CN112980846B - 一种Pax2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法 - Google Patents

一种Pax2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112980846B
CN112980846B CN202110381604.5A CN202110381604A CN112980846B CN 112980846 B CN112980846 B CN 112980846B CN 202110381604 A CN202110381604 A CN 202110381604A CN 112980846 B CN112980846 B CN 112980846B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pax2
seq
mice
nucleotide sequence
sgrna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110381604.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112980846A (zh
Inventor
蔚洪恩
吕娜
王颖
王一卓
陈悦悦
王敏
董丽娜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanxi Provincial Peoples Hospital
Original Assignee
Shanxi Provincial Peoples Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanxi Provincial Peoples Hospital filed Critical Shanxi Provincial Peoples Hospital
Priority to CN202110381604.5A priority Critical patent/CN112980846B/zh
Publication of CN112980846A publication Critical patent/CN112980846A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112980846B publication Critical patent/CN112980846B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种Pax2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，涉及动物模型构建技术领域。本发明所述sgRNAs分别设计在Pax2基因的intron1和intron2非保守区中，5'端和3'端的同源臂分别约为1.4kb和1.4kb。本发明基于上述sgRNA设计了Pax2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，将Cas9/sgRNA质粒和所述特异性打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，通过两步筛选和一次杂交，获得Pax2条件性基因敲除小鼠模型，运用cre‑loxp系统，构建出flox小鼠后可与不同的cre工具鼠灵活搭配运用，研究目的基因在不同组织器官，甚至不同细胞类型中的作用机制。

Description

一种Pax2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法
技术领域
本发明属于动物模型构建技术领域，具体涉及一种Pax2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法。
背景技术
Pax为全长配对盒基因，属于发育调控基因家族，在胚胎发育过程中，可通过编码核转录因子，达到促进组织增生、抑制细胞凋亡和协调细胞的特殊分化的作用。近年来发现与核转录因子有关的Pax家族中的Pax2在免疫组织化学中具有明显的应用，如Pax2同源基因在肾脏的分化过程中表现出强表达，特别是后肾间叶细胞，是间叶细胞向上皮细胞转化的关键因素；同时关于Pax2基因的致瘤性在体外和裸鼠体内试验中也有报道，Pax2在体外肾癌的细胞株上表达，在卵巢浆液性乳头状瘤中也有较高表达。但是目前关于Pax2的作用机理并不深刻，且也没有相关的动物模型进行相关的研究。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种靶向小鼠Pax2基因的sgRNA及Pax2条件性基因敲除模型的构建方法，可成功构建Pax2条件性基因敲除小鼠模型，运用cre-loxp系统，构建出flox小鼠后可与不同的cre工具鼠灵活搭配运用，研究目的基因在不同组织器官，甚至不同细胞类型中的作用机制，为国内外提供有效的模型动物。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种靶向小鼠Pax2基因的sgRNA，所述sgRNA包括5’Guide序列和3’Guide序列，所述5’Guide包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示的任意一条序列；所述3’Guide序列包括SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.16所示的任意一条序列。
优选的，所述sgRNA的5’Guide序列如SEQ ID NO.5所示，且所述sgRNA的3’Guide序列如SEQ ID NO.10所示。
优选的，所述小鼠Pax2基因在NCBI的Gene ID为18504。
本发明提供了一种Pax2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：(1)以小鼠基因组DNA为模板，分别克隆小鼠Pax2基因的LR、A和RR片段，依次将所述LR、A和RR片段连接至LScKO-2G载体，得特异性打靶载体；克隆所述LR片段的引物包括Pax2-LR-F和Pax2-LR-R，其中所述Pax2-LR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述Pax2-LR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；克隆所述A片段的引物包括Pax2-A-F和Pax2-A-R，所述Pax2-A-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，所述Pax2-A-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；克隆所述RR片段的引物包括Pax2-RR-F和Pax2-RR-R，所述Pax2-RR-F的核苷酸序列如SEQID NO.21所述，所述Pax2-RR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；
(2)将上述sgRNA合成oligos，连接入pUC载体，得Cas9/sgRNA质粒；
(3)将Cas9/sgRNA质粒和所述特异性打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，出生后得F0代小鼠；
(4)筛选F0代小鼠中基因重组正确的个体与野生型小鼠交配得到F1代小鼠；
(5)筛选所述F1代小鼠中基因正确表达的杂合子小鼠与组织特异性的Cre小鼠交配，得所述Pax2条件性基因敲除小鼠模型；
步骤(1)和(2)之间不存在时间上的先后关系。
优选的，步骤(1)中扩增所述LR、A和RR片段的PCR程序，均为：94℃预变性2min；98℃变性10s，67℃退火30s，68℃延伸1kb/min，每个循环退火温度降低0.7℃，共15个循环；98℃变性10s，57℃退火30s，68℃延伸1kb/min，25个循环；68℃延伸10min。
优选的，步骤(1)所述连接包括依次将LR片段连接至Not I和BamH I酶切位点之间，将A片段连接至Sal I和Bgl II酶切位点之间，将RR片段连接至Xho I和EcoR I酶切位点之间。
优选的，步骤(4)所述筛选包括利用两对引物进行PCR，其中一对包括Pax2-L-GT-F和cKO-5'-DO-F；另一对包括cKO-3'-DO-R和Pax2-R-GT-R；
所述Pax2-L-GT-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，所述cKO-5'-DO-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；
所述cKO-3'-DO-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，所述Pax2-R-GT-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。
优选的，步骤(5)所述筛选包括利用两对引物进行PCR，其中一对引物包括Pax2-L-GT-F2和cKO-5'-DO-F；另一对引物包括cKO-3'-DO-R和Pax2-R-GT-R1；所述Pax2-L-GT-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示，所述Pax2-R-GT-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。
优选的，步骤(4)和步骤(5)所述筛选时，PCR扩增的程序均包括：94℃预变性2min；98℃变性10s，67℃退火30s，68℃延伸1kb/min，每个循环退火温度降低0.7℃，共15个循环；98℃变性10s，57℃退火30s，68℃延伸1kb/min，25个循环；68℃延伸10min。
本发明还提供了利用上述构建方法构建得到的Pax2条件性基因敲除小鼠模型在构建全身性基因敲除小鼠模型中的应用。
本发明提供了一种靶向小鼠Pax2基因的sgRNA，sgRNAs分别设计在Pax2(也称EGE-YHN-011-A，在19号染色体反链上，全长91.7kb，Gene ID:18504)基因的intron1和intron2非保守区中，5'端和3'端的同源臂分别约为1.4kb和1.4kb。
本发明基于上述sgRNA设计了Pax2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，将Cas9/sgRNA质粒和所述特异性打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，通过两步筛选和一次杂交，获得Pax2条件性基因敲除小鼠模型，运用cre-loxp系统，构建出flox小鼠后可与不同的cre工具鼠灵活搭配运用，研究目的基因在不同组织器官，甚至不同细胞类型中的作用机制，为国内外提供有效的模型动物。
附图说明
图1为特异性打靶载体的质粒图谱；
图2为本发明构建的Cas9/sgRNA质粒图谱；
图3为F0代小鼠基因型鉴定的引物设计原则；
图4为F1代小鼠基因型鉴定的引物设计原则；
图5为F1代杂合子小鼠与组织特异性的Cre小鼠交配方案；
图6为获得全身性基因敲除的小鼠的交配方案；
图7为sgRNA的活性检测结果；
图8为F0代小鼠基因型鉴定结果；
图9为F1代小鼠基因型鉴定结果；
图10为F1代PCR阳性小鼠Southernblot检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种靶向小鼠Pax2基因的sgRNA，所述sgRNA包括5’Guide序列和3’Guide序列，所述5’Guide包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示的任意一条序列；所述3’Guide序列包括SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.16所示的任意一条序列。
本发明所述小鼠Pax2基因(实施例部分图片中也称EGE-YHN-011-A)在NCBI的GeneID为18504，包含3个转录本：Pax2-201(ENSMUST00000174490.8)、Pax2-202(ENSMUST00000173346.3)和Pax2-203(ENSMUST00000004340.10)，本申请实施例中优选以Pax2-203为基础进行sgRNA的设计，所设计的sgRNA序列如表1和表2所示。
表15’Guide序列信息
5’Guide 序列(5’-3’) SEQIDNO
Guide#1 ACCCGCCTGCGCCGCAGGTTTGG 1
Guide#2 CGCCAAACCTGCGGCGCAGGCGG 2
Guide#3 CCGCGCCAAACCTGCGGCGCAGG 3
Guide#4 TAGAAACCCGCCTGCGCCGCAGG 4
Guide#5 CTCAAGCCGCGCCAAACCTGCGG 5
Guide#6 AGTTAGGCAGCGAAGGTGAACGG 6
Guide#7 AAGGGGAAATAATGTTAACGGGG 7
Guide#8 GAAGGTGAACGGGATGTGTTTGG 8
表23’Guide序列信息
Figure BDA0003013220270000041
Figure BDA0003013220270000051
本发明优选对Guide#5和Guide#10进行功能验证和后续小鼠模型的构建。
本发明提供了一种Pax2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：(1)以小鼠基因组DNA为模板，分别克隆小鼠Pax2基因的LR、A和RR片段，依次将所述LR、A和RR片段连接至LScKO-2G载体，得特异性打靶载体；克隆所述LR片段的引物包括Pax2-LR-F和Pax2-LR-R，其中所述Pax2-LR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述Pax2-LR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；克隆所述A片段的引物包括Pax2-A-F和Pax2-A-R，所述Pax2-A-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，所述Pax2-A-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；克隆所述RR片段的引物包括Pax2-RR-F和Pax2-RR-R，所述Pax2-RR-F的核苷酸序列如SEQID NO.21所述，所述Pax2-RR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；
(2)将上述sgRNA合成oligos，连接入pUC载体，得Cas9/sgRNA质粒；
(3)将Cas9/sgRNA质粒和所述特异性打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，出生后得F0代小鼠；
(4)筛选F0代小鼠中基因重组正确的个体与野生型小鼠交配得到F1代小鼠；
(5)筛选所述F1代小鼠中基因正确表达的杂合子小鼠与组织特异性的Cre小鼠交配，得所述Pax2条件性基因敲除小鼠模型；
步骤(1)和(2)之间不存在时间上的先后关系。
本发明以小鼠基因组DNA为模板，分别克隆小鼠Pax2基因的LR、A和RR片段，依次将所述LR、A和RR片段连接至LScKO-2G载体，得特异性打靶载体；克隆所述LR、A和RR片段的引物如表3所示，且在Pax2-LR-F的序列中添加Not I酶切位点，Pax2-LR-R的序列中添加BamHI酶切位点，Pax2-A-F的序列中添加Sal I酶切位点，Pax2-A-R的序列中添加Bgl II酶切位点，Pax2-RR-F的序列中添加Xho I酶切位点，Pax2-RR-R的序列中添加EcoR I酶切位点。
表3克隆LR、A和RR片段的引物信息
Figure BDA0003013220270000061
本发明利用表3中所述的引物和模板DNA进行相应的片段扩增，所述扩增的PCR体系以20μl计，优选均包括：ddH2O 1.9μl、2×KOD FX buffer 10μl、2mM dNTPs 4μl、10μMPrimer-F 0.6μl、10μMPrimer-R 0.6μl、DMSO1μl、1U/μl KOD FX DNAPolymerase 0.4μl、100～200ng/20μl Template DNA1.5μl；程序优选均为94℃预变性2min；98℃变性10s，67℃退火30s，68℃延伸1kb/min，每个循环退火温度降低0.7℃，共15个循环；98℃变性10s，57℃退火30s，68℃延伸1kb/min，25个循环；68℃延伸10min。
本发明优选将测序正确后的上述扩增产物使用对应的限制性内切酶，依次将片段LR、A、RR连接至LScKO-2G载体，最终形成如图1所示的打靶载体。本发明对所述连接的方法并没有特殊限定，优选能够依次将LR片段连接至Not I和BamH I酶切位点之间，将A片段连接至Sal I和Bgl II酶切位点之间，将RR片段连接至Xho I和EcoR I酶切位点之间即可。本发明在得到所述打靶载体后，优选还包括进行酶切检测和质粒测序，其中酶切检测所用的限制性内切酶组合优选如表4所示。
表4酶切检测所用酶信息
组合序号 限制性内切酶 酶切片段(bp)
1 BglII+ScaI 3231+2430+1084
2 ScaI+EcoRI 3522+1809+1414
3 NcoI 3671+2086+988
本发明将上述sgRNA合成oligos，连接入pUC载体，得Cas9/sgRNA质粒。本发明将sgRNA退火后合成所述oligos，然后通过Gibson的方式连入pUC载体，连接产物转化后送样测序验证正确，即可得如图2所示的Cas9/sgRNA质粒。本发明在利用所述Cas9/sgRNA质粒进行后续显微注射前，优选还包括对sgRNA进行活性检测，综合sgRNA活性值和特异性进行选择，最终利用Guide#5和Guide#10进行后续的模型构建。
得Cas9/sgRNA质粒和所述特异性打靶载体后，本发明将所述Cas9/sgRNA质粒和所述特异性打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，出生后得F0代小鼠。在本发明中，由于受精卵注射方法得到F0代小鼠可能为嵌合体/杂合/纯合，所以在进行后续操作前，需要对F0代小鼠进行基因型鉴定，且鉴定得到的的基因型仅供参考。
得F0代小鼠后，本发明筛选F0代小鼠中基因重组正确的个体与野生型小鼠交配得到F1代小鼠。本发明优选根据如图3所示原则设计如表5所示的引物，并配置如上所述的PCR体系；PCR扩增的程序优选包括：94℃预变性2min；98℃变性10s，67℃退火30s，68℃延伸1kb/min，每个循环退火温度降低0.7℃，共15个循环；98℃变性10s，57℃退火30s，68℃延伸1kb/min，25个循环；68℃延伸10min。筛选阳性和疑似阳性的F0代小鼠进行后续的杂交。本发明对所述杂交的亲本并没有特殊限定。
表5F0代小鼠基因型检测引物
Figure BDA0003013220270000081
得F1代小鼠后，本发明筛选所述F1代小鼠中基因正确表达的杂合子小鼠与组织特异性的Cre小鼠交配，得所述Pax2条件性基因敲除小鼠模型。本发明优选依据图4所示引物设计原则设计表6所示引物，并配置如上所述的PCR体系；PCR扩增的程序优选包括：94℃预变性2min；98℃变性10s，67℃退火30s，68℃延伸1kb/min，每个循环退火温度降低0.7℃，共15个循环；98℃变性10s，57℃退火30s，68℃延伸1kb/min，25个循环；68℃延伸10min。
表6F1代小鼠基因型检测引物
Figure BDA0003013220270000082
Figure BDA0003013220270000091
本发明在得到具有上述特征产物的阳性F1代小鼠后，优选还包括对所述阳性F1代小鼠的鼠尾DNA进行Southern blot检测及测序，本发明对所述Southern blot检测的方法并没有特殊限定。
本发明优选按照图5所示方案进行所述交配，且所述组织特异性的Cre小鼠优选购自美国jackson实验室。本发明得到的所述Pax2条件性基因敲除小鼠，均为杂合子，基因型为(fl/+，Cre/+)，将其相互交配，可得到纯合子小鼠(fl/fl，Cre/+)。
本发明还提供了利用上述构建方法构建得到的Pax2条件性基因敲除小鼠模型在构建全身性基因敲除小鼠模型中的应用。本发明优选利用所述Pax2条件性基因敲除小鼠模型与Cre-deleter小鼠交配(图6)，从而实现目的基因全身性的敲除。
下面结合实施例对本发明提供的一种Pax2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1靶序列的测序确认
为了保证所设计Cas9/sgRNA的效率，首先对C57BL/6N鼠尾靶位点序列进行PCR扩增并测序验证(表7)，以保证sgRNA识别序列与C57BL/6N鼠尾DNA序列完全一致。通过对C57BL/6N鼠尾DNA进行靶位点序列PCR及测序，结果证明：C57BL/6N鼠尾靶序列与Genebank和Ensembl所给序列完全一致。
表7PCR扩增用引物
Figure BDA0003013220270000092
Figure BDA0003013220270000101
PCR扩增体系：2×KOD FX buffer 10μl、2mM dNTPs 4μl、10μMPrimer-F 0.6μl、10μM Primer-R 0.6μl、DMSO 1μl、1U/L KOD FX DNA Polymerase 0.4μl、100-200ng/20lTemplate DNA 1.5μl、ddH2O 1.9μl；
PCR扩增程序：94℃预变性2min；98℃变性10s，67℃退火30s(-0.7℃/循环)，68℃延伸1kg/min，15个循环；98℃变性10s，57℃退火30s，68℃延伸1kg/min，25个循环；68℃延伸10min；4℃保存。
2sgRNA的设计及Cas9/sgRNA质粒的构建
基于sgRNA的设计原则，在5'靶位点和3'靶位点区域分别设计如表1和表2所示的8条sgRNA，设计sgRNA序列合成oligos，通过Gibson的方式连入pUC载体，连接产物转化后送样测序验证正确(图2)，对各sgRNA的活性进行检测(UCA CRISPR-Cas9快速构建及活性检测试剂盒)，检测结果如表8和图7所示，综合选择EGE-YHN-011-A-sgRNA5(Guide#5)和EGE-YHN-011-A-sgRNA10(Guide#10)进行下一步实验。
表8各sgRNA的活性
Figure BDA0003013220270000102
Figure BDA0003013220270000111
3打靶载体的构建
使用表3中所示的引物分别扩增获得不同的PCR产物(片段LR、A、RR)，测序正确后使用对应的限制性内切酶，依次将片段LR、A、RR连接至LScKO-2G载体，最终形成如图1所示的打靶载体，并进行酶切检测(酶切组合如表4所示)和质粒测序。
4受精卵显微注射
Cas9/sgRNA、打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，注射后F0代小鼠出生情况如表9所示。
表9 F0代小鼠出生情况
Figure BDA0003013220270000112
5F0代小鼠基因型鉴定
根据表5所示引物对F0代小鼠进行基因型鉴定，结果如图8所示，E1N11-0013，E1N11-0032和E1N11-0042为F0代阳性小鼠，E1N11-0021和E1N11-0045为F0代疑似阳性小鼠。
6F1代小鼠基因型及Southernblot鉴定
选择上述部分F0代阳性小鼠与野生型小鼠交配得到F1代，交配结果如表10所示。
表10 F1代小鼠出生情况
Figure BDA0003013220270000121
7F1代小鼠基因型鉴定
根据表6所示引物进行PCR验证，结果如图9所示，1E1N11-0008，1E1N11-0009，1E1N11-0014，1E1N11-0016，1E1N11-0020，1E1N11-0022和1E1N11-0023为PCR阳性F1代小鼠。
8F1代PCR阳性小鼠Southern blot检测
提取上述PCR鉴定为阳性F1小鼠鼠尾DNA进行Southern blot检测及测序，检测结果表明：1E1N11-0008和1E1N11-0009(图10)均为正确重组，且没有随机插入。
9获得条件性基因敲除小鼠
将上述正确重组的F1代PCR阳性小鼠与组织特异性Cre小鼠(Ts-Cre)交配，获得floxed杂合子小鼠(Pax2条件性基因敲除小鼠，基因型为fl/+，Cre/+)，并将其相互交配，得到纯合子小鼠(fl/fl，Cre/+)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 山西省人民医院
<120> 一种Pax2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
acccgcctgc gccgcaggtt tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
cgccaaacct gcggcgcagg cgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
ccgcgccaaa cctgcggcgc agg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
tagaaacccg cctgcgccgc agg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
ctcaagccgc gccaaacctg cgg 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
agttaggcag cgaaggtgaa cgg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
aaggggaaat aatgttaacg ggg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
gaaggtgaac gggatgtgtt tgg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
tctacattga ttagctgggg ggg 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
ggaaggctgg ttttccacgt ggg 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
ggggtcagct cacccagcat ggg 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
ggaagactac aggagggtcc agg 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
ccataggaac tctgtgcttc ggg 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
agcagagaag gacccatgct ggg 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
ccagctaatc aatgtagatg ggg 23
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
caggagggtc caggttccat agg 23
<210> 17
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 17
atcggcggcc gcaaggtggt cgaaggaagg gagagag 37
<210> 18
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
gctaggatcc agtactgttt ggcgcggctt gagtttcaca a 41
<210> 19
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 19
atgcgtcgac ctgcggcgca ggcgggtttc tagtc 35
<210> 20
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 20
actgagatct cgtgggaagc agagaaggac ccatg 35
<210> 21
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 21
atcgctcgag tggaaaacca gccttccact cccag 35
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 22
atgcgaattc agtctcccgc acacaactgt caaag 35
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 23
ggtaaaggaa acccaaacgc gagact 26
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 24
cgtgctagat cgactgctag agtgac 26
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 25
gacgcctaga ttgtgctact ctcagct 27
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 26
tgttagggca gaaagaggca ccatc 25
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 27
gctgaggaga aaggaaggag aaatc 25
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 28
gggtttcgga gggtgtataa ttagc 25
<210> 29
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 29
gcatcaagct tggtaccgat gctagccttg tgcagcatgg aaggc 45
<210> 30
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 30
acttaatcgt ggaggatgat cggctagctg taagctcgca caagc 45
<210> 31
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 31
gcatcaagct tggtaccgat cgagaagggc gttcaagtaa tggct 45
<210> 32
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 32
acttaatcgt ggaggatgat ttgatgctgc cagtctcgta gtacc 45

Claims (7)

1.一种Pax2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以小鼠基因组DNA为模板，分别克隆小鼠Pax2基因的LR、A和RR片段，依次将所述LR、A和RR片段连接至LScKO-2G载体，得特异性打靶载体；克隆所述LR片段的引物包括Pax2-LR-F和Pax2-LR-R，其中所述Pax2-LR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述Pax2-LR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；克隆所述A片段的引物包括Pax2-A-F和Pax2-A-R，所述Pax2-A-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，所述Pax2-A-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；克隆所述RR片段的引物包括Pax2-RR-F和Pax2-RR-R，所述Pax2-RR-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.21所述，所述Pax2-RR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；
(2)将靶向小鼠Pax2基因的sgRNA合成oligos，连接入pUC载体，得Cas9/sgRNA质粒；所述sgRNA的5’Guide序列如SEQ IDNO.5所示，且所述sgRNA的3’Guide序列如SEQ ID NO.10所示；
(3)将Cas9/sgRNA质粒和所述特异性打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，出生后得F0代小鼠；
(4)筛选F0代小鼠中基因重组正确的个体与野生型小鼠交配得到F1代小鼠；
(5)筛选所述F1代小鼠中基因正确表达的杂合子小鼠与组织特异性的Cre小鼠交配，得所述Pax2条件性基因敲除小鼠模型；
步骤(1)和(2)之间不存在时间上的先后关系。
2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(1)中扩增所述LR、A和RR片段的PCR程序，均为：94℃预变性2min；98℃变性10s，67℃退火30s，68℃延伸1kb/min，每个循环退火温度降低0.7℃，共15个循环；98℃变性10s，57℃退火30s，68℃延伸1kb/min，25个循环；68℃延伸10min。
3.权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(1)所述连接包括依次将LR片段连接至NotI和BamHI酶切位点之间，将A片段连接至SalI和BglII酶切位点之间，将RR片段连接至XhoI和EcoRI酶切位点之间。
4.权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(4)所述筛选包括利用两对引物进行PCR，其中一对包括Pax2-L-GT-F和cKO-5'-DO-F；另一对包括cKO-3'-DO-R和Pax2-R-GT-R；
所述Pax2-L-GT-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，所述cKO-5'-DO-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；
所述cKO-3'-DO-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，所述Pax2-R-GT-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。
5.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(5)所述筛选包括利用两对引物进行PCR，其中一对引物包括Pax2-L-GT-F2和cKO-5'-DO-F；另一对引物包括cKO-3'-DO-R和Pax2-R-GT-R1；所述Pax2-L-GT-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示，所述Pax2-R-GT-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。
6.根据权利要求4或5所述构建方法，其特征在于，步骤(4)和步骤(5)所述筛选时，PCR扩增的程序均包括：94℃预变性2min；98℃变性10s，67℃退火30s，68℃延伸1kb/min，每个循环退火温度降低0.7℃，共15个循环；98℃变性10s，57℃退火30s，68℃延伸1kb/min，25个循环；68℃延伸10min。
7.利用权利要求1或6任一项所述构建方法构建得到的Pax2条件性基因敲除小鼠模型在构建全身性基因敲除小鼠模型中的应用。
CN202110381604.5A 2021-04-09 2021-04-09 一种Pax2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法 Active CN112980846B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110381604.5A CN112980846B (zh) 2021-04-09 2021-04-09 一种Pax2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110381604.5A CN112980846B (zh) 2021-04-09 2021-04-09 一种Pax2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112980846A CN112980846A (zh) 2021-06-18
CN112980846B true CN112980846B (zh) 2023-05-02

Family

ID=76339618

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110381604.5A Active CN112980846B (zh) 2021-04-09 2021-04-09 一种Pax2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112980846B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114150023B (zh) * 2021-09-15 2023-07-04 中南大学湘雅医院 内皮细胞特异性pfn1基因敲除小鼠模型的构建方法
CN114410630B (zh) * 2022-03-21 2023-04-25 云南大学 一种tbc1d8b基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用
CN114592011B (zh) * 2022-05-10 2022-08-05 广东药康生物科技有限公司 一种ptdss2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法
CN117568398B (zh) * 2023-09-19 2024-06-04 新乡医学院 一种PGC-1α基因敲除小鼠构建心律失常动物模型的方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110438160A (zh) * 2019-07-18 2019-11-12 浙江大学 一种Cd2ap基因敲除动物的构建方法及应用
CN111748582A (zh) * 2020-07-06 2020-10-09 青岛大学附属医院 一种条件敲除Foxp3基因鼠的构建方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110438160A (zh) * 2019-07-18 2019-11-12 浙江大学 一种Cd2ap基因敲除动物的构建方法及应用
CN111748582A (zh) * 2020-07-06 2020-10-09 青岛大学附属医院 一种条件敲除Foxp3基因鼠的构建方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《Generation of Pax2‐Cre mice by modification of a Pax2 bacterial artificial chromosome》;T Ohyama等;《Genesis》;20041231;第38卷;第195-199页 *
《Increased repetitive self-grooming occurs in Pax2 mutant mice generated using CRISPR/Cas9》;Hongen Wei等;《Behavioural Brain Research》;20200901;第393卷;第2页右栏 *
Hongen Wei等.《Increased repetitive self-grooming occurs in Pax2 mutant mice generated using CRISPR/Cas9》.《Behavioural Brain Research》.2020,第393卷第1-7页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112980846A (zh) 2021-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112980846B (zh) 一种Pax2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法
Xu et al. Generation of targeted mutant rice using a CRISPR‐Cpf1 system
EP3476865B1 (en) Method for constructing pd-1 gene-modified humanized animal model and use thereof
Ye et al. Robust CRISPR/Cas9 mediated genome editing and its application in manipulating plant height in the first generation of hexaploid Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro)
CN110551759B (zh) 一种提高转基因细胞重组效率的组合物及方法
Nishimura et al. Isolation of a rice regeneration quantitative trait loci gene and its application to transformation systems
CN106282231B (zh) 粘多糖贮积症ii型动物模型的构建方法及应用
WO2006025879A3 (en) Novel polynucleotides related to oligonucleotide arrays to monitor gene expression
CN110438160B (zh) 一种Cd2ap基因敲除动物的构建方法及应用
WO2020077930A1 (zh) 一种应用Cas9技术制备CKO/KI动物模型的方法
CN111748582A (zh) 一种条件敲除Foxp3基因鼠的构建方法
CN110541002A (zh) 一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法
Kibe et al. The DNMT3A PWWP domain is essential for the normal DNA methylation landscape in mouse somatic cells and oocytes
CN110592135A (zh) 一种CRISPR/Cas9编辑水稻香味基因Badh2的方法
CN111206054B (zh) 一种利用CRISPR-Cas9条件性敲除肝脏HO-1基因动物模型的构建方法
CN113801893A (zh) 一种Psme3条件性基因敲除小鼠模型的构建方法及其应用
CN113897369A (zh) KRT10定点基因敲入P2A-CrePR1-T2A-tdTomato小鼠模型的构建及应用
CN112481301B (zh) Stap2基因点突变敲入模式小鼠的打靶载体和构建方法
Wang et al. Engineering bacterial blight-resistant plants through CRISPR/Cas9-targeted editing of the MeSWEET10a promoter in cassava
Dalla Costa et al. Elaboration of a reliable strategy based on real-time PCR to characterize genetically modified plantlets and to evaluate the efficiency of a marker gene removal in grape (Vitis spp.)
CN112063654B (zh) 一种点突变血小板无力症小鼠模型的构建方法
CN109694885B (zh) 基于CRISPR/Cas9技术制备PI3Kγ全身敲除模式小鼠方法及其应用和试剂盒
CN113564204B (zh) 细胞色素p450酶人源化大鼠模型及其构建方法和应用
CN110157704B (zh) 一种抗小鼠肝炎病毒的小鼠及其制备方法
CN114410630B (zh) 一种tbc1d8b基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant