CN114410630B - 一种tbc1d8b基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用，属于生命科学和生物技术领域。TBC1D8B基因的特异性靶位点sgRNA，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的sgRNA3和核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示的sgRNA14。本发明将合成的sgRNA和Cas9 mRNA以及打靶载体导入小鼠受精卵中，培育，筛选及交配，获得TBC1D8B基因敲除的小鼠动物模型。

Description

一种TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用
技术领域
本发明属于生命科学和生物技术领域，具体涉及一种TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用。
背景技术
Homo sapiens TBC1 domain family,member 8B(英文全称，TBC1D8B)基因定 位于人的Xq22.3，编码一个具有TBC(Tre-2/Bub2/CDC16)结构域的蛋白质。一些 具有此结构域的哺乳动物蛋白通过与特定Rab蛋白结合并影响其GTPase活性而发挥 功能。小鼠TBC1D8B基因在X染色体正链上，全长69.3kb，NCBI ID：245638。该 基因在人类基因组中有两个转录本，在小鼠基因组中有一个转录本。
TBC1D8B隶属的TBC结构域家族蛋白在细胞生化过程中具有重要的作用，如承 担真核生物中包括内吞作用的囊泡运输功能，参与了肾小球过滤、蛋白质运输等生理 过程，除了作为GAP负调控Rab，还具有钙离子调控功能。近年来的一些研究发现， TBC1D8B基因在哺乳动物中高度保守，可显著促进细胞增殖和DNA合成，加速细胞 周期进程，提高细胞迁移和浸润能力，具有原癌基因的特征，有可能是一个新的原癌 基因。有研究证明，TBC1D8B的缺失或异常与肾病综合征的发生和发展有关。但目 前并没有相关的小鼠动物模型可以对其进行具体的研究。但是目前关于TBC1D8B的 作用机理研究并不深刻，且也没有相关的动物模型对其进行具体的研究。
CRISPR/Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术， CRISPR/Cas9基因编辑技术是继锌指核酸酶(ZFN)技术、TALEN基因编辑技术之后又 一重大突破。该技术通过RNA指导Cas9核酸酶对靶向基因进行特定DNA编辑。 CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率更高，Cas9系统的载体构建与使用也更加便捷，并 已应用在各物种中，是目前使用广泛的基因编辑技术。通过导向RNA(sgRNA)介导核 酸内切酶Cas9蛋白进行目标DNA序列识别并造成DNA双链断裂，促进以同源重组 或非同源末端连接方式修复受损DNA，从而对目标位点实现基因的定点敲入、以及 基因修正等多种修饰。使用CRISPR/Cas9技术进行基因敲入需要两个关键因素，首先 是有效的sgRNA引导序列，再就是Cas9蛋白的存在。然而CRISPR技术在营造全身 性基因敲除小鼠时存在一些无法忽视的缺陷。全身性基因敲除小鼠有时回因为该基因 对胚胎发育的影响而无法正常分娩；或因出生后严重的生理缺陷而过早死亡；或者因 为不能产生后代而无法获取纯合子。此外，靶基因的sgRNA的设计方法虽然为本领域常规技术，但设计的针对不同位点的sgRNA存在打靶效率的差异，这无疑限制了 TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型的构建。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于打靶TBC1D8B基因的sgRNA，具有较 高的打靶效率。
本发明的目的在于提供一种TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型的构建方法，成功构建了TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型，为后续筛查防治肾病综合征和/或研究肾病综 合征发生发展病程提供动物材料。
本发明提供了一种TBC1D8B基因的特异性靶位点sgRNA，包括sgRNA3和 sgRNA14；
所述sgRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述sgRNA14的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
本发明提供了一种TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型的构建方法，包括以下步骤：
1)合成有活性的所述sgRNA和Cas9mRNA；
2)构建TBC1D8B基因敲除的打靶载体；
3)将步骤1)中所述sgRNA和Cas9mRNA以及步骤2)中所述打靶载体导入小 鼠受精卵中，培育并传代，获得TBC1D8B基因敲除的小鼠动物模型；
步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制。
优选的，步骤3)中所述sgRNA、Cas9mRNA和打靶载体的拷贝数比为(1～1.2)： (2～3)：(1～1.2)；
所述sgRNA中sgRNA3和sgRNA14的拷贝数比为1：(1～1.2)。
优选的，步骤2)中构建TBC1D8B基因敲除的打靶载体的方法，包括以下步骤：
将TBC1D8B基因上游同源臂片段LR、TBC1D8B基因下游同源臂片段RR和点 突变的序列片段A通过克隆到表达载体上，构建获得打靶载体。
优选的，TBC1D8B基因上游同源臂片段LR的扩增引物包括 EGE-YMX-004-A-LR-F和EGE-YMX-004-A-LR-R；
所述EGE-YMX-004-A-LR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；
所述EGE-YMX-004-A-LR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
优选的，TBC1D8B基因下游同源臂片段RR包括EGE-YMX-004-A-RR-F和 EGE-YMX-004-A-RR-R；
所述EGE-YMX-004-A-RR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；
所述EGE-YMX-004-A-RR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示。
优选的，点突变的序列片段A的扩增引物包括EGE-YMX-004-A-A-F和 EGE-YMX-004-A-A-R；
所述EGE-YMX-004-A-A-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；
所述EGE-YMX-004-A-A-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。
优选的，所述表达载体包括pCS-4G载体。
优选的，所述传代是阳性F0代小鼠与野生型小鼠交配，获得的F1代阳性小鼠相 互杂交，获得的F2阳性小鼠与组织特异性Cre小鼠交配，筛选获得纯合子小鼠。
本发明提供了所述构建方法获得的TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型在制备筛查防治肾病综合征和/或研究肾病综合征发生发展病程的实验材料中的应用。
本发明提供了TBC1D8B基因的特异性靶位点sgRNA，包括sgRNA3和sgRNA14； 所述sgRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述sgRNA14的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。本发明在TBC1D8B基因的Exon3的上游和Exon3的下游非保守序列 分别设计了8条sgRNA，通过验证sgRNA的活性，结果表明sgRNA3和sgRNA14 的打靶活性最高，因此选择sgRNA3和sgRNA14作为构建TBC1D8B基因敲除小鼠动 物模型的导向RNA。
本发明提供了一种TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型的构建方法，利用 CRISPR/Cas9技术通过体外转录的方式，将获得的Cas9/sgRNA和所述特异性打靶载 体导入小鼠受精卵中，经培养和传代，成功获得TBC1D8B条件性基因敲除小鼠模型， 构建出小鼠模型后可与不同的cre工具鼠灵活搭配运用。
对小鼠进行条件性目的基因敲除需要Floxed小鼠(即目的基因被LoxP序列锚定的小 鼠，即本发明中制备的小鼠)和Cre鼠(即工具鼠)两种小鼠。Cre小鼠即Cre重组 酶在小鼠体内特定组织或细胞表达的小鼠，其Cre基因的表达受控于一个特异性启动 子，该启动子决定了Cre表达的组织或细胞类型。如果同时将Cre基因置于配体或药 物可诱导的启动子控制下，就可同时实现在时间和空间水平上对Cre表达的精确调控。 Floxed小鼠在和Cre工具鼠结合后，产生的后代会通过调控Cre表达，完成特定时间 或者特定组织内的目的基因的敲除。可见，本发明为研究目的基因在不同组织器官， 甚至不同细胞类型中的作用机制，为国内外提供有效的模型动物。
附图说明
图1为本发明提供的小鼠模型构建方法流程图；
图2为TBC1D8B基因敲除设计策略示意图；
图3A为对体外转录Cas9、sgRNA1～sgRNA8进行电泳后的活性检测结果；
图3B为对体外转录Cas9、sgRNA9～sgRNA16进行电泳后的活性检测结果；
图4为sgRNA的RNA制备的电泳结果图，成功得到可以进行显微注射的Cas9 mRNA、有活性的sgRNA6和sgRNA14；
图5为构建的打靶载体的电泳结果图；结果显示同源臂片段LR、同源臂片段RR 以及引入点突变的序列片段A构建成功。
图6为打靶载体的电泳图；确认打靶载体构建完成，同源臂片段LA、同源臂片 段RR和点突变的序列片段A已成功克隆组装到pCS-4G载体上；
图7为F0代小鼠基因型鉴定引物设计原则图；两对引物的前端和后端分别设计 在TBC1D8B基因的内含子2和内含子5非保守区中，通过扩增可以获取编辑后的完 整序列；
图8A为引物为EGE-YMX-004-A-L-GT-F/Cko-3'-do-R的鉴定电泳图；图8B为 引物为Cko-5'-do-F/EGE-YMX-004-A-L-GT-R的鉴定电泳图；
图9为对潜在脱靶位点进行PCR扩增的结果；
图10A为引物为EGE-YMX-004-A-L-GT-F/Cko-3'-do-R的鉴定电泳图；图10B 为引物为Cko-5'-do-F/EGE-YMX-004-A-L-GT-R的鉴定电泳图；
图11为F2代小鼠纯合子基因型鉴定引物设计原则图；
图12A为引物为EGE-YMX-004-A-5’loxP-F/EGE-YMX-004-A-5’loxP-R的鉴定电 泳图；
图12B为引物为EGE-YMX-004-A-3’loxP-F/EGE-YMX-004-A-3’loxP-R的鉴定电 泳图。
具体实施方式
本发明提供了一种TBC1D8B基因的特异性靶位点sgRNA，包括sgRNA3和 sgRNA14；所述sgRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述sgRNA14的核苷 酸序列如SEQ ID NO:14所示。
在本发明中，sgRNA能够敲除TBC1D8B基因的Exon3-5，并且本发明提供的 sgRNA相对于常规方法设计的其他sgRNA具有明显的高活性。
本发明提供了一种TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型的构建方法，见图1，具体 包括以下步骤：
1)合成有活性的所述sgRNA和Cas9mRNA；
2)构建TBC1D8B基因敲除的打靶载体；
3)将步骤1)中所述sgRNA和Cas9mRNA以及步骤2)中所述打靶载体导入小 鼠受精卵中，培育并传代，获得TBC1D8B基因敲除的小鼠动物模型；
步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制。
本发明合成有活性的所述sgRNA和Cas9mRNA。
在本发明中，合成有活性的所述sgRNA和Cas9mRNA的方法优选采用MEGAshortscript T7 kit(LifeTechnologies)体外转录试剂盒完成。合成后，还优选包括纯化。所述纯化优选通过MEGAclear kit试剂盒进行纯化回收。
本发明构建TBC1D8B基因敲除的打靶载体。
在本发明中，构建TBC1D8B基因敲除的打靶载体的方法，优选包括以下步骤：
将TBC1D8B基因上游同源臂片段LR、TBC1D8B基因下游同源臂片段RR和点 突变的序列片段A通过克隆到表达载体上，构建获得打靶载体。
在本发明中，TBC1D8B基因上游同源臂片段LR的扩增引物优选包括 EGE-YMX-004-A-LR-F和EGE-YMX-004-A-LR-R；所述EGE-YMX-004-A-LR-F的核 苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；所述EGE-YMX-004-A-LR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。TBC1D8B基因下游同源臂片段RR优选包括EGE-YMX-004-A-RR-F和 EGE-YMX-004-A-RR-R；所述EGE-YMX-004-A-RR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:21 所示；所述EGE-YMX-004-A-RR-R的核苷酸序列如SEQ IDNO:22所示。点突变的序 列片段A的扩增引物优选包括EGE-YMX-004-A-A-F和EGE-YMX-004-A-A-R；所述 EGE-YMX-004-A-A-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；所述 EGE-YMX-004-A-A-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。扩增的反应程序优选如 下：
Figure BDA0003465714970000041
所述扩增的反应体系优选如下：ddH2O1.9μl、2×KOD FX buffer 10μl、2mM dNTPs4μl、10μM正向引物0.6μl、10μM反向引物0.6μl、DMSO 1μl、1U/μl KOD FX DNAPolymerase0.4μl、100～200ng/20μl模板1.5μl。
在本发明中，所述表达载体优选包括pCS-4G载体。所述pCS-4G载体的克隆位 点优选包括GAATTC/GGATCC(EcoRI酶切位点)。所述克隆后，优选对载体进行阳 性质粒进行筛选。本发明对所述阳性质粒筛选的方法没有特殊限制，采用本领域所熟 知的阳性质粒筛选方法即可。
得到sgRNA和Cas9mRNA以及所述打靶载体后，本发明将所述sgRNA和Cas9 mRNA以及所述打靶载体导入小鼠受精卵中，培育并传代，获得TBC1D8B基因敲除 的小鼠动物模型。
在本发明中，所述导入时，所述sgRNA、Cas9mRNA和打靶载体的拷贝数比为 1～1.2：2～3：1～1.2；更优选为1：2：1。本发明对所述导入的方法没有特殊限制，采 用本领域所熟知的导入方法即可，例如显微注射。显微注射后存活的受精卵经培养移 植至假孕母鼠体内，筛选，得到阳性F0代小鼠。
在本发明中，获得阳性F0代小鼠后，优选对阳性F0代小鼠进行脱靶检测。所述 脱靶检测的方法优选对潜在的脱靶位点进行PCR扩增。检测结果表明不存在脱靶现 象。
在本发明中，所述传代优选是阳性F0代小鼠与野生型小鼠交配，获得F1代阳性 小鼠与组织特异性Cre小鼠交配，得到的杂合子小鼠相互交配，筛选获得纯合子小鼠。 所述F1代阳性小鼠的鉴定方法优选为PCR扩增，根据扩增产物是否存在目标片段筛 选得到F1代阳性小鼠。所述PCR扩增用引物包括EGE-YMX-004-A-L-GT-F(SEQ ID NO：23)/Cko-3'-do-R(SEQ ID NO：24)和Cko-5'-do-F(SEQ ID NO：25) /EGE-YMX-004-A-L-GT-R(SEQ ID NO：26)。所述PCR扩增的反应程序优选如下： 94℃2min；98℃ 10sec，67℃30sec(-7℃/cycle)；68℃1kb/min，15个循环； 98℃ 10sec，57℃ 30sec，68℃ 1kb/min，25个循环。所述纯合子小鼠的筛选方法 优选采用PCR扩增法进行。所述PCR扩增时引物优选包括EGE-YMX-004-A-5’loxP-F (SEQ ID NO：27)/EGE-YMX-004-A-5’loxP-R(SEQ ID NO：28)和 EGE-YMX-004-A-3’loxP-F(SEQ ID NO：29)/EGE-YMX-004-A-3’loxP-R(SEQ ID NO： 30)。
本发明提供了所述构建方法获得的TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型在制备筛查防治肾病综合征和/或研究肾病综合征发生发展病程的实验材料中的应用。
本领域公知，肾病综合征的发生发展与TBC1D8B基因突变有关，例如TBC1D8B 基因突变导致X连锁肾病综合征(文献来源：Dorval G,etal.,Am J Hum Genet, 2019,104(2):348-355.)。因此，通过构建TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型作为研究 肾病综合征的材料，为揭示疾病的发病机制以及治疗策略打下基础。
下面结合实施例对本发明提供的一种TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
基于CRISPR/Cas9基因敲除技术建立TBC1D8B基因敲入小鼠模型的方法，具 体步骤如下：
1.敲除的TBC1D8B基因的基本信息如下
1)敲除基因名称(Gene ID号)：TBC1D8B(245638)；
2)敲除基因名称(Ensemble)：TBC1D8B(ENSMUSG00000042473)；
3)敲除针对的转录本(Ensemble号)：Tbc1d8b-201(ENSMUST00000096313.4)；
4)敲除针对的exon：exon3～5；
野生型TBC1D8B基因核苷酸序列如(SEQ ID NO：31)所示；
野生型TBC1D8B基因氨基酸序列如(SEQ ID NO：32)所示。
2.Cas9/sgRNA的设计与构建：
TBC1D8B基因敲除设计策略示意图，如图2所示。
1)打靶具体策略如下：
TBC1D8B基因的Exon3-5两端在LoxP位点(LoxP为locus of X(cross)-over in P1的简称，序列来源于P1噬菌体，由两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序 列共同组成)插入Flox(指在基因序列里插入的位点，当与cre小鼠杂交后激活flox 位点从而敲掉两个flox之间的那一段基因)。sgRNA设计在exon3上游和exon5下游 的非保守序列中，5'端和3'端的同源臂分别为约为1.3kb和1.3kb。
具体在5'靶位点和3'靶位点区域分别设计了8条sgRNA，如下表1和表2所示。
表1 5'靶位点区域设计的sgRNA
表2 3'靶位点区域设计的sgRNA
Figure BDA0003465714970000051
3'靶位点区域 序列(5'→3')
Figure BDA0003465714970000052
Figure BDA0003465714970000061
2)按照上述表1和表2中设计的sgRNA序列合成oligos，通过Gibson的方式连 入pCS-4G载体，连接产物转化后送样测序验证其正确性。
对表1和表2设计的sgRNA进行活性检测，采用UCA活性检测的方法，具体采 用UCACRISPR/Cas9快速构建及活性检测试剂盒进行检测，操作参见说明书记载。 检测原理：选取sgRNA的报告基因质粒pUCA(luc)，Luc基因内部含有终止密码 子和CRISPR/Cas9的靶位点序列。终止密码子导致luc的翻译提前终止。核酸酶对靶 位点的切割会引发修复机制，从而重组形成完成的荧光素酶编码序列，从而表达有功 能的荧光素酶。荧光素酶的活性与sgRNA在CRISPR/Cas9的活性成正相关。
UCA活性检测结果如图3A和图3B所示。综合sgRNA的特异性、活性和基因 组所在的位置最终选取sgRNA3和sgRNA14作为构建TBC1D8B基因敲除小鼠动物 模型的sgRNA。
2)将sgRNA3、sgRNA14和Cas9质粒通过MEGAshortscript T7 kit(LifeTechnologies)体外转录试剂盒进行体外转录，得到进行显微注射的Cas9 mRNA、有活性的sgRNA3和sgRNA14，并通过MEGAclearkit试剂盒进行纯化回收 RNA电泳图如图4所示。
3.打靶载体的构建
1)设计引物构建打靶载体：
根据图1的TBC1D8B基因敲除设计策略示意图，设计构建同源臂LR片段的引 物、构建点突变序列片段A的引物和构建同源臂RR片段的引物，引物设计如下表3 所示：
表3构建打靶载体用引物
Figure BDA0003465714970000062
Figure BDA0003465714970000071
注：小写字母表示保护碱基。
2)基于表3中设计的引物，按照本领域常规方法，构建同源臂片段LR、同源臂 片段RR以及引入点突变的序列片段A；电泳图如图5所示。
反应体系：ddH2O 1.9μl、2×KOD FX buffer 10μl、2mM dNTPs 4μl、10μM正向引物0.6μl、10μM反向引物0.6μl、DMSO 1μl、1U/μlKOD FX DNAPolymerase 0.4μl、 100～200ng/20μl模板1.5μl。
反应程序如下：
Figure BDA0003465714970000072
3)将同源臂片段LA、同源臂片段RR和点突变的序列片段A通过组装到pCS-4G 载体上，构建获得打靶载体，具体克隆方法如下：连接的方法并没有特殊限定，优选 能够依次将LR片段连接至EcoRI和XhoI酶切位点之间，将A片段连接至ClaI和SalI 酶切位点之间，将RR片段连接至MluI和NheI酶切位点之间即可
酶切鉴定和测序，确认打靶载体构建完成，其中酶切方法如下：
Figure BDA0003465714970000073
打靶载体的电泳图如图6所示。
4.TBC1D8B基因敲除的小鼠动物模型构建过程
将上述体外转录的有活性的sgRNA3、sgRNA14、Cas9mRNA和构建的打靶载体 注入剂量显微注射入小鼠受精卵中(参考现有技术：[1]Hicham Bouabe and KlausOkkenhaug.Gene Targeting in Mice:a Review.Methods Mol Biol.Author manuscript；available in PMC 2015 Aug5.[2]Andrew J.Modzelewski,Sean Chen,et al.Efficientmouse genome engineering by CRISPR-EZ technology.Nature Protocols.2018 Jun；13(6): 1253–1274.
1)取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即为F0代小鼠。
2)提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增并将产物进行测序鉴定，获得阳性F0代 小鼠或疑似阳性F0小鼠；由于胚胎早期卵裂速度很快，因此得到的F0小鼠为嵌合体。 故以F0小鼠鼠尾DNA进行鉴定得到的F0基因型仅供参考，不能代表其一定为可遗 传的基因突变型，可遗传的基因型需待F1小鼠基因型鉴定后确定。
F0代小鼠基因型鉴定具体过程如下：
①鉴定引物设计
引物设计原则如图7所示。
②引物信息如下表4所示：
表4 F0代小鼠基因型鉴定用引物
Figure BDA0003465714970000081
③PCR条件
PCR扩增条件如下表5所示。
表5 F0代小鼠基因型鉴定的反应条件
Figure BDA0003465714970000082
④F0代小鼠鼠尾基因型鉴定，鉴定结果如下：
引物为EGE-YMX-004-A-L-GT-F/Cko-3'-do-R的鉴定电泳图如 图8A所示；引物为Cko-5'-do-F/EGE-YMX-004-A-L-GT-R的鉴定电 泳图如图8B所示。
由图8A和图8B可以看出：通过PCR产物和测序表明，E7X4-0005和E7X4-0034 为突变的阳性F0代flox小鼠(即目的基因敲除片段两端成功加入LoxP位点的小鼠)。
3)脱靶检测
为了验证F0代TBC1D8B小鼠是否存在脱靶现象，首先在CCtop (https://cctop.cos.uni-heidelberg.de:8043/index.html)网站中进行脱靶位点的预测，然 后设计脱靶位点对应的PCR引物，对潜在的脱靶位点进行PCR扩增。
PCR引物序列如下表6所示。
表6脱靶检测用PCR引物序列
Figure BDA0003465714970000083
Figure BDA0003465714970000091
根据脱靶位点对应的PCR引物，对潜在的脱靶位点进行PCR扩增。扩增得到的 条带与野生型参考基因组预测的长度一致，测序结果表明潜在的脱靶位点序列并没有 发生改变。检测结果见图9。通过PCR产物鉴定及测序结果表明，不存在脱靶现象。
4)将上述阳性F0代阳性小鼠与野生型异性小鼠交配获得F1代小鼠；提取F1代 小鼠尾部DNA，PCR扩增并将产物进行测序鉴定，获得具有稳定基因型的阳性F1代 小鼠。
F1代小鼠基因型鉴定具体过程如下：
鉴定引物设计及PCR条件同F0代小鼠基因型鉴定过程。鉴定结果如下：
引物为EGE-YMX-004-A-L-GT-F/Cko-3'-do-R的鉴定电泳图如 图10A所示；引物为Cko-5'-do-F/EGE-YMX-004-A-L-GT-R的鉴定 电泳图如图10B所示。
由图10A和图10B可以看出：通过PCR鉴定及测序结果表明1E7X4-0024 1E7X4-00261E7X4-0027突变的阳性F1代小鼠。
5)将阳性F1代小鼠杂交获得F2代小鼠，对F2代小鼠进行纯合子基因型的鉴定， 获得F2代纯合子基因型的小鼠，即为TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型。
纯合子基因型鉴定具体过程如下：
①鉴定引物设计：
引物设计原则如图11所示，两对引物分别设计在两个loxP位点的两端，通过扩 增可以获取插入loxP位点后的序列；
②引物信息如下表7所示。
表7纯合子基因型鉴定用引物
Figure BDA0003465714970000101
③PCR条件：
PCR聚合酶：2×Taq Plus Master Mix(Dye Plus)；
PCR扩增条件如下表8所示。
表8纯合子基因型鉴定的PCR扩增条件
Figure BDA0003465714970000102
④F2代纯合子小鼠基因型鉴定结果如下：
引物为EGE-YMX-004-A-5’loxP-F/EGE-YMX-004-A-5’loxP-R的鉴定电泳图如图12A所示。引物为EGE-YMX-004-A-3’loxP-F/EGE-YMX-004-A- 3’loxP-R的鉴定电泳图为图12B所述。
由图12A和图12B可以看出：通过PCR鉴定及测序结果表明2E7X4-0002， 2E7X4-0011，2E7X4-0012和2E7X4-0015为阳性的F2代flox小鼠。
实施例2：
将实施例1获得的正确重组的F1代PCR阳性小鼠与组织特异性Cre小鼠(Ts-Cre)交配，获得floxed杂合子小鼠(TBC1D8B条件性基因敲除小鼠，基因型为fl/+，Cre/+)， 并将其相互交配，得到纯合子小鼠(fl/fl，Cre/+)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润 饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 云南大学
<120> 一种TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用
<160> 50
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tattctgtct aaattcttcg tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtggtctga ttgttaccaa agg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caaatgagga ctctttacta tgg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatactagta gttgtatttg agg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tatggtttac tattgccgcg agg 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ataatttcca aacctaactt cgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caggcctacc tgctgagata tgg 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
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<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gcagagagtt taatgtgttt agg 23
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atcggaattc atgggtggct ttaaaagaaa ttcgc 35
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
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<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
attcatcgat taaagagtcc tcatttgcac agc 33
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atcggtcgac gggtggtacc atatctcagc aggt 34
<210> 21
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atcgacgcgt agatctgata tcctaatggg cttgaatctc tcctc 45
<210> 22
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atcggctagc tggaatatga agtgaacttt taaatcgc 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
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<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cgtgctagat cgactgctag agtgac 26
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aggctctccc tgaagaagac tgact 25
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cagctaacac tgatgcagta ggtct 25
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cccgtgcttc tatggtgagg 20
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<211> 20
<212> DNA
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acttggggta gggtctcaca 20
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<211> 20
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 46
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<211> 20
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<400> 47
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<400> 48
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<210> 49
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ttcatccgat gctttgccca 20

Claims (4)

1.一种TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)合成有活性的TBC1D8B基因的特异性靶位点sgRNA和Cas9mRNA；
所述sgRNA包括sgRNA3和sgRNA14；所述sgRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述sgRNA14的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；
2)构建TBC1D8B基因敲除的打靶载体；
3)将步骤1)中所述sgRNA和Cas9mRNA以及步骤2)中所述打靶载体导入小鼠受精卵中，培育并传代，获得TBC1D8B基因敲除的小鼠动物模型；
步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制；
步骤3)中所述sgRNA、Cas9mRNA和打靶载体的拷贝数比为(1～1.2)：(2～3)：(1～1.2)；所述sgRNA中sgRNA3和sgRNA14的拷贝数比为1：(1～1.2)；
步骤2)中构建TBC1D8B基因敲除的打靶载体的方法，包括以下步骤：将TBC1D8B基因上游同源臂片段LR、TBC1D8B基因下游同源臂片段RR和点突变的序列片段A通过克隆到表达载体上，构建获得打靶载体；
TBC1D8B基因上游同源臂片段LR的扩增引物包括EGE-YMX-004-A-LR-F和EGE-YMX-004-A-LR-R；所述EGE-YMX-004-A-LR-F的核苷酸序列如SEQIDNO:17所示；所述EGE-YMX-004-A-LR-R的核苷酸序列如SEQIDNO:18所示；
TBC1D8B基因下游同源臂片段RR包括EGE-YMX-004-A-RR-F和EGE-YMX-004-A-RR-R；所述EGE-YMX-004-A-RR-F的核苷酸序列如SEQIDNO:21所示；所述EGE-YMX-004-A-RR-R的核苷酸序列如SEQIDNO:22所示；
点突变的序列片段A的扩增引物包括EGE-YMX-004-A-A-F和EGE-YMX-004-A-A-R；所述EGE-YMX-004-A-A-F的核苷酸序列如SEQIDNO:19所示；所述EGE-YMX-004-A-A-R的核苷酸序列如SEQIDNO:20所示。
2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述表达载体包括pCS-4G载体。
3.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述传代是所述传代是阳性F0代小鼠与野生型小鼠交配，获得的F1代阳性小鼠相互杂交，获得的F2阳性小鼠与组织特异性Cre小鼠交配，筛选获得纯合子小鼠。
4.权利要求1～3中任意一项所述构建方法获得的TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型在制备筛查防治肾病综合征和/或研究肾病综合征发生发展病程的实验材料中的应用。
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