4重复序列PCR反应体系和反应条件成分体积反应条件

7、牛胎儿成纤维细胞对G418的耐受性分析

将牛胎儿成纤维细胞以1×10⁴cells/孔在12孔板中培养，待细胞汇合度达到80％左右，分别用含有不同浓度的G418的10％FBS+90％DMEM/F12的培养液培养，所含G418的终浓度分别为：0μg/mL，100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL和700μg/mL，37℃、5％CO²饱和湿度下培养，每天观察细胞生长状况，记录不同浓度的G418将细胞全部杀死的时间。

8、细胞转染及阳性克隆筛选

8.1 CRISPR/Cas9和pP40-5'arm-Epo-3'arm共转染牛胎儿成纤维细胞

复苏两个冻存管的第二代牛胎儿成纤维细胞于两个100mm培养皿中，待其生长汇合到80％，用0.25％胰蛋白酶消化2min，加入4μg/mL含10％FBS的DMEM/F12终止消化，离心收集细胞，弃上清，再加4mL DMEM/F12重悬细胞并计数，再次离心收集细胞，加入DMEM/F12使得细胞密度达到1×10⁶cells/mL。取400μL细胞悬液加入4mm电击杯中，加入6.6μg pP40-5'arm-Epo-3'arm质粒和10.7μg CRISPR/Cas9质粒，轻敲杯底混匀后冰浴2min，采用50V，50μF条件电击转染，电击完成后，静置2min，再冰浴2min，然后将细胞按照密度为4.8×10⁵cells/mL接种在100mm培养皿中，加入不含抗生素10％BS+90％DMEM/F12的培养液15mL，37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养。

8.2转基因细胞的抗性筛选及单克隆细胞的分离扩培

转染48h后，加入含500μg/mL G418的10％FBS+90％DMEM/F12的培养基15mL，继续培养，每天按时观察死亡细胞数量和活细胞生长状况，每2天换液一次，筛选6-7天，出现单克隆细胞，用标记笔标记出单克隆细胞的位置，做好数据统计。用经高压灭菌的自制直径为8mm的钢圈(克隆杯)沾取少量无菌凡士林油，粘在有细胞克隆的标记处，PBS漂洗后，加入0.25％的胰蛋白酶50uL，消化2-3min，用10％FBS+90％DMEM/F12的培养液150uL终止消化，用移液枪轻轻吹打悬浮细胞，接种于48孔培养板中，加入含300μg/ml G418的10％FBS+90％DMEM/F12的培养基补足体积至500μl。待48孔板中细胞生长汇合达到80％左右，加胰蛋白酶消化细胞，将2/3体积的细胞接种于24孔培养板扩大培养，收集细胞，冷冻保存。余下1/3体积的细胞继续在48孔细胞培养板中培养，裂解细胞，按照前面的方法提取细胞基因组DNA，-20℃保存备用，进行PCR鉴定中靶克隆。

8.3中靶单克隆细胞的PCR鉴定

以抗G418的单克隆细胞基因组DNA为模板，PCR鉴定同源重组克隆。判断5'同源臂是否发生了同源重组，对同源臂外源序列设计引物，PCR正义引物位于β-casein基因5'arm的上游序列为5'-CATACCTCAGCCATAAAGGCAAGCAC-3'，反义引物位于Epo基因上序列为5'-AGCCACAGCCAGGCAGGACATTC-3'。反应体系和反应条件如表5。

表5鉴定5'arm PCR的反应体系和反应条件

由于PCR产物含有杂带，故我们将得到的PCR产物稀释100倍，然后将稀释的PCR产物作为模板，进行嵌套PCR，嵌套PCR正义引物序列为5'-GGTTGGACAGGGAGTACCAGGAAACA-3'，反义引物为5'-AGCCACAGCCAGGCAGGACATTC-3'反应体系和反应条件如表6。

表6嵌套PCR的反应体系和反应条件

判断3'同源臂是否发生了同源重组，PCR正义引物位于neo基因上，序列为5'-GCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGC-3'，反义引物位于β-casein基因3'arm的下游，序列为5'-TGGGTAGCCTATCCCTTCTCCTG-3'，反应体系和反应条件如表7。

表7鉴定3'armPCR的反应体系和反应条件

由于PCR产物含有杂带，故我们将得到的PCR产物稀释100倍，然后将稀释的PCR产物作为模板，进行嵌套PCR，嵌套PCR正义引物序列为：5'-ATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTC-3'，反义序列为5'-TGGGTAGCCTATCCCTTCTCCTG-3'，反应体系和条件如表8。扩增的PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收阳性目的条带，测序分析鉴定。

表8嵌套PCR的反应体系和反应条件

实施例2实验结果与分析

1、EPO cDNA的克隆

Trizol提取的人肾脏总RNA经1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下显示三个清晰的条带(28s 18s 5s其中28S最亮)(见图3)。说明RNA样品符合标准，可作为逆转录模板。以此RNA为模板，oligod(T)为引物进行逆转录聚合酶反应，以cDNA为模板，用设计合成的带有XhoI酶切位点的上下游引物进行PCR操作，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR反应产物，凝胶成像系统显示获得598bp的目的片段(见图4)，与理论相符。扩增Epo基因根据预设带有XhoI酶切位点，将目的基因克隆到克隆载体pJET 1.2的XhoI位点上，通过酶切鉴定(图5)得到598bp的Epo片段和2974bp的线性化pJET，证明Epo已连接到骨架载体上。测序引物采用pJET1.2载体通用上下游引物，测序结果表明(图6、7)，克隆的人促红细胞生成素基因序列正确。

2、重组质粒pP40-5'arm-3'arm的鉴定

胶回收5'arm片段，将5'同源臂克隆到实验室构建的pP40-3'arm的XhoⅠ位点上，酶切鉴定重组质粒pP40-5'arm-3'arm，对重组质粒分别做XhoⅠ单酶切和ApaⅠ单酶切，得到大小相同的片段，约为7918bp，再用BamHⅠ单酶切和XhoⅠ、ApaⅠ双酶切，分别的到大片段为6853bp和6873bp(图8)，表明质粒pP40-5'arm-3'arm构建正确。

3、重组质粒pP40-5'arm-Epo-3'arm的鉴定

EPO cDNA两端都有XhoⅠ酶切位点，将其插入到pP40-5'arm-3'arm的XhoⅠ位点上，通过kiser法提取质粒，经1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统紫外灯下显示，初步判断有5个阳性质粒(见图9的泳道3、泳道4、泳道6、泳道8、泳道9)。由于插入的Epo基因两端都为XhoⅠ酶切位点，连接后的质粒可能是正向插入也可能存在反向插入，通过PCR鉴定方向，如果Epo基因反向插入则应扩增出1649bp的特异性条带。经1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统紫外灯下显示，2、3、5泳道质粒扩增出1649bp目的条带，PCR结果不好，杂带较多(图10)，初步判断2、3、5泳道质粒Epo基因反向插入。将2、3、5泳道重组质粒进行部分质粒DNA测序，结果表明(图11)，2、3、5号重组质粒Epo基因为反向插入，2、3、5号重组质粒即为我们构建的基因打靶载体，命名为pP40-5'arm-Epo-3'arm。

4、组织块贴壁法分离培养牛胎儿成纤维细胞的形态学观察

将牛胚胎耳部组织块剪碎贴壁培养，培养1天后，少数组织块边缘开始迁出少量细胞(图12A)。培养2天后，大部分组织块周围均匀的迁出细胞(图12B)此时细胞大多呈梭形，为成纤维细胞，也有少部分细胞呈不规则形状。培养3-5天后，组织块周围迁出大量成纤维细胞，生长旺盛，向四周扩散(图12C、图12D)，梭形的成纤维细胞越来越多，所占比例也越来越大；培养6天后，组织块周围的细胞已生长至完全汇合(图12E)。此时吸除组织块儿，用0.25％胰蛋白酶消化，接种于75cm²培养瓶中扩大培养，待细胞生长至汇合度达80％，冻存备用。少许细胞继续传代，随着传代次数的增多，观察到绝大部分细胞都呈纤维状，成纤维细胞生长分裂快速，细胞形态较好，所以呈优势生长且在细胞群中占主导地位。在传代过程中，不规则细胞和上皮细胞被胰蛋白酶消化的时间比成纤维细胞消化所需时间长，因此经过几次传代后，可获得高纯度的成纤维细胞(图12F)。传代培养至50天，细胞生长缓慢逐渐死亡，体积增大扁平化有空泡，细胞呈老化状态(图12G)。

5、PCR法鉴定牛胎儿成纤维细胞的性别

提取4株牛胎儿成纤维细胞基因组，PCR法鉴定4个细胞株性别。4个细胞株都扩增出了437bp的内参角蛋白5特异条带(图13)，其中2个细胞株扩增出了582bp的S4重复序列特异条带(图13)。结果分析表明牛胎儿成纤维细胞基因组提取成功，4个细胞株中2个为雌性牛胎儿，2个为雄性牛胎儿。雌性牛胎儿细胞株用于基因转染实验。

6、牛胎儿成纤维细胞对G418的耐受性分析

利用不同浓度的G418对牛胎儿成纤维细胞进行抗性检测，结果发现，G418的浓度在200-700μg/mL的范围时，对牛胎儿成纤维细胞有明显的毒害作用。G418浓度为500μg/mL时，细胞培养7d被全部杀死(图14)；G418浓度为600μg/mL时，细胞培养5d被全部杀死(图14)；细胞全部被杀死的培养时间随G418浓度的增大而缩短。本实验利用含有浓度为500μg/mL G418的培养基对转染后的细胞进行抗性细胞克隆的筛选，可以在7d内杀死未转染的成纤维细胞，分离出单克隆细胞。

7、CRISPR/Cas9介导打靶的阳性克隆筛选

CRISPR/Cas9和pP40-5'arm-Epo-3'arm共转染到4.8×10⁵个牛胎儿成纤维细胞中，共转染后48h观察到外源插入的绿色荧光表达情况(图15A1A2明场和暗场)，表明CRISPR/Cas9表达载体成功转入牛胎儿成纤维细胞。用G418进行筛选7天，共获得7个G418抗性克隆(图15B1B2)，用克隆杯分离G418抗性克隆，接种于48孔培养板中待汇合到80％，挑选状态好的细胞胰酶消化，2/3体积细胞接种于24孔板继续扩大培养，待生长汇合至80％，冷冻保存；1/3体积细胞接种于48孔培养板中待汇合到80％，提取细胞基因组DNA，用PCR法鉴定中靶克隆。

8、中靶克隆的PCR鉴定

用设计的引物，进行PCR鉴定中靶细胞克隆。PCR法鉴定7个G418抗性克隆，其中3个扩增出1568bp和1387bp的特异性条带(见图16、17)，双侧结果都为阳性。将3个阳性克隆的PCR产物胶回收，委托Invitrogen公司进行DNA测序，测序结果表明3个克隆均为同源重组克隆(图18-1和18-2)。

本发明利用CRISPR/Cas9介导的同源重组，将人Epo定位整合到了牛胎儿成纤维细胞β-casein基因座；电击转染了4.8×10⁵个牛胎儿成纤维细胞，得到G418抗性克隆7个，以基因组为模板PCR扩增，经PCR产物测序结果分析表明有3个克隆为打靶克隆，相对打靶效率为42.9％(3/7)，绝对打靶效率为6.25×10^-6(见表9)。

表9牛胎儿成纤维细胞打靶效率

结论

1.通过RT-PCR技术成功从人肾脏组织中克隆了hEPO cDNA序列，经DNA测序分析正确。

2.成功构建了牛β-casein基因座的打靶载体pP40-5'arm-Epo-3'arm，为人Epo在牛胎儿成纤维细胞β-casein基因座的定位整合奠定了基础。

3.基于打靶位点序列，成功构建了特异性断裂靶位点序列的CRISPR/Cas9表达载体。

4.采用组织块贴壁法成功分离培养出牛胎儿成纤维细胞，具有正常的形态和旺盛的生长分裂能力，通过PCR鉴定出雌性牛成纤维细胞，为基因打靶提供了供体细胞。

5.成功利用CRISPR/Cas9介导人Epo在牛成纤维细胞β-casein基因座中的

本发明成功克隆了hEPO cDNA基因，并构建了牛β-casein基因座的打靶载体pP40-5'arm-Epo-3'arm；同时，基于打靶位点序列，成功构建了特异性断裂靶位点序列的CRISPR/Cas9表达载体；使用电击转染的方法将CRISPR/Cas9表达载体和打靶载体共转染到牛胎儿成纤维细胞中，通过同源重组获得了人Epo基因在牛β-casein基因座上定位整合的基因打靶牛胎儿成纤维细胞。

将本发明的人Epo基因在牛β-casein基因座上定位整合的基因打靶牛胎儿成纤维细胞作为核供体，可以通过体细胞核移植法获得克隆囊胚，移植到受体牛的子宫角，进行妊娠，产生具有高效表达EPO重组基因的牛的后代，通过后代动物的乳腺生产EPO蛋白。

以上只是本发明代表性实施例，在偏离本发明的精神实质的基础上进行简单的变化或替换也属于本发明的范围。

Claims

1.一种人Epo基因在牛β-casein基因座上定位整合的基因打靶方法，包括以下步骤：

1)从人肾脏中提取总RNA，用RT-PCR法扩增人EPO cDNA基因；

3)特异性断裂靶位点序列的CRISPR/Cas9表达载体的构建；

4)分离培养牛胎儿的成纤维细胞；

5)将步骤2)的打靶载体和步骤3)的CRISPR/Cas9表达载体共转染到牛胎儿成纤维细胞中，获得人Epo基因在牛β-casein基因座上定位整合的基因打靶牛胎儿成纤维细胞，其中，

所述步骤1)的RT-PCR法扩增，采用的引物为上游引物5'-GCCTCGAGATGGGGGTGCACGAATGTCC-3'，下游引物5'-GCCTCGAGTCATCTGTCCCCTGTCCTGC-3'，并在上下游引物5'端分别引入XhoⅠ酶切位点，

所述步骤2)扩增所述牛β-casein基因5′同源臂的引物为上游引物5'-ATTGGGCCCGTGTGTCAAGAGATTGTGATGG-3'和下游引物5'-CATCTCGAGCAAGTCCTGGGAATGGGAAGATG-3'，

所述步骤2)扩增所述牛β-casein基因3'同源臂的引物为上游引物5'-ATTGGATCCGGTCCTCATCCTTGCCTGC-3'和下游引物5'-GCTGGATCCGCTCCTCCTCTATGGGATTTTCC-3'，

所述步骤3)所构建的CRISPR/Cas9表达载体的sgRNA的靶基因位点在牛β-casein基因座第二外显子处，其靶位点序列为：CCAGGAATTGAGAGCCATGAAGG。

2.根据权利要求1所述的方法，步骤2)所构建的基因打靶载体的正筛选基因为编码新霉素磷酸转移酶的基因，即neo基因。

3.根据权利要求1所述的方法，步骤2)所构建的基因打靶载体的重组酶识别序列为Cre酶识别序列。

4.权利要求1-3的方法获得的人Epo基因在牛β-casein基因座上定位整合的基因打靶牛胎儿成纤维细胞。

5.权利要求4的基因打靶细胞用于在动物乳腺生物反应器中制备Epo的用途。