CN110438160B

CN110438160B - 一种Cd2ap基因敲除动物的构建方法及应用

Info

Publication number: CN110438160B
Application number: CN201910650999.7A
Authority: CN
Inventors: 吴志英; 陶青青
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-07-18
Filing date: 2019-07-18
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2039-07-18
Also published as: CN110438160A

Abstract

本发明提供了一种Cd2ap基因敲除动物的构建方法，及获得的Cd2ap基因敲除动物在治疗阿尔茨海默病的药物筛选、药效评价的应用。本发明还提供了一种特异性靶向Cd2ap基因的sgRNA序列、包含sgRNA序列的载体，及可以直接用于显微注射的RNA。

Description

一种Cd2ap基因敲除动物的构建方法及应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种Cd2ap基因敲除动物的构建方法及应用。

背景技术

随着功能基因组学的兴起和发展，基因敲除技术被人们广泛的用于探讨基因功能的研究，通过基因敲除技术逐渐明确了大量模式生物和重要功能微生物的全基因组，并能准确定位功能基因，从基因水平上更加清楚的认识微生物的代谢规律。同时，基因敲除技术的完善可进一步推动微生物代谢工程的广泛应用，通过基因敲除手段改变微生物细胞的代谢流向，阻断有害代谢产物积累，制备基因敲除模式动物，用于特定药物的药效评价和药物筛选。

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是原核生物基因组内的一段重复序列，是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出CRISPR-Cas9系统，利用这个系统，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的染色体上切除，这是细菌特有的免疫系统。本发明采用CRISPR-Cas9系统进行Cd2ap基因的条件性敲除。

Cd2ap基因位于17号染色体，其编码一种调节肌动蛋白细胞骨架的"支架分子"(在神经元通路中的广大连结区域聚积的蛋白分子)。该蛋白质直接与丝状肌动蛋白、及通过多种肌动蛋白结合位点的各种细胞膜的蛋白质、SH3结构域，以及含有SH3结构域结合位点之"富含脯氨酸区域"等交互作用。胞质蛋白定位于膜皱褶，脂筏和细胞的前缘。它牵涉到在受体的"内吞作用"和"胞质分裂"发生动态肌动蛋白重塑和膜交换。

现有技术中，公开了Cd2ap基因的相关功能，例如，文献：Cd2ap相关作用的研究进展，吝娜、王保兴，中国中西医结合肾病杂志，公开了Cd2ap基因敲除(Cd2ap-/-)的小鼠存在免疫功能缺损，于生后6-7周因蛋白尿和肾衰竭死亡。Cd2ap基因单倍缺失的小鼠(Cd2ap+/-)在出生后9月龄时出现肾小球改变并增加肾小球受伤的易感性，但其免疫功能仍正常。专利：CN107245502A公开了通过siRNA/shRNA，CRISPR/Cas9，CRISPR/cpf1，Talen或ZFNs来工作下调Cd2ap配伍，以降低Cd2ap与相关蛋白的相互作用剂，从而治疗个体HCV感染、糖尿病。文献：敲低CD2相关蛋白的表达对足细胞黏附和胞质伸展功能的影响，姜华军、张春等，中华肾脏病杂志，公开了通过利用特异性Cd2ap siRNA来抑制足细胞中Cd2ap分子的表达，结果发现，敲低Cd2ap的表达对胞质伸展、细胞黏附、F-actin、nephrin蛋白和磷酸化水平的影响，且足细胞黏附和胞质伸展的能力下降，足细胞的凋亡可使部分细胞失去黏附作用，但足细胞骨架蛋白的紊乱和nephrin信号通路的抑制更可能是足细胞黏附和伸展功能下降的主要原原因。专利：CN103045729A公开了老年性痴呆病变前期Cd2ap基因mRNA水平原位杂交筛查试剂盒、方法及应用，该检测试剂盒在mRNA水平上检测Cd2ap基因的表达功能，比现有的临床生化检测指标和影像医学检查更早期，能够实现真正的老年性痴呆(AD)病变前期mRNA水平的筛查，做到预防性诊治的目的。

但上述现有技术均未公开敲除Cd2ap基因特定的功能区域，也没有公开采用本发明人设计的特异性靶向基因的sgRNA及CRISPR/Cas9敲除的Cd2ap基因特定的功能区域，更没有公开敲除Cd2ap基因特定的功能区域后的动物在治疗阿尔茨海默病的药物筛选或药效评价中的应用。

发明内容

本发明的第一方面，涉及一种Cd2ap基因敲除动物的构建方法，所述的构建方法包括敲除Cd2ap基因的5号外显子。

优选的，所述的构建方法包括在动物Cd2ap基因座插入同向的特异性重组位点识别序列，获得条件性Cd2ap基因敲除Flox动物，向条件性Cd2ap基因敲除Flox动物导入重组酶或重组酶表达序列，敲除条件性Cd2ap基因敲除Flox动物Cd2ap基因的5号外显子，获得Cd2ap基因敲除动物。

优选的，使用基因编辑技术进行Cd2ap基因敲除动物的构建，所述的基因编辑技术包括但不限于CRISPR/Cas9技术、基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、锌指核酸酶技术、归巢核酸内切酶、转录激活子样效应因子核酸酶技术或其他分子生物学技术。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的基因编辑技术为CRISPR/Cas9技术。

优选的，所述的动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为小鼠。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的小鼠为C57BL/6小鼠。

进一步优选的，所述的构建方法包括使用靶向Cd2ap基因的sgRNA序列和/或靶向载体在所述动物Cd2ap基因的5号外显子两端各放置一个LoxP或Frt序列，获得条件性Cd2ap基因敲除Flox动物，将条件性Cd2ap基因敲除Flox动物与表达Cre或Flp重组酶的动物交配，利用Cre-loxP或Flp-Frt基因重组系统，获得Cd2ap基因敲除动物。

更进一步优选的，所述的sgRNA靶向5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：8-14任一项所示。

最优选的，所述的sgRNA靶向5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：8-11、14任一项所示。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的sgRNA靶向5’端靶位点序列如SEQ IDNO：4所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：14所示。

优选的，所述的靶向载体包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与Gene ID:12488至少具有90％同源性的核苷酸；b)插入的序列；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自与Gene ID:12488至少具有90％同源性的核苷酸。

进一步优选的，所述的插入的序列包括LoxP或Frt序列。

进一步优选的，所述的5’臂和3’臂约为2kb。

更进一步优选的，所述的靶向载体靶向位点为4号内含子和5号内含子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的一种Cd2ap基因敲除动物的构建方法，包括：

1)将如SEQ ID NO：1-7所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQ ID NO：8-14所示的任一项sgRNA靶序列连入带T7启动子的质粒上，并进行体外转录，得到用于显微注射的RNA；

2)向动物受精卵细胞显微注射靶向Cd2ap基因的靶向载体和步骤1)制备的用于显微注射的RNA及Cas9，优选的，所述的靶向载体包含LoxP或Frt序列；

3)培养步骤2)所述的显微注射靶向载体或RNA的受精卵细胞，然后移植至受体雌性非人哺乳动物的输卵管内发育；

4)将步骤3)中怀孕雌性后代筛选获得阳性F0代，将阳性F0代与表达Cre或Flp重组酶的动物交配，利用Cre-loxP或Flp-Frt基因重组系统，获得Cd2ap基因敲除动物。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述的构建方法包括：

4)将步骤3)中怀孕雌性后代筛选获得阳性F0代，将阳性F0代与野生型动物交配，筛选获得F1代阳性的动物，再将F1代阳性的动物与表达Cre或Flp重组酶的动物交配，筛选获得F2杂合子动物(fl/+，Cre/+)。

优选的，将F2杂合子动物(fl/+，Cre/+)相互交配，获得Cd2ap基因敲除的纯合子动物(fl/fl，Cre/+)。

优选的，所述的表达Cre的重组酶的动物为组织特异性的Cre动物。更优选的，所述的组织特异性的Cre动物为cCD2APsyn1Cre。

优选的，所述的步骤3)中的非人哺乳动物为假孕雌性。

优选的，所述的显微注射次数可以为多次。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的显微注射次数为4次。注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠输卵管中，生产基因改造小鼠。具体的，每次受精卵移植至受体母鼠输卵管的数量分别为288、278、175和211个。

本发明的第二方面，涉及一种上述Cd2ap基因敲除动物的构建方法构建的Cd2ap基因敲除动物。

本发明的第三方面，涉及一种条件性Cd2ap基因敲除Flox动物，所述的条件性Cd2ap基因敲除Flox动物的Cd2ap基因5号外显子两端各放置一个同向的特异性重组位点识别序列。

其中，所述的同向的特异性重组位点识别序列为LoxP或Frt序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的小鼠为C57BL/6小鼠。

本发明的第四方面，涉及一种条件性Cd2ap基因敲除Flox动物的构建方法，所述的构建方法包括在动物Cd2ap基因5号外显子两端各放置一个同向的特异性重组位点识别序列。

优选的，所述的使用基因编辑技术进行条件性Cd2ap基因敲除Flox动物的构建，所述的基因编辑技术包括但不限于CRISPR/Cas9技术、基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、锌指核酸酶技术、归巢核酸内切酶、转录激活子样效应因子核酸酶技术或其他分子生物学技术。

优选的，所述的构建方法包括使用靶向Cd2ap基因的sgRNA序列和/或靶向载体在所述动物Cd2ap基因5号外显子两端各放置一个LoxP或Frt序列。

进一步优选的，所述的sgRNA靶向5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：8-14任一项所示。

更进一步优选的，所述的sgRNA靶向5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：8-11、14任一项所示。

进一步优选的，所述的靶向载体包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与Gene ID:12488至少具有90％同源性的核苷酸；b)插入的序列；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自与Gene ID:12488至少具有90％同源性的核苷酸。

更进一步优选的，所述的插入的序列包括LoxP或Frt序列。

更进一步优选的，所述的5’臂和3’臂约为2kb。

在本发明的具体实施方式中，所述的构建方法包括：

3)培养步骤2)所述的显微注射靶向载体或RNA的受精卵细胞，然后移植至受体雌性非人哺乳动物的输卵管内发育。其中，非人哺乳动物为假孕雌性，所述的怀孕雌性后代筛选获得阳性F0代即为条件性Cd2ap基因敲除Flox动物。

本发明的第五方面，涉及一种采用所述的条件性Cd2ap基因敲除Flox动物的构建方法构建的条件性Cd2ap基因敲除Flox动物。

本发明的第六方面，涉及一种特异性靶向Cd2ap基因的sgRNA序列，所述的sgRNA序列靶向5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：8-14任一项所示。

优选的，所述的sgRNA序列的靶位点位于动物Cd2ap基因的4号内含子上和/或5号内含子上。

本发明的第七方面，涉及一种构建Cd2ap基因编辑动物的载体，所述的载体包含上述的sgRNA序列。

本发明的第八方面，涉及一种构建Cd2ap基因编辑动物的载体的制备方法，所述的制备方法包括：

1)提供序列如SEQ ID NO：1-7所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQ ID NO：8-14所示的任一项sgRNA靶序列；

2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，将片段DNA依次通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体pHSG299上，经测序验证，获得pT7-sgRNAG2载体；

3)将步骤1)中所述的sgRNA靶序列连入步骤2)所述的pT7-sgRNAG2载体的双链，筛选获得sgRNA载体。

本发明的第九方面，涉及一种用于显微注射的RNA，所述的RNA为上述的构建Cd2ap基因编辑动物的载体通过体外转录制备获得。

本发明的第十方面，涉及一种靶向载体，所述的靶向载体包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与Gene ID:12488至少具有90％同源性的核苷酸；b)插入的序列；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自与Gene ID:12488至少具有90％同源性的核苷酸。

进一步优选的，所述的插入的序列包括LoxP或Frt序列。

进一步优选的，所述的5’臂和3’臂约为2kb。

更进一步优选的，所述的靶向载体靶向的位点为4号内含子和5号内含子。

本发明的第十一方面，涉及一种Cd2ap基因敲除的细胞，所述的细胞敲除Cd2ap基因的5号外显子，或者，所述的细胞来源于上述的Cd2ap基因敲除动物的构建方法构建的Cd2ap基因敲除动物。

优选的，所述的Cd2ap基因敲除的细胞不是动物品种，所述的Cd2ap基因敲除的细胞不会发育为个体。

本发明的第十二方面，涉及一种Cd2ap基因敲除的细胞的构建方法，所述的构建方法包括：敲除Cd2ap基因的5号外显子。

优选的，使用靶向Cd2ap基因的sgRNA序列和/或靶向载体在细胞Cd2ap基因5号外显子两端各放置一个同向的特异性重组位点识别序列，将含有同向的特异性重组位点识别序列的细胞导入重组酶或重组酶表达序列，敲除所述细胞的5号外显子，获得Cd2ap基因敲除的细胞。

优选的，所述的细胞为受精卵或囊胚。

优选的，所述的同向的特异性重组位点识别序列为LoxP或Frt序列。

优选的，所述的细胞导入重组酶或重组酶表达序列的方式可以为将包含同向的特异性重组位点识别序列的细胞的动物与表达重组酶的动物交配所得受精卵。

优选的，所述的sgRNA靶向5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：8-14任一项所示。

进一步优选的，所述的sgRNA靶向5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：8-11、14任一项所示。

进一步优选的，所述的插入的序列包括LoxP或Frt序列。

进一步优选的，所述的5’臂和3’臂约为2kb。

本发明的第十三方面，涉及一种所述的Cd2ap基因敲除的细胞的构建方法构建的Cd2ap基因敲除的细胞。

本发明的第十四方面，涉及一种条件性Cd2ap基因敲除Flox细胞，所述的条件性Cd2ap基因敲除Flox细胞的Cd2ap基因5号外显子两端各放置一个同向的特异性重组位点识别序列，或者，所述的条件性Cd2ap基因敲除Flox细胞来源于上述的条件性Cd2ap基因敲除Flox动物的构建方法构建的条件性Cd2ap基因敲除Flox动物。

优选的，所述的条件性Cd2ap基因敲除Flox细胞不是动物品种，所述的条件性Cd2ap基因敲除Flox细胞不会发育为个体。

本发明的第十五方面，涉及一种条件性Cd2ap基因敲除Flox细胞的构建方法，所述的构建方法包括在细胞Cd2ap基因5号外显子两端各放置一个同向的特异性重组位点识别序列。

优选的，使用基因编辑技术进行条件性Cd2ap基因敲除Flox细胞的构建，所述的基因编辑技术包括但不限于CRISPR/Cas9技术、基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、锌指核酸酶技术、归巢核酸内切酶、转录激活子样效应因子核酸酶技术或其他分子生物学技术。

优选的，所述的构建方法包括使用靶向Cd2ap基因的sgRNA序列和/或靶向载体在所述细胞Cd2ap基因5号外显子两端各放置一个同向的特异性重组位点识别序列，所述的同向的特异性重组位点识别序列为LoxP或Frt序列。

更进一步优选的，所述的插入的序列包括LoxP或Frt序列。

更进一步优选的，所述的5’臂和3’臂约为2kb。

本发明的第十六方面，涉及一种条件性Cd2ap基因敲除Flox细胞的构建方法构建的条件性Cd2ap基因敲除Flox细胞。

本发明的第十七方面，涉及一种组织或器官或其培养物，所述的组织或器官或其培养物来源于上述的Cd2ap基因敲除动物、条件性Cd2ap基因敲除Flox动物、Cd2ap基因敲除的细胞或条件性Cd2ap基因敲除Flox细胞。优选的，所述的组织为胸腺组织、脾组织、表皮组织或肠组织。

优选的，所述的组织或器官或其培养物不是动物品种，所述的组织或器官或其培养物不会发育为个体。

本发明的第十八方面，涉及一种上述的Cd2ap基因敲除动物的构建方法构建的Cd2ap基因敲除动物、上述的条件性Cd2ap基因敲除Flox动物的构建方法构建的条件性Cd2ap基因敲除Flox动物、上述的Cd2ap基因敲除的细胞、上述的条件性Cd2ap基因敲除Flox细胞在治疗阿尔茨海默病的药物筛选、药效评价的应用。

优选的，所述的候选药物选自胆碱酯酶抑制剂、抗乙酰胆碱分解酵素、抗精神病药物、神经元保护剂、抗癫痫药、抗抑郁症药物、多奈哌齐，及其衍生物、正在研发的类似药物或CAR-T治疗的药物中的一种或两种以上的药物联合使用。更优选的，所述的候选药物选自单抗、双特异性抗体或CAR-T治疗的药物中的一种或两种以上的药物联合使用。

本发明的第十九方面，涉及一种治疗阿尔茨海默病的药物筛选或药效评价的方法，构建阿尔茨海默病动物模型，向其给予候选药物，对给予候选药物的动物进行药效检测和评价，其中，所述的动物为本发明所述的Cd2ap基因敲除动物。

优选的，所述药物筛选或药效评价的方法不是治疗方法。该方法用来筛选药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明提供的Cd2ap基因敲除动物或条件性Cd2ap基因敲除Flox动物的构建方法为纯RNA注射，缩短Cas9蛋白和sgRNA的作用时间。

本发明所述的“sgRNA序列”在待改变的Cd2ap基因上的靶序列是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG-3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列的排列规则。

本发明所述的“受精卵”包括但不限于C57BL/6受精卵、FVB/N受精卵、129受精卵、BALB/c受精卵、DBA/1受精卵或DBA/2受精卵。

除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，Fritschand Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.in chief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

本发明所述的“基因敲除”是指通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。优选的，所述的基因敲除包括全身敲除、组织特异性敲除，诱导性敲除。基因敲除是基因打靶技术的一种。优选的，所述的打靶载体包括替换型载体和插入型载体。所述的打靶载体分为全基因敲除、条件性基因敲除、基因敲进、诱导性基因敲除。例如，所述的Cd2ap基因敲除的细胞为敲除细胞中Cd2ap基因5号外显子的细胞。

本发明所述的“条件性敲除”或者“条件性Cd2ap基因敲除”是指通过基因编辑技术，在目的片段的两侧引入特异性重组位点识别序列，获得的动物即为Flox条件性敲除动物。所述的Flox条件性敲除动物可以与表达Cre或Flp重组酶动物交配，利用Cre-loxP或Flp-Frt基因重组系统，获得基因敲除动物。

本发明所述的“治疗”指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域普通技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术或本发明提供的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同源性。

本发明所述的“动物”为非人哺乳动物，优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿动物。所述的啮齿类动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述的啮齿动物选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。

在本发明的一个特定实施方式中，所述的非人动物为啮齿类动物，包括但不限于BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠及NOD、NOD/SCID、NOD-Prkdc^scid IL-2rg^null背景的小鼠。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：改造野生型小鼠以获得Flox小鼠所使用的打靶载体基因示意图(非按比例)。

图2：改造后的Flox小鼠Cd2ap基因示意图(非按比例)。

图3：Flox小鼠至特异性敲除Cd2ap基因5号外显子的小鼠的Cre重组过程示意图。

图4：sgRNA活性检测结果，图A为识别5’端靶位点的sgRNA活性检测结果，图B为识别3’端靶位点的sgRNA活性检测结果，其中，图A或B中的纵坐标为Cas/sgRNA相对活性值，Con.为阴性对照，PC为阳性对照。

图5：precut pCS质粒图谱。

图6：用于显微注射的RNA电泳图，其中M为Marker，+为sgRNA4或sgRNA14相应制备出的RNA电泳结果。

图7：打靶载体示意图。

图8：打靶载体酶切鉴定结果，其中，第一泳道为Marker，1代表EcoRV+SaII酶切结果，片段长度分别为3649bp+2730bp+1306bp，2代表ScaI酶切结果，片段长度分别为4690bp+2995bp，3代表EcoRI+NotI酶切结果，片段长度分别为4979bp+2706bp，ck代表未经酶切的结果。

图9：F0代小鼠基因型检测结果，采用的引物为L-GT-F/cKO-3'-DO-R，其中，第一泳道为F0代小鼠基因型，+为阳性对照，WT为野生型对照，H₂O为水对照，M为Marker。

图10：F0代小鼠基因型检测结果，采用的引物为cKO-5'-DO-F/R-GT-R，其中，M为Marker，第二泳道为F0代小鼠基因型，+为阳性对照，WT为野生型对照，H₂O为水对照。

图11：F1代小鼠基因型检测结果，采用的引物为L-GT-F/cKO-3'-DO-R，其中，1EQ25-2、1EQ25-4、1EQ25-6、1EQ25-7分别为F1代小鼠编号，+为阳性对照，WT为野生型对照，H₂O为水对照，最后一个泳道为Marker。

图12：F1代小鼠基因型检测结果，采用的引物为cKO-5'-DO-F/R-GT-R，其中，第一个泳道为Marker，1EQ25-2、1EQ25-4、1EQ25-6、1EQ25-7分别为F1代小鼠编号，+为阳性对照，WT为野生型对照，H₂O为水对照。

图13：F1阳性小鼠鼠尾DNA的Southern blot检测结果，其中，1EQ25-2，1EQ25-4，1EQ25-6和1EQ25-7为F1代阳性小鼠，WT为野生型对照。

图14：F1代条件性Cd2ap基因敲除Flox杂合子小鼠与组织特异性Cre小鼠(Ts-Cre)交配，获得fl杂合子小鼠。

图15：F1代条件性Cd2ap基因敲除Flox纯合子小鼠与组织特异性Cre小鼠(Ts-Cre)交配，获得fl杂合子小鼠。

图16：为f1代杂合子小鼠与Cre-deleter小鼠交配的结果图，其中，Δ为由fl小鼠和组织特异性Cre或Cre-deleter小鼠交配，获得的组织特异性或全身敲除目的基因的小鼠。

图17：将杂合子小鼠(Δ/+，Cre/+)相互交配，得到纯合子小鼠(Δ/Δ)的交配结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在下述实施例中，设备和材料是从以下指出的几家公司获得：

C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；

UCA试剂盒来源来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号BCG-DX-001；

Ambion体外转录试剂盒购自Ambion，货号AM1354；

Cas9mRNA来源SIGMA，货号CAS9MRNA-1EA；

EcoRV、SaII、ScaI、EcoRI、NotI酶购自NEB。

实施例1 序列设计

小鼠Cd2ap基因(Gene ID:12488，MGI:1330281，位于17号染色体反链上，全长1.6kb)的转录本见表1。分析该基因的结构域、调控区、保守性确定敲除5号外显子。首先在5号外显子两端(4号内含子的非保守区与5号内含子的非保守区)各放置一个LoxP序列，得到Flox小鼠(打靶载体见图1，Flox小鼠Cd2ap基因见图2)。将Flox小鼠与特异性表达Cre的工具鼠交配，即可获得具有组织或细胞特异性敲除目的基因的小鼠，Flox小鼠至特异性敲除Cd2ap基因5号外显子的小鼠过程示意图如图3所示。

表1 小鼠Cd2ap基因转录本

实施例2 条件性Cd2ap基因敲除Flox动物的构建

1、显微注射的RNA的制备及验证

设计并合成靶向小鼠Cd2ap基因4号内含子非保守区(识别5’端靶位点)及5号内含子非保守区(识别3’端靶位点)的sgRNA序列。具体的，识别5’端靶位点(sgRNA1-sgRNA7)、3’端靶位点(sgRNA8-sgRNA14)的具体序列见表2。不同品系，基因序列可能有差异。为了保证所设计CRISPR/sgRNA的效率，首先需要对B6鼠尾靶位点序列进行PCR扩增并测序验证，以保证sgRNA识别序列与构建品系小鼠DNA序列完全一致。结果表明：B6鼠尾靶序列与Genebank和Ensembl所给序列一致。

表2 sgRNA序列

利用UCA^TM试剂盒检测sgRNA的活性，检测结果见图4和表3，从图4和表3可知，不同的sgRNA序列具有不同的活性，其中，sgRNA5、sgRNA8、sgRNA9、sgRNA11活性相对较低，这可能由于靶位点序列的特殊性导致，但根据我们的实验，sgRNA5、sgRNA8、sgRNA9、sgRNA11的数值仍显著高于对照组数值，仍可判断sgRNA5、sgRNA8、sgRNA9、sgRNA11是具有活性的，并且活性满足基因打靶实验要求，UCA检测结果见表3。从中优先选择sgRNA4及sgRNA14进行后续试验。在sgRNA上游序列加上TAGG获得正向寡核苷酸序列，下游序列加上AAAC获得反向寡核苷酸序列，将正向寡核苷酸与对应的反向寡核苷酸退火后将退火产物分别连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT7-sgRNA4和pT7-sgRNA14。pT7-sgRNA载体由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至pCS骨架载体(见图5)上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。

表3 sgRNA的活性值

Con	PC	sgRNA1	sgRNA2	sgRNA3	sgRNA4	sgRNA5	sgRNA6	sgRNA7
									1	62.12363	79.29981	92.90547	102.494	123.0475	11.30375	58.52391	98.25978
Con	PC	sgRNA8	sgRNA9	sgRNA10	sgRNA11	sgRNA14
									1	57.96125	10.54763	2.361221	35.16926	6.262108	62.45252

将验证正确的载体进行体外转录，得到可以直接用于显微注射的RNA。在65℃跑胶5分钟获得的RNA的电泳图见图6，图6显示，验证正确的载体进行体外转录后获得了直接用于显微注射的RNA。

2、打靶载体的制备及验证

按照图1所示的打靶载体示意图，设计并合成打靶载体(见图7)。打靶载体由外部公司(使用外部公司提供的pUC57质粒作为骨架质粒)合成得到多个质粒，酶切鉴定结果如图8所示。由图8可知，采用EcoRV+SaII酶切后片段长度分别为3649bp+2730bp+1306bp，采用ScaI酶切后片段长度分别为4690bp+2995bp，采用EcoRI+NotI酶切后片段长度分别为4979bp+2706bp，与理论上应该获得的片段长度一致。同时，经测序验证后，将验证正确的载体质粒用于后续实验。

3、显微注射

将上述制备的用于显微注射的Cas9/RNA、制备的打靶载体显微注射到C57BL/6小鼠受精卵中，共注射4次，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠输卵管中，生产基因改造小鼠，即为F0代小鼠，其中，每次注射后F0代小鼠出生情况见表4。

表4 注射后F0代小鼠出生情况

通过PCR鉴定F0代小鼠体细胞基因型，PCR反应条件见表6，小鼠的基因型检测引物如表5所示，鉴定结果见图9、10，结果显示，此鼠为F0代阳性鼠。

表5 小鼠的基因型检测引物

表6 PCR反应条件

由于受精卵注射方法得到F0代小鼠可能为嵌合体/杂合/纯合，以F0代小鼠鼠尾进行基因型鉴定得到的F0代鼠的基因型仅供参考，不代表其基因突变型具有生殖系遗传，可遗传的基因型需经F1代小鼠检测确定。

取F0代阳性鼠与野生型小鼠交配得到F1代小鼠。交配结果如表7所示。F1代小鼠PCR鉴定时的，PCR反应条件见表6，F1代小鼠的基因型检测引物如表5所示。鉴定结果见图11、12。通过PCR及测序，表明1EQ25-2，1EQ25-4，1EQ25-6和1EQ25-7为阳性F1代小鼠。

表7 F0代阳性鼠与野生型小鼠交配产生F1代小鼠情况

进一步的，对F1代PCR鉴定为阳性的4只小鼠进行Southern blot检测，确认是否存在随机插入。提取F1阳性小鼠鼠尾提取基因组DNA，进行Southern blot检测结果见图13。在5’端loxP位点的左侧和3’端loxP位点的右侧分别引入Southern blot酶切位点，若发生正确重组，将会出现野生型和突变型两个条带，如果有随机插入，内源探针检测会出现多条带。

结果表明，1EQ25-2，1EQ25-4，1EQ25-6和1EQ25-7为F1代阳性小鼠，并且均没有随机插入。即获得条件性Cd2ap基因敲除Flox动物。

实施例3 Cd2ap基因敲除动物的构建

1、目的基因组织特异性敲除

将实施例2获得的条件性Cd2ap基因敲除Flox动物(纯合子或杂合子)与组织特异性的Cre小鼠交配，实现目的基因组织特异性的敲除，交配方案见图3。其中，基因检测所需引物见表8。

表8 目的基因组织特异性敲除的基因检测所需引物

首先，将条件性Cd2ap基因敲除Flox动物(纯合子或杂合子)与组织特异性Cre小鼠(Ts-Cre)交配，获得fl杂合子小鼠，交配结果见图14、15所示。采用表8中5’LoxP-F/R进行检测(检测交配策略见表9)，获得杂合子小鼠(fl/+，Cre/+)。

表9 5’LoxP-F/R检测交配策略，选择fl/+，Cre/+

将杂合子小鼠(fl/+，Cre/+)相互交配，采用表8中5’LoxP-F/R进行检测(表10)，获得纯合子小鼠(fl/fl，Cre/+)。

表10 5’LoxP-F/R检测交配策略，选择fl/fl，Cre/+

2、全基因敲除的小鼠

采用fl杂合子小鼠(fl/+，Cre/+)与Cre-deleter小鼠交配，获得全基因敲除小鼠。

首先，将实施例2获得的条件性Cd2ap基因敲除Flox杂合子小鼠与Cre-deleter小鼠交配，以去除exon5，交配结果见图16，采用表8中5’LoxP-F/-R、5’LoxP-F/3’LoxP-R进行检测(表11)，获得杂合子小鼠(Δ/+，Cre/+)。

表11 5’LoxP-F/-R、5’LoxP-F/3’LoxP-R检测交配结果，选择Δ/+，Cre/+

将获得的杂合子小鼠(Δ/+，Cre/+)相互交配，得到纯合子小鼠(Δ/Δ)，采用表8中5’LoxP-F/-R、5’LoxP-F/3’LoxP-R进行检测(表12)，交配结果见图17，获得全基因敲除小鼠(Δ/Δ)。

表12 5’LoxP-F/-R、5’LoxP-F/3’LoxP-R检测交配结果，选择Δ/Δ

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种Cd2ap基因敲除动物的构建方法及应用

<130> 1

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtttgagat ttcactggtc tgg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgcttatggc acatgtatag agg 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttcagggat tagttaaggt agg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggatttcag ggattagtta agg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttgtcgttgt ttaactgaag ggg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctggcacttg agctgcttgg agg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcggctgatt tccaggagct ggg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tagcttttaa ggttcgatac agg 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

attttgggga ctagctttta agg 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaacacagaa gctcttataa tgg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctatcttctt gtctggacac tgg 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtgttttata cagaacagtc agg 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tattccacaa aataggtatt tgg 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tatatattct aataagtagt tgg 23

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tccaagcttg tgcctattgc acttc 25

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gacgcctaga ttgtgctact ctcagct 27

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cgtgctagat cgactgctag agtgac 26

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agcaacagca tcctcatcaa cccaa 25

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gatttccagg agctgggatg atggg 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tcatcaggta aggtgcttgc ctacc 25

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aacaccagac attccaaccc ttta 24

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ctcattgggc atcaacatgt cacact 26

Claims

1.一种Cd2ap基因敲除动物的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括敲除Cd2ap基因的5号外显子，所述的构建方法包括使用靶向Cd2ap基因的sgRNA、Cas9和靶向载体在所述动物Cd2ap基因的5号外显子两端各放置一个LoxP或Frt序列，获得条件性Cd2ap基因敲除Flox动物，将条件性Cd2ap基因敲除Flox动物与表达Cre或Flp重组酶的动物交配，利用Cre-loxP或Flp-Frt基因重组系统，获得Cd2ap基因敲除动物，所述的靶向5’端靶位点的sgRNA序列如SEQ ID NO：4所示，靶向3’端靶位点的sgRNA序列如SEQ ID NO：14所示，所述的靶向载体中含有Cd2ap基因的5号外显子，其两端各毗邻一个LoxP或Frt序列，同时LoxP或Frt序列两端还各延伸有所述5号外显子的左右同源臂序列。

2.根据权利要求1所述的一种Cd2ap基因敲除动物的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括：

1）将SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：14所示的sgRNA序列连入带T7启动子的质粒上，并进行体外转录，得到用于显微注射的RNA；

2）向动物受精卵细胞显微注射靶向Cd2ap基因的靶向载体、Cas9和步骤1）制备的用于显微注射的RNA；

3）培养步骤2）所述的经过显微注射的受精卵细胞，然后移植至受体雌性非人哺乳动物的输卵管内发育；

4）从步骤3）中怀孕雌性后代中筛选获得阳性F0代，将阳性F0代与表达Cre或Flp重组酶的动物交配，利用Cre-loxP或Flp-Frt基因重组系统，获得Cd2ap基因敲除动物。

3.一种Cd2ap基因敲除的细胞，其特征在于，所述的细胞来源于权利要求1-2任一所述的Cd2ap基因敲除动物的构建方法构建的Cd2ap基因敲除动物，所述的Cd2ap基因敲除的细胞不会发育为动物个体。

4.一种权利要求1-2任一所述的Cd2ap基因敲除动物的构建方法构建的Cd2ap基因敲除动物、权利要求3所述的Cd2ap基因敲除的细胞在治疗阿尔茨海默病的药物筛选、药效评价的应用。