CN103525850A - 一种Clec3b基因敲除打靶载体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种Clec3b基因敲除打靶载体及其构建方法，在Clec3b基因外显子1的前后各引入一个loxP位点，其中，一个为独立的loxP位点，另一个带有Neomycin标记（Neo）；通过重组导入载体中。本发明所述载体通过敲除外显子1以及其上游的启动子，使整个TN蛋白无法表达，真正完全消除了TN的功能。这种小鼠模型的建立对研究TN的功能既提供了便捷性，同时又提供了研究准确性的保证。
Description
技术领域
本发明涉及一种条件基因敲除重组载体，尤其涉及一种用于构建敲除Clec3b基因小鼠模型的重组载体、以及所述载体的构建方法。
背景技术
四连接素（tetranectin，TN）于1986年在人类血浆中被发现，是凝集素家族C型成员之一，其分布十分广泛，见于多种组织和细胞中。除了人类，在猴、马、猫、猪、牛、狗、鼠、羊、鱼、爬行动物、两栖动物等动物中也发现TN蛋白的存在，说明TN在动物的生长发育过程中起重要的作用。
TN在血浆中被发现不久，即被发现与多种疾病、尤其是恶性肿瘤有关，如乳房癌、结肠癌、卵巢癌、冠心病、风湿性关节炎、多发性硬化、老年性痴呆、帕金森病等。研究显示，在恶性肿瘤患者血清中，TN呈低水平表达，但是在肿瘤组织中却高表达；还有研究证实，TN在帕金森病患者脑脊液中显著下调，因此可能参与了帕金森病的发生，有可能成为帕金森病的生物标记物。
虽然关于TN的研究已展开30年，但是，至今为止，TN的生理作用并不清楚。根据目前研究，一般认为TN的作用是通过它与纤溶酶原的结合来完成的。TN编码基因（Clec3b）含三个外显子，二个内含子，每个外显子都编码其特有的功能区域，其中外显子3编码的CRD区可能是TN与纤溶酶原结合的主要部位。但是，是否受其他区域影响则不清楚。目前TN领域的研究成果非常有限，因此深入研究TN的作用机理，对进一步研究肿瘤等疾病的发生机制和治疗方法具有十分重要的意义。
但是目前研究TN作用机理的动物模型非常匮乏，国外文献（至今总共发现2篇基因敲除的研究文献，且为同一机构报道）有报道通过敲除外显子3的方式获得TN敲除的小鼠模型，但是，这种方法仅消除了TN的部分功能，尚不能充分说明TN的功能是否完全消除。研究发现TN外显子3敲除后，可引起小鼠的脊椎发育出现畸形以及伤口愈合出现延迟，可是，报道的2篇文献均未能解释、也无法确认是否通过影响TN与纤溶酶原结合而导致这些现象的出现。因此，仍然需要研发完全消除TN功能的动物模型，以更好的在TN领域展开研究。
发明内容
针对目前TN基因研究模型存在的缺陷，本发明提供了一种能够构建敲除Clec3b基因小鼠模型的重组载体，所构建的小鼠模型克服了背景技术所述小鼠模型的缺点，通过敲除外显子1以及其上游的启动子，使整个TN蛋白无法表达，真正完全消除了TN的功能。这种小鼠模型的建立对研究TN的功能既提供了便捷又提供了保证。
本发明第一个方面是提供一种Clec3b基因敲除打靶载体的构建方法，所述方法包括：
在Clec3b基因外显子1的前后各引入一个loxP位点，其中，一个为独立的loxP位点，另一个带有Neomycin标记（Neo）；通过重组导入载体中。
本发明第一个方面所述的方法的一种优选实施例中，设计5’同源臂（5’arm）和3’同源臂（3’arm）引物P1-P4如下：
P1：5’-GGGCGGTGCTCTTTCCATTAGTT-3’
P2：5’-CTGAGCCCAGAAAGCGAAGGA-3’
P3：5’-GTGCCACTCCCACTGTCCTTTCC-3’
P4：5’-TTCCTCTGTGACTGGCCCGACTCC-3’
其中，P1和P2扩增2.7kb的5’同源臂，P3和P4扩增3.8kb的3’同源臂。
本发明第一个方面所述的方法的一种优选实施例中，所述方法步骤为：
PCR扩增5’和3’同源臂，BAC转化至EL350，进行同源重组；
在第一个位置插入floxP-Neo-loxP片段；然后切除loxP位点的floxed Neo标记，余下一个loxP；
在第二个loxP位置插入loxP/FRT-NeFRT片段，构建完成。
本发明第二个方面是提供一种上述方法构建的Clec3b基因敲除打靶载体。
本发明提供的重组载体，通过小鼠胚胎干细胞基因打靶、药物筛选、挑取阳性克隆、PCR鉴定获得同源重组克隆，将正确同源重组的胚胎干细胞通过囊腔注射获得嵌合体子代，嵌合体子代通过与野生型杂交后获得杂合子，杂合子之间进行杂交繁育即获得纯合子。
本发明所述载体通过敲除外显子1以及其上游的启动子，使整个TN蛋白无法表达，真正完全消除了TN的功能。这种小鼠模型的建立对研究TN的功能既提供了便捷性，同时又提供了研究准确性的保证。
附图说明
图1为本发明Clec3b基因条件敲除打靶载体构建策略示意图；
图2为本发明Clec3b基因条件敲除打靶载体质粒图谱；
图3为本发明Clec3b基因条件敲除打靶载体的DNA酶切电泳照片；
图4为ES细胞克隆PCR电泳照片，其中，1：5’arm5’PCR B4；2：5’arm5’PCR B5；3：5’arm5’PCR C7；4：3’arm3’PCR B4；5：3’arm3’PCR B5；6：3’arm3’PCR C7；M：GeneRuler1kb DNA Ladder Ferments（Cat No：SM0311）。
具体实施方式
Clec3b基因（Ensemb1Gene ID：ENSMUSG00000025784；BAC：BMQ193m17）外显子（Exon）和内含子（Intron）如表1所示。
表1，Clec3b基因的外显子和内含子
| Exon/Intron | 长度 | 起始位置 | 终止位置 |
| Exon1（ATG） | 159 | 10001 | 10159 |
| Intron1-2 | 3264 | 10160 | 13423 |
| Exon2 | 99 | 13424 | 13522 |
| Intron2-3 | 2231 | 13523 | 15753 |
| Exon3（TAG） | 684 | 15754 | 16437 |
备注：Clec3b基因外显子1从第10001碱基开始计算
Clec3b基因敲除打靶载体（Clec3b KO）的构建策略
参照图1和图2，本实施例中Clec3b基因敲除打靶载体的构建方法如下：
针对小鼠Clec3b基因设计5’同源臂扩增引物P1和P2、和3’同源臂扩增引物P3和P4；分别扩增5’同源臂和3’同源臂；BAC转化至EL350，进行同源重组。
P1：5’-GGGCGGTGCTCTTTCCATTAGTT-3’
P2：5’-CTGAGCCCAGAAAGCGAAGGA-3’
P3：5’-GTGCCACTCCCACTGTCCTTTCC-3’
P4：5’-TTCCTCTGTGACTGGCCCGACTCC-3’
在Clec3b基因外显子1的前后各引入一个loxP位点，其中，一个为独立的loxP位点，另一个带有Neomycin标记（Neo）。
表2，图1中相关片段在原BAC上的位置
图3为本发明所构建的打打靶载体质粒DNA的BamH I酶切鉴定照片。
表3，图2中相关片段在Clec3b KO载体中的位置
Clec3b基因敲除打靶载体的应用
1.打靶载体线性化
100μg Clec3b KO质粒DNA用Sal I（酶用量：300U）线性化，酶切体系为250μl、37℃消化过夜，等体积酚氯仿、氯仿处理后，无水乙醇沉淀，100μl无菌PBS重悬备用。
2.ES细胞打靶及筛选
ES细胞：SCR012，来源于129SV/EV品系雄性小鼠的胚胎干细胞。
电转仪型号：Bio-Rad Gene Pulser（Cat.No.165-2105）
电穿孔条件：电压240V，电容500μF，实际通电时间10.2ms，实际电压256V克隆筛选条件：300μg/ml G418和2μM GanC筛选8天
挑取抗性克隆和提供DNA样本共96份
3.ES细胞基因组鉴定策略
1.5’arm PCR鉴定
P1引物位于5’arm外，P2位于Neo上；阳性为2.7kbp。
P1、P2引物序列：
P1：GGGCGGTGCTCTTTCCATTAGTT（gene site：7622-7644）
P2：CTGAGCCCAGAAAGCGAAGGA
PCR反应体系
PCR反应条件：
94℃，5min——（94℃，30min——65℃，30min）×35个循环——72℃，3min——72℃，10min——12℃
2.5’arm PCR鉴定
P3引物位于Neo上，P4位于3’arm外；阳性为3.8kbp。
P3、P4引物序列：
P3：GTGCCACTCCCACTGTCCTTTCC
P4：TTCCTCTGTGACTGGCCCGACTCC（gene site：13807-13784）
PCR反应体系
PCR反应条件：
94℃，5min——（94℃，30min——65℃，30min）×35个循环——72℃，4min——72℃，5min——12℃
PCR鉴定药物抗性ES细胞克隆96个，其中3个ES克隆发生双臂同源重组。PCR产物经DNA序列测定进一步证实；3个ES克隆PCR电泳图如图4所示。
4.阳性ES细胞克隆囊胚注射
显微注射用囊胚来源：C57BL/6J小鼠通过超数排卵、自然受孕，化体内发育至囊胚阶段，用于注射。注射后移植入假孕小鼠受体子宫，受体为C57BL/6J
与CBA（♀）的杂交一代。
2011年1月27日至2011年7月22日共注射256枚胚胎，制作14只受体。共出生12只小鼠，其中5只为＞50%嵌合雄鼠。
5.嵌合小鼠繁育灰鼠
将嵌合率大于50%的成熟小鼠与C57BL/6J雌性小鼠进行交配，后代灰色小鼠经提取尾基因组DNA进行PCR鉴定（鉴定策略同上），共获得双臂阳性F1代小鼠8只，分别为：
再杂交繁育得到纯合子小鼠。纯合子小鼠经TN基因型、mRNA RT、Western-blotting等鉴定说明TN蛋白完全敲除。
本发明上述内容中，未提及的相关实验操作可参照现有方法实施，如胚胎干细胞基因打靶方法可参考Jnyner AL编著的“Gene Targetin“（Oxford UniversityPress.1994）；嵌合小鼠的制备方法可参考Nagy A、Gersenstein M、VinteratenK等人编著的“Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory Manual”（NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press，2003）。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (4)
1.一种Clec3b基因敲除打靶载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括：
在Clec3b基因外显子1的前后各引入一个loxP位点，其中，一个为独立的loxP位点，另一个带有Neomycin标记（Neo）；通过重组导入载体中。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法步骤为：
PCR扩增5’和3’同源臂，BAC转化至EL350，进行同源重组；
在第一个位置插入floxP-Neo-loxP片段；然后切除loxP位点的floxed Neo标记，余下一个loxP；
在第二个loxP位置插入loxP/FRT-NeFRT片段，构建完成。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所设计的5’同源臂（5’arm）和3’同源臂（3’arm）引物P1-P4如下：
P1：5’-GGGCGGTGCTCTTTCCATTAGTT-3’
P2：5’-CTGAGCCCAGAAAGCGAAGGA-3’
P3：5’-GTGCCACTCCCACTGTCCTTTCC-3’
P4：5’-TTCCTCTGTGACTGGCCCGACTCC-3’
其中，P1和P2扩增2.7kb的5’同源臂，P3和P4扩增3.8kb的3’同源臂。
4.一种如权利要求1所述的方法制备的Clec3b基因敲除打靶载体。
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